KR20180044259A - 크론병 치료 방법 - Google Patents

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KR20180044259A
KR20180044259A KR1020187001443A KR20187001443A KR20180044259A KR 20180044259 A KR20180044259 A KR 20180044259A KR 1020187001443 A KR1020187001443 A KR 1020187001443A KR 20187001443 A KR20187001443 A KR 20187001443A KR 20180044259 A KR20180044259 A KR 20180044259A
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마이클 앨버트 캄
칼 던 크릭우드
피터-필립 드 크루즈
조셉 웨그너
에밀리 케이트 라이트
마이클 타다오 이노우에
슈 메이 테오
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머독 칠드런스 리서치 인스티튜트
세인트 빈센츠 호스피털(멜버른) 리미티드 트레이딩 애즈 세인트 빈센츠 호스피털 멜버른
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Abstract

본 발명은 만성 염증을 특징으로 하는 염증성 장 질환의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 크론병의 수술 후 재발을 예측, 치료, 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

크론병 치료 방법
분 발명의 분야는 만성 염증을 특징으로 하는 염증성 장 질환에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 분야는 크론병 치료 방법들에 관한 것이다.
크론병은 입에서부터 항문까지의 위장관의 어느 부분에 영향을 줄 수 있는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD)이다. 이는, 복통, 심한 설사, 피로, 체중 감량 및 영양실조를 가져올 수 있는 위장관의 내벽의 염증을 야기한다. 크론병에 의해 야기되는 염증은 다양한 사람들에서 위장관의 상이한 영역을 포함할 수 있다. 크론병에 의해 야기되는 염증은 종종 감염된 장 조직의 층들 내로 깊이 퍼진다. 크론병은 고통스럽고 쇠약해질 수 있으며, 종종 생명을 위협하는 합병증을 야기할 수 있다. 크론병은 장폐색, 장내 궤양들, 및 충분한 영양을 가지는 문제들과 같은 합병증을 발생할 수 있다. 다른 합병증은 위장관 밖에서 야기할 수 있으며, 빈혈, 피부 발진들, 관절염, 안구의 염증, 및 피로를 포함할 수 있다. 질환을 갖는 어린이는 성장 문제들을 가질 것이다.
치료는 증상을 조절하는 것을 도울 수 있으며, 의약들, 영양 보충제들, 및/또는 수술을 포함할 수 있다. 어떤 사람들이 오랜 기간의 차도(remission)를 가지는 동안, 증상이 없을 때, 크론병을 위한 치료제는 없다. 따라서, 크론병의 관리 및 치료를 위한 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명자들은 크론병이 건강과는 별개의 미생물 특징과 관련되어 있다는 것을 결정하였다. 특히, 본 발명자들은, 프로테우스 spp(Proteus spp)가, 매우 낮은 존재량에서 검출될 때에도 크론병 및 수술 후 질환 재발의 발생에 특정한 역할을 가진다는 것을 결정하였다.
따라서, 제1 양태는 환자의 크론병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
제2 양태는 수술적 절제술 이후 환자에서 크론병의 재발을 치료 및 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
제1 및 제2 양태들의 일 실시예에서, 상기 방법은 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다.
일 실시예에서, 조성물은 수술적 절제술 이후 환자에게 투여된다.
제1 및 제2 양태들의 다른 실시예에서, 환자는 수술적 절제술 이후 내시경 검사, CT 촬영, MRI 및/또는 바이오마커 분석에 의해 질환 개발을 갖는 것으로 식별된다.
제1 및 제2 양태들의 또 다른 실시예에서, 방법은 크론병의 수술 후 재발의 치료를 위한 것이다.
제1 및 제2 양태들의 일 실시예에서, 조성물은 프로테우스 속의 박테리아에 대한 살균제 또는 제균제를 포함한다. 일 실시예에서, 조성물은 항균 조성물 또는 항생제이다.
제1 및 제2 양태들의 또 다른 실시예에서, 방법은 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키기 위해 치료를 위해 환자를 선택하는 단계를 포함하며, 프로테우스 속의 박테리아는 환자로부터 얻어지는 샘플 내에 존재한다.
일 실시예에서, 샘플은 환자의 수술적 절제술 후로부터 얻어진다.
