JP2779161B2 - 網膜芽腫の診断用ベクター - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、癌、特に、網膜芽腫および骨肉腫に関連し
た欠損ヒト遺伝子の検出および治療方法に関する。 網膜芽腫は、ほとんどの場合０〜４才の子供に観察さ
れる、網膜細胞の新生物である。治療されなければ、眼
内腫瘍の悪性新生物網膜細胞は体の他の部分に転移して
常に死に至る制御されない生育を示す病単をいくつも形
成する。網膜芽腫の現在の治療法は、眼内腫瘍が大きけ
れば侵された眼の摘出；眼内腫瘍が小さければ放射療
法、レーザー療法、または寒冷療法が好ましい。転移し
た網膜内腫瘍には良い治療法が知られていない。したが
って、腫瘍が眼の外へ広がる前に治療できるような網膜
芽腫の早期診断を困難である。 網膜芽腫は網膜芽腫（Rb）遺伝子の両相同性コピーの
機能欠失によって生じることが証明されている。このよ
うに、Rb遺伝子の１つの欠損アレルを有する個体は一般
にこの病気にかかりやすい。網膜芽腫にかかった眼を１
つ有する子供あるいは網膜芽腫患者の血族である子供は
一般にこの病気の素因を持ち、発病の危険にさらされて
いる。これらの子供は全身麻酔を必要とする眼の検査を
２〜３ヶ月毎に受けて網膜芽腫を試験される。 一般に、本発明は、これらの患者のDNAを単離された
正常ヒト網膜芽腫（Rb）遺伝子またはその固有の部分領
域は（“固有の部分領域”とは、Rb遺伝子に見られるが
ヒト染色体の他の部位には見られないDNA配列を含む領
域をいう）と比較することによってヒト患者をスクリー
ニングする方法を提供する。この比較により、患者の欠
損Rbアレルを検出してこれらの患者が従来の検査方法に
よって継続的に監視する必要があるか否かを決定でき
る。より重要なことは、この比較により欠損Rbアレルを
有せず網膜芽腫の発病のおそれがなく従来の方法で検査
する必要のない患者を見分けられることである。 好ましくは、患者のDNAと正常なRb遺伝子との間の比
較は、患者のDNAを単離したRb遺伝子で試験して大きな
欠失かあるいは小さな欠失すなわちRb位置における点突
然変異のいずれであるかを検出することを含む。患者の
Rbアレルにおける大きな欠失を試験するために、患者の
DNAを好ましくは、単離した正常Rb遺伝子からつくった
プローブを使用したDNAハイブリダイゼーションで分析
する。本発明によれば、小さな欠失すなわち点突然変異
は２つの技術のいずれによって検出してもよい。患者の
Rbアレルと正常なRb遺伝子のヌクレオチド配列を決定し
その相違について比較できる。別法として、患者のDNA
を正常なRb遺伝子でプローブし、得られたヘテロ二本鎖
における誤対合を決定する。 また、単離された正常ヒト網膜穿腫遺伝子を使用し
て、欠損Rbアレルを有することがわかった個体の蛋白質
療法のための正常Rb遺伝子産生物を生成できる。 実施例1:サウザーン・ブロット分析 Rb部位における大量の欠損を検出するために、被験個
体からのDNAについてサウザーン・ブロット分析を行な
った。このDNAは末梢白血球から得られ、患者が１つの
眼に腫瘍を有するときは該腫瘍から得られた。白血球を
DNAを検査するために、10mlの血液試料を個体から得、
標準的方法によって該試料中の白血球からゲノムDNAを
単離した。このDNAを制限エンドヌクレアーゼ、たとえ
ばHind IIIで切断し、アガロース電気泳動ゲル上を泳動
させ、ブロッティングによりニトロセルロースフィルタ
ーに移した。フィルター上のDNAを次いで放射標識され
たp2AR3.8およびp2AR0.9（EcoR Iによる切断によって得
られたp4.7Rからのサブフラグメントを含む）で別々に
プローブした（第４図）。検出された異常の位置をより
明確に決定するためには、p4.7R挿入物全体よりむしろ
２つ以上の断片を別々に使用することが好ましい。プロ
ーブされたフィルターのオートラジオグラムによって、
試験された個体の体細胞または腫瘍DNAにおけるRb部位
の制限地図が得られた。 この制限地図を、対照制限地図であって、同一の制限
酵素による切断とプローブを使用して決定した地図と比
較した。適当な対照は、１組の正常な個体からのアデノ
ビールス−形質転換網膜細胞株または白血球のDNAから
得られたDNAであり得る。被験個体が有意に大きな欠損
を含むRbアレルを有するならば、彼のDNAの制限地図
は、対照と比較して、Rb部位における１つのアレルにお
ける欠失による１つまたはそれ以上の制限断片の、１つ
またはそれ以上のバンドを余計に含み、および／あるい
はサイズの変化によって生じた、強度が50％低下した１
つまたはそれ以上のバンドを含むか、あるいは該バンド
が全面的に欠除しているであろう。 正常Rb遺伝子の単離 網膜芽腫を生起せしめるのに含まれる遺伝子的位置は
ヒト染色体13のq14帯域であると決定されている。〔par
kerら，サイエンス（Science）208:1042（1980）〕DNA
のこの領域からのcDNAクローンであるp4.7RはRb遺伝子
配列を担持することが示されている。このクローンは下
記一般的技術により得られた。 cDNAクローンp4.7Rの単離 ヒト染色体13ラムダファージライブラリーから単離さ
れたヒトDNAプローブpH3−８（Lalandeら,1984,Cancer
Genet.Cytogenet.13:283）を染色体移動技術において使
用してH3−８配列を囲む30kbの染色体DNAを単離し地図
を作製した。この技術によって生成した１つの断片、す
なわちp7H30.7Rを見出してヒト染色体13ばかりでなくマ
ウスの染色体にもDNA配列を確認した。（Dryjaら,1986,
Proc.Nat.Acad.Sci.USA）ヒトとマウスの両方のDNAにつ
いてp7H30.7Rの相同性があることはp7H30.7Rが構造遺伝
子のコード配列を含むことを示唆した。 この可能性を試験するために、p7H30.7Rを放射標識
し、３つの網膜芽腫（＃42,＃30および＃31）およびア
デノビールス12−形質転換ヒト胎児網膜細胞株（Ret）
（Vaessenら,1986,EMBO Journal5:335）から単離される
RNAのノーサーンブロットをプローブした。このp7H30.7
Rプローブは網膜細胞株からの約4.7kbのRNA転写物に対
してハイブリッド形成したが、上記３つの腫瘍試料から
のRNA転写物に対してはハイブリッド形成しなかった
（第１図）。 続いて、アデノビールス形質転換網膜細胞株から単離
されたRNAを使用してcDNAライブラリーを造成した。こ
のライブラリーを標識されたp7H30.7Rプローブによって
スクリーニングした。類似の制限地図を有するいくつか
のcDNAクローンが単離された。それらのもっとも大きな
ものであるp4.7は4.7kbのゲノムDNAを含んでいた。p4.7
Rの制限地図は第２図に示した。 p4.7Rの特定 網膜芽腫（＃42,＃30,＃41,＃31）；骨肉腫（＃16）
およびアデノビールス−形質転換網膜細胞（Ret）から
単離されたRNA転写物をスクリーニングするのにp4.7ク
ローンを使用した。第３図に示されるように、p4.7Rプ
ローブは、単離されたRNA転写物のノーサーンブロット
分析において、４つの網膜芽腫および１つの骨肉腫細胞
試料において存在しない形質転換網膜細胞における転写
物を検出した。2.0kb以下のバンドは、ノーサーンブロ
ットをラットタブリン（tubulin）を検出するプローブ
で洗った後に再プローブする（ブロットにおけるRNAの
