ES2269102T3 - Procedimientos para conservar la integridad del adn. - Google Patents
Procedimientos para conservar la integridad del adn. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2269102T3 ES2269102T3 ES00904537T ES00904537T ES2269102T3 ES 2269102 T3 ES2269102 T3 ES 2269102T3 ES 00904537 T ES00904537 T ES 00904537T ES 00904537 T ES00904537 T ES 00904537T ES 2269102 T3 ES2269102 T3 ES 2269102T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- sample
- edta
- pcr
- feces
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Procedimiento para conservar la integridad del ADN en una muestra seleccionada de entre una muestra de heces o una muestra que contiene células exfoliadas, com- prendiendo el procedimiento exponer la muestra a EDTA en un intervalo entre 0, 250 gramos de EDTA por gramo de muestra y aproximadamente 0, 782 gramos de EDTA por gramo de muestra, siendo la concentración de EDTA en la muestra de por lo me- nos 16 mM, para conservar la integridad de ADN en la muestra.
Description
Procedimientos para conservar la integridad del
ADN.
\global\parskip0.850000\baselineskip
La presente solicitud reivindica la prioridad y
el beneficio de la solicitud de patente provisional U.S. número de
serie 60/122.177, presentada el 25 de febrero de 1999.
La invención proporciona procedimientos para la
extracción de ácido desoxirribonucleico ("ADN") de una muestra
biológica. Más particularmente, la invención se refiere a
procedimientos para la extracción de ADN de alto rendimiento de una
muestra biológica heterogénea mediante la inhibición de la
degradación del ADN.
El ADN es una molécula relativamente estable que
se aisla rutinariamente de las muestras biológicas. Recientemente,
se han caracterizado muchas enfermedades que implican
inestabilidades (por ejemplo mutaciones) en ADN genómico. Además,
se han identificado muchos patógenos por la presencia o ausencia de
un ADN particular en una muestra biológica. Muchas enfermedades,
tales como el cáncer, se detectan óptimamente temprano en su
evolución. Con el fin de que la detección precoz resulte eficaz,
deben detectarse niveles relativamente bajos de ADN indicativo de
cáncer contra un fondo elevado de otro ADN (por ejemplo ADN humano
normal, ADN bacteriano, etc.). Este tipo de detección resulta
técnicamente difícil y típicamente resulta en una sensibilidad de
detección reducida. Además, en determinados espécimenes complejos,
incluyendo las heces, el poco ADN específico de especie que existe,
resulta rápidamente degradado, dificultando todavía más la detección
específica de secuencia eficiente. De esta manera, existe una
necesidad de procedimientos para conservar la integridad del ADN en
una muestra, especialmente en muestras en las que el ADN que debe
detectarse se encuentra en una proporción reducida respecto a otro
ADN en la muestra y resulta rápidamente degradado.
El documento WO 93/20235A da a conocer un
procedimiento para aislar ácidos nucleicos de un espécimen de heces,
que se utiliza para detectar mutaciones asociadas con la neoplasia
gastrointestinal. Los reactivos utilizados para llevar a cabo el
aislamiento de los ácidos nucleicos también se dan a conocer.
El documento WO 98/58081A da a conocer
procedimientos para la preparación de muestras de heces para
incrementar el rendimiento de ADN relevante y proporciona además
procedimientos para aislar y para analizar ADN diana para
características indicativas de cáncer colorrectal. También se
proporcionan procedimientos para cribar pacientes con presencia de
lesiones colorrectales cancerosas o precancerosos.
El documento DE 195 30 132.3 da a conocer un
procedimiento para purificar, estabilizar y/o aislar ácidos
nucleicos de materiales biológicos, estando caracterizado dicho
procedimiento porque se añade una matriz de absorción basada en
carbohidratos (por ejemplo harina de patata) a una muestra de
material biológico que contiene ácidos nucleicos con el fin de
unirse a las impurezas.
En Science Vol. 256, páginas
102-105, 1992, Sidransky et al. enseñan que
los tumores colorrectales (CR) habitualmente son curables si se
detectan antes de la metástasis. Debido a que las alteraciones
genéticas se asocian al desarrollo de estos tumores, pueden
encontrarse genes mutantes en las heces de los individuos con
neoplasmas de CR. Se analizaron las heces de nueve pacientes cuyos
tumores contenían mutaciones de K-ras. En ocho de
los nueve casos, las mutaciones ras resultaron detectables en ADN
purificado a partir de las heces. Entre estos pacientes se incluían
aquellos con neoplasmas benignos y malignos de epitelio colónico
proximal y distal. De esta manera, los tumores colorrec-
tales pueden detectarse mediante un procedimiento no invasivo basado en la patogénesis molecular de la enfermedad.
tales pueden detectarse mediante un procedimiento no invasivo basado en la patogénesis molecular de la enfermedad.
En un aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento para conservar la integridad del ADN en una muestra
seleccionada de una muestra de heces o de una muestra que contiene
células exfoliadas, comprendiendo el procedimiento exponer la
muestra a EDTA en un intervalo de entre 0,250 gramos de EDTA por
gramo de muestra y aproximadamente 0,782 gramos de EDTA por gramo
de muestra, siendo la concentración de EDTA en la muestra de por lo
menos 16 mM, para conservar la integridad del ADN en la muestra.
Los aspectos preferentes de la invención se
indican en las reivindicaciones 2 a 6.
La presente invención proporciona procedimientos
para conservar la integridad del ADN en una muestra. En una
realización preferente, los procedimientos de la invención evitan la
degradación del ADN mediada enzimáticamente. La conservación de la
integridad del ADN facilita el aislamiento y detección del ADN.
Los procedimientos de la invención resultan
especialmente útiles para extraer o detectar ADN en un espécimen
biológico, especialmente uno que contenga niveles reducidos de ADN
relevante. Un buen ejemplo de un espécimen que contiene niveles más
reducidos de ADN relevante son las heces. Las heces humanas típicas
contienen sólo cantidades reducidas de ADN humano intacto. La mayor
parte del ADN humano en las heces de un individuo sano
presumiblemente procede de células epiteliales exfoliadas, y ha
experimentado degradación apoptótica. A medida que las heces en
formación pasan a través del colon, las células epiteliales
colónicas se desprenden sobre las heces como parte del recambio
celular que se produce en el colon. Las heces también contienen
células desprendidas de otras fuentes luminales (por ejemplo,
pulmón, estómago, esófago, etc.). Las células desprendidas
típicamente han pasado o están pasando la apoptosis, dejando ADN
celular en fragmentos pequeños. Algunos enzimas, tales como la
desoxirribonucleasa ("ADNasa") y la nucleasa microcócica
contribuyen a la degradación de cualquier ADN humano intacto
restante. Los procedimientos de la técnica anterior, aunque utilizan
inhibidores de ADNasa, no han podido conseguir rendimientos
significativos de ADN específico de especie intacto de las heces.
Por lo tanto, estos procedimientos no han considerado la
optimización de la inhibición de la degradación del ADN. Los
procedimientos de la invención se basan en la comprensión de que la
inhibición óptima del enzima o enzimas degradativos del ADN
conserva eficazmente el ADN, espe-
cialmente los fragmentos de ADN grandes relevantes para el diagnóstico que se encuentran presentes en una muestra.
cialmente los fragmentos de ADN grandes relevantes para el diagnóstico que se encuentran presentes en una muestra.
En un aspecto, la invención comprende inhibir la
degradación de los ácidos nucleicos en una muestra y opcionalmente
extraer un ADN diana con, por ejemplo, una extracción con
fenol-cloroformo. Preferentemente, la inhibición de
la degradación de los ácidos nucleicos resulta suficiente para
producir un número crítico de moléculas de ADN analizable. En una
realización, los procedimientos de la invención comprenden inhibir
un enzima capaz de degradar el ADN en una muestra de heces. En una
realización preferente, los procedimientos de la invención
comprenden exponer una muestra de heces a un quelante iónico, tal
como un quelante ion divalente. Los quelantes iónicos, en
determinadas realizaciones inhiben la ADNasa. Entre los ejemplos de
inhibidores preferentes se incluyen el ácido
etilendiaminotetraacético ("EDTA"). Los procedimientos
preferentes adicionales de la invención comprenden exponer una
muestra de heces a un inhibidor de nucleasa microcócica, tal como
EGTA, que también es un quelante ion divalente. Los inhibidores de
la degradación del ADN pueden utilizarse solos o en combinación para
conseguir niveles óptimos de conservación del ADN.
