ES2684687T3 - Pronóstico del impacto de la dieta en comorbilidades relacionadas con la obesidad - Google Patents

Pronóstico del impacto de la dieta en comorbilidades relacionadas con la obesidad Download PDF

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Abstract

Método para determinar si un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, comprendiendo dicho método: a) detectar a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, y b) determinar que el sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.

Description

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DESCRIPCION
Pronóstico del impacto de la dieta en comorbilidades relacionadas con la obesidad.
La presente invención se refiere a métodos para determinar el riesgo de comorbilidades relacionadas con la obesidad en sujetos con sobrepeso basado en el microbioma bacteriano intestinal, y a métodos para aumentar la riqueza bacteriana en individuos que lo necesitan, particularmente en individuos con sobrepeso.
El sobrepeso y la obesidad se definen como una acumulación anormal o excesiva de grasa que presenta un riesgo para la salud. Una medida poblacional burda de la obesidad es el índice de masa corporal (BMI), el peso de una persona (en kilogramos) dividido entre el cuadrado de su altura (en metros). Una persona con un BMI igual o superior a 25 se considera con sobrepeso. Una persona con un BMI de 30 o mayor generalmente se considera obesa.
El sobrepeso y la obesidad son los principales factores de riesgo para numerosas enfermedades crónicas, o las llamadas comorbilidades relacionadas con la obesidad, incluyendo diabetes, enfermedades cardiovasculares y cáncer. Una amplia bibliografía apoya que el sobrepeso y la obesidad son las causas principales de las comorbilidades que pueden conducir a una mayor morbimortalidad. En una revisión reciente, se mostró que 18 comorbilidades están estadísticamente correlacionadas con el sobrepeso y la obesidad: cáncer (renal, colorrectal, de próstata, de ovario, de útero/endometrial, de esófago, de páncreas, y de mama posmenopáusico), diabetes tipo II, riesgo de enfermedad cardiovascular (hipertensión, arteriopatía coronaria, insuficiencia cardiaca congestiva, embolia pulmonar, derrame cerebral), enfermedad de la vesícula biliar, dolor de espalda crónico, osteoartritis y asma (Guh D. et al, BMC Public Health.; 9: 88; 2009).
Esto suscita una grave preocupación con respecto a la salud pública, tanto desde el punto de vista de los pacientes como también desde el punto de vista económico. De hecho, las enfermedades mencionadas anteriormente requieren muy a menudo tratamientos médicos extensos, o, en el caso de las enfermedades crónicas, requieren de monitorización continua.
Si bien se ha reconocido desde hace tiempo que la estrategia más eficaz para prevenir esas enfermedades es la pérdida de peso, se pueden considerar muchas estrategias de pérdida de peso diferentes, dependiendo del paciente. Aunque las clásicas dietas bajas en calorías se han recomendado por los médicos durante mucho tiempo, en algunos casos pueden ser necesarios los enfoques drásticos, tales como la cirugía. Aún se discute en cuanto a qué tipo de estrategia de pérdida de peso es más eficaz para aliviar los riesgos de comorbilidad. Una de las posibilidades que parecen surgir de los diferentes estudios es que se pueden necesitar estrategias de pérdida de peso específicas adaptadas a la persona con sobrepeso u obesidad, dependiendo de varios factores tales como los antecedentes genéticos y el perfil hormonal. Sin embargo, probablemente debido a la diversidad de los casos, no se han identificado indicadores claros que podrían servir a los médicos como ayuda para la toma de decisiones.
Sin embargo, las investigaciones recientes apuntan hacia otro aspecto del tema que nos ocupa, que es que la microbiota humana juega un papel crucial en las predisposiciones de diferentes enfermedades (Clemente et al., Cell, 148(6): 1258-1270, 2012).
La microbiota humana comprende miles de especies bacterianas, entre las cuales están las bacterias comensales, benéficas o patógenas. Los seres humanos hospedan microbiota en varios lugares, tales como la piel, los pulmones, la vagina, la boca y el intestino. Esa microbiota es diferente dependiendo de su ubicación y su composición bacteriana. La microbiota intestinal es la más grande en su composición. En general, se considera que comprende miles de especies bacterianas, pesa alrededor de 1,5 kg, y constituye un rico repertorio de genes por sí mismo, también llamado microbioma intestinal, que es 100 veces más grande que el genoma nuclear humano.
Se ha demostrado que la microbiota intestinal desempeña un papel en el desarrollo de trastornos metabólicos tales como la obesidad, el síndrome metabólico y la diabetes. Mientras que la normbiosis, que califica el estado normal de la microbiota, parece garantizar la homeostasis, la disbiosis, que es la distorsión de la normbiosis, se correlaciona con una larga lista de enfermedades.
Estudios recientes muestran que la microbiota intestinal humana puede estar modificada en individuos obesos con respecto a individuos delgados, incluso si se han dado a conocer ciertos cambios inconsistentes. En algunos estudios, pero no en todos, se observó un aumento en el phylum Firmicutes y una disminución de Bacteroidetes asociados con la obesidad, dándose a conocer también lo contrario. Igualmente se dio a conocer un aumento de Actinobacteria en obesos. Las alteraciones relacionadas con la obesidad de la microbiota intestinal de ratón se caracterizan por cambios en la relación de Firmicutes a Bacteroidetes, que aumenta en los animales obesos. Estos cambios probablemente no son una mera consecuencia de la obesidad, ya que el fenotipo obeso se puede transmitir por transplante de microbiota intestinal en ratones, lo que indica que las poblaciones microbianas intestinales pueden tener un papel activo en la patogénesis de la obesidad, y de este modo probablemente en las comorbilidades asociadas.
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Sin embargo, no todas las especies bacterianas de la microbiota intestinal se han identificado y secuenciado, principalmente porque la mayoría de ellas no pueden ser cultivadas. Además, la mayoría de las bacterias solamente están presentes en un bajo número de copias en la microbiota intestinal, lo que las hace difíciles de detectar (Hamady y Knight, Genome Res., 19: 1141-1152, 2009). Por lo tanto, la mayoría de las secuencias en el ADN bacteriano del intestino no están asignadas taxonómicamente todavía, lo que restringe el uso como biomarcadores a especies y genes taxonómicamente conocidos.
De este modo, todavía hay necesidad de marcadores que permitan la determinación del riesgo de un sujeto con sobrepeso para desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad, y además para diferenciar entre sujetos con sobrepeso con el fin de adaptar la estrategia de pérdida de peso a cada individuo.
Leyenda de las figuras
Figura 1. Composición microbiana intestinal de sujetos LGC (n = 18) y HGC (n = 27).
a) Distribución del recuento de genes en todos los individuos (línea roja) o enterotipos (líneas negras) al inicio del estudio, después de la reducción de los datos a 7 millones de lecturas únicamente coincidentes. b) Presencia y frecuencia de 25 genes trazadores para 18 especies bacterianas. Las filas corresponden a los genes, y la frecuencia relativa de cada gen está indicada por el color, incrementando desde gris claro a gris intenso; el diana denota que un gen no ha sido detectado. Las columnas corresponden a los individuos, que han sido ordenados por número creciente de genes para los 3 puntos de tiempo del estudio. Los valores en el lado derecho de la figura dan la probabilidad de Mann-Whitney (q: ajustada por el método de Benjamini-Hochberg) de que una especie sea abundante de manera diferencial entre los individuos con baja y alta cantidad de genes; la abundancia de una especie en un individuo se calculó como la media de las frecuencias de los genes trazadores. F. prau y R. inul significa F. prausnitzii y R. inulinivorans, respectivamente. c) Los valores de AUC obtenidos para las mejores combinaciones de 1 a 15 especies en un análisis ROC de 45 individuos de nuestra cohorte (rojo); Recuadro: AUC para la mejor combinación de 6 especies. El AUC francés y AUC danés se refieren a las cohortes francesa (Micro-obeso) y danesa (MetaHIT), respectivamente.
Figura 2. Diferencias entre sujetos LGC (n = 18) y HGC (n = 27) en las variables bioclínicas.
Las barras blancas y negras se refieren a los grupos LGC y HGC, respectivamente; se indican los errores estándar de la media. 0wk: línea de base, 6wks: fin del periodo de restricción de energía, y 12wks: fin del periodo de estabilización. #valor de p <0,1, *: valor de p <0,05, **: valor de p <0,01 mediante pruebas de Mann-Whitney. El “índice de Disse” se calcula combinando los valores de lípidos y de insulina (véase el material complementario).
Descripción
Los inventores han establecido que los rasgos clínicos vinculados a las comorbilidades relacionadas con la obesidad se correlacionan significativamente con una diversidad bacteriana intestinal reducida en sujetos con sobrepeso. Ellos, además, diseñaron un método para determinar con precisión si un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana reducida. De ese modo es posible determinar con una sensibilidad elevada si un sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad.
La presente invención está dirigida a un método para determinar si un sujeto con sobrepeso que tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad. Dicha determinación es particularmente útil para evaluar si un sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad. Los inventores han mostrado que es posible discriminar entre sujetos con sobrepeso que tienen una diversidad bacteriana intestinal reducida y aquellos que tienen una diversidad bacteriana intestinal normal simplemente evaluando la presencia de un pequeño número de especies bacterianas en el intestino
Los inventores han encontrado un conjunto de especies bacterianas específicas, cuya presencia o ausencia en el ADN bacteriano de las heces de un sujeto con sobrepeso se correlaciona significativamente con la diversidad bacteriana intestinal reducida. Estas especies no se limitan a aquellas que ya se conocían mediante la técnica anterior.
Por “diversidad bacteriana intestinal reducida”, se refiere aquí a una microbiota intestinal en la que el número de especies bacterianas está reducido en comparación con la microbiota intestinal normal promedio.
Por ejemplo, la comparación entre una microbiota de ensayo y una microbiota intestinal normal se puede lograr mediante el genotipado secuencias obtenidas de las muestras biológicas, por ejemplo con un secuenciador de ADN masivamente en paralelo. En ese caso, un sujeto con diversidad bacteriana reducida puede tener un microbioma que comprende menos de 480 000 recuentos de genes bacterianos, en el que dichos recuentos se obtienen secuenciando ADN microbiano intestinal obtenido a partir de una muestra de 200 mg de heces con secuenciación de alta resolución basada en Illumina, cartografiando las secuencias obtenidas sobre un conjunto de
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referencia del genoma bacteriano (tal como se describe en Arumugam et al., Nature, 473(7346): 174-80, 2011), eliminando la contaminación humana, descartando el cartografiado de lecturas en múltiples posiciones, y basado en la cantidad total de lecturas coincidentes que quedan.
De acuerdo con la invención, un sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, o una diversidad bacteriana normal. El persona experta entenderá entonces fácilmente que cuando el método de la invención no determina que el sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, dicho sujeto, obviamente, tiene una diversidad bacteriana intestinal normal. Por “diversidad bacteriana intestinal normal”, se refiere aquí a una microbiota intestinal en la que el número de especies bacterianas es alrededor del número encontrado en la microbiota intestinal normal promedio, es decir, entre 10% inferior y 10% superior al número de especies bacterianas encontradas en la microbiota intestinal normal promedio.
Por “microbiota”, se refiere aquí a la microflora y microfauna en un ecosistema, tales como intestinos, boca, vagina o pulmones. En microbiología, la flora (plural: floras o florae) se refiere a las bacterias colectivas y a otros microorganismos en un ecosistema (por ejemplo, una parte del cuerpo de un hospedante animal). La “microbiota intestinal” consiste en todas las especies bacterianas que constituyen la microbiota presente en el intestino de un individuo.
Una especie bacteriana de acuerdo con la invención comprende no solamente especies bacterianas conocidas, sino también especies que todavía no han sido descritas taxonómicamente. De hecho, ya sea que hayan sido descritas taxonómicamente o no, las especies bacterianas se pueden caracterizar por su genoma. Por ejemplo, los métodos para caracterizar bacterias usando información genética se han descrito en Vandamme et al. (Microbiol Rev. 1996, 60 (2): 407).
Será obvio para el experto en la técnica que los genes de una especie bacteriana están físicamente vinculados como una unidad en lugar de estar distribuidos de forma independiente entre individuos, es decir, el genoma de dicha especie bacteriana comprende secuencias de genes que siempre están presentes o ausentes juntas entre individuos. Por lo tanto, la especie bacteriana puede definirse por partes de su genoma, y la secuenciación de todo el genoma de la especie bacteriana no es necesario para la identificación adecuada de la especie bacteriana.
Por ejemplo, un método para la identificación de especies bacterianas en una composición microbiana, basado en la secuenciación del ADN bacteriano y el uso de genes marcadores como referencias taxonómicas, se ha descrito en Liu et al. (BMC genomics, 12(S2):S4, 2011). La persona experta en la técnica puede referirse además a Arumugam et al. (Nature, 473(7346): 174-80, 2011) o Qin et al. (Nature, 490(7418): 55-60, 2012) para métodos detallados para la identificación de especies bacterianas basados en secuenciación de ADN bacteriano.
De acuerdo con la presente invención, una “especie bacteriana” es un grupo de genes bacterianos del microbioma intestinal, cuyo nivel de abundancia varía en la misma proporción entre las diferentes muestras individuales. En otras palabras, una especie bacteriana de acuerdo con la invención es un grupo de secuencias de genes bacterianos cuyos niveles de abundancia en las muestras de diferentes sujetos están estadísticamente vinculados en lugar de estar distribuidos al azar. Será inmediatamente evidente para la persona experta que dicho grupo corresponde así a una especie bacteriana.
Los genes del microbioma se pueden atribuir a una especie bacteriana mediante varios métodos estadísticos conocidos por la persona experta en la técnica. Preferentemente, se usa un método estadístico para la prueba de covarianza para probar si dos genes pertenecen al mismo grupo. Para ello, el experto puede usar medidas no paramétricas de dependencia estadística, tales como, por ejemplo, el coeficiente de correlación de rangos de Spearman. Lo más preferible, una especie bacteriana de acuerdo con la descripción es un grupo que comprende genes bacterianos intestinales y que se determina por el método usado en Qin et al. (Nature, 490(7418): 55-60, 2012) para identificar grupos de vinculación metagenómica.
Por “sujeto”, se refiere aquí a un vertebrado, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser humano. Por “sujeto con sobrepeso”, se refiere aquí a un ser humano que tiene un índice de masa corporal superior a 25 kg/m2. El índice de masa corporal se define como la masa corporal del individuo dividida entre el cuadrado de su altura. Las fórmulas usadas universalmente en medicina producen una unidad de medida de kg/m2.
Hay varias maneras de obtener las muestras de ADN microbiano intestinal de dicho sujeto (Sokol et al, Inflamm. Bowel Dis., 14(6): 858-867, 2008). Por ejemplo, es posible preparar muestras de las mucosas, o biopsias, obtenidas por colonoscopia. Sin embargo, la colonoscopia es un procedimiento invasivo que está mal definido en términos de procedimiento de recolección de estudio a estudio. Asimismo, es posible obtener biopsias a través de la cirugía. Sin embargo, incluso más que la colonoscopia, la cirugía es un procedimiento invasivo, cuyos efectos sobre la población microbiana no se conocen. Se prefiere el análisis fecal, un procedimiento que se ha usado de manera confiable en la técnica (Bullock et al, Curr Issues Intest Microbiol.; 5 (2): 59-64, 2004; Manichanh et al, Gut, 55: 205-211,2006; Bakir et al, Int J Syst Evol Microbiol, 56(5): 931-935, 2006; Manichanh et al., Nucl. Acids Res., 36(16): 5180-5188, 2008; Sokol et al., Inflamm. Bowel Dis., 14(6): 858-867, 2008). Un ejemplo de este procedimiento se describe en la sección de Métodos de los Ejemplos Experimentales. Las heces contienen alrededor de 1011 células bacterianas por gramo (peso húmedo), y las células bacterianas comprenden alrededor
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de 50% de la masa fecal. La microbiota de las heces representa principalmente la microbiología del intestino grueso distal. Por lo tanto, es posible aislar y analizar grandes cantidades de ADN microbiano a partir de las heces de un individuo. Por “ADN microbiano intestinal”, se entiende aquí el ADN de cualquiera de las comunidades bacterianas residentes del intestino humano. El término “ADN microbiano intestinal” abarca tanto las secuencias codificantes como no codificantes; no se limita en particular a genes completos, sino que también comprende fragmentos de secuencias codificantes. El análisis fecal es de este modo un procedimiento no invasivo, que produce resultados consistentes y directamente comparables de paciente a paciente.
Como se explicó anteriormente, el “microbioma intestinal”, como se usa aquí, se refiere al conjunto de genes bacterianos de las especies que constituyen la microbiota presente en el intestino de dicho sujeto. Las secuencias del microbioma de la descripción comprenden por lo menos las secuencias de genes del catálogo de genes bacterianos publicado por Qin et al. (Nature, 464: 59-65, 2010). Las secuencias de genes a partir del catálogo están disponibles en los sitios web de EMBL (
http://www.bork.embl.de/~arumugam/Qin_et_al_2010/) y de BGI (
http://gutmeta.genomics.org.cn).
