DE69308048T2 - Menschliche Arylamine-N-acetyltransferase Genen - Google Patents
Menschliche Arylamine-N-acetyltransferase GenenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft polymorphe humane Arylamin-N- acetyltransferasegene, ein neues Verfahren zum Nachweis der polymorphen Gene, ein neues diagnostisches Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage einer Nebenwirkung oder Wirkungen, die durch eine Amin-haltige aromatische Substanz verursacht werden, oder zur Untersuchung der Ursache solcher Nebenwirkungen und ein Nachweiskit zur Verwendung in dem Nachweisverfahren.
- Exogene und endogene aromatische Aminoverbindungen werden durch N-Acetylierung hauptsächlich in der Leber inaktiviert, und man kennt die Arylamin-N-acetyltransferase (NAT; EC 2.3.1.5) als ein Enzym, das eine N-Acetylierung katalysiert. Das Enzym wird auch als N-acetylierendes Morphin bezeichnet.
- Das obige N-acetylierende Morphin kommt im allgemeinen in der Leber vor. Der erste Schritt in Richtung auf die Entdeckung dieses Enzyms war die genetische Erkenntnis, die in einer kumulativen Untersuchung von Familienhistorien in Bezug auf Isoniazid-induzierte Neuropathie erhalten wurden, daß es Individuen mit einer hohen Aktivität des Enzyms in der Leber (rasche Acetylatoren) und Individuen mit niedriger Aktivität (langsame Acetylatoren) gibt [Evans D. A. P. et al., Br. Med. J., 2, 485-491 (1960); Evans D. A. P. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 123, 178-187 (1965)].
- Später legte ein Bericht nahe, daß N-Acetyltransferase bei der Exprebsion der Toxizität von Amin-haltigen Arzneimitteln und bei solchen Erkrankungen wie Blasenkrebs und systemischen Lupus Erythematosus (SLE) beteiligt sein könnte [Weber W. W., Fed. Proc., 43, 2332-2337 (1984)].
- Das Auftreten von Typen mit hoher und niedriger N- Acetyltransferaseaktivität, wie oben erwähnt, wurde nicht nur bei Menschen, sondern auch bei Säugern wie Kaninchen, Hamstern und Mäusen bestätigt. Insbesondere bei Menschen hängt das Auftreten einer Nebenwirkung eines Amin-haltigen Arzneistoffes von dem Ausmaß (Rate) der Erststufen- Acetylierung in der Leber ab, und die Individuen, bei denen die Acetylierung langsam fortschreitet, werden als langsame Acetylatoren bezeichnet, und diejenigen, bei denen die Acetylierung rasch fortschreitet, sind rasche Acetylatoren. Bislang sind diese beiden Acetylatortypen durch Verabreichung eines Amin-haltigen Arzneistoffes an Individuen und Bestimmung der Halbwärtszeit des Arzneistoffes unterschieden worden [R. A. Knight et al., Trans. Cong. Chemother Tuberculosis, 18, 52-58 (1949); D. A. P. Evans et al., Br. Med. J., 2, 485-491 (1960)].
- In der Zwischenzeit wurden Tiermodelle für beide Acetylatortypen konstruiert, und die Beziehung zwischen Arzneimittelmetabolismus und Nebenwirkungen oder zwischen Carcinogenese und N-Acetyltransferase sind in den Modellen untersucht worden [R. H. Tannen et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 213, 480-484 (1980); D. W. Hein et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 223, 40-44 (1982); D. W. Hein et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 233, 584-587 (1985)].
- Zur Zeit umfassen Arzneistoffe oder andere Substanzen, bei denen eine Korrelation zwischen dem oben erwähnten langsamen Acetylator und der Metabolisierungsrate vermutet wird, Sulfamethazin, andere Sulfanoide, Isoniazid, Procainamid, Hydrallazin, Phenelzin, Caffein, Nitrazepan, carcinogenes Benzidin, 2-Aminofluorocen und β-Naphthylamin unter anderem [D. A. P. Evans et al., J. Lab. Clin. Med., 63, 394-402 (1964); J. W. Jenne et al., J. Clin. Invest., 44, 1992-2002 (1965); J. W. Jenne et al., Am. Rev. Respir. Dis., 84, 371- 378 (1961); J. H. Peters et al., Life Sci., 4, 99-107 (1965); Weber W. W., The Acetylator Genes and Drug Response, Oxford University Press, New York (1987)].
- In jüngster Zeit wurde das Auftreten eines autosomalen rezessiven Gens, welches zur den obigen beiden Actylator- Phenotypen führt, bei Menschen, Kaninchen und anderen Säugern nachgewiesen [Weber W. W. und Hein D. W., Pharmacol. Rev., 37, 25-79 (1985)] und es wurde ebenfalls bestätigt, daß eine monomorphe N-Acetyltransferase in der Leber zusätzlich zum polymorphen Typ existiert, und daß die N-Acetyltransferase allen Menschen gemeinsam ist, aber einige individuelle Variationen im Vergleich zur polymorphen zeigt [Weber W. W. und Hein D. W., Pharmacol. Rev., 37, 25-79 (1985)].
- Was das Gen für die Arylamin-N-acetyltransferase betrifft (im folgenden kurz als "NAT" bezeichnet), isolierten O. A. Meyer et al. [Blum M. et al., Nucleic Acids Res., 17, 2589 (1989)] cDNA von mRNA der Leber eines Kaninchen, welches einen Phenotyp vom raschen Acetylator zeigte, in vitro unter Verwendung eines Oligonukleotids, das für eine partielle Aminosäuresequenz der gereinigten Kaninchenleber-NAT kodierte [Andres H. H. et al., Mol. Pharmacol., 31, 446-456 (1987)] und ein NAT-spezifisches Antiserum, und D. M. Grant et al. stellten eine cDNA-Sonde her, die für das Kaninchenleber-NAT- Gen spezifisch war, und isolierten erfolgreich ein humanes NAT-Gen unter Verwendung der Sonde [D. M. Grant et al., Nucleic Acids Res., 17, 2978 (1989)). Wie berichtet wird, umfaßt die Kodierung oder kodierende Regiondes humanen NAT- Gens 1981 bp (Basenpaare) mit einer 82%igen und 61%igen Homologie zu den Kaninchen- bzw. Hühnerleber-NAT-Genen. Die cDNA-kodierende Region für die Hühnerleber-NAT wurde von Ohsako et al. isoliert [Ohsako S. et al., J. Biol. Chem., 263, 7534-7538 (1988)].
- Die Erfinder haben ebenfalls intensive Untersuchungen hinsichtlich humaner NAT-Gene unternommen. Sie stellen poly(A)&spplus;RNA aus Humanlebern, die aus einer Autopsie erhalten wurden, her, konstruierten humane λgt10 cDNA-Banken, isolierten 24 positive Klone aus 3 x 10&sup6; rekombinanten Phagen unter Verwendung der obigen Kaninchen-NAT-cDNA als Sonde und erhielten erfolgreich drei cDNA-Typen (bezeichnet als D-14, O-7 und D-24). Mit diesen NAT-Gentypen kamen sie zu den folgenden Ergebnissen [Ohsako S. und Deguchi T., J. Biol. Chem., 265 (8), 4630-4634 (1990)].
- (1) Die Humanleber-NAT-Gen-cDNAs D-14, O-7 und D-24 sind 1210 bp, 1276 bp und 1319 bp lang; D-14 ist 66 Basen kürzer als O-7 in der 5'-nicht-kodierenden Region.
- (2) Alle drei cDNAs kodieren für 290 Aminosäuren.
- (3) O-7 und D-14 unterscheiden sich voneinander an zwei Punkten (282ste und 857ste Basen); die Mutation an Position 282 ist eine stille Mutation, wogegen das Ergebnis der Mutation an Position 857 Glycin bei O-7 und Glutaminsäure bei D-14 ist.
- (4) O-7 und D-14 sind 80%ig homolog zu D-24 auf der Aminosäurestufe.
- (5) Die berechneten Mulekulargewichte sind 33542 für O-7, 33787 für D-14 und 33614 für D-24.
- (6) Bei allen drei cDNA-Typen endet die 3'-nicht-kodierende Region an einer EcoRI-Schnittstelle.
- (7) Im Hinblick auf die bei Expression der Gene in CHO- Zellen erhaltenen NAT-Aktivittsspiegeln sind O-7 und D- 14 polymorphe NAT-Gene, wogegen D-24 ein monomorphes NAT-Gen ist.
- (8) Die von D-14 produzierte NAT-Aktivität ist 9 bis 17 % der von O-7 produzierten Aktivität, und diese Aktivitäten sind unterschiedlich. O-7 kann als vom raschen Typ angesehen werden und D-14 vom langsamen Typ, und dieser Unterschied kann an der BamHI-Schnittstelle nachgewiesen werden. Dieser Aktivitätsunterschied beruht vermutlich auf dem Unterschied in einer einzelnen Aminosäure unter den Aminosäuren, die die Enzymproteine bilden.
- Ferner haben die Erfinder den Acetylator Polymorphismus unter Japanern durch Studium der Unterschiede der Restriktionsendonuklease-Schnittstellenmustern im Southern- Blott in einem Isoniazid-Verabreichungstest untersucht, um den bei den obigen Genen beteiligten Polymorphismus aufzuklären, und als Ergebnis drei Typen von NAT-Genen an der EcoRI-KpnI-Erkennungsstelle einschließlich einer 3'-nichtkodierenden Region nachgewiesen. Der erste Typ ist ein Gen vom Typ 1, enthaltend ein 5,3 kb-DNA-Fragment aus einem KpnI- Verdau mit einer BamHI-Schnittstelle, der zweite Typ ist ein Gen vom Typ 2, enthaltend ein 5,3 kb-DNA-Fragment aus einem KpnI-Verdau und ohne solche Restriktionsschnittstelle, und der dritte Typ ist ein Gen vom Typ 3, enthaltend ein 4,9 kb- DNA-Fragment aus einem KpnI-Verdau mit einer BamHI- Schnittstelle. Auf Grundlage der Kombinationen dieser Gene konnten fünf polymorphe Typen unterschieden werden, und der Acetylatorpolymorphismus konnte aufgrund der Ergebnisse des oben erwähnten Isoniazidtests aufgeklärt werden. Im Ergebnis konnten 29 gesunder japanische Testpersonen in drei Phenotypen zugeordnet werden, nämlich den raschen Acetylatoren (10 Personen), den langsamen Acetylatoren (3 Personen) und den mittleren Acetylatoren (16 Personen). Es wurde daher gefunden, daß die oben erwähnten raschen Acetylatoren Typ 1-Gen-homozygot sind, die mittleren Acetylatoren sind heterozygot von Typ 1- und Typ 2-Genen oder der den Typ 1- und Typ 3-Genen und die langsamen Acetylatoren sind heterozygot für die Typ 2- und Typ 3-Gene oder Typ 3- Gen-homozygot. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das Gen vom Typ 1 mit einer hohen NAT-Aktivität verbunden ist und die Gene vom Typ 2 und Typ 3 zu einer niedrigen NAT-Aktivität führen [Deguchi T. et al., J. Biol. Chem., 265 (22), 12757- 12760 (1990)].
- Wie oben erwähnt, umfaßt das Verfahren zum Nachweis des NAT- Gen-GNA-Polymorphismus, wie zuvor von den Erfindern vorgeschlagen, die Spaltung genomischer DNA mit einer Restriktionsendonuklease oder Endonukleasen, Durchführung einer Sourthern-Hybridisierung mit einer spezifischen Sequenz als Sonde und Abtrennen und Nachweis der Restriktionsfragmente von der Region des Genoms, die die Sequenz enthält, entsprechend der Länge der Fragmente. Daher ist das Verfahren ein RFLP-Analyseverfahren (Restriktionsfragmentlänge des Polymorphismus), welches des Auftreten des Polymorphismus an der (den) Restriktionsstelle(n) oder der Insertion oder der Verlust von DNA in den Fragmenten ausnutzt und den genetischen Polymorphismus durch Veränderungen in der Beweglichkeit der verwandten Banden nachweist. Dieses Verfahren soll jedoch das Gen vom Typ 3 durch Polymorphismus an der KpnI-Schnittstelle in der nicht-kodierenden Region nachweisen, obwohl das Gen vom Typ 2 durch Polymorphismus an der BamHI-Schnittstelle nachgewiesen werden kann. Daher kann das Verfahren nicht als direktes Verfahren zum Nachweis von Schnittstellen, die möglicherweise mit der Enzymaktivität in Beziehung stehen, angesehen werden. Es ist daher ein direkteres Verfahren zum Nachweis der aktiven Schnittstelle erwünscht.
- Man kennt andere Verfahren zum Nachweis von genetischem Polymorphismus z. B. das Verfahren, welches den Nachweis einer Einbasen-Substitution unter Ausnutzung der Tatsache, daß teilweise einzelsträngig gemachte DNA praktisch keine Beweglichkeit bei der modifizierten Gradienten- Gelelektrophorese zeigt und daß der fehlerhaft gepaarte Anteil der DNA rasch dazu neigt, einzelsträngig zu werden, umfaßt [Meyers R. M. et al., Nature, 313, 495-498 (1985)], und Verfahren, die Ligase, Rnase, usw. verwenden. Jedoch sind diese Verfahren kompliziert und bei der gleichzeitigen Handhabung großer Mengen an DNA nachteilig. Obwohl die Entwicklung der PCR-Methode (Polymerase-Kettenreaktion) [Science, 239, 487-491 (1988)) die Entwicklung einer Technik zur Amplifizierung kleiner DNA-Mengen effizient und in kurzer Zeit ermöglicht hat (siehe japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 62-214355) ist immer noch Forschungs- und Entwicklungstätigkeit bei der Suche nach einem analytischen Verfahren solcher Art, welches einfach und leicht automatisiert werden kann, erforderlich.