Los procedimientos de la invención se ponen en
práctica utilizando cualquier inhibidor de la degradación del ADN.
La cantidad de inhibidor varía dependiendo del inhibidor que se
utilice. Sin embargo, debe utilizarse un inhibidor en una cantidad
que conserve niveles significativos de ADN en la muestra para el
análisis posterior. Los procedimientos para determinar los niveles
suficientes de ADN se presentan más adelante. Estos procedimientos
permiten al experto en la materia poner en práctica la invención con
especificidad independientemente del inhibidor utilizado. De
acuerdo con los procedimientos preferentes, se utiliza una cantidad
de inhibidor que conserva suficiente ADN en la muestra para la
detección de un ADN diana dentro de un nivel deseado de confianza
estadística. Mediante la utilización de los procedimientos descritos
en la presente memoria, el experto en la materia puede determinar
una cantidad apropiada de cualquier inhibidor para la utilización en
los procedimientos de la invención. La utilización de diversos
inhibidores específicos se ejemplifica más adelante.
En otra realización preferente, los
procedimientos de la invención comprenden obtener una muestra
representativa de heces (circunferencial o transversal), exponiendo
la muestra o una parte de la misma a un inhibidor de ADNasa, y
aislando el ADN de la muestra. Un inhibidor preferente de ADNasa es
el EDTA. Las cantidades preferentes de EDTA se encuentra
comprendidas entre 0,042 g por gramo de heces y aproximadamente
0,782 g por gramo de heces, y especialmente entre 0,250 g por
gramo de heces y aproximadamente 0,521 g por gramo de heces. El ADN
puede extraerse, por ejemplo, mediante una extracción con
fenol-cloroformo. Tras la extracción, el ADN puede
analizarse mediante procedimientos conocidos de la técnica. Por
ejemplo, la patente U.S. No. 5.830.665 y la patente U.S. No.
5.670.325 dan a conocer procedimientos para analizar el ADN que ha
sido extraído de una muestra de heces.
Los procedimientos de la invención resultan
útiles en cualquier muestra en la que se desee la inhibición de la
degradación del ADN. Por ejemplo, los procedimientos de la invención
resultan especialmente eficaces en muestras que comprenden células
exfoliadas, especialmente células epiteliales exfoliadas. El ADN
contenido en estas muestras típicamente se degrada rápidamente,
dificultando el análisis de un ADN particular, especialmente de uno
existente en proporción reducida dentro de la muestra. Por ejemplo,
entre estas muestras se incluyen heces, esputo, orina, pus y
calostro. Entre los procedimientos de la invención se incluyen
inhibir la degradación del ADN en estas muestras, conservando de
esta manera una cantidad suficiente de ADN para la detección
sensible específica. Cualquiera de las características indicadas
anteriormente, tales como los inhibidores de la degradación del ADN
o las cantidades utilizadas de los inhibidores, pueden resultar
útiles en muestras que contienen células exfoliadas.
La fig. 1 muestra un gráfico de flujo que
describe un aspecto de la invención.
La fig. 2 muestra un gel de separación de ADN
aislado a partir de varios sobrenadantes homogeneizados de heces
diferentes que contenían diversas concentraciones de EDTA.
La fig. 3 muestra un gel de separación de ADN
aislado a partir de sobrenadante de heces homogeneizado que contenía
diversas concentraciones de EDTA seguido de la captura y la
amplificación.
La fig. 4 muestra un gel de separación de ADN
aislado a partir de sobrenadante de heces homogeneizado que contenía
diversas concentraciones de EDTA seguido de la captura, la adición
de más ADN, y la amplificación.
La fig. 5 muestra un conjunto de curvas
producido mediante análisis de regresión de los datos obtenidos
utilizando el modelo tal como se describe para, por ejemplo, las
Tablas 1 y 2.
\global\parskip0.990000\baselineskip
La presente invención proporciona procedimientos
para un rendimiento incrementado de ADN en una muestra biológica
mediante la conservación de la integridad del ADN en la muestra.
Estos procedimientos resultan especialmente útiles cuando el ADN de
interés ("el ADN diana") se encuentra presente en la muestra a
una frecuencia reducida, o resulta rápidamente degradado. Más
particularmente, entre los procedimientos de la invención se
incluyen, por ejemplo, inhibir enzimas que degradan el ADN.
Previamente a la presente invención los expertos
en la materia no han tratado la prevención de la degradación del ADN
previamente a la extracción de una muestra. Típicamente, el ADN de
interés se encuentra presente en las muestras en cantidades
relativamente grandes (por ejemplo células tumorales, sangre), o los
procedimientos se destinan a incrementar la sensibilidad al ADN de
baja frecuencia, y no a conservar su integridad. Sin embargo,
especialmente en el caso del ADN de baja frecuencia en una muestra
heterogénea (por ejemplo una muestra con células y/o residuos
celulares procedentes de múltiples tipos celulares y/o organismos),
los procedimientos para incrementar la sensibilidad al ADN no han
resultado completamente exitosos. Los procedimientos de la
invención proporcionan un nuevo enfoque mediante la conservación de
la integridad del ADN. Los procedimientos de la invención
incrementan la probabilidad de detectar un ADN diana específico
debido a que estos procedimientos resultan en más ADN diana intacto
disponible en la muestra.
Con referencia a la figura 1, un procedimiento
generalizado de la invención implica obtener una muestra (etapa 2)
y exponerla a un inhibidor de la degradación del ADN (etapa 4). Tras
exponer la muestra al inhibidor de la degradación del ADN, se
extrae el ADN diana (etapa 6). La presencia o ausencia de este ADN
diana extraído seguidamente se detecta (etapa 8).
En muestras heterogéneas, tales como heces, las
ADNasas humanas endógenas y/o nucleasas bacterianas degradan el
ADN. Entre los ejemplos de nucleasas se incluyen las ADNasas, tales
como la desoxirribonucleasa I ("ADNasa I") y la nucleasa
microcócica. La ADNasa y la nucleasa microcócica requieren un catión
divalente para funcionar óptimamente. Para la ADNasa, entre los
iones adecuados se incluyen Mn^{+2} y Mg^{+2}. Para la nucleasa
microcócica, Ca^{+2} es un ion adecuado. Los quelantes iónicos, y
particularmente los quelantes de iones divalentes, son capaces de
inhibir las nucleasas. Los quelantes iónicos extraen los iones de su
asociación con la nucleasa, inhibiendo de esta manera la función de
la nucleasa. Por ejemplo, EDTA o EGTA utilizados en cantidades
óptimas resultan quelantes iónicos útiles para la utilización en la
presente invención.
Resultan útiles otros compuestos que inactivan,
interfieren o enlentecen la degradación mediada por enzimas del
ADN. Por ejemplo, los ligandos y/o anticuerpos que compiten o
interfieren con el sitio activo de los enzimas degradativos del
ADN, que inactivan estos enzimas, y/o que bloquean sistemas de
mensajero que controlan los enzimas degradativos del ADN resultan
útiles en la práctica de la invención. Los componentes de la
extracción con fenol-cloroformo, a concentraciones
más altas que aquéllas utilizadas típicamente durante la
extracción, también son capaces de inhibir las nucleasas mediante
separación y desnaturalización. Por ejemplo, el fenol desnaturaliza
los enzimas degradativos del ADN, y se utiliza en procedimientos de
la invención para conservar la integridad del ADN. Además, las
proteinasas que degradan y/o desnaturalizan los enzimas degradativos
del ADN resultan útiles.
Los procedimientos de la invención comprenden la
utilización de cantidades óptimas de inhibidores degradativos del
ADN con el fin de conservar suficiente ADN de alta integridad para
el cribado diagnóstico. En las muestras heterogéneas, tales como
heces, el ADN diana (por ejemplo el ADN mutado o las reducciones del
número de ADNs de tipo salvaje indicativos de una mutación) se
encuentra presente en cantidades reducidas. Una cantidad óptima de
un inhibidor de la degradación del ADN es una cantidad que resulta
en una mejora medible de la cantidad de ADN disponible en la
muestra. De esta manera, el experto en la materia puede determinar
empíricamente las cantidades óptimas de inhibidores de la
degradación del ADN para la utilización en los procedimientos de la
invención mediante la utilización de cantidades de inhibidor
necesarias para conservar una fracción diagnósticamente relevante
de ADN diana de alta integridad. Posteriormente se presenta un
procedimiento para determinar las cantidades de ADN diagnósticamente
relevantes.