Estas especies no se limitan a las que ya se conocen de la técnica anterior. De forma importante, estas especies bacterianas específicas muestran un alto coeficiente de correlación con la diversidad bacteriana intestinal reducida. De este modo, es posible determinar si un sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con una alta sensibilidad. La sensibilidad de un método es la proporción de positivos reales que se identifican correctamente como tales, y se puede estimar por el área bajo la curva ROC (Característica Operativa del Receptor), también llamada AUC. Una curva Característica Operativa del Receptor (ROC), o simplemente ROC, es una representación gráfica que ilustra el comportamiento de un sistema clasificador binario conforme varía su umbral de discriminación. Se crea al representar gráficamente la fracción de positivos reales de los positivos (TPR = tasa de positivos reales) frente a la fracción de falsos positivos de los negativos (FPR = tasa de falsos positivos), a diversos ajustes del umbral. La TPR también se conoce como sensibilidad, y la FPR es uno menos la especificidad o la tasa negativa real. El Área Bajo la Curva (AUC) es una medida de un comportamiento clasificador/de ensayo a través de todos los posibles valores de los umbrales. Cuanto mayor es el AUC, mejor será el comportamiento del ensayo.
Los inventores han encontrado que no es necesario determinar la presencia o ausencia de cada una de dichas especies bacterianas a fin de evaluar la diversidad de la población bacteriana intestinal. Más bien, dicha diversidad se puede evaluar con un alto grado de confianza y precisión examinando un pequeño subconjunto de especies bacterianas. Como se muestra en la parte experimental, un número muy pequeño de especies es un buen marcador de dicha diversidad. De hecho, incluso cuando se evalúa la presencia o ausencia de una sola especie bacteriana, el método de la invención permite la detección de la diversidad bacteriana reducida en un sujeto con un AUC de por lo menos 0,74, y puede ser de hasta 0,89, dependiendo de las especies bacterianas elegidas.
En comparación, un método aleatorio por lo general tiene un AUC de 0,5. Además, cuando la enfermedad inflamatoria intestinal, una de las patologías asociadas con la diversidad bacteriana reducida, se evalúa mediante secuenciación del ARNr 16S de muestras fecales, el AUC es de sólo 0,83 (Papa et al; PLoS One 2012; 7(6):e39242. 2012).
De acuerdo con una primera realización de la invención, el método para determinar si un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida comprende una etapa de detección de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, en la que por lo menos un gen de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
Las especies bacterianas de la descripción se seleccionan de entre la lista que consiste en las especies bacterianas de la Tabla 1. Más precisamente, las especies bacterianas de la descripción se seleccionan de entre la lista que consiste en MOHL-1, MOHL-2, MOHL-3, MOHL-4, MOHL-5, MOHL-6, MOHL-7, MOHL-8, MOHL-9, MOHL-10, MOHL-11, MOHL-12, MOHL-13, MOHL-14, MOHL-15, MOHL-16, MOHL-17, MOHL-1.
Por “por lo menos una especie bacteriana”, se entiende aquí que se evalúa la ausencia de una especie única o de más de una especie. En una realización preferida, el método de la invención incluye la detección de la ausencia de 1,2, 3, 4, o 5 especies bacterianas. Incluso más preferentemente, dicho método incluye la detección de la ausencia de más de 5 especies bacterianas. Lo más preferible, dicho método incluye la detección de la ausencia de 18 especies bacterianas.
La mayoría de los comensales intestinales no pueden ser cultivados. Se han desarrollado estrategias genómicas para superar esta limitación (Hamady y Knight, Genome Res, 19: 1141-1152, 2009). Estas estrategias han permitido la definición del microbioma como el conjunto de los genes comprendidos en los genomas de la microbiota (Turnbaugh et al., Nature, 449: 804-8010, 2007; Hamady y Knight, Genome Res, 19: 1141-1152, 2009). Se ha demostrado la existencia de un pequeño número de especies compartidas por todos los individuos que constituyen el núcleo filogenético de la microbiota intestinal humana (Tap et al, Environ Microbiol., 11(10): 2574-2584, 2009). Recientemente, un análisis de metagenómica ha conducido a la identificación de un amplio catálogo de 3,3 millones de genes microbianos no redundantes del intestino humano, que corresponden a 576,7 gigabases de secuencia (Qin et al., Nature, 464(7285): 59-65, 2010).
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Será evidente inmediatamente para la persona experta en la técnica que la presencia de una especie bacteriana se puede determinar fácilmente detectando una secuencia de ácido nucleico específica de dicha especie. La presencia de especies bacterianas intestinales generalmente se determina mediante la detección de las secuencias del gene de ARNm 16S. Sin embargo, este método se limita a las especies bacterianas conocidas.
Por el contrario, en el método de la invención, no se requiere la identificación previa de las especies bacterianas a las que pertenece dicho gen. Los inventores han determinado un conjunto mínimo de 25 secuencias de genes bacterianos que son secuencias no redundantes para cada especie bacteriana de la Tabla 1, y que pueden ser usadas como genes trazadores.
Tabla 1: especies bacterianas ausentes en sujetos con sobrepeso con diversidad bacteriana reducida, y secuencias comprendidas en ellas.
Especies bacterianas
Secuencias
MOHL-1
SEC ID NO. 1 a 25
MOHL-2
SEC ID NO. 26 a 50
MOHL-3
SEC ID NO. 51 a 75
MOHL-4
SEC ID NO. 76 a 100
MOHL-5
SEC ID NO. 101 a 125
MOHL-6
SEC ID NO. 126 a 150
MOHL-7
SEC ID NO. 151 a 175
MOHL-8
SEC ID NO. 176 a 200
MOHL-9
SEC ID NO. 201 a 225
MOHL-10
SEC ID NO. 226 a 250
MOHL-11
SEC ID NO. 251 a 275
MOHL-12
SEC ID NO. 276 a 300
MOHL-13
SEC ID NO. 301 a 325
MOHL-14
SEC ID NO. 326 a 350
MOHL-15
SEC ID NO. 351 a 375
MOHL-16
SEC ID NO. 376 a 400
MOHL-17
SEC ID NO. 401 a 425
MOHL-18
SEC ID NO. 426 a 450
Será obvio para el experto en la técnica que el número de bacterias a partir de una especie bacteriana dada en una muestra se correlaciona directamente con el número de copias de por lo menos una secuencia del gen detectada en dicha muestra. De ese modo, es posible determinar la ausencia de por lo menos una de las especies bacterianas de la Tabla 1, simplemente detectando la ausencia de por lo menos un gen bacteriano de dichas especies.
Por lo tanto, la invención permite evaluar la diversidad bacteriana intestinal reducida en un sujeto con sobrepeso, y de ese modo el riesgo de dicho sujeto para desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad, sin la necesidad de un análisis estadístico complejo y tedioso. Además, debido a que el método de la invención puede depender de tan poco como un gen bacteriano como un marcador, se puede implementar por cualquier técnica conocida de amplificación o secuenciación de ADN, y no se limita a un método o aparato específico.
Otra realización de la invención es un método para determinar si un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, comprendiendo dicho método:
a) detectar a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, y
b) determinar que el sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
En una realización preferida, las secuencias de los genes bacterianos de las especies bacterianas de acuerdo con la invención se seleccionan de entre la lista que consiste en la secuencia SEC iD NO. 1 a la secuencia SEC ID NO. 450.
Dependiendo del tamaño de la muestra y de la existencia de los genes bacterianos de interés, ciertos genes bacterianos pueden ser difíciles de detectar en una muestra. De este modo, el persona experta podría concebir fácilmente que, para aumentar la confianza de los resultados, es ventajoso determinar la ausencia de una especie bacteriana mediante la detección de la abundancia promedio de varios genes bacterianos procedentes de una especie bacteriana.
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En una realización, detectar si por lo menos un gen bacteriano de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra comprende determinar el número de copias de por lo menos 1,2, 3, 4 o 5 genes bacterianos de dichas especies bacterianas en la muestra. En una realización preferida, detectar si por lo menos un gen bacteriano de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra comprende determinar el número de copias de por lo menos 10, 15, 20 o por lo menos 25 genes bacterianos de dichas especies bacterianas en la muestra.
Además, entre todos los genes bacterianos, algunas especies bacterianas se correlacionan más significativamente con la diversidad bacteriana intestinal reducida. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 3 de la parte experimental, la detección de la presencia o ausencia de una de las especies bacterianas entre MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_14, MO_HL_9, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_16, MO_HL_4, MO_HL_17, MO_HL_1, o MO_HL_7 permite la detección de la diversidad bacteriana reducida en un sujeto con un AUC superior a 0,83.
De ese modo, es posible aumentar la sensibilidad del método de la invención, simplemente evaluando la presencia o ausencia de esas especies bacterianas específicas, o de por lo menos un gen de las especies bacterianas específicas a las que pertenece.
En una realización ventajosa, el método de la invención comprende una etapa de detección, a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, de si por lo menos un gen de una especie bacteriana seleccionada de entre la lista que consiste en MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_14, MO_Hl_9, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_16, MO_HL_4, MO_HL_17, MO_HL_1, or MO_HL_7 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
En una realización particularmente ventajosa, el método de la invención comprende una etapa de detección, a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, de si por lo menos un gen a partir de la especie bacteriana MOHL-5 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra. La persona experta en la técnica sabe que cuantas más especies bacterianas distintas de la Tabla 1 estén presentes en el ADN bacteriano de las heces del sujeto, mayor será la probabilidad de que los sujetos tengan una diversidad bacteriana intestinal reducida. Por lo tanto, seria evidente para la persona experta que la sensibilidad del método de la invención se puede aumentar evaluando la ausencia de genes bacterianos de varias especies bacterianas diferentes de la Tabla 1. Entonces, es posible aumentar la sensibilidad del método mediante el uso de genes bacterianos procedentes de una combinación lineal de 2, 3, 4, 5 o más especies bacterianas diferentes. Por ejemplo, las combinaciones de 2 especies bacterianas de la Tabla 1 permiten un AUC entre alrededor de 0,775 y 0,948, las combinaciones de 3 especies bacterianas de la Tabla 1 permiten un AUC entre alrededor de 0,813 y 0,993, y las combinaciones de 4 especies bacterianas de la Tabla 1 permiten un AUC entre alrededor de 0,827 y 0,987. Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que la detección de combinaciones específicas de 2, 3 o 4 especies bacterianas permite un AUC muy alto. Las combinaciones más ventajosas de 2, 3 y 4 especies bacterianas se indican en las Tablas 3, 4 y 5 respectivamente.
En una realización preferida, el método de la invención comprende una etapa de detección, a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, de si por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas de cualquiera de las combinaciones de especies bacterianas indicadas en las Tablas 3, 4 y/o 5 está ausente en dicha muestra.
Los inventores han seleccionado adicionalmente combinaciones de especies bacterianas de 2 a 18 especies bacterianas que permiten obtener AUC particularmente importantes, como se indica en la Tabla 6, que oscilan desde alrededor de 0,89 a 0,99.
En una realización ventajosa, el método de la invención comprende una etapa de detección, a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, de si:
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12 y MO_HL_11 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_7 y mO_HL_12 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_5, MO_HL_7 y MO_HL_12 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_2 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_17, MO_HL_5, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_11 y MO_HL_8 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
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- por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL12, MO_HL_11, MO_HL_2, MO_HL_5, MO_HL_8, MO_HL_13 y MO_HL_7 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_2, MO_HL_17, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_8 y MO_HL_7 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_4, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_17 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO HL_8,
MO HL_11, MO_HL_6, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_17 y
MO_HL_12 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_4, MO_HL_12, MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_6, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_7 y MO_HL_11 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas
MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_3, MO_HL_12, MO_HL_5, MO_HL_10,
MO_HL_8, MO_HL_7, MO_HL_2 y MO_HL_13 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO HL_18, MO_HL_15, MO_HL_11, MO_HL_10, MO_HL_5, MO_HL_4, MO_HL_6, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_2, MO_HL_13 y MO_HL_3 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_6,
MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_2, MO_HL_4, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_10,
MO_HL_15, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_8 y MO_HL_12 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO HL_10, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_13, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_11, MO_HL_3, MO_HL_4, MO_HL_15, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_12 y MO_HL_8 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_7, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_1, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_12, MO_HL_8, MO_HL_3, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_10, MO_HL_17, MO_HL_15 y MO_HL_9 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_16, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_15, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_11, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_14, MO_HL_4 y MO_HL_12 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
- por lo menos uno del conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL15, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_14, MO_HL_16, MO_HL_10, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_9, MO_HL_5, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_12, MO_HL_18, MO_HL_13 y MO_HL_2 de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
Un gen bacteriano está ausente de la muestra cuando su número de copias en la muestra es inferior a un cierto valor umbral. Por consiguiente, un gen bacteriano está presente en la muestra cuando su número de copias en la muestra es superior a un cierto valor umbral.
De acuerdo con la presente invención, un “valor umbral” pretende significar un valor que permite discriminar muestras en las que el número de copias del gen bacteriano de interés es bajo o alto.
En particular, si un número de copias de un gen bacteriano de interés es inferior o igual al valor umbral, entonces el número de copias de este gen bacteriano en la muestra se considera bajo, mientras que si el número de copias es superior al valor umbral, entonces el número de copias de este gen bacteriano en la muestra se considera alto. Un bajo número de copias significa que el gen bacteriano está ausente de la muestra, mientras que un alto número de copias significa que el gen bacteriano está presente en la muestra.
Para cada gen, y dependiendo del método usado para medir el número de copias del gen bacteriano, el valor
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umbral óptimo puede variar. Sin embargo, se puede determinar fácilmente por una persona experta en base al análisis del microbioma de varios individuos en los que se conoce el número de copias (alto o bajo) para este gen bacteriano particular, y a la comparación del mismo con el número de copias de un gen de control. Dicha comparación se puede facilitar mediante el uso de la misma cantidad de ADN bacteriano para cada una de las muestras analizadas, o dividiendo el número de copias obtenidas del gen bacteriano entre la cantidad inicial de ADN bacteriano usado en el ensayo. De hecho, es bien conocido por la persona experta que la cantidad total de bacterias en el intestino de un sujeto, y por consiguiente en sus heces, sigue siendo la misma incluso en el caso de diversidad bacteriana reducida. También es posible usar una referencia, tal como una especie bacteriana intestinal, cuya abundancia se sabe que no varía entre los individuos con diversidad bacteriana reducida y con diversidad bacteriana normal.
De acuerdo con la invención, la determinación del número de copias de por lo menos un conjunto de 25 genes bacterianos de la menos una especie bacteriana tal como se describe en la Tab. 1 en una muestra obtenida del sujeto se puede lograr mediante cualquier técnica capaz de detectar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos, e incluye entre otras hibridación con una sonda marcada, amplificación mediante PCR, secuenciación, y todos los otros métodos conocidos por la persona experta en la técnica.
En una primera realización, la determinación del número de copias de por lo menos un gen bacteriano en una muestra obtenida del sujeto se realiza usando secuenciación. Opcionalmente, el ADN se puede fragmentar, por ejemplo mediante una nucleasa de restricción, antes de la secuenciación. La secuenciación se realiza usando cualquier técnica conocida en el estado de la técnica, incluyendo la secuenciación por ligación, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, o secuenciación de una sola molécula. La secuenciación también incluye técnicas basadas en PCR, tales como, por ejemplo, PCR cuantitativa o PCR por emulsión.
La secuenciación se realiza en todo el ADN contenido en la muestra biológica, o en porciones del ADN contenido en la muestra biológica. Será inmediatamente evidente para la persona experta que dicha muestra contiene por lo menos una mezcla de ADN bacteriano y de ADN humano del sujeto hospedante. Sin embargo, aunque el ADN bacteriano global probablemente represente la fracción principal del aDn total presente en la muestra, cada especie bacteriana puede representar solamente una pequeña fracción del ADN total presente en la muestra.
Para superar esta dificultad, la persona experta puede usar un método que permite el genotipado cuantitativo con alta precisión de las secuencias obtenidas de la muestra biológica. En una realización de este enfoque, la precisión se consigue mediante el análisis de un gran número (por ejemplo, millones o miles de millones) de polinucleótidos. Además, la precisión se puede mejorar mediante el uso de secuenciación de ADN masivamente en paralelo, tal como, pero sin limitarse a, la realizada por la plataforma Illumina Genome Analyzer (Bentley et al. Nature; 456: 53-59, 2008), la plataforma Roche 454 (Margulies et al. Nature; 437: 376-380, 2005), la plataforma ABI SOLiD (McKernan et al., Genome Res; 19: 1527-1541, 2009), la plataforma de secuenciación de una sola molécula Helicos (Harris et al. Science; 320: 106-109, 2008), la secuenciación en tiempo real usando moléculas de polimerasa individuales (Science; 323: 133-138, 2009), la secuenciación por Ion Torrent (documento WO 2010/008480; Rothberg et al., Nature, 475: 348-352, 2011), y la secuenciación por nanoporo (Clarke J et al.; Nat Nanotechnol.; 4: 265-270, 2009).
