JP5132751B2

JP5132751B2 - Ｄｎａの完全性を保存するための方法

Info

Publication number: JP5132751B2
Application number: JP2010239144A
Authority: JP
Inventors: ピー．シュバーアンソニー; エイ．ハントレスジュニアフレデリック; ケイ．ムーアジェイムズ
Original assignee: エグザクトサイエンシーズコーポレイション
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2020-01-24
Also published as: CA2362251A1; EP1155147B1; ES2269102T3; WO2000050640A1; EP1155147A1; JP2011015701A; DE60028732T2; JP2002537777A; AU752817B2; CA2362251C; US6551777B1; AU2627700A; DE60028732D1; ATE330032T1

Description

（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願番号第６０／１２２，１７７号（１９９９年２月２５日提出）に優先権を主張し、そしてその利益を主張し、この全開示が、本明細書中で参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、生物学的サンプルからのデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）抽出のための方法を提供する。より具体的に、本発明は、ＤＮＡ分解を阻害することによって、異質な生物学的サンプルからの高い収率のＤＮＡ抽出のための方法に関する。

（発明の背景）
ＤＮＡは、生物学的サンプルから慣用的に単離される比較的に安定な分子である。近年、ゲノムＤＮＡにおける不安定性（例えば、変異）に関連する多くの疾患が、特徴付けられている。また、多くの病原体が、生物学的サンプル中に特定のＤＮＡが存在するか、または存在しないかによって同定されている。多くの疾患（例えば、癌）は、それらの進行を早期に最適に検出される。早期検出が有効であるために、癌を示す比較的低レベルのＤＮＡが、他のＤＮＡ（例えば、通常のヒトＤＮＡ、細菌ＤＮＡなど）の高いバックグランドに対して検出されなくてはならない。この型の検出は、技術的に困難であり、そして典型的に、検出の低い感度を生じる。さらに、特定の複雑な検体（糞便を含む）において、種特異性ＤＮＡが少ししか存在しないものは、急速に分解され、効率的な配列特異性検出でさえ、より困難にしている。従って、サンプル、特に、検出されるべきＤＮＡが、サンプル中の他のＤＮＡに対して低い割合であり、そして急速に分解するサンプルにおいて、ＤＮＡの完全性を保持するための方法についての必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、サンプル中のＤＮＡの完全性を保存するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、酵素媒介ＤＮＡ分解を抑制する。ＤＮＡの完全性の保存は、ＤＮＡの単離および検出を容易にする。

本発明の方法は、生物学的被験物（特に、低レベルの関連ＤＮＡを含む被験物）中のＤＮＡを抽出または検出するために特に有用である。低レベルの関連ＤＮＡを含む被験物の良い例は、糞便である。代表的なヒト糞便は、少量のインタクトなヒトＤＮＡのみを含む。健康な個体由来の糞便中のヒトＤＮＡのほとんどは、おそらく剥離された上皮細胞由来であり、アポトーシス分解を引き起こす。形成する糞便が結腸を通過する際、結腸上皮細胞は、結腸内で生じる細胞代謝回転の一部として、糞便上に脱皮される。糞便はまた、他の管腔源（例えば、肺、胃、食道など）から脱皮された細胞を含む。脱皮された細胞は、代表的にアポトーシスを引き起こしたか、または引き起こし、小さなフラグメント内に、細胞ＤＮＡが残る。酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（「ＤＮａｓｅ」）および小球菌ヌクレアーゼ）は、残存する任意のインタクトなヒトＤＮＡの分解に寄与する。ＤＮａｓｅインヒビターを使用する先行技術は、糞便由来の有意な収率のインタクトな、種−特異的ＤＮＡを得るのに失敗した。それ故に、このような方法は、ＤＮＡ分解の阻害の最適化を考慮するのに失敗した。本発明の方法は、ＤＮＡ分解酵素の最適阻害がサンプル中に存在するＤＮＡ、特に大きな診断学的に関連のあるＤＮＡフラグメントを効果的に保存するという理解に基づいている。

１局面において、本発明は、サンプル中の核酸分解を阻害する工程、および必要に応じて、例えばフェノール−クロロホルム抽出を用いて標的ＤＮＡを抽出する工程、を包含する。好ましくは、核酸分解の阻害は、臨界数の分析可能なＤＮＡの分子を産生するのに十分である。１実施形態において、本発明の方法は、糞便サンプル中でＤＮＡ分解し得る酵素を阻害する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、イオンキレート剤（例えば、二価イオンキレート剤）に糞便サンプルを曝露する工程を包含する。イオンキレート剤は、特定の実施形態において、ＤＮａｓｅを阻害する。好ましいインヒビターの例として、エチレンジアミンテトラ酢酸（「ＥＤＴＡ」）が挙げられる。本発明のさらに好ましい方法は、小球菌ヌクレアーゼインヒビター（例えば、ＥＧＴＡ、さらに二価のイオンキレート剤）に糞便サンプルを曝露する工程を包含する。ＤＮＡ分解のインヒビターは、最適レベルのＤＮＡ保存を達成するために、単独で、または組み合わせて、使用され得る。

