CN109517883A - 一种人粪便样本中脱落细胞的保存液 - Google Patents
一种人粪便样本中脱落细胞的保存液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种人粪便样本中脱落细胞的保存液,用来保存粪便样本中的脱落细胞,主要成分是EDTA、Tris、NaCl,其中EDTA是稳定剂,使保存液可在室温放置;Tris是缓冲剂,维持细胞内外渗透压、pH值;NaCl可维持电解质平衡,维持细胞渗透压。本保存液配比简单、成本低廉、使用方便。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人粪便样本中脱落细胞的保存液。
背景技术
结直肠癌是当今最常见的疾病之一,每年全球有约 120 万名患者被确诊为结直肠癌,而有超过 60 万名患者直接或间接死于结直肠癌。其在各地区的发病率有显著差异,这与所谓其生活方式有密切联系。男性结直肠癌的发病率高于女性。此外,结直肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加,比如发达国家的结直肠癌发病中位年龄为 70 岁。
虽然遗传因素是结直肠癌的的危险因素,但大部分结直肠癌都是散发的,并在几年内以腺瘤 - 肿瘤的形式发生。当前结直肠癌最主要的治疗手段是外科手术、新辅助放射治疗(患者是直肠癌)以及辅助化疗(患者为 III、IV 期或高风险的 II 期结肠癌)。 在生存期方面,I 期患者的 5 年生存率可达 90% 以上,而 IV 期患者只有略大于 10% 的生存率。内镜或血液筛查已被证实能有效降低结直肠癌发病率和死亡率,但大部分国家仍未开始实施有组织的筛查。
现阶段运用高通量测序技术检测人基因突变,使肠癌的早期诊断得到了进一步的发展。通过血液和粪便两种途径均可得到人的基因,但是癌细胞直接脱落进入粪便比直接进入血液早,所以从粪便样本中提取脱落细胞DNA进行检测能较早预测结直肠癌的发生。粪便中的脱落细胞较少,若取样后保存不当,导致细胞裂解,最终DNA提取失败。本保存液可以常温保存粪便样本,应用于结直肠癌早期诊断、科学研究等多个领域。
发明内容
本发明目提供一种人粪便中脱落细胞保存液及其制备方法,该保存液配比简单,成本低廉,使用方便。使用本保存液可以保存粪便样本,在常温下可以长时间保存。
本发明的第一个方面,提供了:
一种人粪便样本中脱落细胞的保存液,包括:EDTA、Tris、NaCl和灭菌水。
在一个实施方式中,所述的保存液按1L计,包括25-35g EDTA、55-65g Tris、0.2-0.8g NaCl。
在一个实施方式中,所述的保存液按1L计,包括29.2g EDTA、60.55g Tris、0.58gNacl。
在一个实施方式中,所述的保存液的余量为灭菌水。
本发明的第二个方面,提供了:
人粪便样本中脱落细胞的保存液的制备方法,包括如下步骤:
第1步,将EDTA用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到0.45-0.55mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至7.5-8.5;
第2步,将Tris 用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到0.9-1.1mol/L的Tris溶液;
第3步,将NaCl干粉用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到4.5-5.5mol/L的NaCl溶液;
第4步,按重量配比,加入EDTA溶液、Tris溶液、NaCl溶液充分混匀,调pH至6.5-7.5,再加灭菌水稀释;
第5步,分装。
本发明的第三个方面,提供了:
上述的保存液在用于人粪便样本脱落细胞保存中的用途。
在一个实施方式中,所述的脱落细胞用于DNA检测。
在一个实施方式中,所述的DNA检测采用了基于PCR的方法。
在一个实施方式中,所述的用途,包括如下步骤:将人粪便样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心得到上清,取上清液。
在一个实施方式中,在将样本与保存液混匀后,加入NaHCO3,并采用氮气对混匀液进行吹脱处理。
有益效果
本发明的一种人粪便中脱落细胞保存液及其制备方法,其有益效果在于配比简单、成本低廉、使用方便,使取样后的样本在运输、交接、提取前检测等过程中,在常温下能够长时间有效保存样本。在混合液中加入NaHCO3,在吹脱的过程中可以使样本中的H2S被吹脱气分离,提高了细胞保存质量。
附图说明
图1 显示荧光定量pcr扩增反应条件。
图2 显示荧光定量的标准品荧光定量PCR扩增。
图3是标准品的标准曲线。
图4 是用本保存液保存提取DNA所得浓度的扩增曲线。
具体实施方式
实施例1
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55gTris干粉、0.58g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉29.2g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将Tris干粉60.55g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
3)将2.92Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
4)依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸(陈思媛, 郭明璋, 贺晓云, etal. 用于分子生物学检测的粪便DNA的提取方法优化[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(12):1509-1517.)。
实施例2
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有25g EDTA干粉、65g Tris干粉、0.2g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉25g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将Tris干粉65g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
3)将1.01Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
4)依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
实施例3
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有35g EDTA干粉、55g Tris干粉、0.8g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉35g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将Tris干粉55g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
3)将4.02Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
4)依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
实施例4
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55gTris干粉、0.58g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉29.2g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将Tris干粉60.55g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