Cuando la persona experta se basa en métodos de secuenciación para detectar la presencia o ausencia de ciertos genes bacterianos, la información obtenida de la secuenciación se usa para determinar el número de copias de secuencias de ácido nucleico de interés a través de procedimientos de bioinformática. Por ejemplo, en una realización, las secuencias de ácido nucleico de dicha especie bacteriana en la muestra de ADN bacteriano intestinal se identifican en los datos globales de secuenciación mediante la comparación con las secuencias de ácidos nucleicos SEC ID NO. 1 a SEC ID NO. 450. Esta comparación se basa ventajosamente en el nivel de identidad de secuencia con las secuencias SEC ID NO.1 a SEC ID NO. 450.
De este modo, una secuencia de ácido nucleico que presenta por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100% de identidad con por lo menos una de las secuencias de ácidos nucleicos SEC ID NO. 1 a SEC ID NO. 450 se identifica como una secuencia comprendida en una de las especies bacterianas de la descripción. De este modo, en una realización preferida, detectar si por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra comprende determinar el número de secuencias de ácido nucleico en la muestra de ADN bacteriano intestinal que tiene por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96 %, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100% de identidad con por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico SEC ID NO. 1 a SEC ID NO. 450.
La expresión “identidad de secuencia” se refiere aquí a la identidad entre dos secuencias de ácido nucleico. La identidad entre secuencias se puede determinar comparando una posición en cada una de las secuencias que se puede alinearse con fines comparativos. Cuando una posición en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base, entonces las secuencias son idénticas en esa posición. Un grado de identidad de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico es una función del número de nucleótidos idénticos en las posiciones compartidas por estas secuencias.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para la
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comparación óptima. Por ejemplo, pueden introducirse espacios en la secuencia de una primera secuencia de ácido nucleico para alineación óptima con la segunda secuencia de ácido nucleico. Entonces se comparan los nucleótidos en las posiciones nucleotídicas correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Por lo tanto, el % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones que se solapan X 100.
En esta comparación, las secuencias pueden tener la misma longitud o pueden ser diferentes en longitud. El alineamiento óptimo de secuencias para determinar una ventana de comparación se puede realizar por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (J. Theor. Biol., 91(2): 370-380, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol, 48(3): 443-453, 1972), mediante la búsqueda de similitud por el método de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(5): 2444-2448, 1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package versión 7,0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin), o mediante inspección. Se selecciona la mejor alineación (es decir, aquella que da como resultado el mayor porcentaje de identidad a lo largo de la ventana de comparación) generada por los diversos métodos.
La expresión “identidad de secuencia” significa de este modo que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en una base de nucleótido a nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece la base idéntica del ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El mismo proceso se puede aplicar a las secuencias polipeptídicas. El porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos también se puede calcular usando el software BLAST (Versión 2,06 de septiembre de 1998), con el parámetro por defecto o definido por el usuario.
En otra realización preferida, las técnicas basadas en PCR se usan para determinar el número de copias de por lo menos un gen bacteriano. Preferentemente, la técnica de PCR usada cuantitativamente mide cantidades iniciales de ADN, ADNc, o ARN. Los ejemplos de técnicas basadas en PCR de acuerdo con la invención incluyen técnicas tales como, pero no limitadas a, PCR cuantitativa (Q-PCR), reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (QRT-PCR), amplificación por circulo rodante (RCA), o PCR digital. Estas técnicas son tecnologías bien conocidas y fácilmente disponibles para los expertos en la técnica y no necesitan una descripción precisa. En una realización preferida, la determinación del número de copias de los genes bacterianos usados en la invención se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa.
De este modo, los cebadores de amplificación específicos para los genes a ensayar también son muy útiles para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención. La presente descripción también abarca así cebadores para la amplificación de por lo menos un gen seleccionado de los genes de secuencia SEC ID NO. 1-450.
En otra realización preferida, la presencia o ausencia de los genes bacterianos de acuerdo con la descripción se detecta mediante el uso de una micromatriz nucleica. Una “micromatriz nucleica” consiste en diferentes sondas de ácido nucleico que se unen a un sustrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Un microchip puede estar constituido por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos, o nitrocelulosa. Las sondas pueden ser ácidos nucleicos tales como ADNc (“micromatriz de ADNc”) u oligonucleótidos (“micromatriz oligonucleótida”), y los oligonucleótidos pueden ser de alrededor de 25 a alrededor de 60 pares de bases o menos de longitud.
Para determinar el número de copias de una muestra nucleica diana, dicha muestra se marca, en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, conduciendo a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias sonda unidas a la superficie de la micromatriz. Después se detecta la presencia de complejos hibridados marcados. Están disponibles para el experto en la técnica muchas variantes de la tecnología de hibridación por micromatriz.
En una realización específica, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de sEc ID NOs 1-450. Preferentemente, dicha micromatriz comprende por lo menos 18 oligonucleótidos, siendo cada oligonucleótido específico para un gen de un grupo distinto de la invención. Más preferentemente, la micromatriz de la invención consiste en 450 oligonucleótidos específicos para cada uno de los genes de secuencias SEC ID NOs. 1-450.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12 y MO_HL_11. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que
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consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12 y MO_HL_11.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_7 y MO_HL_12. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_7 y MO_Hl_12.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_5, MO_HL_7 y MO_HL_12. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, mO_HL_5, Mo_Hl_7 y MO_HL_12.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_8, MO_HL_12, mO_HL_7 y MO_HL_2. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_Hl_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_2.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_17, MO_HL_5, MO_HL_12, mO_HL_7, MO_HL_11 y MO_HL_8. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_17, MO_HL_5, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_11 y MO_HL_8.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_11, MO_HL_2, MO_HL_5, MO_HL_8, MO_HL_13 y MO_HL_7. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, mO_HL_11, MO_HL_2, MO_HL_5, MO_HL_8, MO_HL_13 y MO_HL_7.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_2, MO_HL_17, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_8 y MO_HL_7. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_2, MO_HL_17, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_8 y MO_HL_7.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_4, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_17. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_4, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_17.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_8, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_17 y MO_HL_12. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_8, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_17 y MO_HL_12.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_4, MO_HL_12, MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_6, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_7 y MO_HL_11. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_4, MO_HL_12, MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_6, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_7 y MO_HL_11.
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En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_3, MO_HL_12, MO_HL_5, MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_7, MO_HL_2 y MO_HL_13. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_3, MO_HL_12, MO_HL_5, MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_7, MO_HL_2 y MO_HL_13.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_18, MO_HL_15, MO_HL_11, MO_HL_10, MO_HL_5, MO_HL_4, MO_HL_6, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_2, MO_HL_13 y MO_HL_3. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_18, MO_HL_15, MO_HL_11, MO_HL_10, MO_HL_5, MO_HL_4, MO_HL_6, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_2, MO_HL_13 y MO_HL_3.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_2, MO_HL_4, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_10, MO_HL_15, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_8 y MO_HL_12. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_2, MO_HL_4, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_10, MO_HL_15, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_8 y MO_HL_12.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_13, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_11, MO_HL_3, MO_HL_4, MO_HL_15, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_12 y MO_HL_8. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_13, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_11, MO_HL_3, MO_HL_4, MO_HL_15, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_12 y MO_HL_8.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_7, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_1, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_12, MO_HL_8, MO_HL_3, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_10, MO_HL_17, MO_HL_15 y MO_HL_9. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_7, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_1, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_12, MO_HL_8, MO_HL_3, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_10, MO_HL_17, MO_HL_15 y MO_HL_9.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_16, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_15, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_11, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_14, MO_HL_4 y MO_HL_12. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_16, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_15, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_11, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_14, MO_HL_4 y MO_HL_12.
En otra realización, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos un gen de cada una de las especies bacterianas MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_14, MO_HL_16, MO_HL_10, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_9, MO_HL_5, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_12, MO_HL_18, MO_HL_13 y MO_HL_2. Preferentemente, la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende o que consiste en oligonucleótidos específicos para por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o 25 genes de cada una de las especies bacterianas MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_14, MO_HL_16, MO_HL_10, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_9, MO_HL_5, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_12, MO_HL_18, MO_HL_13 y MO_HL_2.
Dicha micromatriz puede comprender además por lo menos un oligonucleótido para detectar por lo menos un gen de por lo menos una especie bacteriana de control. Una especie bacteriana conveniente puede ser, por ejemplo, una especie bacteriana cuya abundancia no varía entre individuos con una diversidad bacteriana reducida e individuos con diversidad bacteriana normal. Preferentemente, los oligonucleótidos son de alrededor de 50 bases de longitud.
Los oligonucleótidos adecuados de la micromatriz, específicos para cualquier gen de SEC ID NOs. 1-450, se
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pueden diseñar, basándose en la secuencia genómica de cada gen, usando cualquier método de diseño de oligonucleótidos de la micromatriz conocido en la técnica. En particular, se puede usar cualquier software disponible desarrollado para el diseño de oligonucleótidos de micromatrices, tal como, por ejemplo, el software OligoArray (disponible en
http://berry.engin.umich.edu/oligoarray/), el software GoArrays (disponible en
http://www.isima.fr/bioinfo/goarrays/), el software Array Designer (disponible en
http://www.premierbiosoft.com/dnamicroarray/index.html), el software Primer3 (disponible en
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3_code.html), o el software Promide (disponible
http://oligos.molgen.mpg.de/).
La descripción se refiere además a un kit para la determinación in vitro del fenotipo de diversidad bacteriana intestinal reducida, que comprende por lo menos un reactivo para la determinación del número de copias de por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de SEC ID NOs. 1-450. Por “un reactivo para la determinación del número de copias de por lo menos un gen”, se entiende un reactivo que permite específicamente la determinación del número de copias de dicho gen, es decir, un reactivo destinado específicamente para la determinación específica del número de copias de por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de SEC ID NOs. 1-450. Esta definición excluye los reactivos genéricos útiles para la determinación del nivel de expresión de cualquier gen, tales como Taq polimerasa o un amortiguador de la amplificación, aunque dichos reactivos también pueden incluirse en un kit de acuerdo con la descripción. Dicho reactivo para la determinación del número de copias de por lo menos un gen puede ser, por ejemplo, una micromatriz dedicada, como se describió anteriormente, o cebadores de la amplificación específicos para por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de SEC ID NOs. 1-450. De este modo, la presente descripción también se refiere a un kit para la determinación in vitro del fenotipo de diversidad bacteriana intestinal reducida, comprendiendo dicho kit una micromatriz dedicada, como se describió anteriormente, o cebadores de la amplificación específicos para por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de SEC ID NOs. 1-450. Aquí también, cuando el kit comprende cebadores de la amplificación, aunque dicho kit pueda comprender cebadores de la amplificación específicos para otros genes, dicho kit comprende preferentemente como máximo 100, como máximo 75, como máximo 50, como máximo 40, como máximo 30, preferentemente como máximo 25, como máximo 20, como máximo 15, más preferentemente como máximo 10, como máximo 8, como máximo 6, incluso más preferentemente como máximo 5, como máximo 4, como máximo 3 o incluso 2 o uno o incluso cero parejas de cebadores de la amplificación específicos para genes distintos de los genes de secuencias SEC ID NOs 1-450. Por ejemplo, dicho kit puede comprender por lo menos un par de cebadores de la amplificación para por lo menos un gen, además de los cebadores para por lo menos un gen que tiene una secuencia seleccionada de SEC ID NOs. 1-450.
Dicho kit para la determinación in vitro del fenotipo de diversidad bacteriana intestinal reducida puede comprender además instrucciones para la detección de la presencia o ausencia de un fenotipo sensible.
Como han mostrado los inventores, el sujeto con sobrepeso con una diversidad bacteriana intestinal reducida presenta un mayor riesgo de comorbilidades asociadas con la obesidad. La determinación de que un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida es por lo tanto extremadamente útil en la determinación de dicho riesgo, de manera particular puesto que se realiza totalmente in vitro.
Por lo tanto, otro objeto de la invención es un método para determinar si un sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9;
b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar si dicho sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad.
Las comorbilidades relacionadas con la obesidad son bien conocidas por la persona experta. Se han estudiado a fondo en la bibliografía científica, y en Guh D. et al, BMC Public Health., 9:88, 2009, se puede encontrar una lista amplia de ellas. Las más significativa de ellas son diabetes tipo II, todos los cánceres, excepto cáncer de esófago, de páncreas y de próstata, todas las enfermedades cardiovasculares (excepto la insuficiencia cardiaca congestiva), asma, enfermedad de la vesícula biliar, osteoartritis y dolor de espalda crónico.
De este modo, en una realización, el método de la invención es para determinar si un sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar diabetes tipo II, todos los cánceres excepto el cáncer esofágico, de páncreas y de próstata, todas las enfermedades cardiovasculares (excepto la insuficiencia cardiaca congestiva), el asma, la enfermedad de la vesícula biliar, la osteoartritis y el dolor de espalda crónico.
Además, los inventores han encontrado que el microbioma bacteriano intestinal de los sujetos con sobrepeso con una diversidad bacteriana intestinal reducida se puede enriquecer por modificaciones de su dieta, es decir, mediante la implementación de una dieta específica. De hecho, descubrieron que la diversidad bacteriana intestinal se puede aumentar con una dieta baja en calorías, rica en proteínas. Los inventores mostraron que el incremento en la diversidad bacteriana intestinal debido a la implementación de dicha dieta es más significativo en los sujetos
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con sobrepeso con una diversidad bacteriana reducida. Por lo tanto, esos sujetos son particularmente propensos a beneficiarse de la intervención dietética.
Por tanto, otro objeto de la invención es un método para determinar si un sujeto con sobrepeso necesita una dieta, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de las reivindicaciones 1 a 9,
b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar si dicho sujeto necesita una dieta.