本発明の方法は、ＤＮＡ分解の任意のインヒビターを使用して、実施される。インヒビターの量は、使用されるインヒビターに依存して変化する。しかし、インヒビターは、後の分析のためのサンプル中の有意なレベルのＤＮＡを保存する量で使用されなければならない。十分なレベルのＤＮＡを決定するための方法は、以下に示される。このような方法は、当業者が、使用されるインヒビターに関わらず、特異性をもって本発明を実施することが可能である。好ましい方法に従って、統計学的信頼性の所望されるレベル内で標的ＤＮＡの検出のために十分なサンプル中のＤＮＡを保存する量のインヒビターが使用される。本明細書中で記載される方法を使用して、当業者は、本発明の方法において使用するための任意のインヒビターの適切な量を決定し得る。種々の特定のインヒビターの使用は、以下に例示される。

別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、代表的な（円周または断面の）糞便サンプルを得る工程、サンプルまたはその一部をＤＮａｓｅインヒビターに曝露する工程、およびＤＮＡをサンプルから単離する工程を包含する。１つの好ましいＤＮａｓｅインヒビターは、ＥＤＴＡである。好ましいＥＤＴＡの量は、１ｇの糞便あたり約０．０４２ｇ〜約０．７８２ｇであり、１ｇの糞便あたり約０．２５０ｇ〜約０．５２１ｇが特に好ましい。ＤＮＡは、例えば、フェノール−クロロホルム抽出によって抽出され得る。抽出後、ＤＮＡは、当該分野において公知の方法によって分析され得る。例えば、米国特許第５，８３０，６６５号および同第５，６７０，３２５号（これらは、本明細書中において参考として援用される）は、糞便サンプルから抽出されたＤＮＡを分析するための方法を開示する。

本発明の方法は、ＤＮＡ分解の阻害が所望される任意のサンプル中で有用である。例えば、本発明の方法は、剥離された細胞、特に剥離された上皮細胞を含むサンプルにおいて特に効果的である。このようなサンプル中に含まれるＤＮＡは、急激に分解し、特定のＤＮＡ（特に、サンプル中に低い割合で存在するＤＮＡ）の分析を困難にさせる。例えば、このようなサンプルとして、糞便、痰、尿、膿、および初乳が挙げられる。本発明の方法は、このようなサンプル中でＤＮＡ分解を抑制する工程、従って特異的な、高感度の検出のための十分な量のＤＮＡを保存する工程を包含する。上記の特徴のいずれも（例えば、ＤＮＡ分解インヒビターまたは使用されるインヒビターの量）は、剥離された細胞を含むサンプルにおいて有用であり得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）糞便サンプル中のＤＮＡの完全性を保存する方法であって、該方法は、以下：
該糞便サンプルを、臨界数の分析可能なＤＮＡ分子を生成するのに十分な量のＤＮＡ分解のインヒビターに曝露させる工程、
を包含する、方法。
（項目２）前記インヒビターがイオンキレート剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）前記イオンキレート剤が二価のイオンキレート剤を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）前記二価のイオンキレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）前記糞便サンプルをＤＮＡ分解のインヒビターの一定量に曝露させる工程が、糞便１グラム当たり０．０４２ｇのＥＤＴＡ〜糞便１グラムあたり０．７８２ｇのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡを提供する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）前記ＤＮＡ分解のインヒビターが、酵素インヒビターを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）標的ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目８）前記抽出する工程が、フェノール−クロロホルム抽出を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）剥離した細胞を含有するサンプル中のＤＮＡの完全性を保存するための方法であって、該方法は、以下：
該サンプルを、臨界数の分析可能なＤＮＡの分子を生成するのに十分な、最小量のＤＮＡ分解のインヒビターに曝露させる工程、
を包含する、方法。
（項目１０）前記サンプルが糞便から得られる、項目９に記載の方法。
（項目１１）前記インヒビターがイオンキレート剤を含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）前記イオンキレート剤が二価のイオンキレート剤を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）前記二価のイオンキレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）前記サンプルをＤＮＡ分解のインヒビターの最小量に曝露させる工程が、糞便１グラム当たり０．０４２ｇのＥＤＴＡ〜糞便１グラムあたり０．７８２ｇのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡを提供する工程を包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１５）標的ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項目９に記載の方法。
（項目１６）前記抽出する工程が、フェノール−クロロホルム抽出を含む、項目９に記載の方法。

図１は、本発明の１局面を記載するフローチャートを示す。図２は、種々の濃度のＥＤＴＡを含む、幾つかの異なる均質化された糞便の上清から単離されたＤＮＡの分離ゲルを示す。図３は、種々の濃度のＥＤＴＡを含む均質化された糞便の上清から単離され、続いて捕捉され、増幅されたＤＮＡの分離ゲルを示す。図４は、種々の濃度のＥＤＴＡを含む均質化された糞便の上清から単離され、続いて捕捉され、さらに多くのＤＮＡを加えられ、増幅されたＤＮＡの分離ゲルを示す。図５は、例えば、表１および表２について記載されるようなモデルを使用して得られるデータの回帰分析によって作成される１組の曲線を示す。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．導入）
本発明は、サンプル中のＤＮＡの完全性を保存することによって、生物学的サンプル中のＤＮＡの増加した収率のための方法を提供する。このような方法は、目的のＤＮＡ（「標的ＤＮＡ」）が、低い頻度でサンプル中に存在するっか、または急速に分解する場合に、特に有用である。より具体的に、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡを分解する酵素を阻害する工程を包含する。

