JP2003510584A - マイクロエレクトロニックアレイ上の生体分子付着部位 - Google Patents

マイクロエレクトロニックアレイ上の生体分子付着部位

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、電子的にアドレス可能なマイクロチップアレイ浸透層の表面への化学部位の付着の増強を提供する。化学部位の付着は、該アレイの予め決定された位置にてまたは全アレイ中に引き起こすことができる。該付着は、アレイの捕捉部位にて電位を使用して、該アレイと接触する溶液のｐＨにおける変化を誘導することによって行うか、あるいは該溶液のｐＨを非電子的に調整することによって行うことができる。考えられる化学部位は、ｐＨ感受性であって、該アレイへの付着のための反応性中心を形成する。また、かかる付着のための新規な接合方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、電子的にアドレス可能なマイクロアレイの浸透層と組み合わせた官
能基の取り込みに関する。より詳細には、本発明は、マイクロアレイ上の特定の
位置にて活性化でき、および／または生体分子を付着させるために高密度まで重
合できる特異的官能基が含まれるマイクロエレクトロニックアレイ浸透層および
それらの製造に関する。
【０００２】 発明の背景 以下の記載は本発明に関連する情報の概要を提供する。本明細書に提供された
いずれの情報も特許請求された本発明に対して先行技術であること、ならびに特
におよび暗黙のうちに参照されたいずれの刊行物も本発明の先行技術であること
を承認するものではない。
【０００３】 肉眼的および顕微鏡的なアレイについての付着化学の技術は、近年非常な注目
を浴びている。しかしながら、アッセイ感度の要求が増大しているので、生体分
子の付着におけるより大きな特異性ならびにより高密度の付着した生体分子を供
することができる付着化学についての必要性も増大している。
【０００４】 共有結合的および非共有結合的な付着化学がよく開発されているが、エレクト
ロニックマイクロアレイで経験されたいくらかの基礎的な困難性を克服した進歩
はほとんどない。例えば、本エレクトロニックマイクロアレイでの問題点には、
特異的な捕捉／検出部位のない生体分子の非特異的結合および電子的アドレス指
定の前、中および後のかかる生体分子の受動的な結合を制御するための不能が含
まれる。これらの問題点の結果、決して非標的分子と標的分子とは理想的に区別
されない。同様に、使用における現行の付着化学は、捕捉部位に対する非標的分
子の望ましくない受動的結合と遭遇することなくして、標的分子の複数部位また
は連続的部位のアドレス指定中に未使用の捕捉部位を操作するのを困難としてき
た。
【０００５】 低特異性の結合および非標的からの標的の区別の問題点に解決策を提供するこ
とにおいて、発明者らは、該マイクロアレイ上の標的結合部位の密度をかなり増
加させる方法によって、結合の特異性ならびに標的区別の増強を供する生体分子
の付着についての付着化学を提供する。さらに、本方法は、該マイクロアレイ電
極を用いて、標的結合部位の付着性を配置するために提供する。
【０００６】 多数の当該技術に関与するマイクロアレイ付着性が結合の特異性を増強するた
めのマスキング技術に関連するが、ある方法を用いて、化学部位でパターン化さ
れるのが望ましい表面を電子的に処理した。SouthernによるＰＣＴ出願ＷＯ９３
／２２４８０では、表面を電気化学的にパターン化する方法が開示され、ここに
、電極グリッドは電解質と溶液接触しておよび直接的に接触してパターン化され
ることが望ましい表面に隣接して配置される。該電極グリッドは、基板表面上で
の分子の付着性、分子の除去または分子の化学的修飾を指令する電位を供する。
かかる電子的処理プロセス後、該グリッドを取り出す。かかる方法が非電子的表
面をパターン化するための手段を供するが、それは受動的アレイ様式だけに適用
できる。加えて、該方法は、アレイの初期形成においてのみ適用でき、活動的な
「要求応答（on-demand）」手法におけるアレイには適用できない。
【０００７】 他の技術は付着性化学に集中してきた。例えば、米国特許第５,９１９,５２３
号においてSundbergらは、誘導体化したガラススライドに直接的に分子を付着さ
せるのに典型的に用いた付着化学を開示している。かかる化学は、核酸配列を付
着および合成するために設計され、ここに、１つの有用な態様は、基板表面の湿
潤性についての必要性である。かかる化学は、本発明のエレクトニックマイクロ
アレイが、本発明の付着および重合化学反応図式に関与する反応性部位を含む電
極上の多孔性（porous）浸透層を必要とする点で、本発明に用いたものとはさら
に区別される。
【０００８】 前記の例の双方において、典型的な付着性化学での場合のごとく、付着した分
子の結合レベルは、基板表面上に存在する反応性部位数に制限される。かくして
、基板に、注目する分子を結合するための付着部位が劇的に増加するかかる方法
において、一般的には、基板表面を誘導体化する方法についての要求が残ってい
る。発明者らは、電子的にアドレス可能なマイクロアレイの浸透層を含む特に基
板に関するかかる方法を見出した。
【０００９】 核酸プローブを用いる標的分子のハイブリダイゼーションおよび検出の当該技
術においてよく理解されているように、該マイクロアレイの検出表面上に結合し
ている高密度の捕捉プローブを有することが重要である。従来の表面修飾技術に
おいて、表面上の利用可能な基を誘導体化して、捕捉プローブに結合できる機能
的部位を含ませる。捕捉プローブ結合は、今度は、検出表面上の誘導体化された
基または結合部位の数および利用可能性に依存する。感染性疾患検出、ゲノム研
究等のごとき多数の適用において、非常に低レベルの核酸を検出するための能力
が必要である。このために、本発明は、表面修飾の新規な方法を提供し、ここに
、捕捉プローブ（すなわち、誘導体化された生体分子）を結合するための複数の
付着部位を有する官能基のポリマーが浸透層上に存在する。また、かかる付着部
位の利用可能性は、該アレイ上の予め決められた位置に配置できる。これは、マ
イクロアレイ上の生体分子の特異的および非特異的な結合間の区別の増大のため
に提供する。
【００１０】 発明の概要定義 本明細書に用いるごとき「誘導体化された生体分子」とは、テスト試料中の分
子の原子団に接触し、その存在を検出するために用いる分子を意味する。一般的
には、これらには、少なくとも部分的に、ストレプトアビジン、ビオチン、フェ
ニルボロン酸（ＰＢＡ）およびサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）のごとき化学
部位に付着した核酸、蛋白質、ペプチド、酵素および抗体のごとき分子が含まれ
る。また、誘導体化された生体分子には、酸化リボース、アミン停止、またはHe
rmanson（Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniquescopyright 1996, Academi
c Press, San Diego, CA（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす））によ
って概説されるごときよく知られたバイオコンジュゲート対合のいずれかの原子
団を含むオリゴヌクレオチド、および／または（１９９９年８月１３日に出願さ
れた同時係属出願第０９／３７４,３３８号に記載されたｐＲＮＡに関する）ｐ
ＲＮＡのごとき代替的核酸構造が含まれる。一般的には、該生体分子への化学部
位の付着は、共有結合を含む。該マイクロアレイへの誘導体化された生体分子の
付着に関して、かかる付着は「Ａ」またはＲ部位のいずれを用いてもよく、また
共有結合または非共有結合のいずれを用いてもよい。
【００１１】 本明細書に用いるごとき「マイクロアレイ」とは、米国特許第５,６３２,９５
７号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）における「ＡＰＥＸチップ
」と命名されたアレイのごとき電子的にアドレス可能なマイクロアレイを意味す
る。
【００１２】 本明細書に用いるごとき「浸透層」とは、前記定義のマイクロアレイのごとき
電子的にアドレス可能なマイクロチップ上の間隔を空けた電極アレイを覆ってい
る多孔性マトリックスコーティングを意味する。該浸透層は、任意の数の物質を
含有できる。好ましい態様において、該層は、基底浸透層マトリックス内で共重
合されたか、あるいは頂部または表面層として存在するＲ部位の形態にて、生体
分子付着部位を有するアガロースまたは重合したアクリルアミドもしくはメタク
リルアミドヒドロゲルのごとき物質を含む基底ポリマー層を含む。かかる部位に
は、チオール、ケトン、アルデヒド、マレイミド、アミン、ヒドラジド、ヒドラ
ジン、メタクリルアミド−ＳＨＡ、ハロ−アセトアミド、ブロモプロピルアミン
およびブロモアセチル−プロピル−メタクリルアミドならびにHermanson（同上
、Hermanson）によって概説されたものが含まれる。該浸透層は、浸透層ポリマ
ーマトリックスと共重合されるか、または浸透層ポリマーマトリックスに接合さ
れるいずれかの官能基の包含がさらに考えられる。接合される場合、該官能基は
、該基が接合反応と同一の反応にて重合されるか、あるいは従前の重合形態にて
接合できるような重合反応において接合できる。さらに依然として、その大部分
の完全な形態において、該浸透層により、生体分子の付着が考えられる。
【００１３】 本明細書に用いるごとき「平均蛍光強度」またはＭＦＩは、１秒間につき検出
カメラインテグレーション時間を標準化するに際しての注目する領域にわたる蛍
光検出中のピクセルカウント値の平均を意味する。その数値範囲は、浸透層の作
成により変化するであろう。ある実験からもう一つの実験へのＭＦＩ値は、光設
定、フィルター、標準化前のインテグレーション時間、光強度、および初期蛍光
体濃度を含めた多数の因子のために１０,０００程度のファクターで変動し得る
。ある実験からもう一つの実験へのＭＦＩ値の直接的比較は推奨されないが、所
与の組の実験内の識別シグナル（differentiating signal）の比較は許される。
【００１４】 「官能基」とは、化学変換を受けることができるいずれかの化学部位を意味す
る。 本発明の具体例は、電子的にアドレス可能なマイクロアレイ上の使用のための
浸透層および浸透層製造についての方法を提供し、ここに、「Ｐ−Ｘ−Ｒ」と示
された官能基は、該層の製造中の共重合によって、あるいは予め成形された基底
浸透層に接合させることによって浸透層に組込まれる。これらの官能基は可変性
であるが設計において単純である。それらは、一般的に別々の機能を果たすが、
いくらかの環境において、同様の機能を果たすことができる２つの反応性中心（
すなわち、該Ｐ部位および該Ｒ部位）を含む。
【００１５】 該Ｒ部位は、誘導体化された生体分子にまたは同一のＰ−Ｘ−Ｒ式のさらなる
官能基に、またはＰおよび／またはＲ部位における変化を有する以外は同一の式
の官能基に結合できる。Ｒ部位がさらなるＰ−Ｘ−Ｒ基に結合する場合、後記の
溶液またはスラリープロセスのいずれかにおける重合反応を含む接合方法が提供
され、ここに、該Ｒ部位は付加された基のＰまたはＲ部位と反応する。さらなる
具体例において、Ｐ部位は、第２の付加された基等のＰまたはＲ部位と反応でき
る。また、付加されるべき官能基は、基底浸透層への付加に先立ち前に重合でき
る。該Ｒ部位が誘導体化された生体分子またはさらなる官能基に結合するかを問
わず、該Ｒ部位は、Ｒ部位の化学構造のために直接的に結合できるか（すなわち
、Ｒ基が「活性化される」必要はない）、活性化後にだけ結合するであろうかか
る化学的に調製されるものであり得る。活性化は、非特異的にまたは特異的にの
いずれでも誘導できる。活性化が非特異的に開始される場合、該Ｒ基は、マイク
ロアレイを覆っている溶液を介するｐＨ変化を生じることによって活性化される
。活性化が特異的に開始される場合、該Ｒ基は、浸透層の下にある電極の位置に
対応してマイクロアレイ上の特定の位置の直上の特異的な位置だけにマイクロア
レイを覆っている溶液中のｐＨ変化を生成することによって活性化される。
【００１６】 該Ｐ部位は、単一の単量体としてまたはさらなるＰ−Ｘ−Ｒの他のＰ部位との
重合反応に関与するように設計される。また、それらは、基底浸透層の反応性中
心（すなわち、「Ａ」部位）に、または浸透層に従前に組込まれた官能基のＲ部
位に結合できる。この場合、浸透層（「Ａ」またはＲ）に付着すべき官能基のＰ
部位は、Ｒまたは「Ａ」に付着するために利用できる以外のポリマーに既に組込
まれ得るか、あるいは該Ｐ部位は重合反応に同時に関与しつつ付着できる。
【００１７】 前記のＲ基に結合する場合のごとく、該重合反応は、溶液またはスラリーのプ
ロセスのいずれかで実施でき、ここに、該Ｐ部位は「Ａ」またはＲ部位および／
または付加された官能基のＰ部位と反応できる。Ｐが「Ａ」またはＲ部位に結合
する場合において、かかる反応性中心の「Ａ」またはＲ部位は、活性化される必
要がない化学部位または代替的に活性化を必要とするものいずれも含み得る。Ｐ
がもう一つのＰ部位との重合に関与する場合において、溶液またはスラリーの接
合は、全マイクロアレイを横切って適用できる加熱および／または照射に感受性
である「重合イニシエーター反応性分子」を用いることによって非特異的に開始
できる。
【００１８】 重合の開始ならびに「Ａ」およびＲ部位の活性化は、前記のＲ部位の場合のご
とく、特異的または非特異的に開始できる。しかしながら、特異的な開始に関し
て、重合はいくつかの方法で実施できる。例えば、１つの具体例において、加熱
または照射よりむしろマイクロアレイを覆っている溶液中の電子的に発生したｐ
Ｈ変化に感受性である化学的イニシエーターを用いることができる。もう一つの
具体例において、紫外線照射を用いて、重合を開始でき、ここに、「指令された
」照射の使用は、重合を電極上だけに生じるために必要とされる。さらにもう１
つの具体例において、重合は、重合しているＰ部位を特異的に活性化した「Ａ」
またはＲ部位に接合することによって予め決定された位置に特異的に向けること
ができる。
【００１９】 Ｘ部位は、他の化学部位または官能基と通常は反応しないリンカー部位として
機能する。１つの具体例において、Ｘはリンカーとして機能し、一方、もう一つ
の具体例において、Ｘはスペサーエレメントとして機能するが、さらにもう一つ
の具体例において、Ｘは化学結合であってもよい。
【００２０】 当業者によって理解されるであろうごとく、後記の「Ａ」、Ｐ、ＸおよびＲの
各々は、誘導体化した生体分子を結合し、それによって電子的にアドレス可能な
マイクロアレイの特異性および感度を増大するために利用可能である高密度のＲ
部位の付加のために提供される。
【００２１】 浸透層技術において当業者が理解可能なごとく、電子的にアドレス可能なマイ
