DE3750738T2 - Menschliche DNS für die Diagnose von Glioma-retinae. - Google Patents
Menschliche DNS für die Diagnose von Glioma-retinae.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft Nachweis- und Behandlungsverfahren eines defekten menschlichen Gens, das mit Krebs verbunden ist, insbesondere mit dem Retinoblastom.
- Nature 305 (1983), 779-784, offenbart, daß eine Mutation des Retinoblastom-Locus (Rb-1), der auf dem menschlichen Chromosom 13, Bande q14, kartiert wurde, zu einer Prädisposition für ein Retinoblastom führt.
- Das Retinoblastom ist ein neoplastischer Zustand der Retinazellen, der praktisch ausschließlich bei Kindern im Alter zwischen 0 und 4 Jahren beobachtet wird. Wird es nicht behandelt, wandern die malignen neoplastischen Retinazellen im intraokularen Tumor in andere Teile des Körpers, bilden Herde von unkontrolliertem Wachstum, die immer tödlich sind. Die derzeitige Behandlung für ein Retinoblastom ist die Enukleation des betroffenen Auges, wenn der intraokulare Tumor groß ist, für kleine intraokulare Tumoren wird eine Strahlentherapie, Lasertherapie oder Kryotherapie bevorzugt. Es gibt keine erfolgreiche Behandlung für ein metastatisches Retinoblastom. Deshalb ist eine frühe Diagnose des Retinoblastoms entscheidend, um eine Behandlung zu ermöglichen, bevor sich der Tumor außerhalb des Auges ausbreitet.
- Es gibt Hinweise, daß das Retinoblastom durch den funktionellen Verlust beider homologer Kopien des Retinoblastom (Rb)-Gens verursacht wird. Folglich sind Individuen, die ein defektes Allel des Rb-Gens tragen, genetisch für die Erkrankung prädisponiert. Kinder, bei denen ein Auge durch ein Retinoblastom befallen wurde, oder die mit einer Person, die ein Retinoblastom aufweist, verwandt sind, können genetisch prädisponiert sein und deshalb das Risiko tragen, die Krankheit zu entwickeln. Diese Individuen werden routinemäßig alle 2 bis 3 Monate durch ein okulares Untersuchungsverfahren getestet, das eine allgemeine Anästhesie des Kindes erfordert.
- Die Erfindung betrifft die Verwendung von genetischem Material, das einem normalen menschlichen Retinoblastomgen oder einem einzigartigen Teilbereich davon entspricht, zur Herstellung von Material zur Verwendung in einem Verfahren zum Überprüfen menschlicher Patienten, umfassend den Vergleich der Patienten-DNA mit dem Gen oder Teilbereich davon. Ebenfalls eingeschlossen sind Vektoren, die genetisches Material umfassen, das einem normalen Retinoblastomgen oder einem einzigartigen Teilbereich davon entspricht.
- Die Erfindung stellt im allgemeinen ein Verfahren zum Überprüfen menschlicher Patienten durch Vergleich der DNA dieser Patienten mit dem isolierten normalen menschlichen Retinoblastom (Rb)-Gen oder einem einzigartigen Teilbereich davon dar (der Begriff "einzigartiger Teilbereich" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die im Rb-Gen und nirgendwo anders im menschlichen Genom gefunden wurde). Dieser Vergleich erlaubt den Nachweis von defekten Rb-Allelen in den Patienten, wobei festgestellt wird, ob diese Patienten eine kontinuierliche Überwachung durch das übliche Untersuchungsverfahren benötigen. Noch wichtiger ist, daß dieser Vergleich solche Patienten identifiziert, die kein defektes Rb-Allel aufweisen und bei denen kein Risiko besteht, ein Retinoblastom zu entwickeln, und die nicht durch das übliche Verfahren untersucht werden müssen.
- Vorzugsweise umfaßt der Vergleich zwischen der Patienten-DNA und dem normalen Rb-Gen das Testen der Patienten-DNA mit dem isolierten Rb-Gen, wobei entweder große Deletionen oder alternativ kleine Deletionen oder Punktmutationen im Rb-Locus nachgewiesen werden. Zum Nachweis großer Deletionen in einem Patienten-Rb-Allel, wird die Patienten-DNA vorzugsweise durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden analysiert, die aus dem isolierten normalen Rb-Gen hergestellt wurden. Erfindungsgemäß werden kleine Deletionen oder Punktmutationen vorzugsweise durch eine von zwei Techniken nachgewiesen. Die Nucleotidsequenzen der Patienten-Rb-Allele und das normale Rb-Gen können bestimmt und auf Unterschiede hin verglichen werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Patienten-DNA mit dem normalen Rb-Gen mittels Sonde untersucht und alle Fehlpaarungen in den erhaltenen Heteroduplices werden identifiziert.