存在を示す）ことによって検出された。 p4.7RクローンもゲノムDNAをスクリーニングするのに
使用した。40個の網膜芽腫、８つの骨肉腫および網膜芽
腫の遺伝形質を有する患者の未知の細胞の未確認腫瘍２
つからなる50人の非血族の患者からの各腫瘍１組からDN
Aを単離した。単離されたDNA試料をHind IIIで切断し、
プローブとして放射標識したp4.7Rを使用してサウザー
ンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。こ
の分析により、ゲノムDNA制限断片の３つの異なったパ
ターン： すなわち、見掛け上の同型接合欠失を示す全面的に不
存在の断片；見掛け上の異型接合欠失を示す不顕化断
片；および制限部位の部分的欠失または変化のいずれか
を示す、サイズが変化した断片を示した。腫瘍DNAの少
くとも30％はこれらの異常のうち１つを示した。比較の
ため、18人の正常な個体からの白血球DNAをサウザーン
ブロット分析して制限断片の均一なパターンを示した。 上記結果はp4.7RがRb遺伝子を欠失することを示す。
１つの骨肉腫DNA試料中の欠失パターンはp4.7RがRb遺伝
子を検出する特に良い証拠を提供する。このDNA試料
は、p4.7R領域内に全体が位置する欠失については同型
接合である。骨肉腫表現型はこの欠失とは関係なく生じ
るということはとてもありそうにない。欠失はp4.7R領
域に限定されるので、この領域は、当然変異を生じたと
き非機能Rb−コード化蛋白質を産正するRb遺伝子を含ん
でいるにちがいない。機能Rb蛋白質が存在しないと新生
物の表現型を形成する。 用途 本発明の方法でp4.7配列を使用するとRb遺伝子の突然
変異アレルの存在について個体をスクリーニングでき
る。このスクリーニング方法を使用すれば、１つの眼に
網膜芽腫の家族歴または既応症があるため網膜芽腫を発
病するおそれのある個体が現在の眼の検査によって日常
的な検査を受ける必要を決定する。もし、スクリーニン
グで個体が突然変異Rbアレルを有することが決定された
場合のみ、定期的に検査を行う必要があろう。２つの正
常なRbアレルを有する患者は検査を中止できる。という
のは、Rb遺伝子の２つの正常な複製物を有する個体が網
膜芽腫を発病する危険性は、アレルを不活性化するに充
分な突然変異を含むRbアレルを患者が有している場合の
危険率80〜90％に比べて、約20000分の１、すなわち0.0
05％であるからである。このように、現在定期的に検査
されている患者の大部分が実際には一般的な人々を越え
る危険にさらされているわけではなく；網膜芽腫の家族
歴も既応症も個体がこの病気に遺伝的にかかりやすいと
いう包括的な証拠にはならない。したがって、実際にRb
遺伝子の２つの正常な複製物を担持しているそのような
個体は不必要な高価且つ外傷性の眼の検査を繰返し受け
てきたことになる。 本発明のスクリーニング方法は好ましくは主として２
つのタイプからなる：（１）Rbプローブに対するハイブ
リダイゼーションを妨害するに充分大きなRb位置におけ
る欠失についての個体のDNAを試験すること、および
（２）Rb位置における小さな欠失すなわち点突然変異に
ついて個体のDNAを試験すること。 スクリーニングに加えて、本発明は、突然変異体Rbア
レルを含むことが決定され、したがって網膜芽腫を発病
するおそれのある患者のための蛋白質療法を提供するの
に役立つ。 本発明のもう１つの用途は、上述の如く、たとえば特
定の腫瘍がRb遺伝子の異常によるものか否か決定する免
疫学的診断である。骨肉腫および特定の未確認腫瘍はRb
遺伝子の検出可能な障害から生じるので、免疫学的診断
を使用してそのような腫瘍の診断を助けることができ
る。 下記例により本発明を説明する。 このようにしてサウザーン分析によるスクリーニング
方法は大きな欠失を有する非機能Rbアレルの存在を検出
するであろう。もしこの分析により固体からの被験DNA
が対照の制限地図と異なる制限地図を有することを示す
場合、当該個体が非機能突然変異Rbアレルを含むという
大きな可能性がある。この個体は今後網膜芽腫の発病に
ついて厳密に監視されなければならない。 もし、被験制限地図が対照と同一であれば、異なるス
クリーニング方法をその個体のDNAについて実施してそ
の個体が小さな欠失すなわち点突然変異を有するRbアレ
ルを含むか否かを決定する。これは該アレルを不活性化
するのに充分であるがプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを防止するには不充分である。スクリーニング方法
は下記例に記載する。 実施例2:Rb位置の精密な構造分析 Rb位置の小さな欠失または点突然変異について個体の
DNAを検査するために該個体からのRb遺伝子の両方の相
同体をクローニングしたアレルを次いで下記の２つの方
法のうちの１つによって、p4.7Rと表わされる正常アレ
ルとの配列の相違があるか否かについて試験する：
（１）クローニングしたアレルおよびp4.7Rの両方のヌ
クレオチド配列を決定し比較する、あるいは（２）p4.7
RからのRNA転写物を被験者からの一本鎖全ゲノムDNAに
対してハイブリッド形成させ、得られたヘテロ二本鎖を
RNA分解酵素Ａで処理して変性ゲル上で泳動させて誤対
合の位置を検出する。より詳しくは、これらの方法は下
記の如く行なわれる： （１） Rbアレルのクローニング 試験されるべき個体のRb遺伝子のアレルを従来の技術
を使用してクローニングした。普通の方法はたとえばバ
クテリオファージベクターEMBL3（Frischaufら,1983,j.
Mol.Biol.170:827）を使用する。10mlの血液試料を個体
から得、ゲノムDNAをこの試料の細胞から単離した。こ
のDNAをMbo Iで部分的に切断して平均サイズ約20kbの断
片にした。18〜21kbの断片を単離した。得られたMbo I
−末端断片をBamH Iで完全に切断し、アルカリホスファ
ターゼで処理し、68℃に10分間加熱して接着末端を分断
しておいたEMBL3ベクターDNAに結合させた。このリゲー
ションミックスをインビトロラムダパッケージング反応
で使用し、プレートストックを生育させることにより、
パッケージされたファージを増殖させた。〔このクロー
ニング技術はマニアティス（Maniatis）ら，モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Clonig）:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Publications,256−293頁
（1982）に一般的に記載されている〕 このプレートストックからの約５×105pfuを使用して
3mlの大腸菌（E.coli）（0.01MμgSO4中〜1.5×109個/m
lの菌体）に感染させ、この感染混合物を37℃で20分間
インキュベートした。47℃で頂部を融解させた寒天65ml
を加え、この混合物を新しく注入され底部に乾いた寒天
を含む10枚の150mmプレート上に塗布した。プラークが
〜1.5mmの直径となり互いに接触し始めるようになるま
で（約10〜12時間）インキュベートした。 二重の円状のニトロセルロースフィルター（ミリポア
HAWP）を各寒天プレートの表面にそっと置いてバクテリ
アファージDNAを結合させた。これらのフィルターを１
分間後に注意深く取り出し、30秒間変性溶液（1.5M Na
Cl,0.5M NaOH）に入れ、５分間中和し（1.5M NaCL,0.