クロチップの浸透層は、任意の数の分子構造を含み得る。好ましい具体例におい
て、かかる層は、一般的には、多孔性物質を含む基底浸透層を含む。本発明の使
用に適当なかかる物質には、アガロース、キトサン、（アクリルアミド、メタク
リルアミド、ポリエチレングリコール、ビニルピロリドンから形成された）ポリ
マー、およびゾル−ゲルのごときかかる物質が含まれる。かかる物質よりなる基
底浸透層は、エレクトロニックマイクロアレイにいくつかの利点を供する。例え
ば、それらは、電極と覆っている溶液との間の絶縁を供する。また、それらは、
電子表面と覆っている溶液との間のイオン交換を可能とするのに適当な多孔性マ
トリックスを供する。また、それらは、蛋白質および核酸のごとき注目する種々
の分子を付着させるために化学部位を結合するのに用いることができる反応性中
心「Ａ」を有する骨格（例えば、官能基）を提供し；また、ゾル−ゲルのごとき
無機物質を用いて、１９９９年７月１５日に出願された同時係属出願シリアル番
号第０９／３５４,９３１号に記載されたごとき基底浸透層を形成できる。これ
らの多孔性ガラスは、シランカップリング剤と反応して、「Ａ」およびＲ部位を
導入できる。
【００２２】 本発明に関して、１つの具体例において、基底浸透層マトリックスの「Ａ」部
位と命名された反応性中心は、式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する機能性分子のごとき、注目
する分子を付着するために提供される。該「Ａ」部位は、それらが機能性分子と
反応し、機能性分子に付着するように設計でき、またはさらなる付着化学（depo
sition chemistry）における関与に先立ち活性化されるに違いないように設計で
きる。１つの好ましい具体例において、「Ａ」部位は、アレイ上のいずれの活性
化した「Ａ」部位も付着化学に関与できるように非特異的に活性化できる。もう
一つの好ましい具体例において、「Ａ」部位は、付着化学がそれらの特異的に活
性化された部位だけにて発生するように浸透層マトリックス下に位置する下にあ
る微小電極に電位を供することによって予め決定された部位（すなわち、捕捉部
位）にて特異的に活性化できる。「Ａ」部位の特異的および非特異的な活性化の
双方において、浸透層を覆っている溶液を作成して、「Ａ」部位の活性化に好ま
しい（非特異的な活性の場合には全アレイ、特異的な活性化の場合には捕捉部位
だけを横切る）ｐＨ条件における変化を経験する。非特異的活性化の場合、ｐＨ
変化は、溶液容量を換えることによって引き起こされ、一方、特異的な活性化の
場合、ｐＨ変化は、捕捉部位にて供された電位によって引き起こされる。
【００２３】 もう一つの具体例において、「Ａ」部位は、基底浸透層の形成の間に式Ｐ−Ｘ
−Ｒを有する官能基と反応でき、ここに、形成後、浸透層は、さらなる付着化学
に利用可能な「Ａ」部位に代えてそれに対して誘導体化した。この具体例におい
て、Ｐ部位は、浸透層基底に付着し、Ｒ部位はさらなる付着化学に利用可能であ
る。この具体例の１つの態様において、Ｒ部位は、誘導体化された生体分子また
はさらなる官能基のいずれとも直接的に反応するように設計できる。この具体例
のもう一つの態様において、該Ｒ部位は、生体分子および官能基のさらなる付着
化学に関与するのに先立ち活性化されることが必要であるように設計できる。後
記のごとき一例において、該生体分子に付着する誘導体部位は、Ｐ−Ｘ−Ｒ官能
基と考えることができる。「Ａ」部位でのごとく、活性化が必要な場合において
、活性化は特異的または非特異的のいずれでも開始できる。
【００２４】 もう一つの具体例において、付着化学は、浸透層上に位置した「Ａ」またはＲ
部位に対する、従前に重合された状態または重合反応のいずれかにおいて式Ｐ−
Ｘ−Ｒを有する官能基の溶液およびスラリー接合を含む。付加された基が従前に
重合されたが、接合手順の間に重合されたかいずれにせよ、接合は、付加される
べき官能基のＰ部位と「Ａ」またはＲ基のいずれかとの間に生じる。前記のごと
く、「Ａ」またはＲとＰとの間の結合は、それらの各々の化学的構成に依存して
「Ａ」またはＲの活性化を必要とし得る。活性化が必要とされる場合、かかる活
性化は、特異的または非特異的のいずれでも開始できる。非特異的活性化は、マ
イクロアレイを覆っている溶液中での高いまたは低いいずれのｐＨ変化によって
も実施できる。特異的活性化は、特異的な捕捉部位の電極にバイアスをかけて、
それらの部位でのｐＨ変化を誘導することによって開始できる。
【００２５】 もし必要ならば「Ａ」またはＲの活性化と同時に、または活性化が必要でない
場合には、「Ａ」および／またはＲ部位への官能基の接合は、本発明のスラリー
または溶液法のいずれを用いても開始できる。「Ａ」またはＲ基が活性化を必要
とするので、接合は、特異的または非特異的な方法のいずれでも実施できる。加
えて、接合は、従前に重合したＰ−Ｘ−Ｒマトリックスの接合、マトリックス官
能基が重合されている同一時間での接合を含むことができる。重合が接合中に生
じる場合、加熱または照射によって活性化される化学的重合イニシエーターが好
ましい。これは、接合プロセスにおける多用途性が特異的な方法で実施されるの
を可能とする。換言すれば、活性化を必要とする「Ａ」またはＲの使用を特異的
に活性化して、スラリーまたは溶液接合反応において重合可能な官能基と反応さ
せて、該アレイ上の特異的な位置にて官能基を接合できる。
【００２６】 スラリー接合方法において、官能基は、イニシエーター分子と濃縮された形態
でアレイ上に層状とする。適当な反応条件下にて、イニシエーターおよび機能性
分子のＰ部位が反応して、浸透基底層に結合した機能分子のポリマーを形成する
。溶液接合法において、イニシエーター分子および機能分子を可溶性混合物中で
アレイ上に層状とする。いずれの場合にも、官能基の高密度接合が生じ、高密度
生体分子付着部位を供する。接合は、捕捉部位に濃縮された重合のための電子的
なバイアスを用いて特異的に、または全アレイを横切って非特異的に実施できる
。
【００２７】 他の具体例において、本発明により、マイクロアレイへの誘導体化された生体
分子の付着が考えられる。前記のごとく、かかる分子の付着はＲ部位を介する。
いずれの場合でも、接合は、用いられた化学に依存して共有結合または非共有結
合のいずれも含む。官能基が複数にて付加されることが一般的に考えられるので
、該アレイに生体分子を付着させる能力は、非常に高密度まで劇的に増大される
。
【００２８】 さらにもう一つの具体例において、浸透層の「Ａ」またはＲは、ｐＨが不安定
（高または低ｐＨ）であるチオエステル部位を含む。この具体例において、特異
的な電子的にアドレス可能な捕捉部位を正または負にバイアスをかけて、予め決
定された捕捉部位にてチオエステルを活性化し、Ｐ−Ｘ−Ｒ官能基または誘導体
化した生体分子のいずれかの結合を可能とする。
【００２９】 浸透層骨格上の「Ａ」部位に関して、一般的には、「Ａ」は、さらなる官能基
を結合するために用いることができる反応性中心を含む。これは、遊離ラジカル
反応にて反応するのに感受性であるポリマー骨格中の炭素原子、あるいは直接的
に反応するまたは増感（すなわち、活性化）に続いて活性化されるのいずれかで
あろう第三炭素のごときポリマー骨格に付着した化学部位を含み、ここに、活性
化は一般的にはＰ部位とのさらなる反応に関与する種の形成を含む。「Ａ」の定
義に含まれるのは、当業者によって認識されるごとく、生体分子を一緒にカップ
リングさせるのに用いられるよく知られたバイオコンジュゲート対合（同上、He
rmanson）である。
【００３０】 さらにもう一つの具体例において、浸透層の「Ａ」またはＲは、酸性溶液また
は電子的なバイアスを用いて加水分解して、特定の捕捉部位にて誘導体化した生
体分子またはＰ−Ｘ−Ｒ官能基の付着のためのアルデヒド官能性を得ることがで
きる。この態様の好ましい具体例において、該捕捉部位は、溶液中の水を酸化し
て、アセタール基の酸性加水分解のための低ｐＨを生じさせ、誘導体化した生体
分子または官能基と反応させるために用いることができるアルデヒド基を得るよ
うに電子的にバイアスがかけられる。
【００３１】 さらにもう１つの好ましい具体例において、接合し重合した官能基は、浸透層
が膨潤するのに関連する先の問題点を克服する。さらにもう一つの具体例におい
て、反応性部位の電子的または非電子的な活性化のいずれを用いて結合しようと
、重合された官能基の使用は、非重合技術と比較して背景蛍光性の減少を可能と
する。本発明の方法により、さらに、プラズマ接合を含めた他の接合方法の使用
が考えられ、ここに、気体は低圧力にて放電に曝露される。次いで、イオン化さ
れた気体は存在しているポリマー上への単量体の接合、引き続いての重合を開始
する。（さらなる詳細については、John Wiley and Sons, New York, NYによるO
dian, G. Principles of Polymerization 第３版,Copyright １９９１；２３２
頁およびその中の参考文献（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）を参
照されたし）。
【００３２】 さらにもう一つの具体例において、本発明の方法は、アレイ上の生体分子の高
密度の付着のために提供される。
【００３３】 好ましい具体例の詳細な記載 本発明の具体例により、浸透層でコーティングされた電子的マイクロアレイお
よびかかるマイクロアレイの製造方法が提供され、ここに、該浸透層は高密度の
誘導体化された生体分子を付着させるための官能基を含む。かかるアレイの製造
に関して、官能基は、単純であるが多用途の式を有する化学部位を含み、それは
、該基がいくつかの方法にて浸透層上に組込まれるのを可能とする。
【００３４】 該官能基は、式： Ｐ−Ｘ−Ｒ ［式中、Ｐは化学基を含み、その設計は、反応させることが望ましい基の性質に
依存して変更できる。Ｐと反応することが望ましい基に拘らず、該Ｐ部位は、重
合反応におけるもう一つのＰ反応性中心への結合、および／または浸透層マトリ
ックスの「Ａ」と命名された反応性中心の結合、および／またはもう一つの官能
基のＲ部位への結合に関与できる反応性中心を常に含む。該Ｐ部位がもう一つの
Ｐ部位反応性中心に結合することを意図するか、あるいは反応性中心「Ａ」に結
合することを意図する場合、Ｐは、限定されるものではないが、置換されたまた
は置換されていないα、βの不飽和カルボニルを含むアルケニル部位、ここに、
該二重結合は、酸素に二重結合し、もう一つの酸素、窒素、ハロゲンまたは炭素
に単結合する炭素に直接的に付着し；ビニル、ここに、該二重結合は、酸素、窒
素、ハロゲン、リンまたはイオウに単結合し；アリル、ここに、該二重結合は、
酸素、窒素、ハロゲン、リンまたはイオウに結合する炭素に単結合し；ホモアリ
ル、ここに、該二重結合は、もう一つの炭素に単結合する炭素に単結合し、次い
で、そのもう一つの炭素が、酸素、窒素、ハロゲン、リンまたはイオウに単結合
し；アルキニル部位、ここに、三重結合は２つの炭素原子間に存在する、よりな
る群から選択される。該Ｐ部位が、Ｒ部位に結合することを意図される場合、Ｐ
は置換されたまたは置換されていないα、βの不飽和カルボニル、ビニル、アリ
ルおよびホモアリル基ならびにアルキンよりなる群から選択される。また、この
具体例内では、Ｐは、アセタール、エポキシド、エステル、カルボン酸、アミド
、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエス
テル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミ
ン；ならびにHermanson（同上、Hermanson）にリストされたものよりなる群から
選択できる。選定されたＰ部位および用いられた反応条件に依存して、Ｐの反応
性中心は、重合および／またはカップリング反応に関与するように反応性とでき
る。後記の例に記載したごとく、重合条件には、スラリー接合法または溶液接合
法の使用を含み得る。好ましい具体例において、該Ｐ部位は重合反応に関与し、
（「Ａ」の場合には）マトリックス骨格自体の性質のため、または（Ｒ部位の場
合には）官能基が構成中または接合に先立ついずれかにて該層に組込まれるため
のいずれかにて浸透マトリックスに既に組込まれた「Ａ」またはＲ部位のいずれ
かに結合するように設計される。
【００３５】 Ｘは、化学結合、１〜１０個の炭素原子のアルキル基、２〜１０個の炭素原子
のアルケニル基、アルキルエステル、ケトン、アミド、チオエステル、アルキル
エーテル、アミド基、カルボニルおよび／またはそのいずれかの組合せよりなる
群から選択される部位である。
【００３６】 本明細書に用いられるごときアルキルとは、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、tert−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ネオペンチル、tert−ペ
ンチル等のごとき直鎖および分岐した炭化水素部位を示す。かかるアルキルは、
限定されるものではないが、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、チオ、シアノ、ニト
ロ、スルホ等を含めた様々な置換基で置換できる。アルケニルとは、１以上の炭
素−炭素結合が二重結合であって、二重結合していない炭素がアルキルまたは置
換されたアルキルである炭化水素を示す。アルケニル炭化水素基は、直鎖であっ
てもよく、または１以上の分岐を含んでいてもよい。アミノとは、２つの水素原
子、アルキル部位およびその組合せに結合した窒素原子を含む部位をいう。アミ
ドとは、酸素原子に二重結合したおよびアミノ部位に単結合した炭素原子を含む
部位をいう。
【００３７】 Ｒは、共有結合的または非共有結合的のいずれかで生体分子を付着させるか、
あるいはＰ−Ｘ−Ｒ基に結合させるための化学基である。ＲがＰ−Ｘ−Ｒ官能基
に結合することを意図される場合、Ｒは、化学結合、ビニル、アリル、ホモアリ
ル、アセタール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオー
ル、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒ
ド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミン；ならびにHermanson（同上
、Hermanson）にリストされたものよりなる群から選択できる。Ｒが誘導体化し
た生体分子に付着することを意図される場合、Ｒは化学結合、ストレプトアビジ
ン、ストレプトアビジンの一部分、ビオチン、フェニルボロン酸、サリチリック
（salicylic）ヒドロキサム酸、ジスルフィド、チオエステル、チオール、ホス
ホロチオレートモノエステル、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、アセタール、
