CN107760675B - 一种人粪便样本中脱落细胞dna的提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1）样本保存液SPB；2）细胞捕获剂CCB；3）细胞裂解液I；4）DNA提取液I；5）DNA溶解液EB；6）无水乙醇和75%乙醇。本发明还提供了使用试剂盒用于人粪便样本中脱落细胞DNA的提取方法。本发明有以下优势和应用价值：1.样本采样简便、无创、个性便捷，无需专人协助取样，可自行取样；粪便样本取样简单（无需取粪便样本硬性要求的特定位置，随机取成型的粪便样本即可），取人者可自行取样，无需到医院由专业人士协助取样，便捷、非侵入、取样者体验友好。2.样本保存方便：常温放置即可；3.样本预处理简单：无需做离心淘洗法、密度梯度离心法、及免疫磁珠法等处理。

Description

一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及医学生物领域中核酸(DNA)的提取方法，具体涉及从人类粪便中提取脱落细胞DNA的方法及应用。
背景技术
粪便是食物经口咀嚼，经食道到达胃后，通过胃的消化，进入十二指肠，同时在胆汁与胰液的共同作用下，经小肠消化和吸收后，最终大肠中形成的残渣排泄物。粪便是保持机体内环境稳定的最终代谢产物，除了含有水、蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维外，还含有细菌细胞、病毒及器官的表皮脱落细胞等。粪便中的细菌主要来源于肠道菌群或者少量来源于食物；器官的表皮脱落细胞主要来源于大肠。粪便中不但蕴藏着丰富的生物学信息，且具有非侵入性、无创、采样便捷、来源广泛等优点。粪便的成分及含量的改变不仅受消化系统的影响，而且与血液循环、代谢、呼吸等系统的生理或病理变化有关。从粪便样本中分离出总核酸，并对这些核酸序列进行分子检测(电泳分析、Q-PCR、Sanger及NGS等技术)，可以帮助对肿瘤、肠道微生物、艾滋病、疟疾等潜在的重大疾病的早期、无创的分子检测。
由于粪便中的脱落细胞含量很低，采用常规的核酸提取方法难以从粪便脱落细胞中获取足量且高质量的核酸。粪便的放置条件、放置的时间等条件都会影响粪便样本中脱落细胞的完整性，进而影响提取核酸时的回收率。为了从粪便中以高回收率获取高质量的核酸，通过采用样本保存液常温保存样本和脱落细胞浓缩捕获方法，从而简化样本采样和保存流程、缩短样本预处理时间，非常方便实际科研和生产的应用。
在采用离心柱法提取核酸时，通常将样品离心通过吸附柱，使样品中的核酸在高盐条件下结合到吸附柱的硅胶模上。然而这样的上样方法对于核酸含量低、样品量较大的粪便样本液而言，不但需要大量的提取试剂，而且上量离心时间过长，不利于核酸的提取。鉴于此难题，尽管近年来许多研究提出相应解决的方法如：离心淘洗法、密度梯度离心以及免疫磁珠法，但这些研究方法具有对粪便取样要求苛刻、粪便样本保存要求高、对耗材和设备要求高、操作流程繁琐而耗时等的缺陷，另外市面上已有一些粪便DNA提取试剂盒不但不能完全解决这些难题，而且最终提取DNA的实际质量并不能达到官方公开的指标，另外价格也比较昂贵，难以实现在分子检测的应用。因此针对粪便中核酸含量低、提取核酸时所需样本量较大的情况下，发明一种从粪便中快速富集并提取核酸的方法，将对临床粪便样本进行无创的分子检测具有重要的应用价值。本发明提供了粪便样本保存液和脱落细胞富集捕获的简易方法，可将大量的粪便样本浓缩处理后，快速富集至核酸吸附柱上，再经洗涤、洗脱步骤提取出高质量的核酸，可用于分子检测。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在不足之处开展的实验研究，目的在于提供一种快速简易、低成本、稳定性和重复性高的从粪便中提取人基因组DNA试剂盒及提取的方法。
本发明的人类粪便DNA提取方法，其实质是自粪便中提取排便人的肠道上皮脱落细胞的DNA，所要解决的技术是不仅能使DNA完整从细胞中释放出来，并且保证在常规一系列的分离、沉淀和纯化技术过程中不被破坏，从而得到浓度和纯度较高的人基因组DNA样本。