La amplificación del ADN, y otros procedimientos
estocásticos llevados a cabo en muestras heterogéneas pueden
contribuir realmente a la incapacidad para medir el ADN de baja
frecuencia. Por ejemplo, un ADN (mutante) típico asociado a cáncer
en las etapas tempranas de oncogénesis representa aproximadamente 1%
del ADN en una muestra heterogénea (por ejemplo heces). Si el ADN en
la muestra se amplifica a una eficiencia de PCR del 30%, cualquier
ADN particular presenta únicamente una probabilidad del 30% de
resultar amplificado en cualquier ronda de PCR. De esta manera, si
un ADN mutante presente inicialmente en la muestra al 1% de una
muestra no resulta amplificado en la primera ronda de PCR, el ADN
mutante representará únicamente aproximadamente el 0,7% del ADN en
la muestra tras la ronda nº 1. Si no se amplifica ningún mutante en
las primeras dos rondas (0,7 x 0,7, o una probabilidad del 49%), el
ADN mutante representará sólo aproximadamente el 0,6% del ADN en la
muestra que entra en la ronda nº 3 de la PCR. Si el ensayo posterior
a la amplificación utilizado para detectar el mutante presenta una
sensibilidad no superior al 0,5% para el mutante, puede no resultar
posible detectar fiablemente la presencia del ADN mutante. De esta
manera, el procedimiento de detección mismo de hecho puede
contribuir a las dificultades para detectar el ADN de baja
frecuencia, especialmente si no se encuentran presentes en la
muestra cantidades suficientes de ADN intacto. De esta manera, un
medio para determinar una cantidad apropiada de inhibidor para
utilizar en los procedimientos de la invención es determinar la
cantidad mínima de ADN intacto que debe encontrarse presente en una
muestra para evitar los efectos estocásticos indicados
anteriormente, y después utilizar suficiente inhibidor para producir
por lo menos el número mínimo de moléculas de ADN en la muestra.
Los procedimientos para calcular el número mínimo de moléculas
de
ADN necesario para superar los efectos de los procesos estocásticos, tales como la PCR, se presentan posteriormente.
ADN necesario para superar los efectos de los procesos estocásticos, tales como la PCR, se presentan posteriormente.
Un modelo útil para generar suficientes
moléculas de ADN para la medición exacta funciona iterando procesos
estocásticos en varias rondas de PCR. En el contexto del diagnóstico
molecular de enfermedades, el modelo dicta el número de moléculas
que debe presentarse a la PCR para garantizar fiablemente la
amplificación del ADN diana deseado. El modelo incorpora una
eficiencia prefijada de la PCR (establecida para cumplir requisitos
de especificidad separados), y una proporción prefijada de ADN
mutante a ADN total en la muestra que debe analizarse (que es una
propiedad de la enfermedad que debe detectarse y de la naturaleza de
la muestra). Basándose en estos valores de entrada, el modelo
predice el número de moléculas que deben presentarse a la PCR para
garantizar, dentro de un nivel predefinido de confianza estadística,
que se amplificará y se detectará una molécula (diana) de baja
frecuencia. Tras determinar el número de moléculas, el experto en la
materia puede determinar el tamaño de muestra que debe utilizar
(por ejemplo el peso, volumen, etc.), dependiendo de las
características de la muestra (por ejemplo la fuente, la composición
molecular, etc.). El modelo dicta el número de moléculas que debe
presentarse a la PCR para garantizar fiablemente la amplificación y
la detección.
El modelo ejemplar simula la selección de ADN
para la amplificación a través de varias rondas de PCR. Para los
fines del modelo, se selecciona una muestra que contiene una
proporción de ADN mutante a total de 1:100 que se supone que se
encuentra en el umbral clínico de enfermedad. Por ejemplo, en el
cáncer colorrectal, el 1% del ADN humano en un espécimen (por
ejemplo heces) se encuentra mutado (es decir, presenta una deleción,
sustitución, reorganización, inversión u otra secuencia que es
diferente que una secuencia de tipo salvaje correspondiente). A lo
largo de un gran número de rondas de PCR, se seleccionarán las
moléculas tanto mutantes como de tipo salvaje (es decir, se
amplificarán) de acuerdo con su proporción en el espécimen (en este
caso, nominalmente 1 de cada 100), suponiendo la presencia de
moléculas anormales en la muestra. Sin embargo, en una ronda
cualquiera, el número de cada especie que se amplifica viene
determinado por una distribución de Poisson. A lo largo de muchas
rondas, el procedimiento se ve sometido a errores estocásticos que
reducen la capacidad de detectar ADN mutante de baja frecuencia. Sin
embargo, las primeras rondas de PCR (principalmente las dos
primeras rondas) resultan proporcionalmente más importantes cuando
debe detectarse una especie de baja frecuencia, y cualquier ronda
después de la ronda nº 10 resulta virtualmente insignificante. De
esta manera, el modelo determina la probabilidad combinada de: (1)
presentación de suficientes moléculas mutantes a la PCR, y (2) los
efectos de la amplificación estocástica sobre aquellas moléculas de
manera que a la salida de la PCR habrá un número suficiente de
moléculas y una proporción suficiente de moléculas mutantes a número
total de moléculas para garantizar la detección fiable.
El modelo utilizado para analizar el número de
moléculas necesario en la primera ronda de PCR se generó como
simulación "Monte Carlo" de mil experimentos, consistiendo cada
experimento de 10 ciclos de PCR operando en cada molécula de la
muestra. La simulación analizó: (1) obtener una muestra del
espécimen; y (2) cada ronda de PCR iterativamente, para determinar
si, en cada ronda, encontrándose presente un ADN mutante en la
muestra, resultaba amplificado. Tras completar el muestreo
iterativo, el modelo determinó el porcentaje de rondas en las que
se había amplificado una cadena mutante, el porcentaje de mutantes
que superaba un umbral predeterminado para la detección (en este
ejemplo, 0,5% basado en la proporción de mutantes:total del 1%), el
coeficiente de variación (CV) para el muestreo es-
tocástico en cada ronda por sí sola, y el coeficiente de varianza para el muestreo estocástico y la PCR combinados.
tocástico en cada ronda por sí sola, y el coeficiente de varianza para el muestreo estocástico y la PCR combinados.
Se crea ruido estocástico en la PCR si la
eficiencia de ésta no es ni 0% ni 100% (representando estos casos
que no se produce ninguna amplificación en absoluto o la fidelidad
perfecta de la amplificación específica). El nivel de señal de
ruido, o fondo, en una PCR que se encuentra comprendido entre 0% y
100% varía con la eficiencia de la PCR. La desviación estándar del
ruido estocástico, S, en una PCR viene dada por la ecuación S =
\surdnpq, en la que n es el número de moléculas en la muestra, p
es la eficiencia de la PCR, y q es 1-p. La Tabla 1
presenta los resultados obtenidos para los muestreos iterativos
fijando la eficiencia de PCR al 100% y al 20%, y una proporción de
mutantes:total del 0,5%.
La Tabla 1 representa los resultados del modelo
en 12 experimentos realizados bajo diversas condiciones. La primera
fila muestra el número nominal de moléculas que entran en la primera
ronda de PCR (es decir, el número total de moléculas disponibles
para la amplificación). La segunda fila muestra el porcentaje de
moléculas (ADN) en el espécimen biológico que se espera que sea
mutante. Para los indicios de cáncer colorrectal en ADN recuperado
de heces, el umbral de relevancia clínica en la detección del cáncer
de estado temprano es del 1%. Es decir, el 1% del ADN en una
muestra derivada de un espécimen heterogéneo (por ejemplo heces)
contiene una mutación asociada con el cáncer colorrectal. La 6ª fila
es el umbral de detección del ensayo utilizado para medir el
producto de PCR tras completar la PCR. Este número resulta
significativo, tal como se observa después, debido a que debe
producirse suficiente ADN mutante por PCR para resultar detectable
sobre la señal aberrante del ADN de tipo salvaje y del ruido
aleatorio de fondo. Bajo el título "Resultados", la primera
fila proporciona la probabilidad de que por lo menos una molécula
mutante se presente a la primera ronda de PCR. La segunda fila bajo
el título de Resultados proporciona la probabilidad de detección de
mutantes (tras la PCR) por encima del umbral de detección. Por
ejemplo, en el experimento nº 4, los resultados indican que en el
87,9% de los experimentos realizados bajo las condiciones
especificadas para el experimentos nº 4, el número de mutantes
excederá el número umbral para la detección. Finalmente, las dos
últimas filas proporcionan el coeficiente de variación para el
muestreo y para la combinación de muestreo y PCR.
