CN108135982A - 治疗克罗恩病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗以慢性炎症为特征的炎症性肠病。具体地，本发明涉及预测、治疗或预防克罗恩氏病术后复发的方法。

Description

治疗克罗恩病的方法
技术领域
本发明的领域涉及以慢性炎症为特征的炎症性肠病。具体地，本发明的领域涉及治疗克罗恩病的方法。
背景技术
克罗恩病是一种炎症性肠病(IBD)，可影响从口腔到肛门的胃肠道的任何部分。它会引起胃肠道内层的炎症，从而导致腹痛、严重的腹泻、疲劳、体重减轻和营养不良。克罗恩病引起的炎症可能涉及不同人群胃肠道的不同区域。克罗恩病引起的炎症常常深入受影响的肠道组织。克罗恩病可能既痛苦又虚弱，有时可能导致危及生命的并发症。克罗恩氏病可引起并发症，如肠堵塞、肠内溃疡以及获得足够营养的问题。其他并发症可能发生在胃肠道外，包括贫血、皮疹、关节炎、眼睛炎症和疲劳。患有这种疾病的儿童可能有生长问题。
治疗可以帮助控制症状，可包括药物、营养补充和/或手术。虽然一些人有长期的缓解症状，但是当他们无症状的时候，并没有治疗克罗恩病。因此，仍然需要用于管理和治疗克罗恩病的方法。
发明内容
本发明人已确定克罗恩病与不同于健康的微生物信号有关。具体地，本发明人已经确定，即使在极低丰度时检测，变形杆菌属在克罗恩病的发展和术后疾病复发中具有特定的作用。
因此，第一方面提供了治疗患者克罗恩病的方法，所述方法包括降低患者中变形杆菌属细菌的水平。
第二方面提供了一种治疗和预防切除手术后患者克罗恩病复发的方法，所述方法包括降低患者中变形杆菌属细菌的水平。
在第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述方法包括向患者施用降低患者中变形杆菌属细菌水平的组合物。
在一个实施方式中，所述组合物是药物组合物。
在一个实施方式中，将所述组合物施用给切除手术后的患者。
在第一方面和第二方面的另一个实施方式中，患者切除手术后通过内窥镜检查、CT扫描、MRI和/或生物标志物分析被确定为具有疾病复发。
在第一方面和第二方面的另一个实施方式中，所述方法用于治疗克罗恩病的术后复发。
在第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述组合物包括对变形杆菌属细菌具有杀菌或抑菌的药剂。在一个实施方式中，所述组合物为抗菌组合物或抗生素。
在第一方面和第二方面的另一个实施方式中，所述方法包括选择患者进行治疗以降低患者中变形杆菌属细菌的水平，其中变形杆菌属细菌存在于从患者获得的样品中。
在一个实施方式中，所述样品是从切除手术后的患者获得的。
在一个实施方式中，所述样品在患者切除手术后约6个月至约18个月获取。
在一个特定的实施方式中，所述样品在患者切除手术后6个月获取。
在又一个实施方式中，所述样品从患者的回肠粘膜中获取。
第三方面提供了一种确定在切除手术后疾病复发风险增加的克罗恩病患者的方法，所述方法包括确定从患者中获得的样品中变形杆菌的存在与否，其中样品中存在变形杆菌表明患者切除手术后临床复发的风险增加。
在第三方面的一个实施方式中，所述方法包括从患者获取样品。
在第三方面的一个实施方式中，所述方法包括确定从切除手术后的患者中获得样品中变形杆菌的存在与否。
在第三方面的另一个实施方式中，所述患者样品是在切除手术后约6个月至切除手术后约18个月获得的。
在第三方面的另一个实施方式中，所述患者样品是在切除手术后约6个月获得的。
在第三方面的一个实施方式中，所述样品取自患者的胃肠道。在又一个实施方式中，所述样品从患者的回肠粘膜获取。
在第三方面的一个实施方式中，所述方法还包括向患者推荐降低患者变形杆菌水平的治疗过程。
在第三方面的另一个实施中，所述方法还包括向切除手术后临床复发风险增加的患者施用降低患者变形杆菌属细菌水平的组合物。
在第三方面的一个实施方式中，所述方法包括：
a.从患者获取样品；
b.检测样品中是否存在变形杆菌；
c.当检测到变形杆菌的存在时，诊断患者具有在切除手术后增加的临床复发风险；以及
d.向确诊的患者施用降低患者中变形杆菌属细菌水平的组合物。
第四方面提供了一种选择克罗恩病患者进行治疗来降低患者中变形杆菌属细菌水平，所述方法包括从切除手术后的患者获得的样品中确定存在变形杆菌属细菌的患者，其中，选择样品中存在变形杆菌属细菌的患者进行治疗。
在第四方面的一个实施方式中，所述方法包括：
a.从患者获取样品；
b.检测样品中是否存在变形杆菌；
c.当患者样品中检测到变形杆菌的存在时，选择患者进行治疗来降低患者中变形杆菌属细菌的水平。
d.向选择的患者施用降低患者中变形杆菌属细菌水平的组合物。
第五方面提供了一种治疗克罗恩病的方法，包括实施第三或第四方面的方法，并向患者施用能够降低患者中变形杆菌属细菌水平的组合物。
第四或第五方面的一个实施方式中，通过16srRNA测序、PCR和/或培养细菌确定变形杆菌的存在与否。
在第一至第五方面的一个实施方式中，所述方法包括降低患者胃肠道中变形杆菌属细菌水平。在一个特定的实施方式中，所述方法包括降低患者回肠和/或结肠中变形杆菌属细菌的水平。
第一方面的一个实施方式提供了一种降低患者变形杆菌属细菌水平的药剂在用于治疗克罗恩病的药物的制备中的应用。
第二方面的一个实施方式提供了一种降低患者回肠或结肠中变形杆菌属细菌水平的药剂在用于治疗或预防克罗恩病术后复发的药物的制备中的应用。
第一方面的另一个实施方式提供了一种在克罗恩病治疗中使用的降低患者变形杆菌属细菌水平的药剂。
第二方面的另一个实施方式提供了一种在治疗或预防克罗恩病术后复发中使用的降低变形杆菌水平的药剂。