ケトン、アルデヒド、ジアルデヒド、ブロモ−またはヨード−アセトアミドおよ
びエステルならびにHermanson（同上、Hermanson）にリストされたものよりなる
群から選択できる。Ｒが生体分子または官能基のいずれを問わず、選定されたＲ
の特定の部位に依存して、該Ｒ部位は、付着が生じ得る前に直接的に反応するか
、あるいは最初に活性化を必要とするかのいずれかであり得る。
【００３８】 浸透層ポリマー骨格上の「Ａ」部位に関して、一般的には、「Ａ」は、遊離ラ
ジカル反応にて反応するのに感受性であるポリマー骨格中の炭素原子を含むか、
あるいは第三炭素またはアセタールのごときポリマー骨格に結合した化学部位を
含むかのいずれかの反応性中心を含み、それは、直接的に反応するか、または増
感（すなわち、活性化）後に活性化され、ここに、活性化はＰ部位とのさらなる
反応に関与するであろう種の形成を一般的に含む。Ｐ、ＸおよびＲの各々につい
ての例を図１８および表Ｉに供する。
【００３９】
【表１】
【表２】 （表１の続き）
【表３】 （表１の続き）
【００４０】 付着している官能基および誘導体化した生体分子を付着させるための化学は、
選定された各部位の性質に依存して変更できる。いくらかの場合、「Ａ」または
ＲがＰまたは誘導体化された生体分子への結合において反応および関与するため
に、結合が生じるべき部位との直接的接触だけが引き起こされる必要がある。例
えば、「Ａ」またはＲがエステルを含むならば、誘導体化された生体分子は、ヒ
ドラジド部位を含むことだけが必要である。結合に活性化が必要でない部位には
、アルデヒド、ケトン、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ハロアセトアミド、
チオール、ホスホロチオレートモノエステルおよびエステルが含まれる。これら
の各々は、表ＩＩに示された以下の組合せにおいて反応につき対合できる。
【００４１】
【表４】
【００４２】 他の場合において、「Ａ」、Ｒ、Ｐまたは生体分子の誘導体化された部分は、
結合または付着が生じるように活性化されなければならない。この場合において
、化学部位は、ジスルフィド、チオエステル、第三炭素、アルケン、アルキルエ
ーテル、アセタールおよびカルボン酸のいずれかを含み得る。活性化を必要とす
るかかる部位は、表ＩＩＩに示されるごとく対合できる。
【００４３】
【表５】
【００４４】 結合が先立つ活性化を必要とする部位（「Ａ」、Ｒ、Ｐまたは誘導体化された
生体分子のいずれかを問わず）を用いて実施されるか否かを問わず、該付着は、
共有結合または非共有結合を含む得る。官能基または誘導体化された分子のいず
れの付着についても活性化が必要でない場合には、全マイクロアレイの浸透層上
に存在する反応性部位は、付着反応における関与に付される。これは、いずれか
の部分のアレイ上の生体分子のさらなる付着のための官能基の高密度のＲ部位の
組込みを可能とする。
【００４５】 活性化が付着が生じるために必要である場合、該部位は、特異的または非特異
的のいずれかで活性化できる。非特異的活性化は、一般的には、全マイクロアレ
イの浸透層上に存在する活性化を必要とする部位の活性化を可能とする。他方の
特異的活性化は、アレイ上に存在する活性化を必要とする選択された部位だけの
活性化のために供する。好ましい具体例において、特異的な活性化は、発生した
電荷は、電極の直上の、マイクロアレイを覆っている溶液のごとき溶液のｐＨに
直接的に影響するので、該アレイの予め選択された電極に（正または負のいずれ
かの）電位を印加することによって行われる。このように、活性化を必要とする
部位（ＡまたはＲ）は、化学的変換を受け、ある部位、例えば、Ｐ、Ｒの反応性
中心または誘導体化された生体分子への付着に利用可能となる。この特異的な活
性化は、アレイの特異的な捕捉部位が「要求応答」バイアスに対して生体分子に
ついての高密度の結合能を供することができる点で、本発明に高度の多様性を提
供する。
【００４６】 さらに、本発明の付着化学（attachment chemistry）は、新規な接合方法を含
み、ここに、官能基は、かかる接合方法と組み合せて前記の種々の付着化学を用
いて浸透層上に組込まれる。１つの態様において、接合は、スラリー法で行われ
る。もう一つの具体例において、接合は溶液法で行われる。スラリーまたは溶液
を問わず、官能基は、全アレイを横切ってまたは予め選択された位置だけで組み
込まれる。全アレイを横切る付着を考える具体例では、一般的には、「Ａ」およ
び／またはＲ部位は先の活性化を必要としても必要としなくてもよい。
【００４７】 さらに、本発明の接合方法に用いた付着化学は、従前に重合された官能基の使
用または付着中の官能基の重合を可能とする反応条件の使用のいずれかを用いて
考えられる。いずれの場合にも、接合は、官能基が「Ａ」またはＲ部位のいずれ
かを有する予め形成された基底浸透層に付着されることを含み、ここに、該「Ａ
」部位は、浸透層の反応性中心であり、該Ｒ部位は個々のＰ−Ｘ−Ｒ官能基の「
共重合」から存在するか、あるいは個々のＰ−Ｘ−Ｒ基、従前に重合されたＰ−
Ｘ−Ｒ基または接合と同時に重合されたＰ−Ｘ−Ｒ基の形態のいずれかにて官能
基の先の接合から存在する。
【００４８】 異なる化学構造を持つ単量体の基を重合することによるマイクロアレイ上の浸
透層の形成中の官能基の付着は、「共重合」と命名される。この具体例において
、Ｐの反応性中心は、マイクロアレイ上の浸透層の形成中、浸透層ポリマーの反
応性中心に付着するようになる。反応性Ｐは、重合された官能基に既に組込まれ
るか、あるいはそれが浸透層マトリックスに付着されるように官能基の同時の重
合に関与できる。一般的には、共重合を介する付着は、非特異的な付着化学を用
い、浸透層に組込まれる官能基は、全アレイを介して付着する。
【００４９】 予め形成された浸透層上への官能基の付着は、「接合（grafting）」と称する
。１つの好ましい具体例において、接合は、スラリー接合を用いて行われる。こ
の方法において、式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する官能基は、反応を誘導するに際して、（
１）浸透層の反応性中心（すなわち、「Ａ」またはＲのいずれか）とＰ部位の反
応性中心との間の結合、および（２）Ｐ部位上の反応性中心を介する官能基の重
合の双方を開始するイニシエーター分子で濃縮されたスラリー中の浸透層と接触
される。官能基が従前に重合された場合、接合プロセスは、主として浸透層への
従前に重合した基の付着だけに関連する。スラリー接合法の詳細は、後記の実施
例２に提供される。この方法の好ましい具体例において、官能基およびイニシエ
ーターは、部分的にだけ溶液中に存在する。
【００５０】 もう一つの好ましい具体例において、接合は、溶液接合を用いて行うことがで
きる。この方法において、式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する官能基は、反応を誘導するに際
して、（１）浸透層の反応性中心（すなわち、「Ａ」またはＲのいずれか）とＰ
部位の反応性中心との間の結合、および（２）Ｐ部位上の反応性中心を介する官
能基の重合の双方を開始するイニシエーター分子を含む溶液中の浸透層と接触さ
れる。官能基が従前に重合された場合、接合プロセスは、主として浸透層への従
前に重合した基の付着だけに関連する。溶液接合法の詳細は、後記の実施例３に
提供される。この方法の好ましい具体例において、官能基およびイニシエーター
は、溶液中に完全に溶解される。
【００５１】 スラリーまたは溶液の接合を用いるかを問わず、本発明の方法は、非特異的ま
たは特異的な様式のいずれかにて接合を行う多様性を可能とする。非特異的様式
が用いられた場合、「Ａ」および／またはＲ部位は、活性化を必要とするものを
含み得る。活性化を必要とするこれらの部位では、接合は、覆っている溶液のｐ
Ｈ条件を変更すことによって全アレイを横切って適用できる。特異的活性化が接
合中に考えられる場合、接合は、イニシエーターおよび官能基の使用と組み合わ
せて活性化を必要とする「Ａ」およびＲ部位を用いてマイクロアレイの電極上に
のみ生じるように指向できる。図１９および２０は、生体分子を付着するための
複数のＲ部位を結合する種々の立体配置を示す。図２０は、それが浸透層の化学
構造を示す点で、より詳細である。図１９は、付加されたＰ−Ｘ−Ｒ基の種々の
変更を示す。”Ａ”において、Ｐ−Ｘ−Ｒ基は、浸透層に対する接合反応におい
て重合された。該接合は、非特異的または特異的のいずれであってもよい。該模
式図は、浸透層のいくらかの反応性中心が接合から保つことができる点で特異的
なものを示す。活性化を必要としないＲ部位が存在するならば、一旦、かかる接
合が生じたならば、誘導体化された生体分子は、活性化なくして直接的に付着し
、あるいは活性化を必要とするＲ部位が存在する場合、Ｒ部位はさらに”Ｃ”お
よび”Ｄ”で示される非特異的または特異的なモードのいずれかで生体分子を付
着させるためにさらに活性化できる。”Ｂ”において、Ｐ−Ｘ−Ｒ基は、個々に
浸透層に共重合するように示され、その後、さらなるＰ−Ｘ−Ｒ基または誘導体
化された生体分子のいずれかのさらなる付着につき非特異的または特異的にそれ
らは前記のごとき誘導体化した生体分子に直接的に付着できるか、適当なＲ部位
が存在することを仮定することによって活性化できる。
【００５２】 共有結合を達成するための接合した単量体の付着は、かなり多数の方法によっ
て開始できる。例えば、接合は、イニシエーター（例えば、ＡＩＢＮ、過酸化ベ
ンゾイル）の熱分解、イニシエーターの光分解性開裂（例えば、５０％の２,４,
６−トリメチルベンゾイル−ジフェニル−ホスフィンオキシドおよび５０％の２
−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−プロパン−１−オンの混合物のＵＶ
開始（Daracur ４２６５、Ciba-Speciality Chemicals C; Tarrytown New York
）（以後、Ｄ４２６５という）、酸化還元反応（例えば、硫酸セリウム（ＩＶ）
）、電離放射線（例えば、α、β、γまたはＸ線）、プラズマ開始（アルゴン、
窒素、酸素）または過塩素酸テトラブチルアンモニウムを用いる電子的開始を用
いてもよく、ここに、該接合は、電流を用いて予め選択された部位上にだけ生じ
る（Samal, S. K.; Nayak, B. J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. １９８８, ２
１，１０３５、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。さらに、接合プ
ロセスは、反応に先立ち活性化されなければならない化学部位を用いることによ
って該アレイの予め決定された位置に特に指向される。
【００５３】 さらにもう一つの具体例において、付着の特異性は、重合および接合を開始す
るために用いたイニシエーターの特性を使用することによって、または電気化学
的活性化によって引き起こされ得る。一般的には、イニシエーターは、加熱また
は照射のいずれかでの接触によって反応性となるように誘導される。また、この
具体例において、活性化を必要とする「Ａ」またはＲ部位との組合せを問わず、
スラリーまたは溶液方法のいずれかを用いる接合は、該アレイの予め選択された
位置だけに放射の接触をマスキングすることによって該アレイ上の予め決定され
た位置に特に指令できる。特異的な活性化のもう一つの方法は、電気化学的に設
計されたイニシエーターにおいて遊離ラジカルを生成する条件下にて電極にバイ
アスをかけることである。
【００５４】 本発明の態様をさらに明確にするために、種々の態様の付着化学の次の記載を
以下に詳述する。 １つの具体例において、重合接合反応における官能基Ｐ−Ｘ−Ｒを浸透層の「
Ａ」に付着する。これは以下の通り図示でき、ここに、Ｘは、化学結合：
【００５５】
【化１】
【００５６】 である。 この概略図の化学反応の例は：
【００５７】
【化２】
【００５８】 である。 もう一つの具体例において、官能基は共重合されるか、あるいは「Ａ」部位を
介して浸透層マトリックスに化学結合され、Ｒ部位を介してさらなる重合接合に
利用可能である。概略図で示されたＸは、単一の化学結合ではない。
【００５９】
【化３】
【００６０】 さらなる具体例において、さらなるＰ'−Ｘ'−Ｒ'基は、浸透層への（共重合
または接合中のいずれかにて）従前に結合した官能基の（Ｒが活性化を必要とす
るか否かを問わず）Ｒ部位上に重合できる。ここに、その結果を次の通り図示で
き、ここに、重合している官能基中のＸ'は、化学結合：
【００６１】
【化４】
【００６２】 である。 Ｒが最初に活性化されなけらばならない部位を含む前記の概略図についての化
学反応の例は：
【００６３】
【化５】
【００６４】 である。 重合拡張は多数の付加のために連続でき、次の概略図：
【００６５】
【化６】
【００６６】 においてＺ−bioと表した生体分子を結合するのに利用可能な非常に多数のＲ部
位を含むポリマーの長鎖を形成できる。
【００６７】 好ましい具体例において、生体分子に付着した誘導体のＺは、好ましくは、化
学結合、ストレプトアビジン、ビオチン、フェニルボロン酸、サリチリック（sa
licylic）ヒドロキサム酸、チオール、ホスホロチオレートモノエステル、ヒド
ラジド、ヒドラジン、アミン、ケトン、アルデヒド、ジアルデヒド、ブロモ−ま
たはヨード−アセトアミドおよびエステルならびにHermanson（Hermanson 同上
）にリストされたものよりなる群から選択される。１つの具体例において、誘導
体化された部位は、いくつかのＲ部位に付着できる。かかる状態は、図２１に図
示され、ここに、ＰＢＡ部位は、Ｒ部位を別々に含むＳＨＡに付着する。
【００６８】 接合中の重合の例は、次のごとく図示できる：
【００６９】
【化７】
【００７０】 ここに、Ｐは単量体の反応性二重結合部位であり、Ｘはアルケンとカルボニル炭
素との間の化学結合であって、Ｒは、生体分子に付着させるために用いたカルボ
キシ基である。７０℃を超えて加熱した場合のイニシエーターは窒素ガスを追い
出し、浸透層からの水素を抜き取る２つのラジカル種を生成する。次いで、この
ラジカル骨格は、単量体の二重結合と反応して、該骨格と単量体との間に共有結
合を形成し、新しく結合した単量体内の三級ラジカルも生成する。このラジカル
は、重合反応を続けることができ、その結果、ポリマー骨格を生じる。
【００７１】 前記の反応は、該ポリマーが浸透層の表面上に広がって非電子的に、または該
アレイの特定の捕捉部位でのポリマーの特異的な置換を高密度で生じる電極にバ
イアスをかけることから活性化されるイニシエーターを用いて電子的にのいずれ
かで開始できる。反応が重合反応における成長化ポリマーについての付着部位と
して関与できる反応性部位を含む基底浸透層の存在下にて行う場合、その結果は
、全アレイを横切るまたは特定の位置にてのいずれかにてアレイ表面上のポリマ
