CN112029824A

CN112029824A - 一种通用于多种样本的核酸保存液

Info

Publication number: CN112029824A
Application number: CN202010966123.6A
Authority: CN
Inventors: 柳辉
Original assignee: Beijing Kangmei Tianhong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Kangmei Tianhong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明公开了一种通用于多种样本的核酸保存液。本发明提供了一种核酸保存液，含有如下溶质：盐酸胍2‑8M，Tris‑HCl 5‑10mM，EDTA 0.5‑10mM，NaCl 0.5‑1.0g/100ml，N‑甲基‑N‑环己基‑2‑氨基‑3,5‑二溴苯甲胺盐酸盐0.5‑10g/100ml。本发明提供的核酸保存液，主要有三个优势：(1)裂解细胞和/或病毒，促使蛋白变性，使得病毒被灭活，从而具有良好的安全性；(2)通用适用于多种样本；(3)可以实现核酸的长期保存。

Description

一种通用于多种样本的核酸保存液

技术领域

本发明属于临床医学技术领域，涉及一种通用于多种样本的核酸保存液。

背景技术

随着生物技术以及医学的发展，越来越多的领域需要用到核酸检测，例如遗传风险性评估、传染病患者的筛查、病人的精准用药等等。

核酸检测涉及到取样和检测两个环节。从空间上来看，两个环节往往处于不同空间，近的话可能处于医院的门诊采样室和化验室，远的话可能处于甲省市的病人家和乙省市的核酸检测实验室。从时间上来看，两个环节往往是非连续性的，可能是上午取样下午检测，也可能是当天取样一周后检测。因此，在取样环节和检测环节中还存在一个关键环节，即运输/保存环节。

对于运输/保存环节来说，需要用到核酸保存液。核酸保存液的性能，对于核酸的保存条件要求以及核酸的保存时间来说，具有至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用于多种样本的核酸保存液。

本发明提供了一种核酸保存液，含有如下溶质：盐酸胍2-8M，Tris-HCl 5-10mM，EDTA 0.5-10mM，NaCl 0.5-1.0g/100ml，N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.5-10g/100ml。

具体的，所述核酸保存液含有如下溶质：盐酸胍3M、Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM、NaCl 0.9g/100ml、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐1g/100ml。

所述核酸保存液中，余量为水。

所述核酸保存液的pH为7-8。

具体的，所述核酸保存液的pH为7.4。

本发明还保护以上任一所述核酸保存液在保存生物样本中的应用。

本发明还保护以上任一所述核酸保存液在保存生物样本的核酸中的应用。

所述生物样本为口腔拭子、鼻拭子、咽拭子、痰液、尿道拭子、宫颈拭子、呼吸道灌洗液或肺泡灌洗液。

所述生物样本为动物或微生物。

具体的，所述生物为人。

本发明提供的核酸保存液可以更长时间的保存生物样本的核酸，保护寄主生物的核酸和寄生微生物的核酸，从而可以用于细菌感染或病毒感染的检测。

面对不同类型样本，需要从众多产品中选择适当的细胞保存液，因此开发一种通用型保存液,对使用者来说可以减少选择的时间，同时对厂家而言，便于统一安排生产，降低生产成本，具有很好的应用前景和经济效益。

本发明提供的核酸保存液，主要有三个优势：(1)裂解细胞和/或病毒，促使蛋白变性，使得病毒被灭活，从而具有良好的安全性；(2)通用适用于多种样本；(3)可以实现核酸的长期保存。

本发明可用于病毒检测，特别适用于传染性强的病毒，例如新型冠状病毒。

附图说明

图1为实施例3中第7天的样本的示例性结果。

图2为实施例4中的结果。

图3为实施例5中的结果。

图4为实施例6中第10天的样本的结果。

图5为实施例7中第10天的样本的结果。

图6为实施例8中第10天的样本的结果。

图7为实施例9中第10天的样本的结果。

图8为实施例10中第10天的样本的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。EDTA，全称为乙二胺四乙酸。实施例中的核酸提取均采用北京康美天鸿生物科技有限公司生产的核酸提取试剂，型号为Ex-DNA/RNA，按说明书操作。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、核酸保存液的制备

核酸保存液(pH7.4)：含盐酸胍3M、Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM、NaCl 0.9g/100ml、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐1g/100ml，余量为水。