本发明的粪便脱落细胞提取试剂盒，包括如下试剂：1)样本保存液SPB；2)细胞捕获剂CCB；3)细胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)无水乙醇和75％乙醇。
本发明提供的粪便脱落细胞提取试剂盒所含试剂及耗材见表1，提取流程为在15ml的保存液SPB中加入5g左右成型粪便样本(采样时，将样本加到保存液指定的液面即可)，高速漩涡振荡混合均匀，离心取1ml上清，加入等体积的细胞捕获剂CCB混合均匀后，离心获得细胞沉淀物，加入300ulDNA细胞裂解液I，混合均匀使沉淀物溶解后，56℃孵育10-15min，加入300ulDNA提取液I混合均匀后，再加入1.2ml的无水乙醇沉淀核酸，混合均匀后将样品全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，用75％的乙醇洗涤三次吸附柱后，待乙醇挥发干净后再用DNA溶解液EB将核酸从吸附柱上洗脱下来。
表1：粪便样本核酸快速提取试剂盒及所含试剂
本发明的发明人根据目标样品的不同，例如对于健康男性、健康女性、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌患者等粪便样本，经过反复实验，对各因素进行优化、摸索出最适应操作步骤及相应的溶液的最佳配方。
表2：样本保存液SPB的配方
Figure BDA0001460194600000031
其中EDTA是稳定剂，使保存液可在室温放置；Tris是缓冲剂，维持细胞内外渗透压、PH值；Nacl可维持电解质平衡，维持细胞渗透压。
粪便样本保存液SPB的PH值调为7最佳，一般保存液SPB与样本比例为3:1最佳，大于这个比例，保存液过多，粪便样本被稀释，后面脱落细胞浓缩捕获难度大；小于这个比例样本不能保证彻底溶解在保存液中，导致脱落细胞有损耗，一般要求在这个比例下粪便样本量至少达到5g，对应的保存液SPB的体积为15ml，一般样本量越大，DNA回收的浓度也高。
保存液SPB可实现粪便样本常温保存，不需要低温保存，方便粪便保存和运输管理。
本发明对粪便的采样要求简单(无需硬性地对粪便样本指定表面位置刮取采样)、个性便捷、无创取样，取样者可自行居家取样即可，无需专门到医院取样，可实现常温保存与运输，保存时间至少可达15天。
表3：细胞捕获剂CCB的配方
Figure BDA0001460194600000032
PEG有吸水性，会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
在一定PH值下，盐浓度越高，所需PEG的浓度越低，溶液的PH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG浓度越低。通过多次试验，PEG6000的浓度可选取在150g/l-250g/l，最适合为200g/L；NaCl可选择在2mol/L-5mol/L，最适合在3.5mol/L。
表4：细胞裂解液I的配方
Figure BDA0001460194600000033
Figure BDA0001460194600000041
表5：DNA提取液I的配方
Figure BDA0001460194600000042
表6：DNA溶解液EB的配方
Figure BDA0001460194600000043
DNA溶解的成分可以是灭菌水或者无酶水，只要是对DNA溶解度大、有保存DNA的能力，而且不会影响下游分子检测实验即可。
本发明的人粪便样本中脱落细胞DNA的提取方法，提取出的核酸包含了粪便中人脱落细胞的基因组DNA、细菌的DNA、病毒DNA和其他潜在的游离的核酸。
本发明的试剂盒与现有技术相比，有如下创新点：
1)增加了预处理的步骤，可以大量富集细胞；
2)提取得到的DNA浓度相对增高。
本发明有以下优势和应用价值：