- Es ist demnach eine Aufgabe der Erfindung, ein automatisierbares Verfahren zu entwickeln, daß von der Wissenschaft in hohem Maße angestrebt wird, zum direkteren Nachweis von der NAT-Aktivitätsschnittstelle auf einfache und leichte Weise unter Verwendung von DNA-Proben in kleinen Mengen.
- Die Erfinder haben ferner intensive Untersuchungen unternommen, um die obige Aufgabe zu lösen und als Ergebnis gefunden, daß kein Nachweisverfahren, welches von der NAT- Aktivitätsschnittstelle Gebrauch macht und die obige Aufgabe lösen könnte, niemals gefunden werden kann, falls es lediglich auf der Basensequenzinformation, welche die kodierende Region der NAT-Gene (Genotypen 1 und 2), wie zuvor von den Erfindern berichtet, beruht. Sie konnten jedoch die Basensequenzen der kodierenden und der nicht-kodierenden Regionen eines NAT-Gens vom Typ 3 neu identifizieren. Sie haben gefunden, daß bei Verwendung-der Basensequenzen die polymorphen DNAs nur aufgrund der Kombinationen der in den NAT-Genen vom Typ 1 bis 3 enthaltenen Restriktionsschnittstellen neu typisiert werden können, und daß die polymorphen Gene auf diese Weise effizient und auf einfache und rasche Weise direkt unter Verwendung der kodierenden Region jeder NAT-Gen-DNA unter Einsatz der Restriktionsendonukleasen BamHI und TaqI im PCR-RFLP- Verfahren nachgewiesen werden können. Die Erfinder haben ferner das Auftreten eines neuen vierten Typs eines NAT-Gens durch Analyse bestätigt und gefunden, daß bei Verwendung dieses Gens vom Typ 4 mehr polymorphe NAT-Gene nachgewiesen werden können. Die obigen Erkenntnisse haben nur zur Vollendung der Erfindung geführt.
- Die Erfindung stellt daher ein humanes NAT-Gen vom Typ 1 zur Verfügung, welches eine Basensequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz des SEQ ID Nr. 7 kodiert, insbesondere ein humanes NAT-Gen vom Typ 1, welches die 5'-nicht-kodierende Region der Basensequenz der SEQ ID Nr. 1 enthält, und das Segment mit der kodierenden Region, die die Basensequenz SEQ ID Nr. 2 enthält; ein humanes NAT-Gen vom Typ 2, welches die Basensequenz enthält, welche für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 kodiert, insbesondere ein humanes NAT-Gen vom Typ 2, welches die 5'-nicht-kodierende Basensequenzregion von SEQ ID Nr. 3 enthält, und die Basensequenz, enthaltend das Segment mit der kodierenden Region von SEQ ID Nr. 4; und ein humanes NAT-Gen vom Typ 3, welches eine Basensequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9 kodiert, insbesondere ein humanes NAT-Gen vom Typ 3, welches die Basensequenz der 5'-nicht-kodierenden Region von SEQ ID Nr. 5 und die Basensequenz, enthaltend das Segment mit der kodierenden Region gemäß SEQ ID Nr. 6 enthält.
- Die Erfindung stellt ebenfalls eine Basensequenz zur Verfügung, die ein humanes NAT-Gen vom Typ 3 enthält, welches das Segment mit der kodierenden Region gemäß SEQ ID Nr. 6 kodiert.
- Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des humanen polymorphen NAT-Gens zur Verfügung, welches umfaßt: Nachweis von irgendeinem der oben erwähnten humanen NAT-Gene vom Typ 1 bis 3 durch RFLP-Analyse und ein Verfahren zur Diagnose einer Nebenwirkung oder von Wirkungen, die durch eine Amin-haltige aromatische Substanz verursacht werden, welches den Nachweis eines humanen polymorphen NAT-Gens nach dem Nachweisverfahren unter Verwendung einer humanen Körperflüssigkeit oder Haar als Probe umfaßt und hierdurch Diagnose, Vorhersage oder Untersuchung der Nebenwirkung oder wirkungen umfaßt.
- Erfindungsgemäß werden die Aminosäuresequenzen und Basensequenzen durch jene Abkürzungen und Symbole dargestellt, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlen werden oder üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden.
- Die erfindungsgemäßen NAT-Gene werden im folgenden in Einzelheiten beschrieben. Bei der Anwendung gentechnischer Verfahren ist es allgemeine Praxis, das erwünschte Protein zu extrahieren und zu reinigen und die Aminosäuresequenz eines Teils des Proteins nachzuweisen oder nach einer cDNA für das fragliche Protein zu suchen und die DNAs zu bestimmen, wobei die cDNA als Sonde verwendet wird. Daher wird in der vorliegenden Beschreibung die Sequenzbestimmung der NAT-cDNAs zunächst beschrieben und anschließend werden die Extraktion, das Screenen und die Sequenzierung der genomischen DNAs für NAT beschrieben.
- Die erfindungsgemäßen Gene können jeweils durch Extraktion gesamter humaner RNA, Abtrennung und Reinigung der mRNA aus der RNA, Transkription der mRNA in cDNA unter Konstruktion einer cDNA-Bank, Selektion der erwünschten cDNA aus der Bank, Einführen der cDNA in Wirtszellen zu ihrer Transformation und Kultivierung der Zellen erhalten werden.
- Die Zellen, aus denen die Gesamt-RNA abgetrennt werden soll, können Leberzellen sein, die aus Humanlebern durch Biopsie erhalten werden, periphere Leukozytenzellen, kultivierte Zellen die aus diesen abgeleitet sind und ähnliche. Sie können z. B. nach einem Verfahren von Hermann et al. hergestellt werden [Hermann B. G. und Frischauf A. M.., Methods Enzymol., 152, 180-183 (1987)]. Die auf obige Weise erhaltenen Zellen können in einem üblichen Medium kultiviert werden, z. B. RPMI-1640-Medium, CEM-Medium, CMRL-10-Medium, DM-160-Medium, Dulbecco's Modifizierung von Eagle's Minimal- Essentiell-Medium (MEM), Fischer-Medium, F-10-Medium oder irgendeinen dieser Medien, das mit einem Serum, wie fetalem Kalbsserum (FCS) oder einer Serumkomponente, wie Albumin, ergänzt wurde. Die Menge an Zellen, relativ zum obigen Medium, ist nicht kritisch, ist jedoch im allgemeinen und empfehlenswert ca. 1 x 10&sup4; bis 10¹&sup0; Zellen/ml. Die Kultivierung kann auf übliche Weise erfolgen, z. B. durch Kultivierung unter Kohlendioxidgas bei einer Temperatur von ca. 30 bis 40ºC, vorzugsweise ca. 37ºC, für einen Zeitraum von 5 bis 17 Tagen, vorzugsweise ca. 8 bis 11 Tagen.
- Es wird empfohlen, die gesamte RNA-Extraktion aus dem auf obige Weise erhaltenen kultivierten Zellen oder Gewebe zu der Zeit durchzuführen, wenn die Produktion und die Akkumulierung der erwünschten humanen NAT im Kulturüberstand sein Maximum erreicht. Das Extraktionsverfahren kann durch ein konventionelles Verfahren wie z. B. einem Guanidinthiocyanat- Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren durchgeführt werden(T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 194, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). In diesem Verfahren werden die obigen Zellen teilweise oder vollständig und unter Verwendung einer Lösung aus einer Mischung von Guanidinthiocyanat oder einem geeigneten Detergens, wie SDS, NP-40, Triton X-100 oder Deoxicholinsäure oder mit einem Homogenisator oder durch ein physikalisches Verfahren, wie dem Einfrier-Auftau-Verfahren vollständig aufgebrochen oder solubilisiert. Die chromosomale DNA wird unter Verwendung eines Polytrons oder eines ähnlichen Mixers oder einer Spritze oder durch Pipettierung in einem gewissen Ausmaß Scherkräften ausgesetzt. Eine Nukleinsäurefraktion wird dann von den Proteinen abgetrennt. Für diese Prozedur wird im allgemeinen das Cäsiumchlorid-Isodichteverfahren unter Verwendung von Ultrazentrifugation bei ca. 100000 x g [Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)] oder das Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren eingesetzt. Um den Abbau der RNA, induziert durch Rnase zu vermeiden, kann das obige Verfahren oder Prozedur in Gegenwart eines RNas- Inhibitors wie Heparin, Polyvinylsulfat, Diethylpyrocarbonat, Vanadiumkomplex, Bentonit oder Makaloid, wie zugegeben, durchgeführt werden. Das in der Proteinfraktion enthaltene und von der Nukleinsäurefraktion durch das obige Verfahren abgetrennte NAT-Protein kann nach konventionellen Verfahren zur Abtrennung von Proteinen z. B. durch ein chromatographisches Verfahren abgetrennt werden.
- Die Isolierung und Reinigung der mRNA aus dem nach dem obigen Verfahren erhaltenen RNA kann durch ein Adsorptionssäulenverfahren oder durch ein Batch-Verfahren unter Einsatz von z. B. oligo-dT-Zellulose (Collaborative Research Inc.), poly-U-Sepharose (Pharmacia), Sepharose 28 (Pharmacia) oder ähnlichen erfolgen.
- Die Reinigung der erwünschten mRNA aus der so erhaltenen M und ihre Konzentrierung und Identifizierung kann durch Fraktionieren der auf obige Weise erhaltenen mRNA durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, wobei z. B. jede Fraktion bei einem Translationsprozeß in einem Protein oder Proteine in Protein-Translationssystemen, z. B. in Eizellen von Xenopus laevis oder einem Kaninchen-Retikulozytenlysat oder in einem zellfreien System, wie z. B. Weizenkeimling, und Prüfen der Aktivität des Proteins, unterzogen werden. Das Vorliegen der erwünschten mRNA kann auf diese Weise bestätigt werden. Die erwünschte mRNA kann auch unter Verwendung zusätzlich zu den obigen Aktivitätsbestimmungsverfahren, eines immunologischen Verfahrens unter Verwendung eines Antikörpers gegen NAT identifiziert werden.
- Die so erhaltene gereinigte mRNA, die üblicherweise instabil ist, wird unter Erhalt der entsprechenden stabilen komplementären DNA (cDNA) revers transkribiert, die dann in ein Replikon, abgeleitet aus einem Mikroorganismus, zur Amplifizierung des erwünschten Gens eingefügt wirdo Im allgemeinen kann die in vitro-Transkription der mRNA in cDNA, d. h. die cDNA-Synthese, realisiert werden durch zuerst Herstellen von poly(A)&spplus;RNA unter Verwendung von oligo(dT- Zellulose oder ähnlichem und dann nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman [Gubler U. und Hofman B1, Gene, 25, 263- 268 (1983)] wie folgt.
- Daher wird unter Verwendung von oligo(dT) als Primer (welcher entweder freies Oligo-dT oder bereits an einem Vektorprimer gebundenes Oligo-dT sein kann) und der mRNA als Matrize eine einzelstängige DNA, die zur mRNA komplementär ist, in Gegenwart von dNTPs (dTP, dGTP, dCTP und dTTP) und einer reversen Transkriptase synthetisiert. Der nächste Schritt ist unterschiedlich, wie folgt, je nach dem ob Oligo-dT oder ein oligo-dT-veränderter Vektorprimer verwendet wird.
- Im ersteren Fall wird die als Matrize verwendete mRNA durch die Zersetzung mittels alkalischer Hydrolyse oder ähnlichem entfernt, und eine doppelstängige DNA wird unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als Matrize in Gegenwart einer reversen Transkriptase oder DNA-Polymerase synthetisiert. Anschließend werden beide Enden der doppelstängigen DNA mit Exonuklease behandelt um sie glatt zu machen, en geeignete Linker-DNA oder eine Kombination von zum Verschmelzen geeigneten Basen wird an jedes Ende angeheftet und die erhaltene DNA in einen geeigneten Vektor eingefügt. Zu diesem Zweck können verschiedene bekannte Verfahren z. B. das Verfahren von Gubler und Hoffman je nach eingesetztem Vektor angewandt werden. Die cDNA-Synthese, wie oben erwähnt, kann unter Verwendung eines handelsüblichen cDNA- Synthetisierungskits erfolgen. der zu verwendende Vektor ist nicht auf irgendeine bestimmte Spezies limitiert, kann jedoch ausgewählt werden je nach Wirt aus Phagenvektoren wie λgt- Phagenvektoren und Plasmidvektoren, die entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden können. Als typische Beispiele für einen Phagenvektor soll λgt10, λgt11, usw. erwähnt werden. Wenn λgt10 oder λgt11 verwendet wird, kann nach dem Verfahren von Young et al. [Young R. A. et al., DNA Cloning, 1, 49 (1985)] gearbeitet werden.