本発明の以前に、当業者は、サンプルからの抽出の前に、ＤＮＡ分解を防ぐことに関心をよせてはいなかった。典型的に、目的のＤＮＡが比較的多量にサンプル中（例えば、腫瘍細胞、血液）に存在するか、または方法が低頻度のＤＮＡに対する増加した感度に関するが、その完全性には向かわないかのいずれかであった。しかし、特に異質なサンプル（例えば、複数の細胞型および／または器官からの細胞および／または細胞細片を有するサンプル）中の低頻度ＤＮＡの場合、ＤＮＡに対する増加した感度についての方法は、全体的に成功ではなかった。本発明の方法は、ＤＮＡの完全性を保存することによる新しいアプローチを提供する。本発明の方法は、特定の標的ＤＮＡを検出する可能性を増加させる。なぜなら、このような方法は、インタクトな標的ＤＮＡをサンプル中でより利用可能とするからである。

図１を参照して、本発明の１つの一般化された方法が、サンプルを得る工程（工程２）およびそれをＤＮＡ分解インヒビターに曝露する工程（工程４）を包含する。一旦、サンプルが、ＤＮＡ分解インヒビターに曝露されると、標的ＤＮＡが抽出される（工程６）。次いで、この抽出された標的ＤＮＡの存在または非存在が検出される（工程８）。

異質なサンプル（例えば、糞便）において、内因性ヒトＤＮａｓｅおよび／または細菌ヌクレアーゼは、ＤＮＡを分解する。ヌクレアーゼの例には、ＤＮａｓｅ（例えば、デオキシボヌクレアーゼＩ（「ＤＮａｓｅＩ」）および小球菌ヌクレアーゼ）が挙げられる。ＤＮａｓｅおよび小球菌ヌクレアーゼの両方は、最適に機能するために二価のカチオンを必要とする。ＤＮａｓｅについて、適切なイオンとしては、Ｍｎ²⁺およびＭｇ²⁺が挙げられる。小球菌ヌクレアーゼについて、Ｃａ²⁺が適切なイオンである。イオンキレート化剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）、特に二価のイオンキレート化剤は、ヌクレアーゼを阻害し得る。イオンキレート化剤は、ヌクレアーゼとの会合からイオンを除去し、従って、ヌクレアーゼの機能を阻害する。例えば、最適な量で使用されるＥＤＴＡまたはＥＧＴＡは、本発明における使用のために有用なイオンキレート化剤である。

ＤＮＡの酵素媒介分解を不活性化するか、干渉するか、または遅くする他の化合物が有用である。例えば、ＤＮＡ分解酵素の活性部位と競合するか干渉し、それらの酵素を不活性化し、そして／またはＤＮＡ分解酵素を制御するメッセンジャーシステムをブロックするリガンドおよび／または抗体は、本発明の実施において有用である。フェノール−クロロホルム抽出成分はまた、抽出の間に典型的に使用される濃度よりもより高い濃度で、分離および変性によってヌクレアーゼを阻害し得る。例えば、フェノールは、ＤＮＡ分解酵素を変性し、そして、本発明の方法において使用して、ＤＮＡの完全性を保存する。また、ＤＮＡ分解酵素を分解および／または変性するプロテイナーゼも有用である。

本発明の方法は、診断スクリーニングのために十分な、高い完全性のＤＮＡを保存するために、最適な量のＤＮＡ分解インヒビターの使用を含む。異質のサンプル（例えば、糞便）において、標的ＤＮＡ（例えば、変異したＤＮＡまたは変異を示す列挙された野生型ＤＮＡの減少）が、少量で存在する。ＤＮＡ分解インヒビターの最適な量は、サンプルにおいて利用可能なＤＮＡの量の測定可能な改善をもたらす量である。従って、当業者は、高い完全性の標的ＤＮＡの診断的に関連したフラクションを保存するために必要なインヒビター量を使用することによって、本発明の方法における使用のためのＤＮＡ分解インヒビターの最適な量を経験的に決定し得る。診断的に関連したＤＮＡの量を決定するための方法を以下に示す。

異質のサンプルに対して実施されるＤＮＡの増幅および他の確率過程は、低頻度のＤＮＡを測定する不可能性に実際に寄与し得る。例えば、腫瘍形成の初期段階における典型的な癌−関連（変異）ＤＮＡは、異質のサンプル（例えば、糞便）中の約１％のＤＮＡを示す。サンプル中のＤＮＡが、３０％のＰＣＲ効率で増幅される場合、任意の特定のＤＮＡは、ＰＣＲの任意のラウンドで、増幅される３０％の可能性のみを有する。従って、サンプルの１％として最初に存在する変異ＤＮＡが、第１のラウンドにおいて増幅されない場合、変異ＤＮＡは、ラウンド１の後のサンプルにおいて、ＤＮＡの約０．7％のみを示す。変異体が、最初の２回のラウンドにおいて増幅されない場合（０．７×０．７、すなわち４９％の確率）、変異ＤＮＡは、ＰＣＲのラウンド３に突入した、サンプル中のＤＮＡの約０．６％のみを示す。変異体を検出するために使用される増幅後アッセイが、変異体に対して、０．５％以下の感度を有する場合、変異ＤＮＡの存在を信頼して検出することが、可能でないかもしれない。従って、検出方法自体は、特に、十分な量のインタクトなＤＮＡがサンプル中に存在しない場合、低頻度のＤＮＡを検出する際の困難さに実際に寄与し得る。従って、本発明の方法において使用するためのインタクトなＤＮＡの適切な量を決定するための１つの手段は、上記の確率的な効果を回避するために、サンプル中に存在しなければならないインタクトなＤＮＡの最小量を決定し、次いで、サンプル中の少なくとも最小の数のＤＮＡ分子を産生するための十分なインヒビターを使用することである。確率過程（例えば、ＰＣＲ）の効果を克服するために必要なＤＮＡ分子の最小数を計算するための方法を以下に示す。