- Das isolierte normale menschliche Retinoblastomgen kann auch zur Herstellung des normalen Rb-Genprodukts zur Proteintherapie von Individuen verwendet werden, bei denen ein defektes Rb-Allel nachgewiesen wurde.
- Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Retinoblastomproteins in einer Tumorprobe dar, wobei die Abwesenheit des Proteins mit einer Reihe verschiedener Neoplasmen einhergeht. Das Verfahren umfaßt die Herstellung eines Antikörpers gegen das Rb-Protein, das Inkontaktbringen des Antikörpers mit der Tumorprobe und den Nachweis von Immunkomplexen als Anzeichen des Vorhandenseins des Proteins in der Tumorprobe. Weist ein Tumor kein Rb-Genprodukt auf, werden keine Immunkomplexe nachgewiesen und man kann daraus schließen, daß der Tumor das Ergebnis mutierter Rb-Allele war. Dies begrenzt die pathologische Diagnose auf solche Tumoren, von denen bekannt ist, daß sie durch mutierte Rb-Allele verursacht werden, wie das Retinoblastom, Osteosarkom und einige undifferenzierte Tumoren unbekannter zellulärer Herkunft. Das Ergebnis wird eine genauere Kategorisierung der pathologischen Diagnose menschlicher Tumoren sein.
- Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
- Figur 1 ist eine bildhafte Darstellung des Autoradiogramms von einem Northern-Blot, der mit p7H30.7R als Sonde untersucht wurde;
- Figur 2 ist eine schematische Darstellung der Restriktionskarte der Insertion in den Clon p4.7R;
- Figur 3 ist eine bildhafte Darstellung des Autoradiogramms von einem Northern-Blot, der mit p4.7R als Sonde untersucht wurde;
- Figur 4 ist eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vektoren p2AR3.8 und p2AR0.9;
- Figur 5 ist eine schematische Darstellung der Fehlpaarung-Nachweistechnik;
- Figur 6 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels eines beim Fehlpaarungsnachweis verwendeten Denaturierungsgels;
- Figur 7 stellt die Sequenz des normalen Rb-Gens mit flankierenden Bereichen dar.
- Der Gen-Locus, der beim Entstehen des Retinoblastoms beteiligt ist, wurde der q14-Bande des menschlichen Chromosoms 13 zugewiesen (Sparkes et al., Science 208 (1980), 1042). Es wurde gezeigt, daß der cDNA-Clon p4.7R aus diesem Bereich der DNA die Rb-Gensequenzen trägt. Dieser Clon wurde durch die folgenden allgemeinen Techniken erhalten.
- Die menschliche DNA-Sonde pH3-8, die aus einer Lambda- Phagen-Bank des menschlichen Chromosoms 13 isoliert wurde (Lalande et al., Cancer Genet. Cytogenet. 13 (1984), 283), wurde in einem Chromosomen-Walking-Verfahren verwendet, wobei 30 kb der die H3-8-Sequenz umgebenden genomischen DNA isoliert und kartiert wurden. Es wurde festgestellt, daß ein durch dieses Verfahren erzeugtes Fragment mit der Bezeichnung p7H30.7R eine DNA-Sequenz im Mausgenom sowie innerhalb des menschlichen Chromosoms 13 erkennt (Dryja et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 1986, in Druck). Die Homologie von p7H30.7R sowohl zur menschlichen als auch zur Maus-DNA legt nahe, daß p7H30.7R codierende Sequenzen eines Strukturgens enthält.
