DE69126064T2

DE69126064T2 - Nachweis von schwachen Metabolisierungsreagentien von Drogen

Info

Publication number: DE69126064T2
Application number: DE69126064T
Authority: DE
Inventors: Urs Albert Meyer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1991-05-29
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2011-05-30
Also published as: AU645091B2; US5648482A; JPH05211895A; NZ238610A; JP3372044B2; EP0463395B1; EP0463395A1; AU7848791A; ES2103756T3; CA2045012C; DE69126064D1; CA2045012A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Primer für den Nachweis von Genen für Arzneimittel metabolisierende Enzyme, insbesondere zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von mutierten Nucleotidsequenzen innerhalb der Gene von "schlechten Metabolisierern" (PM) von Arzneimitteln. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren und einen Diagnosekit zum Nachweis solcher Gene oder Nucleotidsequenzen unter Verwendung der PCR-Technologie.
Polymorphe Gene spielen eine wichtige Rolle als Ursache von interindividuellen Variationen des Arzneimittel-Metabolismus und dem Auftreten von Nebenwirkungen und therapeutischem Versagen. Außerdem dienen sie als genetische Marker für zahlreiche Erkrankungen. Die Sichtbarmachung dieser Mutationen ist daher von klinischer Bedeutung und eine routinemäßige Phänotypisierung wurde empfohlen, insbesondere für Psychiatrie-Patienten und für Freiwillige bei klinischen Studien (Gram und Br sen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics, Kommission der Europäischen Gemeinschaft, Luxemburg, 1990, Seiten 87 bis 96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554 [1989]). Außerdem haben Studien in letzter Zeit darauf hingedeutet, daß eine Verbindung existieren könnte zwischem dem Debrisoquin-Phänotyp und einigen Formen von Krebs (Caporaso et al., Cancer Research 49, 3675-3679 [1989]).
Die Existenz einer polymorphen Oxidation von Debrisoquin und Spartein, die von Mahgoub et al., Lancet 1977, Seiten 584 bis 586 und Eichelbaum et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 16, 183-187 [1979], berichtet wird, verursachte ein Wiederaufleben des Interesses an genetischen Faktoren, die die individuelle Reaktion auf Arzneimittel beeinflussen. Heutzutage ist der Debrisoquin-Polymorphismus wahrscheinlich eine der am besten untersuchten Variationen des Arzneimittel-Metabolismus. In diesem Fall wird der Phänotyp des sogenannten TV "schlechten Metabolisierers" (PM) autosomal rezessiv vererbt und tritt mit einer Häufigkeit von 5 bis 10 % bei der Europäischen und Nordamerikanischen Bevölkerung auf (Meyer et al., Advances in Drug Research 19, 197-241 [1989] und Eichelbaum, ISI Atlas of Science; 243-251 [1988]). Phänotyp bedeutet eine physikalische Eigenschaft oder ein Verhaltensmerkmal eines Organismus. Im Fall des Debrisoquin-Polymorphismus ist der PM-Phänotyp mit der Unfähigkeit einer wirksamen Metabolisierung von mehr als 25 Arzneimitteln verbunden, einschließlich Antiarrhythmika (z.B. Flecainid und Propafenon), Antidepressiva (z.B. Imipramin, Nortriptylin, domipramin), Neuroleptika (z.B. Perphenazin und Thioridazin), angstiösende Mittel (Perhexilin) und Opiate (z.B. Dextromethorphan und Codein (Meyer et al., Pharmac. Ther. 46, 297-308 [1990]). Menschen, die unter diesem Mangel des Arzneimittel-Metabolismus leiden, erleiden häufig starke pharmakologische oder toxische Reaktionen, wenn sie mit gewöhnlichen Dosierungen von Arzneimitteln behandelt werden.
Zusätzlich zu dem Debrisoquin-Polymorphismus wurden zwei andere genetische Polymorphismen des Arzneimittel-Metabolismus auf molekularer Ebene untersucht. Dies sind der Mephenytoin-Polymorphismus, der in der P450IIC-Unterfamilie angeordnet ist und der Acetylierungs-Polymorphismus (Meyer et al., Advances in Drug Research 19, 197-241 [1989]). Die Gründe für diese metabolischen Störungen scheinen die gleichen zu sein, wie für den Debrisoquin-Polymorphismus, indem verschiedene Mutationen in entsprechenden Genen, die die metabolisierenden Enzyme kodieren, vorliegen.
Frühere Untersuchungen haben darauf hingedeutet, daß der Debrisoquin-PM-Phänotyp durch Abwesenheit eines spezifischen Cytochrom-P450-Isozyms, das als P450IID6 (Nebert et al., DNA 8, 1-13 [1989]) oder P450db1 (Zanger et al., Biochemistry 27, 5447-5454 [1988]) bezeichnet wird, in der Leber verursacht wird. Das Gen für P450IID6, das als CYP2D6 (Nebert et al., oben) bezeichnet wird, wurde auf Chromosom 22 lokalisiert (Gonzalez et al., Genomics 2, 174-179 [1988]). Ein postuliertes Pseudogen CYP2D7 und ein definitives Pseudogen CYP2D8 sind 5' des CYP2D6-Locus angeordnet (Figur 1), (Kimura et al., Am. J. Hum. Gen. 45, 889-904 [1989]). Ein abweichendes Spleißen der premRNA wurde beobachtet in der Leber von PMs und könnte die Abwesenheit erklären (Gonzalez et al., Nature 331, 442-446 [1988]). Diese Veröffentlichungen von Gonzalez et al. oder Kimura et al., die oben erwähnt wurden, beschreiben cDNA's (und nicht genomische DNA-Sequenzen) die keine spezifischen Mutationen des CYP2D6-Gens definieren, die die Bestimmung des Genotyps und die Zuordnung des entsprechenden Debrisoquin-Phänotyps zulassen wurden. In weiteren Untersuchungen, in denen eine Analyse des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) der Leukocyten-DNA verwendet wurde, wurden mehrere mutierte Allele des P450IID6- Genlocus (CYP2D), die mit dem PM-Phänotyp verbunden sind, identifiziert (Skoda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5240-5243 [1988]) . Nach dem Verdau der genomischen DNA mit dem Restriktionsenzym XbaI erzeugten diese zwei Allele charakteristische Fragmente mit 11,5 kb bzw. 44 kb (Figur 2). Jedoch prognostizierten bisher nur die Genotypen 44/44 kb, 44/11,5 kb oder 11,5/11,5 kb den PM-Phänotyp. Man hatte gehofft, daß die RFLP-Analyse eine Genotypisierung aller PMs zulassen würde. In der Praxis konnten nur 25 % der PMs vorhergesagt werden nach Tests mit zahlreichen Restriktions- Endonucleasen. Alle extensiven Metabolisierer (EM) und der Rest der PMs (75 %) hatten ein oder zwei 29 kb Fragmente, die sowohl ein aktives (Wildtyp) als auch ein defizientes Allel darstellen können. Daher haben die RFLP-Muster den Nachteil, daß sie im Hinblick auf den Phänotyp nicht informativ sind. Um alle mutierten Allele zu berücksichtigen, bedürfen daher die, die durch die XbaI-29 kb Fragmente dargestellt werden, einer weiteren genomischen Charakterisierung.
Früher wurde der Phänotyp durch die Verabreichung eines Test- Arzneimittels (Debrisoquin, Spartein oder Dextrometorphan) und anschließendes mehrstündiges Sammeln von Urin und eine Bestimmung des Verhältnisses von Ausgangs-Arzneimittel und seinem Metabolit (Urin-Metabolit-Verhältnis) bestimmt. Dieses Verfahren hat beträchtliche Beschränkungen wegen der nachteiligen Arzneimittel-Reaktionen, Arzneimittel-Wechselwirkungen und der verwirrenden Wirkung auf Krankheiten. Die Identifizierung der mutierten Gene, die den PM-Phänotyp verursachen (d.h. des Genotyps) und die anschließende Entwicklung von Tests zum Nachweis des entsprechenden Genotyps ist daher erwünscht.
Der Acetylierungs-Polymorphismus ist auch ein klassisches Beispiel für einen genetischen Defekt beim Arzneimittel- Metabolismus. Er wurde vor über einem Vierteljahrhundert mit dem Einsetzen der Isoniazid-Therapie für Tuberkulose von Hughes et al. (Am. Rev. Respir. Dis., 70, 266-273 [1954]) beobachtet. Patienten konnten als "schnelle" oder "langsame" Ausscheider von Isoniazid klassifiziert werden und Familien- Untersuchungen deuteten darauf hin, daß die Fähigkeit, Isoniazid auszuscheiden, durch zwei Allele auf einem einzigen autosomalen Genlocus bestimmt wurde, wobei langsame Acetylierer homozygot für ein rezessives Allel waren, wie von Evans et al. in Br. Med. Jr., 2, 485-491 (1960) beschrieben. Der Polymorphismus der N-Acetylierung wurde kürzlich in einem Überblick von Meyer et al. in Advances in Drug Research 19, 197-241 (1989) gezeigt.
Die Anteile von schnellen (RA) und langsamen (SA) Acetylierem variieren bemerkenswert bei verschiedenen ethnischen und/oder geographischen Populationen. Zum Beispiel ist der Prozentanteil der langsamen Acetylierer bei den kanadischen Eskimos 5 %, während er bei den Ägyptern auf 83 % und bei den Marokkanern auf 90 % ansteigt. Die meisten Populationen in Europa und Nordamerika haben eine ungefähr gleiche Anzahl von schnellen und langsamen Acetylierern.
Zahlreiche nachfolgende Untersuchungen haben gezeigt, daß der Acetylierungspolymorphismus den Metabolismus einer Vielzahl anderer Arylamin- und Hydrazin-Arzneimittel und zahlreicher Fremdchemikalien beeinflußt. Dies schließt die Arzneimittel Sulfamethazin (SMZ) und verschiedene andere Sulfonamide, Hydralazin, Procainamid, Dapson, p-Aminobenzoesäure (PABA), Phenelzin und Aminoglutethimid ein. Der Polymorphismus betrifft auch den Metabolismus von Coffein, Clonazepam und Nitrazepam ebenso wie die potentiellen Arylamin-Karzinogene Benzidin, 2-Aminofluoren und β-Naphthylamin.
Das Phänotypisierungsverfahren wurde für den Fall des Acetylierungs-Polymorphismus unter Verwendung von Isonazid später ersetzt durch einen Test mit Sulfamethazin oder Dapson. Kürzlich wurde ein Phänotypisierungsverfahren unter Verwendung von Coffein als Testsubstanz entwickelt und von Grant et al. in Brit. J. Clin. Pharmacol. 17, 459-464 (1984) beschrieben und weiter verfeinert von Tang et al., wie in Clin. Pharmacol. Ther. 42, 509-513 (1987) beschrieben. Diese Verfahren haben die gleichen praktischen Beschränkungen, wie oben für den Debrisoquin-Polymorphismus beschrieben. Ein praktischeres und eindeutigeres Verfahren zur Bestimmung dieses Polymorphismus ist daher erwünscht.
Kürzlich wurde das Gen, das die menschliche Leber-Arylamin- N-Acetyltransferase (NAT) kodiert, das für den oben beschriebenen Acetylierungs-Polymorphismus verantwortlich ist, aus menschlicher Leukocyten-DNA von Blum et al. kloniert (DNA and Cell Biology 9, 193-203 [1990]). Die Sequenzen dieser Gene haben die folgenden Bezeichnungen und Hinterlegungsnummern in der EMBL-Datenbibliothek: NAT1, hgnat-a, X17059; NAT2, hgnat-b, X14672. Zwei Gene, die mit NAT1 und NAT2 bezeichnet werden, wurden dem menschlichen Chromosom 8, pterq11, zugeordnet. Das Produkt des NAT2-Gens hatte ein identisches scheinbares Molekulargewicht wie das NAT-Protein, das im menschlichen Lebercytosol nachgewiesen wird. Die zwei menschlichen Gene NAT1 und NAT2, die zwei NAT-Proteine kodieren, wurden kloniert und charakterisiert. Die Zahlen, die den Basissequenzen von NAT1 und NAT2 gegeben wurden, wurden auch in dieser Beschreibung verwendet. NAT2 wurde identifiziert als das Gen, das das polymorphe NAT2-Isozym kodiert. Die Kenntnisse über die Mutationen der Allelvarianten des NAT2-Gens würden die Entwicklung von Methoden zum Nachweis des Genotyps statt des PM-Phänotyps zulassen.