En una realización preferida, la dieta de la invención es una dieta rica en proteína, baja en calorías. En una realización más preferida, la dieta de la invención comprende las dietas de entre 1.200 y 1.500 kcal por día, en la que las proteínas representan 35% de la cantidad total de calorías, los lípidos representan 25% de la cantidad total de calorías, los hidratos de carbono representan 44% de la cantidad total de calorías. Ventajosamente, si el sujeto con sobrepeso es una mujer, la dieta comprende 1.200 Kcal por día, y si el sujeto con sobrepeso es un hombre, la dieta comprende 1.500 Kcal por día.
De forma importante, este enriquecimiento en especies bacterianas intestinales se correlaciona con un alivio de los rasgos clínicos asociados con las comorbilidades relacionadas con la obesidad, y de este modo, con el riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad, a excepción de la inflamación de bajo grado.
Otro objeto de la invención es un método para aliviar los riesgos de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de las reivindicaciones 1 a 9;
b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar si dicho sujeto necesita una dieta.
Será inmediatamente evidente para la persona experta en la técnica que los sujetos con sobrepeso con una diversidad bacteriana intestinal reducida, que también presentan una inflamación de bajo grado, pueden beneficiarse sólo parcialmente de la implementación de una dieta. Sin embargo, es particularmente importante tratar la inflamación de bajo grado tan pronto como sea posible, y por lo tanto ser capaz de distinguir entre los sujetos con sobrepeso para los que la inflamación de bajo grado se pueda aliviar de manera eficiente por la intervención dietética solamente, y aquellos cuya inflamación de bajo grado requiera tratamientos adicionales. El método de la invención permite una detección temprana de aquellos sujetos que requerirán tratamientos para la inflamación de bajo grado, además de la implementación de la dieta.
Por lo tanto, otro objeto de la invención es un método para determinar si un sujeto con sobrepeso necesita un tratamiento para la inflamación de bajo grado, preferentemente además de la implementación de una dieta, que comprende las etapas siguientes:
a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de las reivindicaciones 1 a 9;
b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar si dicho sujeto necesita un tratamiento para la inflamación de bajo grado, preferentemente además de la implementación de una dieta.
Los tratamientos adicionales para la inflamación de bajo grado pueden ser cualquier tratamiento antiinflamatorio convencional, tal como los inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-Co A) reductasa que disminuyen los lipidos (estatinas) y también los activadores del receptor y activado por el proliferador de peroxisoma sensibilizado por insulina (tiazolidindionas).
La evolución de la diversidad bacteriana con la implementación de aquellas modificaciones de la dieta se puede monitorizar fácilmente con el método de la invención.
Por lo tanto, otro objeto de la invención es un método para monitorizar la eficacia de una dieta en el aumento de la riqueza del microbioma bacteriano intestinal en un sujeto con sobrepeso que necesita la misma, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de las reivindicaciones 1 a 9;
b) implementar dicha dieta;
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c) determinar a partir de una segunda muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto, si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método de la invención;
d) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que la dieta es eficaz para aumentar la riqueza del microbioma bacteriano intestinal en dicho sujeto.
La práctica de la invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales o de química de proteínas, virología molecular, microbiología, tecnología del ADN recombinante, y farmacología, que están dentro de la capacidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. (Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, 1995; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; y Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989). Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de, biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología y química medicinal y farmacéutica, descritos aquí, son aquellos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica.
Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener una mayor comprensión de las características y ventajas de la invención mediante la referencia a ciertos ejemplos específicos y figuras que se proporcionan aquí con fines de ilustración solamente y no están destinados a ser limitantes a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplos
Investigación clínica
Sujetos obesos (n=38) y con sobrepeso (n=11), 8 hombres y 41 mujeres, fueron reclutados para una intervención dietética controlada de 12 semanas en el Centro de Investigación en Nutrición Humana, del Hospital Pitié-Salpétriére, París, Francia. Los sujetos incluidos en el estudio no tenían ninguna patología crónica, excepto exceso de peso corporal. Su peso corporal se mantuvo estable en los 3 meses previos al estudio. No tomaron antibióticos ni fármacos dentro de los 2 meses antes de o durante el transcurso del estudio. El Comité Ético del Hospital de Pitié-Salpétriére aprobó el estudio clínico, y los sujetos dieron su autorización firmada. En la primera fase de 6 semanas, los sujetos consumieron una dieta alta en proteínas de energía restringida (1.200 Kcal/día para las mujeres y 1.500 para los hombres: 35% de proteínas, 25% de lipidos, 44% de hidratos de carbono) con hidratos de carbono de bajo índice glucémico y enriquecimiento con fibra soluble. A esta fase le siguió un segundo periodo de estabilización del peso corporal de 6 semanas, con 20% de aumento en el consumo total de energía, por encima de su tasa metabólica de energía en reposo (calorimetría indirecta, Deltatrac, Datex, Francia). A las 0, 6 y 12 semanas, se recogieron muestras de sangre y de heces, y se realizaron mediciones antropométricas. Los sujetos llenaron un registro dietético de 7 días, y fueron entrevistados por un dietista autorizado. En el día de la visita, el dietista revisó la información y aclaró cualquier ambigüedad con respecto a los detalles de los alimentos consumidos. Todos los registros fueron analizados por el dietista autorizado usando el programa informático PROFILE DOSSIER V3 (Audit Conseil en Informatique Médicale, Bourges, Francia), que tiene una base de datos dietética compuesta inicialmente por 400 artículos alimenticios representativa de la dieta francesa como se describió previamente2. Se generó un análisis de los nutrientes para cada sujeto. La composición corporal se determinó mediante absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA). Se obtuvieron muestras de sangre después de 12 horas de ayuno, para medir el colesterol total, lipoproteínas de alta densidad (HDL), colesterol, triglicéridos, insulina, glucosa, y marcadores inflamatorios (proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CRP) e interleucina 6 (IL-6)) como se describió previamente3. Se calculó la resistencia a la insulina mediante la evaluación del modelo homeostático de resistencia a la insulina (HOMA-IR) y el índice “Disse”4,5. Se obtuvieron muestras de tejido adiposo abdominal subcutáneo en todos los puntos de tiempo mediante biopsia con aguja a partir de la zona periumbilical bajo anestesia local (xilocaína al 1%), para medir el diámetro de los adipocitos6 y para estudios inmunohistoquímicos (macrófagos teñidos con HAM56+ en el tejido adiposo). Se realizaron pruebas de Wilcoxon pareadas, para analizar los cambios en estas variables entre los distintos puntos de tiempo (valor de p <0,05). Los valores de p se ajustaron para múltiples ensayos usando el procedimiento de Benjamini-Hochberg7.
Secuenciación por metagenómica
Se determinó el contenido de genes bacterianos intestinales de 49 individuos obesos y con sobrepeso en 3 puntos de tiempo (valor inicial, semana 6 y semana 12) mediante una tecnología de secuenciación ABI SOLiD de alto rendimiento de ADN fecal total. Para cada muestra, se determinó un promedio de 76,5 + 36,5 (media + sd) millones de lecturas individuales de 35 base de longitud (un total de 393 Gb de secuencia). Mediante el uso de corona_lite (v4.0r2.0), se cartografió un promedio de 24,8 + 14,3 millones de lecturas por individuos en el catálogo de referencia de 3,3 millones de genes8 con un máximo de 3 apareamientos incorrectos. Se descartó el cartografiado de las lecturas en múltiples posiciones, y se retuvo un promedio de 14,2 + 8,1 millones de lecturas cartografiadas de forma única por individuos, para estimar la abundancia de cada gen de referencia mediante el uso de METEOR9. La abundancia de cada gen en un individuo se normalizó con METEOR al dividir el número de lecturas que se cartografiaron de forma única con respecto al gen de interés entre la longitud del gen. Después de eso, las abundancias del gen normalizadas se transformaron en frecuencias al dividirlas entre el número total de lecturas
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cartografiadas de forma única para una muestra dada. El conjunto resultante de las frecuencias génicas, denominado perfil génico microbiano de un individuo, se usó para análisis posteriores.
Especies diferencialmente abundantes entre LGC y HGC
Se definieron dos grupos de pacientes con bajo conteo de genes (LGC) y alto conteo de genes (HGC) usando la distribución de riqueza génica (Figura 1a). Los genes significativamente diferentes en grupos de individuos se identificaron mediante pruebas de Mann-Whitney, a un umbral de valor de p de 0,0001. Se agruparon mediante una estrategia de reagrupamiento basado en la abundancia, usando la covarianza de sus perfiles de frecuencia genética entre los individuos de la cohorte. Se determinaron por parejas los coeficientes de correlación de Spearman, y todos los genes que se correlacionaron por encima de un coeficiente rho de 0,85 se asignaron al mismo grupo. La abundancia de una especie dada en cada individuo se calculó como una abundancia media de 25 genes “trazadores” seleccionados arbitrariamente para cada grupo. Los valores estuvieron muy cerca de la frecuencia media de todos los genes de un grupo.
Análisis de la Característica Operativa del Receptor (ROC)
Se llevaron a cabo análisis para distinguir entre individuos HGC y LGC mediante una combinación de especies bacterianas. Para cada combinación, solamente se consideró un modelo de decisión único, calculado como una suma de abundancia de especies más frecuentes en los individuos HGC que en los LGC. A diferencia del número infinito de modelos de regresión, estos modelos son finitos, y se pueden explorar de forma exhaustiva. Para seleccionar los mejores modelos, se usó el criterio del área validada cruzada bajo la curva ROC (CV-AUC)11, que se adapta bien a los modelos de clasificación para datos de resultados binarios.
Correlaciones entre las variables microbiana y clínicas
Se usaron pruebas de Mann-Whitney para comparar las variables bioclínicas, artículos alimenticios y grupos de genes entre la clase de genes LGC y HGC en cada punto de tiempo. Se investigaron las asociaciones entre la riqueza génica basal cuantitativa y las variables bioclínicas/de alimentos o deltas de variables bioclínicas/de alimentos, usando modelos lineales. Para los deltas, los modelos se ajustaron mediante los valores iniciales de las variables. Se aplicó un umbral de valor de p de 0,05 para la significancia estadística. No se usó ningún ajuste para ensayos múltiples debido a las variables bioclínicas y de alimentos muy correlacionadas. Sin embargo, hallazgos similares obtenidos en el artículo adjunto10 apoyan los resultados.
Anotación taxonómica
Para obtener una anotación taxonómica precisa y actualizada usando BLASTN (BLAST 2.2.24, parámetros por defecto), los 3,3 millones de genes del catálogo de referencia se compararon con la base de datos iMOMi12 (publicada en mayo 2011) que contiene 3.340 genomas microbianos completos y en proyecto descargados de los bancos de datos del NCBI. Siguiendo los parámetros de asignación taxonómica descritos por Arumugam13, cada gen se asignó con la taxonomía de la mejor coincidencia que abarca >80% de la longitud del gen y de acuerdo con el umbral de identidad para el rango taxonómico (>65% para el filo, >85% para género y >90% para la especie).
Resultados
Se reclutaron cuarenta y nueve sujetos obesos o con sobrepeso y se sometieron a una dieta alta en proteína y restringida en energía de 6 semanas, seguido de una dieta de mantenimiento de peso de 6 semanas; el cumplimiento fue bueno, como se indica mediante un análisis de PCA de 35 nutrientes a lo largo del tiempo. Las características bioclínicas y las características cualitativas y cuantitativas detalladas de la ingesta de alimentos de los individuos se obtuvieron al inicio, a las 6 y a las 12 semanas. La disminución del 35% en la ingesta de energía después de las primeras 6 semanas se asoció con una reducción en la masa de grasa corporal, el diámetro de los adipocitos y las mejoras de sensibilidad a la insulina y marcadores del metabolismo e inflamación. Durante la fase de mantenimiento del peso, la ingesta de nutrientes tendía a volver a los valores del inicio, mientras que la ingesta de energía total de la dieta, hidratos de carbono y lípidos se mantuvo más baja que al comienzo de la intervención. Las variables de lípidos en suero también tendieron a volver a sus niveles básales, mientras que se produjo una reducción progresiva en los marcadores de la inflamación sistémica.
La composición microbiana intestinal de la población de estudio se examinó en primer lugar al inicio. Se observó una distribución bimodal del número de genes bacterianos (Figura 1), similar a la encontrada en una cohorte de 292 individuos daneses10, aunque un poco menos distinta, posiblemente debido a un menor tamaño de la cohorte. A un umbral de 480.000 genes, definido visualmente y que corresponde a la del manuscrito adjunto10, hubo 18 individuos (40%) con bajo conteo de genes (LGC) y 27 (60%) con alto conteo de genes (HGC), que tuvieron en promedio 379.436 y 561.499 genes, respectivamente, una diferencia de un tercio. Se determinaron los enterotipos de los individuos en nuestra cohorte13. Se encontró que los enterotipos determinados por Bacteroides y Ruminococcus fueron prevalentes entre los individuos LGC y HGC, respectivamente, mientras que el enterotipo determinado por Prevotella se distribuyó de manera más uniforme (Figura 1).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Entonces, se examinaron los fenotipos del inicio de la población de estudio. El grupo LGC tuvo niveles significativamente mayores de resistencia a la insulina y de triglicéridos en suero en ayunas, así como una mayor tendencia a la inflamación que el grupo HGC (Figura 2). Parece ser que en dos países europeos, los individuos del grupo LGC, que tiene baja riqueza bacteriana intestinal, presentan fenotipos que los exponen a un mayor riesgo de comorbilidades asociadas con la obesidad. Se ha dado a conocer que los tratamientos con antibióticos, que reducen la diversidad, mejoran el estado hormonal, metabólico e inflamatorio de ratones obesos; esta aparente contradicción puede ser debida a una restauración de un balance de las especies bacterianas pro- e inflamatorias en ratones. Curiosamente, los sujetos LGC parecen consumir menos frutas y vegetales y menos productos de pescado que los sujetos HGC (Tabla 7), aumentando la posibilidad de que los hábitos dietéticos a largo plazo puedan afectar la riqueza de genes y los fenotipos asociados.
A continuación buscamos las especies bacterianas diferencialmente abundantes en los grupos LGC y HGC. Para este objetivo, primero se identificaron los genes que tenían frecuencias significativamente diferentes en los grupos LGC y HGC. Los genes de la misma especie se agruparon entonces mediante un análisis de covarianza basado en la frecuencia, los genes que varían de una manera coordinada probablemente pertenezcan a la misma especie10. Se identificaron 6.230 genes que eran diferentes según Mann-Whitney p<0,0001; 4.462 (72%) se agruparon en 112 grupos que contienen por lo menos 2 genes en un coeficiente de correlación de Spearman >0,85. Una inmensa mayoría de estos genes (3.966; 89%) se encontró en sólo 18 grupos, que probablemente se originan de especies diferencialmente abundantes en los grupos LGC y HGC. Sólo dos (Faecalibacterium prausnitzii y Roseburia inulinivorans) tuvieron una asignación taxonómica clara. La abundancia relativa de las 18 especies en cada individuo se calcula como una frecuencia de la mediana de sus genes; todos fueron significativamente más abundantes entre los individuos HGC (Figura 1).
Para probar si los individuos LGC y HGC se podían distinguir mediante las 18 especies, se llevó a cabo un análisis ROC exhaustivo de todas las combinaciones de especies, con la validación cruzada de 10 veces, usando 90% de los individuos para el cálculo y el restante 10% para el ensayo. Los mejores valores de AUC para la combinación de diferentes números de especies se muestran en la Figura 1; oscilaron entre 0,96 y 0,99 para 2 a 9 combinaciones de especies, lo que indica una estratificación casi perfecta de los individuos LGC y HGC.
Curiosamente, 14 de las 18 especies (78%) también se identificaron como diferencialmente abundantes entre los individuos LGC y HGC en una cohorte danesa más grande11. De manera no sorprendente, las combinaciones de especies que producen los mejores valores del AUC para nuestra cohorte también estratificaron eficientemente a los daneses LGC y HGC (Figura 1). Esto indica que los individuos LGC y HGC de dos países europeos difieren de manera similar, no sólo por sus fenotipos clínicos, sino también por las características específicas de su microbiota intestinal.
De forma muy interesante, la riqueza génica aumentó significativamente en el grupo LGC después de la dieta restringida en energía, y se mantuvo más alta que al inicio después de la fase de estabilización, incluso si era evidente una ligera tendencia a la baja, mientras que no cambió significativamente durante la intervención en el grupo HGC. De este modo, una intervención dietética puede corregir una pérdida putativa de la riqueza en el grupo LGC, aunque sea parcialmente, puesto que la diferencia entre los grupos LGC y HGC permaneció significativa al final de la intervención. La intervención condujo a una mejora de las variables metabólicas en individuos LGC, acercándolos a la de los individuos HGC: la tendencia hacia una mayor resistencia a la insulina desapareció, mientras que la diferencia en los niveles de triglicéridos se atenuó (Figura 2). De forma importante, aunque la inflamación se redujo en todos los individuos, la diferencia entre los individuos LGC y HGC no se atenuó (Figura 2).