Tal como se muestra en la Tabla 1, incluso a una
eficiencia de la PCR del 100%, se detecta el ADN mutante sólo en el
97,1% de las muestras al utilizar 1.000 moléculas de entrada (es
decir, cuando se encuentran disponibles 1.000 moléculas de ADN para
el cebado en el ciclo inicial de la PCR), aunque se amplifica el
100% del ADN en cualquier ronda dada de PCR. Cuando se presentan
10.000 moléculas, resulta prácticamente seguro que el ADN mutante
resultará amplificado y detectado, tal como se muestra en los
resultados del experimento nº 6 en la Tabla 1. Los errores
estocásticos debido a la variación del número de moléculas de
entrada se convierten en menos significativos con aproximadamente
500 moléculas de entrada o más (es decir, el CV de las variaciones
estocásticas es prácticamente el mismo con independencia de que la
eficiencia del PCR sea del 20% o del 100%). A una eficiencia más
baja de la PCR (del 20% en la Tabla 1), el modelo muestra que la
introducción de 50, 100, 200, 500 o incluso 1.000 moléculas en la
PCR no garantiza ni la amplificación ni la detección. Tal como se
muestra en el experimento nº 12, la introducción de 10.000 moléculas
resulta en la amplificación de la diana mutante, y en una
probabilidad elevada de su posterior detección. De esta manera,
incluso con una PCR eficiente al 100%, se produce un número
significativo de sucesos falsos negativos cuando el número de
moléculas de entrada es inferior a 500.
Los análisis anteriores muestran que existe un
intervalo único para el número de moléculas que debe presentarse a
una PCR con el fin de conseguir la amplificación de un ADN de baja
frecuencia y para permitir su detección. Este intervalo es una
función de la eficiencia de la PCR, y del porcentaje de ADN
(mutante) de baja frecuencia en la muestra, y del umbral de
detección. El modelo anteriormente indicado se desarrolló y compiló
en código de Visual Basic for Applications (Microsoft, Office 97)
para simular una PCR tal como se ha descrito anteriormente. El nivel
de confianza estadística en el que se midieron los resultados se
mantuvo constante a aproximadamente el 99%. Sólo se variaron la
eficiencia de la PCR y el porcentaje de ADN mutante. Tal como se ha
comentado anteriormente, el modelo muestra iterativamente el ADN en
una simulación "Monte Carlo" en mil experimentos, consistiendo
cada experimento de 10 rondas de PCR. Los resultados se muestran a
continuación, en la Tabla 2.
La regresión de los datos obtenidos utilizando
el modelo tal como se ha descrito anteriormente produjo el conjunto
de curvas presentado posteriormente en la figura 5.
Utilizando la figura 5, el número óptimo de
moléculas que deben presentarse a la PCR se determina mediante la
selección de una eficiencia de PCR (o determinando la eficiencia por
medios empíricos) y seleccionando un porcentaje de la muestra que
se sospecha que es ADN mutante asociado a enfermedad. Esto, a su
vez, impone un umbral de detección. No todas las estrategias de
detección presentan umbrales de detección subyacentes similares, de
manera que debe seleccionarse una tecnología apropiada. El
porcentaje de ADN mutante puede determinarse a partir de
consideraciones clínicas tal como se ha descrito de manera general
anteriormente para el cáncer colorrectal.
Puede determinarse la eficiencia de PCR y el
porcentaje esperado de mutantes con el fin de maximizar la
probabilidad de obtener ADN mutante amplificado detectable. Por
ejemplo, puede seleccionarse N, el número de moléculas de entrada
de la curva "1%" en la figura 5, cuando se espera que el 5% de
la muestra sea ADN mutante con el fin de incrementar la confianza
del resultado del ensayo.
Este modelo, y particularmente la figura 5,
resultan útiles al determinar las concentraciones óptimas de un
inhibidor de degradación del ADN. Si se utiliza PCR para analizar el
ADN tras exponer la muestra de ADN a un inhibidor de ADN, la figura
5 indicará cuántas moléculas de ADN diana deben conservarse para
disponer de suficiente ADN analizable. De esta manera, la cantidad
óptima de cualquier inhibidor de degradación del ADN puede
determinarse como esa cantidad, o intervalo de cantidades, de
inhibidor que produce un número suficiente de ADN analizable de
acuerdo con la figura 5. Evidentemente este sistema de modelado
puede aplicarse a técnicas de detección de ADN diferentes de la
PCR. Específicamente, los expertos en la materia pueden aplicar este
sistema de modelado a cualquier procedimiento y/o técnica de
detección en la que resulte problemático el ruido estocástico. De
esta manera, la cantidad óptima de cualquier inhibidor de
degradación del ADN puede determinarse basándose en el número de
moléculas de ADN que resulta suficiente para producir ADN
analizable.
Tras determinar el número de moléculas para
introducir en la PCR, se prepara una muestra que comprende ese
número de moléculas (o un número superior) para la PCR de acuerdo a
procedimientos estándar. El número de moléculas en una muestra
puede determinarse directamente mediante, por ejemplo,
procedimientos enumerativos, tales como aquellos enseñados en la
patente U.S. No. 5.670.325. Alternativamente, el número de moléculas
en una muestra compleja puede determinarse mediante concentración
molar, peso molecular, o mediante cualquier otro medio conocido de
la técnica. La cantidad de ADN en una muestra puede determinarse
mediante espectrometría de masas, densidad óptica u otro medio
conocido de la técnica. El número de moléculas en una muestra
derivada de un espécimen biológico puede determinarse mediante
numerosos medios de la técnica, incluyendo aquellos dados a conocer
en las patentes U.S. Nos. 5.741.650 y 5.670.325.
Los procedimientos tales como los descritos
anteriormente se utilizaron para determinar las cantidades mínimas
u óptimas de inhibidores de degradación de ADN para la utilización
en cualquier procedimiento de aislamiento, detección o
amplificación de ADN en el que se producen procesos estocásticos.
Mediante la utilización del modelo anteriormente descrito para
determinar el número mínimo de moléculas que debe medirse para
detectar fiablemente una especie de baja frecuencia, puede
determinarse empíricamente cuánto debe utilizarse de cualquier
inhibidor dado.
Los procedimientos de la invención resultan
útiles para analizar ADN de heces para la detección del cáncer
colorrectal. Si el cáncer colorrectal se diagnostica precozmente,
puede tratarse eficazmente mediante extirpación quirúrgica del
tejido canceroso. Los cánceres colorrectales se originan en el
epitelio colorrectal y típicamente no se encuentran extensivamente
vascularizados (y por lo tanto no son invasivos) durante las etapas
tempranas de su desarrollo. La transición a un cáncer altamente
vascularizado, invasivo y finalmente metastásico que se extiende
por todo el cuerpo habitualmente tarda diez años o más. Si el cáncer
se detecta previamente a la invasión, la extirpación quirúrgica del
tejido cancerosos resulta una curación efectiva. Sin embargo, el
cáncer colorrectal con frecuencia se detecta sólo al manifestarse
síntomas clínicos, tales como dolor y deposiciones alquitranosas
negras. Generalmente, estos síntomas se presentan únicamente cuando
la enfermedad se encuentra bien establecida, con frecuencia tras
producirse la metástasis, y la prognosis para el paciente es mala,
incluso tras la resección quirúrgica del tejido canceroso. La
detección precoz del cáncer colorrectal, por lo tanto, resulta
importante debido a que puede reducir significativamente la
morbilidad del paciente.