Daher liefert die vorliegende Erfindung Methoden zum Nachweis von normalen und mutierten Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, die eine Phänotypisierung von schlechten (oder langsamen) Metabolisierern, wie oben erwähnt, zulassen.
Die Erfindung liefert auch spezifische Primer für den Nachweis der normalen und mutierten Gene, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren.
Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden Figuren:
Figur 1 Struktur des CYP2D6-8-Genclusters und seiner häufigsten Allele
A: Der Cluster enthält das funktionelle CYP2D6-Gen und das wahrscheinlich nicht funktionelle CYP2D7- und das definitiv nicht funktionelle CYP2D8-Gen. Die Exons sind mit 1 bis 9 numeriert. Die Restriktionsstellen für verschiedene Endonudeasen sind angegeben als E: EcoRI; B: BamHI; H: HindIII; X: XbaI.
B: Das aktive 29-wt-(Wildtyp)-Allel und die vier häufigsten defekten Allele sind schematisch gezeigt. Die Allele 29-A und 29-B haben Punktmutationen im CYP2D6-Gen. Das 11,5 kb Allel hat das gesamte CYP2D6-Gen verloren. Das 44 kb Allel hat ein zusätzliches, bis jetzt unbekanntes Gen und ein mutiertes CYP2D6-Gen, zumindest bei den Kaukasiern.
Figur 2 RFLP-Analyse von menschlicher DNA. Mindestens vier Allele können mit RFLP-Analyse von menschlicher genomischer DNA nach Verdau mit der Restriktions- Endonuclease XbaI identifiziert werden. Eine radioaktiv markierte P450IID6-cDNA wurde als Sonde verwendet. Drei Allele wurden als Fragmente mit 44 kb, 29 kb und 11,5 kb identifiziert. Ein Allel wurde mit 16+9 bezeichnet, da diese zwei Fragmente immer in Kombination gefunden wurden. Diese Allele treten in homozygoter oder heterozygoter Anordnung auf.
Figur 3 Restriktionsanalyse von genomischen DNA-Klonen von drei schlechten Metabolisierern von Debrisoquin. Zwei Klone von jeder Person, die das 9,4 kb EcoRI- Fragment mit dem CYP2D6-Gen enthielten, wurden analysiert. E: EcoRI; B: BamHI. Der Stern zeigt die zusätzliche BamHI-Stelle, die in den mit 29-B und 29-B' bezeichneten Allenen gefunden wurde: alle Exons und Intron-Exon-Verbindungen wurden sequenziert, außer bei den zwei Klonen 29-B, die in Klammern angegeben sind, wo nur die Bereiche mit Mutationen sequenziert wurden.
Figur 4 Anordnung der Mutationen auf zwei Allelen (29-A, 29-B) des CYP2D6-Gens. Der Stern zeigt die zusätzliche BamHI-Stelle (B). Die genaue Anordnung aller Mutationen ist in Beispiel 1B angegeben.
Figur 5 Eine schematische Beschreibung der Konstruktion des eukaryotischen Expressionsvektors pCMV, der die Wildtyp- und chimären CYP2D6-Gene enthält. Das Verfahren und der Vektor sind im Detail in Beispiel 1 angegeben. E: EcoRI; B: BamHI; Hc: HincII; Bs: BssHII; A: AccI; K: KpnI; S: SmaI; H: HindIII. Die chimären Gene von Figur 6 wurden in pUC19 zusammengebaut unter Verwendung von Kombinationen der drei Teile E-Bs (1,8 kb), Bs-A (0,8 kb) und A-H (1,8 kb).
Figur 6 Expression von chimären Genkonstrukten aus Wildtyp CYP2D6 und dem mutierten 29-B-Allel in COS-1-Zellen. 6A: Beschreibung der drei Teile des Wildtyp-(W)- Gens, die gegen die entsprechenden Teile des 29-B- Allels (B) mit Mutationen ausgetauscht wurden. Die Mutationen, die Aminosäure-Veränderungen in Exon 1, 2 und 9 verursachen, sind mit o angegeben, die Mutation in der Spleißstelle der Consensussequenz des 3d-Introns ist mit x angegeben. 6B: Northernblot (mRNA), Westernblot (Protein) und Bufuralol-1'- hydroxylierung von COS-1-Zellextrakten 66 Stunden nach der Transfektion mit den DNA-Konstrukten 1 bis 4, dem intakten Wildtyp (CYP2D6) und dem mutierten (29-B)-Gen. Kontrolle: Mock-transfizierte Zellen.
Figur 7 Expression einzelner Mutationen in Exon 1 (MI) und Exon 2 (MII, MIII) des CYP2D6-Gens. Die Mutationen, die im oberen Teil angezeigt sind, wurden in die Wildtyp IID6-cDNA eingeführt, vorübergehend von COS- 1-Zellen exprimiert und das exprimierte Protein mit Westernblot und auf Bufuralol-1'-hydroxylierungs- Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Figur 8 Prinzip der allelspezifischen Amplifizierung.
A: Primer 1 bis 4 sind komplementär zu den Intronsequenzen des CYP2D6-Gens. Sie werden so ausgebildet, daß eine Amplifizierung von CYP2D7 oder CYP2D8 (Figur 1) ausgeschlossen ist. Das Primerpaar 1/2 liefert das Fragment B mit 739 bp; das Primerpaar 3/4 das Fragment A mit 1123 bp. B: 1 µl des Produktes der ersten PCR wird in der zweiten allelspezifischen PCR verwendet. Die Spleißstellen-Mutation des 29-B-Allels dient als Beispiel, aber das gleiche Prinzip gilt für eine Rastermutation des 29-A- Allels. Der "übliche Primer" ist Primer 1, der bereits bei der ersten Reaktion verwendet wurde. Die zwei verwendeten spezifischen Primer sind komplementär zu der Sequenz an der Verbindung Intron3- Exon4. Der "Wildtyp-spezifische Primer" 7 erzeugt ein Amplifizierungsprodukt aus Matrizen-DNA ohne die Spleißstellenmutation, wohingegen der "mutationsspezifische Primer" 8 nur an die komplementäre Sequenz des 29-B-Allels bindet.
Figur 9 Allelspezifische PCR-Amplifizierungsprodukte von drei einzelnen Personen. Die drei möglichen Ergebnisse sind durch die drei Personen dargestellt. Person #18 mit EM-Phänotyp und einem 29/29 kb XbaI- RFLP-Muster hat kein 29-B-Allel mit einer Spleißstellen-Mutation. Person #13 (PM, 29/29 kb XbaI) hat ein oder zwei 29-B-Allele und kein Allel mit einer normalen Spleißstelle, die hier als "wt" bezeichnet wird. Person #37 (PM, 29/29 kb XbaI) hat ein Allel mit einer normalen Spleißstelle (wt) und ein Allel mit einer mutierten Spleißstelle (29-B).
Figur 10 Identifizierung der zwei mutierten NAT2-Allele M1 und M2 durch RFLP-Analyse und Sequenzbestimmung der klonierten Mutanten. (a) Kpn1-Muster einer Familie mit zwei Generationen (Bahnen 1 bis 4) und von DNA von zwei weiteren Personen. Genomische DNA (5 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, elektrophoretisch auf 0,5 % Agarosegelen aufgetrennt und mit radioaktiv markiertem NAT2 hybridisiert nach Transfer auf eine Nylonmembran. Die Hybridisierung und das Waschen wurden durchgeführt, wie im Stand der Technik beschrieben, z.B. von Sambrook, Fritsch und Maniatis in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press [1982]). Die Phänotypen (R=schneller, S=langsamer Acetylierer) sind oberhalb jeder Bahn angegeben; die Zahlen bedeuten die Größe der Banden in kb. (b) Nucleotid- und Aminosäureveränderungen in M1 und M2, verglichen mit dem Wildtyp-(wt)-Gen; Die Nucleotidnumerierung bezieht sich auf das kodierende Exon (Position 1 = A im Startcodon ATG), wie von Blum et al. in DNA and Cell Biology 9, 193-203 (1990) beschrieben.
Figur 11 zeigt die allelspezifische Amplifizierung mit PCR für drei Mutationen, die mit dem Phänotyp des langsamen Acetylierers verbunden sind. Die Erklärungen der in den Bahnen 1 bis 6 sichtbaren Banden sind in Beispiel 5 angegeben.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, in einer Probe umfassend, daß man
a) eine Nucleinsäuresequenz von allelischen Formen des Gens mit einem wt- oder mutationsspezifischen Primer und einem geeigneten genspezifischen Primer amplifiziert,
b) die amplifizierten Produkte von Stufe a) nachweist.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens wird vor der wt- oder mutationsspezifischen Amplifizierungsstufe a) eine spezifische Amplifizierung von Teilen des Gens selbst in einem Bereich, der die Mutationen enthält, durchgeführt. Dies verhindert die Amplifizierung von homologen Sequenzen in verwandten Pseudogenen, die die gleichen Mutationen enthalten können und deren Amplifizierung zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte.
Bevorzugt ist ein Verfahren zum Nachweis von schlechten Metabolisierern des Debrisoquin-Phänotyps umfassend die folgenden Stufen:
a) Amplifizierung eines 739 bp Fragments des CYP2D6-Gens mit Primern, die die Sequenzen
5' ATTTCCCAGCTGGAATCC 3'
und 5' GAGACTCCTCGGTCTCTC 3' umfassen;
b) Amplifizierung einer geringen Menge des Produkts von Stufe a) mit Primern, die die Sequenzen
5' ATTTCCCAGCTGGAATCC 3'
und 5' CGAAAGGGGCGTCC 3'
umfassen, um ein 564bp-Fragment des 29-wt- und 29-A-Allels zu erhalten, falls es in der Probe enthalten ist;
c) Amplifizierung einer weiteren geringen Menge des Produkts von Stufe a) mit Primern, die die Sequenzen
5' ATTTCCCAGCTGGAATCC 3'
und 5' CGAAAGGGGCGTCT 3' umfassen, um das 564bp-Fragment des 29-B-Allels zu erhalten, falls es in der Probe enthalten ist;
d) Nachweis des Auftretens des Reaktionsproduktes der Reaktionen b) und c).
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von schlechten Metabolisierern des Debrisoquin-Phänotyps umfaßt die folgenden Stufen:
a) Amplifizierung eines 1123 bp Fragmentes des CYP2D6-Gens mit Primern, die die Sequenzen
5' GCGGAGCGAGAGACCGAGGA 3'
und 5' CCGGCCCTGACACTCCTTCT 3' umfassen;
b) Amplifizierung einer geringen Menge des Produktes von Stufe a) mit Primern, die die Sequenzen
5' CCGGCCCTGACACTCCTTCT 3'
und 5' GCTAACTGAGCACA 3' umfassen, um ein 588 bp Fragment des 29-wt- und 29-B- Allels zu erhalten, falls es in der Probe enthalten ist;
c) Amplifizierung einer geringen Menge des Produktes von Stufe a) mit Primern, die die Sequenzen
5' CCGGCCCTGACACTCCTTCT 3'
und 5' GCTAACTGAGCACG 3' umfassen, um ein 588 bp Fragment des 29-A-Allels zu erhalten, falls es in der Probe enthalten ist;
d) Nachweis der Abwesenheit oder Gegenwart von Produkten der Stufen b) und c).
Ein Verfahren zum Nachweis von schlechten Metabolisierern des Acetylierungs-Phänotyps ist möglich durch RFLP-Analyse, die zur Identifizierung der mutierten Allele M1, M2 und M3 führt.