Para investigar aún más las correlaciones entre la riqueza de genes y la intervención dietética, se estudiaron de manera cuantitativa. Para este fin, el tamaño del conjunto de datos se redujo a 4,5 millones de lecturas cartografiadas de manera única, lo que nos permite incluir en cada punto de tiempo a 45 personas. Antes de la intervención dietética, la riqueza génica no estaba relacionada con la edad, el sexo y el BMI, pero se asoció con un mayor consumo de frutas y vegetales y con menores niveles de triglicéridos y colesterol, lo que confirma las comparaciones del grupo lGc/HGC. Después de 6 semanas de dieta baja en calorías, los sujetos con alta riqueza génica al inicio del estudio tuvieron menor resistencia a la insulina y triglicéridos en suero, así como menos células inflamatorias del tejido adiposo que los sujetos con menor riqueza génica; la diferencia fue significativa para los triglicéridos y la inflamación sistémica después de la fase de mantenimiento del peso, a las 12 semanas. Estas observaciones indican que la riqueza de genes afecta la eficacia de la intervención dietética, incluso si la diferencia entre los individuos LGC y HGC se atenuó globalmente. Esta conclusión se vio reforzada por las asociaciones entre la mayor riqueza de genes al inicio del estudio y la mejora del tejido adiposo y de la inflamación sistémica (cambios delta a las 6 y 12 semanas, respectivamente). La riqueza génica parece ser predictiva de la eficacia de la intervención dietética en individuos con sobrepeso/obesidad.
Tabla 2: AUC obtenida al determinar la baja diversidad intestinal mediante la detección de la presencia o ausencia de un conjunto de 25 genes bacterianos de las especies bacterianas dadas.
Especies bacterianas
AUC
MO HL 5
0,890946502057613
MO HL 6
0,890946502057613
MO HL 14
0,872427983539095
MO HL 9
0,845679012345679
MO HL 11
0,843621399176955
MO HL 13
0,831275720164609
MO HL 3
0,82716049382716
MO HL 8
0,826131687242798
MO HL 16
0,825102880658436
MO HL 4
0,820987654320988
MO HL 17
0,812757201646091
MO HL 1
0,808641975308642
MO HL 7
0,800411522633745
MO HL 12
0,79835390946502
MO HL 2
0,777777777777778
MO HL 10
0,765432098765432
MO HL 15
0,742798353909465
MO HL 18
0,740740740740741
Tabla 3: Se obtienen AUC por encima de 0,9 cuando se determina baja diversidad intestinal mediante la detección de la presencia o ausencia de un conjunto de 25 genes bacterianos de la combinación dada de 2 especies bacterianas.
5
Combinación de especies bacterianas
AUC Combinación de especies bacterianas AUC
MO HL 5 y MO HL 6
0,948559670781893 MO HL 3 y MO HL 13 0,874485596707819
MO HL 11 y MO HL 12
0,948559670781893 MO_HL_13 y MO_HL_14 0,874485596707819
MO HL 6 y MO HL 7
0,94238683127572 MO HL 14 y MO HL 15 0,874485596707819
MO HL 5 y MO HL11
0,938271604938272 MO HL 14 y MO HL 17 0,874485596707819
MO HL 6 y MO HL 8
0,932098765432099 MO HL 4 y MO HL 8 0,872427983539095
MO HL 7 y MO HL 11
0,932098765432099 MO HL 4 y MO HL 14 0,872427983539095
MO HL 4 y MO HL 13
0,92798353909465 MO HL 9 y MO HL 15 0,872427983539094
MO HL 5 y MO HL 12
0,921810699588477 MO HL 1 y MO HL 3 0,87037037037037
MO HL 6 y MO HL 13
0,921810699588477 MO HL 1 y MO HL 5 0,87037037037037
MO HL 13 y MO HL 17
0,919753086419753 MO_HL_1 y MO_HL_13 0,868312757201646
MO HL 5 y MO HL 17
0,91358024691358 MO HL3y MO HL 16 0,868312757201646
MO HL6y MO HL 12
0,91358024691358 MO HL 11 y MO HL 15 0,868312757201646
MO HL 5y MO HL 7
0,911522633744856 MO HL 13 y MO HL 15 0,864197530864198
MO HL 5 y MO HL 8
0,909465020576132 MO HL 3y MO HL 12 0,864197530864197
MO HL 8 y MO HL 11
0,909465020576132 MO HL 5 y MO HL 9 0,864197530864197
MO HL 3 y MO HL 9
0,907407407407407 MO HL 6 y MO HL 9 0,864197530864197
MO HL 5 y MO HL 13
0,907407407407407 MO HL 7 y MO HL 18 0,864197530864197
MO HL 14 y MO HL 16
0,905349794238683 MO_HL_2 y MO_HL_15 0,863168724279835
MO HL 12 y MO HL 13
0,904320987654321 MO_HL_1 y MO_HL_11 0,862139917695473
MO HL 2 y MO HL 7
0,901234567901235 MO HL 3 y MO HL 6 0,862139917695473
MO HL 2 y MO HL 14
0,89917695473251 MO HL8y MO HL 17 0,862139917695473
MO HL 4 y MO HL 5
0,89917695473251 MO HL 13 y MO HL 18 0,862139917695473
MO HL 11 y MO HL 17
0,89917695473251 MO_HL_7 y MO_HL_9 0,860082304526749
MO HL 4 y MO HL 11
0,898148148148148 MO HL8y MO HL 18 0,860082304526749
MO HL 7 y MO HL 12
0,896090534979424 MO HL9y MO HL 16 0,860082304526749
MO HL 1 y MO HL 7
0,895061728395062 MO HL 1 y MO HL 17 0,858024691358025
MO HL 1 y MO HL 8
0,895061728395062 MO HL 5 y MO HL 15 0,858024691358025
MO HL 8 y MO HL 12
0,895061728395062 MO HL 3 y MO HL 10 0,858024691358024
MO HL 2 y MO HL 5
0,893004115226337 MO HL 1 y MO HL 15 0,8559670781893
MO HL 2 y MO HL 13
0,893004115226337 MO HL 9 y MO HL 10 0,8559670781893
MO HL 3 y MO HL 14
0,893004115226337 MO HL 8 y MO HL 13 0,854938271604938
MO HL 6 y MO HL 11
0,890946502057613 MO HL 2 y MO HL 16 0,853909465020576
MO HL 9 y MO HL 14
0,890946502057613 MO HL 8 y MO HL 9 0,853909465020576
MO HL 6 y MO HL 17
0,888888888888889 MO HL 4 y MO HL 18 0,851851851851852
MO HL 2 y MO HL 4
0,887860082304527 MO HL 9 y MO HL 12 0,851851851851852
MO HL 4 y MO HL 6
0,886831275720165 MO HL 9 y MO HL 17 0,851851851851852
MOHL7 y MO HL 13
0,885802469135803 MO HL 10 y MO HL 13 0,849794238683127
MOHL4 y MO HL 7
0,885802469135802 MO HL 11 y MO HL 18 0,849794238683127
MO HL 2 y MO HL 6
0,88477366255144 MO HL 1 y MO HL 2 0,847736625514403
MO HL 2 y MO HL 8
0,88477366255144 MO HL 3y MO HL 17 0,847736625514403
MO HL 2 y MO HL 9
0,88477366255144 MO HL 1 y MO HL 6 0,845679012345679
MO HL 3 y MO HL 7
0,88477366255144 MO HL 3 y MO HL 18 0,845679012345679
MO HL 3 y MO HL 8
0,88477366255144 MO HL 4 y MO HL 9 0,845679012345679
MO HL 6 y MO HL 15
0,88477366255144 MO HL 8 y MO HL 15 0,845679012345679
MO HL 9 y MO HL 13
0,88477366255144 MO HL 1 y MO HL 16 0,843621399176955
MO HL 1 y MO HL 9
0,882716049382716 MO HL 3 y MO HL 11 0,843621399176954
MO HL 2 y MO HL 3
0,882716049382716 MO HL 12 y MO HL 17 0,842592592592593
MO HL 2 y MO HL 11
0,882716049382716 MO HL 2 y MO HL 12 0,842592592592592
MO HL 10 y MO HL 14
0,882716049382716 MO_HL_2 y MO_HL_17 0,84156378600823
MO HL 11 y MO HL 13
0,882716049382716 MO_HL_7 y MO_HL_10 0,84156378600823
MO HL 3 y MO HL 4
0,880658436213992 MO HL 1 y MO HL 12 0,839506172839506
MO HL 5 y MO HL 18
0,880658436213992 MO HL3y MO HL 5 0,839506172839506
MO HL 7 y MO HL 8
0,880658436213992 MO HL 3 y MO HL 15 0,837448559670782
MO HL 7 y MO HL 17
0,880658436213992 MO HL 7 y MO HL 15 0,83641975308642
MO HL 9 y MO HL 11
0,878600823045268 MO HL 6 y MO HL 18 0,835390946502058
MO HL 6 y MO HL 14
0,878600823045267 MO HL 7 y MO HL 16 0,835390946502058
MO HL 1 y MO HL 14
0,876543209876543 MO HL 8 y MO HL 16 0,835390946502058
MO HL 5 y MO HL 14
0,876543209876543 MO HL 13 y MO HL 16 0,835390946502058
MO HL 7 y MO HL 14
0,876543209876543 MO HL 4 y MO HL 16 0,835390946502057
MO HL 8 y MO HL 14
0,876543209876543 MO HL 8 y MO HL 10 0,835390946502057
MO HL 9 y MO HL 18
0,876543209876543 MO HL 6 y MO HL 10 0,833333333333333
MO HL 11 y MO HL 14
0,876543209876543 MO_HL_6 y MO_HL_16 0,833333333333333
MO HL 12 y MO HL 14
0,876543209876543 MO_HL_1 0 y MO_HL_16 0,833333333333333
MO HL 14 y MO HL 18
0,876543209876543 MO_HL_11 y MO_HL_16 0,833333333333333
MO HL 2 y MO HL 10
0,874485596707819 MO HL 1 y MO HL 4 0,831275720164609
MO HL 15 y MO HL 17 0,831275720164609
Tabla 4: Se obtienen AUC por encima de 0,95 cuando se determina baja diversidad intestinal mediante la detección de la presencia o ausencia de un conjunto de 25 genes bacterianos de la combinación dada de 3 especies bacterianas.
5
Combinación de especies bacterianas
AUC
MO HL 7, MO HL 11 y MO HL 12
0,993827160493827
MO HL 5, MO HL 11 y MO HL 12
0,977366255144033
MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 12
0,967078189300411
MO HL 4, MO HL 7y MO HL 11
0,965020576131687
MO HL 5, MO HL 7 y MO HL 11
0,965020576131687
MO HL 7, MO HL 11 y MO HL 17
0,958847736625514
MO HL 5, MO HL 6y MO HL 8
0,954732510288066
MO HL 7, MO HL 12 y MO HL 13
0,954732510288066
MO HL 5, MO HL 6y MO HL 12
0,952674897119342
MO HL 6, MO HL 7y MO HL 12
0,952674897119342
MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 11
0,952674897119342
MO HL 4, MO HL 5 y MO HL 11
0,950617283950617
MO HL 6, MO HL 8 y MO HL 11
0,950617283950617
Tabla 5: Se obtienen AUC por encima de 0,96 cuando se determina baja diversidad intestinal mediante la detección de la presencia o ausencia de un conjunto de 25 genes bacterianos de la combinación dada de 4 especies bacterianas.
10
Combinación de especies bacterianas
AUC
MO HL 5, MO HL 7,MO HL 11y MO HL 12
0,987654320987654
MO HL 7, MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 12
0,981481481481482
MO HL 7, MO HL 11, MO HL 12 y MO HL 17
0,981481481481481
MO HL 6, MO HL 8,MO HL 11y MO HL 12
0,977366255144033
MO HL 2, MO HL 7,MO HL 11y MO HL 12
0,975308641975309
MO
HL 7, MO HL 11 , MC HL LO _l X o1 CM 0,975308641975309
MO
HL 2, MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 12 0,973251028806584
MO
HL 5, MO HL 11 , MO HL 12 y MO HL 17 0,973251028806584
MO
HL 6, MO HL 7, MO HL 11 y MO HL 12 0,973251028806584
MO
HL 5, MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 12 0,97119341563786
MO
HL 8, MO HL 11 , MO _HL 12 y MO HL 17 0,97119341563786
MO
HL 7, MO HL 11 , MO HL 12 y MO HL 13 0,969135802469136
MO
HL 5, MO HL 6, MO HL 8 y MO HL 11 0,967078189300411
MO
HL 7, MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 17 0,967078189300411
MO
HL 2, MO HL 5, MO HL 11 y MO HL 12 0,965020576131687
MO
HL 4, MO HL 7, MO HL 11 y MO HL 12 0,965020576131687
MO
HL 5, MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 11 0,965020576131687
MO
HL 7, MO HL 8, MO HL 12 y MO HL 13 0,965020576131687
MO
HL 7, MO HL 12 , MO HL 13 y MO HL 17 0,965020576131687
MO
HL 2, MO HL _4 MO HL 7 y MO HL 11 0,962962962962963
MO
HL 2, MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 13 0,962962962962963
MO
HL 2, MO HL 7, MO HL 12 y MO HL 13 0,962962962962963
MO
HL 4 MO HL _5, MO HL 7 y MO HL 11 0,962962962962963
MO
HL 5, MO HL 6, MO HL 12 y MO HL 13 0,962962962962963
MO
HL 5, MO HL 11 , MO HL 12 y MO HL 13 0,962962962962963
MO
HL 6, MO HL 8, MO HL 12 y MO HL 13 0,962962962962963
MO
HL 2, MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 11 0,960905349794239
MO
HL 5, MO HL 6, MO HL 7 y MO HL 8 0,960905349794239
MO
HL 5, MO HL 6, MO HL 11 y MO HL 12 0,960905349794239
MO
HL 6, MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 11 0,960905349794239
MO
HL 6, MO HL 7, MO HL 8 y MO HL 12 0,960905349794239
MO
HL 6, MO HL 7, MO HL 12 y MO HL 13 0,960905349794239
MO
HL 7, MO HL 8, MO HL 11 y MO HL 15 0,960905349794239
MO
HL 11 , MO HL 12, MO HL 13 y MO HL 17 0,960905349794239
Tabla 6: Especies bacterianas y combinaciones de 2 a 18 especies bacterianas que dan la mejor AUC en el método de la invención.
Especies bacterianas y combinación de las mismas
AUC
MO HL 5
0,890946502
MO HL 12 y MO HL 11
0,948559671
MO HL 11, MO HL 7 y MO HL 12
0,99382716
MO HL 11, MO HL 5, MO HL 7 y MO HL 12
0,987654321
MO HL 11, MO HL 8, MO HL 12, MO HL 7 y MO HL 2
0,983539095
MO HL 17, MO HL 5, MO HL 12, MO HL 7, MO HL 11 y MO HL 8
0,981481481
MO HL 12, MO HL 11, MO HL 2, MO HL 5, MO HL 8, MO HL 13 y MO HL 7
0,983539095
MO HL 12, MO HL 2, MO HL 17, MO HL 11, MO HL 13, MO HL 5, MO HL 8 y MO HL 7
0,983539095
MO HL 4, MO HL 11, MO HL 6, MO HL 13, MO HL 2, MO HL 8, MO HL 12, MO HL 7 y MO HL 17
0,979423868
MO HL 8, MO HL 11, MO HL 6, MO HL 4, MO HL 13, MO HL 5, MO HL 2, MO HL 7, MO HL 17 y MO HL 12
0,981481481
MO HL 5, MO HL 13, MO HL 4, MO HL 12, MO HL 15, MO HL 17, MO HL 6, MO HL 2, MO HL 8, MO HL 7y MO HL 11
0,977366255
MO HL 11, MO HL 6, MO HL 17, MO HL 4, MO HL 3, MO HL 12, MO HL 5, MO HL 10, MO HL 8, MO HL 7, MO HL 2 y MO HL 13
0,975308642
MO HL 18, MO HL 15, MO HL 11, MO HL 10, MO HL 5, MO HL 4, MO HL 6, MO HL 8, MO HL 12, MO HL 7, MO HL 2,MO HL 13y MO HL 3
0,973251029
MO HL 6, MO HL 17, MO HL 3, MO HL 2, MO HL 4, MO HL 18, MO HL 5, MO HL 13, MO HL 10, MO HL 15,MO HL 7,MO HL 1,MO HL 8 y MO HL 12
0,971193416
MO HL 10, MO HL 18, MO HL 2, MO HL 13, MO HL 7, MO HL 1, MO HL 11, MO HL 3, MO HL 4, MO HL 15, MO HL 5, MO HL 6, MO HL 17, MO HL 12 y MO HL 8
0,971193416
MO HL 7, MO HL 4, MO HL 13, MO HL 1, MO HL 5, MO HL 6, MO HL 11, MO HL 12, MO HL 8, MO HL 3, MO HL 18, MO HL 2, MO HL 10, MO HL 17, MO HL 15 y MO HL 9
0,946502058
MO HL 10, MO HL 8, MO HL 1, MO HL 16, MO HL 18, MO HL 5, MO HL 15, MO HL 2, MO HL 7, MO HL 6, MO HL 13, MO HL 11, MO HL 17, MO HL 3, MO HL 14, MO HL 4y MO HL 12
0,942386831
MO HL 15, MO HL 17, MO HL 4, MO HL 14, MO HL 16, MO HL 10, MO HL 7, MO HL 6, MO HL 11, MO HL 9, MO HL 5, MO HL 3, MO HL 8, MO HL 1, MO HL 12, MO HL 18, MO HL 13 y MO HL 2
0,940329218
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Referencias
1. Rizkalla, S. W. et al. Differential effects of macronutrient content in 2 energy-restricted diets on cardiovascular risk factors y adipose tissue cell size in moderately obese individuáis: a randomized controlled trial. Am. J. Clin. Nutr. 95, 49-63 (2012).
2. Bouché, C. et al. Five-week, low-glycemic index diet decreases total fat mass y improves plasma lipid profile in moderately overweight nondiabetic men. Diabetes Care 25, 822-828 (2002).
3. Tordjman, J. et al. Structural y inflammatory heterogeneity in subcutaneous adipose tissue: Relation with liver histopathology in morbid obesity. Journal of Hepatology (2012).doi:10.1016/j.jhep.2011.12.015
4. Disse, E. et al. A lipid-parameter-based index for estimating insulin sensitivity y identifying insulin resistance in a healthy population. Diabetes Metab. 34, 457-463 (2008).
5. Antuna-Puente, B. et al. Evaluation of insulin sensitivity with a new lipid-based index in non-diabetic postmenopausal overweight y obese women before y after a weight loss intervention. Eur. J. Endocrinol. 161, 51-56 (2009).
6. Prat-Larquemin, L. et al. Adipose angiotensinogen secretion, blood pressure, y AGT M235T polymorphism in obese patients. Obes. Res. 12, 556-561 (2004).
7. Benjamini, Y. y Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical y powerful approach a multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B. Methodological 57, 289-300
8. Qin, J. et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464, 59-65 (2010).
9. Pons, N. et al. METEOR, a platform for quantitative metagenomic profiling of complex ecosystems. JOBIM (2010).
10. Le Chatelier, E. et al. Richness of human gut microbial communities correlates with metabolic markers. submitted in Nature
11. Jiang, D., Huang, J. & Zhang, Y. The Cross-Validated AUC for MCP-Logistic Regression with High-Dimensional Data. Stat Methods Med Res (2011).doi:10.1177/0962280211428385
12. Pons, N., Batto, J.-M., Ehrlich, S. D. y Renault, P. Development of software facilities a characterize regulatory binding motifs y application a streptococcaceae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 14, 67-73 (2008).
13. Arumugam, M. et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature 473, 174-180 (2011).
Listado de secuencias
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE UPMC
INSTITUT DE RECHERCHE POUR LE DEVELOPPEMENT IRD
LE CHATELIER, Emmanuelle
EHRLICH, Stanislav
DORE, Joel
CLEMENT, Karine
zUCKER, Jean Daniel
<120> PRONÓSTICO DEL IMPACTO DE LA DIETA EN COMORBILIDADES RELACIONADAS CON LA OBESIDAD.
<130> 364100D31429
<150> EP 12306285,3 <151> 2012-10-17
<160> 450
<170> PatentIn version 3,5
<210> 1 <211> 1713
<212> ADN <213> Desconocida
5 <220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 1
atgacaccat cagaatggag tttccgtatg ctgctgatcc ttgcgctgct gatcggcgcg ctgacggaga gcgtgtttac ctactggggc cgcgccatca cctgctacaa gctcgccatg atctggctct cgaacgctta caaacggagc gtcaacgcca tcacgcagag ccccgacgcg tacgtggagc aggacaacct ccttgacgcc gccgtccgca cccagatcga cgccctgcgc ggcacctata cggaatacat cgatgtcacc gtctgcaaca gcgatttccc ggccgaggag accgcgggcg agagcaagat cgtcgcgctg gcggtctacg ccggctatac cgtcggcagc gggctggaca gctatgtccg tgagctgctc gacgagctct gggccatcga ggagctggac ctgccgtact tcaccggcct gcgcacgctc ctgtcggtcc tcgcccagct gccgacgctg
10
tcgtcggcgg cgatgagcac catcgtctca
ggctgcgccg tcatcgacat caacgccctg
ctttccaaca acaccatctc cgacctcacc
ctgcatctga ccaacaaccc catcacctcg
gagatcctct acgcgaacca gtgctccatc
gcgctcaagg agctgtatct ggccaacaac
tgcacggcgc tgcagacgct ggacctgtcg
tccgagctca ggcagctggt cgacctcaac
gctgtggacg ccgatacgcc gctctggcac
ctgaccggcc ttgcgggcaa cctctccgtc
aagtccatcg caaagctcga ggcgtgcgtc
cccgtgaaca ccgacgaggt caagaagctg
cccgaataca aggaaacgga cacagaagcc
<210>2 <211> 1746 15 <212> ADN
<213> Desconocida
aaacacacgt tgaaaatact gatcccgatc 60 tgctggtttt tcctcatcgc ccgccgcgat 120 aatcattttt ataacaacgg ccgctacggc 180 cacttcgccc cgaaggacgc cgagcttgcc 240 ggcaactata cgaaggccga atataccctc 300 gccgacctct acatcgccct gtccaagacc 360 gagaccatgc tctgccgcat caccaacgac 420 cccgccgcac ccgtgatcga gccggagagc 480 atcaccggga ccgagggcac cgtctacgcc 540 acggacatct ataccggccc catctccctg 600 agcgtggcgg aaaacggcct cgtgagcgac 660 gtcgtggagc cggtcacgct ggcggacgcg 720 ggcaagacgg ctggcagcac gctgatgacg 780 ctgcccgata ccgtcgcctc gctggaggat 840 gcgctgcacc atagcagcgc gtcgatggac 900 cgcacgctgg acctgtccgg ctgcacgctc 960 ctgccggagc tgacgagcct gaacctctcc 1020 attggcctgc agaagctgga attcctcgac 1080 gccctgtccg ccctgcaggc gctcaaggag 1140 ctcgccaacc tcaaaaactg cacgcagctg 1200 acgcgcatcg cgggcctggc cgaccatacg 1260 cagatcgcgg atatctccgt cctcgcctcc 1320 ttcaacgcgg tcacggatat ctccatcgtt 1380 gtgagcaaca accagatcac cgtcttcccg 1440 gtcgatatca gccacaacca gatcgaggat 1500 aacttcatca acgccgacta taataagatc 1560 atgctcgtta agatgaacct ctgggataac 1620 caggacgtcg gcatcatcat caactataac 1680 tga 1713
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
5
10
<400>2
atgatcaaac
gtgtgcatgg
atcaacgcga
ttcgtcatcg
gccgcggcgg
tcctttgcga
gtcacgaaca
atgctggtgt
gccgggatcg
ctgttcaagg
caggccatgc
gccgcctccg
tcccctgcca
aagctcatcg
acgtattcca
acgatggcgc
cagaacccgg
aactttaagt
agatccggcc
cagctcatct
gtgcggcagt
gtgctgttct
gaggagctgc
gacaaatacg
cggctgtgca
acctccgctg
ccggagacga
atcctcgtgc
tcgaaccgga
ggctaa
gtttggcggc
tgggcgaggt
tccagaacgg
ccatgctgtc
gctttgcgaa
acatcgaccg
tccagaacgc
tcgcggtggt
tgccggtgct
cggtcttcaa
gcgtggtcaa
actccgtgcg
tgcagttctg
tcacgtcggg
tgcagatcct
aggcctccgg
cagagccggt
attcggcggc
agaccgtcgg
gccggctgta
acgatctgga
ccggcacgat
agcgggcctg
acacctatat
tcgcgcgggc
tcgacacgaa
cgaagttcat
tcgagggcgg
tctaccggga
ctgtatccgg
cgtatgcgag
ctgcacgatg
gctggggttc
gaatctgcgg
gttttcgacc
gttcatgatg
gatgtccgtc
ggggttcgcg
gaaatacgac
gagcttcgtg
gaaggatttc
cgtgtacacg
cggaacgtat
catgagcctg
caagcgcatc
ctatgatgtg
ggcgaagcgc
catcattggc
cgacgtgacg
gacgctgcgc
caaggagaat
cgagctggcg
cgagcagggc
gctgctgaaa
gaccgacgcg
catcgcgcag
gcagatcgac
agtctatgaa
<210>3 <211>1251 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 3
gaatacaaaa
tgcacgatcc
cagaccattc
ggatcgttgt
catgatctgt
tcgtcgctcg
tgcatccgca
cgcgtgggca
ctgtttctga
gcgctcaacc
cgcgaggact
ctcaaggcgg
tcgatgatcc
ctgggcgtgg
atgatgctct
tgcgaggtgc
aagaacggcg
agcgcgcttt
ggcacggggt
gacggcagcg
aaccaggtcg
ctgcgctggg
tgcgcggatg
ggcacgaacg
aagccgaaga
aagatccgcg
cggatctcgt
gccatgggca
tctcagaaca
ggccgacgat
cgctgctgac
tgtccttcgg
ccggctggtt
attatcaggt
tcacgcggct
tcgcggtgcg
agcagctggc
tgatccggag
actccgtgca
atgagacgga
agaaaatcct
tcatctcgta
gaagtctgac
cgatgatctt
tcgacgagac
acgtggattt
cggacgttga
cttctaagac
tgcgggtcgg
cggtcgtgct
gcgacgcgaa
aattcatcca
tcggcggcgg
ttttgatcct
cggcgctgcg
ccatccagaa
cgcacgagca
aggcgggagg
cctgaccccc
ggcggatctg
actcaagctg
cgcggcagag
gcagggcttt
gacgacggac
cgcgccgatg
gctcatcttc
cgcgctgccg
ggagaacgtg
gaaattctcc
ggcgctcaac
tttcgcggcg
gagcatgatc
cgtgatgctg
gagcagcctg
tgaccatgtc
tttccatgtg
gagtctggtg
cggcgtggac
gcagaagaac
cgcgtcggac
gcagatgccg
gcagaagcag
cgacgactcg
ctcggagatc
cgcggatctc