5Mトリス−Cl pH8.0）、80℃で２時間真空乾燥した。 次いでこれらのニトロセルロースフィルターを放射標
識したp4.7Rによりハイブリダイゼーションとオートラ
ジオグラフィーによってプローブした。p4.7Rプローブ
に対するハイブリダイゼーションを示すプラークを上記
方法によりプラーク精製し再スクリーニングした。再ス
クリーニングからの陽性プラークを単離し使用して個体
からのRbアレルを含むと推定されるDNAをつくった。 これらの単離されたEMBL3ベクターDNA試料におけるMb
o Iゲノム挿入物を、サウザーン分析によりp4.7Rと相同
の配列の位置について試験した。全Rb遺伝子領域を含有
するDNA試料を選択し、これらの試料からのRb遺伝子を
含む適当な制限断片をpUC9の７ような適当なベクターに
サブローンした。これらのサブクローンは試験される個
体のDNAからの１つまたは両方のRbアレルの複製物を含
有した。両方のアレルが発現されているか否かを決定す
るために、当初ファージ単離物を制限多形性の存在につ
い試験した。サブクローニングしたアレルを下記技術の
１つによってp4.7Rとの相違についてしらべた。 （２） 配列比較 まず、p4.7R中の正常なRb遺伝子のヌクレオチド配列
をp4.7Rからの〜500bpの制限断片をM13mp8ファージベク
ターをサブクローニングし、これらのサブクローンをデ
オキシ技術により配列することによって決定した（Sang
erら,1977,Proc.Nat.Acad,Sci USA 74:5463）。これら
の個々のサブクローン配列からRb遺伝子の配列を組立て
ることができた。この配列はフランキング領域をも示す
第７図に示されている。 単離されたRb遺伝子アレルを下記手順で配列化した。
アレルの制限断片（〜2kb）をM13mp8ベクターにサブク
ローニングし、ジデオキシ配列反応においてプライマー
としてp4.7Rから単離された小さな制限断片を使用して
いくつかの短い区域（〜500bp）を個別に配列形成し
た。次いでこの単離されたアレルの複合ヌクレオチド配
列をこれらの個別にプライムされた配列から造成した。
この配列をp4.7Rから決定された正常のRb遺伝子の配列
と直接に比較して、欠失または点突然変異が単離された
アレルに存在するか否かについてしらべた。 （３）誤対合のリボヌクレアーゼ開裂 アレルのDNAを正常Rb遺伝子と比較する別の方法はRNA
分解酵素Ａを使用してp4.7R配列とアレル配列との相違
があるか否か検出する。この比較はプローブとしてのp
4.7Rの小さな（〜500bp）制限断片により段階的に行な
われる。まず、p4.7RをRb遺伝子配列を約500bpの断片に
切断する制限酵素で切断する。これらの断片を電気泳動
ゲル上で単離し、pSR64またはpSP65ようなSP6ベクター
に両方向で別個にクローニングした（Meltonら,1984,Nu
cleic Acids Res.12:7035）、p4.7R断片の挿入物を含有
するSP6に基づいたプラスミドを、SP6転写系（当分野で
周知）を〔α−32P〕GTPの存在下に使用してRb遺伝子の
cDNAの二本鎖の放射標識RNA転写物を形成することによ
ってインビトロで転写した。 これらのRNA転写物を別個に使用してアレルDNAにより
ヘテロ二本鎖を下記の如く形成した。 50ngのアレルサブクローンを使用されるべきRNA転写
物プローブによってカバーされる領域の外を切断する制
限酵素で切断した。この切断されたDNAを30μのハイ
ブリダイゼーション緩衝液（80％ホルムアミド,40mMパ
イプス（Pipes）pH6.4,0.4M NaCl,および1mM EDTA）中
で放射標識RNAと混合し、混合物を90℃で10分間処理し
てDNAを変性した。次いでこの混合物をゆっくりと45℃
に冷却してRNAを45℃で30分間一本鎖DNAにアニーリング
した。このRNA:DNAヘテロ二本鎖を350μのRNA分解酵
素Ａ溶液〔シグマ（Sigma）〕（10mMトリス−HCl pH7.
5,1mMEDTA,0.2MNaClおよび0.1M LiCl中40μg/mlの酸
素）で処理した。この混合物を渦動させ25℃で30分間イ
ンキュベートした。RNA分解酵素Ａ反応を10μのプロ
テイナーゼＫ（10mg/ml）（ベーリンガー・マンハイ
ム）の添加、続いて37℃で20分間インキュベートするこ
とによって停止させた。水性層をフェノール−クロロホ
ルムおよびエタノール沈殿により抽出して蛋白質の混入
しない核酸サンプルを得た。この沈殿した試料を５μ
に再懸濁し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％ポ
リアクリルアミド,7M尿素）を変性することによって分
析した（第５図）。 p4.7R断片と個体からのRbアレルサブクローンとの配
列の相違に起因するRNA:DNAヘテロ二本鎖に生じた誤対
合の結果、RNA分解酵素Ａ処理によりRNA鎖が開裂した。
そのような誤対合は各個体のRbアレルにおける点突然変
異または小さな欠失の結果である。RNA鎖の開裂により
２つ以上の小さなRNA断片が得られ、これらは第６図に
示されるように変性ゲル上をRNAプローブ自体よりも速
く泳動した。 RNA分解酵素技術において、放射標識Rb遺伝子RNAをベ
クターにクローンしておいた個体のRbアレルの一本鎖に
ハイブリッドした。このRNA分解酵素技術もRbアレルを
クローニングしないでも使用できるので便利である。好
ましくは、ゲノムDNAは試験されるべき個体の血球から
単離され、このゲノムDNAは放射表域Rb RNAプローブと
直接ハイブリッドを形成して下記の如く正常なRb遺伝子
との配列上の相違を決定した。単離されたゲノムDNA総
量のうち５μｇを30μのハイブリダイゼーション緩衝
液（80％ホルムアミド,40mMパイプスpH6.4,0.4M NaCl
および1mM EDTA）中の標識RNAプローブとともに再懸濁
し、このハイブリダイゼーション混合物を90℃で10分間
処理してDNAを変性した。次いでこの混合物をゆっくり4
5℃に冷却し、この温度で10時間インキュベートしてRNA
プローブをRbアレルの一本鎖DNA複製物に対してハイブ
リッド形成させた。ハイブリッド形成後、上述の如くRN
A分解酵素Ａ処理と電気泳動を行なった。RNAプローブと
各個体のRbアレルのゲノム複製物とのヘテロ二本鎖にお
ける誤対合は容易に検出できた。 実施例3:蛋白質療法 p4.7Rと表されるように正常Rb遺伝子のクローニング
したcDNAについてのもう１つの用途は、Rb遺伝子の欠損
アレルを有すると決定された個体の治療のためのRb蛋白
質を産生することである。これらの個体における網膜芽
腫の形成を防止するために、Rb遺伝子産生物をこれらの
個体に治療に有効なように投与する。p4.7RからのRb cD
NAを適当な哺乳類の発現ベクターにクローニングし、こ
のベクターからのRb蛋白質をインビボ発現系で発現さ
せ、発現系の培地または細胞Rb蛋白質を単離することに
よってRb蛋白質が産生される。一般的なインビトロ発現
ベクターおよびシステムは当分野で周知である。 実施例4:免疫学的診断 上述の如く産生さたRb蛋白質をウサギに注射して抗−
Rb抗体を産生させ、次いでこれを放射能、蛍光などで、
あるいはアルカリホスファターゼのような酵素で標識し
た。この標識した抗体を使用してヒト腫瘍が欠損Rb遺伝
子由来のものか否か決定した。たとえば、この腫瘍試料