- Im letzteren Fall wird die als Matrize verwendete mRNA als solche, ein geöffnetes Plasmid, das mit dem gleichen Linker wie oben erwähnt ausgestattet ist, und eine Linker-DNA (häufig wird als solche ein DNA-Fragment verwendet, das eine in tierischen Zellen autonom replizierbare Region und eine transkriptionale Promotorregion für mRNA enthält) zu einer zirkularen Form verschmolzen und dann wird die mRNA durch den entsprechenden DNA-Strang in Gegenwart von dNTPs und RNase H und DNA-Polymerase I ersetzt, wodurch eine komplette Plasmid- DNA konstruiert werden kann.
- Die so erhaltene DNA wird in einen Wirt für den Transformationsvektor für den Wirt eingeführt. Ein typisches Beispiel für den Wirt ist Escherichia coli, jedoch ist der Wirt nicht auf diese Spezies beschränkt. Daher können z. B. Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae ebenfalls verwendet werden.
- Für die Einführung der oben erwähnten DNA in einen Wirts- Mikroorganismus zu seiner Transformation kann jedes beliebige von verschiedenen Verfahren, wie üblicherweise in Anwendung, eingesetzt werden. Z. B. wird als Vektor ein Phage verwendet, kann die bloße Infektion von Wirtszellen zu einer wirksamen Integration der DNA in den Wirt führen. Wenn ein Plasmid verwendet wird, werden die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt und mit CaCl&sub2; behandelt, um sie für die spontane DNA-Aufnahme bereitzumachen. Dieses Verfahren für die Plasmidaufnahme ist vorteilhaft. Jedes der obigen Verfahren kann in Gegenwart von MgCl&sub2; oder RbCl durchgeführt werden wie es allgemein bekannt ist, um eine verbesserte Transformationseffizienz zu erreichen. Die Wirtszellen können in Spheroplasten oder Protoplasten vor der Transformation umgewandelt werden. Diese Modifikationen sind im Detail bei Gubler und Hoffman in dem oben zitierten Bericht beschrieben [Gubler U. und Hofman B., Gene, 25, 263-268 (1983)].
- Das Screenen des erwünschten Gens aus der so erhaltenen humanen cDNA-Bank kann nach beliebigen konventionellen Verfahren oder einer Kombination davon erfolgen, z. B. dem Verfahren, welches die Verwendung eines NAT-spezifischen Antikörpers gegen ein durch die cDNA produziertes Protein und Auswahl des entsprechenden cDNA-Klons durch Western-Blotting, dem Southern-Blotting-Verfahren, welches eine Sonde verwendet, die zur selektiven Bindung an die erwünschte cDNA- Sequenz in der Lage ist, dem Northern-Blotting-Verfahren, dem Plaque-Hybridisierungsverfahren oder dem Kolonie- Hybridisierungsverfahren erfolgen. Die hier zu verwendende Sonde ist im allgemeinen eine DNA-Sequenz, die basierend auf der Information betreffend die erwünschte DNA- oder RNA- Sequenz oder die hierdurch kodierte Aminosäuresequenz synthetisiert werden, aber eine DNA oder RNA die aus einer natürlichen Quelle präpariert wurde, kann ebenfalls verwendet werden. Da die humanen NAT-Gene eine besonders hohe Homologie zu Kaninchen- und Hühner-NAT-Genen zeigen, kann eine markierte Modifikation der entsprechenden Komponenten-cDNA von Kaninchen z. B. oder einem Teil davon als obige Sonde eingesetzt werden. Ferner kann eine markierte Modifikation bekannter humaner NAT-O-7-cDNA oder D-14-cDNA oder ein Teil davon als Sonde verwendet werden.
- Die erfindungsgemäßen NAT-Gene können durch Extraktion der genomischen DNA für humane NAT, Reinigen derselben und Integrierung der selben in einen geeigneten Vektor, Konstruktion einer genomischen DNA-Bank durch in vitro- Verpackung, z. B. Screenen der erwünschten genomischen DNA aus der Bank durch Hybridiserung unter Verwendung von humaner NAT-cDNA als Sonde und Isolieren des erwünschten Klons, erhalten werden.
- Die genomische DNA für humanes NAT zur Verwendung im obigen Verfahren kann auf die gleiche Weise wie bei der Gesamt-RNA- Abtrennung unter Verwendung von Lebergewebe, erhältlich von Menschen bei einer Autopsie, Leberzellen, erhältlich aus humanem Lebergewebe bei einer Biopsie, peripheren Leukozytenzellen oder kultivierten Zellen, die hieraus abgeleitet sind, abgetrennt werdenl Die obigen Ursprungszellen können nach einem konventionellen Verfahren kultiviert werden.
- Für die genomische DNA-Extraktion aus den oben erwähnten Gewebequellen wird das Gewebe in einer geeigneten Pufferlösung, wie Tris-Hydrochloridpuffer ergänzt mit NaCl, EDTA, usw. unter Eiskühlung aufgebrochen und anschließend unter Verwendung eines geeigneten Detergens wie SDS, NP-40 oder ähnlichem gelöst, die Proteine werden unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie Proteinase K, extrahiert, die Nukleinsäuren werden nach dem Phenol-Chloroform- Extraktionsverfahren extrahiert, die RNA wird unter Verwendung von Ribonuklease verdaut, es wird wieder eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt und die DNA wird unter Verwendung von Ethanol konzentriert. Auf diese Weise kann die erwünschte DNA erhalten werden. Wenn die DNA-Quelle große Mengen an Cytoplasma und intrazellulären Substanzen der Leber usw. enthält, sollte der Kern vorzugsweise einer zentrifugation unterworfen werden, z. B. nach dem Saccharose- Dichtegradientenverfahren. Wenn kultivierte Zellen als Quelle verwendet werden, werden sie in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, wie auch im Fall von Gewebe, und einer Zentrifugation unter Erhalt eines Zellpellets unterworfen und anschließend kann die erwünschte DNA unter Eiskühlung auf gleiche Weise wie bei dem oben erwähnten Gewebe extrahiert werden. Die oben erwähnte DNA-Extraktion und die Konstruktion einer im folgenden erwähnten Bank sind im Detail bei Haruo Ozeki et al. beschrieben:: "Bunshi Idenshigaku Jikenho (Experiments in Molecular Genetics)", Seiten 94-110, Kyoritsu Shuppan, 1983, auf das Bezug genommen werden kann.
- Eine genomische DNA-Bank kann unter Verwendung des Southern- Hybridisierungsverfahrens z. B. unter Verwendung der obigen DNA konstruiert werden. Der zu verwendende Phagenvektor und Restriktionsenzym oder -enzyme für diese Gelegenheit, können geeigneterweise ausgewählt werden, basierend auf der Information zur Zeit der cDNA-Herstellung. Daher können z. B. EMBL3, EMBL4, λFIXII, Charon 4A, λgt10, λgt11 und ähnliche als Phagenvektoren und pWE15, pWE15, Charomid 9-20 und ähnliche Vektoren als Cosmid-Vektoren verwendet werden. Diese Vektoren sind handelsüblich erhältlich und können leicht erhalten werden. Einsetzbar als Restriktionsenzyme sind z. B. EcoRI, BamHI, Sau3AI, AluI, HaeIII, usw.
- Die genomische DNA zur Rekombination wird teilweise durch Restriktionsendonukleaseverdau auf eine Länge verdaut, die ihre Einfügung in die eingesetzte Phagen-DNA nach der Fraktionierung erlangt. Die Fraktionierung kann z. B. durch Wiedergewinnung aus Agarosegelelektrophorese oder durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation erfolgen.
- Der Phagenvektor wird einem Restriktionsenzymverdau und einer Fraktionierung auf die gleiche Weise unterzogen. Die Phagenvektor-DNAs und das erwünschte DNA-Fragment werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gibatisiert, worauf eine in vitro-Verpackung erfolgt, wodurch die gewünschte Genom- DNA-Bank konstruiert werden kann. Das Verpacken kann erfolgen unter Verwendung eines handelsüblich erhältlichen Kits wie Gigapack II Plus, Gigapack Gold oder Gigapack XL (jeweils erhältlich von Stratagene).
- Die erwünschte DNA kann aus der Genom-DNA-Bank z. B. auf die folgende Weise nachgewiesen werden. Zunächst wird eine markierte Sonde aus der cDNA, einem Teil der Gen-DNA, einem synthetischen Oligonukleotid oder ähnlichem durch Nick- Translation oder durch Einsatz des Zufalls-Primer-Verfahrens hergestellt. Die Sondenmarkierung kann z. B. unter Verwendung eines Multiprime-DNA-Markierungssystems erfolgen (Amersham), welches das Multiprime-DNA-Markierungsverfahren anwendet [Feinberg A. P. et al., Anal. Biochem., 137, 266-267 (1984)]. Die erwünschte DNA karin unter Verwendung der oben markierten Sonde nach dem Plaque-Hybridisierungsverfahren, entwickelt von Benton und Davis [Benton W. und Davis R., Science, 196, 383-394 (1977)] gescreent werden.
- Für die Suche in der obigen genomischen NAT-DNA-Bank kann eine ³²P-markierte Sonde, abgeleitet aus dem 311-Basenpaar- DNA-Fragment- an der BamHI-EcoRI-Stelle in der kodierenden Region des NAT-Gens vom Typ 1 (O-7) oder der gesamten cDNA (O-7) verwendet werden.
- Zur Identifizierung aller rekombinantes Gen enthaltenden Klone im Anschluß an die obige Suche erfolgt weiteres Screenen mit den positiven Klonen unter Verwendung von cDNAs in ihren 5'- und 3'-terminalen Regionen. Die NAT-Gen-haltigen Klone, die erhalten werden, können in einem geeigneten Plasmid, wie z.. B. pUC18, subkloniert werden, worauf Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym oder -enzymen auf übliche Weise, wie bei der allgemeinen cDNA-Klonierung, folgt.
- Die Basensequenz eines jeden NAT-Gens gemäß der Erfindung kann nach dem Dideoxyverfahren unter Verwendung eines T7- Sequenzierungs -Kits (Pharmacia) bestimmt werden. Falls notwendig, können Sequenzprimer unter Verwendung von Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB Biotechnology) oder ähnlichem synthetisiert werden.
- Die verschiedenen einsetzbaren Prozeduren in den obigen Verfahren, z. B. chemische Synthese bestimmter DNAs, enzymatische Behandlung zum Zwecke der DNA-Spaltung, Paarung, Zugabe oder Verknüpfung, DNA-Isolierung, Reinigung, Replikation und Selektion kann auf übliche Weise erfolgen.
- Zur Konstruktion der oben erwähnten genomischen DNA-Bank ist es auch möglich, Riesen-DNAs durch Pulsfeld-Gelelektrophorese z. B. unter Verwendung eines artifiziellen Hefechromosoms (YAC) oder ferner unter Ausschnitt des bestimmten Chromosomteils aus einem Probenchromosom und Verwendung desselben für die direkte Klonierung durch PCR (Polymerase- Kettenreaktions-)-Verfahren [Saiki R. K. et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)] zu verwenden. Die NAT-Gene können ebenfalls durch Selektion und Herstellung eines geeigneten Primers, wie zuvor von den Erfindern berichtet, und Durchführung des PCR-Verfahrens mit der wie oben erwähnt extrahierten DNA analysiert werden.
- Die erfindungsgemäßen NAT-Gene können in verschiedene Plasmide nach einem konventionellen Verfahren kloniert werden. Dieses Klonieren kann z. B. durch Einfügen eines Fragments, das irgendeines der erfindungsgemäßen Gene wie durch Spaltung mit EcoRI und nachfolgender Reinigung erhalten, in einen Klonierungsvektor, z. B. pUC18 oder pUC19, der auf die gleiche Weise mit EcoRI gespalten ist, an der Spaltungsstelle erfolgen, wodurch der erwünschte rekombinante Vektor erhalten werden kann. Zur Einführung des rekombinanten Vektors in einen Wirt und Vermehrung und Abtrennung des rekombinanten Vektors können die verschiedenen oben erwähnten Verfahren eingesetzt werden.
- Unter dem in den oben erwähnten Verfahren einzusetzenden Prozeduren kann z. B. die DNA-Isolierung und das Reinigungsverfahren unter anderen mittels Agarosegelelektrophorese durchgeführt werden. Die DNA-Sequenz von jedem Gen gemäß der Erfindung kann z. B. durch das Dideoxyverfahren [Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)) oder dem Maxam-Gilbert- Verfahren [Maxam A. M. und Gilbert W., Methods in Enzymology, 65, 499-560 (1980)] ermittelt werden. Die oben erwähnte DNA- Basensequenz kann auch leicht unter Verwendung eines handelsüblich erhältlichen Sequenzierkits oder ähnlichem ermittelt werden. Zu Amplifizierung einer spezifischen DNA- Region kann das PCR-Verfahren [Saiki R. K. et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)] in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Kawasaki und Wang [Kawasaki und Wang, PCR Technology, H. A. Erlich, ed., Stockton Press, New York, S. 89-98 (1989)] eingesetzt werden. Die Pulsfeld-Gelelektrophorese ist eine relativ neue experimentelle Technik, dessen Prototyp von Schwarts et al. 1982 produziert wurde, und ist in den jüngsten Jahren zu einem Standardverfahren zur Analyse von Riesen-DNAs geworden und ist in häufiger Verwendung in Bereichen der Molekulargenetik, Molekularbiologie und ähnlichem. Diese Technik kann auch als Verfahren zur Analyse der erfindungsgemäßen Gene eingesetzt werden.