在本文中所述的应用和制剂的一个实施方式中，克罗恩病的复发是临床复发。
在前述所有方面的一个实施方式中，所述方法包括向患者施用另外的治疗剂。用于治疗克罗恩病的其他的治疗剂为本领域技术人员已知的。例如，另外的治疗剂可以是抗炎药或免疫系统抑制剂。用于治疗克罗恩氏病的抗炎药物的例子包括5-氨基水杨酸盐和皮质类固醇。免疫系统抑制剂的例子包括硫唑嘌呤、巯嘌呤、英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、甲氨喋呤、环孢菌素、他克莫司、那他珠单抗、维多珠单抗和美泰木单抗。
在第一到第五方面的另一个实施方式中，降低变形杆菌属细菌水平包括抑制细菌的生长或杀灭细菌。在一个实施方式中，降低患者中变形杆菌属细菌水平包括从患者中消除所述细菌。
第六方面提供了监测治疗患者克罗恩病疗效的方法，所述方法包括治疗克罗恩病受试者，然后确定患者中变形杆菌属细菌的存在与否，其中，变形杆菌属细菌的存在表明疾病发展或疾病复发。
第七方面提供了一种监测患者中克罗恩病的方法，所述方法包括确定患者中变形杆菌属细菌的存在与否，其中，变形杆菌属细菌的存在表明患者疾病发展或复发。
第八方面提供了一种确定用于治疗或预防克罗恩病的候选化合物的方法，所述方法包括：
将候选化合物与变形杆菌属细菌接触，并且
确定所述候选化合物是否杀死或抑制细菌的生长。
其中杀死或抑制细菌生长的候选化合物是治疗克罗恩病的候选化合物。
在本文中描述的每一方面的一个实施方式中，所述变形杆菌属细菌选自奇异变形杆菌(P.mirabilis)、普通变形杆菌(P.vulgaris)和彭氏变形杆菌(P.penneri)。在一个特定的实施方式中，所述变性杆菌细菌为奇异变形杆菌。
显然，本发明一个方面的优选特征和特点适用于本发明的许多其他方面。
在整个说明书中，词“包括”，或其变形如“包含”或“含有”理解为暗示包括所陈述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但是不排除任何其他的要素、整体或步骤的组，或要素、整体或步骤的组。
下面通过非限制性实施例并参考附图来描述本发明。
附图说明
图1(A)根据患者组(克罗恩病(CD)，健康对照(H)和手术对照(S))着色的样品的未加权的UniFrac距离的主坐标图。数字反映CD患者取样的时间点(0：基线，1：6个月，2：18个月)。PC1、PC2和PC3代表了捕获大部分多样性的顶部三个主要坐标。(B)和(C)(B)6个月样品和(C)18个月样品未加权的UniFrac距离的主坐标图，基于样品位点(吻合口和回肠)着色。黑线从同一时间点从同一患者的样品中加入。
详细说明
一般技术和定义
除非另有明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应被认为具有与本领域(例如，在微生物学，生物化学和免疫学中)普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另外指明，否则本发明中使用的微生物学、生物化学和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。文献资料如，J，Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook and Russell.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rdedn，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)，R.Scopes，Protein Purification-Principals and Practice，3rdedn，Springer(1994)，TA Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRLPress(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996),and F.M.Ausubel et al.(编辑),CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括所有的更新至今的新版本),Ed Harlow and David Lane(编辑)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),and J.E.Coligan etal.(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括所有更新至今的新版本)中描述和解释了这些技术。
用语“和/或”，例如，“X和/或Y”应理解为是指“X和Y”或“X或Y”，并应视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
本文中使用的用语“治疗(动词)”、“治疗(动词原形)”或“治疗(名词)”包括向患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物足以降低患者的变形杆菌水平，并减轻或延缓克罗恩病的发作，或减轻或消除至少一种克罗恩病的症状。
本文中使用的用语“预防(动词)”、“预防(动词原形)”或“预防(名词)”是指保护患者免于发展为至少一种克罗恩病的迹象或诊断发现或症状，或减轻克劳恩病的症状的严重性。