を液化し、通常のELISAフォーマットを使用して標識さ
れた抗体に対して試験した。別法として、腫瘍部分を固
定し標識抗体と反応させ、免疫複合体を抗体上の認識の
タイプに応じてオートラジオグラフィーまたは蛍光顕微
鏡で検出できる。Rb遺伝子産生物に対する抗体と反応性
の抗原を欠く腫瘍は網膜芽腫遺伝子の突然変異に起因す
る。突然変異Rb遺伝子によって生起されることが知られ
ている腫瘍は、網膜芽腫および骨肉腫を含めてわずかな
ので、Rb遺伝子産生物を欠く腫瘍の分別診断はそのよう
な試験によって非常に明確にされる。 寄託 プラスミドp2AR3.8およびp2AR0.9は1987年７月17日に
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリ
ーランド州，ロックビル）に各々ATCCNo.40,241と40,24
2として寄託された。 本出願人であるマサチューセッツ・アイ・エンド・イ
アー・インファーマリーは、ATCCは寄託物の永続生を保
証する寄託機関であって、特許が許可されたときは公衆
に容易に分譲されることを表示する。この寄託物の分衆
への分譲についてのすべての制限は特許の許可と同時に
不可逆的に取り除かれよう。寄託物は、37CFR1.14およ
び35USC122の下に資格のある長官によって決定された者
に対して、この特許出願係属中分譲されよう。寄託物は
それを生存させておくに要するすべての管理により維持
され、寄託微生物の試料の提供についてのもっとも最近
の申請から少くとも５年間、およびとにかく、寄託の日
から少くとも30年間あるいは特許権の存続期間のいずれ
か長い方の間不純物の混入がないように管理されよう。
本出願人は、寄託期間が寄託物の状態に起因して、要請
のあった試料の提供を行うことができないときは寄託物
の補充する業務を認める。 他の具体例も前記特許請求の範囲内にある。
た欠損ヒト遺伝子の検出および治療方法に関する。 網膜芽腫は、ほとんどの場合０〜４才の子供に観察さ
れる、網膜細胞の新生物である。治療されなければ、眼
内腫瘍の悪性新生物網膜細胞は体の他の部分に転移して
常に死に至る制御されない生育を示す病単をいくつも形
成する。網膜芽腫の現在の治療法は、眼内腫瘍が大きけ
れば侵された眼の摘出；眼内腫瘍が小さければ放射療
法、レーザー療法、または寒冷療法が好ましい。転移し
た網膜内腫瘍には良い治療法が知られていない。したが
って、腫瘍が眼の外へ広がる前に治療できるような網膜
芽腫の早期診断を困難である。 網膜芽腫は網膜芽腫（Rb）遺伝子の両相同性コピーの
機能欠失によって生じることが証明されている。このよ
うに、Rb遺伝子の１つの欠損アレルを有する個体は一般
にこの病気にかかりやすい。網膜芽腫にかかった眼を１
つ有する子供あるいは網膜芽腫患者の血族である子供は
一般にこの病気の素因を持ち、発病の危険にさらされて
いる。これらの子供は全身麻酔を必要とする眼の検査を
２〜３ヶ月毎に受けて網膜芽腫を試験される。 一般に、本発明は、これらの患者のDNAを単離された
正常ヒト網膜芽腫（Rb）遺伝子またはその固有の部分領
域は（“固有の部分領域”とは、Rb遺伝子に見られるが
ヒト染色体の他の部位には見られないDNA配列を含む領
域をいう）と比較することによってヒト患者をスクリー
ニングする方法を提供する。この比較により、患者の欠
損Rbアレルを検出してこれらの患者が従来の検査方法に
よって継続的に監視する必要があるか否かを決定でき
る。より重要なことは、この比較により欠損Rbアレルを
有せず網膜芽腫の発病のおそれがなく従来の方法で検査
する必要のない患者を見分けられることである。 好ましくは、患者のDNAと正常なRb遺伝子との間の比
較は、患者のDNAを単離したRb遺伝子で試験して大きな
欠失かあるいは小さな欠失すなわちRb位置における点突
然変異のいずれであるかを検出することを含む。患者の
Rbアレルにおける大きな欠失を試験するために、患者の
DNAを好ましくは、単離した正常Rb遺伝子からつくった
プローブを使用したDNAハイブリダイゼーションで分析
する。本発明によれば、小さな欠失すなわち点突然変異
は２つの技術のいずれによって検出してもよい。患者の
Rbアレルと正常なRb遺伝子のヌクレオチド配列を決定し
その相違について比較できる。別法として、患者のDNA
を正常なRb遺伝子でプローブし、得られたヘテロ二本鎖
における誤対合を決定する。 また、単離された正常ヒト網膜穿腫遺伝子を使用し
て、欠損Rbアレルを有することがわかった個体の蛋白質
療法のための正常Rb遺伝子産生物を生成できる。 実施例1:サウザーン・ブロット分析 Rb部位における大量の欠損を検出するために、被験個
体からのDNAについてサウザーン・ブロット分析を行な
った。このDNAは末梢白血球から得られ、患者が１つの
眼に腫瘍を有するときは該腫瘍から得られた。白血球を
DNAを検査するために、10mlの血液試料を個体から得、
標準的方法によって該試料中の白血球からゲノムDNAを
単離した。このDNAを制限エンドヌクレアーゼ、たとえ
ばHind IIIで切断し、アガロース電気泳動ゲル上を泳動
させ、ブロッティングによりニトロセルロースフィルタ
ーに移した。フィルター上のDNAを次いで放射標識され
たp2AR3.8およびp2AR0.9（EcoR Iによる切断によって得
られたp4.7Rからのサブフラグメントを含む）で別々に
プローブした（第４図）。検出された異常の位置をより
明確に決定するためには、p4.7R挿入物全体よりむしろ
２つ以上の断片を別々に使用することが好ましい。プロ
ーブされたフィルターのオートラジオグラムによって、
試験された個体の体細胞または腫瘍DNAにおけるRb部位
の制限地図が得られた。 この制限地図を、対照制限地図であって、同一の制限
酵素による切断とプローブを使用して決定した地図と比
較した。適当な対照は、１組の正常な個体からのアデノ
ビールス−形質転換網膜細胞株または白血球のDNAから
得られたDNAであり得る。被験個体が有意に大きな欠損
を含むRbアレルを有するならば、彼のDNAの制限地図
は、対照と比較して、Rb部位における１つのアレルにお
ける欠失による１つまたはそれ以上の制限断片の、１つ
またはそれ以上のバンドを余計に含み、および／あるい
はサイズの変化によって生じた、強度が50％低下した１
つまたはそれ以上のバンドを含むか、あるいは該バンド
が全面的に欠除しているであろう。 正常Rb遺伝子の単離 網膜芽腫を生起せしめるのに含まれる遺伝子的位置は
ヒト染色体13のq14帯域であると決定されている。〔par
kerら，サイエンス（Science）208:1042（1980）〕DNA
のこの領域からのcDNAクローンであるp4.7RはRb遺伝子
配列を担持することが示されている。このクローンは下
記一般的技術により得られた。 cDNAクローンp4.7Rの単離 ヒト染色体13ラムダファージライブラリーから単離さ
れたヒトDNAプローブpH3−８（Lalandeら,1984,Cancer
Genet.Cytogenet.13:283）を染色体移動技術において使
用してH3−８配列を囲む30kbの染色体DNAを単離し地図
を作製した。この技術によって生成した１つの断片、す
なわちp7H30.7Rを見出してヒト染色体13ばかりでなくマ
ウスの染色体にもDNA配列を確認した。（Dryjaら,1986,
Proc.Nat.Acad.Sci.USA）ヒトとマウスの両方のDNAにつ
