JP2003535351A - バイオ分子を固定しマイクロアレーの出発製品として役立つ表面機能化担体の製造法 - Google Patents
バイオ分子を固定しマイクロアレーの出発製品として役立つ表面機能化担体の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 不特定シグナルが生じたり、被覆密度が僅かで分布が不均一な状態が生じたりしないようにした、バイオ分子固定のための、表面官能化担体及びマイクロアレー、並びにその製造方法を提供する。
【解決手段】 担体表面に開始剤を被覆し、被覆された表面を、重合可能なモノマーの第１グループを含む少なくとも１つの溶液と接触させ、モノマーが、バイオ分子（ゾンデ分子）を結合できる結合箇所を有し、モノマーが、開始剤を介して担体と結合し、次いで、官能化すべきポリマー鎖を重合させて、担体表面に固定された隣接の官能ポリマー鎖の構造が生ずるように、モノマー溶液を賦活担体と接触させる条件を選択して、バイオ分子固定のための担体を製造し、また該製法で製造した表面改質担体上の所定範囲に、溶媒に溶解したゾンデ分子を液滴状に沈積しマイクロアレーを製造する。
Description
【０００１】
この発明は、マイクロアレーの製造に使用する、バイオ分子の固定のための担
体を製造する方法、本発明に基づき製造した表面改質担体から出発してこのよう
なマイクロアレーを製造する方法、及び該方法によって製造できる担体及びマイ
クロアレーに関する。
体を製造する方法、本発明に基づき製造した表面改質担体から出発してこのよう
なマイクロアレーを製造する方法、及び該方法によって製造できる担体及びマイ
クロアレーに関する。
【０００２】
以下において、マイクロアレーとは、分析すべき他のバイオ分子（目標分子）
との特殊な結合をそれ自体で達成できゾンデ（ゾンデ分子）として役立つバイオ
分子を、表面上の相互に分離された所定範囲（スポット）に結合させた平坦な担
体（スライド）を意味する。これらのスポットは、二次元対象として検知される
。概念“アレー”は、広義に解釈され、本明細書で使用する場合、担体表面上の
他の分布、すなわち、必ずしも厳密な意味におけるアレー配置ではない分布も含
む。
との特殊な結合をそれ自体で達成できゾンデ（ゾンデ分子）として役立つバイオ
分子を、表面上の相互に分離された所定範囲（スポット）に結合させた平坦な担
体（スライド）を意味する。これらのスポットは、二次元対象として検知される
。概念“アレー”は、広義に解釈され、本明細書で使用する場合、担体表面上の
他の分布、すなわち、必ずしも厳密な意味におけるアレー配置ではない分布も含
む。
【０００３】
以下において、概念“担体”によって、未処理のガラススライド又は合成樹脂ス
ライドを示す。官能化後、担体は、官能化担体と呼ばれ、この場合、まだ、ゾン
デ分子は結合されてない。概念“マイクロアレー”は、ゾンデ分子を結合した官
能化担体についてのみ使用される。
ライドを示す。官能化後、担体は、官能化担体と呼ばれ、この場合、まだ、ゾン
デ分子は結合されてない。概念“マイクロアレー”は、ゾンデ分子を結合した官
能化担体についてのみ使用される。
【０００４】
マイクロアレーは、例えば、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡ含有錯体混合物の分析又
はタンパク質の分析に使用される。以下において、マイクロアレーを使用する技
術をマイクロアレー技術とも呼ぶ。
はタンパク質の分析に使用される。以下において、マイクロアレーを使用する技
術をマイクロアレー技術とも呼ぶ。
【０００５】
ＤＮＡ分析又はＲＮＡ分析のゾンデ分子としては、例えば、オリゴヌクレオチ
ドを使用する。タンパク質の分析の場合、抗体又は抗原をゾンデ分子として担体
に結合できる。特に、本発明は、核酸分析のためのマイクロチップの製造法に関
する。
ドを使用する。タンパク質の分析の場合、抗体又は抗原をゾンデ分子として担体
に結合できる。特に、本発明は、核酸分析のためのマイクロチップの製造法に関
する。
【０００６】
ゾンデ分子は、例えば、担体表面上で直接に合成できる。しかしながら、スポ
ッティング（点滴）と呼ばれる技術によって担体表面にゾンデ分子を沈積させる
のが好ましい。この場合、担体表面は、ゾンデ分子と結合するよう官能化する必
要がある。
ッティング（点滴）と呼ばれる技術によって担体表面にゾンデ分子を沈積させる
のが好ましい。この場合、担体表面は、ゾンデ分子と結合するよう官能化する必
要がある。
【０００７】
スポッティングのため、すなわち、溶解したゾンデ分子を含む液滴を担体表面
上に沈積させるため、例えば、ゾンデ分子を含むスポットを担体上に、好ましく
は、アレー配置に自動的に形成するピンヘッド又はインジェット・プリント法を
使用するのが好ましい。従来のスポッティング法の場合、液滴量は、通常、0.03
〜２ｎｌの範囲にある。したがって、上記液滴は、三次元特徴を有する。
上に沈積させるため、例えば、ゾンデ分子を含むスポットを担体上に、好ましく