- Um diese Möglichkeit zu überprüfen, wurde p7H30.7R radioaktiv markiert und zum Untersuchen eines Northern-Blots der RNA verwendet, die aus drei Retinoblastom-Tumoren (#42, #30 und #31) und einer Adenovirus 12-transformierten menschlichen embryonalen Retinazellinie (Ret) isoliert wurde (Vaessen et al., EMBO Journal 5 (1986), 335). Die p7H30.7R-Sonde wurde mit einem RNA-Transkript mit einer Länge von etwa 4,7 kb aus der Retinazellinie hybridisiert, aber sie hybridisierte nicht mit jedem der RNA-Transkripte aus den drei Tumorproben (Figur 1).
- Danach wurde die aus der Adenovirus-transformierten Retinazellinie isolierte RNA zur Konstruktion einer cDNA-Bank verwendet. Diese Bank wurde mit der markierten p7H30.7R-Sonde abgesucht. Mehrere cDNA-Clone wurden isoliert, die ähnliche Restriktionskarten aufwiesen. Der längste von ihnen, p4.7R, enthielt 4,7 kb der genomischen DNA. Die physikalische Karte von p4.7R ist in Figur 2 dargestellt.
- Der p4.7R-Clon wurde zum Absuchen von RNA-Transkripten verwendet, die aus Retinoblastomen (#42, #30, #41, #31), einem Osteosarkom (#16) und den Adenovirus-transformierten Retinazellen (RET) isoliert wurden. Wie in Figur 3 dargestellt, wies die p4.7R-Sonde bei einer Northern-Blot-Analyse der isolierten RNAs ein Transkript in den transformierten Retinazellen nach, das nicht in den Zellproben der vier Retinoblastome und des einen Osteosarkoms vorlag. Die Banden bei 2,0 kb wurden nach Waschen durch erneutes Untersuchen des Northern-Blots mit einer Sonde nachgewiesen, die Ratten-Tubulin nachweist (wobei das Vorhandensein der RNA im Blot bewiesen wurde).
- Der p4.7R-Clon wurde auch zum Absuchen genomischer DNA verwendet. Die DNA wurde aus einer Reihe von Tumoren aus 50 nicht verwandten Individuen isoliert, bestehend aus 40 Retinoblastomen, 8 Osteosarkomen und 2 undiffernzierten Tumoren unbekannter zellulärer Herkunft aus Patienten mit einem erblichen Retinoblastom. Die isolierten DNA-Proben wurden mit HindIII gespalten und durch eine Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer radioaktiv markierten p4.7R-Sonde analysiert. Diese Analyse ergab drei Arten von abweichenden Mustern der genomischen DNA-Restriktionsfragmente: vollständig fehlende Fragmente, die für offensichtliche homozygote Deletionen stehen; unterrepräsentierte Fragmente, die für offensichtliche heterozygote Deletionen stehen, und Fragmente mit veränderter Größe, die entweder eine partielle Deletion oder eine Veränderung einer Restriktionsstelle widerspiegeln. Mindestens 30% der Tumor-DNA zeigt eine dieser Anomalien. Im Vergleich dazu zeigt eine Southern-Blot-Analyse von Leucocyten- DNA aus 18 normalen Individuen ein einheitliches Muster von Restriktionsfragmenten.
- Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß p4.7R das Rb-Gen nachweist. Das Deletionsmuster in einer DNA-Probe eines Osteosarkoms liefert einen besonders guten Beweis, daß p4.7R das Rb-Gen nachweist. Diese DNA-Probe ist im Bezug auf eine Deletion homozygot, die ganz innerhalb des p4.7R-Bereichs liegt. Es ist sehr unwahrscheinlich, daß der Osteosarkom-Phenotyp wegen einer Mutation auftrat, die unabhängig von dieser Deletion ist. Da die Deletion auf den p4.7R-Bereich begrenzt ist, muß dieser Bereich das Rb-Gen enthalten, das, wenn mutiert, ein nicht-funktionelles Rb-codiertes Protein produziert. Die Abwesenheit des funktionellen Rb-Proteins ermöglicht die Entwicklung des neoplastischen Phenotyps.