ー鎖の成長化または重合している塊を含むアレイである。図２２Ａおよび２２Ｂ
および２３は、アクリルアミドＰ−Ｘ−Ｒ基（図２２Ｂ）またはアクリル性−Ｎ
ＨＳエステル（図２３）のいずれかを用いる接合重合を示す概略図である。図２
２Ｂは、図２２Ａに描かれたものについてのより詳細な機序を示す。いずれの場
合においても、示されるごとく、重合塊（polymerizing mass）が、浸透層の表
面上に形成される。本発明の他の具体例では、この成長重合反応は非特異的また
は特異的に指令できる。
【００７２】 以下の実施例において、官能基が電子的にアドレス可能なマイクロアレイの浸
透層に添加される種々の実験が開示される。実施例１において、先行技術の付着
化学が示され、ここに、生体分子付着レベルは本発明のものに関して限定される
。また、この実施例は、Ｐ−Ｘ−Ｒとして使用した本発明の付着部位が先行の付
着化学方法に少なくとも同等なレベルまで生体分子の付着を供することを示す。
実施例２は、３つの付着の反応図式を示し、ここに、本発明のために開発された
接合方法は「スラリー」法を含む。実施例３は、浸透層に対する官能基の付着に
ついての溶液接合を示す。実施例４は、「プラズマ接合」方法の利用性を供する
実験を提供する。実施例５は、３つの実験を供し、ここに、付着に先立ち活性化
を必要とする反応性中心Ｒを有する浸透層が形成される。加えて、その実施例は
、該アレイの捕捉部位だけに官能基の結合が生じるような電子的なバイアスを用
いて特異的な付着を行う能力を提供する。実施例６は、誘導体化された生体分子
の付着に先立ち活性化されなければならない部位を含む反応性中心Ｒを示す。
【００７３】実施例１ 先行技術において典型的に用いられた付着化学は、基板表面上の利用可能な反
応性部位数によって限定される。全ての反応部位では、１つの部位だけが試料内
の標的種の検出に関与する分子構造を結合するために付着できる。例えば、基板
上の全ての反応性部位では、１つの検出プローブだけが結合できる。
【００７４】 本発明の付着化学を用いたいくらかの化学部位が先行技術において知られた同
等な化学のレベルまで少なくとも機能することを示すために、３つの実験を行い
、ここに、生体分子を付着する化学基がマイクロアレイ上に配置され、重合なく
して処理された。得られた結果は、該アレイに対して個々に利用可能な部位だけ
に与えられた。
【００７５】 ａ）実験１−シアノメチル保護されたサリチリックヒドロキサム酸ペンチルマ レイミド（ＳＡ（ＯＣＭ）−Ｘ−Ｍａｌ）の付着 ９：０.５：０.５のアクリルアミド／メチレンビスアクリルアミド／Ｎ,Ｎ'−
ビス（アクリロイル）シスタミンおよびＵＶイニシエーターとしてＤ４２６５を
含む基底ヒドロゲル浸透層で層状としたマイクロアレイをマレイミドリンカーと
反応させて、浸透層上に付着マトリックスを形成した。特に、該アレイを窒素下
にてｐＨ８.２の０.５ＭトリスＨＣＬ中の１０ｍｌの２０ｍＭ ＤＴＴ中で１時
間インキュベートして、Ｎ,Ｎ'−ビス（アクリロイル）シスタミンのジスルフィ
ド結合を開裂させた。該アレイをｐＨ６.０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで３回洗
浄した。次に、２ｍｌのＤＭＦ中の８.５ｍｇのＳＡ（ＯＣＭ）−Ｘ−Ｍａｌの
溶液を２０ｍｌのｐＨ６.０の酢酸ナトリウムに添加し、該アレイをその酢酸塩
溶液中で４５分間インキュベートした。これに続いて（ｐＨ８.５の０.１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ３中の）１Ｍ ＮＨ２ＯＨを添加し、３時間反応させ、水中で該アレイ
をさらに洗浄した。
【００７６】 結合アッセイは、複数のＰＢＡで標識されたＴ１２プローブ、特異的な付着部
位、およびBodipy Texas Red 蛍光色素の電子的アドレス指定を用いて行った（
ＰＢＡｎ−Ｔ１２−ＢＴＲ、ここに、ｎは１と８との間の数である）（４００ｎ
Ａ／捕捉部位、２分間にて、５０ｍＭヒスチジン緩衝液中の５０ｎｍ）。Ｔ１２
−ＢＴＲを非特異的対照として用いて、同一条件下にてアドレス指定した。図１
Ａに示すごとく、ＰＢＡ標識プローブがアドレス指定された捕捉部位（カラム２
および４）は、特異的結合を示した。非常に低レベルの非特異的結合がカラム３
および５に観察された。図１Ｂは、図１Ａにおける結果の平均の棒グラフを示す
。示された結合の全レベルは、パッド当り５×１０７分子の範囲に関連する。か
かるレベルは、公知の先行技術の付着化学に匹敵する。
【００７７】 ｂ）実験２− Ｎ−プロピル−ブロモアセトアミド（ＳＡ（ＯＣＭ）−Ｘ−Ｂ ｒＡｃ）の付着 直前の実験１に記載された基底浸透層を含有したマイクロアレイを窒素下にて
ｐＨ８.２の０.５ＭトリスＨＣｌ中の１００μｌの２０ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ）と共に１時間インキュベートした。次いで、該アレイをｐＨ６.０の
５０ｍＭ酢酸ナトリウムで３回洗浄した。該マイクロアレイをｐＨ＝８の５.０
ｍｌのトリス−ＨＣｌに希釈した１１.０ｍｇのＳＡ（ＯＣＭ）−Ｘ−ＢｒＡｃ
を含有する１.０ｍｌの溶液からの０.４０ｍｌの溶液を含む溶液で処理し、３時
間インキュベートした。該アレイを水で洗浄し、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ３中のＮＨ ２ ＯＨの１Ｍ溶液で処理し、再度多量の水で洗浄した。４００ｎＡ／パッド、２
分間にて５０ｍＭヒスチジン緩衝液中の５０ｎＭのＰＢＡ−Ｔ１２−ＢＴＲの電
子的結合。Ｔ１２−ＢＴＲを非特異的標的として用いて、同一条件下にてアドレ
ス指定した。アドレス指定後、チップを標準的な洗浄プロトコールに付した。図
２４Ａに示すごとく、ＰＢＡ標識プローブがアドレス指定された特異的な捕捉部
位（カラム１および３）は、特異的結合を示した。非常に低レベルの非特異的結
合はカラム２および４に観察された。図２４Ａは、図２４Ａにおける結果の平均
の棒グラフを示す。結合の全レベルは、５×１０７蛍光体／５０００μｍ２パッ
ドの範囲である。かかるレベルは、公知の先行技術の付着化学に匹敵する。
【００７８】 ｃ）実験３−シアノメチル保護サリチリックヒドロキサム酸ＮＨＳエステル（ ＳＡ（ＯＣＭ）−Ｘ−ＮＨＳ）の付着 前記の実験１に記載された基底浸透層を含有したマイクロアレイを第一級アミ
ンを含有するように修飾した。該アレイを窒素下にてｐＨ８.２の０.５Ｍトリス
ＨＣｌ中の１０ｍｌの２０ｍＭ ＤＴＴと共に１時間インキュベートした。次に
、８μｌの０.５Ｍ ３−ブロモプロピルアミンを窒素下、３７℃にて２時間添加
した。これに続いて、０.５Ｍトリス−ＨＣｌ中の９μｌの２Ｍ ＤＴＴを添加し
、３０分間インキュベートし、続いて水で洗浄した。次いで、該アレイを乾燥Ｄ
ＭＦですすぎ、次いで、乾燥ＤＭＦ中の８０μｌの２５ｍＭ ＳＡ（ＯＣＭ）−
Ｘ−ＮＨＳで覆った。トリメチルアミン（８μｌ）を添加し、該アレイを室温に
て２.５時間インキュベートした。次いで、該アレイを乾燥ＤＭＦで３回および
水で３回洗浄した。最後に、（０.１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８.５中の）１Ｍ Ｎ
Ｈ２ＯＨを３時間覆って、続いてチップを水中で洗浄した。
【００７９】 結合アッセイは、２分間の４００ｎＡ／部位を用いる５０ｍＭヒスチジン緩衝
液中のＰＢＡ−Ｔ１２−ＢＴＲ（５０ｎｍ）の電子的アドレス指定によって行っ
た。Ｔ１２−ＢＴＲを非特異的対照として用いて、同一条件下にてアドレス指定
した。プローブをアドレス指定した後、該アレイを前記のごときＳＴＥ中での洗
浄に付した。図３Ａは付着結果を示し、ここに、特異的結合（カラム１および３
）は強力であったが、非特異的結合（カラム２および４）は明らかに低かった。
図３Ｂは、特異的および非特異的な結合間の比の棒グラフを示し、ここに、該レ
ベルは、典型的な付着化学に匹敵した。
【００８０】 かくして、前記の実験から、発明者らは、化学的付着部位が本発明の電子的に
アドレス可能なマイクロアレイの浸透層の反応性中心に結合できることを示した
。さらに、かかる付着は、現行の付着技術に匹敵する。発明者らが本発明の方法
を用いて付着させることを所望する付着化学部位は機能的であるので、発明者ら
は、本発明の接合方法ならびに特異的および非特異的な活性化を用いてそれらの
付着をさらにテストした。
【００８１】実施例２ この実験において、マイクロアレイ上の特定の位置にて生体分子を付着させる
ための化学部位は、予め形成された浸透層上に接合される。一つの具体例におい
て、本発明のために開発された接合方法は、「スラリー」法を含む。この方法は
、アクリルアミドベースのヒドロゲル浸透層上に高密度の接合活性化部位（例え
ば、置換されたアクリルアミドまたはメタクリルアミド単量体）を達成する。本
方法において、高濃度の熱活性化されたイニシエーターを用いて、予め形成され
た浸透層上の接合を得る。
【００８２】 好ましい具体例において、スラリーは、室温にて双方がわずかに可溶である重
合イニシエーターおよび付着単量体から作成される。スラリーは、イニシエータ
ーおよび単量体の粒子は、予め成形されたポリマー層の表面上にあるマイクロア
レイの基底浸透層に適用される。次いで、温度を上昇させて、イニシエーターを
活性化し、粒子を溶解させ、その結果、予め形成されたポリマー層の表面付近で
局所的にイニシエーターラジカルおよび溶解した単量体を高濃度とする。単量体
の付着（すなわち、接合）および単量体の重合は同時に生じ、その結果、浸透層
に重合した官能基が共有結合する。このように、生体分子付着部位（すなわち、
Ｒ部位）を、ポリマー層の上部領域まで主として分離し、引き続いて、下にある
電極または電極の電気化学的な酸化の電気分解産物によって生じ得るいずれかの
有害な効果から単離される。
【００８３】 基板層上の利用可能な部位からだけに起因する付着部位を有するシステムに比
較して、本発明の接合システムは、付着している生体分子についての部位の密度
をかなり増加させ、結果的に非特異的な結合のための背景の減少を可能とする。
【００８４】 実施例２についての実験 ａ）実験１ 基底ヒドロゲル浸透層を、メチレン−ビスアクリルアミドで架橋したアクリル
アミドを含む電子的にアドレス可能なマイクロアレイ上に形成した。基底層の形
成に先立ち、下にある基板をアルゴンプラズマを用いて広範にきれいにした。基
底層をＵＶ重合を用いて作成した（９０％アクリルアミド、１０％ビス、ＤＭＳ
Ｏ／Ｈ２Ｏ（５０／５０の容量／容量）、０.３ｍｇ／ｍｌ Ｄ４２６５でのＵＶ
重合）。形成後、該アレイを７０℃にて１５分間乾燥させ、水ですすいで、別の
時間で乾燥した。
【００８５】 付着層を、１０ｍｌの２０％ＤＭＳＯ/８０％Ｈ２Ｏ中のメタクリルアミドＳ
ＨＡ（Ｍｅｔｈ−ＳＨＡ)（１５ｍｇ/ｍｌ）およびＡＩＢＮ（３０ｍｇ/ｍｌ）
を用いて接合した。該アレイは、この混合物と８０℃にて１時間接触させ、続い
てＤＭＳＯおよび水ですすいだ。同一反応条件を用いてＳＨＡが存在しない対照
アレイを製造した。表ＩＶは、Ｍｅｔｈ−ＳＨＡおよびＡＩＢＮのモル％を供す
る。また、リストされたのは、接合したマイクロアレイを１０μＭ ＰＢＡ−Ａ
ＴＡ５−ＢＴＲに１０分間曝露後に得られたプローブ密度である。
【００８６】
【表６】
【００８７】 ｂ）実験２ この実験において、基底浸透層は、実験例１の前記のごとく作成した。付着層
は、３００μｌの３３％ＤＭＳＯ／６７％水中の５ｍｇのＭｅｔｈ−ＳＨＡおよ
び６ｍｇのＡＩＢＮのスラリー混合物を用いて接合した。１００μｌのスラリー
をアレイ基底浸透層に負荷し、８０℃にて１時間加熱した。次いで、処理したア
レイをＤＭＳＯ、水ですすぎ、乾燥した。また、対照アレイを直前のごとくＳＨ
Ａなくして製造した。表Ｖは、この構築体の結果を示す。この実験において、プ
ローブ密度は、ＳＨＡのない対照よりも約３オーダー大きい。
【００８８】
【表７】
【００８９】 ｃ）実験３ 基底浸透層を持つマイクロアレイを前記のごとく作成した。付着層をアレイ上
に構築して、基底層への付着層の結合の性質をテストした。ＡＩＢＮを用いてい
ない対照アレイを構築した（すなわち、３００μｌの３３％ＤＭＳＯ／６７％水
と混合した５ｍｇのＭｅｔｈ−ＳＨＡ、その１００μｌのスラリーをアレイ上に
層状とし、８０℃にて１時間加熱した）。ＳＨＡおよびＡＩＢＮを用いない第２
の対照アレイを製造した（すなわち、１００μｌの３３％ＤＭＳＯ／６７％Ｈ２ Ｏを８０℃にて１時間加熱した）。表ＶＩに示すごとく、プローブ密度は、前記
の表Ｖに含まれているＳＨＡおよびＡＩＢＮを含むプローブ密度に比較して非常
に低い。従って、ＡＩＢＮは、Ｍｅｔｈ−ＳＨＡの好結果の接合に必要である。
加えて、その結果は、Ｍｅｔｈ−ＳＨＡが基底層に単に拡散するではなく、それ
に共有結合することを示唆する。また、この結果は、ＡＩＢＮのない実験１およ
び２において得られた非特異的な結合のレベルが真の受動的な非特異的な結合か
ら起因し、残っているＭｅｔｈ−ＳＨＡのためではないことを示す。この示唆は
、Ｍｅｔｈ−ＳＨＡなしおよびＡＩＢＮなしでの実験３において得られたポジテ
ィブな非特異的な結合のレベルが実験１および２でテストされたアレイに対して
得られたシグナルより実際上大きいものであるという事実から導かれる。
【００９０】
【表８】
【００９１】 図４は、前記の実験の結果をまとめる。示されるごとく、付着レベルは、捕捉
部位当り１０８〜１０９のオーダーのプローブ密度のハイブリダイゼーションを
生じ得る。図４のエントリー３および４は、適用された付着化学の安定性を示す
。（「ＳＨＡ有り／ＡＩＢＮ有り／４０時間浸漬後」で標識された）エントリー
３は、４０時間水に浸漬した後のエントリー２の平均の平均結合強度を示し、蛍
光におけるわずかな損失だけを示す。次いで、エントリー４は、蛍光体での特異
的なＤＮＡに対するさらなる曝露でのシグナルの回復を示し、浸透層に対して付
着システムが傷つけられないことを示す。 ｄ）実験４ マイクロアレイは、実験１に前記されたごとき標準的な基底浸透層で覆った。
次いで、それらをイニシエーターとしてＡＩＢＮを用いるブロモアセチル−プロ
ピル−メタクリルアミド（ＢａｃＭａｃ）でスラリー接合し（５ｍｇ ＢａｃＭ
ａｃ、８０℃にて１時間）、次いで、標準条件にて激しく洗浄した。
【００９２】 結合アッセイは、末端のチオール、末端のホスホロチオエート、非還元のジス
ルフィドで修飾したか、あるいは修飾していないＢＴＲ標識ブローブを用いて行
った。該プローブは、５０ｍＭ β−アラニン、３０秒、および部位当り５０、
１００、２００、４００および８００ｎＡの電流で捕捉部位に電子的にアドレス
指定した。アドレス指定後、該アレイを０.２×ＳＴＥ、１％ＳＤＳおよび水で
洗浄し、次いで、画像化した。図２は、非還元のジスルフィドで置換されたＢＴ
Ｒ標識Ｔ１１（プローブ６ａ１９）が結合を与えなく、置換していないＢＴＲ標
識Ｔ１１（ＲＣＡ７）が背景だけを与え、末端チオールを有するＢＴＲ標識Ｔ１