1.样本采样简便、无创、个性便捷，无需专人协助取样，可自行取样；粪便样本取样简单(无需取粪便样本硬性要求的特定位置，随机取成型的粪便样本即可)，取人者可自行取样，无需到医院由专业人士协助取样，便捷、非侵入、取样者体验友好。
2.样本保存方便：常温放置即可；
3.样本预处理简单：无需做离心淘洗法、密度梯度离心法、及免疫磁珠法等处理；
4.可实现大量粪便样本的DNA提取，特别适合是脱落细胞稀少的粪便样本；使用脱落细胞捕获剂CCB(由200g/L的PEG6000、3.5mol/L的NaCL配制而成)，使最终回收的核酸能满足下游分子检测的需求，特别是能解决粪便中脱落细胞偏少的样本核酸提取的难题。
5.DNA提取流程简易，易于粪便样本批量提取的处理；
6.对试剂和耗材成本低、来源广、易于保存和管理，且廉价易得、安全无刺激性气味和毒性。
7.稳定性和重复性好：正常人的粪便样本中人基因组DNA一般平均在10-100ng/ul；结直肠癌患者样本中人基因组DNA平均在50-2000ng/ul；结直肠癌患者的粪便中人基因组DNA定量的浓度较正常人和结肠息肉粪便的高，这是属于正常的现象，并不是由本发明提取试剂盒及方法不稳定所造成的。原因之一：本来不同人的粪便样本中基因组DNA的浓度会存在一定的差异；原因之二：根据本发明DNA提取数据与相关研究证明，息肉、肿瘤及癌症的粪便样本的人基因的DNA呈多或者高拷贝数的状态，故人基因组DNA总量会比正常人(2个拷贝数)的高，越是肿瘤晚期的粪便样本中人基因组DNA的浓度，越是呈现这种明显递增的趋势。
8.提取的DNA纯度高，可直接用于PCR、Q-PCR、NGS等肿瘤下游的分子检测；
9.安全无毒：本试剂盒中所使用试剂对人体无毒，无腐蚀性和刺激性气味。
附图说明
图1：本发明中基因荧光定量的标准曲线,第一个标准品浓度为100ng/ul，后四个为按梯度稀释5倍的标准品，浓度分别为20ng/ul、4ng/ul、0.8ng/ul、0.16ng/ul；其中，1.第一个标准品浓度：100ng/ul；2.第二个标准品浓度：20ng/ul；3.第三个标准品浓度：4ng/ul；4.第四个标准品浓度：0.8ng/ul；5.第五个标准品浓度：0.16ng/ul；
图2：使用没有经过预处理的一个健康人的样本直接提取DNA，以β-actin为目的基因做荧光定量，做两个重复，样本平均浓度为7.181ng/ul；
图3：使用本发明提取方法提取的一个健康人的DNA样本，以β-actin为目的基因做荧光定量，做两个重复，样本平均浓度为52.37ng/ul；
图4：使用QIAGEN试剂盒提取的一个健康人的DNA样本，以β-actin为目的基因做荧光定量，做两个重复，样本平均浓度为30.68ng/ul。
具体实施方式
现在以未使用预处理的提取方法为例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制：
对照例1使用没有经过预处理的健康人的样本直接提取DNA
本对照例的提取方法，包括如下步骤：
1、粪便样品的采集：预先在粪便中铺好干净的卫生纸，然后取样人把粪便样本排在卫生纸上，取出含有15ml样本保存液SPB的取样管，用取样勺取成型的粪便样本(随机取样即可，不需刮取粪便样本指定的表面部位样本)，取到取样管2/3的刻度即可，然后拧紧取样管(确保拧紧，不要出现歪盖、漏液等情况)，注意取样时每次勺的样本大小不宜大于取样管的瓶口，避免弄脏手和取样管，以防交叉污染。取样完成后，左右轻轻摇动取样管，使大便和取样管中的保存液充分混合即可。
2、粪便样本的保存：由于粪便样本中预先添加保存液SPB，常温保存即可备用于科研或项目生产实验。
3、DNA提取流程
(1)取600ul上清液加入到2ml Eppendorf的离心管中；
(2)再加入600ul细胞裂解液I，高速漩涡彻底混合均匀；
(3)置于56℃金属加热器中孵育10-15min，得到消化液；
(4)在上述的消化液中加入600ul的DNA提取液I,振荡均匀；
(5)如若此时混合液还存在明显固体颗粒，则14000rpm离心1min，取上清液，如没有，直接进入步骤(6)；
