JPH05508307A

JPH05508307A - ヒトの結腸直腸ガンで欠失した遺伝子

Info

Publication number: JPH05508307A
Application number: JP3502772A
Authority: JP
Inventors: ヴォーゲルシュタイン，バート
Original assignee: ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
Priority date: 1990-01-04
Filing date: 1990-12-19
Publication date: 1993-11-25
Also published as: EP0507852A4; CA2073186C; US5650281A; US5874545A; US5561223A; AU649431B2; CA2073186A1; WO1991009964A1; AU7158591A; EP0507852A1; ES2115611T3; DE69032209D1; US5532108A; DE69032209T2; DK0507852T3; US5602243A; ATE164629T1; EP0507852B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ヒトの結腸直腸ガンで欠失した遺伝子発■辺利用分野本発明はガンの診断の分野に関している。とりわけ、本発明はガン組織における野生型口ＣＣ遺伝子の欠失及び／または変異の検出に関している。従来辺技術結腸直腸ガンの発生過程に於て起きるいくつかの遺伝的な変異−その最もよ（起きる例は、１ｌ染色体の短腕（１７ｐ　）および１羽−色体の長腕（１８ｑ　）の欠失である−が、最近の研究によって解明されてきた。　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。ｖｏｌ、　２４４．　ｐ、２０７　（１９８９）；　Ｆｅａｒｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２３８．　ｐ、１９R　（１９８７）；　Ｍｕｌｅｒｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（Ｐａｒｉｓ）、　ｖｏｌ、　２８＋　ｐ−２０６（１９８５）；　Ｍ盾獅垂■嘯≠煤B ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　ｖｏｌ、　４１．　ｐ、　４０４　（１９８ｇ）、ＲＡＳ遺伝子の変異のようないくつかの遺伝的な変異は、結腸直腸ガンの発生過程の比較的初期の段階に起こると考えられる一方、染色体１８ｑの欠失はクラス■からクラス■腺腫への移行あるいは良性（腺腫の）から悪性（腫瘍の）状態への移行に伴ってしばしば後期に起こり（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｖｏｌ、　３P９＋Ｐ、５２５．１．９８８　）　、転移と生存期間の減少に関連しているように見える（Ｋｅｒｎ＋　ｅｔａｌ、、　ＪＡＭＡ、　ｖｏｔ、　２６１．９ｐ、　１３０９９−１３１０３．１９８９　）　、　ＩＩＸＩはしばしば致死性であるため、この移行を仲介する分子レベルの事象のアウトラインを描くことは非常に重要である。染色体１８ｑの広い領域を包合する対立遺伝子の欠失は報告されている（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　１ｂｉｄ、　）　、この領域はＢｃＬ−２遺伝子（ＴｓｕｊｉＩｌｏｔｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２２６．　ｐ、　１０９７　（１９８４）；およびＣ１ｅａｒｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　ｖｏｌ、　４７{　ｐ。１９　（１９８６）、）ガストリン分泌ペプチド遺伝子（Ｓｐｉｎｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　［ＩＳＡ、　ｖａｌ、　８１．　ｐ、　５６９９　（１９８４）、）およびＹＥＳ−１ガン遺伝子の細胞内ホモローブ（Ｓｅｍｂａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２２７．　ｐ、　１０３８　（１９８５）およびＹＯｓｈｉｄａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、　ｖｏｌ、　４０＋　ｐ、　７８６　（１９８５）　）■■■■ いることが知られている。これらの遺伝子は全てガンに関わっていることが知られている。染色体の特別な領域が欠失の対象となっているとしたら、すなわち、それが新生過程に関わっているとすれば、その領域の正確な輪郭は、治療法のみならず診断法を提供するために必要である。腫瘍形成に対するＫｎｕｄｓｏｎのモデル（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｖｏｌ−４５＋　ｐ、　１４８２゜１９８５　）に従えば、全ての正常細胞には腫瘍抑制遺伝子が存在し、変異によってそれら力１能を失うと、新生過程を引き起こす、このモデルに対する証拠は、網膜芽腫および結腸直腸ガンの場合に於て発見されている。これらの縣に関与する抑制遺伝子、ＲＢおよびｐ５３は解析された多くの腫瘍の場合に於て欠失または変異が起きていることが見いだされた。抑制遺伝子の欠損またはそこで生じた細胞を検出することを可能とし、新生過程をやわらげるまたは逆転させることによって欠損を癒していくために、ガンの診断と治療の技術に於て、腫瘍形成に関与するその他の抑制遺伝子を見いだすことが必要である。兄労Ｑ概要ヒトの新生＆ＩＩ織の診断と予測の方法を提供することが本発明の目的の−、つである。野生型ＤＤＣ遺伝子の機能を当該遺伝子機能を失った細胞に供給する方法を提供することが本発明のその他の目的である。復製連鎖反応によってＤＤＣ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するためのキットを提供することが本発明のさらにその他の目的である。ヒ）　口ＣＣ遺伝子における変異を検出するための核酸プローブを提供することが本発明のなおさらにその他の目的である。遺伝的にガンになりやすい体質を検出する方法を提供することが本発明のその他の目的である。［ＩＣＣ遺伝子産物をコードするＣ開Ａ分子を提供することが本発明のさらにその他の目的である。ヒトＤＣＣタンパク質の調製物を提供することが本発明のなおその他の目的である。本発明のこれらおよびその他の目的は以下に記述されるｊ４の一つまたはそれ以上によって提供される。本発明の一つの態様ではヒト新生組織の診断または予測の方法は以下のことを含んで提供される：ヒトから組織を単離すること；および野生型口ＣＣ遺伝子の欠失または当該組織由来の発現産物、組織の新生を意味し、転移及び初期死に関連する当該欠失を検出すること。本発明のその他の態様では、口ＣＣ遺伝子中の変異のために当該遺伝子機能を失った細胞に、野生型ＯＣＣ遺伝子機能を供給するための方法が提供されており、以下のものを含む：当該野生型遺伝子が細胞内で発現するような当該遺伝子機能を失った細胞に野生型ＯＣＣ遺伝子を導入すること。その他の態様では細胞への野生型ＤＣＣ遺伝子機能の供給方法は、野生型ＯＣＣ遺伝子の一部を、当該部分を細胞内で発現するという当該遺伝子機能、当該細胞の非新生増殖に必要とされるｎｃｃタンパク質の一部をコードする当該部分を失った細胞に導入することを包合して供給される。さらにその他の態様では、複製連鎖反応によって口ＣＣ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するためのキットが提供されている０本キットは以下のものを含むニ一本１ｉＤＮ＾プライマーの組のセット、染色体１８ｑから得られた当該セットの配列、　［ｌＣＣ遺伝子コード配列の全ヌクレオチド野合成を可能にする当該セット。本発明の、なおさらにその他の態様では、ヒト野生型ロ江遺伝子コード配列に相補的で、変異口ＣＣ遺伝子とミスマツチを形成可能なため、酵素的或は化学的切断または、電気泳動度の変化によってその検出を可能にするような核酸プローブ供給している。その他の態様では種層細胞において挿入変異をうけるＤＣＣイントロンにハイブリダイズする特別な核酸プローブが提供されている。本発明のさらにその他の態様ではヒトにおける新生組織の存在を検出するための方法を提供している。この方法はヒトから体のサンプルを単離することを含んでいる；当該サンプルにおける野生型ＤＣＣ遺伝子配列または野生型ＤＣＣ発現産物の欠失、ヒトに於ける新生組織の存在を意味する当該欠失の検出。なおさらにその他の態様ではヒトに於て遺伝的にガンになりやすい体質を検出するための方法力咽供されており、以下のものを含んでいる：血液及び胎児組織を含む集団から選択されたヒトのサンプルの単離：サンプルにおける野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列またはその発現産物の欠失、ガンになりやすい体質を意味する当該欠失の検出。さらにその他の態様では、口ＣＣ遺伝子のコード配列を含むｃＤＮ八分へが提供されている。さらにその他の態様では、実質的に他のヒトのタンパク質を含まないヒトＩ］ＣＣタンパク質の調製物が提供されている。このタンパク質のアミノ酸配列は図５に示されている。本発明は、これまで未知であった口ＣＣ遺伝子が実際、染色体上における欠失、挿入及び点突然変異といった変異を受ける対象であり、これらの変異方咽瘍の形成過程と結びついているという、情報とともに技術を提供している。