Los experimentos siguientes demuestran que EDTA,
un inhibidor de ADNasa, incrementa el rendimiento de ADN de alta
integridad de una muestra de heces con un incremento concomitante de
la cantidad de ADN amplificable. En estos experimentos, se
homogeneizaron tres alícuotas de heces (de 5 g cada una) en tampón
(Tris 0,5 M, NaCl 10 mM, EDTA). La proporción de tampón a heces era
de 7:1, de esta manera, se utilizaron 35 ml por cada 5 g de heces.
El tampón contenía EDTA 0 mM, EDTA 16 mM, o EDTA 96 mM. A
continuación, se diluyó cada una de las tres alícuotas con tampón
adicional (que no contenía EDTA) hasta una proporción de tampón a
heces final de 20:1. A continuación, se centrifugó cada alícuota, y
el sobrenadante, que portaba la fracción degradante de ADN activo,
se extrajo a un tubo limpio. Después, se añadió a cada tubo una
mezcla de ADN de 2 \mug de ADN de E. coli y 100 ng de ADN
genómico humano. Cada tubo se incubó durante 75 minutos a 37ºC.
Después, se añadieron a cada tubo 42 \mul de proteinasa K y 250
\mul de SDS (dodecil sulfato sódico) al 10%, seguido de la
incubación durante la noche a 37ºC. Tras la incubación durante la
noche, el ADN en cada muestra se preparó mediante técnicas estándar.
Ver, por ejemplo, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
\NAK\NAK 2.1-2.4, (Ausubel et al., 3a
edición, 1995). Generalmente, se llevó a cabo una extracción con
fenol, una extracción con fenol/cloroformo, y una extracción con
fenol previamente al aislamiento del ADN. A continuación, se
introdujo el ADN aislado en un tampón Tris estándar.
Se llevaron a cabo tres experimentos con el ADN
aislado. El primer experimento demostró que la actividad degradativa
del ADN presente en el sobrenadante homogenizado de heces resultaba
inhibida por cantidades óptimas de EDTA, incrementando la cantidad
de ADN de alta integridad. En este experimento, se aisló ADN del
sobrenadante homogeneizado de heces, obtenido de alícuotas de heces
homogeneizadas en tampón con EDTA 0 mM, 16 mM, o 96 mM. Se corrieron
los ácidos nucleicos totales en un gel de separación. Los resultados
se muestran en la figura 2, en la que las flechas identifican la
localización de la banda amplia (o falta de la misma) que contiene
el ADN de interés.
Los carriles 4, 5 y 6 representan muestras de
ADN añadido a sobrenadante homogeneizado de heces, obtenido de heces
homogeneizadas en tampones que contenían EDTA 0 mM, 16 mM, o 96 mM,
respectivamente, que posteriormente se aisló. Obsérvese que cada
carril muestra una banda de elevado peso molecular que representa
ADN endógeno de la muestra de heces y una banda difusa del ADN
exógeno. La intensidad de la banda y de la banda difusa en la
fotografía (que se correlaciona con la cantidad de ADN en la banda,
correspondiendo una mayor intensidad a una mayor cantidad de ADN) se
incrementó con la concentración de EDTA en el tampón original. Los
carriles 7 a 9 y 10 a 12 son réplicas de los carriles 4 a 6. La
intensidad creciente de las bandas y de bandas difusas a medida que
se incrementa la concentración de EDTA indica que se conservó la
integridad del ADN al incrementar la concentración de EDTA en el
tampón. De esta manera, se inhibió la actividad degradativa del ADN
del sobrenadante homogenizado de heces con el EDTA de una manera
aproximadamente dosis-dependiente.
Los carriles 1, 2 y 3, y los carriles 13, 14 y
15 eran muestras de control que contenían 2 \mug de ADN de E.
coli y 100 ng de ADN humano exógeno en tampón preparado con EDTA
16 mM. Tal como se esperaba, cada carril mostraba una banda difusa
representativa del ADN añadido.
En un segundo experimento, el ADN aislado tal
como se ha descrito anteriormente se capturó y se amplificó. Los
resultados de este experimento demostraron que EDTA no sólo inhibe
la actividad degradativa de ADN presente en el sobrenadante de
heces sino que también incrementa la cantidad de ADN amplificable.
En este experimento, tras preparar el ADN tal como se ha descrito
anteriormente, se llevó a cabo una captura híbrida estándar
utilizando sondas de captura específicas para Kras con el fin de
capturar el ADN de Kras. A continuación, el ADN de Kras se
amplificó por PCR. La figura 3 muestra el efecto de EDTA sobre la
conservación del ADN de Kras. La localización de la banda (o falta
de la misma) que representa el ADN de Kras se identifica con una
flecha.
Los carriles 4, 5 y 6 representan ADN de Kras
que se amplificó a partir de ADN de molde que se añadió al
sobrenadante homogeneizado de heces obtenido de heces homogeneizadas
en tampón que contenía EDTA 0 mM, 16 mM o 96 mM, respectivamente.
Obsérvese que la banda de Kras en el carril 4 se encontraba
prácticamente ausente, mientras que la banda de Kras creció en
intensidad (representando un incremento de la cantidad de ADN de
Kras realmente presente) en los carriles 5 y 6 a medida que se
incrementó la concentración de EDTA en el tampón. Los carriles 7 a 9
son réplicas de los carriles 4 a 6 y muestran un incremento similar
de intensidad de banda (un incremento de la cantidad de ADN
presente) a medida que se incrementa la concentración de EDTA en el
tampón original. De esta manera, se amplificó más ADN de Kras,
resultando en una señal más robusta a las concentraciones más
elevadas de EDTA.
Además, en la población, los niveles de ADN que
pueden amplificarse a partir de heces varían entre individuos. Se
ha caracterizado la población en grupos A a F, donde A es el nivel
más alto de ADN y F es el nivel no detectable de ADN. Los niveles
elevados de ADN en el grupo A se deben a una actividad degradativa
del ADN reducida en las heces ("heces de integridad elevada").
La adición de EDTA al tampón en el que se homogeneiza una alícuota
de heces de un individuo del grupo A no se esperaría que produjese
un gran efecto debido a que las heces del grupo A presentan una
actividad degradativa del ADN reducida. De hecho, al amplificar el
ADN de Kras a partir de ADN molde que se añadió al sobrenadante
homogeneizado de heces obtenido de heces de grupo A homogeneizadas
en tampón que contenía EDTA 0 mM, 16 mM o 96 mM, se observaron pocas
diferencias en la cantidad de ADN de Kras amplificado (carriles 10,
11 y 12, respectivamente). Sólo podía observarse un ligero
incremento de intensidad de banda de Kras entre EDTA 0 mM y EDTA 16
mM o 96 mM, representando únicamente un ligero incremento de la
cantidad de ADN de Kras a las concentraciones inhibitorias de
EDTA.
Los carriles 1 a 3, así como los carriles 13 a
15 representan muestras de ADN de Kras amplificado que no se expuso
a sobrenadante de heces homogeneizadas. Tal como se esperaba, estos
carriles de control mostraban una banda de igual intensidad en
carriles que representaban ADN de Kras. Los carriles 16 y 17 son
controles negativos y, tal como se esperaba, no mostraban ninguna
banda que representase Kras, indicando que cualquier ADN de Kras
observado se debía a ADN capturado y no a contaminantes. El carril
18 es un control negativo y, tal como se esperaba, no presentaba
ninguna banda representativa del gen Kras, indicando que los
productos de PCR eran de la muestra y no de contaminantes. Los
carriles 19 a 21 eran controles positivos, en los que se
amplificaron 50 pg, 100 pg o 200 pg de ADN humano en un fondo de ADN
de E. coli, indicando que el ADN humano puede amplificarse en
un fondo de E. coli en este sistema modelo. Finalmente, el
carril 22 era un marcador de peso molecular.