いてp7H30.7Rの相同性があることはp7H30.7Rが構造遺伝
子のコード配列を含むことを示唆した。 この可能性を試験するために、p7H30.7Rを放射標識
し、３つの網膜芽腫（＃42,＃30および＃31）およびア
デノビールス12−形質転換ヒト胎児網膜細胞株（Ret）
（Vaessenら,1986,EMBO Journal5:335）から単離される
RNAのノーサーンブロットをプローブした。このp7H30.7
Rプローブは網膜細胞株からの約4.7kbのRNA転写物に対
してハイブリッド形成したが、上記３つの腫瘍試料から
のRNA転写物に対してはハイブリッド形成しなかった
（第１図）。 続いて、アデノビールス形質転換網膜細胞株から単離
されたRNAを使用してcDNAライブラリーを造成した。こ
のライブラリーを標識されたp7H30.7Rプローブによって
スクリーニングした。類似の制限地図を有するいくつか
のcDNAクローンが単離された。それらのもっとも大きな
ものであるp4.7は4.7kbのゲノムDNAを含んでいた。p4.7
Rの制限地図は第２図に示した。 p4.7Rの特定 網膜芽腫（＃42,＃30,＃41,＃31）；骨肉腫（＃16）
およびアデノビールス−形質転換網膜細胞（Ret）から
単離されたRNA転写物をスクリーニングするのにp4.7ク
ローンを使用した。第３図に示されるように、p4.7Rプ
ローブは、単離されたRNA転写物のノーサーンブロット
分析において、４つの網膜芽腫および１つの骨肉腫細胞
試料において存在しない形質転換網膜細胞における転写
物を検出した。2.0kb以下のバンドは、ノーサーンブロ
ットをラットタブリン（tubulin）を検出するプローブ
で洗った後に再プローブする（ブロットにおけるRNAの
存在を示す）ことによって検出された。 p4.7RクローンもゲノムDNAをスクリーニングするのに
使用した。40個の網膜芽腫、８つの骨肉腫および網膜芽
腫の遺伝形質を有する患者の未知の細胞の未確認腫瘍２
つからなる50人の非血族の患者からの各腫瘍１組からDN
Aを単離した。単離されたDNA試料をHind IIIで切断し、
プローブとして放射標識したp4.7Rを使用してサウザー
ンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。こ
の分析により、ゲノムDNA制限断片の３つの異なったパ
ターン： すなわち、見掛け上の同型接合欠失を示す全面的に不
存在の断片；見掛け上の異型接合欠失を示す不顕化断
片；および制限部位の部分的欠失または変化のいずれか
を示す、サイズが変化した断片を示した。腫瘍DNAの少
くとも30％はこれらの異常のうち１つを示した。比較の
ため、18人の正常な個体からの白血球DNAをサウザーン
ブロット分析して制限断片の均一なパターンを示した。 上記結果はp4.7RがRb遺伝子を欠失することを示す。
１つの骨肉腫DNA試料中の欠失パターンはp4.7RがRb遺伝
子を検出する特に良い証拠を提供する。このDNA試料
は、p4.7R領域内に全体が位置する欠失については同型
接合である。骨肉腫表現型はこの欠失とは関係なく生じ
るということはとてもありそうにない。欠失はp4.7R領
域に限定されるので、この領域は、当然変異を生じたと
き非機能Rb−コード化蛋白質を産正するRb遺伝子を含ん
でいるにちがいない。機能Rb蛋白質が存在しないと新生
物の表現型を形成する。 用途 本発明の方法でp4.7配列を使用するとRb遺伝子の突然
変異アレルの存在について個体をスクリーニングでき
る。このスクリーニング方法を使用すれば、１つの眼に
網膜芽腫の家族歴または既応症があるため網膜芽腫を発
病するおそれのある個体が現在の眼の検査によって日常
的な検査を受ける必要を決定する。もし、スクリーニン
グで個体が突然変異Rbアレルを有することが決定された
場合のみ、定期的に検査を行う必要があろう。２つの正
常なRbアレルを有する患者は検査を中止できる。という
のは、Rb遺伝子の２つの正常な複製物を有する個体が網
膜芽腫を発病する危険性は、アレルを不活性化するに充
分な突然変異を含むRbアレルを患者が有している場合の
危険率80〜90％に比べて、約20000分の１、すなわち0.0
05％であるからである。このように、現在定期的に検査
されている患者の大部分が実際には一般的な人々を越え
る危険にさらされているわけではなく；網膜芽腫の家族
歴も既応症も個体がこの病気に遺伝的にかかりやすいと
いう包括的な証拠にはならない。したがって、実際にRb
遺伝子の２つの正常な複製物を担持しているそのような
個体は不必要な高価且つ外傷性の眼の検査を繰返し受け
てきたことになる。 本発明のスクリーニング方法は好ましくは主として２
つのタイプからなる：（１）Rbプローブに対するハイブ
リダイゼーションを妨害するに充分大きなRb位置におけ
る欠失についての個体のDNAを試験すること、および
（２）Rb位置における小さな欠失すなわち点突然変異に
ついて個体のDNAを試験すること。 スクリーニングに加えて、本発明は、突然変異体Rbア
レルを含むことが決定され、したがって網膜芽腫を発病
するおそれのある患者のための蛋白質療法を提供するの
に役立つ。 本発明のもう１つの用途は、上述の如く、たとえば特
定の腫瘍がRb遺伝子の異常によるものか否か決定する免
疫学的診断である。骨肉腫および特定の未確認腫瘍はRb
遺伝子の検出可能な障害から生じるので、免疫学的診断
を使用してそのような腫瘍の診断を助けることができ
る。 下記例により本発明を説明する。 このようにしてサウザーン分析によるスクリーニング
方法は大きな欠失を有する非機能Rbアレルの存在を検出
するであろう。もしこの分析により固体からの被験DNA
が対照の制限地図と異なる制限地図を有することを示す
場合、当該個体が非機能突然変異Rbアレルを含むという
大きな可能性がある。この個体は今後網膜芽腫の発病に
ついて厳密に監視されなければならない。 もし、被験制限地図が対照と同一であれば、異なるス
クリーニング方法をその個体のDNAについて実施してそ
の個体が小さな欠失すなわち点突然変異を有するRbアレ
ルを含むか否かを決定する。これは該アレルを不活性化
するのに充分であるがプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを防止するには不充分である。スクリーニング方法
は下記例に記載する。 実施例2:Rb位置の精密な構造分析 Rb位置の小さな欠失または点突然変異について個体の
DNAを検査するために該個体からのRb遺伝子の両方の相
同体をクローニングしたアレルを次いで下記の２つの方
法のうちの１つによって、p4.7Rと表わされる正常アレ
ルとの配列の相違があるか否かについて試験する：
（１）クローニングしたアレルおよびp4.7Rの両方のヌ
クレオチド配列を決定し比較する、あるいは（２）p4.7
RからのRNA転写物を被験者からの一本鎖全ゲノムDNAに
対してハイブリッド形成させ、得られたヘテロ二本鎖を
RNA分解酵素Ａで処理して変性ゲル上で泳動させて誤対
合の位置を検出する。より詳しくは、これらの方法は下
記の如く行なわれる： （１） Rbアレルのクローニング 試験されるべき個体のRb遺伝子のアレルを従来の技術
を使用してクローニングした。普通の方法はたとえばバ
クテリオファージベクターEMBL3（Frischaufら,1983,j.