は、アレー配置に自動的に形成するピンヘッド又はインジェット・プリント法を
使用するのが好ましい。従来のスポッティング法の場合、液滴量は、通常、0.03
〜２ｎｌの範囲にある。したがって、上記液滴は、三次元特徴を有する。
【０００８】
スポッティングによるゾンデ分子の固定は、担体表面の対応する官能化を前提
とする。これに関連して、担体に対するポリリシンの被覆又は担体のシラン化が
知られている。双方の方法には、欠点がある。すなわち、ポリリシン被覆は、不
特定の結合及びスポッティング後の液滴の不測の流動を誘起する。ガラススライ
ドのシラン化の場合、結果の解釈を困難とする不特定のシグナルが生ずることが
ある。
とする。これに関連して、担体に対するポリリシンの被覆又は担体のシラン化が
知られている。双方の方法には、欠点がある。すなわち、ポリリシン被覆は、不
特定の結合及びスポッティング後の液滴の不測の流動を誘起する。ガラススライ
ドのシラン化の場合、結果の解釈を困難とする不特定のシグナルが生ずることが
ある。
【０００９】
米国特許第５８５８６５３号には、熱活性化の下で、例えば、オリゴヌクレオ
チドと共有結合を達成できる反応基を含み親水性ポリマーを表面に結合させたア
レー技術用担体が記載されている。担体の製造は、場合によっては、ポリマー中
の光反応性基を利用して、あらかじめ合成したポリマーを担体表面に結合するこ
とによって行う。比較的大きいポリマーを担体に結合する場合、必然的に、チャ
ージ（被覆）密度が僅かで分布が不均一な状態が生ずるという欠点がある。
チドと共有結合を達成できる反応基を含み親水性ポリマーを表面に結合させたア
レー技術用担体が記載されている。担体の製造は、場合によっては、ポリマー中
の光反応性基を利用して、あらかじめ合成したポリマーを担体表面に結合するこ
とによって行う。比較的大きいポリマーを担体に結合する場合、必然的に、チャ
ージ（被覆）密度が僅かで分布が不均一な状態が生ずるという欠点がある。
【００１０】
本発明の課題は、先行技術の欠点を克服する表面官能化担体及びアレー技術用
マイクロアレーを製造する方法を提供することにある。
マイクロアレーを製造する方法を提供することにある。
【００１１】
この課題は、請求項１及び16に係る方法によって解決される。
【００１２】
請求項１に記載の方法は、請求項16に基づくマイクロアレー、特に、核酸分析
用マイクロチップに構成できる表面官能化担体の製造方法に関する。
用マイクロチップに構成できる表面官能化担体の製造方法に関する。
【００１３】
本発明の場合、請求項１に基づき、まず、担体表面に開始剤を被覆する。この
場合、開始剤は、担体表面に、例えば、吸着されるか、場合によっては、更に、
共有結合される。
場合、開始剤は、担体表面に、例えば、吸着されるか、場合によっては、更に、
共有結合される。
【００１４】
次いで、開始剤を被覆した表面を、重合可能なモノマーの少なくとも１つの第
１グループを含む溶液と接触させる。モノマーを活性化担体表面と接触させる条
件及び活性化に使用する開始剤は、モノマーが、開始剤を介して担体と結合し、
次いで、重合して官能ポリマー鎖を生ずるように、選択されている。
１グループを含む溶液と接触させる。モノマーを活性化担体表面と接触させる条
件及び活性化に使用する開始剤は、モノマーが、開始剤を介して担体と結合し、
次いで、重合して官能ポリマー鎖を生ずるように、選択されている。
【００１５】
本発明に基づき、更に、使用した第１グループのモノマーは、ゾンデ分子とし
て使用されるバイオ分子を、場合によっては、共有結合を構成して、結合できる
結合箇所を有する。
て使用されるバイオ分子を、場合によっては、共有結合を構成して、結合できる
結合箇所を有する。
【００１６】
ＷＯ００／１２５７５には、類似の方法で製造され、特に、スポッティング技
術の特殊な要求を満足するポリマー固相担体が記載されている。ＷＯ００／１２
５７５には、もちろん、ここに記載の活性化担体をマイクロアレー、特に、核酸
分析用マイクロチップに加工できるということは開示されてない。ＷＯ００／１
２５７５に記載の使用目的は、本質的に、化学物質文献シリーズに限定される。
術の特殊な要求を満足するポリマー固相担体が記載されている。ＷＯ００／１２
５７５には、もちろん、ここに記載の活性化担体をマイクロアレー、特に、核酸
分析用マイクロチップに加工できるということは開示されてない。ＷＯ００／１
２５７５に記載の使用目的は、本質的に、化学物質文献シリーズに限定される。
【００１７】
本発明の実施の形態の場合、担体において、少なくとも１つの他の第２モノマ
ーグループを第１グループと共重合させる。第２グループのモノマーは、本質的
に、バイオ分子のための結合箇所を有しておらず、例えば、結合箇所を有する担
体のチャージ（被覆）密度の分布及び制御に役立ち、更に、官能ポリマー鎖の疎
水性又は親水性の調節に役立つ。
ーグループを第１グループと共重合させる。第２グループのモノマーは、本質的