실시예에서, 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월 내지 약 18개월에 환자로부터 얻어진다.
하나의 특정한 실시예에서, 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월에 얻어진다.
또 다른 실시예에서, 샘플은 환자의 회장 점막으로부터 얻어진다.
제3 양태는 수술적 절제술 이후 질환 재발의 증가된 위험에서 크론병 환자를 식별하는 방법을 제공하고, 방법은 환자로부터 얻어지는 샘플 내의 프로테우스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하며, 샘플 내의 프로테우스의 존재는 환자가 수술적 절제술 후 임상 재발의 증가된 위험을 갖는다는 것을 나타낸다.
제3 양태의 일 실시예에서, 방법은 환자로부터 샘플을 얻는 단계를 포함한다.
제3 양태의 일 실시예에서, 방법은 수술적 절제술 후 환자로부터 얻어지는 샘플 내의 프로테우스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다.
제3 양태의 다른 실시예에서, 환자 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월 내지 수술적 절제술 후 약 18개월에서 얻어진다.
제3 양태의 다른 실시예에서, 환자 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월에 얻어진다.
제3 양태의 일 실시예에서, 샘플은 환자의 위장관으로부터 나온다. 제3 양태의 또 다른 실시예에서, 샘플은 환자의 회장 점막으로부터 얻어진다.
제3 양태의 일 실시예에서, 방법은 환자에서 프로테우스의 수준을 감소시키는 치료 과정을 환자에게 추천하는 단계를 추가로 포함한다.
제3 양태의 다른 실시예에서, 방법은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 수술적 절제술 후 임상 재발의 증가된 위험을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
제3 양태의 일 실시예예서, 방법은:
a. 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
b. 프로테우스가 샘플 내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계;
c. 프로테우스의 존재가 검출될 때 수술적 절제술 후 임상 재발의 증가된 위험을 갖는 환자를 진단하는 단계; 및
d. 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 진단된 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
제4 양태는 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키기 위해 치료를 위해 크론병 환자를 선택하는 방법을 제공하며, 방법은 수술적 절제술 후 환자로부터 얻어지는 샘플 내에 존재하는 프로테우스 속의 박테리아를 갖는 환자를 식별하는 단계를 포함하고, 샘플 내에 존재하는 프로테우스 속의 박테리아를 갖는 환자가 치료를 위해 선택된다.
제4 양태의 일 실시예에서, 방법은:
a. 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
b. 프로테우스가 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 단계;
c. 프로테우스의 존재가 환자 샘플 내에서 검출될 때 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키기 위해 치료를 위해 환자를 선택하는 단계; 및
d. 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 선택된 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
제5 양태는 제3 또는 제4 양태들의 방법을 수행하는 단계 및 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 크론병 치료 방법을 제공한다.
제4 또는 제5 양태들의 일 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재는 박테리아의 16s rRNA 서열분석, PCR 및/또는 배양에 의해 결정된다.
제1 내지 제5 양태들의 일 실시예에서, 방법은 환자의 위장관 내의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 하나의 특정한 실시예에서, 방법은 환자의 회장 및/또는 결장 내의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
제1 양태의 일 실시예는 크론병의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 제제의 사용을 제공한다.
제2 양태의 일 실시예는 크론병의 수술 후 재발의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 시 환자의 회장 및/또는 결장 내의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 제제의 용도를 제공한다.
제1 양태의 다른 실시예는 크론병의 치료에 사용하기 위해 환자에서 프로테우스 속의 박테리움의 수준을 감소시키는 제제를 제공한다.
제2 양태의 다른 실시예는 크론병의 수술 후 재발의 치료 또는 예방에 사용하기 위해, 환자에서 프로테우스의 수준을 감소시키는 제제를 제공한다.
여기에 설명된 바와 같은 용도 또는 제제의 일 실시예에서, 크론병의 재발은 임상 재발이다.