- Die p4.7R-Sequenzen können erfindungsgemäß zum Überprüfen von Individuen auf das Vorhandensein eines mutierten Allels des Rb-Gens verwendet werden. Dieses Überprüfungsverfahren ermöglicht die Bestimmung der Notwendigkeit für eine Routineuntersuchung durch das derzeitige okulare Untersuchungsverfahren bei Individuen, die aufgrund der Familienanamnese oder eines vorhergehenden Vorkommens eines Retinoblastoms in einem Auge das Risiko tragen, ein Retinoblastom zu entwickeln. Nur wenn das Überprüfungsverfahren nachweist, daß das Individuum ein mutiertes Rb-Allel aufweist, muß das Untersuchungsverfahren regelmäßig durchgeführt werden. Jene, die zwei normale Rb-Allele aufweisen, können die Untersuchung beenden, da das Risiko der Retinoblastomentwicklung in einem Individuum mit zwei normalen Kopien des Rb-Gens etwa 1 zu 20 000 ist, oder 0,005% verglichen mit einem Risiko von 80-90%, wenn ein Individuum ein Rb-Allel aufweist, das eine Mutation enthält, die ausreicht, um das Allel zu inaktivieren. Folglich weist ein wesentlicher Prozentsatz von Individuen, die derzeit regelmäßig untersucht wurden, in Wirklichkeit kein größeres Risiko auf, als die allgemeine Bevölkerung: weder eine Familienanamnese noch ein vorhergehendes Vorkommen des Retinoblastoms ist ein entscheidender Beweis, daß ein Individuum die genetische Prädisposition für diese Erkrankung aufweist. Deshalb wurden solche Individuen, die in Wirklichkeit zwei normale Kopien des Rb-Gens tragen, wiederholt unnötig dem teueren und traumatischen okularen Untersuchungsverfahren unterzogen.
- Das erfindungsgemäße Überprüfungsverfahren kann aus zwei Hauptarten bestehen: (1) Testen einer Individuum-DNA auf Deletionen im Rb-Locus, die groß genug sind, um die Hybridisierung mit einer Rb-Sonde zu stören, und (2) Testen einer Individuum-DNA auf kleine Deletionen oder Punktmutationen im Rb-Locus.
- Ergänzend zum Überprüfen weist die Erfindung die Möglichkeit auf, eine Proteintherapie für solche Individuen bereitzustellen, bei denen festgestellt wurde, daß sie ein mutiertes Rb-Allel aufweisen, und die deshalb das Risiko der Retinoblastomentwicklung aufweisen.
- Eine weitere Anwendung der Erfindung, wie vorstehend erwähnt, ist die Immundiagnostik, wobei zum Beispiel festgestellt wird, ob ein bestimmter Tumor das Ergebnis einer Rb-Genabnormalität ist. Da Osteosarkome und bestimmte undifferenzierte Tumoren durch nachweisbare Läsionen im Rb-Gen verursacht werden können, kann die Immundiagnostik zur Unterstützung der Diagnose solcher Tumoren angewendet werden.
- Erläuternde Beispiele sind nachstehend aufgeführt.
- Zum Nachweis großer Deletionen im Rb-Locus, wird eine Southern-Blot-Analyse mit DNA durchgeführt, die aus dem zu untersuchenden Individuum gewonnen wurde. Die DNA wird aus peripheren Leucocyten gewonnen oder aus dem Tumor, wenn der Patient einen Tumor in einem Auge aufweist. Zur Untersuchung der Leucocyten-DNA wird eine Blutprobe von 10 ml aus dem Individuum gewonnen und die genomische DNA wird aus den Leucocyten in der Probe nach Standardtechniken isoliert. Diese DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease, z.B. HindIII, gespalten, einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen und durch Blotten auf einen Nitrocellulosefilter übertragen. Die DNA auf dem Filter wird dann getrennt mit den radioaktiv markierten Vektoren p2AR3.8 und p2AR0.9 als Sonden untersucht, die die durch eine EcoR1-Spaltung erhaltenen Teilfragmente aus p4.7R enthalten (Figur 4). Die getrennte Anwendung von zwei oder mehreren Teilfragmenten wird vor der Verwendung der gesamten p4.7R-Insertion bevorzugt, um die Stelle einer nachgewiesenen Abnormalität besser zu definieren. Autoradiogramme der mittels Sonden untersuchten Filter ergeben eine Restriktionskarte des Rb-Locus in der somatischen- oder Tumor-DNA des untersuchten Individuums.
- Diese Restriktionskarte wird dann mit einer Kontrollrestriktionskarte verglichen, die durch die Anwendung der gleichen Restriktionsenzymspaltung und Sonde bestimmt wurde.