に、バイオ分子のための結合箇所を有しておらず、例えば、結合箇所を有する担
体のチャージ（被覆）密度の分布及び制御に役立ち、更に、官能ポリマー鎖の疎
水性又は親水性の調節に役立つ。
【００１８】
更に、ゾンデ分子を共有結合箇所に案内できる共有結合箇所を有していないモ
ノマーの第３グループを使用することができる。例えば、カチオン基（例えば、
特に核酸に好適なＮＲ4 + 基）又はタンパク質に好適なアニオン基又はキレート
基を有したモノマーが好適である。
ノマーの第３グループを使用することができる。例えば、カチオン基（例えば、
特に核酸に好適なＮＲ4 + 基）又はタンパク質に好適なアニオン基又はキレート
基を有したモノマーが好適である。
【００１９】
官能ポリマーは、第１グループのモノマーの重合によって、又は第１グループ
のモノマーと第２グループとのモノマーの共重合によって、又は第１グループの
モノマーと第３グループのモノマーとの共重合によって、又は第１グループのモ
ノマーと第２グループのモノマーと第３グループのモノマーとの共重合によって
構成できる。
のモノマーと第２グループとのモノマーの共重合によって、又は第１グループの
モノマーと第３グループのモノマーとの共重合によって、又は第１グループのモ
ノマーと第２グループのモノマーと第３グループのモノマーとの共重合によって
構成できる。
【００２０】
本発明は、一連の利点を有する。本質的利点は、結合箇所を有する官能ポリマ
ー鎖が、担体表面から出発して本来の位置（インシトゥ： in situ）に形成され
るという点である。すなわち、担体表面は、まず、モノマーと反応する。この場
合、モノマーは、小寸法であるので、良好に制御できる密度で、更に、所望であ
れば、高密度で担体表面に結合できる。すなわち、担体表面は、本発明に基づき
、インシトゥで形成された官能ポリマー鎖によって、担体表面におけるあらかじ
め合成されたポリマーの従来の結合の場合よりも明らかに密にチャージ（被覆）
される。
ー鎖が、担体表面から出発して本来の位置（インシトゥ： in situ）に形成され
るという点である。すなわち、担体表面は、まず、モノマーと反応する。この場
合、モノマーは、小寸法であるので、良好に制御できる密度で、更に、所望であ
れば、高密度で担体表面に結合できる。すなわち、担体表面は、本発明に基づき
、インシトゥで形成された官能ポリマー鎖によって、担体表面におけるあらかじ
め合成されたポリマーの従来の結合の場合よりも明らかに密にチャージ（被覆）
される。
【００２１】
更に、本発明に係る方法の場合、担体表面にわたって結合箇所の三次元分布を
特に有効に達成できる。かくして、ゾンデ分子のための単位面積当りの結合容量
が増大され且つ不特定の結合が減少され、したがって、より良い信号／雑音比が
得られる。
特に有効に達成できる。かくして、ゾンデ分子のための単位面積当りの結合容量
が増大され且つ不特定の結合が減少され、したがって、より良い信号／雑音比が
得られる。
【００２２】
更なる利点は、本発明に係る方法によって良好に制御可能な密度で並置された
官能ポリマー鎖が、液体の急速な気化及び流動を阻止し、かくして、各スポット
のゾンデ分子の結合効率が改善され、スポット表面にわたる均一性が改善され、
隣接スポット間の交差汚染が減少されるという点である。官能ポリマー鎖の調節
可能な三次元構造によって、スポッティング（点滴）時に沈積した液滴の安定化
が保証される。沈積時、沈積された液滴は、先行技術の場合とは異なり、本発明
に基づき製造した担体上に、その三次元構造を本質的に保持し、したがって、よ
り良好に定められたスポットが得られる。
官能ポリマー鎖が、液体の急速な気化及び流動を阻止し、かくして、各スポット
のゾンデ分子の結合効率が改善され、スポット表面にわたる均一性が改善され、
隣接スポット間の交差汚染が減少されるという点である。官能ポリマー鎖の調節
可能な三次元構造によって、スポッティング（点滴）時に沈積した液滴の安定化
が保証される。沈積時、沈積された液滴は、先行技術の場合とは異なり、本発明
に基づき製造した担体上に、その三次元構造を本質的に保持し、したがって、よ
り良好に定められたスポットが得られる。
【００２３】
本発明に基づき、担体として、ガラス担体又は合成樹脂担体（スライド）を使
用できる。合成樹脂担体は、極く少数の例を挙げるとすると、例えば、ポリスチ
ロール，ポリカーボネート，ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンから構成できる
。
用できる。合成樹脂担体は、極く少数の例を挙げるとすると、例えば、ポリスチ
ロール，ポリカーボネート，ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンから構成できる
。
【００２４】
担体は、一般に、平坦な形状を有する。本発明の好ましい実施の形態の場合、
官能化のための担体表面範囲に凹みを構成できる。かくして、官能化可能な又は
チャージ可能な担体表面積を簡単に増大できる。