本文中使用的“施用”应被广泛地解释，并包括向受试者或患者施用本发明的组合物或治疗剂，以及将组合物或治疗剂供给细胞，例如，通过向患者提供前药。
如本文中使用的，短语“降低细菌水平”是指与那些尚未根据本发明方法进行治疗的患者比较，由于进行本文所述的治疗而导致的患者中细菌的数量、浓度或细菌量的减少。“降低细菌水平”也包括从患者中消除细菌。
克罗恩病/复发的治疗和预防
通过采用16srRNA的新一代测序法研究患者样品中的微生物群落，本发明人已经确定可以通过降低克罗恩病患者中变形杆菌属细菌的水平来治疗或预防包括术后复发在内的克罗恩病。此外，本发明人发现，通过检测切除手术后变形杆菌属细菌的存在与否，有可能确定患者是否具有增加的疾病复发风险，从而推荐合适的治疗或预防性治疗方案。
克罗恩病的复发可通过组织学、内窥镜检查、放射学或其他成像技术如CT扫描、超声或MRI或临床(通过症状表现)来确定。重要的是，基于症状出现的临床复发倾向于落后于内窥镜/组织学/生物标志物(例如粪便或血清炎症标志物)的复发，并且大部分患者有临床沉默疾病，而内窥镜检查、升华或组织学具有炎症的征兆。出于这个原因，建议患者在术后6-12个月进行回肠结肠镜检查并检查吻合口。
由于黏膜愈合一直是克罗恩病的主要治疗终点，所以认为内镜复发是未来术后并发症的最佳预测指标。Rutgeerts(Rutgeerts评分)已经开发了内镜复发评分系统。该评分系统侧重于术后克罗恩病患者的回肠结肠吻合处粘膜的内窥镜外观。本文所述的治疗方法可以用于治疗在轻度或重度疾病的任何阶段，以及手术前或手术后治疗克罗恩病。
还提供了监测患者中治疗克罗恩病的疗效的方法，以及监测疾病发展或复发的方法，所述方法包括确定患者中变形杆菌属细菌的存在与否。本文中，用于“发展”是指患者的疾病状态变得更加严重。例如，患者的疾病发展包括从疾病缓解状态发展到疾病复发的患者，其可以是通过内窥镜检测、其他成像技术或通过生物标志物分析确定的临床上明显的疾病或亚临床复发。疾病发展还包括，例如，从轻度至中度疾病或中度至重度疾病发展的克罗恩病患者。
降低变形杆菌属的水平
变形杆菌属是革兰氏阴性变形杆菌属的一个属。变形杆菌在自然界如腐生物中广泛分布，在分解动物物质，污水，粪肥和人畜粪便中可见。它们是机会致病菌，通常导致泌尿和脓毒感染，通常来自医院。奇异变形杆菌、普通变形杆菌和彭氏变形杆菌这三种是机会性人类致病菌，包括导致尿路感染的致病菌。
可以通过施用生物体敏感的抗生素或其他的药物来降低或消除变形杆菌属(包括物种、菌株、亚种或亚型)细菌的水平。这种药物包括抗菌化合物和抗生素，包括抑菌和杀菌组合物。技术人员可以很容易地确定对变形杆菌属有效的合适的抗微生物或抗生素组合物。例如，已知奇异变形杆菌菌株对氨苄青霉素和头孢菌素敏感。已经用于治疗变形杆菌感染的抗生素的实例包括庆大霉素，妥布霉素，左氧氟沙星，环丙沙星，氨苄西林-舒巴坦，哌拉西林-他唑巴坦，头孢唑林，头孢曲松，头孢他啶，头孢吡肟和复方新诺明。
可选择地，降低患者中变形杆菌属细菌水平的组合物可以包含结合和/或中和细菌分子或蛋白质的抗体，或者所述组合物可以包括能够杀死变形杆菌属细菌的噬菌体。
在一个实施方案中，可以通过向患者施用或喂食促进有益菌株的生长的益生素组合物来降低变形杆菌属细菌水平，所述有益菌株能够在益生素组合物存在下生长得超过或生长得快于所述变形杆菌属细菌。
其他治疗剂
在本文所述的方法中，还可以用另外的治疗剂来治疗患者。这种用于治疗克罗恩病的治疗剂是本领域已知的。治疗剂可以是，例如，抗炎药或免疫系统抑制剂。用于治疗克罗恩病的抗炎药物的实例包括5-氨基水杨酸盐和皮质类固醇。免疫系统抑制剂的实例包括硫唑嘌呤、巯嘌呤、英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、甲氨喋呤、环孢菌素、他克莫司、那他珠单抗、维多珠单抗和美泰木单抗。
变形杆菌的检测
确定患者样品中细菌水平或数量的方法是本领域技术人员已知的。可使用微生物培养技术、生化检验或分子技术来鉴定变形杆菌的存在，所述分子技术包括但不限于PCR(聚合酶链式反应)、核酸杂交或测序技术。任选地，所述方法可以包括利用诸如PCR和克隆和/或核酸测序的技术扩增细菌核酸序列。也可以通过16srRNA的测序来识别细菌，包括使用新一代高通量测序技术。
细菌也可以使用免疫学方法检测。可以将与变形杆菌属细菌交叉反应的抗血清或抗体用于合适的免疫学测定中。免疫学测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及那些使用固体载体如浸杆类型测定的测定。这种免疫学测定可以使用标记的抗体，包括荧光、放射性或化学发光标记的抗体或染料分子。
蛋白质检测技术
在一个实施方式中，检测患者样品中的来自变形杆菌属细菌蛋白的抗原、蛋白质或免疫原性片段。在另一个实施方案中，检测患者样品中对细菌特异性的抗体。例如，该方法可以包括将源自患者的生物样品与能够结合细菌抗原或蛋白质的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。
本文中考虑的检测系统包括用于检测从人类受试者中分离的生物样品中的蛋白质或抗原(包括非蛋白质抗原)的任何已知的测定法，例如，SDS/PAGE、等电聚焦、包含SDS/PAGE和等电聚焦的2维凝胶电泳、免疫测定、流式细胞术如荧光激活细胞分选(FACS)、使用抗体或非抗体化合物的基于检测的系统(例如小分子(例如蛋白化合物、蛋白激动剂、蛋白拮抗剂、蛋白变构调节剂、蛋白竞争性抑制剂或蛋白非-竞争性抑制剂)。根据这些实施方式，所述抗体或小分子可以以任何标准的固相或液相形式使用以适合蛋白质的检测。显然本发明包括，例如，使用质谱法、MALDI-TOF、生物传感器技术、瞬逝光纤或荧光共振能量转移的光学或荧光检测。也考虑适用于大量样品的高通量筛选的测定系统，例如高通量光谱学共振方法(例如，MALDI-TOF，电喷雾MS或纳米电喷雾MS)。