(6)将上述1.8ml的混合液分900ul到一个新的Eppendorf的离心管中，每一管都加300ul的无水乙醇沉淀DNA,轻度振荡均匀，得到共2.4mlDNA的混合液；
(7)如若此时混合液还存在明显固体颗粒，则14000rpm离心1min，取上清液，如没有，直接进入步骤(8)；
(8)转移上述600ul的DNA混合液于配套收集管的硅胶离心柱中，室温静置2min；
(9)>14000rpm离心1min，弃收集废液，留硅胶柱；
(10)重复步骤(8)和(9)三次，确保上述的DNA混合液全部转移过虑硅胶离心柱；
(11)向上述硅胶离心柱中加600ul的75％乙醇洗脱；
(12)14000rpm离心1min，弃收集废液，留硅胶柱；
(13)重复步骤(11)和(12)一次；
(14)将硅胶离心柱套上新的收集管，进行14000rpm离心空甩3min，弃收集管，留硅胶柱；
(15)将上述洗脱纯化后得的硅胶柱置于新的1.5ml离心管中，对应标上样本名称；
(16)同时打开硅胶柱和离心管的盖子，室温置于无菌干净的操作台3-5min，挥发除去残留的乙醇；
(17)向上述硅胶柱中加入50ul的DNA溶解液，盖上硅胶柱的管盖，室温静置2min；
(18)10000rpm离心2min，吸取离心得到的液体，再一次加入到硅胶柱中
(19)10000rpm离心2min，弃硅胶柱，留1.5ml离心管的收集液，即获得到DNA模板；
(20)将DNA模板取1ul做thermal分光光度计核酸纯度的测定；
(21)以excel表格形式保存粗DNA浓度和纯度测定的数据；
(22)表格的内容包括:以当天日期+实验名称命名表格、样本名称、DNA总浓度(ng/ul)及样本检测的纯度等参数(如：260/280；260/230)，其中260/280数值在1.8最佳；
(23)利用人特异性β-actin引物做Q-PCR定量；
(24)要求人基因组DNA最低浓度要达到2ng/ul以上,即可满足结直肠癌项目的下游高通量测序的技术要求；
(25)实施例1中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果，详细请查看附图2；
(26)将DNA样本放置-20℃保存
Q-PCR荧光定量实验：以人的β-actin为目的基因，取5ul洗脱下来的核酸溶液作为荧光定量的模板，加入10.95ul无酶水和9.05ul的体系mix，反应体系为25ul，体系mix配制方法见表7；PCR反应程序见表8
β-actin基因引物序列：
β-actin-FGGTCACCTCCAGGTAAATTCGAAC；
β-actin-RGGTCACCTTGTCCTCCTCTAAGATG；
β-actin-ROX TCACCCGAATGTGTACCCTTCGG(5端ROX，3端BHQ2)
表7：Q-PCR体系mix配制方法
Figure BDA0001460194600000071
表8：Q-PCR的程序
Figure BDA0001460194600000072
本对照例1中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果，详细请查看附图2。
实施例2使用本发明的试剂盒和方法提取健康人的DNA
本发明的人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，包括如下试剂：1)样本保存液SPB；2)细胞捕获剂CCB；3)细胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)无水乙醇和75％乙醇；
其中，
所述的样本保存液SPB的组分及各组分在样本保存液SPB中的含量如下：EDTA100mMol/L；Tris 0.5mol/L；NaCl 10mMol/L；所述的样本保存液SPB的pH值为7；
所述的细胞捕获剂CCB的组分及各组分在细胞捕获剂CCB中的含量如下：PEG6000200g/L；NaCl 3.5mol/L；