正確な測定のための十分なＤＮＡ分子を産生するのに有用なモデルは、ＰＣＲの多くのラウンドにわたる確率過程を繰り返すことによって操作する。分子的な疾患診断に状況において、このモデルは、所望の標識ＤＮＡの増幅を信頼して確実にするために、ＰＣＲに存在しなければならない分子の数を指定する。このモデルは、予め設定されたＰＣＲ効率（個別の特異性要求に適合するために確立された）を組み込み、そして分析されるサンプル中の全ＤＮＡに対する変異ＤＮＡの予め設定された比（これは、検出される疾患の特性およびサンプルの性質である）を組み込む。それらの入力値に基づいて、このモデルは、統計的な信頼度の所定のレベル内で、低頻度の（標的）分子が増幅されそして検出されることを確実にするために、ＰＣＲに存在しなければならない分子の数を予測する。一旦、分子数が決定されると、当業者は、サンプルの特性（例えば、その起源、分子構造（ｍａｋｅｕｐ）など）に依存して、使用されるサンプルサイズ（例えば、重量、体積など）を決定し得る。このモデルは、増幅および検出を信頼して確実にするために、ＰＣＲに存在しなければならない分子の数を指定する。

例示的なモデルは、ＰＣＲのいくつかのラウンドを介した増幅のためのＤＮＡの選択をシミュレートする。このモデルの目的に対して、１：１００の変異体対全ＤＮＡの比（これは、疾患に対する臨床的な閾値で存在すると仮定される）を含むサンプルが選択される。例えば、結腸直腸癌において、検体（例えば、糞便）中の１％のヒトＤＮＡが変異される（すなわち、欠失、置換、再配列、転化または対応する野生型配列とは異なる他の配列を有する）。大多数のＰＣＲラウンドにわたって、サンプル中に任意の異常分子が存在することを仮定して、検体におけるそれらの比（ここでは、通常１００の中の１）に従って、変異体および野生型分子の両方が選択される（すなわち、増幅される）。しかし、任意の１つのラウンドにおいて、増幅される各種の数は、ポアソン分布に従って、決定される。多くのラウンドにわたって、このプロセスは、低頻度の変異ＤＮＡを検出する能力を減少させる確率的な誤りに供される。しかし、ＰＣＲの初期のラウンド（主として、最初の２回のラウンド）は、低頻度種が検出される場合、比例してより重要であり、そしてラウンド１０の後の任意のラウンドは、実質的に重要ではない。従って、このモデルは、（１）十分な変異分子のＰＣＲに存在すること、および（２）ＰＣＲの出力において、信頼性のある検出を確実にするために、十分な数の分子および全分子に対する変異体の十分な比が存在するように、確率増幅のそれらの分子に対する効果の合わせた確率を決定する。

ＰＣＲの最初の回に必要な数の分子を作動するために使用されるこのモデルは、１０００回の実験の「ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ」シュミレーションとして作製され、各実験は、サンプル中の各分子に対する１０サイクルのＰＣＲ操作からなる。このシュミレーションによって、（１）被験物由来のサンプルの採取を分析し；そして（２）各回に対して、サンプル中に変異体ＤＮＡが存在する場合増幅されるか否かを測定するための、各回のＰＣＲ反復性を分析した。反復性サンプリングの完了時、このモデルによって、変異体鎖が増幅される回のパーセント、検出のために予め決定された閾値を超える変異体のパーセント（この実施例において０．５％が１％の変異体：総量の比に基づく）、各回単独における確率論的なサンプリングに対する変化の係数（ＣＶ）、ならびに確率論的なサンプリングおよびＰＣＲの組み合わせに対する分散の係数、を決定した。

ＰＣＲ効率が０％または１００％以外のものである場合はいずれも（これらの２つの場合は、増幅が全くないか、または特定の増幅の完全な忠実度のいずれかを示す）、確率論的なノイズ（ｎｏｉｓｅ）が、ＰＣＲにおいて作製される。０％と１００％との間のＰＣＲにおけるノイズのシグナルレベルまたはバックグラウンドのシグナルレベルは、ＰＣＲの効率を伴って変化する。ＰＣＲにおける確率論的なノイズの標準偏差（Ｓ）は、式

によって与えられ、ここで、ｎは、サンプル中の分子の数であり、ｐは、ＰＣＲの効率であり、そしてｑは、１−ｐである。表１は、ＰＣＲ効率を１００％および２０％に設定し、そして変異体：総量の比が０．５％の、反復性サンプリングに関して得られた結果を示す。