免疫测定形式尤其合适，例如，选自由免疫印迹、Western印迹、斑点印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定组成的组。利用荧光共振能量转移(FRET)、同位素编码亲和标签(ICAT)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESI)、生物传感器技术、瞬逝光纤技术或蛋白质芯片技术改进的免疫测试也是有用的。
在一个实施方式中，所述测定是半定量测定或定量测定。标准固相ELISA形式对于确定来自不同患者样品的蛋白质或抗原的浓度是有用的。
在一种形式中，这种测试包括将含有针对来自变形杆菌属细菌或其免疫原性片段的抗原或蛋白质的抗体的生物样品固定在固体基质中，如，聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或试纸上，膜或玻璃载体(例如载玻片)。
核酸检测技术
可以使用任何允许对组织中的变形菌属细菌的核酸进行定性和/或定量检测的合适的技术。可以参照标准对照或阴性对照进行比较。可在基因片段上标记和杂交核酸，在这种情况下，基因浓度将直接与测试中产生的放射性或荧光信号的强度成正比。
在一个具体实施方式中，可以通过将从患者样品中分离的核酸与核酸探针在严格杂交条件下接触，并检测样品中杂交化合物的存在来诊断克罗恩病、疾病复发或疾病发展，所述严格杂交条件允许在核酸探针和源自变形杆菌属细菌的核酸之间形成杂交复合物。为了用作诊断剂，可以优选标记核酸探针以帮助其检测。将这种检测水平与对照水平(例如来自健康样本或标准对照的基因水平)比较，患者组织中杂交复合体水平的变化表示疾病、疾病复发或疾病发展。
本文使用的用语“杂交”是指两个核酸分子相互之间通过氢键相互结合。影响这种键连的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅动；阻断液相分子与固相载体(Denhardt试剂或BLOTTO)的非特异性附着的试剂；分子的浓度；增加分子结合的速率的化合物(葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇)的使用；以及杂交后洗涤条件的严格性(参见Sambrook etal，MolecularCloning；A Laboratory Manual，Second Edition(2001))。
“严格性”是指杂交反应中的条件，相比不同分子的结合，其有利于非常相似的分子的结合。高度严格杂交条件定义为在42℃下，在包含50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠，pH8.0)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5 x Denhardt's溶液，10％葡聚糖硫酸盐和20μg/mL变性、剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中进行过夜培养，然后在约65℃下用0.1×SSC洗涤过滤器。低严格条件是指在5-35℃下进行的杂交反应。优选地，用于本发明方法中杂交的条件是高度严格的那些条件。优选将核酸从样品中分离进行测试。合适的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
在本发明的一些实施方式中，可以使用核糖体RNA(“rRNA”)来区分和检测细菌。例如，细菌核糖体由小的和大的亚基组成，每个亚基还包含核糖体RNA和蛋白质。来自小的亚基的rRNA可以称为SSU rRNA，来自较大的亚基的则被称为LSU rRNA。大量的rRNA已经被测序，并且这些在各种可访问的数据库中均是公开可用的。因此，在一个实施方式中，通过对患者样品中由基因组DNA扩增的域级PCR反应产生的16s核糖体RNA(rRNA)基因扩增子进行测序铼检测变形杆菌属细菌。通常，通过PCR扩增子的克隆和Sanger(毛细管电泳)测序来进行rRNA的测序。新一代测序技术的出现极大地简化并提高了16S rRNA基因测序的测序深度。台式测序仪的推出现在允许技术人员几天内在室内进行16S rRNA测序和分析。
实施例
实施例1克罗恩病患者16s微生物谱的鉴定
为了增加我们对CD中微生物组的理解，本发明人从手术到手术后18个月的时间对CD患者的充分表征和独特的队列进行了研究，以确定16S微生物谱预示术后CD疾病复发和缓解或者与术后CD疾病复发和缓解有关。在切除所有的肉眼可见病变后，本发明人对手术前和手术后的收集的34位CD患者的141个粘膜活检样品进行了新一代测序分析。不同部位(回肠和吻合口)的样本大小和同时采样，以及新一代测序的使用对理解与疾病相关的微生物组作出了重要和显著的贡献。
实施例2材料和方法
受试者和道德支持
本研究与检测术后克罗恩病(CD)治疗(术后克罗恩内镜复发(“POCER”研究))的研究同时进行。该研究得到了澳大利亚墨尔本圣文森特公立和私立医院的人类研究伦理委员会和澳大利亚墨尔本皇家墨尔本医院的批准。