전술한 양태들의 각각의 일 실시예에서, 방법은 추가의 치료제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 크론병의 치료를 위한 다른 치료제는 본 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 예를 들어, 추가의 치료제는 항염증제 또는 면역계 억제제일 수 있다. 크론병의 치료에 사용되는 항염증제들의 예시들은 5-아미노살리실산염 및 코르티코스테로이드를 포함한다. 면역계 억제제들의 예시는 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 인플릭시맵, 아달리무맙, 세르톨리주마브 페골, 메토트렉사트, 시클로스포린, 타크로리무스, 나탈리주마브, 베돌리주마브, 및 우스텔리무마브를 포함한다.
제1 내지 제5 양태들의 다른 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계는 박텔ㅇ의 성장을 억제하거나 박테리아를 사멸시키는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계는 환자로부터 박테리아를 제거하는 단계를 포함한다.
제6 양태는 환자의 크론병의 치료의 효능을 모니터링하는 단계를 제공하며, 방법은 크론병의 대상을 치료하는 단계 및 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 프로테우스 속의 박테리아의 존재는 질환 진행 또는 질환 재발을 나타낸다.
제7 양태는 환자의 크론병을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 프로테우스 속의 박테리아의 존재는 환자의 질환 진행 또는 재발을 나타낸다.
제8 양태는 크론병의 치료 및 예방을 위한 후보 화합물을 식별하는 단계를 제공하며, 방법은:
후보 화합물을 프로테우스 속의 박테리아와 접촉시키는 단계, 및
후보 화합물이 박테리아의 성장을 사멸시키거나 억제하는지 결정하는 단계를 포함하며,
박테리아의 성장을 사멸시키거나 억제하는 후보 화합물은 크론병의 치료를 위한 후보 화합물이다.
여기에 설명된 양태들 각각의 일 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아는 P. mirabilis, P. vulgaris, 및 P. penneri로부터 선택된다. 하나의 특정한 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아는 P. mirabilis이다.
명백해질 바와 같이, 본 발명의 일 양태의 바람직한 피처들 및 특징들은 본 발명의 많은 다른 양태들에 적용가능하다.
본 명세서 전체적으로, 단어 "포함하다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형들은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 암시하지만, 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 제외가 아니라는 것이 이해될 것이다.
이하, 본 발명은 이하의 비제한적인 실시예들에 의해, 첨부된 도면들을 참조하여 설명된다.
도 1. (A) 비가중(unweighted) UniFrac 거리와, 환자 그룹: 크론병(Crohn's disease; CD), 건강한 대조군(healthy controls)(H) 및 수술 대조군(surgical controls)(S)에 따라 착색된 샘플들의 주좌표 그림. 숫자들은 CD 환자들(0: 기준선, 1: 6개월, 2: 18개월)에 대해 샘플이 얻어진 시점을 반영한다. PC1, PC2, 및 PC3는 대부분의 다양성이 캡처된 탑 3개의 주좌표를 나타낸다. (B) 및 (C) 비가중 UniFrac 거리와, 샘플 위치(문합 및 회장)에 기초하여 착색된 (B) 6개월 샘플들 및 (C) 18개월 샘픔들의 주좌표 그림. 블랙 라인은 동일한 시점에서 동일한 환자로부터의 샘플과 조인한다.
일반적인 기술 및 정의들
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 여기에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지는 것으로 여겨져야 한다(예를 들어, 미생물학, 생화학, 및 면역학에서).
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 이용된 미생물학, 생화학, 및 면역학적 기술은 본 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 표준 공정들이다. 이러한 기술들은 J, Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook and Russell., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트들을 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지 모든 업데이트들을 포함)와 같은 출처들의 문헌 전체적으로 기술되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 2개의 의미에 대해 또는 어느 하나의 의미에 대해 명시적인 지지를 제공하도록 여겨져야 한다.
여기서 사용되는 용어들 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 환자의 프로테우스의 수준을 감소시키고, 크론병의 발병 또는 진행을 감소시키거나, 또는 크론병의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한 약제학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
여기서 사용되는 용어들 "예방", "예방하다" 또는 "예방하는"은 환자가 크론병의 적어도 하나의 징후 또는 진단 결과 또는 증상을 발달시키지 못하게 보호하거나, 또는 크론병의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 나타낸다.
여기서 사용되는 "투여하는"은 광범위하게 이해되며, 여기에 설명된 바와 같은 조성물 또는 치료제를 대상 또는 환자에게 투여하는 단계뿐만 아니라, 예를 들어, 환자에게 프로드러그의 제공에 의해, 조성물 또는 치료제를 세포에 제공하는 단계를 포함한다.