表１は、種々の条件下で実施された１２の実験のモデルからの出力を示す。最初の列は、第１回目のＰＣＲで入る分子の公称数（すなわち、増幅から入手可能な分子の総数）を示す。第２の列は、変異体であると予想される生物学的被検物中の分子（ＤＮＡ）のパーセントを示す。糞便から回収されたＤＮＡにおける結腸直腸癌の徴候に関しては、初期段階の癌の検出における臨床的関連に対する閾値は、１％である。すなわち、不均一な被検物（例えば、糞便）から誘導されたサンプルにおける１％のＤＮＡは、結腸直腸癌に関連する変異を含む。６番目の列は、ＰＣＲの完了後に、ＰＣＲ産物を測定するために使用されるアッセイの検出の閾値である。この数がより下にみられる場合、有意である。なぜなら、十分な変異体ＤＮＡは、野生型および無作為バックグラウンドノイズから異常なシグナルに対して検出可能であるように、ＰＣＲによって生成されなければならないからである。見出し「出力」のもと、第１の線は、少なくとも１つの変異体分子が、第１回目のＰＣＲに存在する可能性を提供する。出力見出しの下の第２の線は、検出に対して予備決定された閾値より上の、変異体の検出（ＰＣＲ後）の可能性を提供する。例えば、実験４において、結果から、実験４に特定化された条件下で実行された８７．９％の実験物において、変異体の数は、検出の閾値数を超えることが示される。最後に、最後の２つの列は、サンプリングならびにサン
プリングおよびＰＣＲの組み合わせに対する、変化の係数を提供する。
表１

表１に示すように、１００％のＰＣＲ効率であっても、１０００個の入力分子が使用される場合（すなわち、１０００個のＤＮＡ分子が、最初のＰＣＲサイクルにおけるプライミングに利用可能である）、たとえ１００％のＤＮＡが任意の所定の回のＰＣＲにおいて増幅されたとしても、変異体ＤＮＡは９７．１％のサンプルのみで検出される。１０，０００個の分子が存在する場合、変異体ＤＮＡが増幅されかつ検出されることは、（表１の実験６の結果で示すように）実質的に確実である。入力分子の数における変化に起因する確率的な誤りは、約５００個の入力分子でより有意ではなくなり、そして上昇する（すなわち、統計学的変化に対するＣＶは、ＰＣＲ効率が２０％または１００％であるか否かに関わらず、ほとんど同じである）。低いＰＣＲ効率（表１における２０％）において、このモデルが、ＰＣＲへの５０、１００、２００、５００個、またはさらに１０００個の分子の導入は、増幅または検出のいずれも保証しないことを示す。実験１２に示すように、１０，０００個の分子の導入により、変異体標的の増幅が生じ、そしてこの後の検出の高い可能性を生じる。従って、１００％効率のＰＣＲでさえ、入力分子が５００未満に落ちる場合、有意な偽陰性事象が生じる。

前述の分析により、低頻度ＤＮＡの増幅を達成し、そしてその検出を可能にするために、ＰＣＲへ提供されなければならない分子の特有の範囲の数が、存在することが示される。この範囲は、ＰＣＲ効率、およびサンプル中の低頻度（変異体）ＤＮＡのパーセンテージ、および検出閾値の関数である。上述のモデルが開発され、そして上記のようにＰＣＲをシミュレートするためにＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｃｏｄｅ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｏｆｆｉｃｅ９７）が実行された。結果が測定された統計学的な信頼水準は、約９９％の定数を維持する。ＰＣＲ効率およびパーセント変異体ＤＮＡのみが変化された。上記のように、このモデルは、１，０００回の実験に対する「ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ」シミュレーション（各実験は、１０回のＰＣＲからなる）で、ＤＮＡを反復してサンプリングする。この結果を、以下の表２に示す。
表２

上記のようなモデルを使用して得られたデータの回帰により、以下の図５に示される曲線のセットを作製する。

図５を用いて、ＰＣＲに提供される分子の最適な数が、ＰＣＲ効率を選択し、そして疾患と関連がある変異体ＤＮＡであると疑われるサンプルのパーセンテージを選択することによって決定される。次にはこれが、検出の閾値を指令する。全てではない検出戦略が、類似の基本的な検出閾値を有し、そして適切な技術が選択されなければならない。パーセンテージ変異体ＤＮＡは、直腸結腸癌に関して上記で概説するように、臨床要因によって決定され得る。

増幅された、検出可能な変異体ＤＮＡを得る可能性を最大にするために、ＰＣＲ効率および期待される変異体のパーセントを決定し得る。例えば、５％のサンプルが、このアッセイの結果の信頼度を高めるために、変異体ＤＮＡであることが期待される場合、図５の「１％」曲線からの入力分子の数、Ｎを選択し得る。

このモデル、そして特に図５は、ＤＮＡ分解インヒビターの最適な濃度を決定する場合に、有用である。ＤＮＡサンプルがＤＮＡインヒビターに曝露された後に、ＰＣＲがＤＮＡ分子を分析するために使用される場合、図５は、どれくらい多くの標的ＤＮＡの分子が、十分な分析可能なＤＮＡを有するために保存される必要があるかを示す。従って、任意のＤＮＡ分解インヒビターの最適な量は、図５に従う、十分な数の分析可能なＤＮＡを産生するインヒビターの量またはその量の範囲として決定され得る。当然、このモデリング系は、ＰＣＲ以外のＤＮＡ検出技術に適用され得る。詳細には、当業者は、確率論的ノイズが問題である、任意のプロセスおよび／または検出技術に対してこのモデリング系を適用し得る。従って、任意のＤＮＡ分解インヒビターの最適な量は、分析可能なＤＮＡを生成するのに十分なＤＮＡ分子の数に基づいて決定され得る。