Um mutierte Allele zu identifizieren, wurde eine Restriktionsfragment-Analyse an genomischen DNA-Proben von 25 gesunden Personen durchgeführt, deren Acetylierungs-Phänotyp festgestellt worden war, indem der acetylierte Metabolit von Coffein im Urin gemessen wurde (Grant et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 17, 459-464 [1984]) und an DNA von 33 menschlichen Leberproben mit bekannter NAT2-Enzymaktivität, die mit dem Substrat Sulfamethazin gemessen wurde (SMZ; Grant et al., J. Clin. Invest. 85, 968-972 [1990]). Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen wurden so ausgewählt, daß NAT2-spezifische Signale 10- bis 50fach stärker waren, als Signale von den zwei verwandten humanen Genen NAT1 und NATP, deren Nucleotide mit NAT2 zu 87 bzw. 79 % identisch sind. Der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, der durch MspI und KpnI erzeugt wurde, spaltete den Acetylierungsphänotyp auf; der Einfachheit halber und weil MspI nur ein mutiertes Allel (M1) nachweist, sind nur KpnI-RFLPs in Figur 10a gezeigt. Die Muster in den Bahnen 1 bis 4 zeigen eine Auftrennung von NAT2-spezifischen Fragmenten in einer Familie mit zwei Generationen. Das wt-Allel wurde daher durch die zwei Banden mit 15 kb und 5 kb charakterisiert, wohingegen das mutierte Allel M1 durch eine einzige Bande bei 20 kb (Bahn 1) wiedergespiegelt wurde und das mutierte Allel M2 durch zwei Fragmente mit 15 kb und 4,4 kb. Beispiele für DNA, die homozygot für M2 und wt ist, sind in den Bahnen 5 und 6 von Figur 10a gezeigt.
Sowohl in M1 als auch in M2 war eine Punktmutation, die eine einzige Aminosäureveränderung in der abgeleiteten Proteinsequenz verursacht, mit einer zusätzlichen stillen Basensubstitution verbunden (Figur 10b). Die stille Mutation in M1 verändert die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym KpnI, was den beobachteten RFLP erklärt (Figur 10a).
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis (zur Genotypisierung) von schlecht metabolisierenden Personen mit dem langsamen Acetylierungsphänotyp ist wie folgt:
(a) Amplifizierung eines 568 bp Fragmentes des NAT2-Gens in einer Probe mit der vermeintlichen Mutante M1 und/oder dem Wildtyp-Allel unter Verwendung von Primern, die die Sequenz
5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3'
5' CTG ATT TGG TCC AG 3'
für das wt-Allel umfassen, und von Primern, die die Sequenz
5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3'
5' CTG ATT TGG TCC AA 3's
für das mutierte M1-Allel umfassen;
(b) Amplifizierung eines 565 bp Fragmentes des NAT2-Gens in einer Probe mit dem vermeintlichen mutierten M2- und/oder Wildtyp-Allel unter Verwendung von Primern, die die Sequenz
5' TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC 3'
5' TTT ACG CTT GAA CCT CG 3'
für das wt-Allel umfassen, und von Primern, die die Sequenz
5' TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC 3'
5' TTT ACG CTT GAA CCT CA 3'
für das mutierte M2-Allel umfassen;
(c) Amplifizierung eines 944 bp Fragmentes des NAT2-Gens in einer Probe mit dem vermeintlichen mutierten M3- und/oder Wildtyp-Allel unter Verwendung von Primern, die die Sequenz
5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3'
5' AAT AGT AAG GGA TC 3'
für das Wildtyp-Allel umfassen und von Primern, die die Sequenz
5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3'
5' AAT AGT AAG GGA TT 3'
für das mutierte M3-Allel umfassen;
(d) Nachweis, welche der oben beschriebenen Reaktionen zu amplifizierten Fragmenten führt, was die Bestimmung des Genotyps der analysierten Person zuläßt.
Nur eine Stufe ist erforderlich im Fall von NAT2, da die Primer
AAT TAG TCA CAC GAG GA und
TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC
nur das NAT2-Gen amplifizieren und keine verwandten Pseudogene. Nichtsdestotrotz kann das zweistufige Verfahren mit selektiver Genamplifizierung vor der selektiven Allel-Amplifizierung, wie im Fall des Debrisoquin-Polymorphismus gezeigt, auch für das NAT2-Gen im Acetylierungs-Polymorphismus angewendet werden.
Es versteht sich, daß die in diesen verschiedenen Amplifizierungsreaktionen verwendete Probe gleichen genetischen Ursprungs ist (d.h. von der gleichen Person). Die Probe kann vorbereitet und einmal für alle Amplifizierungen aufgeteilt werden oder die Probe kann aus verschiedenen Quellen (z.B. Haar, Haut, Leber etc.) hergestellt werden, die schließlich gleichen genetischen Ursprungs sind. Für weitere Details der Amplifizierung siehe Beispiel 5 in der Beschreibung.
Dieser DNA-Test läßt die Vorhersage des Acetylierer-Phänotyps bei mehr als 95 % der getesteten Personen zu und erfordert nur eine geringe Probe an DNA, die aus Leukocyten, einzelnen Haarwurzeln, Mundhöhlenepithel oder irgendeinem anderen Gewebe stammen kann.
Die Sequenzen der mutierten NAT2-Allele wurden mit im Stand der Technik bekannten Methoden erhalten. Die angewandten Methoden waren ähnlich denen, die für die genetische Analyse der Allele in dem Debrisoquin-Polymorphismus verwendet wurden, die ausführlich in Beispiel 1 beschrieben sind. Kurz gesagt erfolgte die Klonierung und Sequenzierung von mutierten NAT2-Allelen des Acetylierungspolymorphismus wie folgt:
mutiertes Allel M1 wurde aus einer Genbibliothek, die in λEMBL3 konstruiert worden war, isoliert unter Verwendung von DNA aus einem heterozygoten wt/M1-Individuum. Eine cDNA, die das Kaninchen-NAT2-Enzymprotein kodierte, wie von Blum et al. in Nucl. Acid. Res. 17, 3589 (1989) beschrieben, wurde für das Screenen verwendet. Zur Sequenzanalyse von M1 wurden 1,9 kb EcoRI-Fragmente, die das einzige kodierende Exon von NAT2 enthielten, aus 12 positiven λEMBL3-Klonen isoliert und in pBluescript (Stratagene) subkloniert. Entsprechende Methoden, die zur Klonierung von normalen und mutierten NAT- Genen verwendet wurden, werden auch von Blum et al. in DNA and Cell Biology 9, 193-203 (1990) beschrieben. M2 wurde aus DNA eines homozygoten M2/M2-Individuums kloniert, indem eine λgt10-Bibliothek gescreent wurde, die aus mit EcoRI verdauter genomischer DNA konstruiert wurde mit anschließender Größenselektion (1,6 bis 2,1 kb) auf einem 1 % Agarosegel. Das 1,9 kb EcoRI-Fragment, das das Wildtyp-(wt)-NAT2-kodierende Exon enthielt, wurde als Hybridisierungssonde verwendet und die Inserts von positiven Phagen wurden auch in pBluescript subkloniert. Die Sequenzen von M1 und M2 wurden bestimmt unter Verwendung der Didesoxyketten-Abbruchmethode von Sanger et al., beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463- 5467 (1977) und Sequenase (USB). Die Mutationen einschließlich der wirksamen Aminosäure-Veränderungen sind in Figur 10b gezeigt.
Die Sequenz von M3 wurde von einem anderen Labor veröffentlicht (Ohsako et al., Biol. Chem. 265, 4630-4634 [1990]). Es ist ein seltener Fall des langsamen Acetylierungs-Phänotyps bei den Kaukasiern. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Quelle für die selektive Amplifizierung von DNA-Fragmenten. Diese Methode ist in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben. Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Verfahren, bei dem DNA spezifisch amplifiziert wird durch mehrfache Primer-Extensionssynthese komplementärer Stränge (Saiki et al., Science 230, 1350-1354 [1985] und 239, 487-491 [1988]).
Das PCR-Produkt, bis zu 10&sup6;- bis 10&sup7;fach amplifiziert, ist ein DNA-Fragment diskreter Größe (Amplicon), das durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden kann oder mit anderen Mitteln, wie hier beschrieben. Kurz gesagt betrifft die PCR die Herstellung von kurzen Oligonucleotidprimern, die entgegengesetzten Enden einer bekannten "Ziel"-Sequenz entsprechen, die man amplifizieren und anschließend nachweisen möchte. Bei diesem Verfahren wird DNA oder RNA aus Zellen, Gewebe, Körperflüssigkeiten und dergleichen extrahiert. Die Nudeinsäure wird denaturiert und die Oligonucleotidprimer werden in molarem Überschuß zusammen mit dNTPs (Desoxyribonucleotid- Triphosphaten) und einem DNA-Polymeraseenzym zugegeben, z.B. bevorzugt hitzestabiler Taq-Polymerase. Dieses Enzym und seine Verwendung werden in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 258 017 beschrieben. Bei nachfolgender Hitzedenaturierung, Abkühlen, um ein Hybridisieren mit den Primern zuzulassen und Primer-Extension durch DNA-Polymerase werden zwei "lange Produkte", die mit den jeweiligen Primern beginnen, erzeugt, komplementär zu den zwei Originalsträngen. Dieses Verfahren wird wiederholt und nach einem zweiten Zyklus werden zwei Originalstränge, zwei lange Produkte aus Zyklus 1, zwei neue "lange Produkte" und zwei "kurze Produkte" erzeugt. Die Länge dieser kurzen Produkte (Amplicons) ist gleich der Anzahl von Nucleotiden zwischen und einschließlich von beiden Primern. Mit weiteren Zyklen werden zusätzliche "lange Produkte" erzeugt, die in linearer Weise mit jedem Zyklus ansteigen. Jedoch steigt die Erzeugung von Amplicons mit exponentieller Rate in jedem Zyklus und mit Hilfe dieser Amplifizierung wird der Nachweis von extrem geringen Mengen von DNA ermöglicht.
Jede Quelle von Nucleinsäuren in gereinigter oder nicht gereinigter Form kann als Ausgangs-Nucleinsäure oder Ausgangs- Nucleinsäuren verwendet werden, vorausgesetzt sie enthält die spezifische gewunschte Nucleinsäuresequenz oder es wird angenommen, daß sie sie enthält. So kann das Verfahren z.B. DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA anwenden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Außerdem kann ein DNA-RNA-Hybrid, das von jeder Art einen Strang enthält, verwendet werden. Eine Mischung jeder dieser Nucleinsäuren kann auch angewendet werden oder die Nucleinsäure, die bei einer vorherigen Amplifizierungs-Reaktion unter Verwendung der gleichen oder anderer Primer hergestellt wurde, kann verwendet werden. Die spezifische zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz kann nur ein Teil eines größeren Moleküls sein oder kann anfangs ein diskretes Molekül darstellen, so daß die spezifische Sequenz die gesamte Nucleinsäure bildet. Es ist nicht notwendig, daß die zu amplifizierende Sequenz anfangs in reiner Form vorhanden ist; sie kann ein geringerer Anteil in einer komplexen Mischung sein, z.B. ein Teil des Cytochrom P450-Gens, das in der gesamten menschlichen DNA enthalten ist. Tatsächlich wurde eine PCR- Amplifizierung von DNA aus einzelnen Haarwurzeln, Mundhöhlen- Epithelzellen, Blutflecken oder Urinsedimenten beschrieben (Gasparine et al., N. Engl. J. Med. 320, 809 [1989]; Eisenstein, N. Engl. J. Med. 322, 178-183 [1990]).
Der große Vorteil dieser Lösung zum Nachweis von PMs besteht darin, daß kein Proben-Arzneimittel verabreicht werden muß, kein Urin gesammelt werden muß und keine Wechselwirkung mit gleichzeitiger Arzneimittel-Behandlung auftritt, die das gewöhnliche Phänotypisierungsverfahren beschränken (Br sen et al., Eur. J. Clin. Pharmac. 36, 537-547 [1989]). Daher ist die Genotypisierung mit dem beschriebenen Verfahren eine attraktive und weniger zweideutige Alternative zu der Phänotypisierung über das Urin-Metabolit-Verhältnis.