여기서 사용되는 구 "박테리아의 수준을 감소시키는 것"은 여기서 설명된 바와 같은 치료 결과로서 및 여기서 설명된 방법에 따라 치료되지 않은 환자와 비교할 때, 환자의 박테리움의 수, 농도 또는 양의 감소를 나타낸다. "박테리아의 수준을 감소시키는 것"은 또한 환자로부터 박테리움을 제거하는 단계를 포함한다.
크론병/재발의 치료 및 예방
16s rRNA의 차세대 서열분석에 의해 환자 샘플들의 미생물상을 연구함으로써, 본 발명자들은, 수술 후 재발을 포함하는 크론병이 크론병 환자들의 프로테우스 속으로부터 박테리아의 수준을 감소시킴으로써 치료되거나 예방될 수 있다는 것을 결정하였다. 또한, 본 발명자들은 수술적 절제술 후 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 검출함으로써, 환자가 질환 재발의 증가된 위험을 갖는지 여부를 결정할 수 있고, 그에 의해 적합한 치료의 또는 예방 치료 계획을 추천할 수 있다는 것을 알게 되었다.
크론병의 재발은 조직학적으로, 내시경적으로, 방사선 사진술로 또는 CT 촬영, 초음파 또는 MRI와 같은 다른 영상 기술, 또는 (증상들의 나타남에 의해) 임상적으로 정의될 수 있다. 중요하게는, 증상들의 존재에 기초한 임상 재발은 내시경적/조직학적/바이오마커(대변 또는 염증의 혈청 마커들과 같은) 재발에 뒤쳐지는 경향이 있고, 대부분의 환자들은 임상적으로 침묵 질환이지만 염증의 내시경적, 생화학적 또는 조직학적 증거를 가질 것이다. 이러한 이유로, 환자들은 수술 후 6-12개월에서 문합 검사와 회결장경검사를 받는다.
점막 치료는 크론병의 의학적 치료를 위한 신생(emerging) 주요 엔드 포인트(end point)이기 때문에, 내시경 재발은 수술 후 세팅에서의 미래 합병증의 최상의 예측 변수로서 권유되어왔다. 내시경 재발 점수화 시스템은 Rutgeerts(Rutgeerts 점수)에 의해 개발되어왔다. 이러한 점수화 시스템은 수술후 크론병 환자들의 회결장 문합에서 점막의 내시경 외관에 포커싱한다. 여기에 설명된 바와 같은 치료 방법은 경증 내지 중증 질환 및 수술적 또는 수술후에 임의의 스테이지에서 크론병을 치료하는데 사용될 수 있다.
환자에서 크론병의 치료의 효능을 모니터링하는 방법뿐만 아니라, 질환 진행 또는 재발을 모니터링하는 단계들이 또한 제공되고, 방법들은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "진행"은 환자의 질환 상태가 보다 심각해지는 것을 말한다. 예를 들어, 환자의 질환 진행은 질환 차도에서 질환 재발로 진행하는 환자를 포함하며, 이는 다른 영상 기술 또는 바이오마커 분석에 의해, 내시경적으로 검출되는 임상적 증거 질환 또는 무증상 재발일 수 있다. 질환 진행은 또한 예를 들어, 경증 내지 중등도 질환 또는 중등도 내지 중증 질환으로 진행하는 크론병 환자를 포함한다.
프로테우스 의 수준 감소
프로테우스는 그램-음성 프로테오박테리아의 속이다. 프로테우스 바실러스는 사물기생균으로서 사실상 광범위하게 분포되어 있으며, 동물질, 하수, 토양 비료, 및 사람 및 동물 대변을 분해하는데 발견된다. 이들은 소변 및 부패성 감염들은 종종 병원을 공통으로 담당하는 기회주의적 병원균들이다. 3개의 종들, P. miribilis, P. vulgaris, 및 P. penneri은 요로 감염증에 책임이 있는 병원균들을 포함하는, 기회주의적인 사람 병원균들이다.