所述的细胞裂解液I的组分及各组分在细胞裂解液I中的含量如下：异硫氰酸胍472.5mg/ml；EDTA 20mmol/L；二硫苏糖醇32.5mmol/l；TritonX-100 4％v/v；Tris-HCl10mmol/L；细胞裂解液I的pH值为6.5；
所述的DNA提取液I的组分及浓度如下：盐酸胍573g/L；
所述的DNA溶解液EB的组分及浓度如下：Tris-HCL 10mM。
本实施例的人粪便样本中脱落细胞DNA的提取方法，包括如下步骤：
1、粪便样品采集：预先在粪便中铺好干净的卫生纸，然后取样人把粪便样本排在卫生纸上，取出含有15ml样本保存液SPB的取样管，用取样勺取成型的粪便样本(随机取样即可，不需刮取粪便样本指定的表面部位样本)，取到取样管2/3的刻度即可，然后拧紧取样管(确保拧紧，不要出现歪盖、漏液等情况)，注意取样时每次勺的样本大小不宜大于取样管的瓶口，避免弄脏手和取样管，以防交叉污染。取样完成后，左右轻轻摇动取样管，使大便和取样管中的保存液充分混合即可。
2、粪便样本的保存：由于粪便样本中预先添加保存液SPB，常温保存即可备用于科研或项目生产实验。
3、粪便样本的预处理：将采集好的粪便样本高速漩涡彻底混合均匀，用>14000rpm转速离心10min，如使用5000rpm转速以下低速离心机，至少需要离心20min，收集上清液。
4：DNA提取流程
(1)取1ml上清液加入到2ml Eppendorf的离心管中；
(2)再加入1ml细胞捕获剂CCB，高速漩涡彻底混合均匀5min；
(3)>14000rpm离心2min，去上清液，留沉淀；
(4)在上述的捕获脱落细胞的沉淀中加入300ul细胞裂解液I，高速漩涡彻底混合均匀；
(5)置于56℃金属加热器中孵育10-15min，得到消化液；
(6)在上述的消化液中加入300ul的DNA提取液I,振荡均匀；
(7)如若此时混合液还存在明显固体颗粒，则14000rpm离心1min，取上清液，如没有，直接进入步骤(8)；
(8)在上述的DNA混合液中加入1.2ml的无水乙醇沉淀DNA,轻度振荡均匀，得到1.8mlDNA的混合液；
(9)转移上述600ul的DNA混合液于配套收集管的硅胶离心柱中，室温静置2min；
(10)>14000rpm离心1min，弃收集废液，留硅胶柱；
(11)重复步骤(9)和(10)两次，确保上述的DNA混合液全部转移过虑硅胶离心柱；
(12)向上述硅胶离心柱中加600ul的75％乙醇洗脱；
(13)14000rpm离心1min，弃收集废液，留硅胶柱；
(14)重复步骤(12)和(13)一次；
(15)将硅胶离心柱套上新的收集管，进行14000rpm离心空甩2min，弃收集管，留硅胶柱；
(16)将上述洗脱纯化后得的硅胶柱置于新的1.5ml离心管中，对应标上样本名称；
(17)同时打开硅胶柱和离心管的盖子，室温置于无菌干净的操作台3-5min，挥发除去残留的乙醇；
(18)向上述硅胶柱中加入50ul的DNA溶解液，盖上硅胶柱的管盖，室温静置2min；
(19)10000rpm离心2min，吸取离心得到的液体，再一次加入到硅胶柱中
(20)10000rpm离心2min，弃硅胶柱，留1.5ml离心管的收集液，即获得到DNA模板；
(21)将DNA模板取1ul做thermal分光光度计核酸纯度的测定；
(22)以excel表格形式保存粗DNA浓度和纯度测定的数据；
(23)表格的内容包括:以当天日期+实验名称命名表格、样本名称、DNA总浓度(ng/ul)及样本检测的纯度等参数(如：260/280；260/230)，其中260/280数值在1.8最佳；
(24)利用人特异性β-actin引物做Q-PCR定量；
(25)要求人基因组DNA最低浓度要达到2ng/ul以上,即可满足结直肠癌项目的下游高通量测序的技术要求；
(26)实施例2中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果,详细结果请查看附图3；
(27)将DNA样本放置-20℃保存；