核酸保存液也可用作样本采集液，采集后直接保存，通用于多种样本。

多种样本指的是：口腔拭子、鼻拭子、咽拭子、痰液、尿道拭子、宫颈拭子、呼吸道灌洗液或肺泡灌洗液。

实施例2、核酸提取效果测试

采用实施例1制备的核酸保存液。

10位知情同意的志愿者分为两组，每组5位。

1、核酸提取

第一组：每位志愿者采集1个口腔拭子，每个口腔拭子重悬于1mL核酸保存液中，24小时内取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

第二组：每位志愿者采集1个口腔拭子，每个口腔拭子重悬于1mL生理盐水中，24小时内取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

2、荧光定量PCR

将步骤1得到的核酸溶液作为模板，进行荧光定量PCR。

用于检测人基因组管家基因的引物探针如下：

Human IC-F：5’-ATGGACACGCTCCCCTGAC-3’；

Human IC-R：5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAA-3’；

Human IC-P：5’-GCAATGCCTCCTGCACCACCAA-3’。

Human IC-P为探针，5’末端具有荧光基团CY5，3’末端具有淬灭基团BHQ2。

反应体系的组成：模板、10×PCR Buffer、MgCl₂、dNTP/dUTP Mixture、Human IC-F、Human IC-R、Human IC-P、BSA、Taq DNA聚合酶、UDG酶、灭菌超纯水。

每个反应体系为30μL。每个反应体系中，模板的加入量为2μL、Taq DNA聚合酶的加入量为1.0U、UDG酶的加入量为0.1U。反应体系中，若干组分的浓度为：1×PCR Buffer、3mMMgCl₂、0.1μM Human IC-F、0.1μM Human IC-R、0.05μM Human IC-P、0.4mg/mL BSA。反应体系中，dATP/dCTP/dGTP的浓度均为0.2mM，dUTP的浓度为0.4mM。

Taq DNA聚合酶：北京六合通经贸有限公司，货号为R500A。UDG酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为A640016-0200。10×PCR Buffer(Mg²⁺free)：宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为9151AM。dNTP/dUTP Mixture(提供dATP/dCTP/dGTP/dUTP)：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B602236。

反应条件见表1。

表1

每组的5个样本的Ct值结果见表2。结果显示：各个样本均能有效检出人基因组管家基因。结果表明，与生理盐水相比，核酸保存液中的各个组分对于核酸提取效果没有产生不良影响。

表2

第一组	29.27	29.31	29.45	29.12	29.52
						第二组	29.28	29.43	29.53	29.63	29.78

实施例3、细胞保存效果测试

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的口腔拭子，每位志愿者得到2个口腔拭子。志愿者1得到的口腔拭子为口腔拭子1-1、口腔拭子1-2。志愿者2得到的口腔拭子为口腔拭子2-1、口腔拭子2-2。

1、核酸提取

口腔拭子1-1和口腔拭子2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

口腔拭子1-2和口腔拭子2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

将核酸提取得到的核酸溶液作为模板，进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR同实施例2。

Ct值结果见表3。第一天时，细胞保存液和生理盐水对细胞均有很好的保存效果。第二天时，使用生理盐水保存的脱落细胞，检测效果稍有降低，可能与DNA降解有关。第三天至第十天时，采用核酸保存液保存的效果没有变化，而生理盐水保存的效果降低。

第7天的样本的示例性结果见图1。

表3

实施例4、细胞保存效果测试

采用实施例1制备的核酸保存液。

将序列表的序列1所示的肺炎支原体基因片段插入PUC57载体，得到MP重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5α，得到MP重组菌。

采集2位知情同意的志愿者的口腔拭子，得到2个口腔拭子。

1、核酸提取

每个口腔拭子分别重悬于1mL核酸保存液中，然后加入MP重组菌(使菌浓度达到10⁸-10⁹个/mL)，混匀。2-8℃保存24小时后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

2、荧光定量PCR

将核酸提取得到的核酸溶液作为模板，进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR检测人基因组管家基因，同实施例2。

荧光定量PCR检测MP基因基本同实施例2，差异仅在于替换引物和探针。

用于检测MP基因的引物和探针如下：

MP-F：5′-TGCCATCAACCCGCGCTTAAC-3′；

MP-R：5′-TCGACGGGGACCTTGTTTTTG-3′；

MP-P：5′-CAAACCGGGCAGATCACCTTT-3′。

MP-P为探针，5′末端具有荧光基团FAM，3′末端具有淬灭基团MGB。

Ct值结果见表4和图2。能有效检出人基因组管家基因和MP基因。

表4

	口腔拭子1	口腔拭子2
			MP基因	26.53	26.672
人基因组管家基因	30.17	30.22

步骤1中2-8℃保存24小时后取样的样本，进行平板培养，未观察到MP重组菌。

实施例5、细胞保存效果测试

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的口腔拭子，得到2个口腔拭子。

1、核酸提取

每个口腔拭子分别重悬于1mL核酸保存液中，然后加入金黄色葡萄球菌ATCC25923(使菌浓度达到10⁸-10⁹个/mL)，混匀。2-8℃保存24小时后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