この情報によって、特定の組織の新生状態または個人の潜在的な新生状態の評価を行なう非常に特異的な分析が可能になった。凹面りＷＪ単参説朋図１は染色体歩行の地図およびＤＣＣ領域における交差ハイブリダイズ断片を表わしている。３０回の歩行によってクローン化された約３７０ｋｂのＤＮＡ　８ｉ域が示されている：各回の最大の歩行のみが示されている。”０”における地図の位置はρ１５−６５の局在を示している。この領域に対するＥｃｏＲＩ地図が作成か顛緩い条件下（５５°Ｃ）でげっ歯頚、トリ、またはアフリカッメガエルＤＮＡサンプルにハイブリダイズするＥｃｏＲＩ断片は、四角で囲みアルファベット（＾−Ｘ）で示している、ヒト断片Ｇ、　Ｉ、　Ｊ、　Ｋ、　Ｍ、　０およびＰはラットのクローンの鵜に用いられた。交差ハイブリダイゼーシヨンの最少領域は同定さねヘヒトおよびラット断片の両方について配列が決定された。ヒトｃＤＮＡにハイブリダイズしたＥｃｏＲＩ断片の位置は矢印で示されている。図２はヒト断片０（左のパネル）およびヒト断片Ｐ（右のパネル）とハイブリダイズした、マウス（Ｍ）、ラット（Ｒ）、ハムスター（Ｈ）、トリ（Ｃ）、ｋ調四り艮式」（Ｆ）　、およびＳ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｙ　）から得られた［）ＮＡのサザンブローｔトのオートラジオグラフを示している。キロベース単位の対応する分子量マーカーは二つのパネルの間に示されている。図３はいくつかのヒト断片およびそれらに対応するラフトホモローブのヌクレオチド配列、予想されるアミノ酸（＾Ａ）配列（１文字表記）およびスプライシングのアクセプターおよびドナＨ立置を示している。示されたもの以外はラット断片のヌクレオチド配列はヒトのものと一致している。予想されるラットのアミノ酸配列がヒトのものと異なる場合、ヒトの配列はスラッシュの左に、ラットの配列は右に示している。ラットに比して対応する配列のないヒトの断片０およびＰの中の領域はダッシュで示している。予想されるイントロンとエクソンの境界は矢先で、スプライシングのアクセプター配列に先立つラリアートシグナルとなり得る配列は２重線で示している。図４は８Ｂ２細胞系または正常ヒト脳のいずれかの−ＲＮ＾から顛された重複するｃＯＮＡクローン力）ら得られたヌクレオチド配列を示している。読み取り枠（ＯＲＦ）を開始するメチオニンコドンはアミノ酸２０２で示さｔＬ、最後のアミノ酸は１６４８と番号が振られている。図５はヒト腫瘍および結腸直腸ガン細胞系に於けるｎｃｃの発現を示している。ｌ？ＮＡは単離され、ｃＤＮＡの第−鎖を調製するための鋳型として用いられた。　ｃＤＮＡサンプルは複製連鎖反応（ＰＣＲ）分析に用いられた。ＰＣＲ産物はアガロースゲルを用いた電気泳動によって分離さＬサザントランスファーの後、放射性ラベルされた断片Ｐのサブクローンによってハイブリダイズされた。　ＲＮＡは正常ヒト脳（レーン１）、４つの異なる結腸粘膜標本（レーン２−５）または結腸直腸腫瘍細胞系（レーン６−１６）から単離された。図６Ａは二人の正常な個人の末梢血液リンパ球のＤＮＡから調製されたサザンプロットを放射性標識したｃＤＮ＾プローブ（ｐＤＣＣ１，６５）とハイブリダイズしたもののオートラジオグラフを示している。　ｐｏｃｃ　１．６５は図５に示すｃＤＮＡの５９１から２２５０　ヌクレオチドを含んでいる。　ｋｂ単位の断片のサイズはプロットの右側に示している。　ｐＤＣＣ１，６５で検出される０−４５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片はゲルから流れきっており、従って図には含まれていない。図６８は５１１５由来の正常（Ｎ）および腫瘍（Ｔ）の冷凍切片のＤＮＡに対してプローブｐＫｃ４３０　（Ｉ　Ｊ５ｋｂ　ｃＩＩＮ＾の３゛領域由来）を用いたサザンプロットを示している。このプローブは図５に示すｃＤＮＡの１７６０から２２０５ヌクレオチドを含んでいる図７ＡはＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＯ１０９で切断した正常及び腫瘍ＤＮＡサンプル由来のＤＮＡのサザンプロットを示している。　ＤＮＡはその後、断片Ｐ由来のエクソンを含む０．４ｋｂのゲノム断片とハイブリダイズされた。ｋｂ単位の分子量ζよ左に示している；矢頌は挿入のある種ｆｌ、ＤＮＡ断片を示している。　［ｌＮ＾サンプルは：レーン１及び２；二人の正常な個人の末梢血液リンパ球；レーン３及び４：それぞれ非新生結腸および愚者Ｃｘ１からの結１１１ｒＪｉ腫瘍の異種間移植；レーン５及び６：それぞれ非新生結腸および患者５１７５からの結腸直腸腫瘍の凍結切片：レーン７；患者Ｃｘ１Ｏからの腫瘍異種間移植；レーン８：結腸直腸腫瘍細胞系ＲＫＯ，レーン９：結腸直腸細胞系５ＮＵ６３０：レーンＩＩ：結腸直腸細胞系５Ｗ４８ＢレーンＩ２；結腸ｆｌ細胞系ＦＩＣＴＩ　６、から顛された。図７ＢはパネルＡに示した挿入の起きている１７０ｂｐ　Ｘｂａｌ−Ｅｃｏ０１０９断片の配列を示している。配列の上部の番号はｂｐ単位で断片Ｐ内に含まれているエクソンの３゛端からの距離を示している。　ＸｂａｌとＥｃｏ０１０９の制限酵素部位は示されている。ｎ繰り返し配列の二つの領域は２重線で、プリン−ピリミジン配列の変化した１３０ｂｐの領域は先頭の間に含まれている。図８ＡはＤＣＣの４つのイムノグロブリン様領域の配列のホモロジーを互いに、そして、トリＮ−ＣＡＭＩＮ−ＣＡＭ（ｃ）ｉおよびマウスＮ−ＣＡＭｉＮ−ＣＡＭ（ｍ）］　と比較したものを示している。示されたＮ−ＣＡＭ（ｃ）およびＮ−ＣＡＭ（ｍ）配列は各タンパク質に存在する５つのＩ併最碩域の共通はいれつを表わしている；　Ｎ−ＣＡＭ（ｃ）またはＮ−ＣＡＭ（ｍ）の特別な位置に共通配列が存在しないと（すなわち、もし二つの領域が同一の残基を含まなければ）、位置はＸによって示される。並びの中に挿入された空白はダッシュで示している。ドメイン間のジスルフィド結合に関わると考えられる保存されたシスティンは、三角で示している。　Ｎ−ＣＡＭおよび０２クラスのその他の類似のｒｇ様領領域おいてよく保存されたその他のアミノ酸残基（＠ｉｌｌｉａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ。Ｒｅｖ、　Ｉｗｕｎｏｌ、、　ｖｏｌ、　６．　ｐ、　３８１．　（１９８８））は白抜きの三角で示している。配列列はＤ印共通配列と一致した場合は四角で囲んでいる。図８８はＤＣＣおよびトリおよびマウスＮ−ＣＡＭの間での、フィブロネクチン −タイプＩＮ−関連領域の配列のホモロジーの比較を示している。詳縄在説烟腫瘍形成をともなった変異の発生が、染色体１８ｑ上のここでＯＣＣ（結腸直腸における欠失）遺伝子と名付けられたこれまで知られていなかった遺伝子に於て起こっていることは本発明における発見である。染色体１８ｑに於ける対立遺伝子の欠失があるタイプのガンに共通の事象であることはこれまでに知られていたが、これらの欠失の標的遺伝子がＤＣＣ遺伝子であることは知られていなかった。さらに、ＯＣＣ遺伝子におけるその他の変異発生もまたガンを伴うことは知られていなかった。　ｎｃｃ遺伝子の変異は挿入および欠失といった甚だしい配列の変化を含んでいる。しかしながら野生型ＤＣＣの発現をなくさせる点突然変異もまた、観察されている。本発明の診断及び予測の方法によれば野生型遺伝子の欠失が検出される。欠失は、挿入、欠失または点突然変異によることがある。もし単に一つの対立遺伝子に変異が起こっていた場合、初期の新生鶏を意味する。しかしながら、両方の対立遺伝子に変異が起きていれば、後期の新生状態が意味される。従って、ＤＣＣ変異の発見は診断及び予測の情報の両方を提供する。欠失していないひとつのＤＣＣ対立遺伝子（例えばＯＣＣ欠失を起こした染色体の娘染色体上）は挿入、小さな欠失、および点突然変異といった、その他の変異に関して検索され得る。腫瘍組織に於て検出されるほとんどの変異は、ＯＣＣ遺伝子産物の発現を非常に減少させると信じられている。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異もまた、ガン化状態を引き起こすであろう０点突然変異は、遺伝子のプロモーターといった制ａＩＮ域に起きる可能性もあり、これは−ＲＮ＾の発現の欠失または減少を引き起こす０点突然変異はまた、正しいＲＮＡブロセフシングを阻害し、ＤＣＣｉｔ伝壬子産物発現をなくす場合もある。組織に於て野生型ＤＣＣ遺伝子の欠失を検出するためには、周辺にある正常組織の混在しない組織を単離する事は助けになる。腫瘍細胞からの組ＩＩＩ調製物を純度の高いものにするための方法は技術的に知られている０例えば、組織はパラフィンまたは凍結切片から輔され得る。ガン細胞はまた、フローサイトメトリーによって正常細胞から分離可能である。正常細胞から１！蜂細胞を分離するためのその他の技術同様、これらの方法は技術的によく知られている。もしｍ織に正常細胞が非常に混在している場合は変異の検出はより困難になる。点突然変異の検出は、ｍ織に存在する対立遺伝子の分子的なりローニングおよび技術的によく知られた方法によってその対立遺伝子の配列決定をすることによって達成することが可能である。そのかわりに複製連鎖反応は、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接遺伝子配列を増幅するために利用されることが可能である。増幅された配列のＩ）ｌｉＡ配列はそれから決定され得る。複製連鎖反応それ自体は技術的によく知られている１例えば、５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３９、　ｐ、４８７．１９８８；　ｕ、Ｓ−４，６８３，２０３；　およびｕ、ｓ、　４．６８３．