官能化のための担体表面範囲に凹みを構成できる。かくして、官能化可能な又は
チャージ可能な担体表面積を簡単に増大できる。
【００２５】
凹みは、多様な形状、例えば、ミゾ形状又は任意の刻み込み形状を有すること
ができ、担体表面に規則的に又はランダムに分布させることができる。凹みの形
状及び大きさは同一であってもよく、更に、凹みは、担体表面に同一の相互間隔
で構成できる。この場合、パターンを掃過する慣用のスポッティング装置によっ
て、有利には再現性よくチャージできる規則的なパターンが得られる。
ができ、担体表面に規則的に又はランダムに分布させることができる。凹みの形
状及び大きさは同一であってもよく、更に、凹みは、担体表面に同一の相互間隔
で構成できる。この場合、パターンを掃過する慣用のスポッティング装置によっ
て、有利には再現性よくチャージできる規則的なパターンが得られる。
【００２６】
先端を担体へ向けたピラミッド又は円錐体の形状に凹みを構成するのが特に好
ましい。上記形状を有する凹みの場合に、特に、担体表面積を最適な態様で増大
できる。この場合、円錐形凹みは、円錐体底面（すなわち、平坦な担体における
同等の面）よりも２〜３倍の表面積を有するということから出発する。この場合
、担体をより高い密度で官能化でき、対応して、より多くのゾンデ分子を積載（
チャージ）できるという最終効果が得られる。
ましい。上記形状を有する凹みの場合に、特に、担体表面積を最適な態様で増大
できる。この場合、円錐形凹みは、円錐体底面（すなわち、平坦な担体における
同等の面）よりも２〜３倍の表面積を有するということから出発する。この場合
、担体をより高い密度で官能化でき、対応して、より多くのゾンデ分子を積載（
チャージ）できるという最終効果が得られる。
【００２７】
選択した開始剤被覆法に依存して、例えば、主として、担体表面に対する開始
剤の結合が可能なように、前段階において担体を補足処理する必要がある。ガラ
ス製担体について慣行の方法は、例えば、シラン化である。これも、先行技術に
属する。したがって、ここでは、これについて詳述しない。合成樹脂製担体の場
合、一般に、前段階におけるこのような処理は不要である。
剤の結合が可能なように、前段階において担体を補足処理する必要がある。ガラ
ス製担体について慣行の方法は、例えば、シラン化である。これも、先行技術に
属する。したがって、ここでは、これについて詳述しない。合成樹脂製担体の場
合、一般に、前段階におけるこのような処理は不要である。
【００２８】
開始剤としては、例えば、熱的活性化、光化学的活性化又は酸化還元活性化可
能な化合物（例えば、ベンゾイン誘導体，アゾ化合物又は過酸化物）が好適であ
る。特に好適な開始剤は、例えば、ベンゾフェノンである。ベンゾフェノンは、
紫外光によって活性化される開始剤である。担体にベンゾフェノンを被覆する場
合、ベンゾフェノン含有溶液に、所定の時間、担体を浸漬すれば十分である。
能な化合物（例えば、ベンゾイン誘導体，アゾ化合物又は過酸化物）が好適であ
る。特に好適な開始剤は、例えば、ベンゾフェノンである。ベンゾフェノンは、
紫外光によって活性化される開始剤である。担体にベンゾフェノンを被覆する場
合、ベンゾフェノン含有溶液に、所定の時間、担体を浸漬すれば十分である。
【００２９】
次の工程において、例えばベンゾフェノンを被覆した担体をモノマーで平衡さ
せる。次いで、ベンゾフェノン活性化の場合は、紫外光の照射を行う。この場合
、ベンゾフェノンは、担体表面に対するモノマーの結合を媒介する。
せる。次いで、ベンゾフェノン活性化の場合は、紫外光の照射を行う。この場合
、ベンゾフェノンは、担体表面に対するモノマーの結合を媒介する。
【００３０】
ＵＶ誘導性開始剤の媒介による上記のインシトゥ技術は、光開始グラフト重合
と呼ばれ、例えば、“Ｕlbricht ら”の“Colloids and Surface, Ｖol.138, 19
98, p353”の論文に記載されている。上記論文に記載のグラフト重合によって製
造される基体は、特に、限外濾過目的に使用される。アレー技術における使用及
びこの技術のために適切な製造方法は、上記論文には記載されていない。
と呼ばれ、例えば、“Ｕlbricht ら”の“Colloids and Surface, Ｖol.138, 19
98, p353”の論文に記載されている。上記論文に記載のグラフト重合によって製
造される基体は、特に、限外濾過目的に使用される。アレー技術における使用及
びこの技術のために適切な製造方法は、上記論文には記載されていない。
【００３１】
もちろん、その特殊なコンフィギュレーション又は反応性に基づき担体表面と
モノマーとの間の結合を媒介できる他の開始剤も考えられる。この場合、形成さ
れた分子内に開始剤を組み込むことが考えられ、あるいは、例えばベンゾフェノ
ンの場合は、開始剤が、結合の媒介のみを行い、それ自体は、組み込まれないこ
とも考えられる。
モノマーとの間の結合を媒介できる他の開始剤も考えられる。この場合、形成さ