POCER研究是一项前瞻性随机对照试验，旨在评价术后内镜评估和治疗早期粘膜复发的值。根据复发风险将患者分成不同等级。吸烟者、有穿孔疾病的患者或以前有1次或多次切除术的患者被归类为“高风险”；所有其他人都为“低风险”。所有患者均接受所有肉眼可见病变的切除手术，然后接受3个月的甲硝唑治疗。高风险患者每天还接受硫唑嘌呤(2mg/kg/天)或6-巯基嘌呤(1.5mg/kg/天)治疗。不耐硫嘌呤的患者接受阿达木单抗诱导(160mg/80mg)然后每周两次40mg。低风险患者不接受进一步治疗。
患者在6个月时随机进行(积极护理)或不进行(标准护理)结肠镜检查(积极护理)。对于在6个月时内镜复发(Rutgeerts评分≥12)的患者加强为巯基嘌呤，每两周一次阿达木单抗和硫嘌呤，或每周一次阿达木单抗。主要终点是18个月内镜复发。使用Rutgeert评分来定义内镜缓解。
招募具有完整结肠肠癌家族史的患者作为健康对照，并且只有结肠镜检查正常的患者才包括在内。手术对照包括接受过结肠镜检查的患者，这些患者以前曾接受结肠癌的回肠结肠切除术或右半结肠切除术。
在切除手术以及术后6个月和/或12个月时在结肠镜检查时收集CD患者的粘膜样品，对照组中在筛查结肠镜检查时单个时间点收集样品。在手术后6个月和18个月时采集粪便样品用于测量粪便钙卫蛋白(FC)。
手术前一个月没有CD患者接受抗生素或益生素治疗。结肠镜检查前一个月没有健康对照者接受过抗生素或益生素治疗。患者在手术前一天用聚乙二醇进行肠清洁，在结肠镜检查前患者和健康对照这进行同样的准备。
组织采集和DNA提取方法
在CD患者中，在受影响的回肠区域的切除标本中获取5-10mg组织样品。在6个月和18个月的结肠镜检查中，从同一患者的吻合口和回肠新生末端收集6个组织样品(约5-10mg)。在健康对照中，活检取自回肠，在手术对照中，活检取自吻合口和回肠新生末端。使用标准内窥镜钳并将组织放入含有1ml RNA的无菌管(试剂盒)中，保持在4℃下过一夜以使组织充分渗透，然后在分析之前储存在-80℃。随后将组织样品解冻并均质化，并使用QIAGEN AllPrep Mini试剂盒按照制造商的说明从匀浆中提取DNA。
粪便收集
手术后6个月和18个月收集粪便样品用于测量FC。指导患者在研究就诊之前三天内收集粪便样品，或者如果进行结肠镜检查，在开始肠道检查准备之前结肠镜检查前三天。样品在-20℃下储存在患者的家用冰柜中，冰上运输，在研究中心储存在-80摄氏度下，直到临床研究结束。在中央实验室同时分析所有样品。
16s rRNA基因测序
使用扩大高保真(Expand High Fidelity)PCR试剂盒(Roche)通过Illumina指数/适配器通过PCR扩增细菌16S rRNA可变区2。PCR产物通过使用Qiagen DNA提取试剂盒(Qiagen)纯化，并在澳大利亚基因组研究机构(AGRF)进行Illumina MiSeq测序之前使用Nanodrop进行定量，使用250-循环化学从两端进行250bp测序。
生物信息学和统计分析
将MiSeq生成的重叠配对末端序列读数拼接在一起，并在使用QIME 1.8.0的数据管道中处理。使用Fastxtoolkit 0.0.14版将读数修剪为200bp，使用Flash 1.2.7.16版将合并的配对末端读数合并。合并的序列质量筛选如下：修剪之前允许≤3低质量bp(Phred质量评分<3)，≥189个无未调用的碱基(Ns)的连续高质量bp。使用基于UCHIME参考的方法去除17嵌合体。总共筛除了2464848个序列(7％)，剩下35034316个用于分析。使用QIIMEv1.818和GreenInes 97％OTU参考集(版本135.19)中的二次样品公开参考方法将经过筛选的序列分配到运算分类单位(OTUs)。简而言之，将与参考集有60％低百分比一致性的输入序列进行预筛选，以去除可能序列出错的序列。接下来，将封闭参考OTU拣选应用于筛选的序列(使用UCLUST20封闭参考方法来搜索每个读数据库，并基于最佳命中率≥97％序列一致性将读数分配给OTU)。所有与封闭参考步骤中标准不一致的的序列然后被重新聚类为97％的相似性。SingletonOTUs废弃。这导致平均每个样本分类序列>190000(范围75020-465400)。
在多样性计算之前，使用稀释法将每个读数稀释至75000读数。对每个样品进行10次独立稀释运行来计算Alpha多样性测量(香农指数、杂交和OTU数目)。使用UniFrac度量来计算Beta多样性。对未加权的UniFrac距离矩阵进行主坐标分析。使用报告的最明显数值的前3个PC进行了回归分析。
对于分类学分析，将统计学显著性定义为P值＜0.05，并进行有和没有错误发现率(FDR)调整以校正多重比较。
内窥镜视觉评估
在回肠结肠镜检查时，根据内窥镜的Rutgeerts评分评估吻合口和回肠新生末端的粘膜复发情况。对于6个月和18个月的结肠镜检查，将内窥镜缓解定义为Rutgeerts评分i0(无病变)或il(<5溃疡病变)以及复发为i2(>5溃疡病变或限于吻合口的更大的病变)，i3(弥漫性回肠炎)或i4(弥漫性炎症并伴有严重的溃疡和/或变窄)。两位研究者独立评价了吻合口和回肠新生末端的照片，该研究者不知道内窥镜的评分和患者的身份和治疗。最后的一致得分由两位不知情评估者确定。
粪便生物标记分析
按照制造商的说明通过定量酶免疫法测量粪便钙卫蛋白(FC)(fCALTM，Buhlmann，Schonenbuch，Switzerland)，无需了解患者数据。浓度以μg/g粪便表示。我们之前已经表明FC>100μg/g对术后CD内镜复发的诊断敏感，并选择该截点进行分析。
实施例3结果
独特的术后克罗恩病队列