Ｌ９５参糺遺伝子を増幅するために用いられ得る特異的なプライマーはいかにさらに詳細に議論される。遺伝子の挿入及び欠失はまた、これらの技術を用いて検出することが可能である、さらに遺伝子または周辺のマーカー遺伝子に対する制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを用いて対立遺伝子の欠失または多型断片への挿入を検出することも可能である。挿入及び欠失を検出する、その他に知られている技術もまた、用いることが可能である。野生型遺伝子の喪失は遺伝子の野生型発現産物の喪失の観点からも検出することが可能である。そのような発現産物はタンパク質産物そのもののみならず、ｍＲＮＡも含んでいる０点突然変異は＊ＲＮｆｌを増幅り配列決定をする事によって、あるいは−ＮＡからｃＤＮＡを作成し、分子的にクローニングすることによって検出することが可能である。クローン化されたｃＤＮＡは技術的によく知られたＤＮＡ配列決定技法によって決定され得る。　ｃＤＮＡはまた、いかにさらに詳細にｔａ論する、複製連鎖反応（ＰＣＲ）をつうじて配列決定され得る。本発明に１！拠するミスマツチは１０ｏｚは一致していないハイブリダイズした核酸複合体である。全ホモロジーの欠落は欠失、挿入、置換またはフレームシフト変異によって起こり得る。ミスマツチの検出は遺伝子またはその５ＲＮＡ産物の点突然変異の検出に用いることが可能である。これらの技術は配列決定に比べて感度が落ちるが、多数の腫瘍に関しておこなう場合には簡便である。ミスマツチ切断技術の例は、ＲＮａｓｅ保護法であるが、これは−１ｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　Ｖｏｌ、　８２．　ｐ、　７５７５．　１９８５　およびＭｅｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ−、５ｃＩｅｎｃｅ、νｏｌ。Ｚ３０．　ｐ、　１２４２．１９８５において詳細に記述されている０本発明の実施に於て、ヒト野生型遺伝子コード配列に相補的なラベルされたりボブローブを使用した手法も含まれている。リポプローブおよび腫瘍組織から単離された置ＲＮＡまたはＤＮＡはともにアニール（ハイブリダイズ）さ娠その後ＲＮ＾複合構造に於けるいくつかのミスマツチを検出することが可能な酵素ＲＮａｓｅ＾で切断する。もしＲＮａｓｅ＾によってミスマツチが検出されると、ミスマツチの位置で酵素は切断する。従って、アニールされたＤＡ　ＡＮ製物が電気泳動ゲル担体上で分離されると、ミスマツチが検出されＲＮａｓｅ＾　によって切断されていれば、ＲＮＡ産物は、リボプローブと−ＲＮＡまたはＤＮＡからなる全長複合体と比べて短くなることが観察される。リボプローブはＤＣＣａＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はないが、そのどちらかの一部で有り得る。リボプローブカ（ＤＣＣａＲＮＡまたは遺伝子のごく一部を含んでいる場合、全■Ｒ？ｌ＾配列に関してミスマツチを検索するために、このようなプローブを多数使用することが望ましい。同様に、酵素あるいは化学的切断を通じて、ミスマツチを検出するために、ＤＮＡプローブを用いることも可能である０例えばＣｏｔｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　ＵＳＡ、　ｖｏｌ、　８５．４３９７．１９８８；および５ｈｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　`ｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｖｏｌ、　７２．　ｐ−９８９，１９７５参照０代わりに、ミスマツチはマツチした複合体に比べて、ミスマツチした複合体の電気泳動度が変化することによって、検出することが可能である０例えばＣａｒｉｅｌｌｏ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｆｃｓ、　ｖｏｌ−４２＋　９゜７２６、１９８８　参照、リポプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変異を含み得る細胞■ＲＮＡあるいは［ｌＮＡはハイブリダイゼーションの前にＰＣｌｌ　（以下参照）によって増幅され得る。　ＯＣＣ遺伝子の０にＡにおける変化は、とりわけその変化が欠失及び挿入といった大きなａえであった場合には、サザンハイプリダイゼーシヲンによってもまた、検出され得る。複製連鎖反応によって増幅された腫瘍組織由来のＯＣＣ遺伝子のＯＮ＾配列は対立遺伝子座特異的プローブを用いても検索することが可能である。これらのプローブは、それぞれ既知の変異を持ったＯＣＣ遺伝子配列の領域を含む核酸オリゴマーである。たとえば、−フのオリゴマーは長さが３０ヌクレオチド′で、ＤＣＣ遺伝子配列の一部に対応している。このような対立遺伝子座特異的プローブを −揃い用いることによってＰＣＲ増幅産物は、既に同定した減遺伝子における変異の存在を同定するために検索され得る。増幅されたＤＣＣ配列に対する対立遺伝子座特異的プローブのハイブリダイゼーションは、例えばナイロンフィルター上で行なうことが可能である。厳しいハイブリダイゼーシッン条件下で特定のプローブとハイブリダイズすることは、対立遺伝子座特異的プローブに含まれるものと同様な変異が腫瘍組織に存在することを示唆している。ＤＣＣａＲＮ＾発現の喪失は技術的に知られているいかなる方法によっても検出可能である。これらは、ノーザン分析、ＰＣケ忰喝およびＲＮａｓｅ保護を含んでいる。　５ＲＮＡの発現の減少は野生型ＯＣＣ遺伝子の喪失を意味している。野生型ｎｃｃ遺伝子の喪失は野生型ＤＣＣＣＣタンバク喪失を検索することによっても検出可能である０例えば、ＤＣＣと免疫的に反応するモノクローナル抗体は、組織を検索するために用いることが可能である。抗原の欠落は［ｌＣＣ変異を意味している。変異対立遺伝子座に特異的な抗体もまた変異ＤＣＣ遺伝子産物の検出に用いることが可能である。このような免疫学的な分析は技術的に知られているいかなる便利な形式によっても行い得た。これらは、ウェスタンプロット、免疫組織化学的な分析およびＥＬＩＳＡ分析を含んでいる。変異ｎｃｃタンパク質を検出するいかなる方法も、野生型ＤＣＣ遺伝子の喪失の検出に用いることが可能である。変異ＤＣＣ遺伝子産物を見いだすことは野生型［）ＣＣ遺伝子の喪失を意味する。変異ｎｃｃ遺伝子または遺伝子産物は血清、便、尿および唾液といった、他の人体のサンプルにおいても検出することが可能である１組織における変異Ｄｃｃ遺伝子または遺伝子産物の検出のための上述の技術と同じものが、その他の体のサンプルに対しても通用可能である。ガン細胞は腫瘍からＨＭされへこのような体のサンプル中に現れる。さらに、［ｌＣＣ遺伝子産物そのものは細胞間領域に分泌さね−ガン細胞が存在しなくても、このような体のサンプル中で検出され得る。このような体のサンプルを検索することによって、多くのタイプのガンに対して、単純で初期の診断を行なうことが可能である。さらに化学療法または放射線療法の進行状況を、変異ＤＣＣ遺伝子または遺伝子産物に間してそのような体のサンプルを検査することによって、より簡単に監視することが可能である。本発明の診断の方法は腫瘍形成に口ＣＣがなんらかの役割を果たしているような腫瘍に対して適用可能である９本発明の診断方法は臨床医が適切な治療法を決定するために有用である０例えば両方の口ＣＣ対立遺伝子の喪失が起きている腫瘍はただ一方の口ＣＣ対立遺伝子の喪失が起きている腫瘍の場合よりもさらに積極的な療法計画を意味している。本発明のプライマーキットは複製連鎖反応を用いたＤＣＣ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である０本キットは、ＤｃＣ遺伝子そのものの０１１八合成の増幅の口火を切るために、染色体Ｉ８ｑ上のＯＣＣ遺伝子内またはその周辺の配列にアニールすることの可能な１本１［ＤＮＡプライマーの組のセットを含んでいる。完全なセットはＤＣＣ遺伝子コード領域すなわちエクソンのヌクレオチド全ての合成ヲ可能にする。プライマーのセットは、多くのＤＣＣ変異が［ｌＣＣイントロンに起きているため、イントロンとエクソン配列の療法の合成を可能にすることが望ましい。本キットはまたＤＮＡポリメラーゼ、これは’Ｌポリメラーゼが望ましいが、および適切な反応緩衝液を含み得る。このような構成物は技術的に知られている。増幅された配列を続いてクローニングすることを促進するために、プライマーは、制限酵素切断部位をその５゛端に付加され得る。従って、プライマーの全てのヌクレオチドは制限酵素切断部位を形成するのに必要な数ヌクレオチドを除いて、　Ｉ）Ｃ鳴列または、［）ＣＣに隣合う配列由来である。そのような酵素及び切断部位は技術的によく知られている。プライマー自身は技術的によく知られた方法で合成され得る。一般に、プライマーは市販されている合成機を用いて作製し得る０図４に示したＤＣＣ読み取り枠を与えられれば、特定のプライマーのデザインは技術面では問題がない。本発明で提供した核酸プローブは多くの目的に有用である。これらはゲノムＤＮＡにたいしてサザンハイプリダイゼーションで用いることが可能であり、すでに上述したように点突然変異の検出のためのＲＮａｓｅ保護法に於て用いることが可能である。これらは、その他の技術を用いてＤＣＣ遺伝子または−ＡＩＡのミスマツチを検出する場合にも用いることが可能である。ミスマツチは、酵素（例えばｓ１ヌクレアーゼ）、化学物質（例えばヒドロキシルアミンまたは４酸化オスミウムおよびビベリヂンンあるいは完全にマツチしたバイブリアＦに比したミスマツチハイブリッドの電気泳動度の変化を利用して、検出することが可能である。