Mol.Biol.170:827）を使用する。10mlの血液試料を個体
から得、ゲノムDNAをこの試料の細胞から単離した。こ
のDNAをMbo Iで部分的に切断して平均サイズ約20kbの断
片にした。18〜21kbの断片を単離した。得られたMbo I
−末端断片をBamH Iで完全に切断し、アルカリホスファ
ターゼで処理し、68℃に10分間加熱して接着末端を分断
しておいたEMBL3ベクターDNAに結合させた。このリゲー
ションミックスをインビトロラムダパッケージング反応
で使用し、プレートストックを生育させることにより、
パッケージされたファージを増殖させた。〔このクロー
ニング技術はマニアティス（Maniatis）ら，モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Clonig）:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Publications,256−293頁
（1982）に一般的に記載されている〕 このプレートストックからの約５×105pfuを使用して
3mlの大腸菌（E.coli）（0.01MμgSO4中〜1.5×109個/m
lの菌体）に感染させ、この感染混合物を37℃で20分間
インキュベートした。47℃で頂部を融解させた寒天65ml
を加え、この混合物を新しく注入され底部に乾いた寒天
を含む10枚の150mmプレート上に塗布した。プラークが
〜1.5mmの直径となり互いに接触し始めるようになるま
で（約10〜12時間）インキュベートした。 二重の円状のニトロセルロースフィルター（ミリポア
HAWP）を各寒天プレートの表面にそっと置いてバクテリ
アファージDNAを結合させた。これらのフィルターを１
分間後に注意深く取り出し、30秒間変性溶液（1.5M Na
Cl,0.5M NaOH）に入れ、５分間中和し（1.5M NaCL,0.
5Mトリス−Cl pH8.0）、80℃で２時間真空乾燥した。 次いでこれらのニトロセルロースフィルターを放射標
識したp4.7Rによりハイブリダイゼーションとオートラ
ジオグラフィーによってプローブした。p4.7Rプローブ
に対するハイブリダイゼーションを示すプラークを上記
方法によりプラーク精製し再スクリーニングした。再ス
クリーニングからの陽性プラークを単離し使用して個体
からのRbアレルを含むと推定されるDNAをつくった。 これらの単離されたEMBL3ベクターDNA試料におけるMb
o Iゲノム挿入物を、サウザーン分析によりp4.7Rと相同
の配列の位置について試験した。全Rb遺伝子領域を含有
するDNA試料を選択し、これらの試料からのRb遺伝子を
含む適当な制限断片をpUC9の７ような適当なベクターに
サブローンした。これらのサブクローンは試験される個
体のDNAからの１つまたは両方のRbアレルの複製物を含
有した。両方のアレルが発現されているか否かを決定す
るために、当初ファージ単離物を制限多形性の存在につ
い試験した。サブクローニングしたアレルを下記技術の
１つによってp4.7Rとの相違についてしらべた。 （２） 配列比較 まず、p4.7R中の正常なRb遺伝子のヌクレオチド配列
をp4.7Rからの〜500bpの制限断片をM13mp8ファージベク
ターをサブクローニングし、これらのサブクローンをデ
オキシ技術により配列することによって決定した（Sang
erら,1977,Proc.Nat.Acad,Sci USA 74:5463）。これら
の個々のサブクローン配列からRb遺伝子の配列を組立て
ることができた。この配列はフランキング領域をも示す
第７図に示されている。 単離されたRb遺伝子アレルを下記手順で配列化した。
アレルの制限断片（〜2kb）をM13mp8ベクターにサブク
ローニングし、ジデオキシ配列反応においてプライマー
としてp4.7Rから単離された小さな制限断片を使用して
いくつかの短い区域（〜500bp）を個別に配列形成し
た。次いでこの単離されたアレルの複合ヌクレオチド配
列をこれらの個別にプライムされた配列から造成した。
この配列をp4.7Rから決定された正常のRb遺伝子の配列
と直接に比較して、欠失または点突然変異が単離された
アレルに存在するか否かについてしらべた。 （３）誤対合のリボヌクレアーゼ開裂 アレルのDNAを正常Rb遺伝子と比較する別の方法はRNA
分解酵素Ａを使用してp4.7R配列とアレル配列との相違
があるか否か検出する。この比較はプローブとしてのp
4.7Rの小さな（〜500bp）制限断片により段階的に行な
われる。まず、p4.7RをRb遺伝子配列を約500bpの断片に
切断する制限酵素で切断する。これらの断片を電気泳動
ゲル上で単離し、pSR64またはpSP65ようなSP6ベクター
に両方向で別個にクローニングした（Meltonら,1984,Nu
cleic Acids Res.12:7035）、p4.7R断片の挿入物を含有
するSP6に基づいたプラスミドを、SP6転写系（当分野で
周知）を〔α−32P〕GTPの存在下に使用してRb遺伝子の
cDNAの二本鎖の放射標識RNA転写物を形成することによ
ってインビトロで転写した。 これらのRNA転写物を別個に使用してアレルDNAにより
ヘテロ二本鎖を下記の如く形成した。 50ngのアレルサブクローンを使用されるべきRNA転写
物プローブによってカバーされる領域の外を切断する制
限酵素で切断した。この切断されたDNAを30μのハイ
ブリダイゼーション緩衝液（80％ホルムアミド,40mMパ
イプス（Pipes）pH6.4,0.4M NaCl,および1mM EDTA）中
で放射標識RNAと混合し、混合物を90℃で10分間処理し
てDNAを変性した。次いでこの混合物をゆっくりと45℃
に冷却してRNAを45℃で30分間一本鎖DNAにアニーリング
した。このRNA:DNAヘテロ二本鎖を350μのRNA分解酵
素Ａ溶液〔シグマ（Sigma）〕（10mMトリス−HCl pH7.