ＰＣＲへの入力のための分子の数が一旦決定されると、その数（またはより多く）の分子を含むサンプルは、標準の方法に従うＰＣＲに対して調製される。サンプル中の分子の数は、例えば、米国特許第５，６７０，３２５号（これは、本明細書中に参考として援用される）に教示されるような列挙の方法によって、直接決定され得る。あるいは、複合体サンプル中の分子の数は、モル濃度、分子量によって、または当該分野で公知の他の手段によって決定され得る。サンプル中のＤＮＡの量は、質量分析器、光学濃度、または当該分野で公知の他の手段によって測定され得る。生物学的被検物由来のサンプル中の分子の数は、当該分野における多数の手段（米国特許第５，７４１，６５０号および同第５，６７０，３２５号（これらの両方は、本明細書中に参考とし援用される）において開示される手段を含む）によって測定され得る。

上記のような方法は、確率論的なプロセスが生じる任意のＤＮＡ単離、検出、または増幅プロセスにおける使用のための、ＤＮＡ分解インヒビターの最小量または最適な量を決定するために使用される。分子の最小数（これは、低頻度の種を信頼して検出するように測定されなければならない）を決定するための上記のモデルを使用して、経験的に、どれくらいの任意の所定のインヒビターが使用されるべきであるかを決定し得る。

（ＩＩ．実施例−ＤＮＡ分解インヒビターとしてＥＤＴＡを含む糞便中のＤＮＡの検出）
（Ａ．導入）
本発明の方法は、結腸直腸癌を検出するための糞便由来のＤＮＡ分析に有用である。結腸直腸癌は、早期に診断される場合、その癌性組織の外科的除去によって効果的に処置され得る。結腸直腸癌は、結腸直腸の上皮において発生し、そして代表的には、発生の早期段階中には広範には可視化されない（従って、これは、侵襲性ではない）。身体全体に広がる、高度に可視化され、侵襲性であり、そして最終的に転移性の癌への移行には、１０年以上かかる。この癌は、侵襲の前に検出される場合、この癌性組織の外科的除去が、効果的な治療法である。しかし、結腸直腸癌は、しばしば、臨床症状（例えば、痛み、および黒いタール状の糞便）の発現の際にしか検出されない。一般的に、このような症状は、この疾患が十分に確立されたとき（しばしば、転移が生じた後）にのみ現れ、そしてその患者の予後は、その癌性組織の外科的切除後でさえ、思わしくない。従って、結腸直腸癌の早期検出が、重要である。なぜなら、早期検出は、患者の罹患率を有意に減少し得るからである。

（Ｂ．実験）
以下の実験は、ＤＮａｓｅのインヒビターである、ＥＤＴＡが、糞便サンプルからの高い完全性のＤＮＡの収率を増加し、同時に、増幅可能なＤＮＡの量を増加することを実証する。これらの実験において、糞便（各５ｇ）の３つのアリコートを、緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ、１０ｍＭＮａＣｌ、ＥＤＴＡ）中でホモジェナイズした。緩衝液対糞便の比を、７：１にした（従って、３５ｍｌの緩衝液を、各５ｇの糞便に対して使用した）。この緩衝液は、０ｍＭのＥＤＴＡ、１６ｍＭのＥＤＴＡ、または９６ｍＭのＥＤＴＡを含んだ。次いで、この３つのアリコートの各々を、最終的に２０：１の緩衝液対糞便の比まで、緩衝液（ＥＤＴＡを含まない）でさらに希釈した。次いで、各アリコートを遠心分離し、そして上清（これは、活性なＤＮＡ分解画分を有する）をきれいなチューブに取り出した。次いで、２μｇのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡおよび１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡのＤＮＡ混合物を、各チューブに添加した。各チューブを、３７℃で７５分間インキュベートした。次いで、４２μｌのプロテイナーゼＫおよび２５０μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を、各チューブに添加した後、３７℃で一晩インキュベートした。この一晩のインキュベーション後、各サンプル中のＤＮＡを、標準的な技術によって調製した。例えば、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ §§２．１−２．４（Ａｕｓｕｂｅｌら、第３版、１９９５）を参照のこと。一般的に、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、そしてフェノール抽出を行った後に、ＤＮＡを単離した。次いで、単離されたＤＮＡを、標準的なＴｒｉｓ緩衝液中に置いた。

この単離されたＤＮＡに対して、３つの実験を行った。第１の実験は、ホモジェナイズした糞便の上清に存在するＤＮＡ分解活性が、至適量のＥＤＴＡによって阻害され、これが、高い完全性のＤＮＡの量を増加することを実証した。この実験において、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中でホモジェナイズした糞便のアリコートから採取した、そのホモジェナイズした糞便の上清からＤＮＡを単離した。全核酸を、分離ゲル上で泳動した。結果を図２に示す。ここで、矢印は、目的のＤＮＡを含むスメア（または、スメアの欠失）の位置を示す。

レーン４、５、および６は、それぞれ、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中でホモジェナイズした糞便から得られたホモジェナイズした糞便の上清に添加し、その後で単離したＤＮＡのサンプルを表す。各レーンは、糞便サンプル由来の内因性ＤＮＡを表す高分子量のバンド、および外因性ＤＮＡ由来のスメアを示すことに留意する。写真のバンドおよびスメアの強度（これは、バンド中のＤＮＡの量に相関し、強度が大きいほど、より多くの量のＤＮＡに対応する）は、元の緩衝液中のＥＤＴＡの濃度が増加するほど、増加した。レーン７〜９および１０〜１２は、レーン４〜６の複製である。ＥＤＴＡ濃度が増加するにつれて、バンドおよびスメアの強度が増加することは、ＤＮＡの完全性が、緩衝液中のＥＤＴＡの濃度が増加するほど保存されることを示した。従って、このホモジェナイズした糞便の上清のＤＮＡ分解活性は、ＥＤＴＡによって、ほぼ用量依存性の様式で阻害された。