これらの技法は技術的に知られている。Ｃｏｔｔｏｎ、　肪匠り、　５ｈｅｎｋ、四以互−，Ｍｙｅｒｓ、ｓｕ肛、Ｗｉｎｔｅｒ、　≦慧工堕］し一部　ａｎｄ　Ｎｏｖａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ先　Ｖｏｆ、　８３．　ｐ−５８６，１９８６参照、一般に、プローブはＩＩＣＣ遺伝子コード配列に相補的であるが、特定のイントロンに対するプローブもまた意図されている。とりわけ、一つのプローブは図３に示し７た断片Ｐ内のＤＣＣエクソンから１６５ｂｐ下流に位置するＸｂａｌ−ＥｃｏＯ１０９断片にハイブリダイズする。その他のプローブは断片Ｐそのものとハイブリダイズし、殿コード配列のプローブである。核酸プローブの一組は野生型ＤＣＣ遺伝子の喪失の検出に用いるためのキットを構成するためにもちいられる。キットは全ＤＣＣ遺伝子に対するハイブリダイゼーシッンを可能にする、プローブは互いに重複するか、隣接し得る。ａＲＮＡに対するミスマツチを検出するためにリボプローブが用いられた場合には、それはヒト野生型ＯＣＣ遺伝子の一曲＾に相補的である。リボプローブは従って、アンチセンスプローブであり、それは、センス値に対して逆方向の極性であるため胤タンパク質をコードしない、リボプローブは一般に技術的に知られた方法で放射性標識される。リボプローブがＤＮＡとのミスマツチを検出するために用いられる場合にはセンスまたはアンチセンスのどちらの極性を持っていてもよい、同様にｒｌＮＡｌＮ−ブもまた、ミスマツチを検出するために用いることが可能である。核酸１０−ブもまたＩ）ＣＣ遺伝子の変異対立遺伝子座に相補的である。これらはミスマツチよりもハイブリダイゼーシ！ｉ：／に基づいて、その他の愚者における同様の変異を検出するためにを用である。これらは上記で議論さｔｈ対立遺伝子座特異的プローブとして扱われている。上述したように、ＤＣＣプローブは欠失及び挿入といった大きな染色体上の変化を検出するためにゲノムＤＮ＾に対するサザンハイブリダイゼーシテンにおいても、また、用いることが可能である。プローブは腫瘍及び正常Ｍ織からの紅遺伝子のｃＤＮＡクローンを選択する場合にも用いることが可能である。さらにプローブは、野生型ＤＣＣ遺伝子の喪失の結果組織におけるＤＣＣ５ＲＮＡの発現が減少したか否かを決定するために、　ＤＣＣｓｌｉＮＡを検出するために用いることが可能である０図４に示すＤＣＣコード配列が提供されれば、特定のプローブをデザインすることは、通常の技術をもつ者の技術を持ってすれば良好である。本発明に従えば、手法は変異口ＣＣ対立遺伝子をもつ細胞に対して野生型ＤＣＣ機能を供給する方法もまた提供される。野生型ＤＣＣ遺伝子または遺伝子の一部は遺伝子力噴色体外に存在したままの状態にさせるようなベクターを用いて細胞内に導入することが出来る。そのような状態では遺伝子は染色体外のｓＩ域から細胞によって発現される。遺伝子の一部が導入さ娠変異ＤＣＣ対立遺伝子を持っている細胞において発現されると、遺伝子の一部は細胞の非新生増殖に必要とされるＤＣＣタンパク質の一部をコードするはずである。野生型口ＣＣ遺伝子またはその一部がその様な方法で変異細胞内に導入されへ細胞内にある内在性変異ＤＣＣ遺伝子と組換えを起こすような状況がさらに望ましい、そのような組換えは２重の組換えを必要とし、その結果ＯＣＣ遺伝子変異の修正がおきる０組換えと、染色体外保持のための遺伝子導入用ベクターは技術上知られており、適切なベクターはいかなるものも利用可能である。エレクトロポルーシッン、リン酸カルシウム共沈法及び、ウィルス形質導入といった、細胞内にＤＮＡを導入する方法は技術的に知られており、どの方法を選択するかは作業を行なう者の能力に依存している。野生型ＤＣＣ遺伝子によって形質転換された細胞はガンの鎮静化および、このような鎮静化を促進する薬剤治療の研究のモデル系として用いることが可能である。紅活性を持つポリペプチドを変異口ＣＣ対立遺伝子をもつ、あるいは口ＣＣ対立遺伝子を欠く細胞に供給することは可能である。　ＤＣＣタンパク質の配列は図４に開示されている。タンパク質は細菌内でｃＤＮＡａｉｉ列の発現することによって、例えば、既知の発現ベクターを用いて産生され得る０代わりに、ＯＣＣは脳細胞のようなりＣＣ産生は乳動物細胞から抽出することが可能である。さらに、合成化学の技術によってＤＣＣタンパク質を合成することが可能である。そのような技術のどれもが、図４に示した配列を持つＤＣＣ遺伝子産物を含む本発明のｍ１１物を提供する。１ｉｉＲは実質的に他のヒトのタンパク質を含まない、これば微生物あるいはｉｎ　■ｔｒｏ　において合成することによって、直ちに調製される。活性のあるＤＣＣ分子は例えばマイクロインジェクシッンまたは、リポソームを用いて細胞内に導入され得る１代わりに、そのような活性分子のいくつかは積極的にあるいは拡散によって細胞に取り込まれる。ＤＣＣはそのホモローブである、神経細胞接着分子同様、細胞表面に働きかけるため、ＤＣＣ遺伝子産物を細胞外から働かせることは、腫瘍の成長をもたらすために十分で育り得る。Ｉ）ＣＣ活性を持つ分子の供給は新生状態の部分的な逆転につながるはずである。ＤＣＣ活性を持つその他の分子もまたそのような逆行を引き起こすことが出来る。本発明はまたヒトＤＣＣタンパク質と免疫反応活性のある抗体の調製物を提供している。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルで本来のＤＣＣタンパク質またはＤＣＣ融合タンパク質に対して作製されている。抗体はＤＣＣエピトープに免疫反応するはずであり、その他のヒトタンパク質に存在しないエピトープに反応することが望ましい０本発明の望まれる態様において、抗体はポリアクリルアミドゲルのウェスタンプロット上のＤＣＣＣＣタンバク対して反応するのみならず、溶液中のＤＣＣタンパク質とともに免疫沈降する。抗体を作製し、精製する技法は、技術的によく知られており、本発明の調製物を得るためには、そのようないかなる技法を選ぶことも可能である。ガンの予測はＤＣＣ遺伝子の変異に関してヒトの正常組織を検査することによって惰力）めることが可能である０例えば、生殖細胞において［１α変異を受け継いだ人は、ガンにかかる傾向がある。これはこの人の体のいかなる組織由来のＤＮＡを検査することによって決定され得る。最も簡便には、血液を採取し、血液中の細胞からＤＮＡを抽出する。さらに出生前の診断も、ＤＣＣ遺伝子の変異に関して胎児細胞または羊水を検査することによって行なうことが可能である。野生型ＤＣＣ対立遺伝子の喪失は、例えばそれが点突然変異によるものか、欠失によるものか、は上述したいかなる方法によっても検出することが可能である。本発明に従ったｃＤＩＪＡ分子はイントロンのない、ｌ１ｌｃｃ遺伝子コード領域である、これは［ｌＣＣ＊ＲＮＡを鋳型として用いた逆転写酵素反応によって作製可能である。これらの分子はベクター中及び、細胞系で、既知の技術によって増殖させることが可能である。そのような分子は図４に示された配列を待っている。　ｃＤＩｌｉＡはまた、ここで開示された配列を与えられれば、合成化学の技法で作製することも可能である。以下は、単に実例を示すためだけに提供しており、これまで広い意味で記述してきた本発明の範囲を限定することは意図していない。実施例１本実施例は、頻繁な対立遺伝子欠失および体細胞性突然変異を受ける１８（ｌ染色体上の遺伝子座が肺および結腸直腸癌の細胞系列で発現していることを示すものである。腫瘍５１２３は、プローブＰ１５−６５をプローブとした場合、同じ患者の正常な結腸粘膜とは異なるハイブリダイゼーシッンパターンをもつことが見出だされた。その腫瘍は７．８と１０．５ｋｂの２つのＭｓｐｌ対立遺伝子についてヘテロなパターンを示した。ＰＩ５−６５１０−ブは、匿名ＤＮＡセグメント０ＬＶＩＩ　ＥＩＯ内に含まれる配列に、隣接した配列とそれを含む配列からの２，７ｋｂ　５ａｉｌ−Ｅｃ。Ｒ１フラグメントを含んでいる。マールヘンス（Ｍａｒｌｈｅｎｓ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１５．ｐ、１３４８，１９８７．０ＬＶＩＩＥＩＯは、０．８ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントであり、１８ｑ２１．３のＤ１８３８遺伝子座をマークし、正常な個体におけるＭｓｐｒ多型を検出する。プラスミドｐ１５−６５は、Ｍｂｏｌで部分消化し、ラムダＦＩＸ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化されたヒトＤＮＡから調製したヒトゲノムＤＮＡライブラリーから由来する。０ＬＶＩ［ＥＩＯにハイブリダイズする２つのファージクローンがハイブリダイイー９５フ選択により分離された。同定されたその２つのファージクローンからの試験済みサブフラグメントのうち、ＰＩ３−６５はサザンブロフト実験に使用した場合に最も高いシグナル／ノイズ比を示した。プラスミドｐ１５−６５（および０ＬＶＩ［ＥＩＯ）は多型性Ｍｓｐ１部位を検出し、そのようにして１０．　５．　９．　７．　７．　ａ、　７．ｏｋｂ　（出現頻度はそれぞれ１７％、４％、４９％、３０％（Ｎ−２３２））の４つの対立遺伝子を生じさせる。患者５１２３の癌組織におけるヘテロ性の獲得の分子機構を決定するため、影響の現れたＭｓｐ１部位を含んでいるゲノムＤＮＡクローンを癌より分離し、正常なりＮＡ配列と比較した。この領域の制限地図は、Ｍｓｐｌを除き、患者５１２３の腫瘍組織と正常組織とで同一であった。これは本腫瘍で甚だしいＤＮＡ付加や欠失が起こっていないことを示している。影響を受けたＭ　ｓ　ｐ　Ｉ　ＮＭｌ’＝よ、ＰＩ３−６５から５ｋｂにある１、８ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントのＡｌｕ型の繰り返し要素内にあることが見出だされた。