gctgctggct
tgctgacaat
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1746
5
10
atgaaaatca aaaatgttgt ctgcgcacca ggacgtaccg gcttctattt tgacgatcag
cgcgcgatca agcgcggcgc ggggcacgac gggatgttct atatcggtca gcctgtcacc
gagggctttt ccgccgtccg tcaggcaggc gaggcgatct cggtcatgct gatcctggag
gacggccagg tcgcttacgg cgactgcgcg gcggtacagt attccggcgc aggcgggcgc
gatccgctgt ttttggcgaa ggattttatt cctattattg agcagtacat caaaccgtgt
ctggttggcc aggaagcgga caatttccgt gcgcttgccg caaggatgga agccatcgag
gtcggcggca agcggctgca tacggcgatc cgctatggtg tttctcaggc gctgcttgac
gccgttgcaa aggcgagcgg gcgcatgatg tgtgaggtcg tggcggatga atacggctgc
acggtatcgg atcacctgat tccgatcttt acccagtccg gggacgaccg gtatgataat
gcggacaaaa tgatcatcaa gggcgcgcag gtgctcccgc acgcattgat caacaacggg
gagacgaagc tcggcgcgca cggcgaaaag cttcaggagt atgtggcgtg gcttcgtgac
cggatcttgg cgcagcgtct ggacgagcac tatgccccgg tcctgcatat cgatgtctac
ggtacgatcg gcgcagcctt cggaaatcat aactacgcag ccatggcgga ttatctggcg
gtcctggagc agaccgcaaa gccgttccac ctgcggatcg aaggaccgat ggactgcgac
tgtgaccgcg aaacgcagat ggaggcgctc gcggggctga ccgcggagct ggaccggcgc
ggcatcgatg ttgagctggt cgctgacgaa tggtgcaata cgctcgaaga tatcaagctt
ttcgccgatc acaaagccgg tcacatgatc cagatcaaaa cgccggatct cggcggcatc
aacaatacca tcgaggcagt cctctactgc aaggaaaagg gcatcggtgc atatcagggc
ggcacctgca atgagaccga ccgctctgcg caggtctgcg tgcagtgcgc catggcgaca
cagccggcac agatcctcgc aaagcccggc atgggtgtgg acgaaggcta tatgatcgtc
tataacgaga tgaaccggat cctcgcgctg cggaaggcaa aggcagaata a
<210>4 <211> 990 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 4
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1251
5
10
atgcagaagg agcaggttat catgcgcgga atcccgtctt
aaagtcttta ccgaggtcgc ccggatggca tactccggcg
atccccttca agatcgtccc cggccagagc ccgctgcacc
cgcgccatcg cgggcgaacg cgtgcgtctt gcgatgggtc
acgcgcacgc ttctgaccga gggcatggac caggccgcca
ccgccgctcg tcaacatcat cccctacgcc tgccacgcct
gtcaacgagc tgtgtcaggg ctgtctcgcc tcctcgtgcc
gcgatcaaat ttgtcaacgg caagagccgc atcgaccaga
aaatgcgcca gatcctgtcc gtacaacgcc atcacctacc
gcctgcggca tggacgccat cggcgtcgac gaatacggca
cgctgcgtct cctgcggcca gtgccttgtg agctgcccgt
agccagatct atcaggtcat ccgctccatg ctcgagggca
gcgccgtcgt tcgtcggcca gttcggcaag gacgtgaccg
atgaagcagc tcggctttgc cgatgtggtc gaggtcgcgg
atcgaggaag cgcgggactt tatggaaaag gtcccggagg
tcctgctgcc cgtcgtggcg gatgatggcc agacggctgt
atttccatga cctacacgcc gatggtctat
<210>5 <211> 1221 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 5
tgatcacaga gatccgaaag actacaccga tatggaggat gcgaatcggt ctttcttgag tgtccctgca gcccgtacag tcgccgagca gtattacgag gcccgacgcg gcagtaccgt agcgcgtgtg cccgaagggc aactgtgcat caagtgcggc tcgagcgccc gtgtcaggcc aggcctgcat cgactatgac tcggcgcgat cgtcgacaag acgaggtcgt ggccatcgtc tgccgaagtt cctcacggcc tcggcgcgga tatctgcacg agcagcggtt catggcgacc tccccgccga atccggcaac
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
990
5
10
tcgcattgct
gcttgcagcg atcatggtgc tcggtctggc tgcctgcgca 60
agcccgagac
caccaccgaa ccggaaacca ccaccgaaac cgctcccgag 120
aacccgccgc
tgaggagccc gcagctgaag aagagacccc ggctgaagag 180
acgctgctta
ctccgtcgcc atgatcaccg actacggtga taccaccgac 240
accagaccac
ctacgaggcc tgcaaggagt tctgcgaggc caacggcctg 300
atttcaagcc
cgccggtgac tccgacgccg agcgtgtcgc catgatcgag 360
acgagggcta
caacgttgtt gtgatgcccg gctacgcttt cgcaggcgcc 420
ctgccgacat
ctatcccgag gtcaccttca ttgcgctgga cgtcagtgcc 480
gcgatgacta
caccctgccc gccaacctct actgcgctgt ctatcaggaa 540
gctacatggc
cggctacgca gctgtgaagc tccgctacac caagcgcgga 600
gcatggctgt
ccccgctgtt gtccgttacg gcttcggcta tgtgcagggc 660
ctgccaagga
gctcggcatc acggtcgacc tcaagtacgc ttacggcaac 720
gcgacgctga
catcaccgct gcaatggaca cctggtatca gggcggcacg 780
tcgcctgcgg
cggcggcatc tatacctccg cggctgaggc tgctgccaag 840
agatcatcgg
cgtcgacgtt gaccaggccg gcatcatcga cggcgattac 900
tgaccgttac
ctccgcaatg aagggccttg ctcccaccgt caagcatctg 960
tcgtggccgg
caactttgcc aactacggcg gcaagatcga aacgctgggc 1020
ccaacccgga
agagaactac gtccagatcc cgaccgcttc cacgcagttc 1080
agttcaccca
ggctgactac gaagcgctcg tcgctgccat gttcgccggc 1140
tctccaacga
catcacggct atgcccgctg tcaccaacgt caccgttgag 1200
acctgaagta
a 1221
<210>6 <211> 1446 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 6
5
10
atgctgccgc
tgggtgatgc
cgggccgtca
tcgctcgtcg
gtgttcgaga
gagctcgaca
attctggtgt
cgggccgaga
aagatcctct
ggcggcgagc
tttgccatcc
gtcttcatgg
ttcgacctgg
acgctgctca
catcacgcgg
tttgacctgt
agcgccgggt
gccaaggcgg
ggcaagcccg
ctcatcgctg
ctcacggccg
gcgggcaact
ctcgggcggc
aaataa
gggcgatcgt
ctatgtgctg ggcgcggtgc tgctgatcgg ggccgcgctg 60
cgctgctcgt
ggcgctgatc taccatgagg taagcggctg gtatttcctc 120
tgggggcggc
ggtgctcggc gcgctggccc tgcggctggg cggcggcaag 180
tgtacgcaaa
agaagggctg atcgcggtgg cgctcagctg gatcgtgctt 240
gcgcgctgcc
gttcacgctt tcggggcaga tcccgtttta tctcgacgcc 300
tgatctccgg
ctttaccacc accggctcga gcatcctgcc cgcggtggag 360
agtgcatgct
gttctggcgc agcttttcgc actggatcgg cggcatgggc 420
tcatgctggc
catcgtccgg atggacggcg gccaggccat ccacctgctg 480
gccccgggcc
gacggtctcc aagatggtgc cgcggatggc cgattcgtcc 540
acgggatcta
ttttggcctg acggtgctgc agatcctctt ttatctggcc 600
cgctgcttga
ctcgctctgc aatgccttcg gcacggccgg caccggcggc 660
gcaacgattc
cttcgcctcc tacagcgcct acacgcagac ggtcacgacc 720
ccctgttcgg
cgtcaatttt tcgatctatt tcttcctgct gcgccggaaa 780
cgtggaagaa
tacggagctg cgctggtacg tgtcgatcat tctcggctcg 840
tcacctgcaa
catcatgaag ctctacggcg gcgatttcgg cttcagcctg 900
cttttgccgt
ctcctccgtc atcaccacga cgggctttgg cacggagaac 960
ggccggagtt
ttcccgcgtg atcctggtgc tcctcatgat cgtcggtgcg 1020
cgacgggcgg
cggactgaag gtctcgcgcg tggtcatcct gatgcgcgcg 1080
agctgcgcaa
gatcctgcac ccgcacaccg tgaaggtcat caccgtcgac 1140
tctccggcga
gacggtccgg gccgtgagca cctattttat cctgtacgtg 1200
cggcgtcggt
gctgctcgtc tcgctcgacg gctacgacgg ctcgaccacg 1260
tcatggcgac
gttcaacaac atcggtcccg gcctcggcct ctgcggcccg 1320
tcgcgttctt
ttctccgttc gcgaaggtga tcctgtgcct cgatatgctg 1380
tggagctgta
cccgatgctg gtgctgctga tgccgagcac gtggagaaag 1440
1446
<210>7 <211> 657 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400>7
5
10
15
ttggacgcga
ggcagcaact
gtcgcgatcg
gtgctggagc
cgcacaaagg
aaggtctcgg
tccctgcatg
ctcaacgtgg
ccggtcgcgc
ggcgctcttc
tacactctct
aattactgga cctgctggag gcgaagtggt gatccacgag aaaacgggca tgtgaccggc agctggggca cgaggatgac acggaaagat cctgaaatcc ggatcctggg gatcaactat acttcatctc agccgatcag ccgatctgct cgacgacctc tgatgaccaa agacgacaag tgattaccaa atccggcgat attcatacct agataacagt
cagatcgcaa aggcgatcgc ctttccggca aaagcgccta cgcaaggtgg gcgacgggcc agcgcaaagg atcagcttgc tcctctgtgt atatccgtga gacatttcca tgatgcagct catgcgagcc gcgagcccga atccggcagg cggacgaact gtcaaggcca tccgctatct aaaatagcga agcatttcgg aaaacaggag gaacaaacga
agcacaattc
60
ttcctcgatc
120
ctcccatgtg
180
gtatctgacg
240
cgagtccgga
300
gtttgaaaac
360
gcgcatcacc
420
ggttggaaaa
480
cagtaattcc
540
catatccaag
600
actatga
657
<210>8 <211> 1176 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400>8
gaagacgccg
ctcaaggccg
gtgctgaccg
gaggtcccca
atgcaggacc
gtcattctgg
ggctataccc
ggcctgaagg
gagctggccg
aagcccgagc
ctcaagaaga
tttgagaacg
atgatcgacg
ggcatgaaga
tccatgcgcc
catcaggaga
gagcagtaca
tccgatctca
aaggaaaagg
gctcccgcag
tcaacgagat
tcggccagcc
tttccactga
aggagaccgt
gcaacgcccg
actttgaagg
tgacgctcgg
ccggtgaaga
gcaaggccgc
tcgacgacga
gcatcaaggc
aggctgtcgt
agcaggtcga
tggaagacta
cgatggcgga
acatcgacgt
agatggagct
agggccgcaa
aaaagaaggc
aagaggctcc
cttccccgag
ctccgttacc
gctctacccc
ttccatctcc
catcgagacc
ctttgtcgac
ctccggcgcg
gaaggccgtc
gaccttccag
gttcgccaag
cgacctcgcc
tctggccggc
caagcacctc
cgtcaagatg
gcagaccgtc
gaccgacgag
ggacaagatc
ggctgtgaag
cgccaagaaa
caaggctgag
atctacgaag
gatatgcaga
gaggtcaccc
aaggccgaag
gttgaccgcg
ggcaagccct
ttcatccccg
gaggtcacct
tgcaagatcc
gacgtctccg
aagaagcgtc
aagaacatga
gagcagtttg
atcggcggcg
cgcagcaaca
gaagtcgaag
aaggaaatga
ctgatcgtcg
tctgccaaga
gaataa
ctgccattgt
cccccgaaga
tcggcgagta
tcgacgcaga
aagccaagac
tcgacggcgg
gcttcgaaga
tccccgagag
acgaggtcaa
aatacgacac
aggaagctgt
cctgcgacat
cctatcagct
acgtcaaggg
tcctgctgag
aagagctgaa
tcgacgtcga
acaatgccaa
aggaagacga
caagcaggag
cggcagcgtc
caagggcatc
gctcggccgc
cggcgacacc
caaggccgag
tcagctcgtc
ctacaccaag
ggagaccatc
gctggccgcc
tgaccgtgac
ccccgcctgc
gcagtcccag
catgcgcgat
cgagatcgtc
gaagctggcc
ggccgtcaag
gcccgtcgag
ggctgccgaa
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1176
<210>9 <211> 1653
5
10
15
20
<212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400>9
cagcagatga
tgctccccca
ccctatatgg
gaggcgggca
aacgcgccgc
ggcatcgctg
gtggaaaagc
ctcgactgcg
atccacatct
gtgaagatcc
tgcaccgaga
cgccgcgcca
aactactgca
ggcgcgatcg
gccgcgacgg
agcccggacg
agcggcacgc
tgcgtcggct
tgcatgtaca
tacgtcttct
gccgtcgagc
ggcggcaagc
gccgacatgg
acgatgctga
cgcccggtcg
gatatccccg
tgcaaggaca
ggctgctcca
tccaggagaa gaatgcacga tccagatcgc cggaaaaggc tgaccgcggg gcatccagac agccgaccat ccgcgtgcat attcctactc gccgcaaagc agtgcccgca tctatatece gcatgctcaa actacaagca gcttcaaccc tcgtctcgag tcctgcgccc cccgctgtga cggcgaagca acatcgacgt agtacggcgt tcaaggtgca tcgtcctcgc cggcctccat aaagcccgac agacggtcgc gcctgacctg actgtgaaaa
gatccacgaa
gcagacgttc
caacatccgc
catcatcctc
cagcagcccc
ggcgctcgac
cggcggcaag
cctgaccccg
cgagatcgaa
gcgcttcgtc
gaagaaggtc
cttcgcacag
aaacggcaag
gaccgacacc
catcgacctt
cctggaattt
gtccgacggc
cggtgtggag
cgccatgctc
ccggaccccc
gcattacatc
ggcgtccgac
ggccgccatc
ggacaccaac
ggcaggcgtg
acaggcgtcc
caacccgtgc
ggtctgcccc
<210> 10 <211> 843 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 10
tacgggctga
cgcaagacct
gageagtget
ggccgggccg
gtgaccaagc
atcgccgagg
atgacccaga
aagatggtcg
tccgtgggcg
aaggaagacg
ccgaacgaat
gccgtgccga
tgcggtgtgt
tteategage
tccaaattcg
gagcgcctca
acgcacccga
aagggcaagc
tgccgcgaaa
ggcaaaaact
aagggcatgg
ctgctcgaga
gagcctgaca
gactttttca
ttcctgtccg
gccgcggcgg
gtggcgcagc
tac
ccggcgtagt
gtgaaaaagc
cctggatcca
ccatcgccaa
gggcgctcgt
ccggatttga
tcgacaagac
actgcgcaca
gcttcgtcgg
tctgcaccgg
tcaacctcgg
aggtcgcgac
gcgcaaaggt
aggaatacgg
atgaattcgc
tgaacgccgc
agaccatcgt
cctactgctc
aatacccgga
ttgacgagtt
tcggcaaggt
accggcagct
agtccgcccg
ccgaggccca
gcatgtgcca
cgaaggtcat
cggatgagat
catctgttcg
aggtctcaac
caagtacaag
ggtacatctg
catcggcggc
ggtcgatatc
cttcccgacg
gaacgagaag
caacttccac
ctgcggactt
catggacaac
catcgatccc
ctgttccgcc
cgccatcgtc
ctacagccag
gggcccgacg
cttcgtccag
caagatctgc
caccgacgtg
ctaccgcaga
cacgccggag
gcacatcgac
gccgctcgct
tccgaagctc
ggggccgaag
cggccttctg
gatgtgcaac
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1653
5
10
atctacgtgc
gttttgcgca
tttacgggcc
gccgccatca
ctcaaattct
ctcggcgtgt
atcggcctgc
gccgagatca
cagctgctgc
atctgcatcg
atccgcgatg
atggcattca
cagaccacgg
gtc
aaaaaggcct ctccctgcag tcgccttcct gctcgaccgc agggcgcgat ctattccctc tgttctccct cggacaggcg acatctcgag cggcatccgc ccctgaccga gacgctgcag tcgtttcgct gctgctggcg ccgtcctgaa gctcaagagc tccgcgcgct ggtccagctc gcggcttccc gtatttctcc ccatcgtcgt gctgctgatc atgagatcgc cgccgaggcc tcatctcctc gttctttgcc tccaggccaa cacgttcaaa
acgatcctga ccatcgcggg atcccgggcg tgcccatcat gtcgccgtct ccatgaacct ggcttcatgc tggtcggcgc tcgacggtgt atcagtacta aacgccctcg gcaatacggc ggcctgctcg ccgcggggct gactatctgg ccatcgccac gaggcgttcg cgcccgtcgc gataccttca tgccgttcgt aactcgacct acggccgcgc atgggcatca accttgccca ggcatctccg gcgcgctgct tcggccatga cgtatgagat
catcgccctc
60
gctcacgacg
120
gctcaacggc
180
ctatgccttc
240
tgatccgctg
300
gggcaccgtc
360
ggcgtacete
420
gctcggcttc
480
caacggctcg
540
gatcgtcggc
600
cttcaaggcc
660
ccacaagcgc
720
ggccatgtac
780
cctgctcatc
840
843
<210> 11 <211> 978 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 11
atgatcgtgg atattaccta ccccattgag acctggccga agcagaatga gctgacgcac 60
atcaccgagg
gcaagactcg
ggcgatttcg
cgcaacggcc
ttcttccagc
ctcgacgtcg
gacgcggaat
aagacgtcca
gcgctcaaat
gtgctgctcc
aagctccacg
ggcatggacg
atcaagggca
acggatatgc
agcgaggtca
ctgtacggca
gcatcaagca
atccccagct
tcctgcagga
gcacgtcctt
acgcgggcgc
atatcttcca
acggcacgaa
tcgacgtcgt
acaccgacta
gcggagaaga
agctgggcgt
agaacggcaa
ccgtcggcgc
cgctgccgga
gcgcgtccga
agaaataa
gtccaccggc
tccgctcgtg
gatgggaaaa
taccgcggtc
gaacgcctac
cattggctat
gatggcgcgg
ctccgaggcg
ctgcatcatc
cggcgtgctg
tgcgaagtgg
ttactatgag
gggcgacgcg
ggcgctgaag
cggcgtgaag
ggctcggtct gcctccggct tacaagaata atgtccaaca tacggcgagg atcctgctgc cttctgcacc ggcgagcgct aacgagcttg catgtggaaa gccgtcatee tttgagagcc ttctgcgcgg ctcggcgctt acgaaggatg
gcaacaccat
ttgccgggca
tcgacctttc
accagacgaa
acgacatcga
tgccgcatct
gggcgcagaa
ttgcgcggct
agacccagca
acatgaaggc
actgcccgga
tgaagctccc
gcgttctgta
gcagcgcggc
aagtcctgaa
ttcggacctc
tgacgccgag
catggtcaag
ggagcgcacc
ctgggataag
ggacgagccg
ggccgggatg
cgtgaccccg
gaccacgggc
cgcgctgcag
gatcggctgc
gaagggctat
cgcggcggag
ggcctccctc
gctgtacgag
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
978
5
10
15
20
<210> 12 <211> 567 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 12
atgacaacct
cagacgctca
tccttcggct
ctccccaagg
ttccggccca
atgctgcagc
ggcagcggcg
tgctatttct
gctgggcagg
atggtcaagc
tctccgagca
gttccctatc gtatttcagg ccctgaatgt gggctttttg 60
agctgttttt
tgtgacgctc atcggcgcga tcccgctggg tctgatcatc 120
ccatgagccg
ctggtcgccg ctgggctttc tgcgcccgta tctgaaaaat 180
acggcaagct
cacctggtgg cagaagacgc agctatggtt cgcggtcgac 240
tccgcctgat
tgtgcgtttc gtcatctggg tcgtgcgcgg cacgccgctg 300
tgctggtgtt
ctactacttc cccggccttg tgctgcacaa gaatatctgg 360
aggcagggcg
cttcctcgca tcgtcgatcg cgttcatctt caactacgcg 420
ccgagatgtt
ccgcggcggc atccagggcg tcccgaaggg gcagcaggag 480
tgctcggcat
gacgagcacg cagatcttct tcaaggtgac gctgctgcag 540
gcatcgtgcc
gcccatg 567
<210> 13 <211> 1449 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 13
5
10
gacctgaatc
ggcaagacca
acgatcggcg
cgcaaggtcg
aacatctcct
aaaaatgctg
gacgagtgcc
gacgccttta
ggggccgatc
gccgcgaagg
gtcgtcaagc
agccgcatcg
cagcagcagc
gacgaaccgc
cgcctgcacg
atgacgctcg
ccgctggagg
tccatcaact
gtcctcggtg
ttcgcagacc
cagaagggct
gtcgacgagg
ctcggcatcc
tacggcgcc
tcaaactcga
acacgtcacc aagcgctggg ccaagttcta cgctgtggaa 60
ttaccattga
gaataacgcg ttcgtcacgc tgctcggtcc ctccggctgc 120
cgacgctccg
catgatcgcg ggtctggaga ccccgacgtc gggccgcatc 180
acaaggtcgt
cttcgacagc gacctcggta tcaacgtccc ggccaacaag 240
gcttcctgtt
ccagaactat gcgctctggc ccaacatgac ggtctaccag 300
tcggcctctc
caacatcaaa gaggagctcc egaagatega cttcgaggcc 360
cgcgtctggc
tcagatcctc cagactccgt ccgatgtgac cgcggttctg 420
gcgacaagga
cggcaagctg gaagaaaaga aggccgtcct caagctcatc 480
cgctctcgca
gtacacggcg aagaagctct tcggctatca tctggagaac 540
gcgccgccgc
gatcgccgca ctgcaggcaa aggtcgacgc agcccataag 600
acgccggctg
cacgctggac gaggagttcc gcttctgcag ggacggcagc 660
agacgagaaa
gctcacgaag gaggagatcg acctctccgt ccgccgcgtc 720
tcaagattgg
catgttcatg gaccggtatg cggccgagct ctccggcggc 780
gtgtcgccat
cgcaagaacg ctcgcgccgg agcccacggt tttgttcatg 840
tgtcgaacct
cgacgcgaag ctgcggctcg agatgegeta tgagctgcag 900
tggagaccgg
ctcgaccttc gtctacgtca cgcacgacca gatggaggcc 960
ccacgcagat
ctgcctcatc aataacggcg ttctgcagca gtatgaagcg 1020
tctatcatea
cccggcgaac ctctttgtcg ccgacttcgt cggcaacccg 1080
ttgtcgaagc
caagggcaag caggcggccg acggctcgct gaccctcacg 1140
ggctgacagc
cagattccgc ccggcaaagg cgctcgagct ttccaagtgg 1200
gcgacgcagc
tgccgccaag aaagccgccg acctcaagga gaaggccgcg 1260
acgtcgaaaa
gggcaacaag gatgaggtct tccgctatca tatcgcaaag 1320
aagacgactc
ccttgcggag cttcccgaga teaegaaega agattttgtc 1380
gcccggagtt
cctcgacatc gcggacgaag ggaacctccg cggcgagatc 1440
1449
<210> 14 <211> 1020 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 14
5
10
tttggctgcg
caagggatcg
atgcacgacg
ctgaccatgc
ctgctctctg
ggcccgcaga
gcggactgca
aaggtcctcg
aagggcggcg
aagatcaact
gtcgtttccg
ttcatggcct
cttttgtgca
ggcaccgcgc
ctggccatcc
acactggcag
acaacgcccc
ggatcagatc gcgctcggtg cgatccaggc cgcgaaggac 60
aggccgtact
ggtcggccgc ggcgaggcca ttttgcaggc gctcaaggac 120
agacgcttcc
caagggcgtg gagatcgcca acgccgacga cgtcgtcgat 180
acccggcgac
ggtcgtgaaa aagaaaaagg attcctccat ggtcgtcgga 240
tcaaagaggg
cggcggcgac gcgttcgtct ccgccggctc gacgggcgca 300
cggcgacgct
gatcgtccgg cgcgtcaagg gcatccgccg cgcggccatg 360
tcccgacgaa
gaccggccgg gagtgcgtcc tcatcgactg cggtgcaacg 420
cgccggagtt
tctgctgcag tttgccttca tgggctcgta ttacgcggaa 480
ggatcgaaaa
cccgcgcgtg gcgcttctca acatcggcgc agaggactcc 540
agctgcagaa
ggccgtttac ccgctgctga agcaggcggg cgaggccggg 600
tcaccggcaa
catcgaagcg cgtgacgtgc cgctgggcgg cgcggacgtg 660
acggcttctc
cggcaatatc ctgctcaagg ggatcgaggg catggcgctt 720
ccatgatgaa
ggacatgttc aagaaaaatc tgctgaccaa gctggccgcg 780
tggacggcgt
caaggcgttc aagaagaaaa tggactaccg cgagaccggc 840
tgatcggcct
caacaagcct gtcatcaagg cgcacggctc gtccgacgcg 900
gcaacgccat
ccggcaggcc atcggcgccg tcgaggcgga tgtcgccggg 960
caaatatcga
ccatatggtc gttccaaagg agtatcaaca tgctgagtga 1020
<210> 15 <211> 1347 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 15 atggcgaccc
ggctactatt
ggcgaggatc
cagatgctgc
gagaagttcg
ctgaacgact
gtcttccgta ttccgatttt gccgatatcc cggtggaatg ctggggcggc gctacgttcg cctggcagag actgcgcgac atccgcaagg ttcgcggcca gaacctgctc ggctacaagc tcgagctgtc catcaagaac ggcatcgaca tccgcaacat cgccaccgcg ctggaagcta
tgccggaaat
gaacaaggcc 60
actcctgcct
gcgttacctg 120
ccatgcccga
caccaagctg 180
actatcatga
cgacgtcgtc 240
tcctgcgtat
ctttgacgca 300
ccaagaaata
cgcgaccaag 360
5
10
aacaccgtcg
tatgtcgaga
atggccggca
gtcggcgatg
gtgacgaagg
aacggcacca
gagactggcc
cagaagtacg
ctggtctaca
aaggccatgg
ggctatcccc
gtcctgatgg
cagtacggca
ggcggcaagc
aaagccaagg
tgctatccgg
tgcacctacg
cctccggctg tatctcctac tgtgcaagga gctcaagaac ccatgagccc gtacgaggcc ttcccctcat cctgcacacc ccatcgagtc cggcatcgac gccagccctc caccgagacc tcaatgagga cgtcatcaac tcgattccgg ccgcatcagc aggtcccggg cggcatgctc ataagttcga cgccgcgctc cgctggtcac cccgctgagc gcgagcgcta caagatcgtc tcgcgcccgc gcctgtctct ccgtcgactg ccgcatcgaa aagccctcgg cgatctggcg atcaggccat gaagttcttc tcatcgaaga agcataa
acccagagcc cggtccacac atgggcttcg acaccatctg gagcacctca tcaagggcat cactgcacca ccggcatggc gtgatcgact gcgcgacctc atgttctacg ccctcggcca aaggtcaacg actacttcaa gccaagtcca tggcgaccga tccaacatga tcgccaacct aaggagatcc ccgaagtccg cagatggtcg gcaaccaggc tccaaggaag tgcagaacta gaagagctgc aggccaagat gacgccaagc gcaccggcga aagagcgaag aggatgtcat gaagaccgca aggccaagga
ggtcgaaata
420
cctgaaggat
480
caaggacgcc
540
ttacatgacc
600
ctgcttctcc
660
gtacggcatc
720
gcccatcaag
780
cgcgcaggcg
840
gaccgacatg
900
caaggatctg
960
cgttaccaac
1020
tttcaagggc
1080
cctcggcgag
1140
agacttcaag
1200
gagctacate
1260
agaaaacgtc
1320
1347
<210> 16 <211> 1329 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 16
ctgcgtctgc
acttatatag
gagcagggca
gcgcgctatg
tccgacctgc
ctgctggagt
tacgccgaaa
gcggccatct
gcgatggggc
ctgcgcgaga
gcggcacgcg
cggaaaagcg ctgaaaacaa aggagcacgg aacagtgaac 60
taaagggaga
tatetgette agccggagca tggatgagat cgtctgtctg 120
gcatcgttgt
ggaaaacggc cgcatcaccg gcgtctttca gacgctgccg 180
ccgcgctgcc
ggtgctcgat tacggccatc ggctgatcct gcccggtatg 240
atgtccacgc
gccgcagttc gccttccgcg ggctcggcat ggatatggag 300
ggctcaacac
ctataccttc ccggaggaat ccaaatacaa ggacctggac 360
gggcgtatgg
cagcttcgcc tcgcatctgc tgcgcagcac gaccacgcgc 420
tcgccaccat
ccatgtgccc gcgacggagc ttctcatgca gaagctggac 480
tggaatgctt
cgtgggcaag gtcaatatga accgcaactc gccggtctac 540
tctccaccaa
ccaggccctg cgcgccaccg agcgctgcat ctgcgagacg 600
10
15
atgcccatgt
caggcccatc ctgaccccgc gcttcatccc gtcgtgcacg 660
tgttcgggct
ggcgcggctg cgggtgaaat acgacctgcc ggtgcagagc 720
aaaactattc
ggagatcgcc tggatccgcg agctgtgccc gcgctcgaag 780
acgcgtatga
gcagttcggc atgttcggcg gcggatatcc gtgcatcatg 840
tccactcgaa
cgaggacgag caggcgctga tgcagaaaaa cggcgtgttc 900
cgccggaatc
gaacatgaac ctcgcctccg gcgtcgcgcc gatcaataaa 960
acggtctgca
ggtcggcctt gcgacggata tcgccggcgg cagccacgag 1020
gcgccatgac
ccacgccatc caggcctcga agctccgctg gcggctgtat 1080
tgaagcccct
gtcgtttgac cgcgcgttct atcttgccac catgggcggc 1140
tcggcaaggt
cggctcgttc ctggacggct acgaatttga cgccgtcgtg 1200
cggcgctgga
ccatccgcag gagctttcgg tccgcgcccg gctcgagcgc 1260
tggccgacga
ccggaacctc acggccaaat ttgtcgcggg gcagaaaatt 1320
1329
ctcggttga
<210> 17 <211> 882 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 17