れた分子内に開始剤を組み込むことが考えられ、あるいは、例えばベンゾフェノ
ンの場合は、開始剤が、結合の媒介のみを行い、それ自体は、組み込まれないこ
とも考えられる。
【００３２】
モノマーとしては、良好に重合させることができる全ての化合物、例えば、ア
クリル酸，メタクリル酸，アクリル酸誘導体，メタクリル酸誘導体，ビニル化合
物及びアリル化合物が好適である。
クリル酸，メタクリル酸，アクリル酸誘導体，メタクリル酸誘導体，ビニル化合
物及びアリル化合物が好適である。
【００３３】
所望のゾンデ分子を、場合によっては、共有結合で、結合できる結合箇所を補
足して有する第１グループの特に好適なモノマーは、例えば、アクリル酸，メタ
クリル酸グリシジル又はメタクリル酸アミノアルキルである。
足して有する第１グループの特に好適なモノマーは、例えば、アクリル酸，メタ
クリル酸グリシジル又はメタクリル酸アミノアルキルである。
【００３４】
第２グループのモノマーとしては、官能ポリマー鎖の親水性又は疎水性を調節
する性質を有する全ての化合物が好適である。例えば、ポリエチレングリコール
，メタクリラート又はヒドロキシメチルメタクリルアミドが、特に好適である。
する性質を有する全ての化合物が好適である。例えば、ポリエチレングリコール
，メタクリラート又はヒドロキシメチルメタクリルアミドが、特に好適である。
【００３５】
結合箇所は、一般に、モノマー中に含まれる官能基である。ゾンデ分子の共有
結合を実現できるような結合箇所、すなわち、ＣＯＯＨ−，ＳＨ−，ＮＨ2 −，
エポキシド基又はチオール基が、特に好のましい。モノマーの選択又は結合箇所
として役立つ官能基の選択は、結合すべきゾンデ分子に適合するように簡単に実
施できる。これは、当業者にとって、全く問題ではない。
結合を実現できるような結合箇所、すなわち、ＣＯＯＨ−，ＳＨ−，ＮＨ2 −，
エポキシド基又はチオール基が、特に好のましい。モノマーの選択又は結合箇所
として役立つ官能基の選択は、結合すべきゾンデ分子に適合するように簡単に実
施できる。これは、当業者にとって、全く問題ではない。
【００３６】
本発明に基づき表面官能化した担体は、主として、所定スポットのゾンデ分子
との結合後、マイクロアレーとして使用できる。アレー技術は、特に核酸分析と
組み合わせて、慣用の方法である。したがって、ここでは、これについて詳述し
ない。
との結合後、マイクロアレーとして使用できる。アレー技術は、特に核酸分析と
組み合わせて、慣用の方法である。したがって、ここでは、これについて詳述し
ない。
【００３７】
上記技術の本質的特徴は、例えば、所定の塩基配列を有する核酸分子又は所定
の免疫性を有するタンパク質について、高度に特定的な結合性質を有するゾンデ
分子を、所定箇所に結合したマイクロアレーを使用するということにある。
の免疫性を有するタンパク質について、高度に特定的な結合性質を有するゾンデ
分子を、所定箇所に結合したマイクロアレーを使用するということにある。
【００３８】
所定箇所に対するこのようなゾンデ分子のチャージは、一般に、既述の如く、
スポッティングと呼ばれる技術によって自動的に行われる。スポッティングは、
公知の技術であり、したがって、ここでは詳述しない。
スポッティングと呼ばれる技術によって自動的に行われる。スポッティングは、
公知の技術であり、したがって、ここでは詳述しない。
【００３９】
さて、本発明に基づき製造した表面官能化担体には、例えば、スポッティング
技術によって、ゾンデ分子をチャージでき、かくして、マイクロアレーに更に加
工できる。
技術によって、ゾンデ分子をチャージでき、かくして、マイクロアレーに更に加
工できる。
【００４０】
この場合、若干の例として挙げれば、例えば、プラスミド−ＤＮＡ，コスミド
−ＤＮＡ，バクテリオファーゲン−ＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，
ｐＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを結合できる。もちろん、上記結合箇所に、タ
ンパク質分析のための抗原又は抗体又は他のバイオ分子を結合することも考えら
れる。
−ＤＮＡ，バクテリオファーゲン−ＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，
ｐＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを結合できる。もちろん、上記結合箇所に、タ
ンパク質分析のための抗原又は抗体又は他のバイオ分子を結合することも考えら
れる。
【００４１】
本発明は、表面官能化担体又はマイクロアレーの製造法に限定されるものでは
ない。本発明は、上記方法に基づき製造できる官能化担体及びアレーにも関する
。
ない。本発明は、上記方法に基づき製造できる官能化担体及びアレーにも関する
。
【００４２】
特に、本発明は、核酸分析のためのマイクロチップに加工できる表面官能化担
体の製造法及び対応するマイクロチップに関する。