Die Verwendung der PCR für die Amplifizierung ausgewählter Genfragmente des CYP2D6-Gens oder mutierter Allele davon, die schließlich für den Debrisoquin-Phänotyp verantwortlich sind, ist in den Beispielen 2 und 3 ausgeführt. Die zwei Reaktionen betreffen, wie bereits vorher beschrieben, als erste Stufe eine Amplifizierung des kodierenden Gens ohne Selektion irgendwelcher mutierten Varianten. Teile dieser Varianten- Allele werden selektiv in der zweiten Reaktion amplifiziert und dann nachgewiesen.
Allelspezifische Amplifizierung wäre im Prinzip möglich durch eine einzige PCR-Reaktion anstelle der zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen, wenn keine nah verwandten Gene in einer vorherigen Stufe vorselektiert werden müssen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin Primer zur Amplifizierung einer Nucleinsäuresequenz von Allelen von Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, um mutierte und wt-Allele nachzuweisen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Primer eine Länge von etwa 10 bis 50 Basen haben und am 3'-Ende mindestens eine Base enthalten, die komplementär zu der Mutation oder der wt-Sequenz an der entsprechenden Position ist und die verbleibenden Basen in 5'-Richtung im wesentlichen komplementär sind entweder zu dem kodierenden Strang oder dem Antisense-Strang dieses Gens. Bevorzugt haben die Primer eine Länge von 10 bis 25 Basen.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die Primer zur Amplifizierung der Nucleinsäuresequenzen von Allelen des CYP2D6-Gens am 3'-Ende eine Base, die komplementär ist zu den Basen Nrn. 1062, 1072, 1085, 1749, 1934, 2637 oder 4268 der wt- oder mutierten CYP2D6-Gensequenz, die das P450IID6-Enzym kodiert.
Am meisten bevorzugt sind Primer, die eine Sequenz umfassen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
5' CGAAAGGGGCGTCC 3'
5' CGAAAGGGGCGTCT 3'
5' GCTAACTGAGCACA 3'
5' GCTAACTGAGCACG 3'.
Die Erfindung liefert weiterhin Primer zur Amplifizierung einer Nucleinsäuresequenz von Allelen oder des NAT2-Gens, die die N-Acetyltransferase kodieren. Bevorzugt haben diese Primer an ihrem 3'-Ende Basen, die komplementär sind zu Base Nr. 282, 341, 481, 590 oder 857 der wt- oder mutierten NAT2- Gensequenz.
Am meisten bevorzugt sind Primer, die eine Sequenz umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5' CTG ATT TGG TCC AG 3'
5' CTG ATT TGG TCC AA 3'
5' AAT AGT AAG GGA TC 3'
5' AAT AGT AAG GGA TT 3'
5' TTT ACG CTT GAA CCT CG 3'
5' TTT ACG CTT GAA CCT CA 3'.
Die Erfindung liefert weiterhin Primer für die selektive Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen von Bereichen, die Mutationen von Genen enthalten, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Primer eine Länge von etwa 10 bis 50 Basen haben und im wesentlichen komplementär zu dem kodierenden Strang oder dem Antisense-Strang dieses Gens in dem Bereich sind, um eine selektive Amplifizierung von Teilen des Gens selbst einschließlich dessen Mutationen zuzulassen und eine Amplifizierung homologer Sequenzen in verwandten Pseudogenen zu verhindern.
Bevorzugt umfassen die Primer für die selektive Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen des CYP2D6-Gens eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
5' ATTTCCCAGCTGGAATCC 3'
5' GAGACTCCTCGGTCTCTC 3'
5' GCGGAGCGAGAGACCGAGGA 3'
5' CCGGCCCTGACACTCCTTCT 3'.
Bevorzugt umfassen die Primer für die selektive Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen des NAT2-Gens eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3'
5' TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC 3'.
Diese Primer können als geeignete genspezifische Primer verwendet werden, wie sie in der Amplifizierungsmethode für den Nachweis von Mutationen in Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, wie oben beschrieben, erwähnt werden. Solche Primer sollen eine spezifische Amplifizierung einer Nucleinsäuresequenz eines Gens zulassen, das Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodiert einschließlich von Allelen davon. Daher haben diese Primer einen zweifachen Zweck. Unter Verwendung von zwei dieser genspezifischen Primer ist eine Amplifizierung einer Nucleotidsequenz eines Gens möglich, das Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodiert. Mit diesen Amplifizierungs-Primern ist eine Vorselektion des Gens möglich, wodurch es von möglichen nah verwandten Pseudogenen abgetrennt wird, wobei aber die Mutationen in der amplifizierten Nucleotidsequenz einer weiteren Charakterisierung bedürfen, da die amplifizierte Nucleotidsequenz dann zusätzlich aus verschiedenen Sequenzen bestehen kann, die aus verschiedenen Mutationen innerhalb verschiedener Allele dieses Gens in der amplifizierten Region des Gens stammt. Diese Primer alleine können nicht spezifische Allele dieses Gens amplifizieren. Dies ist nur möglich, wenn sie in Kombination mit den oben beschriebenen allelspezifischen Primern verwendet werden. Wenn eine Auftrennung nah verwandter Pseudogene nicht notwendig ist, können diese genspezifischen Primer direkt in Verbindung mit allelspezifischen Primern verwendet werden, um spezifisch wtund mutierte Allele der Gene, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, zu amplifizieren und nachzuweisen. Andernfalls können die genspezifischen Primer noch einmal nach der Genamplifizierung in der allelspezifischen Amplifizierungsstufe zusammen mit den allelspezifischen Primern verwendet werden. Es ist auch möglich, neue genspezifische Primer zusammen mit den allelspezifischen Primern für die allelspezifische Amplifizierung zu verwenden.
Sonden, bevorzugt in einer markierten Form, werden direkt für den Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe verwendet, wohingegen ein Primer verwendet wird, um eine größere Anzahl der Ziel-DNA herzustellen gefolgt vom direkten Nachweis des amplifizierten Produktes, bevorzugt durch Gelelektrophorese. Eine markierte Sonde zum Nachweis kann zusätzlich nach der Amplifizierung verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von markierten Primern oder markierten Nucleosidtriphosphaten bei der Amplifizierungs-Reaktion, da diese Primer und Nucleotide in die amplifizierte Nucleinsäuresequenz eingebaut werden, was ihren Nachweis später erleichtert. Ausgewählte Oligonucleotidsonden und Primer können mit irgendeiner der vielen wohlbekannten Methoden markiert werden. Geeignete Markierungen schließen Radioisotope ebenso wie nicht radioaktive Reporter- Gruppen ein. Isotopische Markierungen schließen ³H, ³&sup5;S, ³²p, ¹²&sup5;I, Kobalt und ¹&sup4;C ein. Die meisten Methoden der Isotopenmarkierung betreffen die Verwendung von Enzymen und schließen bekannte Methoden der Nick-Translation, Endmarkierung, Zweitstrangsynthese und reversen Transkription ein. Wenn radioaktiv markierte Sonden verwendet werden, kann die Hybridisierung durch Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gammazählung nachgewiesen werden. Das ausgewählte Nachweisverfahren hängt von den Hybridisierungs-Bedingungen und dem jeweils für die Markierung verwendeten Radioisotop ab.
Nicht isotopische Materialien können auch für die Markierung verwendet werden und können durch Einbau modifizierter Nucleotide durch die Verwendung von Enzymen oder durch chemische Modifikation der Sonde eingeführt werden, z.B. durch Verwendung von Nicht-Nucleotid-Linkergruppen. Nicht isotopische Markierungen schließen fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, Cofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden ein.
Die Primer der vorliegenden Erfindung überwinden das Problem der Nachweisempfindlichkeit in üblichen auf Sonden basierenden Systemen. Wenn nur geringe Mengen der Zielsequenz in einer Probe verfügbar sind, kann es möglich sein, daß Sonden sie nicht nachweisen.
Die Primer der vorliegenden Erfindung können ohne weitere Modifikationen verwendet werden und können leicht auf einem DNA-Syntheseautomaten mit irgendeiner der verschiedenen bekannten Methoden synthetisiert werden, z.B. einschließlich automatisierter chemischer Festphasensynthese unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoramidit-Vorläufern. Im allgemeinen kann die Synthese sowohl in flüssiger Phase als auch in fester Phase durchgeführt werden, wie z.B. in Science 230, 281 (1985), Chimia 41, 302 oder in "Oligonucleotide Synthesis: A practical Approach", IRL Press, Oxford, UK, M. J. Gait, Ed. (1984) beschrieben.
Der Nachweis amplifizierter Zielsequenzen ist leicht aufgrund der großen durch die Polymerase-Kettenreaktion erzeugten Menge. Die Gelelektrophorese der erhaltenen Fragmente und die anschließende Sichtbarmachung unter Verwendung von UV-Schatten- oder Färbemethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, ist bevorzugt, was die Analyse der Gegenwart und Länge der erwarteten Ziel-Oligonucleotide zuläßt (Maniatis et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Gene, die verschiedene Proteine kodieren, werden gewöhnlich selektiv amplifiziert, da die entsprechenden Oligonucleotidsequenzen verschieden genug voneinander sind, um die Konstruktion von zwei genselektiven Amplifizierungsprimern zuzulassen.
Eine Unterscheidung zwischen Wildtyp- und mutierten Allelen eines Gens ist schwieriger. Dies wird erreicht, indem die mutierte Base (oder Basen) an das 3'-Ende des Primers gebracht werden. Unter geeigneten Amplifizierungs-Bedingungen wird nur die Allelsequenz mit dem komplementären Primer, der die richtige Watson-Crick-Basenpaarung am 3'-Ende des Primers besitzt, amplifiziert.
Auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, können weiterhin sequenzierte Gene für Arzneimittel metabolisierende Enzyme nachgewiesen und analysiert werden.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung können in Testkits durchgeführt werden, die in Kombination die folgenden Reagenzien umfassen:
Primer für die genspezifische Amplifizierung. Primer für die allelspezifische Amplifizierung. Diese Primer sind typischerweise in getrennten Behältern in dem Kit vorhanden. Der Kit kann auch ein Denaturierungs-Reagenz zur Denaturierung des Analyten, Hybridisierungspuffer, Enzym und Enzymsubstrate, negative und positive Kontrollen und eine schriftliche Anleitung zur Durchführung des Tests enthalten.
Definitionen der in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Ausdrücke:

Arzneimittel metabolisierendes Enzym:

Ein Protein, dessen Aminosäuresequenz seinen Ursprung in der Nucleotidsequenz von Genen für Arzneimittel metabolisierende Enzyme hat. Dieses kann in dem Genom von einzelnen Säugetieren, z.B. Menschen nachgewiesen werden, die diese Gene besitzen.

Nucleotid:

Eine Untereinheit einer Nucleinsäure, die aus einer Phosphatgruppe, einem 5'-Kohlenstoffzucker und einer stickstoffhaltigen Base besteht. In der RNA ist der 5'-Kohlenstoffzucker Ribose. In der DNA ist es eine 2-Desoxyribose. Der Ausdruck schließt auch Analoge solcher Untereinheiten ein.

Nucleotidpolymer oder Oligonucleotid:

Mindestens zwei Nucleotide, die miteinander durch Phosphodiester-Bindung verbunden sind. Der Ausdruck umfaßt Primer, Sonden, Nucleinsäure-Fraumente in markierter oder unmarkierter Form.

Nucleinsäuresonde:

Eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz, die sich mit einer komplementären einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz verbindet unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls (Hybrid), gewöhnlich für einen nachfolgenden Nachweis. Eine Nucleinsäuresonde kann ein Oligonucleotid oder ein Nucleotidpolymer sein.

Primer:

Bezieht sich auf ein Oligonucleotid, unabhängig davon, ob es natürlich in einem gereinigten Restriktionsverdau vorhanden ist oder synthetisch erzeugt wurde, das als Anfangspunkt der Synthese dienen kann, wenn es Bedingungen unterworfen wird, in denen die Synthese eines Primer-Extensionsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, d.h. in Gegenwart von Nucleotiden und einem, Induktionsmittel, wie einer DNA-Polymerase und bei ein er geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH. Der Primer ist bevorzugt einzelsträngig für eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifizierung, kann aber alternativ auch doppelsträngig sein. Falls er doppelsträngig ist, muß der Primer zuerst so behandelt werden, daß sich die Stränge auftrennen, bevor er verwendet wird, um Extensionsprodukte herzustellen. Bevorzugt ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart des Induktionsmittels zu primen. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Temperatur, der Quelle des Primers und der verwendeten Methode. Zum Beispiel enthält für diagnostische Anwendungen abhängig von der Komplexität der Zielsequenz der Oligonucleotidprimer gewöhnlich 10 bis 25 oder mehr Nucleotide, obwohl er weniger Nucleotide enthalten kann. Für andere Anwendungen ist der Oligonucleotidprimer typischerweise kürzer, z.B. 7 bis 15 Nucleotide. Solche kurzen Primermoleküle erfordern im allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden.
Die hier verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen zu amplifizierenden Sequenz sind. Dies bedeutet, daß die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit den jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Daher muß die Primersequenz nicht die exakte Sequenz der Matrize widerspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht komplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende des Primers gebunden werden, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist.
Eine ausgewählte Primersequenz ist im Prinzip auch geeignet zur Konstruktion einer Sonde. Daher ist, wenn ein Primer erwähnt wird, die entsprechende mögliche Anwendung als Sonde mitenthalten.

Hybridisierung:

Das Verfahren, bei dem zwei komplementäre Stränge von Nucleinsäuren sich vereinigen unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls (Hybrid).

Komplementarität:

Eine Eigenschaft, die die Basensequenz eines einzelnen Strangs von DNA oder RNA aufweist, die ein Hybrid oder einen doppelsträngigen DNA:DNA, RNA:RNA oder DNA:RNA-Komplex bilden kann durch Wasserstoffbindung zwischen Watson-Crick-Basenpaaren auf den jeweiligen Strängen. Adenin (A) komplementiert gewöhnlich mit Thymin (T) oder Uracil (U), während Guanin (G) gewöhnlich mit Cytosin (C) komplementiert.

Primerspezifität:

Eigenschaft eines Primers, die die Fähigkeit beschreibt, zwischen Ziel- und Nichtzielsequenzen zu unterscheiden, abhängig von der Sequenz und den Testbedingungen. Die Primerspezifität kann absolut sein (d.h. der Primer kann zwischen dem Ziel-Oligonucleotid und jedem Nicht-Ziel-Oligonucleotid unterscheiden). Das gleiche trifft zu für eine Sonde.

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

bezieht sich auf Unterschiede in DNA-Nucleotidsequenzen, die verschiedene Restriktions-Endonucleasemuster erzeugen. Diese Muster können sich verändern, wenn Mutationen innerhalb der spezifischen Nucleötidsequenz liegen, die durch ein Restriktionsenzym erkannt werden.

Gen

bezieht sich auf ein Segment von DNA, das die Erzeugung einer RNA kodiert, die zu einem Proteinmolekül als Endprodukt führt. Es schließt sowohl die transkribierte Region als auch alle Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts ein, die für die richtige und gesteuerte Expression verantwortlich sind. Fragmente, die Teile dieser DNA umfassen, sind auch in diesem Ausdruck enthalten. Verschiedene allelische Formen eines Gens sind auch in diesem Ausdruck enthalten.

PCR-Technik

soll Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Technologien bedeuten, was die von den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 abgedeckten Nucleinsäure-Amplifizierungsverfahren einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein.

Polymorphismus

bezieht sich auf das gleichzeitige Vorkommen von Genomen (Personen) mit Allelvariationen in der Bevölkerung und zeigt sich entweder an Allelen, die verschiedene Phänotypen erzeugen oder bei Veränderungen der DNA, die das Restriktionsmuster, das durch Restriktionsenzyme verursacht wird, beeinflussen.

Allel

Ein Allel besteht aus einem Segment von Desoxyribonucleinsäure (DNA), das alle Informationen umfaßt, die notwendig sind, damit eine Polypeptidkette exprimiert wird. Daher können Allele, die sich in Nucleotidsequenzen unterscheiden, zu verschiedenen Polypeptidketten führen oder dazu, daß das Protein nicht gemacht wird. Jedoch können identische Polypeptidketten von verschiedenen Allelen stammen, vorausgesetzt, daß die Nucleotidsequenzunterschiede auf der Ebene der Translation "stumm" sind. Außerdem beeinflussen Nukleotidsequenzunterschiede zwischen Allelen nicht die Polypeptidkettensequenz, vorausgesetzt, daß die Unterschiede in Introns oder in nicht translatierten Bereichen der Exons auftreten. Daher können Allele, die als solche auf DNA-Ebene erkannt werden, nicht als Allele, sondern als Produkte des gleichen Gens auf der Proteinebene in Erscheinung treten. Allelische Gene, obwohl ähnlich, unterscheiden sich voneinander, besetzen aber identische Positionen in dem Genom oder zumindest in dem Chromosom. Aufgrund des diploiden Charakters des Säugetiergenons einschließlich des menschlichen Genoms, kann ein Individuum nur zwei Allele an den zwei gegebenen Chromosomen-Loci exprimieren. Jedoch kann die gesamte Population eine große Anzahl von Allelen an einem solchen Locus exprimieren. Zwei identische Allele führen zu einem homozygoten, zwei verschiedene Allele zu einem heterozygoten Träger der genetischen Information.

Beispiel 1

A) Charakterisierung von PM-Individuen

Die Leukocyten-DNA von drei Individuen mit PM-Phänotyp wurde aus einer Sammlung von DNA-Proben für Populationsund Familien-Untersuchungen ausgewählt (Skoda et al., Proc. Natl. Sci. USA 85, 5240-5243 [1988]). Die drei Personen, die als PM1 (ZICL), PM2 (KABI) und PM3 (B07) bezeichnet wurden, wurden als PMs identifiziert durch Phänotypisierung entweder mit Debrisoquin (Meier et al., Gastroenterology 85, 682-692 [1983]) oder Spartein (Eichelbaum et al., Xenobiotica 16, 465-481 [1986]). Das Verhältnis Debrisoquin/4-OH-Debrisoquin-Metabolit im Urin war 332 bzw. 55 für PM1 bzw. PM2. PM3 wurde identifiziert durch das Verhältnis Spartein/Dehydrospartein- Metabolit im Urin, das 250 war. Diese PMs wurden ausgewählt, da sie den XbaI 29 kb/29 kb Genotyp haben, der keine Information über den Phänotyp durch Restriktionsanalyse liefert. Die Sequenzinformation des Wildtyp CYP2D6-Gens, die zum Vergleich verwendet wurde, stammte aus einem homozygoten übermäßig metabolisierenden (EM) Individuum (EZA), wie von Kimura et al. beschrieben (Am. J. Hum. Gen. 45, 889-904 [1989]). Eine Southernblot-Analyse wurde durchgeführt, wie beschrieben (Skoda et al., oben).

B) Klonierung und Sequenzierung von mutierten CYP2D6-Genen

Die Strategie der Klonierung basierte auf der Information aus den Southernblots mit BamHI, EcoRI und XbaI und der fast vollständigen Sequenz des Bereiches der drei Gene CYP2D6, CAP2D7 und CYP2D8, die aus DNA von übermäßig Metabolisierern isoliert wurde (Kimura et al., Am. J. Hum. Gen. 45, 889-904 [1989] und Skoda et al., oben). Danach enthält das EcoRI-Fragment mit 16 kb das CYP2D7- Gen, das 5' von dem normalen CYP2D6 angeordnet ist. Das EcoRI-Fragment mit 9,4 kb stellt das CYP2D6-Gen dar und das Fragment mit 8,5 kb das CYP2DB Pseudogen. Genbibliotheken wurden aus Leukocyten-DNA von jedem der drei PM-Individuen konstruiert. Da die Southernblot- Analyse ihrer genomischen DNA das gleiche EcoRI-Muster hatte, wie die EMs, wurde angenommen, daß ihre Fragmente mit 16, 9,4 und 8,5 kb die gleichen CYP2D-Gene enthalten, wie die DNA des Wildtyps oder des homozygoten übermäßig metabolisierenden. Die DNA wurde vollständig mit EcoRI verdaut und in den Vektor λgtWES (BRL) inseriert. Dieser Vektor kann Inserts mit 2 bis 15 kb prozessieren. Da das 16 kb Fragment zu lang ist, um von λgtWES angenommen zu werden, enthalten diese Bibliotheken nur die Fragmente mit 9,4 und 8,5 kb, entsprechend den CYP2D6- und CYP2D8-Genen. Die Bibliotheken wurden mit zwei Sonden gescreent, um die Identifizierung von Klonen mit dem CYP2D6-Gen sicherzustellen. Beide Sonden wurden mit [³²P] durch Nick-Translation markiert. Das erste Screening erfolgte mit der IID6-cDNA voller Länge (Gonzalez et al., oben), die die CYP2D6- und CYP2D8-Klone erkennt. Daher wurde eine zusätzliche Sonde, ein SacI-Fragment mit 0,4 kb (bp -717 bis 305) verwendet und aus der genomischen DNA eines homozygoten übermäßigen Metabolisierers hergestellt. Dieses Fragment erkennt die 5'-flankierende Region sowohl des CYP2D6- als auch des CYP2D7-Gens, nicht aber das CYP2D8-Gen. Da die Bibliothek nur CYP2D8- und CYP2D6-Gene enthält, selektiert somit das zweite Screening mit dieser Sonde CYP2D6. Zwei positive Klone wurden aus den Genom- Bibliotheken von jedem der drei PM-Individuen isoliert (Figur 3). Es war zu diesem Zeitpunkt unbekannt, ob die zwei Klone aus dem gleichen Allel stammten. Vier dieser 6 Klone (29-B, 29-B, 29-B', 29-A) wurden vollständig sequenziert bei allen Exons und an allen Übergangen von Intron zu Exon. Die verbleibenden zwei Klone ((29-B) (29- B)) wurden nur teilweise sequenziert, wie im Detail unten angegeben. Die EcoRI-Fragmente der positiven Klone wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen zu kleineren DNA-Fragmenten verdaut, diese wurden in pUC19 subkloniert und durch Doppelstrang-Didesoxy-Kettenabbruch- Verfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Sci. USA 74, 5463--s 5467 [1977] und Hatton et al., Analytical Biochemistry 152, 232-238 [1986]) sequenziert, wobei universelle und reverse Primer ebenso wie 18 synthetisierte Oligonucleotide (20-mer), die dem 5'- und 3'-Teil jedes der 9 Exons und der Intron-Exon-Übergänge entsprachen.