レーン１、２および３、ならびにレーン１３、１４および１５は、１６ｍＭＥＤＴＡで作製した緩衝液中の２μｇのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡおよび１００ｎｇの外因性ヒトＤＮＡを含有するコントロールサンプルであった。予測されたように、各レーンは、この添加したＤＮＡを表すスメアを示した。

第２の実験において、上記のように単離されたＤＮＡを、捕捉および増幅した。この実験の結果は、ＥＤＴＡが、糞便上清中に存在するＤＮＡ分解活性を阻害するのみならず、増幅可能なＤＮＡの量を増加することを実証した。この実験において、上記のようにＤＮＡを調製した後、標準的なハイブリッド捕捉（ｈｙｂｒｉｄｃａｐｔｕｒｅ）を、Ｋｒａｓ特異的捕捉プローブを使用して、ＫｒａｓＤＮＡを捕捉することによって行った。次いで、ＫｒａｓＤＮＡをＰＣＲ増幅した。図３は、ＫｒａｓＤＮＡの保存に対するＥＤＴＡの効果を示す。ＫｒａｓＤＮＡを表すバンド（または、バンドの欠失）の位置を、矢印で示す。

レーン４、５および６は、それぞれ、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中でホモジェナイズした糞便から得られた、そのホモジェナイズした糞便の上清に添加したテンプレートＤＮＡから増幅された、ＫｒａｓＤＮＡを表す。レーン４においてＫｒａｓのバンドは、ほとんど存在しないが、レーン５および６においては、緩衝液中のＥＤＴＡの濃度が増加するにつれて、このＫｒａｓのバンドの強度が増加した（これは、ＫｒａｓＤＮＡが実際に存在している量の増加を表す）。レーン７〜９は、レーン４〜６の複製であり、これは、元の緩衝液中のＥＤＴＡの濃度が増加するにつれて、類似のバンド強度の増加（ＤＮＡ存在量の増加）を示す。従って、ＥＤＴＡの濃度が高いほど、ＫｒａｓＤＮＡが多く増幅され、より強いシグナルを生じる。

さらに、集団において、糞便から増幅され得るＤＮＡレベルは、個体間で変化する。これらの個体を、Ａ〜Ｆのグループに特徴付け、Ａは、ＤＮＡレベルが最も高く、そしてＦは、ＤＮＡが検出不可能なレベルである。グループＡの高いＤＮＡレベルは、それらの糞便における低いＤＮＡ分解活性に起因する（「高い完全性の糞便」）。グループＡの個体由来の糞便アリコートをホモジェナイズする緩衝液にＥＤＴＡを添加することは、大きな効果を生じることが予測されない。なぜなら、グループＡの糞便は、ＤＮＡ分解活性をほとんど有さないからである。実際、ＫｒａｓＤＮＡを、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中でホモジェナイズされたグループＡの糞便から得られた、そのホモジェナイズした糞便の上清に添加したテンプレートＤＮＡから増幅した場合に、増幅されたＫｒａｓＤＮＡの量には、ほとんど差異は観察されなかった（それぞれ、レーン１０、１１および１２）。Ｋｒａｓバンドの完全性において、０ｍＭのＥＤＴＡと１６ｍＭまたは９６ｍＭのＥＤＴＡとの間で、わずかな増加
しか観察され得ず、これは、ＥＤＴＡの阻害濃度で、ＫｒａｓＤＮＡの量がわずかにしか増加しないことを表す。

レーン１〜３およびレーン１３〜１５は、ホモジェナイズした糞便の上清に曝露されなかった、増幅されたＫｒａｓＤＮＡのサンプルを表す。予測されたように、これらのコントロールのレーンは、レーン間で等しい強度のＫｒａｓＤＮＡを表すバンドを示す。レーン１６および１７はネガティブコントロールであり、そして予測されたように、Ｋｒａｓを表すバンドを示さず、これは、観察されたいずれのＫｒａｓＤＮＡも、捕捉されたＤＮＡに起因し、混入に起因しないことを示す。レーン１８は、ネガティブコントロールであり、そして予測されたように、Ｋｒａｓ遺伝子を表すバンドを有さず、これは、このＰＣＲ産物が、サンプル由来であり、混入由来ではないことを示す。レーン１９〜２１は、ポジティブコントロールであり、ここでは、５０ｐｇ、１００ｐｇまたは２００ｐｇのヒトＤＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡのバックグランド下で増幅され、これは、ヒトＤＮＡが、このモデル系におけるＥ．ｃｏｌｉのバックグランド下で増幅され得ることを示す。最後に、レーン２２は、分子量マーカーである。