종, 균주들, 아종 또는 서브-균주들을 포함하는 프로테우스 속의 박테리아의 수준은 생물체(들)이 민감한 다른 약제들 또는 항생제들을 투여함으로써 감소되거나 제거될 수 있다. 이러한 약제들은 제균 및 살세균 조성물들을 포함하여 항균 화합물들 및 항생제들을 포함한다. 통상의 지식을 가진 자는 프로테우스 spp.에 대해 활성인 적합한 항균 또는 항생제 조성물들을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, P. mirabilis 균주들은 암피실린 및 세팔로스포린에 민감한 것으로 알려져 있다. 프로테우스 감염을 치료하는데 사용되어온 항생제들의 예는 젠타마이신, 토브라마이신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 암피실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐, 세파졸린, 세프트리악손, 세프타지딤, 세페핌, 및 트리메소프림-셀파메톡사졸을 포함한다.
대안적으로, 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물은 박테리아 분자 또는 단백질을 결합하고/하거나 중화시키는 항체를 포함할 수 있거나, 조성물은 프로테우스 속의 박테리아를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아의 수준은 프로바이오틱 조성물의 존재 하에 프로테우스 속의 박테리아를 다른 경쟁자들보다 뛰어나거나 성장할 수 있는 박테리아의 유익한 균주들의 성장을 촉진시키는 프로바이오틱 조성물을, 환자에게 투여하거나 공급함으로써 감소될 수 있다.
추가의 치료제들
여기서 설명된 방법에서, 환자는 또한 추가의 치료제에 의해 치료될 수 있다. 크론병의 치료를 위한 이러한 치료제들은 본 기술 분야에 알려져 있다. 치료제는 예를 들어, 항염증제 또는 면역계 억제제일 수 있다. 크론병의 치료에 사용되는 항염증제들의 예시들은 5-아미노살리실산염 및 코르티코스테로이드를 포함한다. 면역계 억제제들의 예시들은 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 인플릭시맵, 아달리무맙, 세르톨리주마브 페골, 메토트렉사트, 시클리스포린, 타크로리무스, 나탈리주마브, 베돌리주마브, 및 우스텔리무마브를 포함한다.
프로테우스의 검출
환자 샘플 내의 박테리움의 수준 또는 양을 결정하기 위한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 프로테우스 spp.의 존재는 이에 제한되지는 않지만, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 핵산 혼성화 또는 서열분석 기술들을 포함하는, 미생물 배양 기술들, 생화학적 분석들 또는 분자 기술들을 사용하여 식별될 수 있다. 대안적으로, 방법은 PCR과 같은 기술에 의해 박테리아성 핵산 서열을 증폭시키는 단계 및 핵산을 클로닝 및/또는 서열분석하는 단계를 포함할 수 있다. 박테리아의 식별은 또한 차세대 고처리량 서열분석 기술들의 사용을 포함하여, 16s rRA의 서열분석에 의해 달성될 수 있다.
박테리아는 또한 면역학적 방법들을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 프로테우스 속의 박테리아와 교차 반응하는 항체들 또는 항혈청은 적합한 면역학적 분석에서 사용될 수 있다. 면역학적 분석은 효소 결합 면역흡착제 분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 및 딥-스틱 타입 분석과 같은 고체 지지체들을 사용하는 것들을 포함한다. 이러한 면역학적 분석은 형광, 방사성 또는 화학 발광의 표지 항체들 또는 염료 분자들을 포함하는 표지 항체들를 이용할 수 있다.