PM1 und PM2:

Bei einem Klon der zwei aus jeder PM- Bibliothek isolierten wurden zuerst alle Exons und alle Intron-Exon-Übergänge sequenziert. Es wurde klar, daß diese zwei Klone identische Mutationen hatten ebenso wie eine zusätzliche BamHI-Restriktionsstelle, verglichen mit dem Wildtyp-CYP2D6-Gen, (Figur 3, 4). Sie wurden als 29-B bezeichnet. Der zweite Klon jedes PM wurde nur in den zwei Bereichen sequenziert, wo Mutationen identifiziert worden waren, nämlich der 3'-Intron-Exon-Übergang des dritten Introns und Exon 2. Die gleichen Mutationen wurden wiederum nachgewiesen, ebenso wie die zusätzliche BamHI-Stelle, die in beiden Allelen in PM1 und PM2 vorhanden ist, was bereits bei der genomischen Southernblot-Analyse offensichtlich war. Es ist natürlich unbekannt, ob die zwei Klone von dem gleichen Allel stammen oder nicht.
Die Mutationen des 29-B-Allels sind in Figur 4 zusammengefaßt. Sie schließen zwei stumme Mutationen (1085 C in G, 1749 G in C), 4 Aminosäure-Veränderungen (188 C in T führt zu 34 Pro in Ser, 1062 C in A führt zu 91 Leu in Met, 1072 A in G führt zu 94 His in Arg, 4268 G in C führt zu 486 Ser in Thr) und eine Nucleotid-Veränderung (1934 G in A) am 3'-Ende des dritten Introns. Die Veränderung von G in A am letzten Nucleotid von Intron 3, die sich in allen 29-B-Allelen findet, ist wahrscheinlich die Hauptursache für das nicht vorhandene Protein und die nicht vorhandene Funktion, da die Consensus-Akzeptorsequenz AG zu 100 % in zahlreichen Genen von untersuchten menschlichen und anderen Arten konserviert ist (Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195, 247-259 [1987]). Versuche mit Punktmutagenese stützen den Gedanken, daß die "AG"-Consensus-Akzeptorsequenz eine Vorbedingung für einen normalen Spleiß-Mechanismus ist (Aebi et al., Cell 47, 555-565 [1986]). Es gab keinen Unterschied in der Größe der RNA bei den Northernblot-Analysen der COS- Zellen, in denen diese Mutation exprimiert wurde (Figur 6B). Das 29-B-Allel enthält mehrfache zusätzliche Mutationen und kann noch mehrere in den nicht sequenzierten Introns aufweisen. Die Sequenzpositionen entsprechen der veröffentlichten CYP2D6-Sequenz (Kimura et al., Am. J. Hum.Gen. 45, 889-904 [1989]).

PM3:

Mit der Kenntnis der zusätzlichen BamHI-Stelle in den Klonen von PM1 und PM2 wurde PM3 ausgewählt, um untersucht zu werden, da dieses schlecht metabolisierende Individuum in dem genomischen Southernblot bezüglich dieser BamHI-Stelle heterozygot war. Beide Klone von PM3 wurden vollständig sequenziert. Ein Allel war identisch mit dem mutierten Allel 29-B, außer der stummen Mutation (1749 G in C) in Exon 3 und wurde daher als 29-B' bezeichnet.
Das andere Allel, das keine zusätzliche BamHI-Stelle hatte, hatte eine Nucleotid-Deletion (2637 A) im fünften Exon was zu einer Leserahmen-Verschiebung führte. Dieses Allel wurde mit 29-A bezeichnet (Figur 3, 4).

c) Konstruktion von Expressionsklonen

Die Konstruktion von Expressionsklonen mit voller Länge ist in Figur 5 zusammengefaßt.

CYP2D6-Wildtyp:

Ein AccI-KpnI-Fragment aus dem 3'-Teil des CYP2D6-Wildtyp-Gens wurde durch Behandlung mit T4- DNA-Polymerase (BRL) mit glatten Enden versehen und in pUC19 subkloniert unter Verwendung der HincII-Stelle in der richtigen Orientierung. Das HincII-Fragment des gleichen Gens wurde in die SmaI-Stelle des Bluescript- Vektors (Promega) in der richtigen Orientierung subkloniert. Das EcoRI-BamHI-Fragment des ersten Klons wurde dann durch daßs des letzteren Klons ersetzt, um ein Gen voller Länge in pUC19 zu konstruieren. Das entstehende Gen wurde durch EcoRI und HindIII herausgeschnitten und in den pCMV-Expressionsvektor inseriert (Andersson et al., J. Biol. Chem. 264, 8222-8229 [198,9] und Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 659-663 [1984]), unter Verwendung der gleichen Restriktionsstellen.

CYP2D6 mutierte Gene (29-B-Allel):

Das EcoRI-KpnI- Fragment des mutierten 29-B-Gens wurde in pUC19 (BRL) subkloniert. Dieser Klon wurde mit HindIII und SalI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase die Enden geglättet und wiederum ligiert, um die AccI-Stelle in dem Vektor zu eliminieren. Die HindIII-Stelle in dem Vektor wurde während dieses Verfahrens erhalten. Das HincII-Fragment des mutierten 29-B-Gens wurde dann in die SmaI-Stelle eines anderen pUC19 in der richtigen Orientierung subkloniert und das EcoRI-BssHII-Fragment des ersteren Klons wurde durch das dieses Klons ersetzt. Das verarbeitete Gen vollständiger Länge in pUC19 wurde weiter in pCMV subkloniert unter Verwendung der EcoRI- und HindIII-Stellen.
Wie in Figur 6B gezeigt erzeugte das CYP2D6 Wildtyp-Gen- Konstrukt ein funktionelles und immunologisch reaktives Protein in COS-1-Zellen. Das mutierte 29-B-Gen führte bei der Expression nicht zu einem erkennbaren Protein und es konnte keine enzymatische Aktivität in transfizierten COS-1-Zellen gezeigt werden (Beispiel 1F). Die mRNA wurde von der IID6-cDNA in Northernblots erkannt (Beispiel 1G) und hatte die gleiche scheinbare Größe bei beiden Konstrukten (Figur 6B).

D) Chimäre Gene

Es wurden chimäre Gene zusammengesetzt in pUC19 unter Verwendung von Kombinationen der drei Teile (EcoRI- BssHII, 1,8 kb; BssHII-AccI, 0,8 kb; AccI-HindIII, 1,8 kb) der konstruierten Genklone voller Länge (Figur 6A). Die Gesamtlänge der chimären Gene war somit 4,4 kb. Die chimären Gene wurden, wie in Beispiel 1C beschrieben, in pCMV eingesetzt unter Verwendung von EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen.

Chimäre Gene Nr. 1 und 2.

Wegen der erwarteten Bedeutung der Mutation in der Spleiß-Consensus-Sequenz am 3'-Ende des dritten Introns wurden zuerst chimäre Gene konstruiert, die es zulassen wurden, die Folgen dieser Mutation zu testen. Das chimäre Gen Nr. 1 schließt den mittleren Teil des mutierten 29-B-Allels und den 5'- und 3'-Teil des Wildtyp-Gens (Figur 6A) ein. In dem Konstrukt Nr. 2 stammte andererseits der mittlere Teil aus dem Wildtyp- Gen und der 5'- und 3'-Teil aus dem mutierten 29-B- Allel. Bei der Expression (Beispiel 1F, Figur 6B) führte das chimäre Gen Nr. 1 zu keinem erkennbaren Protein und keiner Enzymaktivität, wie das gesamte 29-B-Gen. Die Größe der mRNA war identisch mit den 29-B- und Wildtyp- Gen-Produkten (Figur 6B). Die mRNA-Analyse wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1G beschrieben. Das chimäre Gen Nr. 2 erzeugte offensichtlich eine ähnliche Menge an IID6-Protein, wie das Wildtyp-IID6-Gen, aber keine signifikante Aktivität gegenüber COS-1-Zellkontrollen.

Chimäre Gene Nr. 3 und 4.

Um die Wirkung der Aminosäure- Veränderungen in dem 5'- und 3'-Teil des 29-B-Allels auszuwerten, wurden die Klone Nr. 3 und Nr. 4 konstruiert, die die 5'- und 3'-Teile des 29-B-Gens beinhalten, jeweils kombiniert mit den anderen beiden Teilen des Wildtyp-Gens. Der Klon Nr. 3 erzeugte ein immunologisch reaktives Protein, aber keine Aktivität, wie es das chimäre Gen Nr. 2, das oben beschrieben wurde, tat. Daher können die drei Aminosäure-Veränderungen in dem 5'-Teil des Gens zusammen oder allein die Funktion dieses Proteins zerstören (Beispiel 1E)s. Jedoch brachte das chimäre Gen Nr. 4 bei der Expression die gleiche oder sogar eine höhere Aktivität als das Wildtyp-Gen. Dies zeigt, daß die Aminosäure-Veränderung (486 Ser in Thr), die durch die Mutation im neunten Exon erzeugt wurde, nicht wichtig ist für die Expression oder Aktivität. Eine Westernblot-Analyse (Beispiel 1H) der Produkte der Klone Nr. 2, 3 und 4 zeigte mehrere zusätzliche kürzere Banden, von denen einige auch bei den Produkten des Wildtyp-Gens zu sehen waren (Figur 6B, Bahn 2).

E) Punktmutationen in Exon 1 und 2:

Eine humane CYP2D6-cDNA voller Länge wurde konstruiert, indem ein EcoRI-SmaI- Fragment mit 400 bp, das die ersten 140 bp der kodierenden Sequenz und 260 bp der 5'-untranslatierten Region eines CYP2D6-Wildtyp-Genom-Klons enthielt (Kimura et al., Am. J. Hum. Gen. 45, 889-904 [1989]) in eine Ratten-Human-Hybrid-cDNA subkloniert wurde, bei der der entsprechende Teil entfernt worden war, indem mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten worden war. Die gleiche Strategie wurde verwendet, um eine cDNA zu konstruieren, die nur eine Mutation 1 enthielt (MI, 188 C in T), indem ein Genomklon eines 29-B-Allels verwendet wurde. Mutation 2 (MII, 1062 C in A) und Mutation 3 (MIII, 1072 A in G) wurden in die Wildtyp-cDNA eingeführt durch die Polymerase-Kettenreaktion nach Kammann et al., Nucleic Acids Res. 17, 5404 [1989]), wobei zwei mutagene Primer (GGGTCACCATCGCCTCGCG für MII, TCCTCGCCGCGGGTCACCA für MIII) verwendet wurden. Eine einzige XhoII-Stelle wurde verwendet, um die durch PCR erzeugten Fragmente in die Wildtyp-cDNA zu subklonieren (Figur 7). Alle Konstrukte wurden sequenziert, wie in Beispiel 1B beschrieben, um PCR-Artefakte auszuschließen.
Alle drei mutierten cDNAs wurden in COS-1-Zellen exprimiert und führten zu immunologisch reaktivem Protein (Figur 7), aber nur die Mutation in Exon 1 (188 C in T, 34 Pro in Ser) vernichtete die Aktivität des exprimierten Proteins, wobei die Aktivität so gering war wie in Mock-transfizierten Kontrollzellen.