５１２３腫瘍ＤＮＡからのクローン化されたＤＮＡフラグメントの配列は、正常な対立遺伝子と１つの塩基対において異なっており、Ｍｓｐ＋認識配列５　’　−ＣＣＧＧ−３’内の内側のＧ残基がＡ残基に置きかわっていた。この変異は、霊長類遺伝子のイントロン−エクソン連結部に対するコンセンサス配列（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１５．Ｐ、７１５５．１９８７；ラスキン（Ｒｕｓ　ｋ　ｔ　ｎ）ら、Ｃｅ１ｌ、ｖｏｌ、３８．Ｐ、３１７，１９８４；ツアン（Ｚｈｕａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ−Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、ｖｏ　１．８６．ｐ、２７５２．１９８９）と同一な、潜在的な３′スプライス部位を作り出した。異常なＲＮＡプロセシングに関与するスプライス受容部位を作り出す変異がサラセミアなどの遺伝病において以前に見出だされていることは有名である（レイ　（Ｌｅｙ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．ＡｃａｃＬ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖ。１．７９．ｐ、４７７５．１９Ｂ２；シャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ａｎｎｕａ　ＩＲｅｖｉｅｗｓ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、５５．ｐ、１１１９．１９８６）。腫瘍５１２３の変異ＭｓｐＩ部位を含む３５ｋｂ領域を取り囲むファージクローンを分離した。そのファージクローンのすべてのＥＣ０ＲＩフラグメントをサブクローン化し、正常結腸粘膜と、結腸およびその他幾つかの器官からの細胞系列のＲＮＡを含むノーザンプロットによるハイブリダイゼーション実験に使用した。この実験ではいかなる発現も検出されなかったが、これらのＲＮＡ試料を本ファージクローンからの選択されたサブフラグメントを用いてＲＮアーゼプロテクション実験を行なっても発現は検出されなかった。それ故、１８ｑ染色体のこの領域からの発現を同定するために、より徹底した戦略がとられた。この領域からの二方向による染色体歩行が、バクテリオファージベクターを使って行なわれた。３０ラウンドのウオーキングにおいて、約３７０ｋｂにわたり１４０以上のユニークなりローンが分離された。３０ラウンドの各々に対して最大限の歩行を表すクローンを図１に示す０本クローンは以下のようにして得られた。ヒトゲノムＤＮＡをＭｂｏｌで部分消化し、１２−１８ｋｂの断片を販売元が推薦する条件を用いてラムダＦＩＸベクター（Ｓｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。クローンを大腸菌Ｃ６００またはＴＡＰ９０細胞（バターマン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１５゜ｐ、６２９８．１９８７）に拡げた。ウオーキングの各ラウンドに対して、重なりあったファージクローンの消化物を比較してＥｃｏＲＩ地図を作製した（ρ １５−６５を含むファージクローンより開始）、以前に得られたファ・−ジクローンから最も遠くにマンピングされたＥｃｏＲ１フラグメントを使って本ライブラリーを再スクリーニングした。ウオーキングの各ラウンドにつき約ｌＸｌ０’ 個のファージクローンをスクリーニングした。各ウオーキングにつき概して３から７個の新しいクローンが得らワヘそのクローンを３ラウンドのハイブリダイゼーシン選択を通じて精製した。他の種との相同性をもとにその３７０ｋｂ領域中の潜在的なエクソンを同定するために、その領域からのＥｃｏＲＩフラグメントをすべて単離し、低ストリンジェント（ハイブリダイゼーシッンバッファーに０．５％無脂ドライミルクが含まれることとフィルターの洗いを４４．５ｍＭ塩化ナトリウム、１．８ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３ｍＭ）リス、ｐＨ１，５で５５°Ｃ４５分間行なったこと以外は、フォーゲルシュタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｆｎ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、ｖｏｌ、４７．Ｐ、４８０６．１９８７に記載された条件に従ッテイる）でのハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用して様々な種（マウス、ラット、ハムスター、トリ、アフリカッメガエル、酵母）からのＤＮＡ試料をスクリーニングした。このようなエクソンの同定法はデュシェーヌ筋ジストロフィー遺伝子や嚢胞性繊維症遺伝子に使われている。（モナコ（Ｍｏｎａｃｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３２３．Ｐ、６４６．１９８６．　ロメンス（ＲｏｍｍｅｎＳ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４５．Ｐ−１０５９，１９８９）　１１７個のＥｃｏＲＩフラグメントのうち２４個が試験した種のいずれか１つの分離したＤＮＡ断片にハイブリダイズした。これらの断片は図１に黒塗りの箱で示されている１強い異種間クロスハイブリダイゼーシきンを示す断片のうち２つについて観察されたパターンを図２に表す、フラグメントＯはマウス、ラット、ハムスター、アフリカッメガエルのＤＮＡに強くハイブリダイズし、フラグメントＰはマウス、ラット、ハムスターのＤＮＡに強くハイブリダイズした。その９間クロスハイブリダイズしたフラグメントの大部分を、様々な正常組織または腫瘍細胞系列のＲＮＡで調製したノーザンプロットのスクリーニングにプローブとして使用し、また正常結腸粘膜標本、結腸直腸アデノーマ細胞系列、脳腫瘍、繊維肉腫系列、胚腫瘍系列からのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにも使用した。クロスハイブリダイゼーシ町ンフラグメントをプローブとして用いても、こうしたノーザンプロットでは発現についていかなる証拠も得られなかったし、ｃＤＮＡライブラリーのいずれにおいてもハイブリダイズするクローンは同定されなかった。本りロスハイブリダイゼーシタンフラグメントのうちエクソン様の構造的特徴を持つものがあるかを決定するために、ラットから幾つかの相同フラグメントをクローン化し、ヒトとラットの両方に対して各フラグメントについてクロスハイブリダイゼーシッン領域を決定した。２つの方法でラットのゲノムクローンを得た。ひとつは異種間クロス／％イブリダイゼーシヲンによるサザンプロットで同定されたフラグメントをアガロースゲルから溶出し、クロスハイブリダイズする放射性標識したヒトクローンをプローブとして使い（ヒトゲノムクローンについて上述したようにして）クローン化した。ふたつめはラフトゲノムＤＮＡのＭｂｏ１部分分解物を販売元により勧められた条件を用いてラムダＤＡＳＨ（Ｓｔ　ｒａ　ｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、そのライブラリーを対象となっているヒト相同クローンでスクリーニングした。クロスハイブリダイズした領域を次に両方の種からサブクローン化し塩基配列を決定した。この分析が行なわれた７つの領域はＧ、Ｉ、Ｊ、　Ｋ、　Ｍ、　Ｏ，Ｐである。調べた相同領域のサイズは１２８から５３４ｂｐ以上の範囲であり、その相同性は７５−８９％の範囲であった０本塩基配列をオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）について調べ、そのＯＲＦの予想アミノ酸配列における保存性、そのＯＲＦの５′端での哺乳動物におけるスプライス受容部位とラリアフトのコンセンサス配列、そのＯＲＦの３′端でのスプライス供与部位のコンセンサス配列について調へた（シャビ０　（Ｓｈａｐ　１ｒｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１５．ｐ、７１．５５．１９８７；ラスキン（Ｒｕｓｋｉｎ）ら、Ｃｅ１ｌ、ｖｏｌ、３８．ｐ、３１７．１９８４）、こうしたｅｒａの幾つかがシーフェンスした大部分のフラグメントにおいて見出だされた。３組のヒト−ラット断片（図１．３のフラグメントＧ、　Ｏ，Ｐ）は他のフラグメントよりエクソン様の特徴を有していることが見出だされた。ヒトのフラグメントＧとラットの相同フラグメントからの異種間クロスハイブリダイゼーシ町ン領域はアミノ酸配列において２カ所異なるＯＲＦが予想された（図３）、ｌ＃に、残りの他の２組のフラグメントから予想されるＯＲＦは高度に保存されており、ヒトのフラグメントＯおよびＰはそれぞれのラットの相同フラグメントと１アミノ酸の置換がしかない（図３）、３組のフラグメントすべてについて、ヌクレオチドの置換の多くはエクソン様の領域中のコドンの３文字目にあり、これらの領域の外側では配列の相同性は７５％以下に低下していた。ヒトとラットの配列間の強い相同性およびそのエクソン様の構造的特徴は、本フラグメントが潜在的なエクソンを含みうろことを示唆した。しかしながら、上述したように、これら３つのフラグメントを様々なＲＮＡのノーザンプロットのプローブとして使用したりｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した場合、いかなる発現も検出されなかった。