体の製造法及び対応するマイクロチップに関する。
【００４３】
次に、実施の形態及びその図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【００４４】
官能化ガラス担体の製造
片面をシラン化したガラス担体（ＣＣＴ，Ｊｅｎａ）を使用した。ガラス担体
をベンゾフェノンの 100ｍＭアセトン溶液中に１５min 浸漬し、次いで、ベンゾ
フェノンの１ｍＭアセトン溶液で洗浄し、次いで、空気中で乾燥した。次いで、
ガラス担体のシラン化してベンゾフェノンを被覆した面を、１ｍＭ過ヨウ素酸ナ
トリウムを添加したモノマー溶液（以下に説明する）上に、ガラスと溶液との間
に気泡が封入されないように、置いた。１５min の平衡時間後、モノマー溶液上
に浮かぶ試料をガラスを介して露光した（ｔUV）。更に１５min の後反応時間後
、担体を強力に水洗し、次いで、アセトンで洗浄し、次いで、再び水洗した。次
いで、試料を乾燥した。
をベンゾフェノンの 100ｍＭアセトン溶液中に１５min 浸漬し、次いで、ベンゾ
フェノンの１ｍＭアセトン溶液で洗浄し、次いで、空気中で乾燥した。次いで、
ガラス担体のシラン化してベンゾフェノンを被覆した面を、１ｍＭ過ヨウ素酸ナ
トリウムを添加したモノマー溶液（以下に説明する）上に、ガラスと溶液との間
に気泡が封入されないように、置いた。１５min の平衡時間後、モノマー溶液上
に浮かぶ試料をガラスを介して露光した（ｔUV）。更に１５min の後反応時間後
、担体を強力に水洗し、次いで、アセトンで洗浄し、次いで、再び水洗した。次
いで、試料を乾燥した。
【００４５】
Ａ） モノマー溶液として、２５ｇ／ｌ（水）の濃度のアクリル酸を使用した
。このモノマー溶液を各種の露光時間（ｔUV）において処理した。 上記モノマーによって調製した結合箇所は、カルボキシル基であった。 各種のバリエーションを以下に括めた： １．アクリル酸２５ｇ／ｌ 7.5 min ｔUV ２．アクリル酸２５ｇ／ｌ １０min ｔUV ３．アクリル酸２５ｇ／ｌ １５min ｔUV
。このモノマー溶液を各種の露光時間（ｔUV）において処理した。 上記モノマーによって調製した結合箇所は、カルボキシル基であった。 各種のバリエーションを以下に括めた： １．アクリル酸２５ｇ／ｌ 7.5 min ｔUV ２．アクリル酸２５ｇ／ｌ １０min ｔUV ３．アクリル酸２５ｇ／ｌ １５min ｔUV
【００４６】
Ｂ） モノマー溶液として、それぞれ、ヒドロキシメチルメタクリルアミド２
５ｇ／ｌ（水）を加えた濃度１０ｇ／ｌ（水）及び２０ｇ／ｌ（水）のメタクリ
ル酸グリシジルを使用した。この場合も、それぞれ、異なる露光時間、すなわち
、１０min ｔUV（１０ｇ／ｌ（水）及び２０ｇ／ｌ（水））及び１５min ｔUV（
２０ｇ／ｌ（水）の場合のみ）を使用した。 上記モノマーによって調製した結合箇所は、エポキシド基であった。 各種のバリエーションを以下に括めた： １．メタクリル酸グリシジル１０ｇ／ｌ １０min ｔUV ２．メタクリル酸グリシジル２０ｇ／ｌ １０min ｔUV ３．メタクリル酸グリシジル２０ｇ／ｌ １５min ｔUV それぞれ、＋ヒドロキシメチルメタクリルアミド２５ｇ／ｌ
５ｇ／ｌ（水）を加えた濃度１０ｇ／ｌ（水）及び２０ｇ／ｌ（水）のメタクリ
ル酸グリシジルを使用した。この場合も、それぞれ、異なる露光時間、すなわち
、１０min ｔUV（１０ｇ／ｌ（水）及び２０ｇ／ｌ（水））及び１５min ｔUV（
２０ｇ／ｌ（水）の場合のみ）を使用した。 上記モノマーによって調製した結合箇所は、エポキシド基であった。 各種のバリエーションを以下に括めた： １．メタクリル酸グリシジル１０ｇ／ｌ １０min ｔUV ２．メタクリル酸グリシジル２０ｇ／ｌ １０min ｔUV ３．メタクリル酸グリシジル２０ｇ／ｌ １５min ｔUV それぞれ、＋ヒドロキシメチルメタクリルアミド２５ｇ／ｌ
【００４７】
試料に対して、バイオ分子固定及びバイオ分子アッセイ（Assay)を実施した。
【００４８】
Ａ） ＥＤＣ／ＮＨＳによって２５℃において１ｈ活性化した表面に、Ｎ−ア
ミノエチルビオチンアミド（“ビオチンアミン”；Molecular Probes）を介して
ビオチンを結合させた（ｐＨ7.4 ，２５℃において５ｈ反応させた）；ブランク
試料を同様に調製した。但し、“ビオチンアミン”は使用しなかった。
ミノエチルビオチンアミド（“ビオチンアミン”；Molecular Probes）を介して
ビオチンを結合させた（ｐＨ7.4 ，２５℃において５ｈ反応させた）；ブランク
試料を同様に調製した。但し、“ビオチンアミン”は使用しなかった。
【００４９】
Ｂ） 表面に“ビオチンアミン”を介してビオチンを結合させた（ｐＨ9.6 ，
２５℃において一晩反応させた）。緩衝液中で、ｐＨ＝9.6 ，２５℃において一
晩培養してブランク試料を得た。
２５℃において一晩反応させた）。緩衝液中で、ｐＨ＝9.6 ，２５℃において一
晩培養してブランク試料を得た。