5,1mMEDTA,0.2MNaClおよび0.1M LiCl中40μg/mlの酸
素）で処理した。この混合物を渦動させ25℃で30分間イ
ンキュベートした。RNA分解酵素Ａ反応を10μのプロ
テイナーゼＫ（10mg/ml）（ベーリンガー・マンハイ
ム）の添加、続いて37℃で20分間インキュベートするこ
とによって停止させた。水性層をフェノール−クロロホ
ルムおよびエタノール沈殿により抽出して蛋白質の混入
しない核酸サンプルを得た。この沈殿した試料を５μ
に再懸濁し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％ポ
リアクリルアミド,7M尿素）を変性することによって分
析した（第５図）。 p4.7R断片と個体からのRbアレルサブクローンとの配
列の相違に起因するRNA:DNAヘテロ二本鎖に生じた誤対
合の結果、RNA分解酵素Ａ処理によりRNA鎖が開裂した。
そのような誤対合は各個体のRbアレルにおける点突然変
異または小さな欠失の結果である。RNA鎖の開裂により
２つ以上の小さなRNA断片が得られ、これらは第６図に
示されるように変性ゲル上をRNAプローブ自体よりも速
く泳動した。 RNA分解酵素技術において、放射標識Rb遺伝子RNAをベ
クターにクローンしておいた個体のRbアレルの一本鎖に
ハイブリッドした。このRNA分解酵素技術もRbアレルを
クローニングしないでも使用できるので便利である。好
ましくは、ゲノムDNAは試験されるべき個体の血球から
単離され、このゲノムDNAは放射表域Rb RNAプローブと
直接ハイブリッドを形成して下記の如く正常なRb遺伝子
との配列上の相違を決定した。単離されたゲノムDNA総
量のうち５μｇを30μのハイブリダイゼーション緩衝
液（80％ホルムアミド,40mMパイプスpH6.4,0.4M NaCl
および1mM EDTA）中の標識RNAプローブとともに再懸濁
し、このハイブリダイゼーション混合物を90℃で10分間
処理してDNAを変性した。次いでこの混合物をゆっくり4
5℃に冷却し、この温度で10時間インキュベートしてRNA
プローブをRbアレルの一本鎖DNA複製物に対してハイブ
リッド形成させた。ハイブリッド形成後、上述の如くRN
A分解酵素Ａ処理と電気泳動を行なった。RNAプローブと
各個体のRbアレルのゲノム複製物とのヘテロ二本鎖にお
ける誤対合は容易に検出できた。 実施例3:蛋白質療法 p4.7Rと表されるように正常Rb遺伝子のクローニング
したcDNAについてのもう１つの用途は、Rb遺伝子の欠損
アレルを有すると決定された個体の治療のためのRb蛋白
質を産生することである。これらの個体における網膜芽
腫の形成を防止するために、Rb遺伝子産生物をこれらの
個体に治療に有効なように投与する。p4.7RからのRb cD
NAを適当な哺乳類の発現ベクターにクローニングし、こ
のベクターからのRb蛋白質をインビボ発現系で発現さ
せ、発現系の培地または細胞Rb蛋白質を単離することに
よってRb蛋白質が産生される。一般的なインビトロ発現
ベクターおよびシステムは当分野で周知である。 実施例4:免疫学的診断 上述の如く産生さたRb蛋白質をウサギに注射して抗−
Rb抗体を産生させ、次いでこれを放射能、蛍光などで、
あるいはアルカリホスファターゼのような酵素で標識し
た。この標識した抗体を使用してヒト腫瘍が欠損Rb遺伝
子由来のものか否か決定した。たとえば、この腫瘍試料
を液化し、通常のELISAフォーマットを使用して標識さ
れた抗体に対して試験した。別法として、腫瘍部分を固
定し標識抗体と反応させ、免疫複合体を抗体上の認識の
タイプに応じてオートラジオグラフィーまたは蛍光顕微
鏡で検出できる。Rb遺伝子産生物に対する抗体と反応性
の抗原を欠く腫瘍は網膜芽腫遺伝子の突然変異に起因す
る。突然変異Rb遺伝子によって生起されることが知られ
ている腫瘍は、網膜芽腫および骨肉腫を含めてわずかな
ので、Rb遺伝子産生物を欠く腫瘍の分別診断はそのよう
な試験によって非常に明確にされる。 寄託 プラスミドp2AR3.8およびp2AR0.9は1987年７月17日に
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリ
ーランド州，ロックビル）に各々ATCCNo.40,241と40,24
2として寄託された。 本出願人であるマサチューセッツ・アイ・エンド・イ
アー・インファーマリーは、ATCCは寄託物の永続生を保
証する寄託機関であって、特許が許可されたときは公衆
に容易に分譲されることを表示する。この寄託物の分衆
への分譲についてのすべての制限は特許の許可と同時に
不可逆的に取り除かれよう。寄託物は、37CFR1.14およ
び35USC122の下に資格のある長官によって決定された者
に対して、この特許出願係属中分譲されよう。寄託物は
それを生存させておくに要するすべての管理により維持
され、寄託微生物の試料の提供についてのもっとも最近
の申請から少くとも５年間、およびとにかく、寄託の日
から少くとも30年間あるいは特許権の存続期間のいずれ
か長い方の間不純物の混入がないように管理されよう。
本出願人は、寄託期間が寄託物の状態に起因して、要請
のあった試料の提供を行うことができないときは寄託物
の補充する業務を認める。 他の具体例も前記特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
第１図はp7H30.7Rによってプローブされたノーサンブロ
ットからのオートラジオグラムを図示したものであり； 第２図はクローンp4.7Rにおける挿入物の制限地図の概
略図であり； 第３図はp4.7Rによりプローブされたノーサンブロット
のオートラジオグラフィーを図示したものであり； 第４図は本発明のベクターp2AR3.8とp2AR0.9の概略図で
あり； 第５図は誤対合検出技術の概略図であり； 第６図は誤対合検出に使用されたゲルを変性する例の概
略図であり； 第７図はフランキング領域を有する正常なRb遺伝子の配
列である。
ットからのオートラジオグラムを図示したものであり； 第２図はクローンp4.7Rにおける挿入物の制限地図の概
略図であり； 第３図はp4.7Rによりプローブされたノーサンブロット
のオートラジオグラフィーを図示したものであり； 第４図は本発明のベクターp2AR3.8とp2AR0.9の概略図で
あり； 第５図は誤対合検出技術の概略図であり； 第６図は誤対合検出に使用されたゲルを変性する例の概
略図であり； 第７図はフランキング領域を有する正常なRb遺伝子の配
列である。
フロントページの続き
(72)発明者 タデュース・ピー・ドライジャ
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
02186，ミルトン，フォーブス・ロード
85
(72)発明者 スティーブン・フレンド
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
02143，サマーヴィル，スペンサー・ア
ベニュー 14
(56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．208
（1980） Ｐ．1042−1044
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．精製単離されたヒト網膜芽腫遺伝子又はその部分領
域で長さが少なくとも20個の塩基からなる精製された核
酸であって、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異し
て不活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第
13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、その
cDNAが以下に示す制限酵素地図を有することを特徴とす
る核酸。 ２．精製単離されたヒト網膜芽腫遺伝子又はその部分領
域で長さが少なくとも20個の塩基からなる精製された核
酸であって、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子がcDNAであり、以下に示す制限
酵素地図を有することを特徴とする核酸。 ３．前記ヒト網膜芽腫遺伝子が該ヒト網膜芽腫遺伝子の
ゲノムDNAであることを特徴とする特許請求の範囲１に
記載の核酸。 ４．前記核酸が前記ヒト網膜芽腫遺伝子と相補するRNA
であることを特徴とする特許請求の範囲１に記載の核
酸。 ５．ヒト網膜芽腫遺伝子又はその部分領域で長さが少な
くとも20個の塩基からなる核酸を含むベクターであっ
て、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異し
て不活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第
13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、か
つ、そのcDNAが以下に示す制限酵素地図を有することを
特徴とするベクター。 ６．外来からベクターを導入することにより形質転換さ
れた細胞であって、 前記ベクターが、ヒト網膜芽腫遺伝子又はその部分領域
で長さが少なくとも20個の塩基からなる核酸を含み、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異し
て不活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第
13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、か
つ、そのcDNAが以下の制限酵素地図を有することを特徴
とする形質転換された細胞。 ７．前記核酸が特異的に前記ヒト網膜芽腫遺伝子とハイ