En un tercer experimento, se utilizó el mismo
protocolo que en el segundo experimento excepto en que se añadió ADN
genómico humano a cada muestra tras la captura. Se amplificó
nuevamente el ADN de Kras mediante PCR. De esta manera, se
encontraba disponible un exceso de ADN de molde para la PCR. Este
experimento demostró que los niveles variables de amplificación por
PCR en el segundo experimento no se debían a que EDTA interfería o
intensificaba la PCR normal sino que se debían a los niveles
variables de ADN de molde disponible para la amplificación que
resultaban de los diversos niveles de inhibición de la degradación
del ADN por EDTA. La figura 4 muestra los resultados de este
experimento. La localización de la banda (o falta de la misma) que
representa Kras se identifica con una flecha. Los carriles 1 a 6 y 8
a 13 corresponden a los carriles 1 a 12 en el segundo experimento
(es decir, los carriles 1 a 3 eran controles, los carriles 4 a 6 y 8
a 10 eran con EDTA 16 mM o 96 mM, y los carriles 11 a 13 eran ADN de
Kras en exceso amplificado en muestras expuestas a sobrenadante
homogeneizado de heces procedente de heces de alta integridad
homogeneizadas en EDTA 0 mM, 16 mM o 96 mM). Tal como se esperaba,
las pistas 1 a 6 y 8 a 13 mostraban un producto de PCR de intensidad
aproximadamente igual debido a que se encontraba disponible un
exceso de ADN de molde. El EDTA no interfiere ni intensifica la PCR
normal. Este resultado indica que los niveles variables de
amplificación por PCR en las muestras con EDTA 0 mM, 16 mM o 96
mM en el segundo experimento se debían a niveles variables de ADN
de molde y no al inhibidor. El carril 14 muestra una muestra de ADN
genómico humano. Los carriles 15 a 18 son los mismos controles que
los carriles 17 y 19 a 21 en el segundo experimento.
A partir de los datos experimentos descritos
anteriormente, se calculó la cantidad de ADN requerido para inhibir
la ADNasa. La concentración de EDTA en los diversos tampones
utilizados en los tres experimentos se normalizó como gramos de
EDTA por gramo de heces. Generalmente, la concentración de EDTA se
multiplicó por el peso molecular de ETA y por el volumen de tampón
en el que se homogeneizaron las heces. El producto se dividió por
la cantidad de heces que se habían homogeneizado. Por ejemplo, se
utilizaron las ecuaciones siguientes para normalizar la
concentración de EDTA.
Para EDTA 16 mM (comparativo):
(EDTA 0,016 M/L
x 372,2 g/M x 0,035 L) \div 5 g = 0,042 g de EDTA por gramo de
heces
Para EDTA 96 mM:
(EDTA 0,096 M/L
x 372,2 g/M x 0,035 L) \div 5 g = 0,250 g de EDTA por gramo de
heces
De esta manera, para cualquier cantidad de heces
a homogeneizar, deben utilizarse por lo menos 0,250 g de EDTA por
gramo de heces en el tampón de homogeneización con el fin de
maximizar el rendimiento de ADN. El intervalo de EDTA que puede
utilizarse es de entre 0,250 g de EDTA por gramo de heces y
aproximadamente 0,782 g de EDTA por gramo de heces. Más
preferentemente, se utiliza entre 0,250 g de EDTA por gramo de heces
y aproximadamente 0,521 g de EDTA por gramo de heces. Todavía más
preferentemente, se utilizan aproximadamente 0,391 g de EDTA por
gramo de heces.
Estos cálculos indican que, con los volúmenes de
tampón y las cantidades de heces utilizados comúnmente, la cantidad
de EDTA presentes en la muestra homogeneizada es un factor más
importante que la concentración final de EDTA en la muestra
homogeneizada. Sin embargo, tal como apreciará el experto en la
materia, en algún punto, aunque la cantidad de EDTA permanezca
igual en un volumen dado, el volumen puede ser tan grande que se
diluya el efecto del EDTA sobre la integridad del ADN. Al examinar
una muestra de heces dentro de los parámetros utilizados comúnmente,
no se observa este efecto de dilución. Sin embargo, en realizaciones
alternativas, la concentración de EDTA es un factor relevante. En
estas realizaciones, resulta útil el EDTA entre aproximadamente 16
mM y aproximadamente 300 mM. Más preferentemente, resulta útil el
EDTA entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 200 mM. Todavía
más preferentemente, resulta útil EDTA aproximadamente 150 mM.
Claims (6)
1. Procedimiento para conservar la integridad
del ADN en una muestra seleccionada de entre una muestra de heces o
una muestra que contiene células exfoliadas, comprendiendo el
procedimiento exponer la muestra a EDTA en un intervalo entre 0,250
gramos de EDTA por gramo de muestra y aproximadamente 0,782 gramos
de EDTA por gramo de muestra, siendo la concentración de EDTA en la
muestra de por lo menos 16 mM, para conservar la integridad de ADN
en la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además una etapa de extracción de un ADN diana.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la etapa de extracción comprende una extracción con
fenol-cloroformo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende exponer la muestra a EDTA en un intervalo entre 0,250
gramos de EDTA por gramo de muestra y aproximadamente 0,521 gramos
de EDTA por gramo de muestra.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende exponer la muestra a aproximadamente 0,391 gramos de EDTA
por gramo de muestra.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, para
conservar la integridad del ADN diagnósticamente relevante en una
muestra que contiene niveles reducidos de dicho ADN diagnósticamente
relevante.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12217799P | 1999-02-25 | 1999-02-25 | |
| US122177P | 1999-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2269102T3 true ES2269102T3 (es) | 2007-04-01 |
Family
ID=22401146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00904537T Expired - Lifetime ES2269102T3 (es) | 1999-02-25 | 2000-01-24 | Procedimientos para conservar la integridad del adn. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6551777B1 (es) |
| EP (1) | EP1155147B1 (es) |
| JP (2) | JP2002537777A (es) |
| AT (1) | ATE330032T1 (es) |
| AU (1) | AU752817B2 (es) |
| CA (1) | CA2362251C (es) |
| DE (1) | DE60028732T2 (es) |
| ES (1) | ES2269102T3 (es) |
| WO (1) | WO2000050640A1 (es) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6818404B2 (en) * | 1997-10-23 | 2004-11-16 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting hypermethylated nucleic acid in heterogeneous biological samples |
| US20080064108A1 (en) * | 1997-12-10 | 2008-03-13 | Tony Baker | Urine Preservation System |
| US7569342B2 (en) * | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| AU767983B2 (en) * | 1999-04-09 | 2003-11-27 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer |
| US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US7368233B2 (en) * | 1999-12-07 | 2008-05-06 | Exact Sciences Corporation | Methods of screening for lung neoplasm based on stool samples containing a nucleic acid marker indicative of a neoplasm |
| US6919174B1 (en) * | 1999-12-07 | 2005-07-19 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| EP1207208A3 (en) * | 2000-11-15 | 2003-12-10 | Becton Dickinson and Company | Method for preservation of cells and nucleic acid targets |
| US6911308B2 (en) | 2001-01-05 | 2005-06-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting, grading or monitoring an H. pylori infection |
| US6428964B1 (en) * | 2001-03-15 | 2002-08-06 | Exact Sciences Corporation | Method for alteration detection |
| US7776524B2 (en) * | 2002-02-15 | 2010-08-17 | Genzyme Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| US7482116B2 (en) * | 2002-06-07 | 2009-01-27 | Dna Genotek Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
| US7214484B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Sigma-Aldrich Co. | Compositions and methods for nucleic acid extraction from biological samples |
| US20040259101A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Shuber Anthony P. | Methods for disease screening |
| ES2347564T3 (es) * | 2003-08-05 | 2010-11-02 | Becton, Dickinson And Company | Dispositivo y metodos para la recogida de una muestra de fluido biologico y el tratmaiento de componentes seleccionados. |
| US20080241827A1 (en) * | 2004-05-10 | 2008-10-02 | Exact Sciences Corporation | Methods For Detecting A Mutant Nucleic Acid |
| US20080124714A1 (en) * | 2004-05-14 | 2008-05-29 | Exact Sciences Corporation | Method for Stabilizing Biological Samples for Nucleic Acid Analysis |