１（プローブ６ａ１９.ｂ）が特異的付着を与えて、ホスホロチオエートで置換
されたＢＴＲ標識Ｔ１１（プローブ１３ａｌ）が特異的な付着を与えた。特異的
付着レベルは、接合重合技術から生じた潜在的な結合部位数の増加のために実施
例１に示されたレベルより優れている。
【００９３】実施例３ この実施例において、マイクロアレイ上の特定の位置での生体分子の付着につ
ての化学部位は予め形成された浸透層上に接合する。一つの具体例において、本
発明につき開発された接合方法は、「溶液」方法を含む。この方法は、アクリル
アミド−ベースのヒドロゲル浸透層上の高密度の接合した活性化部位（例えば、
置換されたアクリルアミドまたはメタクリルアミド単量体）を達成する。この方
法において、高濃度の熱活性化イニシエーターを用いて、予め形成された浸透層
上の接合を得る。
【００９４】 好ましい具体例において、溶液は室温にて双方が可溶性である重合イニシエー
ターおよび付着単量体から作成する。該溶液をマイクロアレイの基底浸透層に適
用し、次いで温度を上昇させてイニシエーターを活性化させ、その結果、予め形
成されたポリマー層の表面付近に局所的にイニシエーターラジカルおよび単量体
を高濃度とする。単量体の付着（すなわち、接合）および単量体の重合は同時に
生じる結果、浸透層に対して重合した官能基が共有結合的に付着する。このよう
に、生体分子付着部位（すなわち、Ｒ部位）は、ポリマー層の上部領域に主に分
離され、結果的に下にある電極の電気分解産物および電極での直接的な電気化学
的な酸化によって生じ得るいずれかの有害な効果から単離される。
【００９５】 基板層上の利用可能な部位からだけ起因する付着部位を有するシステムに比較
して、本発明の接合システムは、接合している生体分子の密度をかなり増加させ
、その結果、非特異的結合のための背景の減少を可能とする。
【００９６】 共有結合を達成するための接合した単量体の付着は、かなりの数の方法によっ
て開始できる。例えば、接合は、イニシエーターの熱分解（例えば、ＡＩＢＮ、
過酸化ベンゾイル）、イニシエーターの光分解開裂（例えば、Ｄ４２６５のＵＶ
開始）、酸化還元反応（例えば、硫酸セリウム（ＩＶ））、電離放射線（例えば
、α、β、γまたはＸ線）またはプラズマ開始（例えば、アルゴン、窒素、酸素
）を用いることができる。さらに、接合プロセスは、反応前に活性化されなけば
ならない化学部位を用いてアレイの予め決定された位置に特に指向できる。
【００９７】 実施例３：実験１ この実験において、基底浸透層は、前記の実施例２の実験１のごとく作成した
。付着層は、３００μｌ ＤＭＳＯ中の５ｍｇ Ｍｅｔｈ−ＳＨＡおよび６ｍｇ
ＡＩＢＮの溶液を用いて接合した。１００μｌの溶液をアレイ基底浸透層上に負
荷し、８０℃にて１時間加熱した。次いで、処理したアレイは、ＤＭＳＯ、水で
すすぎ、乾燥した。
【００９８】 図１７Ｂは、電子的逆ドットアッセイの結果を示す棒グラフであり、ここに、
該捕捉プローブは、５００ｎＡ／パッドにて１分間、アドレス指定し、続いて、
４００ｎＡ／パッドにて２分間、特異的および非特異的なＢＴＲ標識６９−ｍｅ
ｒ標識アドレス指定（５００ｐＭ濃度）した。画像化に先立ちチップを１％ＳＤ
Ｓおよび０.２×ＳＴＥで広範囲に洗浄した。
【００９９】 カラム３は、特異的標的でアドレス指定し、カラム１および５は、非特異的標
的でアドレス指定して、カラム２および４はアドレス指定しないままであった。
画像は、図１７Ａに示す前記のごときストリンジェントな洗浄後に記録した。図
１７Ｂに示すごとき棒ブラフは、７×１０７プローブ／パッドの特異的結合を持
つＢＴＲ標識標的の特異的結合についての高い識別を示す。前記の実験の結果は
、生体分子の付着についての個々の官能基ならびに他の官能基の第１層を設ける
溶液接合方法の利用性を示す。
【０１００】 実施例４ 「プラズマ接合」方法を用いるさらなる実験を行った。この具体例において、
アレイを９：１のアクリルアミド／ビス−アクリルアミド重量／重量を含む基底
浸透層で被覆した。次いで、該アレイをアルゴンプラズマ（５０Ｗ、１００ＳＣ
ＣＭ）で処理し、続いて、ＤＭＳＯまたは１：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中のいずれ
かのメタクリルアミド−サリチルヒトロキサム酸（ＭＡ−ＳＨＡ）の溶液で５分
間覆った。該アレイを水で洗浄し、乾燥させた。接合の程度は、ＰＢＡ−Ｔ１２
−ＢＴＲプローブのポジティブまたは電子的な付着によって決定した。図５は、
種々の条件下にて接合したアレイ上のＰＢＡ−Ｔ１２−ＢＴＲプローブのポジテ
ィブな結合を示す。特に、これらのアレイは、該アレイが１分間のアルゴンプラ
ズマで接合した条件下にて捕捉部位当り約２×１０７のプローブ密度を与えた（
図５は、対応するＭＦＩ／秒レベルに対応して示す）。図６は、２分間のアルゴ
ンプラズマで接合したアレイに対する種々の電子的アドレス指定条件に続いての
プローブの結合を示す。捕捉部位当り１×１０７プローブにて電子的にアドレス
指定されたアレイについての付着レベル（２００ｎＡ、３０秒間にて電子的なバ
イアスをかけた）。比較すると、スラリー接合は、部位当り２×１０８プローブ
の範囲の付着レベルを与えた。
【０１０１】 実施例５ この実施例において、官能基との付着に先立って活性化されなけばならない活
性中心Ｒを有する浸透層を形成する。加えて、本実施例は、官能基の結合が該ア
レイの捕捉部位だけに生じるような電子的なバイアスを用いて特異的な付着を行
う能力を提供する。
【０１０２】 基底浸透層は、塩酸３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）メチレ
ンビス−アクリルアミド（ＢＩＳ）およびアクリルアミド（Ａｍ）の水溶液（３
０％固体）から、各々、５−５−９０のモル％比を用いて製作した。Ｎ,Ｎ,Ｎ',
Ｎ'−テトラメチルエチレンンジアミンを０.２容量／容量％にて、続いて、０.
２容量／容量％の単量体混合物に対して最終濃度にて０.５ｇ／ｍｌの過硫酸ア
ンモニウムを添加した。この溶液の７.５μｌを従前にシラン化（３−トリメト
キシシリルプロピルメタクリレートまたはＴＭＳＰＭ）した電子的にアドレス可
能なマイクロチップのアレイ上に置き、次いで、（Cleveland OhioのBlue Coal-
Slick 50社によって製造されたRain-XTMのごとき）疎水性シリコーン溶液で従前
に処理したカバーガラス片で覆った。該単量体溶液は、室温にて９０分間重合さ
せた。被覆したマイクロチップをカバー片から取り出し、よく洗浄して、残りの
単量体を除去した。遊離アミンを持つ被覆したマイクロチップをＤＭＳＯ中の１
.５ｍｇ/ｍｌの４−（Ｎヒドロキシスクシンイミジル）−４−メルカプト−（メ
チルエステル）フタネート（ＳＡＴＰ）および０.１ＭのｐＨ７.５のリン酸緩衝
液の溶液と反応させた。一晩反応させた後、該マイクロチップを緩衝液、ＤＭＳ
Ｏおよび水で洗浄して、未結合のＳＡＴＰを除去した。ＳＡＴＰとアミンとの反
応は、チオエステル、ゆえに浸透層の誘導体化を与えた。そのチオエステル官能
基は、高または低ｐＨ条件に対してさらに曝露した（すなわち、活性化）後、遊
離チオールを含む能力を持つ浸透層表面を提供した。図７は、遊離チオール生成
の反応図式を示す。
【０１０３】 チオエステルの活性化を正または負のバイアスのいずれかを用いて特異的な微
小電極位置（すなわち、捕捉部位）にバイアスをかけることによって達成した。
しかしながら、ｐＨ変化が電極上で局在化したままであることを保証するために
、適当な緩衝液システムをバイアス条件の間に選択した。緩衝条件が余りも強い
ならば、電極上のｐＨ変化は、最小化または消失しかねず、それによって、官能
基の活性化を妨げる。また、緩衝液が余りも弱いならば、ｐＨ変化は局在化せず
、捕捉部位の位置の範囲を超えて浸透層の活性化を可能とする。加えて、適当な
電流をバイアス手順の間に選択した。余りにも小さな電流は、チオエステル結合
を加水分解するのに必要とされる十分なｐＨ変化を生成しないであろう。また、
電流が余りにも大きいならば、緩衝液は、ｐＨ変化を局在化するのを保つたため
の困難な時間を有するであろう。
【０１０４】 この実施例において、３つの緩衝液条件を比較した。１つの実験において、緩
衝液は、ｐＨ６.８の０.１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭトリエチルアミンを含有
した。捕捉部位（直径８０μｍ）を位置当り６００ｎＡの電流にて１分間バイア
スをかけた。３'Ｈｅｘ蛍光体および５'ヨードアセトアミドを有した、チオール
反応性官能基の２０塩基のヌクレオチドをｐＨ７.５の０.１Ｍリン酸ナトリウム
水溶液、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の２０μＭ溶液として調製した。次いで、ＤＮＡオ
リゴマーを活性化したマイクロチップ浸透層と受動的に反応させた。緩衝液と水
で何回かチップを洗浄後、チップを表面蛍光顕微鏡（epifluorescence micro-sc
ope）下にて画像化した。図８に示すごとく、Ｈｅｘ標識ＤＮＡは、６００ｎＡ
／パッドを用いて付着部位にバイアスをかけた場合、背景を超える非常に高い比
まで捕捉パッドに付着した。この結果は、適当な緩衝液系についての必要性およ
びチオエステル開裂および引き続いての官能基付着のための適当なｐＨ変化を生
成するのに必要な電流レベルに対する感度を示す。これらの試験に用いた電流で
の非リン酸緩衝液は、捕捉部位にて局所ｐＨに対する有用な効果を供しなかった
。
【０１０５】 図９は、特定の捕捉部位で付着したチオール基を有したおよび標識されたオリ
ゴマーと反応したマイクロチップをさらに処理して、未反応チオール基がキャッ
ピング部位の使用を介して不活性となり、それによって、マイクロチップ捕捉部
位の特異性をさらに増強するこの例のもう一つの具体例を示す。
【０１０６】 さらに、この例によって用いることができる活性化を必要とする基には、アセ
タール、ケタール、イミン、ＴＢＯＣ、ＦＭＯＣ、トリチル、トリフルオロアセ
トアミド、他のエステルのごとき様々な酸不安定部位、および除去または加水分
解できる部位が含まれる。この具体例に有用な基底不安定部位には、除去または
加水分解できるエステル、アミド、置換されたリン酸塩、トシル、メシル、トリ
フレートおよびβ−シアノエチル部位が含まれる。
【０１０７】 また、活性化を必要とする部位を用いて、蛋白質固有の部位または選択された
部位を付加する修飾を介して、酵素のごとき蛋白質を特異的に付着できる。
【０１０８】実施例６ この実施例において、反応性中心Ｒが誘導体化された生体分子の付着に先立ち
活性化しなければならない具体例を供する。この実施例は、官能基のＰおよびＲ
部位が生体分子を付着する所望の方法に依存して変更できる。
【０１０９】 アセタール部位は、活性化される場合、アルデヒド基が非捕捉部位アレイ表面
を除外して捕捉部位上に特異的に形成されるようにヒドロゲル形成に組込まれる
。アセタール基の使用は、様々な条件下にて反応でき、それによって捕捉部位で
生体分子を付着するための様々な化学試薬および変形の使用を可能とする官能基
を供する。例えば、アルデヒド反応性基とヒドラジドとの反応は、酸化リボース
末端オリゴヌクレオチドの付着を可能とする。もう一つの例は、アルデヒドとア
ミン末端オリゴヌクレオチドとの直接的反応である。また、同様に、ビオチン化
オリゴヌクレオチドに結合するために、アルデヒドと、ストレプトアビジンのご
とき蛋白質のアミン基とを反応できる。
【０１１０】 この具体例において、アセタール部位を含む反応性中心Ｒをヒドロゲル形成に
組込み、アセタール機能性を含む浸透層を得る。このアセタール機能性を活性化
し、アセタール基の電気化学的に生じた酸加水分解を介してアルデヒド機能性に
変換できる。水の電気化学的な酸化を用いて、アセタールを加水分解するのに必
要な酸性条件を生成する。次いで、アルデヒド基を用い、ジヒドラジン、アミン
末端オリゴヌクレオチドならびにビオチン化したオリゴヌクレオチドおよびスト
レプトアビジンを含む酸化リボースオリゴヌクレオチドの使用のごとき様々な付
着反応図式によってＰ−Ｘ−Ｒ官能基を用いて、オリゴヌクレオチドのごとき生
体分子を浸透層に結合する。
【０１１１】 特に、この実施例で用いたごときアセタール単量体（３,９−ジビニル−２,４
,８,１０−テトラオキサスピロ［５,５］ウンデカン、および２−ビニル−１,３
−ジオキソラン）を架橋したアクリルアミドヒドロゲル中の共重合体によって浸
透層マトリックスに組込んだ。その結果は、アセタール機能性を含むアレイ上に
覆ったヒドロゲルである。アセタール基は、引き続いて電気化学的に生成した酸
を介してアルデヒド基に加水分解した。加水分解に必要な低ｐＨは、０.１Ｍ Ｋ
Ｃｌ溶液中の水の電気化学的酸化によって生成する。次いで、アルデヒドは、Ｐ
−Ｘ−Ｒ官能基、結果的にオリゴヌクレオチド生体分子についての付着部位とし
て用いた。
【０１１２】 ３つの付着反応図式を評価した。反応図式１において、アルデヒドは、アジピ
ン酸の（adipic）ジヒドラジドでの反応、続いて、酸化リボース末端オリゴヌク
レオチドでの処理を介してヒドラジドに変換した。アセタールは、共重合した２
−ビニル−１,３−ジオキソランを介して誘導した。反応図式２において、アル
デヒドをアミン末端オリゴヌクレオチドと反応させた。この場合、アセタールは
、２−ビニル−１,３−ジオキソランの共重合を介して誘導した。反応図式３に
おいて、アルデヒドをストレプトアビジン（Ｓ）上のアミン基と反応させ、引き
続いて、ビオチン化オリゴヌクレオチドに付着させた。この反応図式を架橋アク
リルアミドヒドロゲル上で用い、２−ビニル−１,３−ジオキソランまたは３,９
−ジビニル−２,４,８,１０−テトラオキサスピロ［５,５］ウンデカンのいずれ
かと接合した。これらの反応図式の特定の詳細を以下に提供する（図１０参照）
。これらの反応図式における異なる官能基の使用は、アセタール機能性が式Ｐ−
Ｘ−Ｒの異なる官能基に一般的であることを示す。さらに、それは、付着が注目
する特異的部位に対して制御できることを示す。
【０１１３】 実施例６ 実験 ａ）反応図式１ ９２.５％アクリルアミド、５％メチレン−ビスアクリルアミドおよび２.５％
３,９−ジビニル−２,４,８,１０−テトラオキサスピロ［５,５］ウンデカンを
含有するヒドロゲル基底浸透層を作成した。（３０％固体）ヒドロゲルで覆った
マイクロアレイを、ヒドロゲル層の重合に先立ちアルゴンプラズマ（１０分間）
を用いて広範囲にきれいにした。重合をＵＶイニシエーターとして３ｍｇ／ｍｌ
のＶＡＯ４４の添加およびＵＶ光への曝露によって開始した。６５℃での１０分
間の引き続いての加熱を用いて、完全な硬化を保証した。ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（５
０／５０ 容量／容量）を溶媒として用いた。
【０１１４】 マイクロアレイは、５捕捉部位毎に５行を含んだ。行１、３および５は、０.