さらに、ＲＮアーゼ　プロテクション寥験（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏ　１．８２．Ｐ、７５７５．１９８５）は、アンチセンス転写産物の作製にこれら３つのフラグメントを使用しても、正常な結腸粘膜、結腸直腸細胞系列２および他の様々なタイプの腫瘍細胞系列を含めた種々のＲＮＡ試料における発現の証拠を決定的に示すことはできなかった。発現アッセイの感度を上げるために、”エクソンーコネクシタン”法でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，サイキ（Ｓａｉｋｉ）、　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２３９．ｐ、４８７．１９８８）を利用した。ランダムなヘクサマーをプライマーとして逆転写酵素を使用して、様々な細胞系列や組織の全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した（ヌーナン（Ｎｏｏｎａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１６．Ｐ、１０３６６．１９８８）、次にこの１末鎖ｃＤＮＡを、上述の潜在的なエクソンのうち２つからの配列由来のオリゴヌクレオチドの組みと共に、ＰＣＲ実験に使用した。その２つの潜在的エクソンが同しＲＮＡ転写産物に存在していれば、適当なオリゴヌクレオチドを使えばこれら２つの領域が繋がったｃＤＮＡ産物を増幅させることが可能であると考えられる。ＲＮＡ調製物にしばしば混入する微量のＤＮＡは、そのエクソンがイントロンで分離されているので、このアッセイでは同じサイズのＰＣＲ産物を生じないと考えられる、上記のヒト−ラットの相同部分の７つの領域からのオリゴヌクレオチドの大半の組では、この方法により試験した場合、明確なＰＣＲ産物を生じなかった、しかしながら、図３のフラグメント０とＰの配列由来のオリゴヌクレオチドの組は、肺小細胞癌（Ｈ８２）と結腸直腸癌（ＨＣＴ１１６）を含め、調べたｍ　ＲＮ　Ａ試料の幾つかのｃＤＮＡから明確な２３３ｂｐＰＣＲ産物を生ずることが見出だされたフラグメントＯ由来のオリゴヌクレオチドは５　”−ＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡ−３’、　フラグメントＰ由来のオリゴヌクレオチドは５ ′−ＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡ−３’であっ九サイクル時間は９５℃　１分、５８℃　１分、７０’Ｃ２分で、２５サイクル行なわれた。そのＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてリン［ヒし、ＥｃｏＲＩリンカ−（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結し、ラムダｇｔｌＯファージのアーム（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）に挿入し、大腸菌Ｃ６００細胞にクローン化した。インサートを含むクローンを、フラグメントＯとＰからの放射性標識したプローブを用いたパイプリダイゼーシッンを通じて同定した（図３）、そのファージクローンからのＥｃｏＲＩインサートをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、Ｓ、ターバー（Ｔａｂｏｒ）＆Ｃ，Ｃ，リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。ＵＳＡ、ｖｏｌ、８４．Ｐ、４７６７．１９８７；クラフト（Ｋｒａ　ｆ　ｔ）ら。Ｂｉｏｔｅｃｈ、、ｖｏｌ、６．Ｐ、５４４．１９８８により記載されたようにしてシーフェンスした。Ｈ８２とＨＣＴ１１６の両方の細胞系列からのＰＣＲ産物が、フラグメント０の予想されたエクソンがフラグメントＰの予想されたエクソンに直接にスプライシングされた産物であることが見出だされた０以上のことから染色体１８Ｑの本領域は発現されている。実施例２本実施例は結腸直腸癌で欠失している遺伝子のコード配列に相当するｃＤＮＡの分離とシーフェンス決定を示すものである。上記のＰＣＲ実験を確認、展開するために、Ｈ８２細胞系列のＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した（ガブラー（Ｃｚｕｂｌｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ、２５．ｐ−２６３，１９８３）、約３Ｘ１０’の組み換えｃＤＮＡクローンを、図３のフラグメンＩ−Ｇ、　Ｏ，Ｐの領域を含むゲノムＤＮＡサブクローンでスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンが４つ分離され互いに図１に示すように本ゲノムクローンにマツピングされた。最も大きなりローンは長さ１．　６５ｋｂでヒトゲノムＤＮＡにおいて少なくとも１１個のユニークなＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイズしく図６Ａ）、そのうち８個は図１に示した染色体歩行でクローン化された３７０ｋｂの領域内に存在した０分離した４つのｃＤＮＡクローンをシーフェンスし、Ｈ８２細胞または正常なヒトの脳から得たｃＤＮＡライブラリーのプローブとして以後使用し、合計２８５４塩基対におよぶｃＤＮＡクローンをさらに得た。シーフェンスしたところ、すべてのクローンは１つの転写産物の重なり合う部分をコードしていることが見出ださ瓢そこには２２５０ｂｐの単一な長いＯＲＦが存在しこれはシーフェンスした領域の端まで伸びていた。そのＯＲＦは、コザック（Ｋｏｚａｋ）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１５．Ｐ、８１２５．１９８７の範例に従う翻訳開始点によく見られる配列中にあるメチオニンコドンから始まっていた（図４のヌクレオチドｌ）、そのメチオニンの後には２５アミノ酸からなる比較的疎水的な配列が続いており、これは以前に記載された膜結合性タンパク質に見られるシグナル配列に僚でいた（ワ゛トソン（Ｗａｔａｓｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｖｏｌ、１２．ｐ、５１４５．１９８４）、そのシグナル配列のすぐ後ろには、神経細胞接着分子およびそれに関連した他の細胞表面の垢タンパク質と有意な相同性をもつ７２５アミノ酸が続いていた。この転写産物をコードする遺伝子をＤＣＣ（Ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｏ１ｏｒｅｃｔａｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）と呼ぶことにする。実施例３本実施例はラットおよびヒトの大部分の正常組織がＤＣＣ転写産物を生産していることを示すものである。しかし大部分の結腸直腸癌の細胞系列では、正常細胞と同じくらいの量は生産されていない。ＤＣＣ遺伝子が発現している組織を同定するために、ラットの幾つかの器官からｅＤＮＡを調製した。これらは肝臓、腎臓、副腎、心臓５肺、胃１食通肺臓、小織乳房、膀胱、子宮、大動脈２腰筋、脳、結腸、舌、および皮膚であった、ＤＣＣ遺伝子の高度な保存性から（図３参照）、ヒトの細胞における発現を示すのに使用したものと同じオリゴヌクレオチドブライマーを、ラットにおいても使用できた０発現を調べるために、図３のフラグメント０とＰからのオリゴヌクレオチドの組を上述のＰＣＲ発現アッセイに使用した。試験した１８のラット組織のうち１７個では低レベルで本転写産物力領されているようであった〔脳において最も豊富に観察された（チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）ら、Ａｎａ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、１６２．ｐ、１５６．１９８７））、唯一肝臓においては検出可能な転写産物は生産されていなかった。ヒトの組織および細胞系列についての同様な解析により、本転写産物が脳で最も高い濃度で存在し、正常結腸粘膜および肺、脳１間充識の腫瘍由来のものを含めた幾つかのｌ１１ｇ胞系列においても発現していることが明らかにされた（図５および未発表データ）、シかし、大部分の結腸Ｂ癌では発現が大きく減少していたりあるいは発現されていなかった。調べた１７の結腸直腸癌の細胞系列のうち、正常直腸粘膜の５％より高いレベルでＤＣＣｍＲＮＡを発現しているものは２つしかなかった（図５の例）、使用したヒト結腸直腸癌細胞系列は、レーン６．５Ｗ９４８；レーン？、５Ｗ１４１７；レーン８．５Ｗ１１１６；ｔ、−：／９．５Ｗ４０３；レーアｔｏ、５Ｗ１４６３；Ｌ／　−：／１１，５Ｗ４８；レーン１２．Ｉ（ＣＴ１１６ｉ；レーアＬ３．ＲＫＯ；レーア１４、ＲＣＡｉレーア１５、”Ｃ″　；レーン１６．ＭＯ３ＥＲであった。この遺伝子から生産される転写産物のサイズを決定するため、正常な結腸粘膜または脳からのＲＮＡを含むノーザンプロットを放射性標識したｃＤＮＡクローンでハイブリダイズした。正常な脳のＲＮＡにおいては１Ｏ−１２ｋｂの主要なバンドが観察されたが、結腸粘膜からのＲＮＡにおいてはバンドは見られなかった（未発表データ）、これはＰＣＲ解析により脳において観察された高い発現量に一致するものである。実施例４本実施例は、５１１５腫瘍における対立遺伝子の１つの欠失の境界が本ＤＣＣ遺伝子内にあり、本遺伝子の再編成がｃＤＮＡプローブを用いてヒトの細胞で検出できることを示すものである。