【００５０】
それぞれ、１６ｍｍ2 の官能化ガラスを使用して、Ａ及びＢにおいて、ビオチ
ン・アッセイを実施した：１）ストレプトアビジン・アルカリ性ホスファターゼ
共役体によって室温（ＲＴ）において３０min 培養；２）37℃において３０min
、パラニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰ）と反応させ、 405ｎｍにおいて反
応体の測光を行う。 測光結果を図１に示した。
ン・アッセイを実施した：１）ストレプトアビジン・アルカリ性ホスファターゼ
共役体によって室温（ＲＴ）において３０min 培養；２）37℃において３０min
、パラニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰ）と反応させ、 405ｎｍにおいて反
応体の測光を行う。 測光結果を図１に示した。
【００５１】
双方の事例について、官能化表面に対するビオチンの極めて有効な結合が認め
られた。この場合、バックグランド信号（この場合、ストレプトアビジン・共役
体の不特定結合による）は、モノマー（Ｂ）の対応する選択によって、又はチャ
ージ（被覆）密度（Ａ２，３）の制御を介して最小化できる。
られた。この場合、バックグランド信号（この場合、ストレプトアビジン・共役
体の不特定結合による）は、モノマー（Ｂ）の対応する選択によって、又はチャ
ージ（被覆）密度（Ａ２，３）の制御を介して最小化できる。
【００５２】
図２に、官能化すべき表面範囲１１に、円錐形凹み１２を規則的間隔で設けた
平坦な担体１０を示した。円錐形凹みは、例えば、約２０μｍの径を有すること
ができ、同じく２０μｍの相互間隔を有することができる。通常のスポットは、
約 100〜150 μｍの径を有し、したがって、担体１０の表面１１上の２０〜４０
個の範囲の円錐形凹みを被う。上記データは、もちろん、絶対的なものではない
。同じく、形状、径などの異なる凹みを表面に構成した担体を使用することもで
きる。しかしながら、凹みは担体内で、できる限り狭窄することが肝要である。
なぜならば、かくして生ずる傾斜面が、所望の表面積増大を実現するからである
。
平坦な担体１０を示した。円錐形凹みは、例えば、約２０μｍの径を有すること
ができ、同じく２０μｍの相互間隔を有することができる。通常のスポットは、
約 100〜150 μｍの径を有し、したがって、担体１０の表面１１上の２０〜４０
個の範囲の円錐形凹みを被う。上記データは、もちろん、絶対的なものではない
。同じく、形状、径などの異なる凹みを表面に構成した担体を使用することもで
きる。しかしながら、凹みは担体内で、できる限り狭窄することが肝要である。
なぜならば、かくして生ずる傾斜面が、所望の表面積増大を実現するからである
。
【００５３】
図２に示した担体１０は、未だ、表面官能化されてない。図３の断面図に、表
面官能化状態を示した。同図には、同じく、凹み120 を構成した官能化表面110
を有する担体100 が示してある。官能化の枠内において表面110 に共有結合され
たポリマー鎖を130 で示した。もちろん、円錐形凹み120 当り、寸法的に円錐体
底面に対応する表面110 の同等の平坦部分の場合よりも、多数のポリマー鎖130
を結合できる。
面官能化状態を示した。同図には、同じく、凹み120 を構成した官能化表面110
を有する担体100 が示してある。官能化の枠内において表面110 に共有結合され
たポリマー鎖を130 で示した。もちろん、円錐形凹み120 当り、寸法的に円錐体
底面に対応する表面110 の同等の平坦部分の場合よりも、多数のポリマー鎖130
を結合できる。
【図１】
本発明に基づき製造される官能化担体の実施の形態の結合特性を示すグラフ図
である。
である。
【図２】
本発明に基づき使用される担体の構造を示す平面図である。
【図３】
図２に示した担体から製造した表面官能化担体の断面図である。
１０，100 担体
１１，110 表面
１２，120 円錐形凹み
130 ポリマー鎖
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０８Ｆ 20/00 ５１０ Ｃ０８Ｆ 20/00 ５１０
Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ
Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２
Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB20 CC03 CC08 FA12
4D075 AE03 BB42Z BB46Z BB68X
DA07 DB13 DB36 DB37 DB38
DB48 DC30 EA07 EA21 EB20
EB22 EB24 EB33 EC07 EC37
4J011 CA01 CA02 CC08 CC10 QA02
QA03 QA06 QA33 QA34 QA35