- Als Selektionsverfahren für die erwünschten Gene kann auch das Verfahren der Southern-Hybridisierung [Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)] oder Dot-Hybridisierung (Ditto) eingesetzt werden. In diesem Verfahren werden aus der Restriktions-Endonuklease-Spaltung erhaltene DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert und vom Gel auf einen Nitrozellulose- oder Nylonfilter überführt, eine durch Markierung einer dem erwünschten Gen entsprechenden DNA hergestellte Sonde wird mit den DNA-Fragmenten mit der komplementären Basensequenz auf dem Filter unter Erhalt von Hybriden hybridisiert, und die Hybrid-bildenden DNA-Fragmente werden durch Autoradiographie z. B. nachgewiesen.
- Die Basensequenzen der so erhaltenen drei Typen (Typen 1 bis 3) vom erfindungsgemäßen NAT-Gen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind wie folgt.
- Das NAT-Gen vom Typ 1 umfaßt die 5'-nicht-kodierende Basensequenzregion (2768 bp) von SEQ ID Nr. 1 und die das kodierende Regionsegment enthaltende Basensequenz (6464 bp) von SEQ ID Nr. 2 miteinander über eine Basensequenz von ca. 6,4 kb verbunden. Die der kodierenden Region des Gens vom Typ 1 entsprechenden Aminosäuresequenz besteht aus den 290 Aminosäuren der SEQ ID Nr. 7.
- Das NAT-Gen vom Typ 2 umfaßt die Basensequenz der 5'-nichtkodierenden Region (2768 bp) von SEQ ID Nr. 3 und die Basensequenz, die das Segment für die kodierende Region (6464 bp) von SEQ ID Nr. 4 enthält, miteinander über eine Basensequenz von 6,4 kb verbunden. Die Aminosäuresequenz, die der kodierenden Region des Gens vorn Typ 2 entspricht, besteht aus den 290 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 8.
- Das NAT-Gen vom Typ 3 umfaßt die Basensequenz der 5'-nichtkodierenden Region (2768 bp) von SEQ ID Nr. 5 und die Basensequenz, die das Segment für die kodierende Region (6464 bp) von SEQ ID Nr. 6 miteinander verbunden über eine Basensequenz von ca. 6,4 kb. Die Aminosäuresequenz entsprechend der kodierenden Region, die 874 Basen umfaßt, des Gens vom Typ 3 besteht aus den 290 Aminosäuren der SEQ ID Nr. 9.
- In der 9232-Basenregion, die wie oben sequenziert wurde, fand man, daß das NAT-Gen vom Typ 1 mit dem Restriktionsenzym BamHI an drei Stellen spaltbar ist, mit KpnI an zwei Stellen und mit TaqI an vier Stellen. In den Sequenzen der Gene vom Typ 2 und Typ 3 wurden entsprechend 13 und 23 Punktmutationen gefunden. Im Gen vom Typ 2 ist eine der beiden Punktmutationen im kodierenden Exon, das sich nahe am C- Terminus befindet, eine Punktmutation von G zu A, welches die Aminosäuregylcin durch Glutamin ersetzt, unter Verlust einer BamHI-Schnittstelle. Die andere Mutation in der kodierenden Region ist eine stille Mutation von C nach T. Im Gen vom Typ 3 wurde eine Punktmutation von T nach G bei der 3982sten Base stromabwärts vom zweiten Exon gefunden, wodurch eine neue KpnI-Schnittstelle gebildet wurde. Eine weitere KpnI- Schnittstelle wurde an der 542sten Base stromabwärts von der neuen KpnI-Schnittstelle in allen Genen vom Typ 1, Typ 2 und Typ 3 gefunden. Das Auftreten dieser beiden KpnI- Schnittstellen wurde durch die unterschiedliche Fragmentlänge, die beim KpnI-Verdau gefunden wurde, bestätigt. Während die Gene vom Typ 1 und Typ 2 ein Fragment von ca. 5,3 kb enthalten, enthält das Gen vom Typ 3 ein 4,7- kb-Fragment. In der kodierenden Region des Gens vom Typ 3 gibt es zwei Punktmutationen, die Mutation von G nach A, welches Arginin durch Glutamin ersetzt, unter Verlust einer TaqI-Schnittstelle, und wobei die andere Mutation von C nach T an derselben Position wie im Gen von Typ 2 lokalisiert ist, j edoch ohne Aminosäuresubstitution.
- Die durch weiteres Screenen unter Verwendung der gesamten cDNA als Sonde erhaltenen Ergebnisse bestätigten das Vorliegen eines neuen NAT-Gens vom Typ 4, das unterschiedlich zu den oben erwähnten Genotypen 1, 2 und 3 ist. Im Gen vom Typ 4 gibt es drei Punktmutationen in seiner kodierenden Region. Eines ist die Mutation der 1063sten Base T im NAT-Gen vom Typ 1 gemäß der Erfindung nach C, was eine entsprechende Aminosäuresubstitution von Isoleucin durch Threonin verursacht. Die zweite Mutation ist die der 1203sten Base C im NAT-Gen von Typ 1 nach T ohne Aminosäuresubstitution. Die dritte Mutation ist die der 1525sten Base A im NAT-Gen vom Typ 1 nach G, was Lysin durch Arginin ersetzt. Die Läge von der BamHI-Schnittstelle im ersten Exon vom Typ 4 zur KpnI- Schnittstelle, die stromaufwärts vom zweiten Exon auftritt, wurde als nicht weniger als 15 kb bestätigt.
- Wenn alle oder ein Teil der erfindungsgemäßen Gene verwendet werden, können neue andere polymorphe NAT-Gene isoliert und gereinigt werden. Die erfindungsgemäßen Gene können durch das obige PCR-Verfahren amplifiziert und nachgewiesen werden, und daher kann ein Teil der erfindungsgemäßen Gene wirksame als Prirner zur Genamplifizierung eingesetzt werden. Daher stellt die Erfindung auch die NAT-Gene und Teilfragmente davon als DNA-Sonden oder Prirner für PCR zur Verfügung.
- Ferner können die erfindungsgemäßen NAT-Gene zur Herstellung und Reinigung von NATs auf einfache Weise und in großen Mengen unter Anwendung der sogenannten allgemeinen rekombinanten DNA-Technologie eingesetzt werden [siehe z. B. Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Commun,, 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 5990 (1983); EP-Offenlegungsschrift Nr. 187991). Insbesondere kann die NAT-Produktion durch Gentechnik z. B. durch eine Verfahren durchgeführt werden, welches die Verursachung der Expression des NAT-Gens vom Typ 3 gemäß der Erfindung in geeigneten tierischen Zellen, wie CHO (chinesische Hamsterei)-Zellen umfaßt, und dies kann nach dem Verfahren, welches von dem Verfahren, welches zuvor von den Erfindern berichtet wurde, durchgeführt werden [Ohsako S. und Deguchi T., J. Biol. Chem., 265 (8), 4630-4634 (1990)].
- Die nach dem obigen rekombinanten DNA-technologischen Verfahren erhältlichen NAT-Proteine können auch zur Bestimmung der NAT-Aktivität in verschiedenen Amin-haltigen Arzneimitteln oder Nahrungsmitteln verwendet werden. Die Proteine können ferner bei der Herstellung von Antikörper, die spezifisch gegen NAT-Proteine gerichtet sind, verwendet werden. Bei dieser Antikörperproduktion können gentechnisch manipulierte Komponenten als Antigene verwendet werden, und die Antikörper umfassen polyklonale wie auch monoklonale Antikörper. Epitop-spezifische Antikörper können auch als polyklonale Antikörper gegen NAT-Proteinkomplexe nach dem Verfahren von Weinberger et al. [Science, 228, 740-742 (1985)] z. B. erhalten werden. Die so erhaltenen Antikörper können auch zur Reinigung, Test oder Identifizierung von NAT- Proteinen oder zur Identifizierung eines möglicherweise vorkommenden NAT-Gens oder anderen Genen als den Typ 1, Typ 2, Typ 3 und Typ 4 NAT-Genen verwendet werden.
- Während die obigen NAT-Proteine im wesentlichen die unter SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenzen besitzen, kann die rekombinante DNA- Technologie zu Mutant-Polypeptiden, die hiervon abgeleitet sind, führen, z. B. solchen Polypeptiden, bei denen das N- terminale Methionin der entsprechenden Aminosäuresequenzen deletiert ist, und zu solchen mit zusätzlichen Aminosäuresequenz, z. B. dem gesamten oder einem Teil der Signalpeptidsequenz für die NAT-Gene am N-Terminus, und solche, bei denen ein Teil dieser Aminosäuresequenzen fehlt. Diese Polypeptide können durch post-coding-Modifizierung oder unter Verwendung mutierter Gene hergestellt werden. Die mutierten Gene können synthetisiert werden, z. B. durch ortspezifische Mutagenese von gegen von natürlichem Typ oder durch chemische Synthese, z. B. durch das Phosphotriesterverfahren. Es ist daher festzustellen, daß die erfindungsgemäßen NAT-Gene solche verschiedene Mutantgene, die nach konventionellen Verfahren erhältlich sind, umfassen.
- Im folgenden wird ein Verfahren zum Nachweis polymorpher NAT- DNAs unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gene im Detail beschrieben&sub1; Für das Nachweisverfahren kann das Sourthern- Hybridisierungsverfahren oder dot-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden. Als spezifisches Beispiel davon können das zuvor von den Erfindern berichtete Verfahren [Deguchi T. et al., J. Biol. Chem., 265, (22) 12757-12760 (1990)] wirksam eingesetzt werden. Insbesondere wird dieser NAT-DNA- Polymorphismusnachweis oder die Bestimmung des humanen Acetylator-Phenotyps unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gene durch das PCR-RFLP (PCR-Restriktionsfragment- Polymorphismusanalyse)-Verfahren, der PCR-Einzelstang höherer Ordnung Strukturpolymorphismus-Analyseverfahren [Orita M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766 (1989)], dem PCR-SSO (PCR-spezifisches Sequenz-Oligonukleotid-)-Verfahren oder dem Allel-spezifischen Oligomerverfahren (ASO) [Saiki R. et al., Nature, 324, 163-166 (1986)], beruhend auf den PCR- SSO- und Dot-Hybridisierungstechniken, durchgeführt werden.
- Wenn die Probe humanes Blut oder Haar ist, wird das obige PCR-RFLP-Verfahren wie folgt durchgeführt. Bei einer Human- Blutprobe werden z. B. Zellen mit Zellkern aus der Human- Blutprobe nach einem üblichen Verfahren gesammelt und nach der Phenolbehandlung wird DNA extrahiert. Zunächst werden ein 5'-Primer und ein 3'-Primer so synthetisiert, daß das durch PCR zu amplifizierende DNA-Fragment eine Länge von 100 bp bis 500 bp einschließlich der beabsichtigten Restriktionsschnittstelle hat. Dann werden die extrahierte DNA-Probe, ein PCR-Reaktionspuffer, eine Lösungsmischung der vier Deoxynukleotide, die synthetischen 5'-Primer und 3'- Primer und die Taq-Polymerase vermischt, die Mischung wird verteilt, eine Mineralölschicht wird darübergelegt und PCR wird durchgeführt. Die PCR wird durch Unterziehen der obigen Reaktionsmischung einem Zyklus von Erhitzen bei 94ºC für 3 Minuten, bei 54ºC für 2 Minuten und dann bei 72ºC für 3 Minuten, dann 29 Zyklen aus Erhitzen bei 94ºC für 1 Minute, bei 54ºC für 2 Minuten und bei 72ºC für 3 Minuten und schließlich Erhitzen bei 72ºC für 10 Minuten unter Erhalt der DNA-Amplifizierung unterworfen.
- Anschließend wird das Mineralöl aus der obigen Reaktionsmischung entfernt, und die Mischung wird auf einem 3%igen Agarosegel elektrophoretisiert. Die Bandenindentifikation beruht auf der Färbung mit dem oben erwähnten Ethidiumbromid.
- Ferner werden eine Restriktionsendonuklease oder -endonukleasen, die zur Erkennung der beabsichtigten Restriktionsschnittstelle oder -stellen in der Lage sind, zur Amplifizierungsreaktionsmischung zugegeben, dann erfolgt Verdau über Nacht bei 37ºC, und es erfolgt eine 3%ige Agarosegelelektrophorese auf die gleiche Weise wie oben, worauf eine Bandenidentifizierung durch Ethidiumbromidfärbung folgt.
- Der Genotyp der chromosomalen DNA kann basierend auf das auf obige Weise erhaltene Bandenmuster bestimmt werden. Basierend auf diesem Muster, können die folgenden Phenotypen unterschieden werden: der rasche Typ, umfassend Genotyp 1 und Genotyp 1, der mittlere Typ, umfassend Genotyp 1 und Genotyp 2, der mittlere Typ, umfassen Genotyp 1 und Genotyp 3, der langsame Typ, umfassend Genotyp 2 und Genotyp 2, der langsame Typ, umfassen Genotyp 2 und Genotyp 2 und der langsame Typ, umfassend Genotyp 3 und Genotyp 3. Wenn das PCR-RFLP- Verfahren verwendet wird, kann der NAT-Gen- Polymerphismusnachweis auf einfache und simple Weise innerhalb eines kurzen Zeitraums durchgeführt werden, ohne daß radioaktive Substanz oder irgendwelche verschiedene markierte, typspezifische Oligonukleotidsonden verwendet werden.