2、荧光定量PCR

将核酸提取得到的核酸溶液作为模板，进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR检测人基因组管家基因，同实施例2。

荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femB基因基本同实施例2，差异仅在于替换引物和探针。

用于检测金黄色葡萄球菌femB基因的引物和探针如下：

SA-F：5'-TAACGAAATGGGCAGAAA-3'；

SA-R：5'-GCAACACCCTGAACTT-3'；

SA-P：5'-TAACTGGATGGTACGCGC-3'。

SA-P为探针，5′末端具有荧光基团FAM，3′末端具有淬灭基团MGB。

Ct值结果见表5和图3。能有效检出人基因组管家基因和金黄色葡萄球菌femB基因。

表5

	口腔拭子1	口腔拭子2
			金黄色葡萄球菌femB基因	25.83	26.13
人基因组管家基因	29.14	29.67

步骤1中2-8℃保存24小时后取样的样本，进行平板培养，未观察金黄色葡萄球菌。

实施例6、细胞保存效果测试(痰液)

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的痰液样本，每位志愿者得到2份样本。志愿者1得到的痰液样本为痰液1-1、痰液1-2。志愿者2得到的痰液样本为痰液2-1、痰液2-2。

1、核酸提取

痰液1-1和痰液2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

痰液1-2和痰液2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表6。第10天的样本的结果见图4。

表6

实施例7、细胞保存效果测试(尿道拭子)

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的尿道拭子，每位志愿者得到2份样本。志愿者1得到的尿道拭子为尿道拭子1-1、尿道拭子1-2。志愿者2得到的尿道拭子为尿道拭子2-1、尿道拭子2-2。

1、核酸提取

尿道拭子1-1和尿道拭子2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

尿道拭子1-2和尿道拭子2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表7。第10天的样本的结果见图5。

表7

实施例8、细胞保存效果测试(鼻拭子)

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的鼻拭子，每位志愿者得到2份样本。志愿者1得到的鼻拭子为鼻拭子1-1、鼻拭子1-2。志愿者2得到的鼻拭子为鼻拭子2-1、鼻拭子2-2。

1、核酸提取

鼻拭子1-1和鼻拭子2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

鼻拭子1-2和鼻拭子2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表8。第10天的样本的结果见图6。

表8

实施例9、细胞保存效果测试(咽拭子)

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的咽拭子，每位志愿者得到2份样本。志愿者1得到的咽拭子为咽拭子1-1、咽拭子1-2。志愿者2得到的咽拭子为咽拭子2-1、咽拭子2-2。

1、核酸提取

咽拭子1-1和咽拭子2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

咽拭子1-2和咽拭子2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表9。第10天的样本的结果见图7。

表9

实施例10、细胞保存效果测试(宫颈拭子)

采用实施例1制备的核酸保存液。

采集2位知情同意的志愿者的宫颈拭子，每位志愿者得到2份样本。志愿者1得到的宫颈拭子为宫颈拭子1-1、宫颈拭子1-2。志愿者2得到的宫颈拭子为宫颈拭子2-1、宫颈拭子2-2。

1、核酸提取

宫颈拭子1-1和宫颈拭子2-1分别重悬于1mL核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

宫颈拭子1-2和咽拭子2-2分别重悬于1mL生理盐水中，混匀，2-8℃保存，分别于保存的第1天、第2天、第3天、第7天、第10天，各取样200μL(振荡混匀后取液相)，每个取样样本分别进行核酸提取。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表10。第10天的样本的结果见图8。

表10

实施例11、核酸保存液比较

核酸保存液1(pH7.4)：盐酸胍3M，Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl 0.9g/100ml，余量为水。

核酸保存液2(pH7.4)：盐酸胍3M，Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl 0.9g/100ml，SDS 0.2g/100ml，余量为水。

采集2位知情同意的志愿者的咽拭子，每位志愿者得到3份样本。志愿者1得到的咽拭子为咽拭子1-1、咽拭子1-2、咽拭子1-3。志愿者2得到的咽拭子为咽拭子2-1、咽拭子2-2、咽拭子2-3。