| US7981607B2 (en) | 2004-08-27 | 2011-07-19 | Esoterix Genetic Laboratories LLC | Method for detecting recombinant event |
| WO2006047787A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Exact Sciences Corporation | Method for monitoring disease progression or recurrence |
| AU2006225044B2 (en) * | 2005-03-16 | 2012-03-15 | Dna Genotek Inc. | Compositions and method for storage of nucleic acid from bodily fluids |
| WO2007044071A2 (en) | 2005-04-21 | 2007-04-19 | Exact Sciences Corporation | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
| JP5150507B2 (ja) | 2005-12-09 | 2013-02-20 | ディーエヌエー ジェノテック インク | 物質を解放できるように貯蔵するための容器システム |
| US20120164238A1 (en) | 2009-02-03 | 2012-06-28 | Mdxhealth Sa | Methods of detecting colorectal cancer |
| US9928552B1 (en) * | 2009-03-13 | 2018-03-27 | New York Life Insurance Company | Methods and systems for insurance investment product decision modeling |
| EP2721140B1 (en) | 2011-06-19 | 2016-11-23 | Abogen, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
| US10253358B2 (en) | 2013-11-04 | 2019-04-09 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiple-control calibrators for DNA quantitation |
| EP3084004A4 (en) | 2013-12-19 | 2017-08-16 | Exact Sciences Corporation | Synthetic nucleic acid control molecules |
| US10435735B2 (en) * | 2014-03-07 | 2019-10-08 | Dna Genotek Inc. | Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples |
| WO2018017710A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Exact Sciences Development Company, Llc | Nucleic acid control molecules from non-human organisms |
| EP3488004B1 (en) | 2016-07-19 | 2021-10-06 | Exact Sciences Development Company, LLC | Methylated control dna |
| CN106754869A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 成都大学 | 一种血液基因组dna的提取方法 |
| CN106754874A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-05-31 | 浙江指针基因科技有限公司 | 一种从人体粪便样本中提取dna的试剂盒及其使用方法 |
| CN107760675B (zh) * | 2017-11-07 | 2020-02-14 | 泰州达安达瑞医学检验有限公司 | 一种人粪便样本中脱落细胞dna的提取试剂盒及提取方法 |
Family Cites Families (88)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4101279A (en) | 1977-04-06 | 1978-07-18 | Muhammed Javed Aslam | Device for the collection and processing of stool specimens |
| US4333734A (en) | 1980-01-18 | 1982-06-08 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Diagnostic device for fecal occult blood and method of use |
| US4535058A (en) | 1982-10-01 | 1985-08-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Characterization of oncogenes and assays based thereon |
| US4309782A (en) | 1980-09-11 | 1982-01-12 | Esteban Paulin | Device for collecting fecal specimens |
| US4358535A (en) | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US5482834A (en) | 1982-05-17 | 1996-01-09 | Hahnemann University | Evaluation of nucleic acids in a biological sample hybridization in a solution of chaotrophic salt solubilized cells |
| US4445235A (en) | 1982-09-13 | 1984-05-01 | Pearl Slover | Stool specimen collector |
| US4578358A (en) | 1983-05-03 | 1986-03-25 | Warner-Lambert Company | Collection of specimens and detection of occult blood therein |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4871838A (en) | 1985-07-23 | 1989-10-03 | The Board Of Rijks Universiteit Leiden | Probes and methods for detecting activated ras oncogenes |
| US4705050A (en) | 1985-10-02 | 1987-11-10 | Markham Charles W | Moisture-activated floatation device |
| US5348855A (en) | 1986-03-05 | 1994-09-20 | Miles Inc. | Assay for nucleic acid sequences in an unpurified sample |
| CA1284931C (en) | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| US4981783A (en) | 1986-04-16 | 1991-01-01 | Montefiore Medical Center | Method for detecting pathological conditions |
| CA1341576C (en) | 1986-08-11 | 2008-07-08 | Thaddeus P. Dryja | Diagnosis of retinoblastoma |
| US4735905A (en) | 1986-08-15 | 1988-04-05 | V-Tech, Inc. | Specimen-gathering apparatus and method |
| US4935342A (en) | 1986-12-01 | 1990-06-19 | Syngene, Inc. | Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples |
| AU625169B2 (en) | 1987-03-23 | 1992-07-02 | Imperial Chemical Industries Plc | Molecular markers |
| US4857300A (en) | 1987-07-27 | 1989-08-15 | Cytocorp, Inc. | Cytological and histological fixative formulation and methods for using same |
| AU631788B2 (en) | 1988-04-15 | 1992-12-10 | Montefiore Medical Center | Method for determining state of malignant and pre-malignant progression |
| FR2630000A1 (fr) | 1988-04-18 | 1989-10-20 | Sultan Bernard | Flacon destine a recueillir un echantillon biologique urinaire pour examen cytobacteriologique |
| US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
| US5248671A (en) | 1989-02-15 | 1993-09-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
| US5087617A (en) | 1989-02-15 | 1992-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
| US5380645A (en) | 1989-03-16 | 1995-01-10 | The Johns Hopkins University | Generalized method for assessment of colorectal carcinoma |
| US5527676A (en) | 1989-03-29 | 1996-06-18 | The Johns Hopkins University | Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor |
| EP0390323B2 (en) | 1989-03-29 | 2012-08-08 | Johns Hopkins University | Detection of loss of the wild-type p53 gene |
| US5362623A (en) | 1991-06-14 | 1994-11-08 | The John Hopkins University | Sequence specific DNA binding by p53 |
| US5196167A (en) | 1989-04-04 | 1993-03-23 | Helena Laboratories Corporation | Fecal occult blood test product with positive and negative controls |
| US5192501A (en) | 1989-04-04 | 1993-03-09 | Helena Laboratories Corporation | Method of formulating a test ink for a fecal occult blood test product |
| US5589335A (en) | 1989-04-05 | 1996-12-31 | Amoco Corporation | Hybridization promotion reagents |
| DE69003477T2 (de) | 1989-06-23 | 1994-01-27 | Canon Kk | Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren. |
| US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| CA2029219A1 (en) | 1989-11-08 | 1991-05-09 | Mary K. Estes | Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses |
| US5641628A (en) | 1989-11-13 | 1997-06-24 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA |
| US5137806A (en) | 1989-12-11 | 1992-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules |
| ATE164629T1 (de) | 1990-01-04 | 1998-04-15 | Univ Johns Hopkins | In menschlichen kolorektalkarzinomen fehlendes gen |
| US5126239A (en) | 1990-03-14 | 1992-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| US5200314A (en) | 1990-03-23 | 1993-04-06 | Chiron Corporation | Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification |
| DK1013666T3 (da) | 1990-06-27 | 2006-08-14 | Univ Princeton | Proteinkompleks p53/p90 |
| WO1992008133A1 (en) | 1990-10-29 | 1992-05-14 | Dekalb Plant Genetics | Isolation of biological materials using magnetic particles |
| US5846710A (en) | 1990-11-02 | 1998-12-08 | St. Louis University | Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension |
| US5352775A (en) | 1991-01-16 | 1994-10-04 | The Johns Hopkins Univ. | APC gene and nucleic acid probes derived therefrom |
| ATE137808T1 (de) | 1991-02-05 | 1996-05-15 | Lifecodes Corp | Molekulare genetische identifikation unter verwendung von sonden, die polymorphe orte erkennen |
| WO1992014157A1 (en) | 1991-02-05 | 1992-08-20 | Kamal Bahar | Simple test for detecting carcinoembryonic antigen |
| US5330892A (en) | 1991-03-13 | 1994-07-19 | The Johns Hopkins University | MCC gene (mutated in colorectal cancer) used for diagnosis of cancer in humans |
| US5468610A (en) | 1991-05-29 | 1995-11-21 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Three highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers |
| US5378602A (en) | 1991-05-29 | 1995-01-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers twenty-[seven]six |
| US5149506A (en) | 1991-08-09 | 1992-09-22 | Sage Products, Inc. | Stool collection and transport device |
| US5506105A (en) | 1991-12-10 | 1996-04-09 | Dade International Inc. | In situ assay of amplified intracellular mRNA targets |
| WO1993020235A1 (en) * | 1992-04-01 | 1993-10-14 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting mammalian nucleic acids isolated from stool specimen and reagents therefor |
| US5489508A (en) | 1992-05-13 | 1996-02-06 | University Of Texas System Board Of Regents | Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity |
| US5409586A (en) | 1992-08-26 | 1995-04-25 | Hitachi, Ltd. | Method for analyzing nucleic acid or protein and apparatus therefor |