ブリッド形成条件下でハイブリッドを形成することを特
徴とする特許請求の範囲１に記載の核酸。 ８．ヒト患者の網膜芽腫遺伝子における欠失を該患者が
新生物を発育させる素因を有することの表示として検出
する方法であって、 （ａ）前記患者からの核酸試料に、精製単離されたヒト
網膜芽腫遺伝子又はその部分領域で少くとも20個の塩基
の長さからなる核酸プローブをハイブリダイズさせる工
程であって、前記ヒト網膜芽腫遺伝子が対立遺伝子の双
方が変異して不活性化することにより網膜芽腫を引き起
こすヒト第13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子で
あり、かつ、そのcDNAが以下の制限酵素地図を有し、 （ｂ）前記核酸プローブと前記核酸試料とのハイブリッ
ド形成を検出する工程と、を含み、 前記核酸試料に対するハイブリッド形成の欠如が前記患
者の網膜芽腫遺伝子における欠失を示唆することを特徴
とする検出方法。９．ヒト患者の網膜芽腫遺伝子における欠失を上記患者
が新生物発育の素因を持つことの表示として検出する方
法であって、 （ａ）前記患者からの核酸試料の成分又は前記成分から
生成された核酸断片を物理的性質に従って分離する工程
と、 （ｂ）前記成分又は断片に精製単離されたヒト網膜芽腫
遺伝子またはその部分領域で少くとも20塩基からなる核
酸プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記
ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異して不
活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第13番
染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、かつ、そ
のcDNAが以下の制限酵素地図を有し、 （ｃ）上記プローブと上記成分或いは断片との間のハイ
ブリッドを検出する工程と、 （ｄ）上記ハイブリッドを、上記プローブと野生型の網
膜芽腫遺伝子から分離された核酸断片とのハイブリッド
形成から検出されたハイブリッドと比較する工程とを含
み、 ハイブリッドが存在しないこと又は前記ハイブリッドの
小型化が上記患者の網膜芽腫遺伝子における欠失を示す
ことを特徴とする検出方法。 １０．前記物理的性質が分子量であることを特徴とする
特許請求の範囲９に記載の検出方法。 １１．ヒト患者の網膜芽腫遺伝子における変異を検出す
る方法であって、 （ａ）上記患者からの網膜細胞芽腫の対立遺伝子又はそ
の部分領域の塩基配列を決定する工程と、 （ｂ）上記塩基配列を、網膜細胞芽腫に罹っていないヒ
トから単離したヒト網膜細胞芽腫対立遺伝子又はその部
分領域の対応する塩基配列と比較する工程とを含み、 前記ヒト網膜細胞芽腫対立遺伝子が、ヒト第13番染色体
長腕14バンドから由来し、かつ、そのcDNAが以下の制限
酵素地図を有することを特徴とする検出方法。 １２．ヒト患者の網膜芽腫遺伝子における変異を検出す
る方法であって、 上記患者からの核酸試料と精製単離されたヒト網膜芽腫
遺伝子或いはその部分領域で少くとも20塩基からなる検
出可能な拡散プローブとの間のミスマッチを検出する工
程を含み、 前記核酸プローブが網膜細胞芽腫に罹っていないヒトか
ら調製され、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異し
て不活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第
13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、か
つ、そのcDNAが以下の制限酵素地図を有し、 また、前記ミスマッチの検出が上記患者の網膜芽腫遺伝
子に変異の存在を表示することを特徴とする検出方法。 １３．精製単離されたヒト網膜芽腫遺伝子又はその部分
領域で長さが少なくとも20個の塩基からなる精製された
核酸、或いはこの核酸を含むベクターとを用いて網膜細
胞芽腫ポリペプチドを生成する方法であって、上記核酸
或いは上記ベクターから上記ポリプペチドを発現する工
程を含み、 前記ヒト網膜芽腫遺伝子が、対立遺伝子の双方が変異し
て不活性化することにより網膜芽腫を引き起こすヒト第
13番染色体長腕14バンドに位置する遺伝子であり、か
つ、そのcDNAが以下の制限酵素地図を有することを特徴
とする網膜細胞芽腫ポリペプチド生成方法。
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| CA2014473A1 (en) * | 1989-04-14 | 1990-10-14 | Hong-Ji Xu | Purified, highly specific antibodies against gene products including retinoblastoma and method |
| US5262321A (en) * | 1991-05-31 | 1993-11-16 | Dana-Farber Cancer Institute | DNA encoding p107 tumor suppressor |
| TW346397B (en) * | 1991-10-17 | 1998-12-01 | Univ California | Cell cycle controlling compositions and methods of using same |
| WO1994008049A1 (en) * | 1992-10-01 | 1994-04-14 | The General Hospital Corporation | Functional assay for tumor suppressor genes |
| JPH06296489A (ja) * | 1992-11-20 | 1994-10-25 | Univ Texas Syst | 網膜芽腫−関連タンパク質をコードする細胞性遺伝子 |
| US5496731A (en) * | 1993-03-25 | 1996-03-05 | Xu; Hong-Ji | Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy |
| AU7834994A (en) * | 1993-09-13 | 1995-04-03 | Canji, Inc. | Therapeutic use of the retinoblastoma susceptibility gene product |
| US5550020A (en) * | 1994-07-08 | 1996-08-27 | Visible Genetics Inc. | Method, reagents and kit for diagnosis and targeted screening for retinoblastoma |
| US6974666B1 (en) * | 1994-10-21 | 2005-12-13 | Appymetric, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
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| US5670325A (en) * | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| US5741650A (en) * | 1996-01-30 | 1998-04-21 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting colon cancer from stool samples |
| US6203993B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
| US6146828A (en) * | 1996-08-14 | 2000-11-14 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor |
| US6300077B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-10-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for the detection of nucleic acids |
| US6100029A (en) * | 1996-08-14 | 2000-08-08 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of chromosomal aberrations |
| US5928870A (en) * | 1997-06-16 | 1999-07-27 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6020137A (en) * | 1996-08-14 | 2000-02-01 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
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| US6268136B1 (en) | 1997-06-16 | 2001-07-31 | Exact Science Corporation | Methods for stool sample preparation |
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