atgaagaaaa aacgctattt ttcccgcacg gtctgctttc tgctctgcgc ggtgttcgcg 60

ctgttgtttt tgctgccgac ggttctgacc atcacgaact ccttcatgac gcagagcgag 120

atcacggcca gctacggcca ggtctttgaa aacgccaacg acggcaagag ctacatctcc 180

aagaccattg aactcaaatt catccccgac aaggtcagct tcacccagta tttcaccgtc 240

ctgctcaaaa gcccggacta tctgctgaaa ttctggaact ccgtcatcct gaccgcgccg 300

atcgtcttcg cgcagctcat ggtcgcgtcc atcgcggcct atggctttac ccgctggcgc 360

gggaaggtgc gcgacagtct gttcttcttc tatgtgatcc tgatgctcat gccgtatcag 420

gtcacgctgg tccccaacta tctggtgagc gactggctga agatcctcaa tacccggtgg 480

gcgatcttcc tgcccggcgc gtttgcgccg ttctcggtct ttctgctcac caaattcatg 540

cgccgcatcc ccatggctgt catcgaatcg gccaagatcg acggcgcgaa cgagtggcat 600

atcttctgga acatctgcct gccgcagtgc cggagcgccc tctattccat tgcgatcctg 660

gtgttcatcg acaactggaa catggtcgaa cagccgctga tcctgctcaa cgacgtggag 720

aagcagccgc tttcgatgtt cctgtccagc atcaacgccg gcgagatcgg catcgccttt 780

gccgccgccg tcatctatat gatccccggt ctgctgctgt ttctgcacgg cgaggcgtat 840

ctggtggaag gcatcgcaca ttctggctct gtgaaaggat aa 882
<210> 18 <211> 1347 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
5
5
10
<400> 18 atgacccaca
catatgctct
gagctcgtca
aacattctcg
ggctgtcttg
gtgcttggca
aaacgctaca
accacgccgg
tactgcatca
aaggaggcgg
accagccgct
ctgtgccgga
tcacaggagc
ccgatccagc
tacgtcaagg
agccttatca
ttgaaggaat
cgcgcggcag
gccgagatcc
caggtcctgt
gactcgccgg
gactttgccg
gaagaataca
cgataggcat gatctcgctt ggctgctgcg gcaggcaggg tcgtcaacac ctgcggcttt ccatggcgca gctcaaggcg cgcagcgcta tcaggaggag ccggctccta ctttgacgtt agcgcttcga cgatatcaat agtattatgc ctatctgaag tcccgaagct gcgcggcaag agcagcttgc ggccgacggc acggtctcga tctctacggc tcgacgggct tgtctggatc tgattgacgt gctggcgaac acatcaacga cgatatcctc agctgttcgc caagctccgc ccggccttcc cggcgagggc acaagctcga gcgcgtcggt agatggaata tcctgatacc agtcccgcat catggacgat gcgagggcta cgatcccgat atattgacgg gaagatctgg acgtccgtgt ggtggacgcc atgacgactg cgagtaa
ggctgcgcca aaaatcaggt tatgagatca gccccgaccc atcgagtccg caaagaccga gagggccgga tccagaagat attctgcagg aaatgccgga gccaacgcgg tcgggcaggt gcagaccagt cggaggatgg atcgccgagg gctgcgacaa ctgcgcagcc gcccgatcga gtcaaggagc tgatcgtcgt gagcggaagc tcgcggagct cgcgtgcact atctctatcc gagccgaaga tcgtcaagta cgccgcatga accgccgcgg cgcgagatcc caggccttgt gaggcggaat ttgcccagct gcgtttgcgt tctccccgga gagatcgccc ggcagcgcgc tacaacgaat cgtgcatcgg gaagagagct attacggccg ttcacggcgg aaaaacatat tatgacggtg agcttgtcgg
caatgccgag
60
cgacggtgcg
120
ggccatcgac
180
cctggtcacc
240
ggtcgacggc
300
gctgagcggc
360
ccgtatcctg
420
ccactgtgcc
480
ggagctcgtc
540
cgcgcaggat
600
gctgcggcag
660
ggatgagatg
720
tctggatatc
780
caacggcgaa
840
gctccgcacg
900
ctgtgacttt
960
ggagggcacg
1020
ggacatggtc
1080
caagaccatg
1140
gacctttgcc
1200
caagaccggt
1260
tgtgctggag
1320
1347
<210> 19 <211> 1383 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 19
5
10
taa
ccctcggccg
caccatcctc cagctctacc atcagaccta cggccgcacg 60
gaagatcgct
ggacgatctg gcgccgaagt acgtcatcga caccgtcaaa 120
cacgccgggc
caagctccac gagctggagc agaagcgcga taagctcgag 180
ccaagctctc
cgaaacggag cagtatgcca agcacaccga gctcgacacc 240
tggccgagga
cgcgctgctc gacatcacaa agatcgtcgg cggcttcctc 300
atctcgatcc
cgtgatcgcg gcctattcca aggactacgg catcgcgcgc 360
cgctcgagga
aaggcggcag gcgctgcagg tcgacgtcga cgacgcgcag 420
agaccgccga
agaggcgggc aagtccgaaa agtccggcca gctcgaaaag 480
agctcaagca
gtgtgacgat cagatcgccg cgctgcggca gcagctggac 540
aggagatcga
ggcgctgcgc cagccgtatg ccagcgatcc cgaattccag 600
cctaccgcga
cgacggtatc gaccttgccc gactggagta caacgagatg 660
gcagcgatat
gcagctcatt ttccaggatc cgtattcctc gctgaacccg 720
tcggccagat
catcagcgag ggcatgcagg cgcacaacat gatcaagaaa 780
gtatgcagca
gctcgtcctg aacatcatgg acgaatgcgg cctcgcaccg 840
accgcttccc
gcaccagttc tccggcggcc agcggcagcg catcggcatc 900
tcgccacgaa
cccgaagttc gtcgtctgcg acgaggctgt ttccgcgctg 960
ttcaggccca
gatcatcaac ctgctgctcg acctcaagga gcaccagaac 1020
tgttcatcac
gcacgacctg tccgtcgtca agtacatctc cgaccgcgtc 1080
acctcggcaa
catggtcgag ctggcggagg ccgacgagat cttccaccac 1140
cgtacaccga
ggccctgctc aacgccatcc cgacgacgga taccgtcggc 1200
tctccatcct
cgaaggcgat atccccagcc cggtcaaccc gccgaagggc 1260
acacgcgctg
caagtactgc acagagatct gcacgcaggt cgtcccggcg 1320
tccggccgaa
ccatttcgtc gcctgccatc ataagctcga agtcaaggag 1380
1383
<210> 20 <211> 1194 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 20
5
10
15
gcctacggcg
ggcaatcctt
accgtcccgg
gcgaagatgg
tatatgacct
ggcgacgagg
gcgggcggca
gccttctccg
ccttccggtg
aaatcagccg
gcctatgacg
tattccttca
ccggagctga
ggctatatca
gcggatatct
ggctatacct
gacgcgaccg
gaattcggct
cgcagcctcc
aaaaaatggt
cgcctggggc agccagggct gcgtcatccg ggatctcgcc 60
agcagcgcgc
cgccgtcgtc ggcgcggaaa acgtgttcaa ctttaccatc 120
ccgtcccggc
gccgtcctgc gtccggcaga cgatcgagca cctgctgcag 180
ccgagcagct
gcacgcctat acggccgcgc cgggccttgc gtccgtccgc 240
cggcgtatct
cgagaagacg ttcggcgtcg gctaccgcgc ggaggacgtg 300
ccggcgcatc
ctcggcgctg gcgatgctgg cctatgcgct gctctcgccg 360
tgctgacgct
cagcccgtat ttctcggagt acaagctcta cgccgaggcc 420
cgctcacggc
cgtgccctcg aacccggagg atttccagat cgatctggac 480
ctgccatcag
cgagaagacc gccgtcgtcc tcctgaactc cccgaacaac 540
tcatcctctc
ccgccggagc atcacaaagc tggcggagct gctggagaaa 600
aatacggcca
ccgcatctac atcgtcgccg acgagcccta ccgcgagctg 660
gcgaggaggt
gccgttcatc cccgccatct acaaggacac catctactgc 720
gcaagaccct
ctcgctgccc ggtgagcgca tcggcttcct ggccatccat 780
ccgactacgc
gcgcgtccgc gcggccatct acggcgcggg ccgggcgctc 840
acgccagcac
gatgttccag ctcgtagcgg cggaatgcgt cgggcagacg 900
ccgtctacaa
gcagaaccgg gatctgatcc atacggcgct tctggatatg 960
gcgtgaagcc
ttcgggcgcg ttctatcttt tcctcaaaac gccggagccg 1020
cgttctgcaa
aaaggcgatg gcgctcgacc tgctggtcgt gccgggcgac 1080
gcccgggcta
cgtccgcctg gcctactgcg tccccaaaac catgctcgag 1140
cccgcttccg
ccagctcgcc gaccaatacg gcctcaaaaa ataa 1194
<210> 21 <211> 498 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 21
gcctatgaca accggccgct tacgtctccg ccacgcccgc gtgatccggc ccacgggcct atcgacgatc tcatcggcga acgacgctga cgaagaagat cgcgtgcgct acatgcactc ctgcgcatgg cgaagttcga ctgcccgagg tctcgctcat gagacgagcc tcatccag
caccttcgac gaatttacag ggactatgag cgcagccgcg tctcgacccc gaggtcttcg gatcaacgcc acgaccgaca ggccgaggat ctgaccaaat ggacatcggc gcgatggaac tgtactggtc ggcatcaacc cgccattctt gacgcagaca
accgcatcca tcaggccatc ccgggcagat cgccgagcag tgcgccccat tgaggggcag agggcgagcg cacgctcgtc atctgaccga aaacggcatc gcatggagat catccgcgat tgctgcgcga ggggctcgac aggaggggtt cctgcgctcc
60
120
180
240
300
360
420
480
<210> 22 <211> 1932 <212> ADN <213> Desconocida
5
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 22
gaccacggcg
aagcccatcg
ggcgtcgaca
aatctcagct
gatatggagc
gggcgcatcc
gagtatgccg
ccggagcagc
ctcgtcgtga
ctgctctgca
gaggaattct
gcgtttgaca
tatttcctgc
ctctgccgcg
ctcgactacg
tgggatttcg
gccgcgggct
gggctttatt
gacttcggtg
gaccatgtcg
gtcggccgcg
ccgacgccgc
tacgactctg
ccgcgcaaca
tatgtgccgc
gaggagctcg
gatgccatcc
aacgacccca
gaatcgaccg
tccatcatcg
tgcaagcagg
gtcacctacg
gggtattcgc
tcatgtacgg
tcggctgcga
aagaacccta
atatggtctc
tgctgcgcga
cgcagtcgat
aagttttcgg
ggaccgtcaa
cgaacgacgc
tccagaccgg
atctcaagag
atacagtaaa
cggaattcaa
agggctttga
agatcgacat
tgcgctttgc
cgatggtcac
tcgagcgttt
acacccggcg
cacagatcgt
tgatgaactt
acatgacgct
acgaacgggt
cctcgacgca
tggcgacgaa
ggctcctcaa
gcgatatccg
aggtcatgga
gcatgacggg
tcgccgccta
atccgtcgct
gctgcatcct
te
<210> 23 <211> 1323 <212> ADN <213> Desconocida
cacgatcgac
ggtctatgtc
ccatctcgtc
gctcggcttc
gcatcacgag
catgcaggac
gccggaccat
cgcacagatc
acactatctg
caagaccgcc
cgaagaggag
aattgcggag
gctcccggag
cgagctctac
gategagaag
caaatcggcc
ctactgcctg
cctcaacccg
cgccgaggtc
caccttcggt
cacctacgcc
ggcggacgcg
cagggaactg
cgccgcgggc
cgacggcacg
aatggacttc
taagaccgag
catgctcacg
cgtgtgcatg
ccggccgggc
cgtcaaatac
ctatcaggag
ttttaccgcg
gcccgccgca
ctcctgtgtg
acggagggct
ggcctgatcg
gacctgcagg
ttttatctgg
cgcaagctcg
cgcaagtcgg
gacgacccga
ctgcgcgagc
cgctgcaatg
ggcgtgacga
gggacagagc
atgggcttta
gggatcccgg
catatcaccg
gcgcgcgtga
gtcgactacg
accatggctg
gagacggacg
ctgaagcagt
gtcgacacgg
gtggtcatca
atcgttaccg
ctcggcctgc
ccggacttct
cagggccgga
ggcctgaagc
ccgatggaat
aagcacccga
caggtcatcg
cagcaaagaa
cgcgcttcga
aaaacgagac
tttataaccg
ccctgtccgc
ccgccgagca
agctgcagga
ccgaaaaact
acgcgaaaat
accgcatgaa
tgttcccgga
tggagtttac
gcctttcgta
acccggaata
ccgattactt
tcggccccgg
agatcgaccc
cgatgcccga
tccggcgcaa
cgcgcggctc
cggtggccaa
cgccgcagct
caaaggccat
ccaagctccc
aatacaccat
gcaacatcac
ccatggcccg
ccgccggtgt
cgcagtcgat
cgatcccgcg
tgctgcagcc
agatcttccg
ggccgggatc
caaggtccac
cggctaccgc
cccgcgcgtg
ctgtctggct
ggcggcgcgc
tcacggcatc
gtctctgccg
gcaggacgtg
atttgagacg
tgtgccggag
gttcggcaag
tettaageag
tatgeageag
cctcatcgtg
gcgcggcagc
catgaaatac
tategatatg
atacggcgag
catccgcgac
gctcgtgccg
gcggcagatg
cgagggcatg
ggtctatgac
gacgacgctg
cgtcatcgac
cgtcaccgac
gttccagatg
cgaagatctg
cctgatcgcc
catcctctcc
caagcttgcc
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1932
5
10
15
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 23
atgcaggcgc agcggatgac ggagcccggc gcggattctg tgagcatgct gcacgtgctg gtagaagccg cgcacttcaa ccatcacctg tttgtccggc agctgtgcgc ctcgctcggc caggcgcggg cggcgcagac gcatgaatct gcgttctttg acacactccc cggccttgtc gagactgtgc tcctgaacct cacgcgcggg ccgaagcgcg gacggctcat ccggccgatg tgtcttgctg agcacggatt ttcttatgtg cggcgcaacc ggctgcgcca gcgcgtgatc gcacagaccg tcttccggac ctgcgcgctg cgggcgcgcg aggcgctgca ggctgctcaa tccgcttggc cggaggctgt gcgcacccgc gcgcccaatc tgacgcagcg gcatatcgat ccctccgctt ctgtctcgct gccgggcggc tacctgacgg accgctcccc tgccgcttcc acagtgctga tcccggcgct cgggctgcgc gaaaaagcaa aaaccctctc cacttttgca cggatcacga tccgtccgcg tcaggcgcat tcgctcaaaa agctgctgat cgaccgcaag gtggccgctg acgcatccgg tgttctgggc gccgcggctc cgggcgaacg cgcggtcatc tag
<210> 24 <211> 1836 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 24
gatacggtcg tatgcgcagt gtcgggcggc ctgtcactgc aggacacgct cgacatccgg cgcggcgcgg aatccgaccg cgacgaggcc gtgccgctgc acacgggcgg cggcgacgtg ctggaagagg ctgcgcgcaa gctccgctac gccacggcgc acacgcagga cgacaatctc accggccttg ccgggctgac cggcatcccg ctggtctgca cgcgggcgca gatcgaggcg accgacagca ccaatctcct gccggacgcc ccgcttctgc gggaggaaaa ccccgccgtc ctccgtaagg atgacgcata tcttgatacg ttgccggacg gtgtcagccg cagtgcactt gcagtccggc tgctgctcga gtcgatccat gcggtcgacc ggctgctgtt cgcttcgtgc tttgccgcgc ggctggaata tgacaggctg ttttcacccg tgacactttc gccgggcgag gtcgaatgcc ggatcgaaga aaattttcag gtcaaatatg ataccataga gcaaactccc gacgtcatgc gcacggcagg cggcacgaaa gtccccgcag cacgacgtgc gctcatgccg gtttatggga tcggcgtcga tctgggccgc atcacaatcg aagaaacaga gaaagaggat
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1323
5
gcgccggagg
ctctcgaagg
ctgatctact
atcggcatct
gacatcgacc
catccggagg
ctgctgttcg
ctgctggccg
gtgctgtatt
cgtgtgctct
taccccgcgg
gagccggtcg
tcgatcgcgg
gcgcccgcca
cgcaggtgcg
gccgtgaccg
agccagaaat
ccgggtcccg
cgcaaggagg
ctcacgacgc
agcgtgacgg
aaggtgccgc
gggctgttcc
ccgcggctgg
ctggagaacg
tcggccgtgc
gacctggtgg
ccggacgcga
gcgccgcaca
aacatccgcg
cccgtcaagg
accgcttccc
ggtatccggc
gcctgtgcct
cgccgtggac
cctccatgac
acccgctgtg
tgggcgggga
cgggctgccg
atctcaatga
ccccggcccg
ccaagcggcg
acgtgcaggt
tgcggctgcg
tcgaggagga
cgttccgcgt
acggcacggg
acggcatcca
aggagctgga
ccaccgccta
tgatgctgcc
agttcatcgc
ggcggatgcg
cgagcaggac
gcgactattc
acgcgcggat
tgcgggcgat
gcgaatgcaa
tggcgccgta
actgcggcgt
agccggagct
tcgagagcaa
ggccgcgctg
caaccagatc
gcggctcaag
cgatctgacc
gccggagctg
ttcgccgctg
cgaggtcatg
gagcaggctc
gaatatgtcg
gaagctgcgg
caactggacg
gctgcgcgcg
ccggggcgtg
caagagctac
gctggtgtat
cggcctcatc
gatcccggcg
ggacagcttc
tcagctctcc
ggtggacgcc
ggccgtcatg
ccgccggccc
gcttcggaac
gctcgcggag
gatggccgcc
gccgctgttt
atcgtgcctg
tgtcgcgcgg
cgtcagctgg
ggaatcccat
ccagcgctgg
<210> 25 <211> 1359 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
gatgatgcgc
ctgctgtgcg
cagcggaagc
ggctccggcc
ctgcagtttt
ttcggcgatc
ctcgacgaca
atcgtcgcgc
gatttcgaca
tggatgcggc
aactacttcc
gcgctggacg
ttctggtatt
ccgctcgtcc
aagaaccggc
ttcctcaaga
gagcgcggcg
ctgcactatg
ggcacgccgg
gtaaaggcca
atgaaggcca
gtcaaggtcc
ttcgcgtcct
atctgcaaga
aagatcgcca
atcaaaaata
tgcctgtcca
atggatttca
gacggcacga
ttttaccgtg
acgtga
tcgtcagcta
gcgagtctgc
tgccgctgcc
agtcctatat
acgcggcgtg
tgacgggctt
cgcgggtgct
cggagcgctg
cgatcaacca
tggacaacgc
gcctctccgc
ttacggtgcg
atctcgagga
acgtgccgtt
tggccgtgga
cgctgacggc
tgctcggccg
ccggtaacgt
agccggacgg
aggcgaaaga
tcagcgacct
tgctgccggt
acgtgacgcc
tcgtgcgcta
cgaacgtcgc
tcgccatgaa
atctcgggct
tcatcggcgt
tgtatatcaa
tcctgcacac
tcagtatctg
gggcggcgga
atgcgggctg
cgacacccgc
ctataccgac
tccgccgtcg
gcacgaaaag
gcacgcgtat
gtttatgacg
cgcgaagatc
cacgctgaca
gcgcttcccg
gatcagcaag
cgacgacgtg
gtttttccac
ggaatatctg
gctggaggat
caccgccagc
ctttctggat
gtttggcgtc
gcagaccgag
caacctgcgc
ggagatcgac
ccgcatgggt
gagcgaacgc
ggccgttttc
ggtacagctg
acaggcaaag
catgatccgc
gctggggctg
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1836
5
10
gccgcggcaa tgtcgctggt cctgtccggc
acgctcccta agcactctga tgaatataac
tccagccaga acgcgtccta cgccgcgccg
ctggccgatc tggacggcga cgggacggaa
gacaagccgc tcaaggcctg catcttttcc
gtgatcgagg gcgacggtac cagctttgcg
cccggtgttg agctggtcat cgggcggcag
gcgtattcgt acaccggcgg gcacgtggtc
cgctgcgtcg atctcgacga agacgggcgg
gagcagccgc agggcgtggc cgagctctac
ccggaggcgt atctgacggc cggcgcgtcg
atggaagatg tcccggctgt ctttgtggcg
gacgtgtttg ccttccggga cggcgtgttc
gcgctttcca ccgtgcgcag ctattacgtc
atcgagctgc cgcagatcct tccgctgccg
gtcatcagat ggtataattt agacctgcag
cacagctttt ccggcggctg gttcttatcc
atcacccgca gcgaagaggt cggcggtgtc
gagacgcaca cggagctgat cttcaccatc
ctcgcttcgt ctgacggccg gttcctcctt
cagcttgcag cagggaagtg ggcaggcgag
cactttattc atattgactg gaattcggga
<210> 26 <211> 1101 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida <400> 26
cggatgaaac ggatgctgct ggccgtgctg tgctttgtca agaccgtcga cgagctgtac cggctggaac aggccatcga tcaggtcatg gtctccggca tgaaccagca gtcggtccag gaggcggtcg ctttcctgaa aacgacgggc cgcgtcgatg aggattatca gctcatggac agcgtggaat acgtgccgct gaccggcggc ctttccacgg acgtgctgca gtcgctgtgc gagctgctga gcacgaatta ctcggaatac acggatctgt tcgtcctccg ctttgacgcg cgctggcagg gcgaccagat ggagcgcgag ccggtcaagc gcattgtgtc cggtgatctg agcgcctatg aagagaacgg gcttgcgacc cgcaacatta ccgctgccga cccgggcagc tacgccaccg atgtggacag cgacggactc tcggctgcgg gctcggagga gaactacagc ggccgcagca caccgaagat gacgacctat ctgccggacc ggtggcagaa ccggctctgc cgcggctacg tcttctccga gtggaaggat tatgccttct ccggcgacga ccgggcgcag gccgagaagg gcgatatcac atacgcagcg ctttccgagc agacgctcag aggcatgttc gagacgtga
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1359
5
10
taggaattct
cagcgagacc tttgctcgct ccggctttgc taatctcagc 60
gcgtcatgct
gctcatttcc tttgtgctgc tgtactgcgc cattgtaaag 120
cgctgctgct
gctgcccatc gcttttggta tgatgctggc caacctgcct 180
ttatgaccga
tgccaccgaa gccgccaccc ttgcggtaaa gaatgcttcg 240
ccgccgatcc
taccaaccca acgcttgtct cggaactggc tgctgcccag 300
ccaatgttca
ctggtatgat tccggcgttc tgcgtatcat ccaccgcggc 360
ccatcttccc
ctgcctcatc ttcatgggcg taggcgcgat gaccgacttt 420
tggccaaccc
catctccctg ctgctcggcg ctgccgctca gctgggtatc 480
tcatcttcgc
caatgccatc accgtcggcg gcgagcacct gttcacggct 540
cttccatcgg
tatcatcggc ggcgcggatg gtcctaccgc tatctttgtt 600
tggctcccga
gctgctctct gccatcgcag tagctgccta ctcctacatg 660
cgctcatcca
gccccccatc atgaaggctc ttaccaccaa gaaagagcgc 720
tgggccagct
gcgcaaggtt tccaaggcgg agaaggtcat cttccccatt 780
gcgttgttat
catgctcatc cccgataccg cttctctgat cggctgcctg 840
acctgttccg
tgaggccggc tgcgttgagc gtctttccga caccgcgcag 900
gcaacatcgt
taccatcatg ctgggtacca ccgttggcgc taccgccgat 960
tcctttccct
gcagaccatt ggtatcgtcg taatgggtct ggctgccttc 1020
ccgctggtgg
tgtactgctg ggcaagctgc tgtgcctgct caccggcggc 1080
ctctgatcgg
t 1101
<210> 27 <211>1281 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 27
5
10
ataccgacaa
tgcgctgcgg cgcagcgtga tctatgaagt atatgtacgc 60
cggaggggac
ctttaaggcg atagagcctg acctggaccg gatagcggca 120
atattgtatg
gttcatgccc attcacccta ttggggggct gaacaaaaaa 180
gctgccccta
tgccaaccgg gactatcgca ccgtgaaccc ggaatacggc 240
attttctgca
cctggtggag gagatccata agcggggtat gaagtgcatc 300
tgtataacca
cacctcgccc gattccacac tggtggcgga gcatccggac 360
ataagccgga
tggctgccgc ggcaacaagg tgggcgactg gaccgatgtg 420
actatgaaaa
ccgcgcgctg tggcagtatc agattgattc gctgtgctac 480
atgtggatgg
cttccgttgc gatgtagcca gcaccgtgcc ggtggccttt 540
cccgccgggc
tgtggagcag atccggccgg gggccatctg gctgggagaa 600
tggcgcacat
tcaggccttc cgggagatgg gcttctatgc cgcgaccgat 660
tcacggcttt
cgatatccta tacccctacg acctgtggcc gctgtatgag 720
agggacggct
gccgctttcc cggtggtttg atgccgtgga ttaccaggag 780
agagcggata
caataagctg cgctgcctgg aaaaccatga taccagccgc 840
gcttcccgga
gcggaagaag ctgctggcct ggacagcgct gaattacttt 900
ccatactact
gtacgctggg caggaggtat gtgaaaagca cacgccctcc 960
aggagccggt
ggactggaac agcggagagg atatcagcgg ttatctggcc 1020
ccatcaagaa
gaagctgccc accgatgagc tgttccgcat tggggcggat 1080
gcatagtgac
cgccagctat atcgggccag ccacacgggc tgtgggcggc 1140
agggcaacgg
cggcaccgtg gccgtacccc tgccggatgg cgcctacacc 1200
gtggcaaagc
agtaacagta gccgatggca tgctgaccat cggggaagaa 1260
tattgggata
a 1281
<210> 28 <211> 1131 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 28
5
10
ggtacggtgc
atttccgctt
ctgcatctgc
ggttggcagg
ctacggcata
tttatgggac
gcatttgatg
cggacgaccc
gatactgtga
attcgggtgc
ggcctggcag
tttgccccga
gaatcggtac
catggccatc
gatgaccgcc
tacttgcgcc
aacctgtggt
tttgagagct
tgaaactgac
agaaggagca gcccggcggg gagcgcttac caccgtacat 60
agacgccggc
ctttatgaat gtggcgacgg cggctgccat caagggcggt 120
atgacctgaa
ggagctgaag tgccaggtgg tgctgtgcaa tacctatcac 180
gacctggtga
taatgtggtg cgtcagctgg gagggctgca caggtttacc 240
gacccatcct
gaccgacagc ggcgggttcc aggtgttttc gcttgcatcg 300
tcgaggaaaa
gggagtgacc tttgcctccc atategatgg acatcgtatt 360
cagaggagag
catgcagatc cagtcgcatt tgggttctac cattgcaatg 420
aatgtatcga
aaacccatcg ccccgggatt atgtgcagaa atcggtagca 480
gatggttgga
gcgctgccaa aaggaaatgg cccggctgaa cagcctggag 540
atccacacca
gctactgttt ggcatcaacc agggcagcac ctatgaggat 600
agcacatgaa
ggatattgct gcgatgggac tggacggcta tgccatcggt 660
tgggcgagag
cgccgaagag atgtatcata tcattgaggc tgtggagccc 720
aggataagat
ccgttaccta atgggtgttg gtacacctgt gaatatcttg 780
accggggtgt
agatcttttt gactgtgtga tgccaagccg caatgcccga 840
tttttacctg
ggaagggatc attaatatcc aaaatgctaa gtatgtaacg 900
cggtggatgc
cctttgcggg tgcccactgt gccgtaacca tacccgcgcc 960
acctgatgcg
tgccaatgaa atgcttggta tgcggctggc tgtgatgcat 1020
tctataatac
actgatggaa aagataaggt tagcactgga tgagggacgg 1080
tttaccgcga
gcatgtgcca atactgggta atagaatata a 1131
<210> 29 <211>1251 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 29 atgaaaaaag
gtttccaccg
atgcagtcca
gaccagaact
accgtccccg
acctacaagt
gatatcatea
catttgcact ggcactggct ggaaccagac tggctacccc tcgtgcccgg acagtctatc ggggcaagac caacggcagc taggcagcga tctcatcgcc atgtggtgac caccaaggcc tttccggcgt aaaggtcacc
gtgctgatgg tgtgcaccat ggcggcacct ccgcggccga gtattcacee aggaagagct tttgacccca agaagaatac agccagggct gggtacggac aatgagacct ctgtactgga gtttacggtg tttccgctcc
ggcgtttgcg
60
taacacctac
120
gggcctgact
180
cgttaccctg
240
cgatgagacc
300
taacaatgcc
360
ggcgctgaat
420
5
10
gtgagctatg gagctggcga agcgaggacc gccgtatttg tatactgtaa tccgtcaccg aagatctact aacgacaacc caggtcatea gcctacatgg actggtctgc ctgaccgcga ggcggcagcc gggggtatca
tgaaggatgt
aaacggcgtg accaactata cctatgttac cagctttgat 480
gcttctccgc
caaggagccg ggcgacaact tctgccccat gaacgccaag 540
acatcctggc
catgtgcttc gactacggcc gcaaggctga tgaggccgac 600
gcgcgggcgg
actgaatgtc gccaacatgg ataagaccgg taaaatcctg 660
aggccgccac
cgtagatggc cagtacatca ccagcggcag ctggaaccag 720
aggataacgg
cggcaaggtc actgtttctg tcccgctgaa ggccggcgac 780
ttggcaccgt
gaattacacc accctttccc ccgccgccca gaaggcgctg 840
taaccaaggc
cggcgcttcc atcaaggctt cctacggcta cggcgctgag 900
tcaaccgccc
ggcggagatc accgtggacg gcatggccaa gggctacaat 960
tccgcgagga
cggctccctg cagagcctga gcgccaagtt taatgagggc 1020
tgagctttgg
cggcaccctg accggcccgg tcatcgtgac cgataaggca 1080
ccaccaccag
caatagcggc aacagcggct ccaatggctc caacagcaat 1140
agaatcctgc
caccggtgcc aatgacatcg taggcgtagc ggccgctctg 1200
ccggcgtttc
cgccgccgcc atttccctga agaaggacta a 1251
<210> 30 <211> 1551 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 30
atgttaggtt
ctcatcggtg
ggcggccgca
agctacctgc
tggacctgca
ctgcggcgct
tatggcgata
atcccctata
gtggattacc
ggcggtttta
ctgatcgttg
aatgccgagg
ggcgcggctt
ctcaagtagt
cattctgata accatagcgg tatacctgat tgccatggtg 60
tatactttgg
caaaaagggc agcggcaaca gcagcgatga cttttacctg 120
agatgggccc
gctggtgacg gccatgagcg ctgaggccag cgatatgagc 180
tgatgggtct
gccgggactg gcatacctgt gcggcctgcc ggaggtttcc 240
tcgggctggc
gataggcacc tacctcaact ggcttatcgt agcgcggcgg 300
attcggcccg
cattggggcc atcaccgtgc cggacttttt ctcccgccgg 360
agaaaaacct
gctttccgcc attgcggcgg tggtaatcct ggttttcttt 420
ccgcttccgg
ctttaaggcc atcggtacgc tgttcaacag cctgtttggg 480
ataccgcgat
gatcgtgggc gctattgtag tcattggcta tacagtgctg 540
tggcggtttc
cttcaccgac ctgatccagt ccatctttat gaccattgcg 600
tagtggtgtt
tggcatccaa caggcgggcg gtgtggatac cgtcattgcc 660
cgctgcccgg
ctacttgagc atgaccaagg gctatgatgt gactaccggc 720
ccttcggggg
gctcagcatt atctccacgc tggcgtgggg tctgggctac 780
5
10
tttggtatgc gattcccgtc ggtgtgattg gatgeagaga gccattgtgg agccagctgc atcaagctga gccatcggta gcctgggcag cgcagcaaca tggaagtacc tttgtggtgg gaaattgtag
ctcacatcct
gctgcgcttt atggctatca aggaggaaaa gaagcttaac 840
ggatcgcgac
cgtctgggtg gtgatctcga tgttcattgc ggtggctatt 900
gttatagcgt
ttcggtggcg ggcaaggtgc ccttcctgac caacagcagc 960
cgatcatcat
taagctggcg gacctgatga gtcagcacgg taccctgctg 1020
cgggcgtaat
cctttccggt attctggcgg cgacgatgtc caccgcggac 1080
tgacagcggc
ttccagcgtt tcgcaggatc tttctcagaa tgtgtttggc 1140
gcagcaagac
cgagatgatc gtggcacggg cgacagtact ggttattgcg 1200
ttactctggc
gtgggacccc aatagctcgg tattccgggt ggtttccttt 1260
gctttggcgc
ggcttttggc ccggtggtgc tgttctcgct gttctggaag 1320
agtggggcgc
cctggccggt atggttgccg gcggcgtgat ggtatttgtg 1380
tgattgcccc
gatgggcggc gcatgggcca tetaegaget gctgccggcc 1440
cgtgcattgc
cctagtggtg gtttctctgc tgaccgaggc cccggaaaag 1500
agacctacga
aagcgtgtgt gccaagaagg taaaggcgta a 1551
<210> 31 <211> 1146 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 31 atgtcaaagc
gtcacccgtc
ctgctggcgc
tccatctacg
catgatatcg
ttctggaata
atgctggtgc
gccatcctct
accaatgaga
ttcctcaagg
ggctggttcc
gtctgcatcg
gtgggcgaaa
tgaataaacc gcaggccact gggatcagat cccgctgggc tcatcgtgtg cagtgtggtc ccaccatcct ccacggcgcg ccattctgct gtgcatctcg ccggcgccga aggccaggtg tgggcggcaa agtgcccgat ccggcgttat ctggggcatt ccctcttcac ccttatgatg tggcggataa gaccggctcc cggaaatttt cggcgtcaag ccatgcacat ctacctgcgg gcgaaaatac cgcccattac
gcccgtcccg cccgggaacc cgggccattc tcatccgggt acccgtgtcc tcaccgggga ttcggcaccg gccgtatgct ctggcggtca ccccggcctt ctcatcggct gcctttccac ggtctgctca tcctcatcat atccccgcct tctttaaggc aactatgttg ccatccagct aatgttgtcg gccccgatct tatctgctca atatccttat tacagcaagc acggctatga atcggcatcg atgtcaaaaa
cttcctctat
60
catcgccatc
120
tgaccccctc
180
ggtcaccctg
240
ccgcatgcgc
300
cgcggtatgc
360
ggcagtttcc
420
ccattggaac
480
ggtggaatac
540
gctcacccac
600
cgtcgccatc
660
gatcgccgtt
720
ggtcatéate
780
5
10
15
cgcaccatgg
tcctcccact
tcctggctcg
ctggcccgcg
atccttaccg
gtccatttca
aactga
ctctttccgg cgccatctgc ccatcgattc caacctcgtg ccaagttcga tcccttcacc gcgccgatga agtcacctcc gcatcatctt gttcttcatc atcatcacaa aaaagaaaaa
ggcctggccg gtctgctgct gatggccgcg gcttcaccgc atgatcctta ccacgctgct aagtttggcc tcaacagcga atcggctgtg agttctttat acggcgtcgg ccgccgtcag
ggtcggcggc
840
catcatggtt
900
gctggtgttc
960
tttttccgag
1020
caattaccag
1080
cggggagggg
1140
1146
<210> 32 <211> 1200 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida
<400> 32
atgaacaaga
gccttttccc
accgaacggg
tactacggct
ggcctggagg
tccggcagcg
ctgctggttc
gcgcttatta
ggccgcctgc
gagaacaact
gtaagtgaag
ttcatcgccc
cgcggcgtta
agcggtactg
gatgcgaaca
acggagctct
accgccggca
gtcaccacgg
cccgactatg
gctgaactgg
aaatttcgct
tggcgcggcc atcgcctata tggccatcgt agcggctgtg 60
ttaccatgat
ctactcgatg aacctgttca atgtgaagat gacaggcatc 120
aaaaaatgta
cagctctctg catgaggtag acctgtatgt gcgggaaaat 180
ccatcaatga
ggaagcgctg caggaggcca ttgcccgcgg gtatatcgat 240
acagcaatgc
ccgctacttc accgctgcgg aatatgaggc ctatacccaa 300
gcaaatatgt
aggcgtgggt ctggtgaccg agatggattc ctccggctat 360
gggaggttta
tcccgattct ccggcgcaga tggcgggcat caaggtgggg 420
ccaatgtaaa
cggcacccgc gtgaccgaaa ataacaatga aagcatggcg 480
gtggcgaagc
cggcaccaag gtgactctga ccatccaaca ggatagccag 540
acgagctgac
cctgcgcgcc attgaggtgc ccacagtaaa aacgaccatg 600
ataccgccta
tatcagcttt accgagtgga gcggtaccac tgccgaccag 660
agctgaatgc
cttgaaggcc caggaagtaa agggcattct gctggatgta 720
ccagcaatga
gctttcctat gcggtccggc tgctggatcc gctgctgccc 780
tggcctattc
ccgcgctaag gacggcaacc tgaccgccgt ggcggaatcc 840
gctgggatat
tccgctggtg gtgctggccg atgagaccac cggtggcacc 900
ttgtgatggc
gctgcaggac tttggccggt ccaaggtggt aggcgcccgc 960
acggcgatat
caccgagatc ttcaagcttt cgggtggttc ggccatccag 1020
cgcagtatgc
cgggcccaag caaaagagct ttggtgatac cggtgtgggc 1080
aagtggaact
ggcagccagc gagagtaacc ggggtgacat cctgggcaac 1140
atgctcccta
taagaaggca ctggaagtgc tggcagcggc catccggtaa 1200
<210> 33 <211> 3576 <212> ADN <213> Desconocida
<220>
<223> Bacteria intestinal desconocida