Q-PCR荧光定量实验：以人的β-actin为目的基因，取5ul洗脱下来的核酸溶液作为荧光定量的模板，加入10.95ul无酶水和9.05ul的体系mix，反应体系为25ul，体系mix配制方法见表7；PCR反应程序见表8
β-actin基因引物序列：
β-actin-F GGTCACCTCCAGGTAAATTCGAAC；
β-actin-RGGTCACCTTGTCCTCCTCTAAGATG；
β-actin-ROX TCACCCGAATGTGTACCCTTCGG(5端ROX，3端BHQ2)
表7：Q-PCR体系mix配制方法
表8：Q-PCR的程序
Figure BDA0001460194600000102
本实施例中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果,详细结果请查看附图3；
本实施例与实施例1做对比，预处理和未预处理的样本结果显示，经过预处理的样本得到的DNA模板浓度更高。
下面以QIAGEN试剂盒QIAamp Fast DNAStool Mini Kit为例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制：
对照例3使用QIAGEN试剂盒提取健康人的DNA
本对照例的DNA的提取方法，包括如下步骤：
1、粪便样品采集：
预先在粪便中铺好干净的卫生纸，然后取样人把粪便样本排在卫生纸上，取出含有15ml样本保存液SPB的取样管，用取样勺取成型的粪便样本(随机取样即可，不需刮取粪便样本指定的表面部位样本)，取到取样管2/3的刻度即可，然后拧紧取样管(确保拧紧，不要出现歪盖、漏液等情况)，注意取样时每次勺的样本大小不宜大于取样管的瓶口，避免弄脏手和取样管，以防交叉污染。取样完成后，左右轻轻摇动取样管，使大便和取样管中的保存液充分混合即可。
2、粪便样本的保存
由于粪便样本中预先添加保存液SPB，常温保存即可备用于科研或项目生产实验。
3、DNA提取流程
(1)取1ml上清液加入到2ml Eppendorf的离心管中；
(2)再加入1mlInhibitEX buffer，高速漩涡彻底混合均匀1min；
(3)14000rpm离心1min；
(4)加25ul proteinase K到一个新的Eppendorf的离心管中；
(5)转移600ul步骤(3)的上清液到加入了proteinase K的Eppendorf的离心管中；
(6)加入600ul Buffer AL，高速漩涡15S；
(7)置于70℃金属加热器中孵育10min；
(8)加入600ul无水乙醇，漩涡混匀；
(9)转移600ul步骤(8)得到的混合物到QIAamp离心柱中，关上盖子14000rpm离心1min，抛弃有滤液的收集管，换上新的2ml收集管；
(10)重复步骤(9)两次；
(11)加入500ul Buffer AW1，14000rpm离心1min，抛弃有滤液的收集管，换上新的2ml收集管；
(12)加入500ul Buffer AW2,14000rpm离心1min，抛弃有滤液的收集管；
(13)换上新的2ml收集管，14000rpm离心空甩3min；
(14)抛弃有滤液的收集管，换上新的1.5ml的离心管，直接加入50ul Buffer ATE到QIAamp离心柱中的过滤膜上，室温放置1min，14000rpm离心1min，留1.5ml离心管收集液，即获得到DNA模板；
(15)将DNA模板取1ul做thermal分光光度计核酸纯度的测定；
(16)以excel表格形式保存粗DNA浓度和纯度测定的数据；
(17)表格的内容包括:以当天日期+实验名称命名表格、样本名称、DNA总浓度(ng/ul)及样本检测的纯度等参数(如：260/280；260/230)，其中260/280数值在1.8最佳；
(18)利用人特异性β-actin引物做Q-PCR定量；
(19)要求人基因组DNA最低浓度要达到2ng/ul以上,即可满足结直肠癌项目的下游高通量测序的技术要求；