3)将2.92Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
4)依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,再在混合液中加入0.2gNaHCO3,并使用氮气进行吹脱处理10min,处理之后,将混合液放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸(陈思媛, 郭明璋, 贺晓云, et al. 用于分子生物学检测的粪便DNA的提取方法优化[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(12):1509-1517.)。
对照例1
与实施例1的区别是:保存液中未加入EDTA干粉。
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有60.55g Tris干粉、0.58g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将Tris干粉60.55g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
2)将2.92Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
3)依次分别加入500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
对照例2
与实施例1的区别是:保存液中未加入Tris干粉。
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、0.58g NaCl干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉29.2g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将2.92Nacl干粉倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。
3)依次分别加入200ml EDTA溶液、2ml Nacl溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
对照例3
与实施例1的区别是:保存液中未加入NaCl干粉。
保存人粪便中细胞的保存液,其特征在于,在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55g Tris干粉,余量为灭菌水。
所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法,包括以下步骤:
1)将EDTA干粉29.2g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至8。
2)将Tris干粉60.55g倒入烧杯,用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
3)依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液充分混匀,调pH至7,再加灭菌水至1L。
往30mL取样管中加入15mL保存液,以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中,盖紧管盖,常温放置。将样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心30min以上得到上清,取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA;再经化学法和酶法破碎细胞壁后,用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
采用上述实施例1~4以及对照例1~3中得到的DNA样本,取1μl进行Qubit定量。
表1 DNA样本定量结果
从上表中可以看出,采用本发明的方法可以获得纯度较好的DNA样本,而在对照例中的保存液存在着细胞发生降解的问题,使得A260/A280值升高,并且DNA提取量较低。而实施例4中采用了吹脱处理,可以有效地消除掉粪便中的H2S对样本的影响,可以提高DNA提取效果。
实时荧光定量pcr扩增及定量
1试剂准备
采用实施例1中的保存液得到的DNA样品,按比例混合pcr扩增反应体系的成分,充分混匀后备用。
2加样
向pcr反应管中加入pcr扩增反应体系20ul,再分别加入标准品5ul、待测样本5ul和无酶水5ul,盖紧管盖,放入仪器样品槽。
3编辑(BIO-RAD CFX96)
打开仪器相应的软件,点击File新建扩增反应循环条件:94℃ 5分钟,94℃30秒,56℃30秒,4个循环,92℃ 30秒,62℃ 30秒,35个循环(见附图1),点击ok后保存。点击NEXT到plate setup,按对应顺序设置标准品、待测标本和无酶水,并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔,点击select Fluorophores,选择ROX点击ok,回到之前的页面后再点击ok保存。点击NEXT到下一个页面,再点击start run运行。
4检测结果,附图2、3、4。
可以看出,采用本发明的方法得到的DNA样本可以适合于实时荧光定量PCR的方法。
Claims (10)
1.一种人粪便样本中脱落细胞的保存液,其特征在于,包括:EDTA、Tris、NaCl和灭菌水。
2.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液,其特征在于,所述的保存液按1L计,包括25-35g EDTA、55-65g Tris、0.2-0.8g NaCl。
3.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液,其特征在于,所述的保存液按1L计,包括29.2g EDTA、60.55g Tris、0.58g Nacl。
4.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液,其特征在于,所述的保存液的余量为灭菌水。
5.权利要求1-4任一所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第1步,将EDTA用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到0.45-0.55mol/L的EDTA溶液,再用浓盐酸调pH至7.5-8.5;
第2步,将Tris 用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到0.9-1.1mol/L的Tris溶液;
第3步,将NaCl干粉用少量灭菌水溶解,溶解完全后加灭菌水得到4.5-5.5mol/L的NaCl溶液;
第4步,按重量配比,加入EDTA溶液、Tris溶液、NaCl溶液充分混匀,调pH至6.5-7.5,再加灭菌水稀释;
第5步,分装。
6.权利要求1-4任一所述的保存液在用于人粪便样本脱落细胞保存中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的脱落细胞用于DNA检测。
8.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的DNA检测采用了基于PCR的方法。
9.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的用途,包括如下步骤:将人粪便样本与保存液充分混匀,放入离心机中离心得到上清,取上清液。
10.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,在将样本与保存液混匀后,加入NaHCO3,并采用氮气对混匀液进行吹脱处理。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190326 |
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