F) DNA-Transfektion von COS-1-Zellen

Expressionsklone wurden in COS-1-Zellen transfiziert (Y. Gluzman, Cell 23, 175-182 [1981]) mit der Diethylaminoethyl-(DEAE)-Dextranmethode (Sompayrac et al., Proc. Natl. Sci. USA 78, 7575-7578 [1981] und Zuber et al., Science 234, 1258-1261 [1986]) mit geringen Modifikationen. 16 Stunden vor der Transfektion wurden COS-1-Zellen von einer zusammenfließenden 100 mm Kulturschale in 4 Schalen mit Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10 % foetales Kälberserum (FCS) enthielt, überführt. Die Transfektion wurde durchgeführt, indem die Zellen 2 Stunden lang mit DEAE-Dextran (250 µg/ml; Pharmacia) und DNA (20 µg/Platte) in serumfreiem DMEM inkubiert wurden und anschließend drei Stunden in DMEM, das 10 % FCS und Chloroquin (52 µg/ml; Sigma) enthielt, inkubiert wurden. Die Zellen wurden für die Analyse von IID6-Protein und dessen Funktion geerntet 66 Stunden nach der Inkubation in DMEM mit 10 % FCS. Für eine Beurteilung der IID6-Funktion in intakten gezüchteten Zellen wurde (+)Bufuralol (200 µM) zu den Kulturen in den letzten 24 Stunden zugegeben und 1'-Hydroxybufuralol wurde in dem Medium analysiert (Beispiel 1I) (Zanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 8256-8260 [1988]).

G) RNA-Blot-Analyse

20 µg der gesamten RNA, die aus den transfizierten COS- 1-Zellen isoliert wurde (M. Wilkinson, Nucleic Acids Res. 16, 10933 [1988]) wurde der Größe nach durch Elektrophorese in 1,0 % Agarose-Formaldehydgelen (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. [1982]) aufgetrennt. Die CYP2D6-cDNA mit voller Länge wurde radioaktiv markiert mit der Random-Priming-Methode (Feinberg et al., Anal. Biochem. 132, 6-13 [1983]) und wurde als Sonde verwendet. Der Transfer der RNA auf eine Nylonmembran (Gene Screen Plus; Dupont, New England Nuclear) und Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde wurden unter den von Dupont empfohlenen Bedingungen durchgeführt.

H) Immunoblot-Analyse

SDS-PAGE von COS-1-Zell-Homogenisaten (Protein 50 bis 100 µg/Bahn) wurde auf einem 10 % Polyacrylamidgel durchgeführt, die Proteine wurden auf Nitrocellulose überführt, dem monoklonalen Antikörper 114/2 ausgesetzt und anschließend Kaninchen-Anti-Maus-IgG. Gebundenes IgG wurde durch Autoradiographie nach Inkubation mit ¹²&sup5;I- Protein A sichtbar gemacht (Zanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8256-8260 [1988]).

I) Test der Bufuralol-1'-Hydroxylierung

Bufuralol-1'-Hydroxylierungstests wurden durchgeführt, wie für mikrosomale Fraktionen von Zanger et al. beschrieben (Biochemistry 27, 5447-5454 [1988]), in Gegenwart von NADPH und O&sub2;. Die COS-1-Zellen wurden in PBS geerntet, die Suspension mit 1000 g 3 Minuten lang zentrifugiert, das Pellet in Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wieder suspendiert, dreimal 10 Sekunden lang bei 4ºC beschallt und der Test mit 350 µg Protein durchgeführt. Die Substrat-Konzentration von (+)-Bufuralol war 500 µM.

Beispiel 2

CYP2D6-spezifische Amplifizierung

Der CYP2D-Gencluster auf Chromosom 22 (Figur 1A) enthält drei nah verwandte Gene, das funktionelle CYP2D6-Gen, das P450IID6 kodiert und zwei nicht funktionelle Gene CYP2D7 und CYP2D8P (Kimura et al., oben). Einige der Mutationen des CYP2D6-(D6)- Gens in den defekten 29-A- und 29-B-Allelen sind auch in den CYP2D7-(D7)- und CYP2D8P-(D8)-Genen des Wildtyp-Allels vorhanden.
Um den "falsch positiven" Nachweis von Mutationen in Pseudogenen auszuschließen, wurden die DNA-Fragmente des D6-Gens, die Mutationen des 29-A- und 29-B-Allels enthielten, spezifisch amplifiziert. Dies wurde erreicht mit 18 bp- oder 20 bp-Oligonucleotidprimern, die komplementär zu den einzigen CYP2D6-Intronsequenzen an beiden Seiten der interessierenden Mutationen waren (Figur 8A). Diese Primer sind komplementär zu den folgenden Auszügen der CYP2D6-Sequenz (die Numerierung entspricht der von Kimura et al., Am. J. Hum. Genet. 45, 889- 904 [1989]) verwendeten: Primer 1 (ATTTCCCAGCTGGAATCC) von 1385 bis 1402; Primer 2 (GAGACTCCTCGGTCTCTC) von 2105 bis 2122; Primer 3 (GCGGAGCGAGAGACCGAGGA) von 2098 bis 2117 und Primer 4 (CCGGCCCTGACACTCCTTCT) von 3181 bis 3200.
Die erste PCR-Reaktion (CYP2D6-spezifische Amplifizierung), die zur spezifischen Amplifizierung der CYP2D6-spezifischen Fragmente durchgeführt wurde, lieferte ein 739 bp Fragment (Fragment B) mit dem Primerpaar 1/2 und ein 1123 bp Fragment (Fragment A) mit dem Primerpaar 3/4 (Figur 3A). Fragment B enthielt einen Teil des Introns 2, Exon 3, Intron 3, Exon 4 und einen Teil des Introns 4. Fragment A bestand aus einem Teil von Intron 4; Exon 5, Intron 5, Exon 6 und einem Teil von Intron 6. In den Kontrollproben mit DNA von einem Individuum mit 11,5/11,5 kb XbaI-Genotyp wurden keine Fragmente amplifiziert. Die Leukocyten-DNA stammte anfangs von den in Beispiel 1A beschriebenen Individuen. Ihr Phänotyp wurde mit Debrisoquin, Spartein oder Dextromethorphan bestimmt, wie in Beispiel lA beschrieben. Die Oligonucleotid-Primer wurden an einem Applied Biosystems DNA Syntheseautomaten synthetisiert. Die Amplifizierungsreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 µl in Gegenwart von 0,8 mm MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,01 % Gelatine, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dCTP, jeden Primer (0,25 µM), von 400 bis 600 ng genomischer DNA als Matrize und 1,5 U Tag-Polymerase (BRL, Bethesda Research Laboratories) durchgeführt. Nach einem Anfangs-Schmelzzeitraum von einer Minute 30 Sekunden bei 94ºC wurden 30 bis 35 Zyklen mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute, 30 Sekunden bei 52ºC, einer Minute, 30 Sekunden bei 72ºC und einem letzten Extensionszeitraum von 7 Minuten bei 72ºC durchgeführt. Danach wurden 10 µl jeder Probe auf einem 1,2 % Agarosegel analysiert. Die DNA eines Individuums, das homozygot war für das XbaI-11,5 kb Allel wurde als negative Kontrolle verwendet, da diesem Allel das CYP2D6-Gen fehlt (Gaedigk et al., Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 341 (Ergänzung), Abstract 435 [1990]).

Beispiel 3

Allelspezifische Amplifizierung

Bei der zweiten PCR-Reaktion (allelspezifische Amplifizierung) amplifizierte das Primerpaar 4/5 ein Fragment mit 588 bp aus 29-wt- und 29-B-Allelen von Fragment A, denen beiden die Rastermutation in Exon 5 fehlt. Das Primerpaar 4/6 amplifizierte ein Fragment der gleichen Länge nur aus den 29-A-Allelen. Das 29-B-Allel wurde unzweifelhaft durch Amplifizierung eines Fragments mit 564 bp aus Fragment B mit dem Primerpaar 1/8 identifiziert, wohingegen die Amplifizierung der 29-wt- und 29-A-Allele nur mit dem Primerpaar 1/7 auftrat (Figuren 8 und 9). 1 µl des Ansatzes von Beispiel 2 wurde als Matrize in zwei parallelen allelspezifischen Reaktionen verwendet, eine mit einem "Wildtyp-spezifischen Primer" und die andere mit einem "mutationsspezifischen Primer". Der zweite Primer war in beiden Fällen der "übliche Primer" 1 und 4, der bereits bei der ersten PCR-Reaktion in Beispiel 2 verwendet wurde; Fragment A wurde daher einmal mit den Primern 4 und 5 (GCTAACTGAGCACA von 2624 bis 2637) und einmal mit den Primern 4 und 6 (GCTAACTGAGCACG, G an Position 2637), Fragment B einmal mit den Primern 1 und 7 (CGAAAGGGGCGTCC von 1934 bis 1947) und einmal mit den Primern 1 und 8 (CGAAAGGGGCGTCT, T an Position 1947) amplifiziert. Die Amplifizierung von Fragment B ist in Figur 8B speziell gezeigt. Die Reaktionsbedingungen wurden so ausgewählt, daß eine Amplifizierung nur im Fall einer perfekten Hybridisierung zwischen Primer und Matrizen-DNA möglich war. Diese waren wie folgt: Gesamtvolumen 50 µl; 0,8 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCL pH 8,3, 50 mM KCl, 0,01 % Gelatine, jeweils 0,2 mM dNTP, jeweils 0,25 µM Primer, 1 U Taq-Polymerase. Es wurden 15 Zyklen mit 1 Minute bei 94ºC, 1 Minute bei 50ºC und 1 Minute bei 72ºC durchgeführt. 10 µl jeder Probe wurden auf einem 1,2 % Agarosegel analysiert. Die DNA von 3 PM- Individuen mit vorher sequenzierten CYP2D6-Allelen diente als Kontrolle für diese zweite PCR-Reaktion.

Beispiel 4

Nachweis und Analyse

Die gemeinsamen Ergebnisse für alle vier Reaktionen, die in Beispiel 3 beschrieben wurden, lassen die Bestimmung beider Allele bei Individuen mit dem XbaI 29/29 kb Genotyp und des 29 kb Allels bei Individuen mit dem XbaI 11,5/29 kb oder XbaI 44/29 kb Genotyp zu. Die drei möglichen Ergebnisse für jede Mutation sind für die Spleißstellenmutation des 29-B-Allels in Figur 9 beispielhaft aufgeführt. Person #18 hat kein 29-B- Allel, Person #37 hat ein 29-B-Allel und #13 hat eine oder zwei 29-B-Allele. Die Ergebnisse der 29-A-allelspezifischen Amplifizierung können auf gleiche Weise ausgelegt werden. So hatten #18 und #13 kein 29-A-Allel, #37 hatte eines. Zusammengefaßt deuten diese Daten auf die folgenden Genotypen: 29-wt/29-wt für #18, 29-A/29-B für #37 und 29-B/29-B für #13, was mit deren Phänotypen von EM, PM bzw. PM übereinstimmt.
Es wurden keine falsch positiven oder falsch negativen Ergebnisse beobachtet bei Verwendung der DNA von 3 PM-Individuen mit bekannten Sequenzen sowohl der CYP2D6-Allele als auch von sieben Individuen mit bekanntem Phänotyp mit einem 11,5 kb/29 kb XbaI-Genotyp, wobei das 29 kb Allel dem Phänotyp entsprechen muß. Von 9 PMs mit dem XbaI 29/29-Muster waren 6 homozygot bezüglich des 29-B-Allels, die verbleibenden drei waren heterozygot 29-A/29-B. Von 6 PMs mit dem XbaI 29/11,5-Muster hatten fünf ein 29-B-Allel und einer ein 29-A-Allel. Von 22 EMs (XbaI 29/29 kb) waren 10 homozygot bezüglich des 29-wt-Allels, 9 waren heterozygot bezüglich der 29-wt/29-B-Allele und drei waren heterozygot bezüglich der 29-wt/29-A-Allele.