- Unter Verwendung des erfindungsgemäßen PCR-RFLP-Verfahrens ist es möglich, einen polymorphen NAT-Gennachweis und Phenotypbeurteilung unter Verwendung einer Körperflüssigkeit eines Säugers, wie z. B. einem Menschen, als Probe, z. B. einer Blutprobe, einer Markflüssigkeit, Sperma, Flüssigkeit aus der Peritonealhöhle oder Urin oder Gewebezellen wie Leberzellen oder Körperhaar wie z. B. Kopfhaar durchzuführen.
- Die Verwendung der durch die Erfindung zur Verfügung gestellten NAT-Gene ermöglicht dem polymorphen NAT- Gennachweis auf einfacher und raschere Weise mit kleineren DNA-Mengen als Vergleich mit dem polymorphen NAT-Gennachweise nach dem früheren RFLP-Verfahren. Ferner kann ein Kit für den polymorphen NAT-Gennachweis zur Verfügung gestellt werden. Durch den polymorphen NAT-Gennachweis ist es möglich die Ausbildung eines Nebeneffekts oder Nebenwirkungen durch Aminhaltige aromatische Substanzen zu diagnostizieren oder vorherzusagen und/oder die Ursachen der Nebenwirkung oder Wirkungen u. a. zu untersuchen.
- Ein besonders bequernes Verfahren zur erfindungsgemäßen Durchführung verwendet ein Kit für den NAT-Gennachweis. Es ist wichtig, daß das Kit zwei Reaktionslösungen für PCR für die Stelle Ol und die Stelle 02, wie später in dem Beispielteil erwähnt, umfaßt. Die Lösungen enthalten einen 5'-Primer und einen 3'-Primer für die 01- und 02-Stelle. Die PCR-Reaktionslösungen selbst können bekannte sein. Als typische Bespiele für PCR-Reaktionslösungen für das obige KIT gemäß der Erfindung können PCR-Reaktionslösungen für den 01- und 02-Schnittstelle erwähnt werden, die jeweils 100 µl eines Reaktionssystems aus jeweils 1 µM von jeweils einem 5'-Primer und einem 3'-Primer für die 01- und die 02-Schnittstelle, 0,2 mM dATP, 0,2 InM DCTP, 0,2 mM DGTP, 0,2 mM DTTP, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 1 mg/ml Gelatine und 25 E/ml Taq-Polymerase zur Anwendung pro 0,5 µg Proben-DNA enthalten.
- Als weiteres Beispiel kann ein Kit für den polymorphen NAT- Gennachweis erwähnt werden, welches eine Lösungsmischung umfaßt, die die Restriktionsenzyme TaqI, BamHI und KpnI (jeweils 15 Einheiten) zur Verwendung pro 10 µl obiger Amplifikationsrekationsmischung enthält. Daher kann das gesamte Kit z. B. ein Kit I für die Stelle Ol PCR, Kit II für die Stelle 02 PCR und eine Restriktionsenzym-Mischungslösung wie oben erwähnt enthalten.
- Die folgenden Beispiele und Referenzbeispiele bedeuten die Erfindung in weiteren Einzelheiten, sollen jedoch nicht für den Umfang der Erfindung beschränkend sein.
- In den Beispielen wird auf die anliegenden Zeichnungen Bezug genommen, worin
- Fig&sub1; 1 die Restriktionsenzymkarte einer NAT-Gensonde zeigt;
- Fig. 2 zeigt die Restriktionsenzymkarten verschiedener NAT- Gentypen wie durch Restriktionsenzymanalyse genomischer DNAs für humanes NAT gezeigt;
- Fig. 3 zeigt die Bandenmuster bei der Southern- Hybridisierung für Genotypbestimmung durch RFLP;
- Fig. 4 zeigt die 01-Schnittstellen-Amplifikationsregion in der kodierenden Region des NAT-Gens und Primer für die Schnittstelle Ol;
- Fig. 5 zeigt die Schnittstellen-02-Amplifikationsregion in der kodierenden Region des NAT-Gens und Primer für die Schnittstelle 02;
- Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen dem Elektrophoresemuster im PCR-RFLP und dem Genpolymorphismus /Acetylatorphenotyp;
- Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Amplifikation der Schnittstelle-01- und Schnittstelle-02-DNA-Fragmente durch PCR, wie in Beispiel 2 durchgeführt;
- Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der PCR-RFLP-Analyse der Schnittstelle 02 und Schnittstelle 02, wie in Beispiel 2 durchgeführt;
- Fig. 9 zeigt die Ergebnisse der Amplifikation der Schnittstelle-01- und Schnittstelle-02-DNA-Fragmente durch PCR, wie im Beispiel 3 durchgeführt; und
- Fig. 10 zeigt die Ergebnisse der PCR-RFLP-Analyse der Schnittstelle Ol und der Schnittstelle 02, wie in Beispiel 3 durchgeführt.
- Die BamHI-EcoRI-Schnittstelle der 3'-kodierenden Region vom NAT-Gen vom Typ 1 [siehe Ohsako s. und Deguchi T., J. Biol. Chem., 265 (15), 4630-4634 (1990); Deguchi T. et al., J. Biol. Chem., 265 (22), 12757-12760 (1990)] wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamIII (Takara Shuzo) und EcoRI (Takara Shuzo) verdaut, und es wurde ein DNA-Fragment von ca. 308 Basenpaaren erhalten.
- Die cDNA mit gesamter Länge, wie oben erwähnt, wurde ebenfalls als Sonde verwendet. Während die Verwendung des obigen BamHI-EcoRI-Fragments beim polymorphen NAT-Gennachweis nützlich ist, kann die cDNA mit der gesamten Länge, bei Verwendung als Sonde, nicht nur polymorphe NAT-Gene sondern auch monomorphe NAT-Gene nachweisen.
- Zur Verwendung als Sonde wurde das obige BamHI-EcoRI-Fragment unter Verwendung von α-[³²P]-DCTP nach dem Multiprime-DNA- Markierungssystem (Amersham) markiert, bei dem das Multiprime-DNA-Markierungsverfahren [Feinberg A. P. et al., Anal. Biochem., 137, 266-267 (1984)] eingesetzt wird.
- Die spezifische Aktivität der Sonde war 5 bis 10 x 10&sup8; cpm/µg.
- Die Restriktionsenzymkarte der Sonde ist in Fig. 1 gezeigt.
- Ein Anteil von 1 bis 5 g von Humanlebern, die bei einer Autopsie erhalten wurde, wurde in ein Pulver durch Behandlung mit einem Whirlmixer in Gegenwart von flüssigem Stickstoff umgewandelt und dann nach Zugabe von 10 bis 40 ml einer zuvor eisgekühlten cytolytischen Lösung [0,32 M Saccharose, 1 % (V/V) Triton X-100, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5)] homogenisiert. Der Kernanteil wurde durch Zentrifugation (2500 Upm, 4ºC, 20 Minuten) abgetrennt, es wurden 5 ml einer Extraktlösung (10 mM Tris-Hydrochlorid, 0,1 M EDTA, 20 µg/ml RNase, 0,5 % SDS, pH 8,0) zugegeben und die Mischung wurde bei 37ºC 1 Stunde inkubiert. Die Proteinase K wurde zu der Mischung in einer Konzentration von 100 µg/ml zugegeben, und der Proteinverdau erfolgte bei 50ºC für 3 Stunden. Dann wurde nach Phenol-Chloroform-Extraktion die Präzipitation mit Ethanol durchgeführt und das erhaltene Präzipitat wurde in TE-Puffer gelöst.
- Ca. 100 µg der auf obige Weise erhaltenen DNA wurde teilweise mit der Restriktionsendonuklease Sau3AI verdaut, und nach zweimaligen Extraktionen mit Phenol-Chloroform (1:1) erfolgte eine Ethanolpräzipitation. Das Präzipitat wurde in 200 µl TE- Puffer (10 mM Tris-Hydrochlorid, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst. Saccharose wurde in 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8,0), das 10 mM NaCl und 1 mM EDTA enthielt, unter Herstellung eines 10- bis 40%igen Saccharose-Dichtegradienten in einem Beckman- SW40-Polyallometer-Zentrifugenröhrchen gelöst. Der teilweise Verdau der wie oben beschrieben extrahierten DNA wurde auf 68ºC 10 Minuten angewärmt, dann auf 20ºC gekühlt und sorgfältig über den Saccharose-Dichtegradienten beschichtet. Der Inhalt des Zentrifugenröhrchens wurde bei 22000 Upm und 20ºC 22 Stunden unter Verwendung eines Beckman-SW40-Rotors (Beckman Ultrazentrifuge L8M-65) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Boden des Zentrifugenröhrchens mit einer Injektionsnadel mit einer Weite von Gauge 19 aufgestochen und der Röhrcheninhalt wurde fraktioniert in ca. 350-µl-Portionen, beginnend von der untersten Schicht unter Verwendung eines peristaltischen Pumpe, abgezogen. Ein 5-µl- Anteil einer jeder der so erhaltenen Fraktion wurde auf eine 0,5 % Agarosegelelektrophorese für die Bestätigung der DNA- Größe elektrophoretisiert. Fraktionen zu ca. 20 kb wurden gesammelt und einer Ethanolpräzipitation unterworfen, und das Präzipitat wurde im TE-Puffer aufgelöst.
- Es wurde EMBL3 als Vektor zur oben erhaltenen teilweise verdauten genomischen DNA-Fragmentfraktion zugegeben und die Mischung wurde bei 15ºC über Nacht mit T4-DNA-Ligase inkubiert. Die so hergestellten rekombinanten DNAs ließ in Phagenpartikeln durch in vitro-Verpackung aufnehmen, dann ließ man die Phagenpartikel auf Escherichia coli LE 392- Zellen absorbieren, die Zellen wurden zusammen mit einem Top- Agar-Medium auf einer Platte ausgesät und der Titer wurde bestimmt.
- Auf obige Weise kann eine human-genomische DNA-Bank, die die erwünschte DNA enthält und mindestens 1,5 bis 3 x 10&sup6; Plaques umfaßt, konstruiert werden.
- Das Screenen erfolge mit der Plaque-Hybridisierungstechnik, entwickelt von Benton und Davis [Benton W. und Davis R., Science, 196, 383-394 (1977)] unter Verwendung wie oben in (2) beschrieben erhaltenen EMBL3-genomischen DNA-Bank und der wie oben in (1) hergestellten Sonden zum Screenen, wie folgt.
- Es wurde daher die wie oben in (2) beschrieben hergestellte Bank durch Inkubation der EMBL3-Genom-DNA-Bank und E. coli LE392 bei 37ºC für 20 Minuten unter Verursachung der Phagenadsorption auf den Indikatorstamm LE392 auf einem geschmolzenen LB-Soft-Agar-Medium [1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Natriumchlorid, 1,5 % Bacton-Agar, pH 7,5], das 50 µg/ml Ampicillin in einer Inokulumgröße von ca. 3 x 10&sup5; Zellen pro Kulturplatte enthielt, ausgesät, und bei 37ºC 7 bis 9 Stunden zur Plaquebildung inkubiert. Es wurde eine Gesamtzahl von 10 Kulturplatten verwendet. Dann wurden die Platten auf 4ºC für mindestens 1 Stunde abgekühlt. Ein Nitrozellulosefilter (20 cm x 20 cm; German Science) wurde auf die Agarplattenoberfläche gelegt und nach 10-minütigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Filter abgezogen. Die so behandelten zehn Filter wurden der Reihe nach numeriert und als Masterfilter wiederum derselben Prozedur unterzogen.
- Die obigen Filter wurden auf Filterpapier (Whatman 3 MM; Whatman), das mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl-Lösung imprägniert war, mit ihrer Plaque-haltigen Oberfläche nach oben aufgelegt und man ließ 10 Minuten für die Alkalibehandlung der Phagen-DNAs stehen. Jeder Filter wurde dann auf ein mit 1 M Tris-Hydrochlorid (pH 7,5) und 1,5 M NaCl-Lösung imprägnierten Filterpapier ausgebreitet und man ließ 10 Minuten zur Neutralisation stehen, und ferner wurde es auf einem mit 2 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat (pH 714)] imprägnierten Filterpapier ausgebreitet und man ließ 5 Minuten stehen. Die Filter wurden bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und ferner durch Erhitzen in einem Vakuumtrockner bei 80ºC 2 Stunden zur Fixierung der Phagen-DNAs auf den Filtern getrocknet. Die erhitzten Filter wurden in 2 x SSC eingetaucht, in eine Vorwaschlösung [50 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8,0), 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS] eingetaucht und durch Schütteln bei 42ºC für 1 Stunde zur Entfernung der Kolonien auf den Filtern gewaschen.