１Ｍ ＫＣｌ中で６００ｎＡ／部位にて２分間バイアスをかけ、水で完全にすす
いだ。次いで、マイクロアレイを３２ｍｇ／ｍｌのアジピックジヒドラジドを含
有する１ｍｌの０.１Ｍリン酸塩に１.５時間浸漬した。水でのすすぎを介した後
、アレイをｐＨ７.４の０.１Ｍリン酸緩衝液中で１０μＭ酸化リボ−Ｕ ＡＴＡ
５で２０分間インキュベートした。アレイを０.２×ＳＴＥ／１％ＳＤＳですす
ぎ、次いで、０.２×ＳＴＥですすいで、いずれの酸化リボ−Ｕ ＡＴＡ５も除去
した。次いで、アレイをｐＨ７.４の０.１Ｍリン酸／５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液
中のBodipy−Texas Redで標識した１０μＭ ＲＣＡ５で２０分間インキュベート
した。（ＡＴＡ５およびＲＣＡ５は相互の完全相補体である）ハイブリダイゼー
ション後に、該アレイを０.２×ＳＴＥ／１％ＳＤＳですすぎ、次いで、０.２×
ＳＴＥですすいで、Bodipy−Texas Redで標識したいずれのＲＣＡ５も除去した
。
【０１１５】 ３,９−ジビニル−２,４,８,１０−テトラオキサスピロ［５,５］ウンデカン
は、低ｐＨに曝露した場合にアルデヒドを形成するアセタール含有化合物である
。０.１Ｍ ＫＣｌ中の６００ｎＡ／部位での２分間の特異的部位のバイアスは、
適当なレベルのプロトンを生成し、アセタール基を加水分解した。次いで、これ
らのアルデヒド基は、Ｐ−Ｘ−Ｒ官能基（すなわち、アジピンジヒドラジド）と
反応させ、正にバイアスをかけた捕捉部位だけにアルデヒドを付着させた。酸化
したＡＴＡ５オリゴ（すなわち、誘導体化した生体分子）は、ジアルデヒド基を
有し、次いで、それをＲ部位ヒドラジドと反応させた。図１１は、選択された部
位での特異的活性化、または特異的な活性化なくして（すなわち、非特異的結合
）に続いてのＡＴＡ５への標識した生体分子のＲＣＡ５−ＢＴＲの付着結果を示
す。ハイブリダイゼーションは、部位当り６００ｎＡにて２分間の正のバイアス
の特異的活性化を用いた場合、背景を超えて引き起こされた。
【０１１６】 ｂ）反応図式２ この具体例において、ヒドロゲル基底浸透層は、８５％アクリルアミド、５％
メチレン−ビスアルキルアミドおよび５％の２−ビニル−１,３−ジオキソラン
よりなった。マイクロアレイを、ヒドロゲル層の重合に先立ちアルゴンプラズマ
（１０分間）を用いて広範囲にきれいにした。重合をイニシエーターとして、０
.３ｍｇ／ｍｌのＤ４２６５の添加によって開始し、ＵＶ光に曝露した。７０℃
までの３０分間の引き続いての加熱を用いて、硬化を保証した。ＤＭＳＯ／Ｈ２ Ｏ（５０／５０の容量／容量）を溶媒として用いた。
【０１１７】 図１２は、生体分子の特異的付着の結果を示す棒グラフであり、ここに、選択
された捕捉部位は０.１Ｍ ＫＣｌ中で６００ｎＡ／捕捉部位にて２分間バイアス
をかけてＲ部位アセタールをアルデヒドに活性した。活性化後、アレイを水で完
全にすすいだ。次いで、マイクロアレイをTexas Redで標識した１０μＭのアミ
ン末端ＡＴＡ７を含有するｐＨ８の０.１Ｍリン酸緩衝液の５０μｌの溶液で被
覆した。３０分間インキュベートした後、マイクロアレイを０.２×ＳＴＥ／１
％ＳＤＳですすぎ、次いで、０.２×ＳＴＥですすいで、いずれの未結合のアミ
ン末端Texas Red標識のＡＴＡ７も除去した。
【０１１８】 図１２によって示すごとく、付着は、６００ｎＡ／捕捉部位にて２分間バイア
スをかけた電極だけに生じた。付着レベルは、部位当り約１０７プローブであっ
た。この例は、アセタール基の電気化学的に生成した酸加水分解によって形成さ
れたアルデヒド基へのアミン末端オリゴヌクレオチドの直接的な付着を示した。
【０１１９】 ｃ）反応図式３ この具体例において、基底浸透層は、９０％アクリルアミドおよび１０％メチ
レン−ビスアクリルアミドよりなった（１／１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中３０重量％
）。Ｄ４２６５をＵＶイニシエーターとして用いて、試料をＵＶ光に曝露した。
アレイを６０℃にて１時間硬化させ、すすぎ、次いで６０℃にて乾燥させた。
【０１２０】 この例において、ビニルアセタール部位は、第１のＰ−Ｘ−Ｒ官能基［式中、
Ｐはビニルであり、Ｘは化学結合であって、Ｒはアセタールである］を含むと考
えることができる。該アセタール部位は、アルケン部位の重合を通じる「スラリ
ー」接合を介して浸透層の反応性中心に結合された。この重合プロセスは、スラ
リー接合法の適用可能性を例示する。
【０１２１】 スラリーアプローチは、イニシエーターおよび官能基が室温にて不完全に可溶
であり、かくして、イニシエーターおよび官能基のスラリーを創製する溶媒系を
用いる。イニシエーターおよび官能基の粒子は、浸透基底層の表面の表面上外に
位置する。９０℃までの温度の増加に際して、イニシエーターは、反応性となり
、スラリーの成分を溶解させて、予め形成されたポリマー基底層の表面付近に局
所的に高濃度の官能基およびイニシエーターを生じる。この結果、ヒドロゲルへ
の官能基の付着部位Ｐの共有結合を生じる。この実施例において、アセタール単
量体は、等重量のビニルアセタールおよびイニシエーターとして機能するＡＩＢ
Ｎを用いて浸透層上に接合した。５ｍｇの単量体およびＡＩＢＮは、１００μｌ
ＤＭＳＯに溶解させ、次いで、２００μｌの水の添加でスラリーとした。接合は
、マイクロアレイ表面上への５０μｌのスラリーの添加および９０℃での１時間
インキュベートし、続いて、多量のＤＭＳＯおよび水での洗浄によって達成され
た。
【０１２２】 第２のＰ−Ｘ−Ｒ官能基［式中、Ｐがアミンであり、Ｘが化学結合であって、
Ｒがストレプトアビジンである］をストレプトアビジンの形態にて添加した。こ
の官能基を電気的脱保護（０.１Ｍ ＫＣｌ中の３００ｎＡ／捕捉部位、４５〜６
０秒）の後に（この場合、Ｒ部位はアルデヒドを含む）活性化部位に結合した。
この工程は、アセタール基の電気化学的に生じた酸性加水分解を引き起こし、注
目する捕捉部位の直上にアルデヒドを形成した。ストレプトアビジン官能基（１
ｍｇ／ｍｌ）を１時間受動的に適用し、続いて今後はシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウムで洗浄した（１時間）。
【０１２３】 前記工程は、テストマイクロアレイ上で行われ、ここに、カラム１〜４はアセ
タールで接合し、活性化してアルデヒド部位を生成し、官能基ストレプトアビジ
ンを付加した。カラム５は、非特異的付着を調べるためのアセタール表面として
残した。カラム１および３は、電極当り４００ｎＡにて２分間Bodipy Texas Red
で標識した５０ｎＭのビオチン化Ｔ１２で電子的にアドレス指定した。カラム２
および４は、Bodipy Texas Redで標識した５０ｎＭのビオチン化していないＴ１
２で電子的にアドレス指定した。かくして、カラム１および３は特異的な付着を
提供し、一方、カラム２および４は非特異的な付着を提供した。次いで、該マイ
クロアレイを少なくとも１０分間０.２×ＳＴＥ、１％ＳＤＳ中で洗浄し、すす
ぎ、さらに１０分間０.２×ＳＴＥに浸漬した。最後に、該アレイを水中ですす
ぎ、ヒスチジン緩衝液中で画像化した。
【０１２４】 図１３は、全アレイが１０μＭ溶液としてのビオチンＴ１２−ＢＴＲに１時間
曝露させた前記の製作したマイクロアレイの結果を示す。示されるごとく、結合
は、カラム１〜４にて生じたが、カラム５では生じなく、すなわち、結合は、特
異的に活性化された部位だけに生じた。
【０１２５】 図１４において、アレイは、前記ごとく製造したが、カラム１および３は３０
０ｎＡ／部位にて３０秒間活性化し、一方、カラム３および４は６０秒間曝露さ
せた。活性化後、アレイをストレプトアビジンと反応させ、カラム１および３上
の特定の部位で電子的にアドレス指定し、カラム２および４は、非特異的なプロ
ーブ（ビオチン化していないオリゴ）でアドレス指定した。捕捉部位の蛍光分析
は、電子的な活性化の量の指標が官能基の結合に重要であることを提供した。示
されるごとく、カラム１はカラム３と比較して蛍光強度を有さず、これはカラム
１の部位上のストレプトアビジンの欠如を示す。かくして、用いた条件下での活
性化の時間は、カラム１部位にて完全な活性化を供するのに十分ではなかった。
カラム１、２および４に記録された蛍光値が図１４に示すごとき同様の数値を有
することは興味深い。カラム４に用いたオリゴがストレプトアビジンに結合する
ためのビオチンを欠くが、カラム１および２が十分なストレプトアビジンを欠く
という事実は、非特異性が、部分的に、多孔性浸透層中へのオリゴを駆動する電
流のためであり得ることを示唆する。
【０１２６】 非特異的な結合をさらにテストするために、アレイを前記のごとく調製した。
カラム１および３はビオチンＴ１２−ＢＴＲでアドレス指定し、続いて５０ｍＭ
ヒスチジン緩衝液でアレイを洗浄し、今度はカラム２および４をビオチン化され
ていないプローブでアドレス指定した。図１５に示されたごとく、非特異的結合
に対する特異的結合は非常に明確であった。いくらかの背景がカラム２および４
で観察されたという事実は、図１６に示されたさらなる研究をまだ刺激し、ここ
に、ビオチンＴ１２−ＢＴＲをカラム１、３および５にアドレス指定し、洗浄し
、画像化した。示すごとく、カラム１および３は、期待されたごとくハイブリダ
イズされ、一方、今まで活性化されなかったカラム５は限界背景を示した。これ
らのデータは、受動的な結合およびオリゴ捕捉の双方が起こり、限界レベルの背
景を生じることを示唆する。
【０１２７】 前記の実験の結果は、個々の官能基（すなわち、アセタール）の一次層の下に
あり、および第２の官能基層（すなわち、ストレプトアビジン部位）を結合する
スラリー接合方法の利用性を示す。加えて、その結果は、緩衝液中の電気化学的
に発生したｐＨ変化を用いるマイクロアレイ上の特に選択された部位にて活性化
機能性部位の利用性を示す。さらに、ヒドロゲルポリマー浸透層への官能基の接
合およびオリゴヌクレオチドの電子的なアドレス指定は、特異的および非特異的
な付着のレベルに対する情報を提供する。さらに、２−ビニル−１,３−ジオキ
ソランまたは３,９−ジビニル−２,４,８,１０−テトラオキサスピロ［５,５］
ウンデカン官能基では、特異的な電子的な付着密度は、部位当り１０８プローブ
のオーダーにあり、一方、非特異的なものは１０ないし１００倍小さかった。
【０１２８】 前記は、本発明の具体例の例示であることを意図し、何ら本発明を限定するも
のではない。本発明は、特定の修飾に関して記載されているが、種々の同等物、
変更および修飾はその精神および範囲から逸脱することなく行うことができ、か
かる同等な具体例は本明細書に含まれるべきものであると理解されるので、その
詳細は限定として構築されるものではない。個々の各刊行物または特許出願は、
特におよび個々に示されて、出典明示して本明細書の一部とみなされるような同
一の範囲まで出典明示して本明細書の一部とみなす。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、アレイ表面上のマレイミドの付着後のプローブ付着密度
の結果を示す。図１Ａは、カラム２および４が特異的結合につき二連であり、一
方、カラム３および５は、非特異的結合につき二連である。カラム１は、標識プ
ローブがアドレス指定されていないゼロ結合対照である。図１Ｂは、ＭＦＩ／秒
で表された特異的結合と非特異的結合との間の相対的な差を示す棒グラフである
。このレベルは、１×１０７の結合密度に対応する。
【図２】 図２は、ブロモ−アセトプロピルメタクリルアミド付着層を持つ基底浸透層（
３０％の９：１のアクリルアミド／Ｎ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド比）が
プローブでアドレス指定された実験の結果を示す棒グラフである。プローブオリ
ゴは、５００ｎＭで存在し、β−アラニンは５０ｍＭにて存在した。アドレス指
定時間は３０秒間であって、該アレイを検出に先立ち０.２×ＳＴＥおよび１％
ＳＤＳで洗浄した。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、拘束されたアミンまたはアミンエステルとのアクリレー
トエステルの重合に続いてのプローブ付着密度の結果である。図３Ａは、カラム
１および３が二連の特異的結合であり、一方、カラム２および４が二連の非特異
的結合である顕微鏡写真である。図３Ｂは、特異的および特異的な結合の相対強
度を示す。強度は、行１から行５までの光強度勾配の増加のために、行１から行
５まで増加している。
【図４】 図４は、スラリー接合技術を用いる接合実験の結果を示す棒グラフである。
【図５】 図５は、種々のプラズマ接合条件を使用するプラズマ接合方法に続いてのプロ
ーブの受動的付着を示す棒グラフである。
【図６】 図６は、プラズマ接合方法に続いてのプローブの電子的付着を示す棒グラフで
ある。該グラフは、種々のアドレス指定条件下にてプローブ結合レベルを示す。
【図７】 高または低ｐＨのいずれかによるチオエステル開裂は活性化したチオール基を
与え、今度はそれが生体分子を付着するための化学部位に結合できるか、あるい
はポリマーを付着するための化学部位に結合できる。
【図８】 図８は、官能基付着を援助するための電子的に発生したｐＨ変化に続いて捕捉
部位にて標識したＤＮＡオリゴマーのその検出または欠如を示す棒グラフである
。該グラフは、３つの異なる緩衝液を用い、２００、４００および６００ｎＡに
て１分間バイアスをかける付着の結果を示す。用いた緩衝液は、ｐＨ６.８の０.