1、核酸提取

咽拭子1-1和咽拭子2-1分别重悬于1mL实施例1制备的核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

咽拭子1-2和咽拭子2-2分别重悬于1mL核酸保存液1中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

咽拭子1-3和咽拭子2-3分别重悬于1mL核酸保存液2中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表11。

表11

	咽拭子1-1	咽拭子2-1	咽拭子1-2	咽拭子2-2	咽拭子1-3	咽拭子2-3
							第1天	25.67	25.73	25.84	25.68	25.88	25.75
第3天	25.86	25.63	28.69	28.85	29.74	29.56

实施例12、核酸保存液比较

核酸保存液3(pH7.4)：盐酸胍1M，Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl 0.1g/100ml，N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.3g/100ml，余量为水。

核酸保存液4(pH7.4)：盐酸胍0.1M，Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl 0.3g/100ml，N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.1g/100ml，余量为水。

采集2位知情同意的志愿者的痰液样本，每位志愿者得到3份样本。志愿者1得到的痰液样本为痰液1-1、痰液1-2、痰液1-3。志愿者2得到的痰液样本为痰液2-1、痰液2-2、痰液2-3。

1、核酸提取

痰液1-1和痰液2-1分别重悬于1mL实施例1制备的核酸保存液中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

痰液1-2和痰液2-2分别重悬于1mL核酸保存液3中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

痰液1-3和痰液2-3分别重悬于1mL核酸保存液4中，混匀，2-8℃保存，分别于第1天和第3天后取样(振荡混匀后取液相)，进行核酸提取，得到核酸溶液。

2、荧光定量PCR

同实施例2的步骤2。

Ct值结果见表12。

表12

	痰液1-1	痰液2-1	痰液1-2	痰液2-2	痰液1-3	痰液2-3
							第1天	26.75	26.55	26.73	26.69	26.87	26.71
第3天	26.43	26.51	29.57	29.44	32.75	32.52

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京康美天鸿生物科技有限公司

<120> 一种通用于多种样本的核酸保存液

<130> GNCYX201953

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)

<400> 1

aatgccatca acccgcgctt aaccccgtga acgtatcgta acacgagctt ttcctccctc 60

cccctcacgg gtgaaaatcc cggggcgtgg gccttagtgc gcgacaacag cgctaagggc 120

atcactgccg gcagtggcag tcaacaaacc acgtatgatc ccacccgaac cgaagcggct 180

ttgaccgcat caaccacctt tgcgttacgc cggtatgacc tcgccgggcg cgccttatac 240

gacctcgatt tttcgaagtt aaacccgcaa acgcccacgc gcgaccaaac cgggcagatc 300

acctttaacc cctttggcgg ctttggtttg agtggggctg caccccaaca gtgaaacgag 360

gtcaaaaaca aggtccccgt cgaggtggcg caagacccct ccaatcctta tcggtttgcc 420

gttttactcg tgccgcgtag cgtggtgtac tatgagcagt tgcagcgggg gttagcgctc 480

cctaaccaag ggagttcgtc aggctcagac agcactaacc aaacaggcgc aatgtttggc 540

ttgaaggtga aggatgcaac cgtggatagt tcgaagcaat caacggaaag cttaaagggc 600

Claims

1.核酸保存液，含有如下溶质：盐酸胍2-8M，Tris-HCl 5-10mM，EDTA 0.5-10mM，NaCl0.5-1.0g/100ml，N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.5-10g/100ml。

2.如权利要求1所述的核酸保存液，其特征在于：含有如下溶质：盐酸胍3M、Tris-HCl10mM、EDTA 1mM、NaCl 0.9g/100ml、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐1g/100ml。

3.如权利要求1或2所述的核酸保存液，其特征在于：所述核酸保存液中，余量为水。

4.如权利要求1至3中任一所述的核酸保存液，其特征在于：所述核酸保存液的pH为7-8。

5.如权利要求4所述的核酸保存液，其特征在于：所述核酸保存液的pH为7.4。

6.权利要求1至5中任一所述核酸保存液在保存生物样本中的应用。

7.权利要求1至5中任一所述核酸保存液在保存生物样本的核酸中的应用。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述生物样本为口腔拭子、鼻拭子、咽拭子、痰液、尿道拭子、宫颈拭子、呼吸道灌洗液或肺泡灌洗液。

9.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述生物样本为动物或微生物。