| US5331973A (en) | 1993-03-15 | 1994-07-26 | Fiedler Paul N | Method for obtaining stool samples for gastrointestinal cancer testing |
| CA2092115C (en) | 1993-03-22 | 1998-12-15 | Janet L. Taylor | Testing for infestation of rapeseed and other cruciferae by the fungus leptosphaeria maculans (blackleg infestation) |
| US5492808A (en) | 1993-05-05 | 1996-02-20 | The Johns Hopkins University | Means for detecting familial colon cancer (FCC) |
| US5466576A (en) | 1993-07-02 | 1995-11-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Modulation of PIF-1-type helicases |
| ATE225856T1 (de) | 1993-07-08 | 2002-10-15 | Johnson & Johnson Clin Diag | Verfahren zur koamplifikation zweier unterschiedlicher nukleinsäure-sequenzen unter verwendung der polymerase-kettenreaktion |
| EP0664339A4 (en) | 1993-07-09 | 1999-04-28 | Wakunaga Seiyaku Kk | METHOD FOR DISCRIMINATION OF NUCLEIC ACIDS AND TEST KIT FOR THIS PURPOSE. |
| US5416025A (en) | 1993-11-29 | 1995-05-16 | Krepinsky; Jiri J. | Screening test for early detection of colorectal cancer |
| US5681697A (en) | 1993-12-08 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor |
| US5709998A (en) | 1993-12-15 | 1998-01-20 | The Johns Hopkins University | Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis |
| US5538851A (en) | 1993-12-22 | 1996-07-23 | Institut Pasteur And Cneva | Primers for the amplification of genes coding for the enterotoxin and the lecithinase of Clostridium perfringens and their application to the determination of the presence and numeration of these bacteriae |
| US5496470A (en) | 1994-05-27 | 1996-03-05 | Barnes International, Inc. | Magnetic separator |
| US6037465A (en) | 1994-06-14 | 2000-03-14 | Invitek Gmbh | Universal process for isolating and purifying nucleic acids from extremely small amounts of highly contaminated various starting materials |
| KR0125130B1 (ko) | 1994-08-17 | 1997-12-05 | 김은영 | 옥사졸리논계 유도체 및 그의 제조방법과 용도 |
| US5702886A (en) | 1994-10-05 | 1997-12-30 | The Johns Hopkins University | Chromosome I8Q loss and prognosis in colorectal cancer |
| US5512441A (en) | 1994-11-15 | 1996-04-30 | American Health Foundation | Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method |
| US5463782A (en) | 1994-11-21 | 1995-11-07 | Eric V. Carlson | Foldable stool sample collection device |
| DE19530132C2 (de) * | 1995-08-16 | 1998-07-16 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien |
| US5670325A (en) | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| US5612473A (en) | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
| US5741650A (en) | 1996-01-30 | 1998-04-21 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting colon cancer from stool samples |
| US6143529A (en) | 1996-08-14 | 2000-11-07 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for improving sensitivity and specificity of screening assays |
| US5928870A (en) | 1997-06-16 | 1999-07-27 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6203993B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
| US6146828A (en) | 1996-08-14 | 2000-11-14 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor |
| US6020137A (en) | 1996-08-14 | 2000-02-01 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
| US6100029A (en) | 1996-08-14 | 2000-08-08 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of chromosomal aberrations |
| US5952178A (en) | 1996-08-14 | 1999-09-14 | Exact Laboratories | Methods for disease diagnosis from stool samples |
| US6300077B1 (en) | 1996-08-14 | 2001-10-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for the detection of nucleic acids |
| US5856104A (en) | 1996-10-28 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Polymorphisms in the glucose-6 phosphate dehydrogenase locus |
| US5830665A (en) | 1997-03-03 | 1998-11-03 | Exact Laboratories, Inc. | Contiguous genomic sequence scanning |
| AU7816898A (en) * | 1997-06-16 | 1999-01-04 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for stool sample preparation |
| US6268136B1 (en) | 1997-06-16 | 2001-07-31 | Exact Science Corporation | Methods for stool sample preparation |
| US5888778A (en) | 1997-06-16 | 1999-03-30 | Exact Laboratories, Inc. | High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers |
| US6503718B2 (en) | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
| US6280947B1 (en) | 1999-08-11 | 2001-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension |
-
2000
- 2000-01-24 JP JP2000601203A patent/JP2002537777A/ja not_active Withdrawn
- 2000-01-24 AU AU26277/00A patent/AU752817B2/en not_active Ceased
- 2000-01-24 EP EP00904537A patent/EP1155147B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-24 AT AT00904537T patent/ATE330032T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-01-24 ES ES00904537T patent/ES2269102T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-24 US US09/491,093 patent/US6551777B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-24 WO PCT/US2000/001759 patent/WO2000050640A1/en active IP Right Grant
- 2000-01-24 CA CA002362251A patent/CA2362251C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-24 DE DE60028732T patent/DE60028732T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-10-25 JP JP2010239144A patent/JP5132751B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2362251A1 (en) | 2000-08-31 |
| EP1155147B1 (en) | 2006-06-14 |
| WO2000050640A1 (en) | 2000-08-31 |
| EP1155147A1 (en) | 2001-11-21 |
| JP5132751B2 (ja) | 2013-01-30 |
| JP2011015701A (ja) | 2011-01-27 |
| DE60028732T2 (de) | 2007-06-14 |
| JP2002537777A (ja) | 2002-11-12 |
| AU752817B2 (en) | 2002-10-03 |
| CA2362251C (en) | 2008-06-17 |
| US6551777B1 (en) | 2003-04-22 |
| AU2627700A (en) | 2000-09-14 |
| DE60028732D1 (de) | 2006-07-27 |
| ATE330032T1 (de) | 2006-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2269102T3 (es) | Procedimientos para conservar la integridad del adn. | |
| Jin et al. | Commensal microbiota promote lung cancer development via γδ T cells | |
| ES2855130T3 (es) | Composiciones y métodos para identificar mutaciones de manera precisa | |
| Chen et al. | Eosinophilic esophagitis: update on management and controversies | |
| ES2689958T3 (es) | Marcador para predecir el pronóstico de cáncer de estómago y procedimiento para predecir el pronóstico de cáncer de estómago | |
| US20110183328A1 (en) | Detecting neoplasm | |
| US20060127922A1 (en) | Methods for detecting, grading or monitoring an H. pylori infection | |
| Arias et al. | Dietary treatment modulates mast cell phenotype, density, and activity in adult eosinophilic oesophagitis | |
| Millares et al. | The respiratory microbiome in bronchial mucosa and secretions from severe IgE-mediated asthma patients | |
| KR20190117486A (ko) | 개체에서 결장직장암 상태를 결정하는 방법 | |
| Siupsinskiene et al. | Intranasal Helicobacter pylori infection in patients with chronic rhinosinusitis with polyposis | |
| Afzal et al. | PARP1: A potential biomarker for gastric cancer | |
| Kim et al. | Bile microbiota in patients with pigment common bile duct stones | |
| Johnson et al. | Lack of Association of the Esophageal Microbiome in Adults with Eosinophilic Esophagitis Compared with Non-Eosinophilic Esophagitis Controls. | |
| Cho et al. | Transcriptome and methylome analysis of periodontitis and peri-implantitis with tobacco use | |
| Collard et al. | The appendix orchestrates T-cell mediated immunosurveillance in colitis-associated cancer | |
| US20020004206A1 (en) | Methods of screening for disease | |
| Stec-Michalska et al. | Loss of FHIT expression in gastric mucosa of patients with family histories of gastric cancer and Helicobacter pylori infection | |
| ES2684687T3 (es) | Pronóstico del impacto de la dieta en comorbilidades relacionadas con la obesidad | |
| US20120100542A1 (en) | Method for detection of target nucleic acid, and method for testing for colon cancer | |
| Nakayama et al. | Allergic fungal rhinosinusitis: What we can learn from allergic bronchopulmonary mycosis | |
| CN106526203B (zh) | 一种用于左半结肠癌检测的试剂盒 | |
| US20220170111A1 (en) | Salivary biomarkers for the detection of epidermoid cancer of the head and neck | |
| Jeergal et al. | Evaluation of Oral Squamous Cell Carcinoma Patients Using Polymerase Chain Reaction Regarding the Prevalence of Human Papillomavirus Types 16 and 18 | |
| JP2005168474A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法 |