１Ｍ ＮａＰＯ４／トリエチルアミン；モルホリノエタンスルホン酸；および酢
酸ナトリウムであった。
【図９】 図９は、捕捉部位（マイクロロケーション）にてチオエステルの特異的活性化
に続いてかかる捕捉部位だけにて生体分子を特異的に結合し、非捕捉部位の位置
にて未反応基をキャッピングすることを示す模式図である。この図において、付
着化学には、高密度の生体分子付着の付着を達成するための非電子的付着および
特異的な電子的バイアスの双方の使用が含まれた。
【図１０】 図１０は、アセタール反応性中心を使用する異なる付着反応図式についての３
つの反応性配列を示す。
【図１１】 図１１は、アセタール基を含む特異的捕捉部位が活性化された具体例（図１０
の反応図式１）からの結果を示す棒グラフである。
【図１２】 図１２は、特異的捕捉部位が活性化された具体例（図１０の反応図式２）から
の結果を示す棒グラフである。
【図１３〜１６】 図１３ないし１６は、特異的活性化の種々の結果および標識プローブの結合（
図１０の反応図式３）を示す顕微鏡写真である。図１３は、電子的に脱保護した
パッド上の受動的付着を特に示す。図１４は、アルデヒドへのアセタールの十分
な脱保護のために必要な電子条件を示す。図１５および１６は、脱保護されたア
セタール部位上の標識捕捉分子の特異的および非特異的な付着を示す。
【図１７】 図１７Ａおよび１７Ｂは、ＳＨＡメタクリルアミド誘導体の溶液接合に続いて
のプローブ付着密度の結果を示す。図１７Ａは、カラム３が特異的結合であるが
、カラム１および５が二連の非特異的結合である顕微鏡写真である。図１７Ｂは
、特異的および非特異的な結合の相対強度を示す。
【図１８】 図１８は、Ｐ、ＸおよびＲ部位の例を示す。これらはいずれの組合せでも混合
および対合できる。
【図１９および２０】 図１９および２０は、浸透層へのＰ−Ｘ−Ｒ基の付加の種々の変更の模式的ダ
イアグラムを示す。図２０は、図１９より詳細な化学構造を示す。
【図２１】 図２１は、メタクリルアミドがＰであり、Ｘが化学結合であって、ＲがＳＨＡ
である式Ｐ−Ｘ−Ｒの官能基の付着化学の一形態を示す。
【図２２】 図２２Ａは、スラリー接合についての反応図式を示し、ここに、イニシエータ
ーＡＩＢＮは、基底層上の溶液から析出し、一方、メタクリルアミド単量体を含
む官能基が共沈し、該表面上の溶液中に部分的に残っている。加熱および／また
はＵＶ照射のいずれかを使用して、ＡＩＢＮ形成の反応性遊離ラジカルを反応さ
せる。該遊離ラジカルは、ポリマーについての付着部位を供する基底浸透層マト
リックスから水素を取り除く。 図２２Ｂは、図２２Ａに示されたプロセスについての化学的メカニズムの詳細
を示す。
【図２３】 図２３は、求核性ヒドラジド修飾した基底浸透層を強力な親電子物質のアクリ
ロイル−ＮＨＳエステルに曝露する本発明の具体例を示す。反応に際して、アク
リロイル基は浸透層に固定され、重合されるであろう。
【図２４】 図２４Ａおよび２４Ｂは、先行技術において記載された方法のごときブロモア
セトアミド結合を介するＳＨＡの付着に続いてのプローブ付着密度の結果を示す
。図２４Ａは、カラム１および３が特異的結合であるが、カラム２および４が非
特異的結合である顕微鏡写真である。カラム５はアドレス指定されていない。図
２４Ｂは、特異的および非特異的な結合の相対強度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールズ・エイチ・グリーフ アメリカ合衆国92065カリフォルニア州ラ モーナ、オークリー・ロード16345番 (72)発明者 グレゴリー・ジェイ・ケボーキアン アメリカ合衆国92529カリフォルニア州テ メキュラ、カミノ・ピエドラ33490番 (72)発明者 ジェーン・クロッツ アメリカ合衆国92126カリフォルニア州サ ンディエゴ、ウエストリー・プレイス6913 番 (72)発明者 クリスティー・エル・リクスタッド アメリカ合衆国92128カリフォルニア州サ ンディエゴ、ナンバー309、カミニト・カ ンティレナ18622番 (72)発明者 ダニエル・イー・レイモンド アメリカ合衆国92129カリフォルニア州サ ンディエゴ、キカ・コート・ナンバー 2813、9928番 (72)発明者 ハワード・アール・リーズ アメリカ合衆国92064カリフォルニア州ポ ーウェイ、アパートメント121、オーク・ ノール12604番 (72)発明者 レジーナ・ルーニー アメリカ合衆国92037カリフォルニア州 ラ・ホラ、トーレイ・パインズ・ロード・ ナンバー302、2500番 (72)発明者 ジョン・ジェイ・スコット アメリカ合衆国47901インディアナ州ラフ ァイエット、サウス・４ストリート425番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 CC02 CC03 CC08 FA12 FA15

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マイクロアレイ生体分子および／または第２の化学基に付着
    するための第１の化学基を含む浸透層を持つ電子的にアドレス可能なマイクロア
    レイであって、第１の該基が、式： Ｐ−Ｘ−Ｒ ［式中、Ｐは、該マイクロアレイの結合用および／または該第２の化学基の部位
    の結合用の化学部位であり； Ｘは、化学結合または結合用化学部位であって； Ｒは、誘導体化された生体分子を共有結合的または非共有結合的のいずれかで
    付着させるか、あるいは該第２の化学基の部位を共有結合的に付着させるための
    化学部位である］ を有する該マイクロアレイ。
  2. 【請求項２】 Ｐが、限定されるものではないが、α、βの不飽和カルボニ
    ルのビニル、アリルおよびホモアリル基を含むアルケニル部位；エポキシド、化
    学結合、フェニルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、アセタール、エステ
    ル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレート
    モノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド
    、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択される請求項１記載のマイクロア
    レイ。
  3. 【請求項３】 Ｒが、化学結合、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン
    の一部分、ビオチン、フェニルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニル
    、アリル、ホモアリル、アセタール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−ア
    セトアミド、チオール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジス
    ルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる
    群から選択される請求項１記載のマイクロアレイ。
  4. 【請求項４】 Ｒが、誘導体化された生体分子または該第２の化学基の部位
    のいずれかを結合するための化学反応に関与するのに先立って活性化される化学
    部位である請求項１記載のマイクロアレイ。
  5. 【請求項５】 該Ｒが、該Ｒを覆っている溶液のｐＨにおける増加または減
    少のいずれかによって活性化される請求項４記載のマイクロアレイ。
  6. 【請求項６】 該ｐＨ変化が、電子的にアドレス可能なマイクロアレイの電
    極の電子的に発生した電位によって供される請求項５記載のマイクロアレイ。
  7. 【請求項７】 Ｐが、該第２の化学基とさらに結合し、ここに、該第２の化
    学基は式Ｐ'−Ｘ'−Ｒ'を有し、さらに、該Ｐは少なくとも１つの該第２の化学
    基のＰ'部位に結合する請求項１記載のマイクロアレイ。
  8. 【請求項８】 該第２の化学基がポリマーを形成し、ここに、該ポリマーの
    骨格は、相互に連結したＰ'部位を含み、−Ｘ'−Ｒ'が各Ｐ'に連結する請求項７
    記載のマイクロアレイ。
  9. 【請求項９】 Ｐ'がＰに等しく、Ｘ'がＸに等しく、および／またはＲ'が
    Ｒに等しい請求項８記載のマイクロアレイ。
  10. 【請求項１０】 Ｒが該第２の化学基と結合し、ここに、該第２の化学基は
    式Ｐ'−Ｘ'−Ｒ'を有し、さらに、該Ｒは少なくとも１つの該第２の化学基のＰ'
    部位に結合する請求項１記載のマイクロアレイ。
  11. 【請求項１１】 該第２の化学基がポリマーを形成し、ここに、該ポリマー
    の骨格は相互に連結したＰ'部位を含み、−Ｘ'−Ｒ'は各Ｐ'に連結する請求項１
    ０記載のマイクロアレイ。
  12. 【請求項１２】 Ｐ'がＰに等しく、Ｘ'がＸに等しく、および／またはＲ'
    がＲに等しい請求項１１記載のマイクロアレイ。
  13. 【請求項１３】 Ｘが、化学結合、１〜１０個の炭素原子のアルキル基、２
    〜１０個の炭素原子のアルケニル基、アルキルエステル、ケトン、アミド、エー
    テル、チオエステル、アミド基およびカルボニルならびにそのいずれかの組合せ
    よりなる群から選択される請求項１記載のマイクロアレイ。
  14. 【請求項１４】 第１の化学基および第２の化学基を含む浸透層を持つ電子
    的にアドレス可能なマイクロアレイであって、該第１の基が式Ｐ−Ｘ−Ｒを有し
    、該第２の基が式Ｐ'−Ｘ'−Ｒ'を有し、 ここに、Ｐは該マイクロアレイに結合するための化学部位であり、各々の該Ｐ
    部位は、該マイクロアレイの浸透層および該第２の基の少なくとも１つのＰ'に
    さらに連結し、該Ｐ'部位は、各々、該第２の基のポリマーを形成するように該
    第２の基の少なくとも１つの他のＰ'部位をさらに連結し； ＸおよびＸ'は、化学結合、１〜１０個の炭素原子のアルキル基、２〜１０個
    の炭素原子のアルケニル基、アルキルエステル、ケトン、エーテルアミド、チオ
    エステル、アミド基およびカルボニル、ならびにそのいずれかの組合せよりなる
    群から選択される結合用化学部位であり、 ＲおよびＲ'は、誘導体化した生体分子を共有結合的または非共有結合的に付
    着させるための化学部位である該マイクロアレイ。
  15. 【請求項１５】 ＲおよびＲ'が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジ
    ンの一部分、ビオチン、ＰＢＡ、ＳＨＡ、ビニル、アリル、ホモアリル、アセタ
    ール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホ
    ロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン
    、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択される請求項１４記
    載のマイクロアレイ。
  16. 【請求項１６】 ＲがＲ'に等しい請求項１５記載のマイクロアレイ。
  17. 【請求項１７】 該ＰまたはＰ'およびＲまたはＲ'が、活性化が同一または
    相互に排他的な条件下のいずれかにある化学反応に関与するのに先立って、活性
    化される化学部位であり、ここに、該化学反応は、ＰおよびＰ'、Ｒおよび誘導
    体化した生体分子、および／またはＰ'およびもう一つの第２の基のＰ'のいずれ
    かの組合せの間にある請求項１４記載のマイクロアレイ。
  18. 【請求項１８】 該Ｐ、Ｒ、Ｐ'またはＲ'が、該マイクロアレイを覆ってい
    る反応溶液のｐＨにおける増加または減少のいずれかによって活性化される請求
    項１７記載のマイクロアレイ。
  19. 【請求項１９】 該ｐＨ変化が、電子的にアドレス可能なマイクロアレイの
    電極の電子的に発生した電位によって供される請求項１８記載のマイクロアレイ
    。
  20. 【請求項２０】 Ｐが、当該単量体の重合を含む化学反応において遊離Ｐ'
    −Ｘ'−Ｒ'単量体に結合するように活性化され、ここに、該Ｐは、少なくとも１
    つの該遊離単量体のＰ'部位中の反応性中心に結合し、各々の該Ｐ'部位は、もう
    一つの単量体の少なくとも１つの他のＰ'に結合する請求項１４記載のマイクロ
    アレイ。
  21. 【請求項２１】 第１の化学基および第２の化学基を持つ浸透層を含む電子
    的にアドレス可能なマイクロアレイであって、該第１の基が式Ｐ−Ｘ−Ｒを有し
    、該第２の基が式Ｐ'−Ｘ'−Ｒ'を有し、 ここに、Ｐは該マイクロアレイに直接的に結合するための化学部位であり、各
    々の該Ｐ部位は、該マイクロアレイの浸透性ポリマーに該第１の基をさらに連結
    し、該Ｒは、該第２の基の少なくとも１つのＰ'に連結している化学基であり、
    該Ｐ'部位は、各々、該第２の基のポリマーを形成するように該第２の基の少な
    くとも１つの他のＰ'部位をさらに連結し； ＸおよびＸ'は、化学結合、１〜１０個の炭素原子のアルキル基、２〜１０個
    の炭素原子のアルケニル基、アルキルエステル、ケトン、アミド、エーテル、チ
    オエステル、アミド基およびカルボニル、ならびにそのいずれかの組合せよりな
    る群から選択される結合用化学部位であり、 Ｒ'は、誘導体化した生体分子を共有結合的または非共有結合的のいずれかで
    付着させるための化学部位である該マイクロアレイ。
  22. 【請求項２２】 ＲおよびＲ'が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジ
    ンの一部分、ビオチン、フェニルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニ
    ル、アリル、ホモアリル、アセタール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−
    アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジ
    スルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりな
    る群から選択される請求項２１記載のマイクロアレイ。
  23. 【請求項２３】 ＲがＲ'に等しい請求項２２記載のマイクロアレイ。
  24. 【請求項２４】 該ＰまたはＰ'およびＲまたはＲ'が、活性化が同一または
    相互に排他的な条件下のいずれかにある化学反応に関与するのに先立って、活性
    化される化学部位であり、ここに、該化学反応は、ＰおよびＰ'、ＲおよびＰ'、
    ならびにＰ'およびもう一つの第２の基のＰ'のいずれかの組合せの間にある請求
    項２１記載のマイクロアレイ。
  25. 【請求項２５】 該Ｐ、Ｒ、Ｐ'またはＲ'が、該マイクロアレイを覆ってい
    る溶液のｐＨにおける増加または減少のいずれかによって活性化される請求項２
    ４記載のマイクロアレイ。
  26. 【請求項２６】 該ｐＨ変化が、電子的にアドレス可能なマイクロアレイの
    電極の電子的に発生した電位によって供される請求項２５記載のマイクロアレイ
    。
  27. 【請求項２７】 Ｒが、当該単量体の重合を含む化学反応において遊離Ｐ'
    −Ｘ'−Ｒ'単量体に結合するように活性化され、ここに、該Ｒは、少なくとも１
    つの該遊離単量体のＰ'部位中の反応性中心に結合し、各々の該Ｐ'部位は、もう
    一つの単量体の少なくとも１つの他のＰ'に結合する請求項２１記載のマイクロ
    アレイ。
  28. 【請求項２８】 生体分子に、および／または第２の化学部位を含む重合さ
    れた単量体単位に付着した第１の化学部位を有し、該第２の化学部位が、生体分
    子にさらに付着する浸透層を有する電子的にアドレス可能なマイクロアレイであ
    って、該第１の化学部位または該重合された単位への該生体分子の該付着が、酸
    性および／または塩基性ｐＨ条件下にて、少なくとも１つの該第１および／また
    は該第２の化学部位の活性化後に引き起こされ、該第１の化学部位は、式Ｐ−Ｘ
    −Ｒを有し、該第２の化学部位は、式Ｐ'−Ｘ'−Ｒ'を有し、ここに、該Ｐは、
    該透過層におよび／または該第２の化学部位のＰ'に付着させるための活性化を
    必要とする化学的エレメントを含み、該ＸおよびＸ'が、非反応性の化学的エレ