- Eine geeignete Kontrolle kann die DNA sein, die aus der Adenovirus-transformierten Retinazellinie oder aus Leucocyten-DNA von einer Reihe von normalen Individuen gewonnen wurde. Wenn das untersuchte Individuum ein Rb-Allel aufweist, das eine signifikante große Deletion enthält, weist die vorstehende Restriktionskarte seiner DNA verglichen mit der Kontrolle eine zusätzliche Bande oder Banden auf, und/oder eine Bande oder Banden, die 50% ihrer Intensität aufgrund einer Veränderung der Größe oder durch eine totale Eliminierung eines oder mehrere Restriktionsfragmente durch die Deletion in einem Allel am Rb-Locus verloren hat.
- Folglich weist dieses Überprüfungsverfahren durch Southern-Analyse das Vorliegen von nicht-funktionellen Rb- Allelen nach, die große Deletionen aufweisen. Zeigt diese Analyse, daß die untersuchte DNA von einem Individuum eine Restriktionskarte aufweist, die sich von der Kontrollkarte unterscheidet, besteht die große Wahrscheinlichkeit, daß das Individuum ein nicht-funktionelles mutiertes Rb-Allel enthält. Das Individuum muß danach genau auf die Entwicklung eines Retinoblastoms überwacht werden.
- Scheint die Testrestriktionskarte mit der Kontrolle identisch zu sein, kann ein unterschiedliches Überprüfungsverfahren mit der Individuum-DNA durchgeführt werden, wobei festgestellt wird, ob das Individuum ein Rb-Allel mit einer kleinen Deletion oder Punktmutation trägt, die ausreicht, um das Allel zu inaktivieren, die aber nicht die Hybridisierung mit einer Sonde verhindert. Dieses Überprüfungsverfahren wird in dem folgenden Beispiel beschrieben.
- Um eine Individuum-DNA auf kleine Deletionen oder Punktmutationen im Rb-Locus zu untersuchen, werden vorzugsweise beide Homologe des Rb-Gens von dem Individuum cloniert. Die clonierten Allele können dann auf das Vorhandensein von Sequenzunterschieden von dem normalen Allel, dargestellt durch p4.7R, durch eines der folgenden zwei Verfahren untersucht werden: (1) die Nucleotidsequenz beider clonierten Allele und von p4.7R wird bestimmt und dann verglichen, oder (2) RNA- Transkripte von p4.7R werden mit der gesamten einzelsträngigen genomischen DNA von einem zu untersuchenden Individuum hybridisiert, und der erhaltene Heteroduplex wird mit RNase A behandelt und auf einem Denaturierungsgel aufgetrennt, wobei die Stelle vorhandener Fehlpaarungen nachgewiesen wird. Noch ausführlicher werden diese Verfahren wie folgt durchgeführt:
- Die Allele des Rb-Gens in einem zu untersuchenden Individuum werden unter Anwendung herkömmlicher Techniken cloniert. Ein übliches Verfahren verwendet zum Beispiel den Bakteriophagenvektor EMBL3 (Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170 (1983), 827). Eine Blutprobe von 10 ml wird aus dem Individuum gewonnen und die genomische DNA wird aus den Zellen in dieser Probe isoliert. Diese DNA wird partiell mit MboI bis zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße von etwa 20 kb gespalten. Fragmente im Bereich von 18 bis 21 kb werden isoliert. Die so erhaltenen MboI-endenden Fragmente werden in die EMBL3-Vektor- DNA ligiert, die vollständig mit BamHI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und für 10 Minuten auf 68ºC erhitzt wurde, wobei die kohäsiven Enden aufgebrochen werden. Dieses Ligationsgemisch wird in einer in vitro-Lambda-Verpackungsreaktion verwendet und der verpackte Phage wird durch das Wachstum eines Phagenstamms auf einer Platte amplifiziert (diese Clonierungstechnik wird von Maniatis et al. allgemein beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Publication, 256-293).
- Etwa 5 x 10&sup5; pfu aus diesem Plattenstamm werden zur Infektion von 3 ml E. coli-Zellen mit einer Konzentration von 1,5 x 10- Zellen/ml in 0,01 M MgSO&sub4; verwendet, und das Infektionsgemisch wird für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. 65 ml bei 47ºC geschmolzener Deckagar wird zugegeben und das Gemisch wird dann auf zehn 150 mm-Platten ausplattiert, die frisch eingefüllten und trockenen Bodenagar enthalten. Die Agarplatten werden inkubiert bis die Plaques einen Durchmesser von 1,5 mm erreichen und gerade beginnen sich zu berühren (etwa 10 bis 12 Stunden).