第３の実験において、ヒトゲノムＤＮＡを捕捉後の各サンプルに添加したことを除き、第２の実験と同じプロトコールを使用した。ＫｒａｓＤＮＡを、ＰＣＲによって再度増幅させた。従って、過剰のテンプレートＤＮＡが、ＰＣＲに利用可能である。この実験は、第２の実験における種々のレベルのＰＣＲ増幅が、正常なＰＣＲを妨害または増強するＥＤＴＡに起因せず、ＥＤＴＡによる種々のレベルのＤＮＡ分解阻害から生じる、増幅されるべき利用可能な種々のレベルのテンプレートＤＮＡに起因することを実証する。図４は、この実験の結果を示す。Ｋｒａｓを表すバンド（または、バンドの欠失）の位置を、矢印で示す。レーン１〜６および８〜１３は、第２の実験のレーン１〜１２と対応する（すなわち、レーン１〜３は、コントロールであり、レーン４〜６および８〜１０は、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡ中でホモジェナイズされた、そのホモジェナイズされた糞便の上清に曝露されたサンプル中で増幅された、過剰のＫｒａｓＤＮＡであり、そしてレーン１１〜１３は、０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡ中でホモジェナイズされた高い完全性の糞便からの、そのホモジェナイズされた糞便の上清に曝露されたサンプル中で増幅された、過剰のＫｒａｓＤＮＡであった）。予測されたように、レーン１〜６および８〜１３は、ほぼ等しい強度のＰＣＲ産物を示す。なぜなら、過剰のテンプレートＤＮＡが利用可能であるからである。ＥＤＴＡは、正常なＰＣＲを妨害または増強しない。この結果は、第２の実験での０ｍＭ、１６ｍＭ、または９６ｍＭのＥＤＴＡサンプル中の種々のレベルのＰＣＲ増幅が、種々のレベルのテンプレートＤＮＡに起因し、そしてインヒビターに起因しなかったことを示す。レーン１４は、ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを示す。レーン１５〜１８は、第２の実験のレーン１７および１９〜２１と同じコントロールである。

上記の実験データから、ＤＮａｓｅを阻害するために必要とされるＥＤＴＡの量を計算した。この３つの実験で使用した種々の緩衝液中のＥＤＴＡの濃度を、１グラムの糞便あたりのＥＤＴＡのグラムとして正規化した。一般的に、ＥＤＴＡの濃度を、ＥＤＴＡの分子量および糞便がホモジェナイズされた緩衝液の容量によって乗算した。この積を、ホモジェナイズした糞便の量で除算した。例えば、以下の等式を使用して、ＥＤＴＡ濃度を正規化した。

従って、ホモジェナイズされる任意の量の糞便について、ＤＮＡの収率を最大化するために、１ｇの糞便あたり少なくとも約０．０４２ｇのＥＤＴＡを、ホモジェネーション緩衝液に使用するべきである。使用され得るＥＤＴＡの範囲は、１ｇ糞便あたり約０．０４２ｇのＥＤＴＡ〜１ｇ糞便あたり約０．７８２ｇのＥＤＴＡである。より好ましくは、１ｇ糞便あたり約０．２５０ｇのＥＤＴＡ〜１ｇ糞便あたり約０．５２１ｇのＥＤＴＡを使用する。最も好ましくは、１ｇ糞便あたり約０．３９１ｇのＥＤＴＡを使用する。

これらの計算は、通常使用される緩衝液の容量および糞便量で、ホモジェナイズされたサンプル中に存在するＥＤＴＡの量が、そのホモジェナイズされたサンプル中のＥＤＴＡの最終濃度よりも、より重要な因子であることを示す。しかし、当業者が理解するように、ある点において、ＥＤＴＡの量が所定の容量中で同じままであるが、この容量は、非常に大きくなって、ＤＮＡの完全性に対するＥＤＴＡの効果が希釈されるかもしれない。通常使用されるパラメーター内の糞便サンプルを試験する場合、この希釈効果は見られない。しかし、代替的実施形態において、ＥＤＴＡの濃度は、関連性のある因子である。これらの実施形態において、約１６ｍＭのＥＤＴＡ〜約３００ｍＭのＥＤＴＡが、有用である。より好ましくは、約１００ｍＭのＥＤＴＡ〜約２００ｍＭのＥＤＴＡが、有用である。最も好ましくは、約１５０ｍＭのＥＤＴＡが、有用である。

Claims

糞便サンプル中のＤＮＡの完全性を保存する方法であって、該方法は、該糞便サンプルを、糞便１グラム当たり０．２５０ｇのＥＤＴＡ〜糞便１グラムあたり０．７８２グラムのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。
標的ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記抽出する工程が、フェノール−クロロホルム抽出を含む、請求項２に記載の方法。
剥離した細胞を含有するサンプル中のＤＮＡの完全性を保存するための方法であって、該方法は、該サンプルを、サンプル１グラム当たり０．２５０ｇのＥＤＴＡ〜サンプル１グラムあたり０．７８２グラムのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。
前記サンプルが糞便から得られる、請求項４に記載の方法。
標的ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
前記抽出する工程が、フェノール−クロロホルム抽出を含む、請求項６に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記糞便サンプルを、糞便１グラム当たり０．２５０ｇのＥＤＴＡ〜糞便１グラムあたり０．５２１グラムのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記糞便サンプルを、糞便１グラムあたり０．３９１グラムのＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。
請求項４に記載の方法であって、該方法は、前記サンプルを、サンプル１グラム当たり０．２５０ｇのＥＤＴＡ〜サンプル１グラムあたり０．５２１グラムのＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。
請求項４に記載の方法であって、該方法は、前記サンプルを、サンプル１グラムあたり０．３９１グラムのＥＤＴＡに暴露させて、ＤＮＡの完全性を保存する工程を包含する、方法。