    メントを含み、該ＲおよびＲ'が、該生体分子を付着するか、またはもう一つの
    第２の化学部位のＰ'に付着するためにＰおよびＰ'とは異なる活性化を必要とす
    る化学的エレメントを含む該マイクロアレイ。
  29. 【請求項２９】 該浸透層が、アルキルとは炭素鎖をいうアクリルアミド、
    ビスアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、機能化
    したエチレングリコール誘導体、Ｎ−ビニルピロリジノン、ビス−シスタミン、
    アクリレート、メタクリレート、およびアクリロニトリルよりなる単量体群から
    重合されたポリマーを含む請求項２８記載のマイクロアレイ。
  30. 【請求項３０】 該生体分子が、ビニル、アリル、ホモアリル、アセタール
    、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチ
    オレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒ
    ドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択される化学部位で誘導体
    化された請求項２８記載のマイクロアレイ。
  31. 【請求項３１】 該ＰおよびＰ'が、アルケニル部位、α、βの不飽和カル
    ボニル、ビニル、アリルおよびホモアリル基、アセタール、チオエステル、ジス
    ルフィド、エポキシド、アルキルエーテルおよびカルボン酸よりなる群から選択
    される請求項２８記載のマイクロアレイ。
  32. 【請求項３２】 ＸおよびＸ'が、化学結合、１ないし１０個の炭素よりな
    る炭素鎖、エステル、ポリエーテル、アミドおよびエステルよりなる群から選択
    される請求項２８記載のマイクロアレイ。
  33. 【請求項３３】 該ＲおよびＲ'が、アルケニル部位、α、βの不飽和カル
    ボニル、ビニル、アリル、ホモアリル、アセタール、エステル、カルボン酸、チ
    オエステル、ジスルフィド、エポキシドおよびアルキルエーテルよりなる群から
    選択される請求項２８記載のマイクロアレイ。
  34. 【請求項３４】 該ＲがＲ'に等しい請求項３３記載のマイクロアレイ。
  35. 【請求項３５】 ｐＨの調整が、該緩衝液のｐＨを低下または上昇させるこ
    とによっておよび／または正および負の電位のいずれかで該電子的にアドレス可
    能なアレイの電極にバイアスをかけることによって開始された請求項２８記載の
    マイクロアレイ。
  36. 【請求項３６】 該Ｐ、Ｐ'、Ｒおよび／またはＲ'の各々がチオエステルで
    ある請求項２８記載のマイクロアレイ。
  37. 【請求項３７】 各々の該Ｐ、Ｐ'、Ｒおよび／またはＲ'がアセタール部位
    である請求項２８記載のマイクロアレイ。
  38. 【請求項３８】 該Ｒが、アミン、誘導体化アミン、−サリチルヒドロキサ
    ム酸、ブロモアセトアミド、サリチルヒドロキサム酸、マレイミド、ストレプト
    アビジン、ビオチン、ビニル、アリル、ホモアリル、アセタール、エステル、カ
    ルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモノエ
    ステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒド
    ラジンおよびアミンよりなる群から選択される請求項２８記載のマイクロアレイ
    。
  39. 【請求項３９】 該電位が、３０と６００秒との間の期間の活性化を意図し
    たマイクロアレイ上の部位にて、５０ｎＡ／５０００μｍ２と５μＡ／５０００
    μｍ２との間の電流密度にて印加された請求項３５記載のマイクロアレイ。
  40. 【請求項４０】 電子的にアドレス可能なマイクロチップ上に生体分子のマ
    イクロアレイを作成する方法であって、 ａ．式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する化学基を該マイクロチップの浸透層に結合させ； ｂ．当該第１の部位が当該第１の部位に結合するであろう第２の化学部位を有
    する生体分子と反応させ、および生体分子に付着させるように、該式のＲによっ
    て表された該第１の化学部位を活性化し；次いで、 ｃ．活性化された（ｂ）の該第１の部位と、該生体分子の該第２の部位とを接
    触させ、 ここに、該式のＰは、当該化学基を該浸透層に接触させるための化学基を表し、
    Ｘは非反応性部位であって、Ｒは該生体分子を付着するための化学部位であるこ
    とを特徴とする該方法。
  41. 【請求項４１】 該Ｐ化学部位が、アルケニル部位、α、βの不飽和カルボ
    ニルのビニル、アリルおよびホモアリル基、アセタール、エポキシド、エステル
    、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモ
    ノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、
    ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４０
    記載の方法。
  42. 【請求項４２】 該Ｒ化学部位が、活性化されて反応性チオールとなるチオ
    エステルであることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該Ｒ化学部位が、活性化されてアルデヒドとなるアセター
    ル単量体であることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  44. 【請求項４４】 該Ｘ化学部位が、化学結合、アミド、１ないし１０個の炭
    素を含む炭素鎖、エステル、エーテルおよびポリエーテルよりなる群から選択さ
    れることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  45. 【請求項４５】 該Ｒ化学部位が、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニ
    ルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニル、アリル、ホモアリル、アセ
    タール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホス
    ホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケト
    ン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択されることを特徴
    とする請求項４０記載の方法。
  46. 【請求項４６】 該生体分子の該第２の部位が、ビオチン、ストレプトアビ
    ジン、フェニルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニル、アリル、ホモ
    アリル、アセタール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チ
    オール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アル
    デヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択され
    ることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  47. 【請求項４７】 電子的にアドレス可能なマイクロチップ上の生体分子のマ
    イクロアレイを作成する方法であって、 ａ．式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する化学基のポリマーを該マイクロチップの浸透層に結
    合させ、ここに、各基のＰが少なくとも１つの他のＰ部位に付着して、該Ｐ のうち１つを用いて、該ポリマーを該浸透層に結合させるようにポリマー骨格を
    形成する第１の化学部位であり；次いで ｂ．該式のＲによって表された第２の化学部位を、該第２の化学部位に共有結
    合的または非共有結合的のいずれかで結合するであろう誘導体部位を有する生体
    分子と接触させ； ここに、Ｘは、非反応性部位であることを特徴とする該方法。
  48. 【請求項４８】 該Ｐ化学部位が、アルケニル部位、α、βの不飽和カルボ
    ニルのビニル、アリルおよびホモアリル基、アセタール、エポキシド、エステル
    、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモ
    ノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、
    ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４７
    記載の方法。
  49. 【請求項４９】 該Ｒ化学部位が、活性化されて反応性チオールとなるチオ
    エステルであることを特徴とする請求項４７記載の方法。
  50. 【請求項５０】 該Ｒ化学部位が、活性化されてアルデヒドとなるアセター
    ル単量体であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
  51. 【請求項５１】 該Ｘ化学部位が、化学結合、アミド、１ないし１０個の炭
    素を含む炭素鎖、エステル、エーテルおよびポリエーテルよりなる群から選択さ
    れることを特徴とする請求項４７記載の方法。
  52. 【請求項５２】 該Ｒ化学部位が、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニ
    ルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニル、アリル、ホモアリル、アセ
    タール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホス
    ホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケト
    ン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択されることを特徴
    とする請求項４７記載の方法。
  53. 【請求項５３】 該生体分子の該誘導体化部位が、ビオチン、ストレプトア
    ビジン、フェニルボロン酸、サリチリックヒドロキサム酸、ビニル、アリル、ホ
    モアリル、アセタール、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、
    チオール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、ア
    ルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択さ
    れることを特徴とする請求項４７記載の方法。
  54. 【請求項５４】 式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する化学部位を電子的にアドレス可能な
    マイクロアレイの浸透層上に接合することを含む電子的にアドレス可能なマイク
    ロチップ上に生体分子のマイクロアレイを作成する方法であって、ここに、該接
    合は、 ａ）該浸透層と、式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する重合可能な単量体ならびに重合および
    接合を開始するための活性化可能なイニシエーターを含む接合用スラリーとを接
    触させ、該単量体の該Ｐは、Ｐが該浸透層に結合できるか、他の該単量体のＰ部
    位と重合できる化学部位を含み、該単量体の該Ｒは、Ｒが該Ｒに結合するのに感
    受性である部位を有する生体分子に共有結合的または非共有結合的のいずれかで
    結合できる化学部位を含み、該Ｘは化学結合アミド、１ないし１０個の炭素より
    なる炭素鎖、エーテルおよびポリエーテルよりなる群から選択され； ｂ）該イニシエーターを活性化して、該単量体の重合を開始し、該浸透層に接
    合し；次いで ｃ）該Ｒ部位に結合するであろう化学部位を有する生体分子を接触させ、ここ
    に、該生体分子が該Ｒ部位に結合するようになることを含む工程において行われ
    ることを特徴とする該方法。
  55. 【請求項５５】 該イニシエーターが、ＡＩＢＮ、過硫酸アンモニウムおよ
    びＴＥＭＥＤ、過酸化ベンゾイル、Ｄ４２６５、硫酸セリウム（ＩＶ）、α、β
    、γまたはＸ−線、電子ビーム照射、またはアルゴン、窒素および酸素よりなる
    群から選択されたプラズマによる開始よりなる群から選択されることを特徴とす
    る請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 該浸透層がヒドロゲルであることを特徴とする請求項５４
    記載の方法。
  57. 【請求項５７】 該ヒドロゲルが重合したアクリルアミドを含むことを特徴
    とする請求項５６記載の方法。
  58. 【請求項５８】 該重合可能な単量体が、アルケニル部位、α、βの不飽和
    カルボニルのビニル、アリルおよびホモアリル基よりなる群から選択されること
    を特徴とする請求項５４記載の方法。
  59. 【請求項５９】 該Ｒが、該生体分子と結合するのに先立って活性化されな
    ければならない部位であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
  60. 【請求項６０】 該浸透層がゾル−ゲルであることを特徴とする請求項５４
    記載の方法。
  61. 【請求項６１】 式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する化学部位を電子的にアドレス可能な
    マイクロアレイの浸透層上に接合することを含む電子的にアドレス可能なマイク
    ロチップ上に生体分子のマイクロアレイを作成する方法であって、ここに、該接
    合は、 ａ）該浸透層と、式Ｐ−Ｘ−Ｒを有する重合可能な単量体ならびに重合および
    接合を開始するために活性化を必要とするイニシエーターを含む接合用溶液とを
    接触させ、該単量体の該Ｐは、Ｐが該浸透層に結合でき、ならびに他の該単量体
    のＰ部位と重合できる化学部位を含み、該単量体の該Ｒは、Ｒが該Ｒに結合する
    のに感受性である部位を有する生体分子に共有結合的または非共有結合的のいず
    れでも結合できる化学部位を含み、該Ｘは化学結合アミド、１ないし１０個の炭
    素よりなる炭素鎖、エーテルおよびポリエーテルよりなる群から選択され、 ｂ）該イニシエーターを活性化して、該単量体の重合を開始し、該浸透層に接
    合し；次いで ｃ）該Ｒ部位に結合するであろう化学部位を有する生体分子を接触させ、ここ
    に、該生体分子が該Ｒ部位に結合するようになることを含む工程において行われ
    ることを特徴とする該方法。
  62. 【請求項６２】 該浸透層がヒドロゲルであることを特徴とする請求項６１
    記載の方法。
  63. 【請求項６３】 該ヒドロゲルが重合したアクリルアミドを含むことを特徴
    とする請求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 該イニシエーターが、ＡＩＢＮ、過酸化ベンゾイル、Ｄ４
    ２６５、硫酸セリウム（ＩＶ）、α、β、γまたはＸ−線、あるいはアルゴン、
    窒素および酸素よりなる群から選択されたプラズマによる開始よりなる群から選
    択されることを特徴とする請求項６１記載の方法。
  65. 【請求項６５】 該重合可能な単量体が、アルケニル部位、α、βの不飽和
    カルボニルのビニル、アリルおよびホモアリル基よりなる群から選択されること
    を特徴とする請求項６１記載の方法。
  66. 【請求項６６】 該Ｒが、該生体分子と結合するのに先立って活性化されな
    ければならない部位であることを特徴とする請求項６１記載の方法。
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