- Anschließend wurden die Filter in einer Vorhydridisierungslsung [5 x SSC, 30 % Formamid, 50 InM Natriumphosphat (pH 7,4), 5 x Denhardt's Lösung {2 x Denhardt's = 0,02 % Rinderserumalburnin, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon}, 0,1 % SDS, 100 µg/ml thermisch denaturiertes Lachssperma-DNA] bei 42ºC 1 Stunde zur Vorhybridisierung geschüttelt. Die Lösung wurde dann weggeworfen und wiederum wurden 100 bis 200 ml (10 bis 20 ml pro Filter) der gleichen Vorhybridisierungslösung zugegeben. Dann wurden 10 bis 20 ml pro Filter einer Lösung mit der NAT- cDNA-Sonden mit gesamter Länge, wie oben unter (1) beschrieben, erhalten, durch Markierung mit α-[³²P]-DCTP mit einer Radioaktivitätsmenge von 5 bis 10 x 10&sup5; cpm/ml zugegeben, und die Hybridisierung erfolgte bei 42ºC für 24 Stunden. Nach Abschluß der Hybridisierung wurden die Filter herausgenommen und bei Raumtemperatur 30 Minuten unter Verwendung von 2x SSC und 0,1 % SDS-Lösung gewaschen. Nach zweimaliger Wiederholung der Waschungen auf diese Weise wurden die Filter zweimal in 0,5 x SSC und zweimal in 0,1 % SDS jeweils bei 56ºC für 30 Minuten gewaschen und dann an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet. Die luftgetrockneten Filter wurden auf ein Filterpapier befestigt und nach Markierung mit [³²P]-haltiger Tinte in eine Kassette, zusammen mit einem Röntgenstrahlfilm [Kodak XAR5; Kodak] und einem sensitiven Papierblatt, gestellt, worauf Belichtung über Nacht bei -70ºC erfolgte. Nach Entwicklungs- und Fixierungsbehandlung des Films wurde nach Signalen, welche ein überlapp zwischen beiden Filtern zeigte und eine Vielzahl von Plaques entsprechend dem Orten, bei denen solche Signale gefunden wurden, zusammen mit dem Top-Agar-Medium abgekratzt, in SM-Puffer suspendiert [50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;, 100 mM NaCl, 0,01 % Gelatine] verdünnt, dieses Mal in einem solchen Ausmaß, daß kein Überlappen miteinander auftrat, und auf Nitrozellulosefilter ausgesät. Die Filter wurden einer Rehydridisierung zum Sekundärscreenen unterzogen, und reine Phagenklone wurden isoliert.
- 24 positive Klone wurden aus ca. 3 x 10&sup6; Klonen auf obige Weise erhalten. Sie wurden einem Sekundärscreenen unterzogen, und aus den so erhaltenen positiven Klonen wurden drei Klone entsprechend dem NAT-Genotypen 1, 2 und 3 selektiert. Die selektierten Klone wurden jeweils einer Agarosegelelektrophorese zur Isolierung und Reinigung unterzogen. Die rekombinanten Phagenklone, die aus der EMPBL3-Genom-DNA-Bank erhalten wurden, und entsprechend die transkriptionalen Regionen der NAT-Gene von den Typen 1 bis 3 enthielt, wurden als "λhNAT1", "λhNAT2" und "λhNAT3" bezeichnet.
- Die Klone λhNAT1, λhNAT2 und λhNAT3 enthalten die transkriptionalen Regionen des Genotyps 1, Genotyps 2 und Genotyps 3 als Inserts. Besagte Regionen enthalten ein Exon, umfassend die 5'-nicht-kodierende Region von ca. 7000 bp stromaufwärts von der kodierenden Region, und die 3'-nichtkodierende Region und die kodierende Region sind im zweiten Exon enthalten.
- Die DNAs von λhNAT1 bis λhNAT3 wurden jeweils mit der Restriktionsendonuklease EcoRI (Takara Shuzo) unter Erhalt eines DNA-Fragments von ca. 1,3 kb in der Größe verdaut. Hiervon getrennt wurde Plasmidvektor pUC18 (Takara Shuzo) mit derselben Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut. Beide Fragmente wurden miteinander mittels eines Ligationskits (Takara Shuzo) unter T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) verbunden, und die erhaltenen Plasmid phNAT1 bis phNAT3 wurden entsprechend für die Transduktion kompetenter E. coli HB101- Zellen (Amersham) verwendet.
- Die Gen-GNA aus jedem der Klone λhNAT1, λhNat2 und λhNAT3 wurde an spezifischen Stellen mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen unter Erhalt von Fragmenten von ca. 0,3 bis 0,7 kb gespalten. Diese Fragmente wurden in den Klonierungsvektor pUC18 (Takara Shuzo) zur Subklonierung insertiert, und die Basensequenz einer jeden DNA-Region wurde unter Verwendung eines T7-Sequenzierungskits (Pharmacia) nach dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren [Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)] unter Verwendung von [³²P]-dCTP bestimmt.
- Die Gensequenzen, deren Basensequenzen bestimmt wurden, enthielten 9232 bp, 2768 bp, die in der 5'-nicht-kodierenden Region der NAT-Gene vom Typ 1, Typ 2 und Typ 3 enthalten waren und 6464 bp, die in der kodierenden Region und der 3'- nicht-kodierenden Region der NAT-Gene vom Typ 1, Typ 2 und Typ 3 enthalten waren.
- Die Basensequenzen und Aminosäuresequenzen, die hiervon ableitbar sind, sind in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7 bis SEQ ID Nr. 9 gezeigt.
- Wie in der Sequenzliste dargestellt, wurden die folgenden Erkenntnisse gewonnen: Das humane NAT-Gen vom Typ 1 umfaßt die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1, eine 6,4-kb-5'-Region, deren Basensequenz nicht bestimmt wurde, und die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2, mit einer Gesamtzahl von 1321 Basen einschließlich der 5'-nicht-kodierenden Region, der kodierenden Region und der 3'-nicht-kodierenden Region. Die kodierende Region hat eine Länge von 870 Basen, entsprechend einem Protein aus 290 Aminosäureresten. Basierend auf dieser abgeleiteten Sequenz wurde das Molekulargewicht zu 33541 berechnet.
- Das humane TAT-Gen umfaßt die DNA-Sequenz des SEQ ID Nr. 3, ein 6,4-kg-5'-Enderegion, deren Sequenz noch bestimmt wurde, und die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 4, mit einer Gesamtzahl von 1321 Basen einschließlich der 5'-nicht-kodierenden Region, der kodierenden Region und der 3'-nicht-kodierenden Region. Die kodierende Region hat eine Länge von 870 Basen, entsprechend einem Protein aus 290 Aminosäureresten. Beruhend auf dieser abgeleiteten Sequenz wurde das Molekulargewicht zu 33613 berechnet.
- Das humane NAT-Gen vorn Typ 3 umfaßt die DNA der SEQ ID Nr. 5, eine 6,4-kb-5'-Enderegion, deren Sequenz nicht bestimmt wurde, und die DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 6, mit einer Gesamtzahl von 1321 Basen einschließlich der 5'-nicht- kodierenden Region, der kodierenden Region und der 3'-nicht- kodierenden Region. Die kodierende Region hat eine Länge von 870 Basen, entsprechend einem Protein aus 290 Aminosäureresten. Beruhend auf dieser abgeleiteten Sequenz wurde das Molekulargewicht zu 33513 berechnet.
- Unter den obigen Sequenzen sind die kodierenden Regionen der NAT-Gene vom Typ 1 und Typ 2 im Stand der Technik bereits bekannt [Ohsaka 5. und Deguchi T. et al., J. Biol. Chem., 265 (8), 4630-4634 (1990)].
- So weit wie die obigen 9232 Basen betroffen sind, ist die Homologie zwischen dem NAT-Gen vom Typ 1 und NAT-Gen vom Typ 2 derart, daß Punktmutationen, die 13 Basenpaare betreffen, vorkommen. In der kodierenden Region ist die 1004te Base C im NAT-Gen vom Typ 1 und im NAT-Gen vom Typ 2 ist es T. Die 1579te Base ist G im NAT-Gen vom Typ 1, wogegen sie im NAT- Gen vom Typ 2 A ist. Hinsichtlich der entsprechenden Aminosäureveränderungen geht die Basenveränderung an Position 1004 nicht mit einer Aminosäuresubstitution einher, jedoch führt die Basenveränderung an der Position 1579 zu einer Substitution der 286ten Aminosäure verursacht (Glycin im Fall vom NAT-Gen vom Typ 1 und Glutamin im Fall vom NAT-Gen vom Typ 2).
- Für die 9232 Basen ist die Hornologie zwischen dem NAT-Gen vom Typ 1 und dem NAT-Gen vom Typ 3 derart, daß Punktmutationen vorkommen, die 23 Basenpaare betreffen. In der kodierenden Region ist die 1004te Base C im NAT-Gen vom Typ 1, während sie T im NAT-Gen vom Typ 3 ist. Die 1312te Base im NAT-Gen vom Typ 1 ist G und im NAT-Gen vom Typ 3 ist sie A. Hinsichtlich der entsprechenden Aminosäureveränderungen geht die Basenveränderung an Position 1004 nicht mit einer Aminosäuresubstitution einher, wogegen die Basenveränderung an Position 1312 eine Substitution der 197sten Aminosäure verursacht (Arginin im Fall vom NAT-Gen vom Typ 1 und Glutamin im Fall vom NAT-Gen vom Typ 2). Ferner ist die 5918te Base stromabwärts vom zweiten Exon G im NAT-Gen vom Typ 3 im Gegensatz zu T im NAT-Gen vom Typ 1.
- Im Hinblick auf das zuvor Gesagte ist offensichtlich, daß im NAT-Gen vom Typ 1 eine 6-Basensequenz einschließlich der 1597sten Base eine BamHI-Restriktionsschnittstelle bildete und eine 4-Basensequenz einschließlich der 1312ten Base eine TaqI-Restriktionsschnittstelle liefert, wogegen jede Basensequenz einschließlich der 5918ten Base nicht als KpnI- Schnittstelle dient.
- Im Gegensatz hierzu ziehen im NAT-Gen vom Typ 2 eine 4- Basensequenz einschließlich der 1312ten Base als TaqI- Erkennungsstelle, wogegen eine 6-Basensequenz einschließlich der 1579ten Base eine BamHI-Erkennungsstelle bildet. Keine 6- Basensequenz einschließlich der 5918ten Base führt auch nicht zur Bildung einer KpnI-Erkennungsstelle.
- Im NAT-Gen vom Typ 3 bildet eine 6-Basensequenz einschließlich der 1579ten Base eine BamHI-Erkennungsstelle und eine 6-Basensequenz einschließlich der 5918ten Base dient als KpnI-Erkennungsstelle, wogegen keine 4-Basensequenz einschließlich der 1312ten Base als TaqI-Erkennungstelle dient.
- Die humanen Acetylator-Phenotyen wurden nach dem folgenden Test bestimmt. Es wurden gesunde humane freiwillige Probanden eine 12-stündige Ruhe vor und 3 Stunden nach der Wirkstoffaufnahme verordnet. Blindblutproben wurden 9.00 Uhr morgens entnommen und dann wurde eine einzelne Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht Isoniazid (INH) in Pulverform (Daiichi Seiyaku) zusammen mit 150 ml Wasser verabreicht. 1, 2 und 3 Stunden nach Wirkstoffverabreichung wurden Blutproben in heparinisierten Röhrchen gesammelt und sofort einer Zentrifugation (3000 Upm, 10 Minuten) für die Plasmaabtrennung unterworfen. Die Plasma-INH-Spiegel und die Plasma-Acetylisonizid (acetyl-INH)-Spiegel wurden durch HPLC (Hochdruck-Flüssig-Chrornatographie) nach dem Verfahren von Hutching et al. [Hutching A. et al., J. Chromatogr., 277, 385-390 (1983)) bestimmt.
- Acetylator-Phenotypen wurden unterschieden, beruhend auf der Halbwärtszeit von INH und dem Acetyl-INH/INH-Verhältnis bei 3 Stunden, wie durch Plasma-INH-Spiegelanalyse bei 3 Stunden nach Wirkstoffverabreichung, bestimmt. Individuen, die ein Acetyl-INH/INH-Verhältnis von nicht mehr als 0,4 zeigten, wurden als langsame Acetylatoren klassifiziert, Individuen, bei denen das Verhältnis nicht kleiner als 4,4 war, wurden als rasche Acetylatoren, und Individuen, bei denen das Verhältnis zwischen den beiden lag, als mittlere Acetylatoren klassifiziert.
- Die Typen der NAT-Gene wurden durch das Verfahren von Deguchi et al. zur Analyse von Bandenmustern bei der Sourthern- Hybridisierung als Ergebnis von Unterschieden in der Restriktionsschnittstellenverteilung wie folgt [Deguchi T. et al., J. Biol. Chem., 265 (22), 12757-12760 (1990)] bestimmt.
- 8 ml Blut wurde auf jeweils 6 gesunden Probanden in eine antikoagulierende Blut-konservierende Lösung (ACD-A-Lösung) entnommen und unter Erhalt von Leukozyten (100x g, 10 Minuten) zentrifugiert. Die Leukozyten wurden in einem Polypropylenröhrchen überführt und 5 ml mit STE-Puffer [10 ml-Tris-Hydrochlorid, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1000 x g, 10 Minuten) gesammelt und es wurden 4 ml einer Cytolyselösung [10 mM Tris-Hydrochlorid, 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, pH 8,0] zur Suspendierung der Zellen zugegen und nach weiterer Zugabe von 100 µg/ml Proteinase K (Kanto Chemical) erfolgte der Proteinverdau unter Fortschritt über Nacht bei 37ºC. Anschließend wurden 4 ml von mit Tris-Puffer gesättigtem Phenol zugegeben und nach schwachem Rühren wurde die erhaltene Mischung auf die gleiche Weise wie oben zentrifugiert, und die wäßrige Phase wurde abgetrennt. Zu dieser wäßrigen Phase wurden 4 ml einer Mischung aus gleichem Volumen von Phenol und Chloroform zugegeben, worauf schwaches Rühren folgte. Die erhaltene Mischung wurde auf die gleiche Weise zentrifugiert, und die wäßrige Phase wurde abgetrennt. Ferner wurden 4 ml Chloroform zu dieser wäßrigen Phase zugegeben, und die Mischung wurde schwach gerührt und dann auf die gleiche Weise zentrifugiert und die wäßrige Phase wurde abgetrennt. Zu dieser wäßrigen Phase wurden 0,4 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 8 ml Ethanol zugegeben, worauf heftiges Rühren folgte.