- Zwei runde Nitrocellulosefilter (Millipore HAWP) werden vorsichtig auf die Oberfläche jeder Agarplatte gelegt, wobei die Bakteriophagen-DNA gebunden wird. Die Filter werden nach einer Minute vorsichtig entfernt und für 30 Sekunden in eine Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) gelegt, 5 Minuten neutralisiert (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0) und unter vermindertem Druck 2 Stunden bei 80ºC getrocknet.
- Diese Nitrocellulosefilter werden dann mit einer radioaktiv markierten p4.7R-Sonde durch Hybridisierung und Autoradiographie untersucht. Plaques, die an die p4.7R-Sonde hybridisieren, werden Plaque-gereinigt und nach dem vorstehenden Verfahren erneut überprüft. Positive Plaques aus der erneuten Überprüfung werden isoliert und zur Herstellung einer DNA verwendet, die vermutlich die Rb-Allele des Individuums enthält.
- Die genomischen MboI-Insertionen in diesen isolierten EMBL3-Vektor-DNA-Proben werden durch eine Southern-Analyse auf die Stelle der zu p4.7R homologen Sequenzen untersucht. DNA- Proben, die den gesamten Rb-Genbereich enthalten, werden selektiert und die geeigneten Restriktionsfragmente, die das Rb- Gen aus diesen Proben enthalten, werden in einem geeigneten Vektor, wie pUC9, subcloniert. Diese Subclone enthalten folglich Kopien eines oder beider Rb-Allele aus der DNA des zu untersuchenden Individuums. Um zu bestimmen, ob beide Allele vorliegen, werden die anfänglichen Phagenisolate auf das Vorhandensein eines Restriktionspolymorphismus untersucht. Diese subclonierten Allele werden dann durch eine der folgenden Techniken auf Unterschiede von p4.7R untersucht.
- Zuerst wird die Nucleotidsequenz des normalen Rb-Gens in p4.7R durch Subclonierung von Restriktionsfragmenten von 500 bp von p4.7R in einem Mq3mp8-Phagenvektor und durch Sequenzierung dieser Subclone durch die Didesoxytechnik bestimmt (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 74 (1977), 5463). Eine zusammengesetzte Sequenz des Rb-Gens kann dann aus diesen Subclonsequenzen zusammengesetzt werden. Diese Sequenz ist in Figur 7 dargestellt, die auch die flankierenden Bereiche zeigt.
- Die isolierten Rb-Genallele werden gemäß dem folgenden Verfahren sequenziert. Restriktionsfragmente ( 2 kb) des Allels werden im M13mp8-Vektor subcloniert und kurze Stücke ( 500 bp) werden unter Verwendung kleiner Restriktionsfragmente einzeln sequenziert, die aus p4.7R als Primer in den Didesoxysequenzierungsreaktionen isoliert wurden. Die zusammengesetzte Nucleotidsequenz des isolierten Allels kann dann aus diesen einzeln geprimten Sequenzen konstruiert werden. Diese Sequenz wird direkt mit der Sequenz des normalen Rb-Gens verglichen, die aus p4.7R bestimmt wurde, wobei bestimmt wird, ob in dem isolierten Allel Deletionen oder Punktmutationen vorliegen.
- Ein anderes Verfahren des Vergleichs der allelen DNA mit dem normalen Rb-Gen verwendet RNase A, um das Vorhandensein von Unterschieden zwischen der p4.7R-Sequenz und der Allelsequenz nachzuweisen. Dieser Vergleich wird schrittweise mit kleinen ( 500 bp) Restriktionsfragmenten von p4.7R als Sonde durchgeführt. Zuerst wird p4.7R mit einem Restriktionsenzym(en) gespalten, das die Rb-Gensequenz in Fragmente von etwa 500 bp schneidet. Diese Fragmente werden durch Elektrophorese auf einem Gel isoliert und einzeln in beiden Orientierungen in einem SP6-Vektor, wie pSP64 oder pSP65, cloniert (Melton et al., Nucleic Acids Res. 12 (1984), 7035). Die Sp6- bezogenen Plasmide mit Insertionen des p4.7R-Fragments werden in vitro unter Verwendung des auf dem Fachgebiet gut bekannten SP6-Transkriptionssystems in Gegenwart von (α-³²P)GTP transkribiert, wobei radioaktiv markierte RNA-Transkripte beider Stränge der cDNA des Rb-Gens erzeugt werden.