Beispiel 5

Nachweis des langsamen Acetylierungs-Polymorphismus durch allelspezifische Amplifizierung

Die Kenntnis der Mutationen der NAT2-Allele, die als M1 und M2 bezeichnet wurden (Figur 10b), ebenso wie die Kenntnis von einem dritten mutierten Allel, M3, über das kürzlich von Ohsako et al., unten, berichtet wurde, wurde verwendet, um einen Satz von mutationsspezifischen Primern für eine allelspezifische Amplifizierung geringer Mengen von DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu entwickeln. Die Untersuchungspopulationen waren zusammengesetzt aus 18 in vivo phänotypisierten Individuen (Coffeintest, 14) und 26 in vitro phänotypisierten Leberproben (Sulfamethazin-Acetylierung, 7). 24 wurden als langsame und 20 als schnelle Acetylierer klassifiziert. Der Test zeigte richtig 19 von den 20 schnellen und 22 von den 24 langsam acetylierenden Phänotypen voraus. Von den identifizierten 65 langsamen Allelen machte M1 30 Allele aus (46 %), M2 32 Allele (49 %) und M3 nur 3 Allele (5 %).
Die folgende detaillierte Beschreibung zeigt die Verwendung und die Sequenzen der spezifischen Primer, die zum Nachweis von wt und den drei mutierten Allelen (M1, M2 und M3) angewendet wurden. Die Mutation, die für das M3-Allel verantwortlich ist, wurde von Ohsako et al. in J. of Biol. Chem. 265, 4630-4634 (1990) beschrieben mit einer Mutation an Position 857, die ein Austausch von G (wt) in A (M3) in dem NAT2-Gen ist.
Spezifische Primer für das wt-Allel und die mutierten Allele M1, M2 und M3 wurden in getrennten PCR-Reaktionen verwendet. Primer "M1 wt" (CTGATTTGGTCCAG) ist komplementär zu dem NAT2- Gen an Position 481 bis 494, Primer "M1 mut" (CTGATTTGGTCCAA) erkennt die Mutation C&sub4;&sub8;&sub1; zu T in M1; die Primer "M2 wt" (574 bis 590, TTTACGCTTGAACCTCG) und "M2 mut" (574 bis 590, TTTACGCTTGAACCTCA) testen auf die Gegenwart der Mutation G&sub5;&sub9;&sub0; zu A in M2, die Primer "M3 wt" (857 bis 870, AATAGTAAGGGATC) und "M3 mut" (857 bis 870, AATAGTAAGGGATT) testen die Mutation G&sub8;&sub5;&sub7; zu A in M3. Der übliche Primer, der für die Reaktionen mit den Primern M1 wt, M1 mut, M3 wt und M3 mut verwendet wurde, ist "Primer 1" (-74 bis -58, AATTAGTCACACGAGGA) für die Reaktionen mit den Primern "M2 wt" und "M2 mut" ist es "Primer 2" (1119 bis 1138, TCTAGCATGAATCACTCTGC).
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 0,01 % (G/V) Gelatine, jeweils 0,2 mM dNTP, jeweils 0,5 µM Primer, 1,25 U Taq-Polymerase (Bethesda Research Laboratories), 300 bis 600 ng genomischer DNA und entweder 1,5 mM MgCl&sub2; (Primer "Ml wt" und "Ml mut") oder 1,25 mM MgC1&sub2; ("M2 wt" und "M2 mut") oder 1,75 InM MgCl&sub2; ("M3 wt" und "M3 mut") durchgeführt. 30 Zyklen (60 Sekunden bei 94ºC, 90 Sekunden bei 48ºC (Ml)/55ºC (M2)/35ºC (M3), 3 Minuten bei 72ºC) wurden durchgeführt und anschließend eine letzte Extensionsperiode von 7 Minuten bei 72ºC. 10 µl jeder Probe wurden auf einem 1,5 % Agarosegel analysiert.
Zuerst wurden die Personen mit üblichen Methoden (Coffeintest) als langsame oder schnelle Acetylierungs- Phänotypen klassifiziert. Danach wurde eine allelspezifische Amplifizierung mit PCR durchgeführt an DNA dieser Personen, um die drei möglichen Mutationen, die mit einer langsamen Acetylierung verbunden sind, nachzuweisen unter Verwendung der oben beschriebenen Primer und Methoden.
Das Ergebnis der entsprechenden PCR-Reaktionen ist in den Bahnen 1 bis 6 von Figur 11 gezeigt. Der mutationsspezifische Primer (mut) für M1 (Bahn 2) und M2 (Bahn 4) lieferte jeweils die richtigen Amplifizierungsprodukte (568 bp und 565 bp), während keine Bande sichtbar ist nach einer Amplifizierung mit dem M3-spezifischen Primer (Bahn 6). Die DNA der in den Bahnen 1 bis 6 beispielhaft aufgeführten Person hat daher ein M1- und ein M2-Allel. Der Primer, der dem Wildtyp NAT2-Gen an der Mutationsstelle M1 komplementär ist, führt vorhersagbar zu einer Amplifizierung von Allel M2 (Bahn 1), der entsprechende "Wildtyp-Primer" von M2 bindet an Allel M1 (Bahn 3) und der "Wildtyp-Primer" von M3 amplifiziert beide Allele dieser Person (Bahn 5, 944 bp Fragment).

Claims

1. Primer zur Amplifizierung einer Nucleinsäuresequenz von Allelen von Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, um mutierte und wt-Allele nachzuweisen, die Primer eine Länge von etwa 10 bis 50 Basen haben und am 3'-Ende mindestens eine Base enthalten, die komplementär ist zu der Mutation oder der wt-Sequenz an der entsprechenden Position und die verbleibenden Basen in 5'-Richtung im wesentlichen komplementär entweder zum kodierenden Strang oder dem Antisense-Strang dieses Gens sind.

2. Primer nach Anspruch 1 mit einer Länge von 10 bis 25 Basen.

3. Primer nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gen das CYP2D6- Gen ist, das das Cytochrom-P450-Isozym P450IID6 kodiert.

4. Primer nach einem der Ansprüche 1 bis 31 worin die Base an dem 3'-Ende komplementär ist zu der Base Nr. 1062, 1072, 1085, 1749, 1934, 2637 oder 4268 der wt- oder mutierten CYP2D6-Gensequenz.

5. Primer nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

5' CGA AAG GGG CGT CC 3'

5' CGA AAG GGG CGT CT 3'

5' GCT AAC TGA GCA CA 3'

5' GCT AAC TGA GCA CG 3'.

6. Primer nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gen das NAT2- Gen ist, das das Enzym N-Acetyltransferase kodiert.

7. Primer nach Anspruch 6, worin die Base an dem 3'-Ende komplementär ist zu der Base 282, 341, 481, 590 oder 857 der wt- oder mutierten NAT2-Gensequenz.

8. Primer nach Anspruch 6 oder 7, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

5' CTG ATT TGG TCC AG 3'

5' CTG ATT TGG TCC AA 3'

5' AAT AGT AAG GGA TC 3'

5' AAT AGT AAG GGA TT 3'

5' TTT ACG CTT GAA CCT CG 3'

5' TTT ACG CTT GAA CCT CA 3'.

9. Primer für die selektive Amplifizierung von Nudeinsäuresequenzen von Regionen, die Mutationen von Genen enthalten, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren, dadurchgekennzeichnet, daß die Primer eine Länge von etwa 10 bis 50 Basen haben und im wesentlichen komplementär sind zu dem kodierenden Strang oder dem Antisense-Strang des Gens in dem Bereich, um eine selektive Amplifizierung von Teilen des Gens selbst einschließlich der Mutationen darin zuzulassen und eine Amplifizierung homologer Sequenzen in verwandten Pseudogenen zu verhindern.

10. Primer nach Anspruch 9 zur Amplifizierung von Nudeinsäuresequenzen des CYP2D6-Gens, das das P450IID6-Enzym kodiert, das Ziel des Debrisoquin-Polymorphismus.

11. Primer nach Anspruch 9 oder 10 umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

5' ATT TCC CAG CTG GAA TCC 3'

5' GAG ACT CCT CGG TCT CTC 3'

5' CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT 3' oder

5' GCG GAG CGA GAG ACC GAG GA 3'

zur Amplifizierung von Teilen des CYP2D6-Gens oder Allelen davon.

12. Primer nach Anspruch 9 zur Amplifizierung von Nudeinsäuresequenzen des Gens, das das N-Acetyltransferaseenzym NAT2 kodiert, das Ziel des Acetylierungspolymorphismus.

13. Primer nach Anspruch 12, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

5' AAT TAG TCA CAC GAG GA 3' oder

5' TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC 3'

zur Amplifizierung von Teilen des NAT2-Gens oder Allelen davon.

14. Verfahren zum Nachweis von Mutationen von Genen, die Arzneimittel metabolisierende Enzyme kodieren in einer Probe umfassend

a) die Amplifizierung einer Nucleinsäuresequenz von allelischen Formen des Gens mit einem wt- oder mutationsspezifischen Primer nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Gegenwart eines geeigneten Primers nach einem der Ansprüche 9 bis 13 und

b) Nachweis der amplifizierten Produkte von Stufe a).

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin vor der wt- oder mutationsspezifischen Amplifizierungsstufe eine spezifische Amplifizierung von Teilen des Gens selbst in einem Bereich, der die Mutationen des Gens enthält, durchgeführt wird, um die Amplifizierung von homologen Sequenzen in verwandten Pseudogenen zu verhindern.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die Mutationen des CYP2D6-Gens, die für den Debrisoquin-Polymorphismus verantwortlich sind, nachgewiesen werden.

17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin Mutationen des NAT2-Gens, die für den Acetylierungs-Polymorphismus verantwortlich sind, nachgewiesen werden.

18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin Mutationen von Genen der CYPIIC-Unterfamilie, die für den Mephenytoin- Polymorphismus verantwortlich sind, nachgewiesen werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin das Gen in der Probe von Säugetier-DNA stammt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, worin das Gen in der Probe von genomischer DNA stammt.

21. Diagnosekit zum Nachweis von Genen für Arzneimittel metabolisierende Enzyme umfassend einen ersten Satz von einem oder mehreren Behältern mit Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen zweiten Satz von einem oder mehreren Behältern mit Primern nach einem der Ansprüche 9 bis 13.

22. Diagnosekit nach Anspruch 21, der zusätzlich Reagenzien zur Durchführung der PCR-Amplifizierung enthält.

23. Diagnosekit nach Anspruch 21 oder 22, der weiterhin Einrichtungen zum Nachweis der amplifizierten Fragmente enthält.