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Método para determinar si un sujeto con sobrepeso tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, comprendiendo dicho método:
    a) detectar a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, y
    b) determinar que el sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de por lo menos una especie bacteriana de la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende una etapa de detección a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto de si por lo menos uno de los conjuntos de 25 genes bacterianos de una especie bacteriana seleccionada de entre la lista que consiste en MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_14, MO_HL_9, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_16, MO_HL_4, MO_HL_17, MO_HL_1, o MO_HL_7 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
  3. 3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que comprende una etapa de detección a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto de si por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de la especie bacteriana MOHL-5 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
  4. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que comprende una etapa de detección a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto de si por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas de cualquiera de las combinaciones de especies bacterianas indicadas en la Tabla 3, 4 y/o 5 está ausente en dicha muestra.
  5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que comprende una etapa de detección a partir de una muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto de si:
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12 y MO_HL_11 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_7 y MO_HL_12 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_5, MO_HL_7 y MO_HL_12 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_2 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_17, MO_HL_5, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_11 y MO_HL_8 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_11, MO_HL_2, MO_HL_5, MO_HL_8, MO_HL_13 y MO_HL_7 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_12, MO_HL_2, MO_HL_17, MO_HL_11, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_8 y MO_HL_7 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_4, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7 y MO_HL_17 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_8, MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_5, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_17 y MO_HL_12 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_4, MO_HL_12, MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_6, MO_HL_2, MO_HL_8, MO_HL_7 y MO_HL_11 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_11, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_3, MO_HL_12, MO_HL_5, MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_7, MO_HL_2 y MO_HL_13 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_18, MO_HL_15, MO_HL_11, MO_HL_10, MO_HL_5, MO_HL_4, MO_HL_6, MO_HL_8, MO_HL_12, MO_HL_7, MO_HL_2, MO_HL_13 y MO_HL_3 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_2, MO_HL_4, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_13, MO_HL_10, MO_HL_15, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_8 y MO_HL_12 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_13, MO_HL_7, MO_HL_1, MO_HL_11, MO_HL_3, MO_HL_4, MO_HL_15, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_17, MO_HL_12 y MO_HL_8 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_7, MO_HL_4, MO_HL_13, MO_HL_1, MO_HL_5, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_12, MO_HL_8, MO_HL_3, MO_HL_18, MO_HL_2, MO_HL_10, MO_HL_17, MO_HL_15 y MO_HL_9 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra, o;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_10, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_16, MO_HL_18, MO_HL_5, MO_HL_15, MO_HL_2, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_13, MO_HL_11, MO_HL_17, MO_HL_3, MO_HL_14, MO_HL_4 y MO_HL_12 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra;
    - por lo menos el conjunto de 25 genes bacterianos de cada una de las especies bacterianas MO_HL_15, MO_HL_17, MO_HL_4, MO_HL_14, MO_HL_16, MO_HL_10, MO_HL_7, MO_HL_6, MO_HL_11, MO_HL_9, MO_HL_5, MO_HL_3, MO_HL_8, MO_HL_1, MO_HL_12, MO_HL_18, MO_HL_13 y MO_HL_2 tal como se describe en la Tabla 1 está ausente en dicha muestra.
  6. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende detectar el número de copias de por lo menos uno de dichos conjuntos de 25 genes bacterianos de dichas especies bacterianas en la muestra.
  7. 7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por que dichos genes bacterianos se seleccionan de entre la lista que consiste en la secuencia SEC ID 1 a la secuencia SEC ID 450.
  8. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la presencia o ausencia de los genes bacterianos según la invención es detectada mediante el uso de una micromatriz nucleica, que es preferentemente una micromatriz oligonucleotídica o una micromatriz de ADNc.
  9. 9. Método según la reivindicación 8, caracterizado por que la micromatriz nucleica es una micromatriz oligonucleotídica que comprende por lo menos un oligonucleótido específico para por lo menos cada uno de dichos 25 genes bacterianos que tienen una secuencia seleccionada de entre las SEC ID NOs 1-450.
  10. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicha muestra de ADN microbiano intestinal se obtiene de una muestra de heces.
  11. 11. Método para determinar si un sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionada con la obesidad seleccionadas de entre diabetes tipo II; cánceres, excepto cáncer de esófago, de páncreas y de próstata; enfermedades cardiovasculares, excepto insuficiencia cardiaca congestiva; asma; enfermedad de la vesícula biliar; osteoartritis; y dolor de espalda crónico, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
    a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que dicho sujeto con sobrepeso está en riesgo de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad.
  12. 12. Método para determinar si un sujeto con sobrepeso necesita una dieta, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que dicho sujeto necesita una dieta.
  13. 13. Método para aliviar los riesgos de desarrollar comorbilidades relacionadas con la obesidad seleccionadas de entre diabetes tipo II; cánceres, excepto cáncer de esófago, de páncreas y de próstata; enfermedades cardiovasculares, excepto insuficiencia cardiaca congestiva; asma; enfermedad de la vesícula biliar; osteoartritis; y dolor de espalda crónico, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
    a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que dicho sujeto necesita una dieta.
  14. 14. Método para determinar si un sujeto con sobrepeso necesita un tratamiento para la inflamación de bajo grado, preferentemente además de la implementación de una dieta, que comprende las etapas siguientes:
    a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    b) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que dicho sujeto necesita un tratamiento para la inflamación de bajo grado, preferentemente además de la implementación de una dieta.
  15. 15. Método para monitorizar la eficacia de una dieta en el aumento de la riqueza del microbioma bacteriano intestinal en un sujeto con sobrepeso que necesita la misma, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
    a) determinar que dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    b) implementar dicha dieta;
    c) determinar a partir de una segunda muestra de ADN microbiano intestinal obtenida de dicho sujeto si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
    d) si dicho sujeto tiene una diversidad bacteriana intestinal reducida, determinar que la dieta es eficaz en el aumento de la riqueza del microbioma bacteriano intestinal en dicho sujeto.
    imagen1
    FIGURA 1
    mmol/l
    índice Disse
    *
    imagen2
    -8
    •10 -
    0 semanas 6 semanas 12 semanas
    HOMA-IR
    1>5 l
    imagen3
    0 semanas 6 semanas 12 semanas
    2,5
    Triglicéridos
    imagen4
    hsCRP
    6 n
    6 -
    imagen5
    0 semanas 6 semanas 12 semanas
    FIGURA 2
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