34名CD患者(41％为男性，中值年龄28岁，范围23-43)提供了共141例的粘膜活检样品，所述粘膜活检样品来自切除手术标本(基线)和在术后6和/或8个月结肠镜检查时的回肠和吻合口。获得了28个对照样品，这些样品包括源自12个具有正常结肠的健康结肠的12个结肠样品(健康对照)和源自8个手术对照的16个回肠和吻合口样品。对CD患者和对照者的人口统计如表1所示。CD患者的中值年龄比健康的以及手术对照的都小。
表1人口统计
使用Illumina MiSeq平台获得每个样品平均>190000(范围75020-465400)分类学分配的16S序列。在多样性计算之前通过对每个样品随机二次取样将读取数归一化至75000个读数(稀释)。如果检测到任何读数，不管数值如何，将分类群分成经过检测。除去所有样品中＜10％的分类群。
Alpha多样性
当通过运算分配单位(OTU)数(分别为p<0.001和p＝0.368)香农多样性指数(p＝0.002和P＝0.552)和Chao多样性指数(分别为p<0.001和p＝0.607)测量时，与健康对照而非手术对照相比，CD与系统发育丰富度整体下降(α多样性)有关。
当比较基线和术后样本时，CD患者的α多样性没有统计学明显差异。在6或18个月仍保持内镜缓解的患者和那些发展为内镜复发的患者之间，基线差异无法检测到。那些内镜缓解的患者和复发(Rutgeerts≥i2)的患者之间的α多样性没有统计学明显差异，那些粘膜正常(Rutgeerts i0)和严重复发的患者(Rutgeerts i3和i4)之间也没有统计学明显差异。与不吸烟者相比，吸烟者在α多样性方面没有明显的不同。作为单独测量的复发和缓解，与FC≤10μg/g相比，FC≥10μg/g与α多样性的显著变化无关。
在CD组中，与从吻合口采集的样品比较，从回肠新生末端采集的样品在α多样性没有统计学明显差异。
Beta多样性
克罗恩病和健康
CD(基线)和健康对照(P＜0.001)之间的微生物组成明显不同。考虑术后回肠切除术和回肠结肠吻合术，CD与手术对照者(P＝0.022和P＝0.027)在术后6个月18个月都存在明显的不同，图1A。
克罗恩病——时间和样本位点
随着时间的推移，CD患者内微生物组成发生改变。基线切除样本与在6个月(P＝0.005)和18个月(P＝0.001)采集的结肠镜检查样本明显不同。6个月时的样本组成与18个月时采集的样本组成存在显著差异(P＝0.023)。同一时间取自同一患者的回肠和吻合口的成对样本比同一时间取自不同患者的相同位点的样品相似性更高(平均未加权的Unifrac分别是0.39对0.63，P<0.001)，图1B和1C。
克罗恩病——内镜复发，粪便钙卫蛋白和吸烟
比较在6个月或18个月(分别为P＝0.476和P＝0.198)继续发展为内镜复发的CD患者的切除术样本和保持内镜缓解患者的切除标本(基线)时，β多样性无显著差异。内镜复发的CD患者(i2，i3和i4)和内镜缓解(i0和i1)在6个月或18个月时(分别是P＝0.926和P＝0.074)的β多样性无显著差异。CD重度内镜复发(i3和i4)与粘膜正常组(iO)相比，在6个月时没有明显差异(n＝5对n＝8；β多样性P＝0.847)，但在18个月时差异显著(n＝7对n＝5；β多样性P＝0.010)。在6个月或18个月时FC≤100μg/g的患者与FC≥100μg/g的患者之间的β多样性没有明显差异(P＝0.801，P＝0.798)，吸烟者与非吸烟者之间也无差异明显差异(分别是P＝0.326和P＝0.448)。
与疾病和复发有关的细菌
克罗恩病和健康
与健康对照组相比，CD组(基线)与几个分类群的丰度变化包括在门水平增加的变形杆菌门、放线杆菌门和梭杆菌门，在科水平增加的肠杆菌科和在属水平增加的韦永氏球菌属、嗜血杆菌属、肠球菌属和梭杆菌属拟杆菌(门)和瘤胃球菌属和毛螺菌属(属)的减少有关。
6个月和18个月时CD组和手术对照组比较，在α多样性方面没有明显差异，但是在两个时间的集中分类群的丰度都明显不同。与手术对照相比，在手术后6个月和18个月时CD样本的Christensellaceae科和普氏菌属减少，Traubulsiella属增加。在CD和健康对照之间观察到的大部分分类群的改变在CD和手术对照患者进行比较时没有观察到，表明在CD患者手术后观察到的微生物变化可能是由手术和单独重新配置的解剖导致的，而不是因为炎症疾病的存在。
切除并随后复发的细菌
在基线处，在6个月或18个月时，在继续发展为内镜复发的患者与那些保持缓解的患者之间观察到明显的特定分类群的变化，但是这两个时间点都与复发无关。在切除手术时Faecalibacterium的丰度或变形杆菌属的存在与否不能预测6个月或18个月时的内镜复发。
术后克罗恩病随着时间的变化和内镜复发
CD中的细菌组成随时间而改变(表2)。Streptococacceae和02d06是仅有的在基线和6个月之间，以及在术后6个月和18个月之间显著增加的类群。在6个月时，与缓解(P＝0.008)相比，内镜复发与变形杆菌属的丰度增加有关。使用逻辑回归校正吸烟因素，与未检测到变形杆菌相比，在6个月时检测到变形杆菌与明显的高复发风险有关[OR 13(1.1-150)，P＝0.039]。
在18个月时，内镜复发与科水平的Desulfovibrinaceae(P＝0.004)和疣微菌科P＝0.014)，以及属水平的Faecalibacterium(P＜0.001)脱硫弧菌属(P＝0.011)和嗜胆菌属(Bilophila)(P＝0.022)的丰度下降有关。当对吸烟因素进行校正，只有低丰度的Faecalibacterium是内镜复发的风险因素[OR14(1.7-110)，P＝0.013]。