零〇ＣＣ遺伝子について５ｌ１５腫瘍におけるホモ接合な喪失の境界を確定しようと試みて、本ｃＤＮＡクローンを１０−ブに５１１５ＤＮＡを含んだサザンプロットを調べた。４３０ｂｐのサブクローン（ｐＫｃ４３０．本ｃＤＮＡのヌクレオチド１７６０から２２０５にあたる）が、患者５１１５の非新生物結腸粘膜からのＤＮＡにおいて２０ｋｂ、１０ｋｂ、１．８ｋｂの３つのＥｃｏＲＩ断片を検出した（図６Ｂ）、ｊ、かじながら、３１１５腫瘍からのＤＮＡにおいては、２０ｋｂの断片が検出されず、１Ｏｋｂと１．８ｋｂの断片は存在したが正常なりＮＡで観察されたときに比べて約半分の強度しかなかった。さらに、その腫瘍からのＤＮＡにおいてのみ新たな５ｋｂの断片刃層察されたＣ図６Ｂにて矢頌で示した）、ｐＫｃ４３０よりも３′側のプローブも本腫瘍のＤＮＡにおいて、正常なりＮＡにおいて見られたものの半分の強度で存在するこれらのフラグメントを検出した。一方、ｐＫｃ４３０の５′のプローブは本腫瘍においてはホモに欠失しているフラグメントを検出した０以上のことから、本ＤＣＣ遺伝子は２コピーの第１８染色体のうち一方において欠失により破壊されているようで、その破壊点はホモな喪失の１つの境界となっていた。実施例５本実施例は本発明のｃＤＮＡが結腸直腸腫瘍から分離されたＤＮＡ試料における遺伝子変更を検出しうることを示すものである。他の遺伝子変更を調べるために、本ｃＤＮＡプローブを結腸直腸腫瘍のＤＮＡ試料のサザンプロット分析に使用した。正常および腫瘍ＤＮＡ試料からのＤＮＡをＥｃｏＲＩとＥｃｏ０１０９で消化し、上記のようにしてサザンブロ７トを調製した１次にフラグメントＰからのエクソンを含む０．４ｋｈゲノム断片にそのＤＮＡをハイブリダイズさせた。５１の初期腫瘍のうち３つと２１の腫瘍異種移植片のうち２つが同じ患者の正常なりＮＡには存在しない新たなフラグメントを持つことが見出だされた。さらに、２２の結腸直腸腫瘍細胞系列のうち５つが、正常個体からの４４のＤＮＡ試料にも、結腸や直腸以外の組織由来の腫瘍細胞系列からの４５のＤＮＡ試料のいづれにも存在しない変更されたフラグメントを持つことが見出だされた。すべての場合において、詳細なマツピング実験により本ｃＤＮＡプローブにより検出された新たなフラグメントが、図３のフラグメントＰ中のエクソンの■６５ｂｐ下流の位置にある約１７０ｂｐのＸｂａＩ−Ｅｃｏ０１０９断片における挿入から生じたことが示された。ｌ１ｌｌＩＤＮＡ試料をＸｂａ　Ｉ＋ＥｃｏＯ１０９とＨｉｎｄｍを組み合わせて消化してできたサザンプロットのパターンを比較することにより、その挿入をマツピングした。腫瘍における挿入の大きさは１２〇−３００ｂｐと様々であった（図７Ａ）、正常な個体からの対立遺伝子におけるＸｂａ　ｒ−ＥｃｏＯ１０９断片のサイズの変動が見られたが、明べた８８の正常な対立遺伝子のうち最も小さなものと最も大きなものとのサイズの違いは大きくても約３５ｂｐであり、正常な対立遺伝子の最も大きなものが約Ｌ２０ｂｐであることがわかった。これは本腫瘍において見られる変更対立遺伝子のいづれのものよりも小さかった。挿入部位を含む１４ｋｂのＥｃｏＲｒ断片（フラグメン）Ｐ）を本染色体歩（テＣ図１）のゲノムクローンの１つから分離し、塩基配列を決定した。このフラグメントからのＸｂａ　Ｉ−Ｅｃｏ０１０９フラグメント１７０ｂｐの塩基配列を図７Ｂに示す、このＸｂａ　Ｉ−Ｅｃｏｏ　１０９フラグメントにはＴＡ繰り返し領域が２つあり、そのうちひとつは８個のリピートを、もう一方は２６個のリピートを持っていた０両方のＴＡ＆ｉり返し領域は、Ｚ−ＤＮＡ　（リッチ（Ｒｉ　ｃ　ｈ）ら、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉａｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、５３．ｐ、７９１．１９８４）を潜在的に形成しうる１３０ｂｐからなる交互なプリン−ピリミジン塩基対の領域中に含まれていた。実施例６本実施例は、トリＮ−ＣＡＭおよびマウスＮ−ＣＡＭ遺伝子とともに本ＤＣＣ遺伝子の４つの免疫グロブリン様ドメイン間の配ダ唾似性を示すものである。ＤＣＣの予想アミノ酸配列は、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）およびそれに近縁の他の細胞表面糖タンパク質と高い相同性を示す（ニーデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ　２７．ｐ、３５３５．１９８９）、２つの高度な相同部分が注目される。まず本ＤＣＣ遺伝子は、５０から５６アミノ酸を挟んだシスティンの組と各組の初めと２つめのシスティンを取り巻く高度に保存された他の残基により規定される、０２クラスの４つの免疫グロブリン様４１ｇ様）ドメインを含んでいる（図８およびウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　ｌ　ｊａｍｓ）。Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．、ｖｏｌ、６．ｐ、３１Ｎ、１９８８Ｌそのドメインの配列を監察によりアラインし、ダフシェにより示されるスペースを全体に渡るマツチングが最も高くなるように挿入した０本ＤＣＣドメインのうち２つ以上の残基が同一である場合、それらを箱で括った。各１ｇ様ドメインの長さは約１００アミノ酸である。ＤＣＣドメインｎｏ、１はアミノ＃１４０番目から１３９番目を、ｎｏ−２はアミノ酸１４０−２３９を、ｎｏ、３はアミノ酸２４０−３３２を、ｎｏ−４はアミノ［３３３−４２２を含んでいる。ＤＣＣの４つのｒｇ様ドメインは、Ｎ−ＣＡＭ、Ｌｌやｔｇスス−−ファミリーの他のメンバーよりも互いの間で相同性が高いことが見出だされた。ＤＣＣの４つのＩｇ様ドメインに対するコンセンサス配列は本ポジシタンについて６７％とさ孤本ＤＣＣコンセンサス配列はこうしたポジションについて４２％でＮ−ＣＡＭコンセンサス配列に一致した。ＤＣＣとトリやマウスのＮ−ＣＡＭ遺伝子間の配列相同性は、フィブロネクチン −タイプ■関連領域にも見出だされた。ＤＣＣアミノ酸の４２３から６０５番目を、２−′）のＮ−ＣＡＭタンパク質のアミノ＃４８１から６６２番百と比較した、潜在的なＮ結合グリコジル化部位がこのａ域内に幾つか見出だされた。フィブロネクチン−タイプ■関連ドメインは、Ｎ−ＣＡＭ、ＬＬ、白血球共通抗原関連遺伝子１（Ｌａｒｌ）、ファシクリンパおよびｍ胞接着分子ファミリーの他のメンバーに存在するフィブロネクチン様ドメインに類似している。これらフィブロネクチン関連ドメインは、ＤＣＣを含めこれらのタンパク質すべてに８いてＩｇ様トドメインカルボキシル側にある。ＤＣＣのフィブロネクチン様領域内の１９５の位置のうち、３１％がＤＣＣとＮ−ＣＡＭにおいて同一で、また幾つかの保存的な置換も見られた（図８Ｂ）、ＤＣＣおよびこのファミリーの他のメンバー間でのＩｇ様トドメインフィブロネクチン様ドメインの両方における広範囲に渡る相同性は、これらのタンパク質すべてが、こうした領域を両方含む共通の祖先から派生してきた可能性を示唆するものである。実施例７本実施例は、細菌における本ＤＣＣタンパク質の発現および抗ＤＣＣ抗体の産生を示すものである。図４に示されるＤＣＣｃＤＮＡ配列を細菌発現ベクターｐＥＸ２に挿入した、本ベクターは、いづれのオープンリーディングフレームからのタンパク質も、ベータガラクトシダーゼとの融合産物として生産するだろう、（スタンルー（Ｓｔａｎｌｅｙ）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、ｖｏｌ、３．ＰＰ、１４２９−１４３４．１９８４）細菌で発現されたＤＣＣＣＣタンバク部分精製し、フロイントのアジェバンドとともにウサギに注射した。そのウサギに３か月の促進注射を施した０本ウサギは、１旦　ｖｉ　ｔｒｏ翻訳反応で合成したＤＣＣＣＣタンバク免疫沈降する抗体を産生じた０本抗体はウェスタンプロット上でもＤＣＣと結合した。？工ＧＩＪＲＥ　ｌ口＞ｉ？工ＧＵＲＥ　２Ｃ旦二二　生：蚕　：：：；さ、；′：、呂　二ＣＡ’Ｃ井　旨τ暮　；８　二２ス　；；　乱を二　脆　こ零；　４−７　蟲ｌ″ｇ　４１＃　ｃｔｔ＋　ｓｚｓ　Ｐｒｏ　４Ｊａ　Ｖａｌ　Ａ５　ｕｒロ　ＡＳａ　１ｉａｒ　Ｐｒｅ）ＰＰＣＩ　ＴＦＤ　νＮ@Ｐｒｏ　’ 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♀　・・ＦＩＧτ…伍７ＡＦＩＧＵＲＥ　７ＢＦＩＧＵＲＥ　８Ａ要約書ＤＣＣと名付けられた新しいヒトの遺伝子が開示される。ヒト組織および体のサンプルにおけるＤＣＣ遺伝子の変異を評価するための方法とキットカ囃される。ＤＣＣにおける挿入、欠失及び点突然変異はヒト腫瘍細胞で観察される。正常組織はＤＣＣを発現するが多くの結腸ガンでは発現しない、野生型［）ＣＣ遺伝子の喪失は新生過程の進行と生存期間の短縮をともなっている。国際調査報告＋−ｍ−Ｉ１１ｅＭａ＋ｎ帥１１＋＋＋曜ａ−＋Ｎａ灯／ＵＳ９０１０７３１４ｔ＋１−内ｈ６止１＾＋””””　）　、、＋’／ＵＳ９０１０７３１４

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトの組織を単離し；野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列またば当該細胞由来のその発現産物の喪失を検出し、当該喪失の検出は組織の新生を意味し転移および死と関連する、ことからなるヒトの新生組織の診断と予測の方法。
２．発現産物がｍＲＮＡである請求の範囲第１項の方法。