(20)实施例3中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果，详细结果请查看附图4；
(21)将DNA样本放置-20℃保存；
Q-PCR荧光定量实验：以人的β-actin为目的基因，取5ul洗脱下来的核酸溶液作为荧光定量的模板，加入10.95ul无酶水和9.05ul的体系mix，反应体系为25ul，体系mix配制方法见表7；PCR反应程序见表8
β-actin基因引物序列：
β-actin-F GGTCACCTCCAGGTAAATTCGAAC；
β-actin-RGGTCACCTTGTCCTCCTCTAAGATG；
β-actin-ROX TCACCCGAATGTGTACCCTTCGG(5端ROX，3端BHQ2)
表7：Q-PCR体系mix配制方法
Figure BDA0001460194600000121
表8：Q-PCR的程序
Figure BDA0001460194600000122
对照例3中健康人的粪便DNA样本两次平行定量的结果,详细结果请查看附图4；
本发明的提取方法与市面上购买的试剂盒的结果显示，本发明的提取方法可以得到更高浓度的DNA模板。

Claims (4)

1.一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1）样本保存液SPB；2）细胞捕获剂CCB；3）细胞裂解液I；4）DNA提取液I；5）DNA溶解液EB；6）无水乙醇和75%乙醇；
其中，
所述的样本保存液SPB 的组分及各组分在样本保存液SPB中的含量如下：EDTA100mMol/L；Tris 0.5mol/L；NaCl 10mMol/L；所述的样本保存液SPB的pH值为7；
所述的细胞捕获剂CCB的组分及各组分在细胞捕获剂CCB中的含量如下：PEG6000 150-250g/L；NaCl 2-5mol/L；
所述的细胞裂解液I的组分及各组分在细胞裂解液I中的含量如下：异硫氰酸胍472.5mg/ml；EDTA 20mmol/L；二硫苏糖醇 32.5mmol/l；TritonX-100 4%v/v；Tris-HCl10mmol/L；细胞裂解液I的pH值为6.5；
所述的DNA提取液I的组分及浓度如下：盐酸胍 573g/L；
所述的DNA溶解液EB的组分及浓度如下：Tris-HCL 10mM。
2.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述的细胞捕获剂CCB的组分及各组分在细胞捕获剂CCB中的含量如下：PEG6000 200g/L；NaCl3.5mol/L。
3.使用如权利要求1所述的试剂盒提取人粪便样本中脱落细胞DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：在预先加入固定体积的样本保存液SPB中加入粪便样本使其液位上升到取样管的指定刻度，即可满足最低取样需求，将取好的粪便样本高速漩涡混合均匀，离心弃沉淀，取粪便样本上清液即富含脱落细胞的悬浮液，然后加入等体积的细胞捕获剂CCB，混合均匀后，离心弃上清，取沉淀，即脱落细胞沉淀物，往沉淀中加入细胞裂解液I，混合均匀使沉淀完全溶解后，孵育10-15min后，加入等体积DNA提取液I混合均匀后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀核酸，获得富含核酸的母液，将此时的母液全部通过核酸吸附柱，母液中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，用75%的乙醇洗脱三次后，待残留乙醇挥发干净后，最后用DNA溶解液EB将核酸从吸附柱上洗脱下来。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的样本保存液SPB与样本的体积重量比为3ml:1g。
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