当可检测到时，变形杆菌的丰度非常低。相反，当可检测到时，Faecalibacterium以更高的丰度存在。在14名CD患者中(21个样本)，一些时候会检测到变形杆菌。当存在时，每个样品的读数中值是35[四分位间距(IQR)7-82]。在健康或手术对照中检测不到变形杆菌。在6个月时，6个检测到变形杆菌的患者中有5名有内镜复发。18个月时，有1名患者检测到变形杆菌，该患者有内镜复发。
表2从切除手术时起克罗恩病微生物分类群丰富程度随着时间的推移而发生的显著变化
有7例患者在基线以及在6个月或18个月时检测到了变形杆菌，这些患者中的6例有内镜复发，其中包括4例伴有严重复发(i3或i4)。尽管在6个月时检测到变形杆菌，仍有1名患者保持内镜缓解(i0)。在18个月时，与完全粘膜正常(i0)的相比，有严重的内镜复发(Rutgeerts i3和i4)与变形菌门增加(P＝0.018)；疣微菌科(P＝0.003)、理研菌科(R＝0.033)和Turicibacteraceae(P＝0.33)的下降，Faecalibacterium(P＝0.005)、脱硫弧菌属(P＝0.009)、Lachnobacterium(P＝0.009)、颤螺旋菌属(P＝0.023)、Paraprevotella(P＝0.033)奇异菌属(P＝0.033)、Odoribacter(P＝0.033)和Turicibacter(P＝0.033)的下降有关。在6个月时没有观察到这些变化。
吸烟的影响
本组中的主动吸烟与内镜复发有关[OR 3.3(11)P＝0.049]，与Faecalibacterium和变形杆菌属的存在无关。主动吸烟与6个月和18个月的不吸烟者相比，在几个分类群中存在显著差异(表5)。与不吸烟者相比，吸烟者6个月时变形杆菌增加(P＝0.037)。
粪便钙卫蛋白
在这34例CD患者中，FC>10μg/g与内镜复发相关[OR6.4(1.02-51.4)P＝0.032]。在FC>100μg/g的患者中，假单胞菌和Parvimonas的丰度在6个月时增加(分别为P＝0.030和P＝0.042)。
变形杆菌、Faecalibacterium、吸烟与内镜复发的关系(P20)
吸烟与手术后变形链球菌丰度增加有关。变形杆菌的存在和Faecalibacterium的低丰度也独立的与内镜复发风险的增加相关。在6个月和/或18个月时复发的24例患者中，20例与低Faecalibacterium丰度或变形杆菌的存在相关。
在6或18个月时包含包含高丰度Faecalibacterium以及不存在变形杆菌的微生物谱对内镜缓解的敏感性为84％、特异性为69％、阳性预测值(PPV)为％和阴性预测值(NPV)为83％。
在内镜复发的诊断中，考虑到变形杆菌的存在、Faecalibacterium的丰度以及吸烟因素，使用受试者工作特征(ROC)曲线对回肠粘膜微生物分析的准确性建模，在预测内镜复发方面取得了中等的准确度(AUC0.740，95％CI0.69-0.79)。
物种水平的分类确定
在这项研究中，有867个OTU被确定为Faecalibacterium。这些中的857个(99％)在物种水平上被确定为Fprausnitzii。
四个不同的OTU(Greengenes OTUs 4440497，814112，560629和de novo OUT；Greengenes 16s rRNA数据库；greengenes.lbl.gov)被确定为属于变形杆菌属，但这些不能在物种层面上确定。其中，OTU 814112是最丰富的(占所有读数的65％)，并且至少部分存在于检测到变形杆菌的21个样品中的19个中。当检查该OTU的代表性全长16S序列并与美国国家生物技术信息中心(NCBI)BLAST参考数据库进行比较时，其与奇异变形杆菌物种匹配最密切(查询覆盖率100％，E值0.0，同一性95％)。OTU560629也被发现与奇异变形杆菌最匹配(查询覆盖100％，E值0.0，同一性98％)。
实施例4讨论
80％的CD患者在其一生中接受了手术治疗，但大部分患者术后一年内吻合口和回肠新生末端会发现疾病复发。因此，对回肠新生末端中的微生物群落进行术后研究有可能识别重要的致病生物体。
本发明人发现，CD患者的微生物谱与健康对照相比，存在显著差异。其他类群被确定为与CD相关(表2)。这项研究采用了高通量的Illumina测序技术，其提供了深度测序以及低丰度生物体的潜在鉴定。
本研究选择回肠活检结果进行分析。回肠被认为是CD中主要的免疫诱导部位。此外，吻合口的活组织检查结果是不准确的，与回肠或结肠粘膜是否取样有关。
这项研究有四个主要发现。首先，回盲肠切除术(包括阑尾切除术、切除回盲瓣和改变解剖结构)与变化的微生物谱有关，与原发疾病无关。其次，柔嫩梭菌群(Faecalibacterium prausnitzi)和变形杆菌与手术复发明显有关，与吸烟无关。再次，从低级粘膜炎症(通过升高的FC识别)到严重内镜复发的复发性疾病的发展与肠道微生物谱随时间的变化有关。最后，本发明人表征了包含微生物和环境因素的复发模型。
以前没有描述回盲肠切除术后的微生物的变化。这可能与单纯切除，切除回盲瓣或切除阑尾有关。阑尾可起到保留和保护肠道中有益或共生微生物的作用。已证明阑尾切除术可防止溃疡性结肠炎的发展，但在CD中阑尾切除术可能是疾病发展的危险因素。
与以前的研究类似，在我们的队列中显示柔嫩梭菌群(F.prausnitzii)的丰度与手术后持续的内镜缓解相关。人们发现柔嫩梭菌群具有抗炎性，并且与健康对照相比似乎具有明显更低的丰度，从而猜测这种物种可能在CD的保护或治疗中具有保护性或治疗性的作用。