QA38 QA40 SA22 UA01 VA01
WA10
Claims (21)
- 【請求項１】 マイクロアレーの製造のための出発製品として役立つバイオ
分子固定のための担体を製造する方法において、担体表面に開始剤を被覆し、次
いで、被覆された表面を、重合可能なモノマーの第１グループを含む少なくとも
１つの溶液と接触させ、モノマーが、バイオ分子（ゾンデ分子）を結合できる結
合箇所を有し、モノマーが、開始剤を介して担体と結合し、次いで、官能化すべ
きポリマー鎖を重合させて、担体表面に固定された隣接の官能ポリマー鎖の構造
が生ずるように、モノマー溶液を賦活担体と接触させる条件を選択することを特
徴とする方法。 - 【請求項２】 開始剤として、光活性化可能な物質、特に、ベンゾフェノン
を使用することを特徴とする請求項１に係る方法。 - 【請求項３】 担体が、ガラス又は合成樹脂からなることを特徴とする請求
項１又は２に係る方法。 - 【請求項４】 使用する合成樹脂担体が、ポリスチロール，ポリカーボネー
ト，ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンからなることを特徴とする請求項３に係
る方法。 - 【請求項５】 担体が、平坦に構成されており、官能化のために設けた表面
範囲に凹みを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に係る方法。 - 【請求項６】 形状及び大きさが同一の凹みが、相互に同一の間隔を置いて
、担体表面に設けてあることを特徴とする請求項５に係る方法。 - 【請求項７】 凹みが、先端を担体へ向けたピラミッド又は円錐体の形状を
有することを特徴とする請求項５又は６に係る方法。 - 【請求項８】 使用するガラス製担体を、第１工程において、シラン化する
ことを特徴とする請求項１〜３及び５〜７のいずれか１項に係る方法。 - 【請求項９】 モノマーの少なくとも１つの他の第２グループを、担体にお
いて、第１グループと共重合させ、この場合、第２グループのモノマーは、バイ
オ分子のための結合箇所を有してないことを特徴とする請求項１〜８のいずれか
１項に係る方法。 - 【請求項１０】 共重合された官能ポリマー鎖の所望の親水性又は疎水性の
調節のため、第２グループのモノマーの選択及びモノマー使用濃度の決定を適切
に行うことを特徴とする請求項９に係る方法。 - 【請求項１１】 第２グループのモノマーの選択及び使用濃度に基づき、ス
ポッテイング時に沈積した液滴を受容、保持する三次元構造を有する共重合官能
ポリマー鎖が得られることを特徴とする請求項１０に係る方法。 - 【請求項１２】 第１及び第２グループのモノマーを下記化合物、すなわち
、アクリル酸，メタクリル酸，アクリル酸又はメタクリル酸の誘導体及びビニル
化合物又はアリル化合物から選択したことを特徴とする請求項１〜１１のいずれ
か１項に係る方法。 - 【請求項１３】 第１グループのモノマーを下記化合物、すなわち、アクリ
ル酸，メタクリル酸グリシジル又はメタクリル酸アミノアルキルから選択したこ
とを特徴とする請求項１２に係る方法。 - 【請求項１４】 第２グループのモノマーを下記化合物、すなわち、ポリエ
チレングリコール，メタクリラート又はヒドロキシメチルメタクリルアミドから
選択したことを特徴とする請求項１３に係る方法。 - 【請求項１５】 第１グループのモノマーに含まれた結合箇所が、官能基、
特に、ＣＯＯＨ−，ＳＨ−，ＮＨ２ −，エポキシド基又はチオール基であるこ
とを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に係る方法。 - 【請求項１６】 マイクロアレーの製造法において、請求項１〜１５のいず
れか１項に基づき製造した表面改質担体上の所定範囲に、溶媒に溶解したゾンデ
分子を液滴状に沈積することを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 表面改質した担体に、スポッティングによってゾンデ分子
を被覆することを特徴とする請求項１６に係るマイクロアレー製造方法。 - 【請求項１８】 ゾンデ分子としてオリゴヌクレオチド又は抗体を使用する
ことを特徴とする請求項１６又は１７に係る方法。 - 【請求項１９】 マイクロアレーを核酸分析のマイクロチップとして構成す
ることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に係るマイクロアレー製造
方法。 - 【請求項２０】 請求項１〜１５のいずれか１項に基づき製造できる表面改
質担体。 - 【請求項２１】 請求項１６〜１９のいずれか１項に基づき製造できるアレ
ー結合技術用担体。
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| DE10028851.0 | 2000-06-02 | ||
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