- Diese RNA-Transkripte werden wie folgt einzeln zur Erzeugung von Heteroduplexen mit der allelen DNA verwendet. 50 ng des Allelsubclons werden mit einem Restriktionsenzym gespalten, das außerhalb des Bereichs schneidet, der durch die verwendeten RNA-Transkriptsonde abgedeckt wurde. Diese gespaltene DNA wird mit der radioaktiv markierten RNA-Sonde in 30 ul Hybridisierungspuffer (80% Formamid, 40 mM Pipes, pH 6,4, 0,4 M NaCl und 1 mM EDTA) gemischt und das Gemisch wird für 10 Minuten bei 90ºC behandelt, wobei die DNA denaturiert wird. Das Gemisch wird dann langsam auf 45ºC abgekühlt und die RNA läßt man bei 45ºC für eine halbe Stunde an die einzelsträngige DNA anlagern.
- Die RNA:DNA-Heterodupexe werden dann mit 350 ul einer RNase A-Lösung (Sigma) (40 ug/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl und 0,1 M LiCl) behandelt. Das Gemisch wird mit Hilfe eines Vortexgerätes gemischt und für 30 Minuten bei 25ºC inkubiert. Die RNase A-Reaktion wird durch Zugabe von 10 ul Proteinase K (10 mg/ml) (Boehringer Mannheim) beendet, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 20 Minuten. Eine Extraktion mit Phenol-Chloroform und eine Ethanolpräzipitation der wäßrigen Schicht ergibt eine Nucleinsäureprobe, die frei ist von einer Proteinkontaminierung. Die ausgefällte Probe wird in 5 ul resuspendiert und durch eine denaturierende Gelelektrophorese (4% Polyacrylamid, 7 M Harnstoff) analysiert (Figur 5).
- Fehlpaarungen, die im RNA:DNA-Heteroduplex aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen dem p4.7R-Fragment und dem Rb-Allelsubclon des Individuums auftreten, führen zur Spaltung des RNA-Strangs durch die RNase A-Behandlung. Solche Fehlpaarungen können das Ergebnis von Punktmutationen oder kleinen Deletionen im Rb-Allel des Individuums sein. Die Spaltung des RNA-Strangs ergibt zwei oder mehrere kleine RNA-Fragmente, die auf einem denaturierenden Gel schneller als die RNA-Sonde selbst wandern, wie in Figur 6 dargestellt.
- Bei der vorstehenden RNase A-Technik wird die radioaktiv markierte Rb-Gen-RNA mit einzelnen Strängen eines Rb-Allels eines Individuums hybridisiert, das in einen Vektor cloniert wurde. Die RNase A-Technik ist vorteilhaft, da sie auch ohne die Clonierung der Rb-Allele angewendet werden kann. Vorzugsweise wird die genomische DNA aus Blutzellen des zu untersuchenden Individuums isoliert und diese genomische DNA wird direkt mit den radioaktiv markierten Rb-RNA-Sonden hybridisiert, wobei wie folgt die Sequenzunterschiede des normalen Rb-Gens bestimmt werden. 5 ug der isolierten, gesamten genomischen DNA wird mit der markierten RNA-Sonde in 30 ul Hybridisierungspuffer (80% Formamid, 40 mM Pipes pH 6,4, 0,4 M NaCl und 1 mM EDTA) resuspendiert, und dieses Hybridisierungsgemisch wird für 10 Minuten bei 90ºC behandelt, um die DNA zu denaturieren. Das Gemisch wird dann langsam auf 45ºC abgekühlt und 10 Stunden bei dieser Temperatur inkubiert, um die Hybridisierung der RNA-Sonde an die einzelsträngigen DNA-Kopien des Rb-Allels zu ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden RNase A-Behandlung und Elektrophorese wie vorstehend durchgeführt. Fehlpaarungen in den Heteroduplexen zwischen der RNA-Sonde und den genomischen Kopien der Rb-Allele des Individuums werden leicht nachgewiesen.