３．野生型ＤＣＣｍＲＮＡの喪失が、ＤＣＣ遺伝子プローブに対する当該組織由来のｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションによって検出される、請求の範囲第２項の方法。
４．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織から単離されたゲノムＤＮＡに対するＤＣＣ遺伝子コード配列プローブのサザンハイブリダイゼーションによって検出される請求の範囲第１項の方法。
５．さらに以下のものを含む請求の範囲第４項の方法；ヒトの非新生組織の単離；当該非新生組織からのゲノムＤＮＡの車離；該ゲノムＤＮＡの、ＤＣＣ遺伝子コード配列プローブによるサザンハイブリダイゼーションヘの適用；および当該組織へのＤＣＣ遺伝子プローブのハイブリダイゼーションの比較。
６．ＤＣＣ遺伝子プローブが制限酵素切断断片長多型を検出する、請求の範囲第４項の方法。
７．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、複製連鎖反応を用いて当該組織でＤＣＣ遺伝子の全または一部の配列を決定することによって検出され、図４に示されたＤＣＣ配列で決定されたＤＣＣ配列の変異は新生を意味する、請求の範囲第１項の方法。
８．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、（１）当該粗織から単離されたＤＣＣ遺伝子またはＤＣＣｍＲＮＡおよび（２）ヒト野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列に対して相補的な核酸プローブ、の二つの分子を互いにハイプリダイズさせて補合体を形放させたときの、両者の間のミスマッチを同定して検出される、請求の範囲第１項の方法。
９．ＤＣＣ遺伝子プローブが図３に示された１．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片である、断片Ｐとハイプリダイズする請求の範囲第４項の方法。
１０．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織におけるＤＣＣ遺伝子配列の増幅及び増幅されたＤＣＣ遺伝子の、ＤＣＣ配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって、検出される、請求の範囲第１項の方法。
１１．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織でのＤＣＣ遺伝子の分子的クローニング及び、クローン化されたＤＣＣ遺伝子の全または一部の配列の決定によって、検出される請求の範囲第１項の方法。
１２．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が、欠失変異に対する検索を含む請求の範囲第１項の方法。
１３．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が、点突然変異の検索を含む請求の範囲第１項の方法。
１４．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が挿入変異の検索を含む請求の範囲第１項の方法。
１５．ヒトから単離された組織が結腸粘膜由来である請求の範囲第１項の方法。
１６．発現産物がタンパク質分子である請求の範囲第１項の方法。
１７．野生型ＤＣＣタンパク質の喪失がウエスタンプロットによって検出される請求の範囲第１６項の方法。
１８．ＤＣＣ遺伝子内の変異によって当該遺伝子機能を失った細胞に野生型ＤＣＣ遺伝子機能を供給する方法において、当該遺伝子が細胞内で発現するように野生型ＤＣＣ遺伝子を当該遺伝子機能を失った健腕へ導入することよりなる上記方法。
１９．導入された野生型ＤＣＣ遺伝子が、細胞内に存在する内在性の変異ＤＣＣ遺伝子と２重に組換えを起こすことによってＤＣＣ遺伝子変異を修復する、請求の範囲第１８項の方法。
２０．野生型ＤＣＣ遺伝子機能を、ＤＣＣ遺伝子内の変異によって当該遺伝子機能を失った細胞へ供給する方法において、当該細胞の非新生増殖に必用とされるＤＣＣタンパク質部分をコードする野生型ＤＣＣ遺伝子の部分を、当該部分が細胞内で発現されるように、当該部分を喪失した細胞へ導入することよりなる、上記方法。
２１．ＤＣＣ遺伝子コード配列の全ヌクレオチドの合成を可能ならしめる一本鎖ＤＮＡプライマーの組のセット（当該セットの配列は染色体１８ｑ由来である）を含んでなる、複製連鎖反応（ポリメラーぜ・チェーン・リアクション）によってＤＣＣ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するためのキット。
２２．プライマーの各々が５′端に制限酵素切断部位を有している請求の範囲第２１項のキット。
２３．ヒト野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列に相補的な核酸プローブ。
２４．図３に示す断片Ｐ内のＤＣＣエクソンから１６５ｂｐ下流に位置するｘｂａｌ−Ｅｃｏ０１０９断片にハイプリダイズする核酸プローブ。
２５．全体としてＤＣＣ遺伝子の全ヌクレオチドにハイプリダイズする核酸プローブの一組を含む、野生型ＤＣＣ遺伝子の喪失を検出すろためのキット。
２６．ヒトの体のサンプルを単離し；当該サンプルに於て、野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列または野生型ＤＣＣ発現産物の喪失を検出し、当該喪失はヒトに於て新生組織が存在することを意味する、ことからなるヒトにおける新生組織野存在を検出する方法。
２７．当該する体のサンプルが血清、便、尿、および唾液からなる群から選択される請求の範囲虜２６項の方法。
２８．血液及び胎児組織からなる群から選択されるヒトサンプルを単離サンプルの野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列またはその発現産物の喪失を検出し、当該喪失の検出がガンになり易いことを意味する、ことからなるヒトにおける遺伝的なガンになりやすい体質の検出方法。
２９．発現産物がｍＲＮＡ分子である請求の範囲第２８項の方法。
３０．野生型ＤＣＣＭＲＮＡがＤＣＣ遺伝子プローブに対する、当該組織由来のｍＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションによって検出される請求の範囲第２９項の方法。
３１．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織から単離されたゲノムＤＮＡに対するＤＣＣ遺伝子コード配列プローブのサザンハイブリダイゼーションによって検出される請求の範囲第２８項の方法。
３２．ＤＣＣ遺伝子コード配列プローブが制限酵素切断断片長多型を検出する、請求の範囲第３１項の方法。
３３．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、複製連鎖反応を用いて、当該組織におけるＤＣＣ遺伝子の全または一部の配列を決定することによって検出され、図４に示されたＤＣＣ配列で決定されたＤＣＣ配列の変異はガンになり易い傾向を意味する、請求の範囲第２８項の方法。
３４．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、（１）当該組織から単離されたＤＣＣ遺伝子またはＤＣＣｍＲＮＡおよび（２）ヒト野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列に対して相補的な核酸プローブ、の二つの分子を互いにハイプリダイズさせて複合体を形成させたときの、両者の間のミスマッチを同定して検出される、請求の範囲第２８項の方法。
３５．ＤＣＣ遺伝子プローブが図３に示された１．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片である、断片Ｐとハイプリダイズする請求の範囲第３１項の方法。
３６．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織におけるＤＣＣ遺伝子配列の増幅及び増幅されたＤＣＣ遺伝子の、ＤＣＣ遺伝子コード配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって、検出される、請求の範囲第２８項の方法。
３７．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失が、当該組織でのＤＣＣ遺伝子の分子的クローニング及び、クローン化されたＤＣＣ遺伝子の全または一部の配列の決定によって、検出されろ請求の範囲第２８項の方法。
３８．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が、欠失変異に対する検索を含む請求の範囲第２８項の方法。
３９．好生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が、点突然変異の検索を含む請求の範囲第２８項の方法。
４０．野生型ＤＣＣ遺伝子コード配列の喪失の検出が挿入変異の検索を含む訴求の範囲第２８項の方法。
４１．発現産物がタンパク質分子である請求の範囲第２８項の方法。
４２．野生型ＤＣＣタンパク質の喪失が、ウエスタンプロットによって検出される請求の範囲第２８項の方法。
４３．ＤＣＣ遺伝子のコード配列を含むｃＤＮＡ分子。
４４．図４に示されたものに対応するアミノ酸配列を有し、実質的に他のヒトのタンパク質を含まないヒＤＣＣタンパク質調製物。
４５．ヒトＤＣＣタンパク質に免疫反応し、その他のヒトのタンパク質とは実質的に免疫反応しない抗体調要物。