- Man ließ die Mischung bei -80ºC 1 Stunde stehen und zentrifugierte dann (2500 x g, 30 Minuten) und die Sediment- DNA wurde gewonnen. Das Sediment wurde mit 80 % Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in 0,3 ml TE-Puffer gelöst. Ca. 300 µg DNA konnten aus jeder Blutprobe nach dem obigen Verfahren gewonnen werden.
- Zu 8 µg einer jeden so erhaltenen DNA wurden 50 Einheiten eines jeden Restriktionsendonulease entweder allein oder in Kombination, nämlich KpnI, KpnI + BamHI, EcoRI oder EcoRI + BamHI (jeweils erhalten von Takara Shuzo) zugegen und man ließ den enzymatischen Verdau über Nacht bei 37ºC fortschreiten. Die Reaktionsmischung wurde auf einem 0,8%igen Argarosegel bei 25 Volt 16 Stunden elektrophoretisiert. Nach der Elektrophorese wurden die Banden auf ein Hybond N&spplus;- Nylonfilter (Amersham) transferiert. Dieser Filter wurde in einen Plastikbeutel gelegt, es wurde eine Vorhybridisierungslösung [6 x SSPE, 5 X Denhardt's, 0,5 % SDS, 100 µg/ml thermisch denaturierte Lachssperma-DNA] zugegen, und die Vorhybridisierung erfolgte bei 65ºC für 2 Stunden. Die Zusammensetzungen der oben erwähnten 6 x SSPE und 5 x Denhardt's sind wie folgt:
- 6 x SSPE = 0,9 M NaCl, 60 mM Natriumphosphat, 6 mM EDTA, pH 7,4;
- 5 x Denhardt's = 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalburnin.
- Dann wurde ein 308-Basenpaarfragment, welches die 3'-nichtkodierende Region, enthaltend die BamHI-EcoRI-Region, wie vom NAT-Gen-cDNA vom Typ 1 abgeleitet, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1-(1) erhalten. Eine Sonde wurde hieraus hergestellt durch Markieren mit [³²P] unter Verwendung eines Multiprime-DNA-Markierungssystems.
- Die markierte cDNA-Sonde (spezifische Aktivität: 1 x 10&sup8; cpm/µg) wurde zu einer Vorhybridisierungsmischung in einer Konzentration von 10&sup6; cpm/ml gegeben, und man inkubierte die Mischung über Nacht bei 65ºC. Nach Inkubation wurde die Nylonmembran aus dem Beutel genommen und zweimal bei Raumtemperatur 5 Minuten mit 2 x SSPE [0,1 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, 2 mM EDTA, pH 7,4], enthaltend 0,5 % SDS, gewaschen, weitere 2 Stunden bei 65º0 mit 1 x SSPE (pH 7,4), enthaltend 0,5 % SDS, gewaschen und wieder bei 65º0 10 Minuten mit 2 x SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, gewaschen.
- Anschließend nach 5-minütigem Waschen bei Raumtemperatur mit 2 x SSPE wurde die Membran an der Luft getrocknet und dann einer Autoradiographie (-80ºC, 6 Tage) zur Belichtung eines Röntgenstrahlfilms unterworfen.
- Die Ergebnisse, die auf diese Weise erhalten wurden, sind in Fig. 3 gezeigt.
- Unter Bezugnahme auf die humanen NATs enthält das NAT-Gen vom Typ 1 die Basensequenz GGATCC, wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. BamHI erkennt die Basensequenz GGATCC, die an den Positionen 1578 bis 1583 auftritt, und spaltet die chromosomale DNA an dieser Stelle. KpnI erkennt nicht die Basensequenz GTTACC, die an den Positionen 5917 bis 5922 in der anschließenden Basissequenz des Gens, wie unter SEQ ID Nr. 2 gezeigt, auftritt, und daher kann die chromosomale DNA nicht an dieser Stelle mit KpnI gespalten werden. Demnach wird bei der Southern-Hybridisierung nach KpnI-Verdau das NAT-Gen vom Typ 1 als Bande von 5,3 kb nachgewiesen und nach KpnI + BamHI- Verdau als Bande von 4,9 kb.
- Das NAT-Gen vom Typ 2 enthält die Basensequenz GAATCC, wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigt. Da die Basensequenz nicht erkennbar ist, wird sie nicht mit BamHI gespalten. Die Sequenz GTTACC wird auch nicht mit KpnI gespalten. Daher wird dieser Typ 2 als Bande von 5,3 kb bei der Southern-Hybridisierung nach KpnI-Verdau wie auch nach der Southern-Hybridisierung nach KpnI + BamHI-Verdau nachgewiesen.
- Das NAT-Gen vom Typ 3 enthält die Basensequenz GGATCC, wie in SEQ ID Nr. 6 gezeigt, und diese Sequenz ist mit BamHI spaltbar. Dieser Typ enthält ebenfalls die Sequenz GGTACC und diese Sequenz ist mit KpnI spaltbar. Daher wird bei der Southern-Hybridisierung nach KpnI-Verdau dieser Typ als Bande von 4,7 kb nachgewiesen, und bei der Southern-Hybridisierung nach KpnI + BamHI-Verdau als Bande von 4,3 kb.
- Auf Grundlage der oben erwähnten Bandenmuster kann der Polymorphismus des humanen NAT-Gens 6 Typen umfassen, wie in er folgenden Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
- Auf Grundlage der Typisierungsgruppen, wie in Tabelle 1 gezeigt und der in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse, wurden die Ergebnisse für die gesunden Probanden, die für den vorliegenden Test eingesetzt wurden, welcher nach dem Testverfahren von Referenzbeispiel 1, wie oben erwähnt, durchgeführt wurde, wie auch die Ergebnisse der obigen RFLP- Analyse, wie in Tabelle 2 gezeigt zusammengefaßt.
- Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden zwei Probanden als rasche Acetylatoren vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 1 ermittelt, einer wurde als mittlerer Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 2 und drei als mittlere Acetylatoren vom NAT-Gen-Typ 1/NAT- Gen-Typ 3 ermittelt.
- Das folgende Verfahren wurde unter Verwendung von DNA-Proben aus 6 gesunden Probanden auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 2 verwendet. Nach Phenolextraktion, wie im Referenzbeispiel 2, wurde ein 0,5-µg-Anteil einer jeden DNA als Probe für PCR verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Amplifikatorsystems durchgeführt (Perkin Elmer Cetus) unter Anwendung des Verfahrens von Saiki et al. [Saiki R. et al., Science, 239, 487-491 (1988)] wie folgt.
- Zunächst wurde ein 117-bp-Segment einschließlich der TaqI- Restriktionsschnittstelle wie in der kodierenden Region von jedem NAT-Gen gefunden, als kodierende Regionsschnittstelle Ol bezeichnet, und ein 393-bp-Segment einschließlich der BamHI-Schnittstelle in der kodierenden Region als kodierende Regionsschnittstelle 02. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1-(1) wurden zwei 5'-Primer und zwei 3'-Primer für PCR für die Stelle Ol und die Stelle 02 aus vier β- Cyanoetyhlphosphoamiditderivaten unter Verwendung des Festphasenverfahrens unter Einsatz des automatisierten DNA- Synthesators [Gene Assembler Plus (Pharmacia)] synthetisiert. Für die Synthese dieser Oligonukleotidprimer wurde das Verfahren von Sinha et al. [Nucl. Acids Res., 5, 397 (1987)] angewandt.
- Die so synthetisierten Oligonukleotide wurden jeweils auf 55ºC in konzentriertern wäßrigem Ammoniak zur Schutzgruppenentfernung und Oligonukleotidfreisetzung aus dem festen Träger erwärmt. Die so hergestellten synthetischen Oligonukleotide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und die erwünschten Oligonukleotide wurden als 5'-Primer oder 3'- Primer erhalten. Die so erhaltenen gereinigten Oligonukleotide wurden jeweils in TE-Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert.
- Die synthetisierten Primer für die 01-Stelle sind in Fig. 4 gezeigt und die für die 02-Stelle in Fig. 5.
- In Fig. 4 bedeutet die Beschriftung "117 bp" die Amplifikationsregion der Stelle 01 in der kodierenden Region des NAT-Gens, und "TCGA" bedeutet die Stelle, bei der die 117-bp-Region in zwei Fragmente (63 bp und 54 bp) durch die Restriktionsendonuklease Taqi gespalten wirdo Der 5'-Primer ist ein 20-mer-Primer, umfassend die 12485te und die 1267ste Base [Stelle 01; 5'-Primer (1248 bis 1267)], wogegen der 3'- Prirner ein 20-mer-Primer, umfassend die 1345ste Base bis 1364ste Base ist [Stelle 02; 3'-Primer (1234 bis 1364)].
- In Fig. 5 bedeutet die Beschriftung "393 bp" die Amplifikationsregion der Stelle 02 in der kodierenden Region des NAT-Gens, und "TCGA" bedeutet die Stelle, bei der die 393-bp-Region in zwei Fragmente (114 bp und 279 bp) durch die Restriktionsendonuklease BamIII gespalten wird. Der 5'-Primer ist ein 20-mer-Primer, umfassend die 1465ste bis 1484ste Base [Schnittstelle 01; 5'-Primer (1465 bis 1484)], und der 3'- Primer ein 20-mer-Primer, umfassend die 1838ste bis 1857ste Base [Stelle 02; 3'-Primer (1838 bis 1857)].
- Es ist daher möglich, den fraglichen Genpolymorphismus durch Amplifikation nach dem PCR-Verfahren der beiden Regionen zu untersuchen, die jeweils eine Restriktionsendonukleasenschnittstelle besitzen, die kennzeichnend für den Genpolymorphismus ist, die in der kodierenden Region einer jeden der drei NAT-Gene liegt, Unterwerfen dieser amplifizierten DNA-Fragmente einer Restriktionsendonukleaseverdau und Beurteilung auf Grundlage der Kombination der Elektrophoresemuster für die Stelle 01 und Stelle 02.
- Die Beziehung zwischen den Elektrophoresemustern bei der PCR- RFLP und dem Genpolymorphismus ist in Fig. 6 erläutert. In der Figur bedeutet "Gen 1" den Typ 1, "Gen 2" den Typ 2 und "Gen 3" den Typ 3 und "RASCH", "LANGSAM" und "MITTEL", jeweils in Klammern und als Kombination der Typen, bedeutet einen raschen Acetylator, einen langsamen Acetylator und einen mittleren Acetylator.
- Daher zeigen beim NAT-Gen vom Typ 1 die Elektrophoresemuster für die DNA-Fragmente aus der Amplifizierung mittels der Prirner für die PCR-RFLP und die Restriktionsenzymspaltung zwei nachweisbare Banden entsprechend 63 bp und 54 bp für die 01-Stelle (da die Restriktionsendonuklease TaqI die Basensequenz TCGA in dem amplifizierten DNA-Fragment der Stelle 01 erkennt und spaltet) und zwei erkennbare Banden entsprechen 279 bp und 114 bp für die Stelle 02 (da BamHI GGATCC erkennt und spaltet).
- Beim NAT-Gen vom Typ 2 werden das DNA-Fragment, das an der Stelle 01 amplifiziert ist, mit TaqI gespalten, wodurch zwei Banden entsprechend 63 bp und 54 bp nachgewiesen werdenl Jedoch wird in der Stelle 02 die Basensequenz GAATCC nicht mit BamHI gespalten, und daher wird das amplifizierte 393-bp- DNA-Fragment als solches nachgewiesen.
- Ferner wird beim NAT-Gen vom Typ 3 die Sequenz AATC im amplifizierten DNA-Fragment der Stelle 01 nicht mit TaqI gespalten, daher wird das amplifizierte 117-bp-DNA-Fragment als solches nachgewiesenl Hinsichtlich der Stelle 02 erkennt und spaltet andererseits BamHI GGATCC, was zu zwei nachweisbaren Banden entsprechend 279 bp und 114 bp führt.
- Aufgrund der obigen Fakten kann jede Kombination polymorpher NAT-Gene auf Grundlage der Elektrophoresemuster für die Stelle 01 und Stelle 02, wie in Fig. 6 erläutert, nachgewiesen werden.
- Ein 0,5-µg-Anteil einer jeden in Beispiel 2-(1) erhaltenen DNA wurde zu 100 µl eines Reaktionssystems gegeben, worauf weitere Zugabe eines Paars von Primer für die Stelle 01 oder die Stelle 02) (jeweils 1 µm) zusammen mit dATP (0,2 mM), dCTP (0,2 mM), dGTP (0,2 mM), DTTP (0,2 mM), Tris- Hydrochlorid (10 mM), MgCl&sub2;(1,5 mM), KCl (50 mM), Gelatine (1 mg/ml) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (alle von Perkin Emler Cetus erhalten) folgte. Nachdem 100 µl Mineralöl auf die obige Mischung geschichtet wurden, wurden jedes DNA- Fragment der Stelle 01 und Stelle 02 durch einen Behandlungszyklus bei 94ºC für 3 Minuten, bei 54ºC für 2 Minuten und 72ºC für 3 Minuten und dann 29 Behandlungszyklen bei 94ºC fur 1 Minute, bei 54ºC für 2 Minuten und 72ºC für 3 Minuten und schließlich 10 Minuten bei einer Behandlung von 72ºC unterworfen.