本发明人在12名CD患者(12％)中检测到变形杆菌。健康或手术对照中没有发现。当术后6个月在回肠中检测到时，它与复发密切相关，与吸烟无关，复发风险增加13倍。变形杆菌属是肠杆菌科的一员，可以在正常的胃肠道菌群中发现。虽然传统上不认为在胃肠道中是致病的，但是变形杆菌通常与复杂的泌尿道感染有关。变形杆菌属与类风湿性关节炎的病原学有关。在这项研究中，吸烟、Faecalibacterium的低丰度或存在变形杆菌中的一种或多种可能占据了术后疾病复发的患者的88％(21/24)。所有严重复发的12例患者都存在这些因素中的至少一个(Rutgeertsi3和i4)。
存在于组织中的钙卫蛋白(钙结合蛋白S100家族的一员)与存在的炎症程度成正比。术后确定粪便钙卫蛋白>10μg/g的患者可能有内镜可识别复发。本研究中假单胞菌与FC>100μg/g明显相关。人们发现，与健康对照相比，假单胞菌属在CD患儿的回肠粘膜中更普遍，并且已经与CD的发病机制有关。在目前的研究中，虽然假单胞菌与FC升高相关，但是内镜复发患者中并不多。相反，变相杆菌的发现和柔嫩梭菌群的低丰度的与内镜复发有关，而与FC的升高无关。只有低丰度的柔嫩梭菌群与严重复发有关，并且只有在术后18个月才能观察到，伴随着beta多样性以及其他分类群差异的明显减少。这些发现表明炎症复发存在不同阶段的演化，并且这些阶段可能与不同的微生物谱和影响有关。
本研究中的所有CD患者在术后前三个月都接受甲硝唑治疗，一些患者接受硫嘌呤或阿达木单抗治疗。术后回肠微生物组在药物治疗方面的详细评估受到临床研究中使用的异质治疗方案和每个药物方案队列中相对较少的数量的限制。不考虑药物治疗，我们的发现表明复发本身可能反映微生物的变化。
总之，在回肠新生末端中检测到变形杆菌，即使是非常低的丰度，也可能在早期术后复发的发展中起作用。因此，可以通过降低CD患者胃肠道中变形杆菌属细菌的水平来治疗或预防克罗恩病和术后疾病复发。
本领域技术人员理解，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种改变和/或修改，而不脱离广泛描述的本发明的范围。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
本文讨论和/或参考的所有出版物的全部内容并入本文。
本申请要求AU2015902286的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
已经包括在本说明书中的文件、行为、材料、设备、文章等的任何讨论仅仅是为了提供本发明的上下文的目的。不能因为它存在于在本申请的每项权利要求的优先权日之前而认为这些事物的任意一个或全部构成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域的公知常识。

Claims (19)

1.一种治疗患者克罗恩病的方法，所述方法包括降低患者中变形杆菌属细菌的水平。
2.一种治疗或预防切除手术后患者克罗恩病复发的方法，所述方法包括降低患者中变形杆菌属细菌的水平。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述方法包括向患者施用降低患者中变形杆菌属细菌的水平的组合物。
4.权利要求3所述的方法，其中所述组合物为药物组合物。
5.权利要求3或权利要求4所述的方法，其中将所述组合物施用给切除手术后的患者。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述患者在切除手术后通过内窥镜检查、CT扫描、MRI和/或生物标志物分析被确定为具有疾病复发。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗克罗恩病的术后复发。
8.权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包括对变形杆菌属细菌具有杀菌或抑菌作用的药剂。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择患者进行治疗以降低患者中变形杆菌属细菌的水平，其中变形杆菌属细菌被检测到存在于从患者中获取的样品中。
10.权利要求9所述的方法，其中所述样品从切除手术后的患者中获得。
11.权利要求10所述的方法，其中所述样品从切除手术后约6个月至约18个月的患者中获得。
12.一种确定切除手术后疾病复发风险增加的克罗恩病患者的方法，所述方法包括确定从患者获取的样品中变形杆菌属细菌的存在与否，其中样品中变形杆菌属细菌的存在表明患者切除手术后疾病复发的风险增加。
13.权利要求12所述的方法，其中所述方法包括确定从切除手术后患者中获取的样品中变形杆菌属细菌的存在与否。
14.权利要求13所述的方法，其中所述患者样品在切除手术后约6个月至切除手术后约18个月时获取。
15.权利要求14所述的方法，其中所述患者样品在切除手术后约6个月获取。
16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述样品从患者的回肠粘膜获取。
17.权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向患者推荐降低患者变形杆菌属细菌水平的治疗过程。
18.一种治疗克罗恩病的方法，包括实施权利要求12-17中任一项所述的方法，并且向患者使用降低患者中变形杆菌属细菌水平高的组合物。
19.权利要求12-18中任一项所述的方法，其中变形杆菌属细菌的存在与否通过16srRNA测序确定。
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