- Eine andere Anwendung für die clonierte cDNA des normalen Rb-Gens, wie durch p4.7R dargestellt, ist die Herstellung des Rb-Proteins. Das Rb-Protein wird durch Clonierung der Rb-cDNA von p4.7R in einem geeigneten Säugerexpressionsvektor, Expression des Rb-Proteins aus diesem Vektor in einem in vivo- Expressionssystem und Isolierung des Rb-Proteins aus dem Medium oder den Zellen des Expressionssystems hergestellt.
- Allgemeine in vitro-Expressionsvektoren und -systeme sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
- Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Rb-Protein wird in ein Kaninchen injiziert, um einen anti-Rb-Antikörper zu produzieren, der dann markiert wird, z.B. radioaktiv, fluoreszierend oder mit einem Enzym, wie der alkalischen Phosphatase. Der markierte Antikörper wird für den Nachweis verwendet, ob menschliche Tumoren von einem defekten Rb-Gen verursacht werden. Dies kann durch jedes übliche Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Tumorprobe verflüssigt und unter Verwendung einer herkömmlichen ELISA-Anordnung gegen den markierten Antikörper getestet werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Tumorschnitt fixiert und mit dem markierten Antikörper umgesetzt werden, und vorhandene Immunkomplexe können dann unabhängig von der Markierungsart des Antikörpers durch Autoradiographie oder Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Tumoren, die kein Antigen aufweisen, das mit dem Antikörper gegen das Rb-Genprodukt reagiert, werden durch Mutationen des Retinoblastom-Gens verursacht. Da wenige Tumoren bekannt sind, die durch ein mutiertes Rb-Gen verursacht werden (einschließlich Retinoblastom und Osteosarkom), wird die Differentialdiagnose von Tumoren, denen das Rb-Genprodukt fehlt, durch einen solchen Test stark eingeschränkt.
- Die Plasmide p2AR3.8 und p2AR0.9 wurden am 17. Juli 1987 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielten die ATCC-Hinterlegungsnummern 40,241 und 40,242.
- Andere Ausführungsformen sind in den folgenden Patentansprüchen eingeschlossen.
Claims (10)
1. Verwendung von genetischem Material, das einem normalen
menschlichen Retinoblastomgen oder einem eindeutigen
Teilbereich davon entspricht, zur Herstellung von
Material zur Verwendung in einem Verfahren zum Überprüfen
menschlicher Patienten auf defekte Retinoblastomallele,
wobei das Verfahren den Vergleich der Patienten-DNA mit
dem Gen oder Teilbereich umfaßt.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vergleich durch
DNA-Hybridisierung durchgeführt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vergleich durch
Sequenzvergleich oder Sequenzanalyse durchgeführt wird.
4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vergleich durch
den Nachweis von Fehlpaarungen in einem Heteroduplex
zwischen der Patienten-DNA und dem normalen Gen oder
RNA-Transkripten von dem normalen Gen durchgeführt wird.
5. Vektor umfassend genetisches Material, das einem
normalen menschlichen Retinoblastomgen oder einem eindeutigen
Teilbereich davon entspricht.
6. Vektor nach Anspruch 5, wobei der Teilbereich mindestens
20 bp lang ist.
7. Verfahren zum Nachweis eines Retinoblastomproteins in
einer Tumorprobe, wobei die Abwesenheit des Proteins mit
einem Neoplasma einhergeht und das Verfahren die
Herstellung eines Antikörpers gegen das
Retinoblastomprotein, das Inkontaktbringen des Antikörpers mit der
Tumorprobe und den Nachweis von Immunkomplexen als
Anzeichen
des Vorhandenseins des Proteins in der Tumorprobe
umfaßt.
8. Verfahren zum Überprüfen eines menschlichen Patienten
auf das Vorhandensein eines defekten Retinoblastom (Rb)-
gens, das den Vergleich der Patienten-DNA mit einem
normalen menschlichen Retinoblastomgen oder einem
eindeutigen Teilbereich davon umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Vergleich durch
DNA-Hybridisierung oder durch Sequenzvergleich oder
-analyse durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Vergleich durch den
Nachweis von Fehlpaarungen in einem Heteroduplex
zwischen der Patienten-DNA und dem normalen Gen oder RNA-
Transkripten von dem normalen Gen durchgeführt wird.
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