- Das Mineralöl wurde sorgfältig von der auf obige Weise erhaltenen Reaktionsmischung entfernt, ein 5-µl-Anteil der übrigen Reaktionsmischung wurde entnommen und auf 3 % Agarosegel mit Mspi-verdauten pUC19 -DNA-Fragmenten (pUC19/MspI) als Marker elektrophoretisiert, worauf Ethidiumbrornidfärbung zur Bandenidentif ikation folgte4
- Die Ergebnisse der Stelle 01 und Stelle 02 DNA-Fragmente durch PCR sind in Fig. 7 gezeigt.
- In der Figur bedeutet Bahn 1 die pUC19/MspI-Marker, Bahn 2 Probe Nr. 1, Bahn 3 Probe Nr. 2, Bahn 4 Probe Nr. 3, Bahn 5 Probe Nr. 4, Bahn 6 Probe Nr. 5 und Bahn 7 Probe Nr. 6.
- Wie aus der Figur hervorgeht, wurde eine 117-bp-Bande und eine 393-bp-Bande für die Stelle 01 und Stelle 02 bei allen Proben nachgewiesen. Daher wurden 10 µl einer jeden Amplifikationsreaktionsmischung mit 15 Einheiten von jeweils TaqI und BamHI über Nacht bei 37ºC verdaut und dann auf 3 % Agarosegel elektrophoretisiert worauf Ethidiumbromidfärbung zum Bandennachweis, wie oben erwähnt, folgte.
- Die Ergebnisse der PCR-RFLP-Analyse sind in Fig. 8 gezeigt.
- In der Figur bedeutet Bahn 1 die pUC19/MspI-Marker, Bahn 2 Probe Nr. 1 vor Verdau, Bahn 3 Probe Nr. 1 nach Verdau, Bahn 4 Probe Nr. 2 vor Verdau, Bahn 5 Probe Nr. 2 nach Verdau, Bahn 6 Probe Nr. 3 vor Verdau, Bahn 7 Probe Nr. 3 nach Verdau, Bahn 8 Probe Nr. 4 vor Verdau, Bahn 9 Probe Nr. 4 nach Verdau, Bahn 10 Probe Nr. 5 vor Verdau, Bahn 11 Probe Nr. 5 nach Verdau, Bahn 12 Probe Nr. 6 vor Verdau und Bahn 13 Probe Nr. 6 nach Verdau.
- Die in Fig. 8 gezeigten Daten weisen darauf hin, daß für die Stelle 01 die Proben Nr. 4 und 6 vollständig verdaut wurden ohne Spuren der ursprünglichen 117-bp-Bande. Daher enthält keine dieser Proben Nr. 4 bis 6 NAT-Gen vom Typ 3. Für die Proben Nr. 1 bis Nr. 3 werden 3 Banden, nämlich die ursprünglich 117-bp-Bande und zwei Banden (63-bp-Bande und 54-bp-Bande) aus dem Verdau beobachtet. Dies bedeutet vermutlich, daß das Chromosom, welches eines der Allele umfaßt, ein NAT-Gen vom Typ 3 enthält, das nicht durch TaqI nachweisbar ist.
- Für die 02-Stelle wurden alle Proben außer Probe Nr. 5 verdaut, welches keine Spur der ursprünglichen 393-bp-Bande zurückließ. Daher vermutet man, daß keine der Proben 1 bis 4 und Probe 6 NAT-Gen vom Typ 2 enthält. für die Probe Nr. 5 werden drei Banden, nämlich die ursprüngliche 393-bp-Bande und die beiden Banden des Verdauungsprodukts (279 bp und 114 bp) beobachtet. Dies bedeutet, daß das Chromosom, das eines der Allele enthält, alle Typen vom NAT-2-Gen umfaßt, welche mit BamHI nicht erkennbar sind.
- Die Phenotypbestimmung, beruhend auf der Kombination der Stellen 01 und Stellen 02, wie oben erwähnt, identifizierte Probe Nr. 1 als einen mittleren Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 3, Probe Nr. 2 als einen mittleren Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 3 und Probe Nr. 3 als einen mittleren Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 3, Probe Nr. 4 als einen raschen Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen- Typ 1, Probe Nr. 5 als einen mittleren Acetylator vom NAT- Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 2 und Probe Nr. 6 als einen raschen Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 1. Diese Ergebnisse stimmen mit denen der vorhergehenden RFLP-Analyse überein.
- Die Verwendung der PCR-Techniken ermöglicht es, Proben in Spurenmengen zu analysieren. Daher wurde diese Möglichkeit untersucht unter Verwendung von Haarproben, die in einen unbeeinträchtigten Zustand gesammelt werden. Die DNA- Extraktion aus Haarproben erfolgte im wesentlichen nach dem Verfahren von Higuchi et al. [Nature, 332, 543 (1988)] wie folgt.
- 3 bis 10 Haare mit jeweils der Haarwurzel, wurden aus 6 gesunden Probanden entnommen (4 Männer und 2 Frauen). Die Haare wurden mit sterilem destilliertem Wasser und mit Ethanol gewaschen, dann an der Luft getrocknet und in eine Länge von 5 bis 10 mm geschnitten. Jede geschnittene Haarprobe wurde in ein Polypropylenröhrchen überführt, worauf Zugabe von 0,5 ml BCL-Puffer [10 ml Tris-Hydrochlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,32 M Saccharose, 1 % Triton X-100, pH 7,5], Proteinase K (Kanto Chemical) in einer Endkonzentration von 100 µg/ml und SDS in einer Endkonzentration von 0,5 % erfolgte, und der Proteinverdau erfolgte bei 70ºC für 1 Stunde. Dann wurde nach Zugabe von 0,6 ml einer Mischung mit gleichem Volumen von Phenol und Chloroform zugegeben und sanftem Rühren wurde die Mischung zentrifugiert (10000 x g, 15 Minuten) und die wäßrige Phase wurde abgetrennt. Zu dieser wäßrigen Phase wurden weitere 0,5 ml Chloroform zugegeben und nach sanftem Rühren wurde die Mischung auf die gleiche Weise zentrifugiert und die wäßrige Phase wurde abgetrennt. Zu dieser wäßrigen Phase wurden 50 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 1 ml Ethanol gegeben. Nach ausreichendem Rühren ließ man die Mischung bei -80ºC 10 Minuten stehen und zentrifugierte dann (1000 x g, 20 Minuten) zur Gewinnung des DNA- Präzipitats. Das Präzipitat wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, dann getrocknet und in 150 µl steriles destilliertes Wasser gelöst. Ein 70-µl-Anteil einer jeden nach dem obigen Verfahren hergestellten DNA-Lösung wurde einer Stelle-01-PCR und Stelle-02-PCR unterworfen.
- Die Haarproben, die der PCR unterworfen wurden, waren wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse der PCR sind in Fig. 9 gezeigt. TABELLE 3
- In der Figur bedeutet Bahn 1 pUC19/MspI-Marker, Bahn 2 bis Bahn 7 sind die DNA-Fragmentamplifizierungen durch PCR an der Stelle 01 mit der Probe 1 bis Nr. 6 und Bahn 8 bis Bahn 13 die DNA-Fragmentamplifizierung an der Stelle 02 mit den Proben Nr. 1 bis Nr. 6.
- Aus Fig. 9 wurde entnommen, daß die Menge des aus der Probe Nr. 3 amplifizierten DNA-Fragments, welches aus 10 gesammelten Haaren bestand, groß war, wogegen die Menge des aus Probe Nr. 4 abgeleiteten DNA-Fragmentes klein war. Man nahm an, daß dieses die Unterschiede in der Menge der gesammelten und extrahierten DNA wiedergab und nicht aufgrund eines PCR-bezogenen Unterschieds. Demnach wurden die Probengrößen so eingestellt, daß die Mengen an amplifizierten DNA-Fragmenten im wesentlichen gleich miteinander waren, und es wurde ein DNA-Verdau mit den Restriktionsendonukleasen TaqI und BamHI durchgeführt.
- Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt.
- Aus dieser Fig. wurde gefunden, daß hinsichtlich Stelle 01 Probe Nr. 6 allein drei Banden ergab und daher ein NAT-Gen vom Typ 3 hatte. Für alle anderen Proben wurden die 117-bp- DNA-Fragmente verdaut, daher nahm man an, daß die Proben kein NAT-Gen vorn Typ 3 enthielt. Hinsichtlich Stelle 02 ergaben alle Proben keine 393-pb-Bande, daher nahm man an, daß sie kein NAT-Gen vom Typ 2 enthielt. Deshalb wurde der Genpolymorphismus-basierende Phenotyp wie folgt bestimmt: Proben Nr. 1 bis Nr. 5 als rascher Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 1 und Probe Nr. 6 als mittlerer Acetylator vom NAT-Gen-Typ 1/NAT-Gen-Typ 3.
- Ferner wurden Haarproben auch von solchen Probanden gesammelt, die für die Blutprobe in Referenzbeispiel 2 (RFLP) und Beispiel 2 (PCR-RFLP) gesammelt wurden und auf die gleiche Weise wie oben analysiert, was zu Ergebnissen führt, die mit den vorherstehenden Ergebnissen in Übereinstimmung waren.
Claims (5)
1. Kit zur Bestimmung des humanen Arylamin-N-
acetyltransferase-Phenotyps, umfassend die Komponente I
für die Stelle 01 und Komponente II für Stelle 02, worin
die Komponente I 100 µl einer Reaktionslösung,
enthaltend jeweils 1 µM 5'-Primer der DNA-Sequenz
CTTAATTCTC ATCTCCTGCC und einen 3'-Primer mit der DNA-
Sequenz TGTTGGAGAC GTCTGCAGGT für die Stelle 01, 0,2 mM
dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 10 mM Tris,
1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 1 mg/ml Gelatine und
25 Einheiten/ml Taq-Polymerase, und Komponente II 100 µl
einer Reaktionslösung, enthaltend jeweils 1 µM eines 5'-
Prirners mit der DNA-Sequenz ACAATACAGA TCTGGTCGAG und
eines 3'-Primers mit der DNA-Sequenz AGCATGAATC
ACTCTGCTTC für die Stelle 02, 0,2 mM dATP, 0,2 mM DCTP,
0,2 mM DGTP, 0,2 mM DTTP, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl&sub2;,
50 mM KCl, 1 mg/ml Gelatine und 25 Einheiten/ml Taq-
Polymerase, und eine Lösung, enthaltend jeweils
15 Einheiten der Restriktionsenzyme Taq I und Bam HI,
enthält.
2. Verfahren zur Identifizierung der humanen Arylamin-N-
acetyltransferasegentypen 1, 2 oder 3 durch
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismusanalyse,
umfassend die Schritte:
(a) Amplifizieren eines DNA-Fragments extrahiert aus
einer Proben-DNA unter Verwendung einer DNA-
Polymersase, eines Primers, der an das 5'-Ende des
Primers hybridisiert, worin der Primer mit dem 5'-
Ende die Sequenz
CTTAATTCTC ATCTCCTGCC oder ACAATACAGA TCTGGTCGAG
hat,
und eines Primer, der an das 3'-Ende des Fragments
hybridisiert, worin der Primer mit dem 3'-Ende die
Sequenz
TGTTGGAGAC GTCTGCAGGT oder AGCATGAATC ACTCTGCTTC
hat,
wobei das DNA-Fragment mindestens 100 bis 500
Basenpaare hat und eine Restriktionsschnittstelle
von TaqI und BamHI der humanen Arylamin-N-
Acetyltransferase-kodierenden Region aufweist,
wobei das DNA-Fragment eine polymorphe
Restriktionsenzymschnittstelle aufweist, die
typisch ist für die Typen 1, 2 und 3 der humanen
Arylamin-N-Acetyltransferase;
(b) Spalten des amplifizierten DNA-Fragments von
Schritt (a) mit BamIII und TaqI-
Restriktionsendonuklease;
(c) Erhalten des Bandenmusters, beruhend auf der Größe
für die gespaltenen DNA-Fragmente, erhalten in
Schritt (b); und
(d) Analyse der Bandenmuster um so das Vorliegen der
humanen Arylamin-N-acetyltranferase-Gentypen 1,2
oder 3 nachzuweisen.
3. Verfahren zum Nachweis des humanen Arylamin-N-
acetyltransferase-Phenotyps, umfassend die Analyse des
Bandenmusters, erhalten nach dem Verfahren zum Nachweis
des humanen Arylamin-N-acetyltransferase-Gentypen 1,2
oder 3 gemäß Anspruch 2 und in Bezugsetzen des Musters
zur raschen, mittleren oder langsamen
Acetylatoraktivitätl
4. Verfahren zum Nachweis des humanen Arylamin-N-
acetyltransferase-Gentyps 1, 2 oder 3 gemäß Anspruch 2,
worin das DNA-Fragment erhalten wird aus einer Probe
ausgewählt aus Humanblut, Humanmark, Humansperma,
humanperitonealer Bauchflüssigkeit, Urin, humanem Zellgewebe
und humanem Haar.
5. Verfahren zum Nachweis des humanen Arylamin-N-
acetyltransferase-Phenotyps gemäß Anspruch 3, worin das
DNA-Fragment erhalten wird aus der Probe, ausgewählt aus
Humanblut, Humanmark, Humansperma, human-peritonealer
Bauchflüssigkeit, Urin, humanem Zellgewebe und humanem
Haaro
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