단백질 검출 기술
일 실시예에서, 박테리아성 항원, 단백질 또는 프로테우스 속의 박테리아로부터의 단백질의 면역원성 단편이 환자 샘플에서 검출된다. 다른 실시예에서, 박테리아에 특이적인 항체가 환자 샘플에서 검출된다. 예를 들어, 방법은 환자로부터 유래된 생물학적 샘플을 박테리아성 항원 또는 단백질을 결합할 수 있는 항체와 접촉하는 단계 및 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
여기에 고려된 검출 시스템들은 예를 들어, SDS/PAGE, 등전위 초점법, SDS/PAGE 및 등전위 초점법을 포함하는 2차원 겔 전기 영동법과 같은 사람 객체로부터 분리되는 생물학적 샘플에서, 비단백질 항원들을 포함하는 단백질들 또는 항원들을 검출하기 위한 임의의 알려진 분석, 면역분석, 유동 세포 분석법, 예를 들어, 형광 활성 세포 분리(fluorescence-activated cell sorting; FACS), 예를 들어 소분자와 같은 비항체 화합물 또는 항체를 사용하는 검출 기반 시스템을 포함한다. 이들 실시예들에 따라, 항체 또는 소분자는 단백질들을 검출할 수 있는 임의의 표준 고체상 또는 용액 상 분석 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 질량 분석법, MALDI-TOF, 바이오센서 기술, 소실성 광섬유들, 또는 형광성 공명 에너지 전달을 사용하는 것과 같은 광학 또는 형광 검출은 본 발명에 의해 명확하게 포함된다. 질량 샘플들의 고처리량 스크리닝에 사용하기에 적합한 분석 시스템들, 고처리량 분광 공명 방법, 예를 들어, MALDI-TOF, 전기 분무 MS 또는 나노-전기 분무 MS)이 또한 고려된다.
예를 들어, 면역 블롯, 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 효소 결합 면역흡착제 분석(ELISA), 방사면역분석(radioimmunoassay; RIA), 효소 면역분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역분석 형식들이 특히 적합하다. 형광성 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; FRET), 동위원소-코딩 친화 태그(isotope-coded affinity tags; ICAT), 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight; MALDI-TOF), 전기분무 이온화(electrospray ionization; ESI), 바이오센서 기술, 소실성 광섬유 기술 또는 단백질 칩 기술을 이용하는 수정된 면역분석들이 또한 유용하다.
일 실시예에서, 분석은 반정량 분석 또는 정량 분석이다. 표준 고체상 ELISA 포맷들은 다양한 환자 샘플들로부터 단백질 또는 항원의 농도를 결정하는데 유용하다.
일 형태에서, 이러한 분석은 프로테우스 속의 박테리아 또는 그의 면역원성 단편으로부터의 단백질 또는 항원에 대한 항체들을 포함하는 생물학적 샘플을, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로웰 또는 딥스틱, 멤브레인, 또는 유리 지지체(예를 들어, 유리 슬라이드)와 같은 고체 매트릭스 상에 고정화시키는 단계를 포함한다.
핵산 검출 기술
조직 내의 프로테우스 속의 박테리아로부터 핵산의 정성 및/또는 정량 검출을 가능하게 하는 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 표준 대조군 또는 음성 대조군을 참조하여 비교가 이루어질 수 있다. 핵산은 유전자 어레이 상에 표지되고 혼성화될 수 있으며, 유전자 농도는 어레이에서 발생된 방사성 또는 형광 신호의 세기에 정비례할 것이다.
하나의 특정한 예시에서, 크론병, 질환 재발 또는 질환 진행은 프로테우스 속의 박테리아로부터 핵산 프로브와 핵산 사이의 하이브리드 복합체의 형성을 가능하게 하는 엄격한 혼성화 조건 하에, 환자 샘플들로부터 분리된 핵산을 핵산 프로브에 접촉시킴으로써 및 샘플들 내의 하이브리드 복합체의 존재를 검출함으로써 진단될 수 있다. 진단제로서 사용하기 위해, 검출을 돕기 위해 핵산을 표지하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 검출의 수준은 예를 들어, 건강한 시편 또는 표준 대조군으로부터의 유전자 수준들과 같은 대조군 수준들과 비교되며; 환자 조직으로부터 하이브리드 복합체의 변화된 수준의 검출은 질환, 질환 재발 또는 질환 진행을 나타낸다.
여기서 사용된 용어 "혼성화"는 수소 결합에 의한 2개의 핵산 분자들의 서로에 대한 회합을 말한다. 이러한 결합에 영향을 주는 팩터들은: 용매의 타입 및 부피; 반응 온도; 혼성화 시간; 교반; 고체 지지체(덴하르트 시약 또는 BLOTTO)에 대한 액체상 분자의 비특이적 결합을 차단하는 제제; 분자들의 농도; 분자들(덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 회합 속도를 증가시키는 화합물들의 용도; 및 혼성화 이후 세척 조건들의 엄격성(Sambrook et al. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (2001) 참조)을 포함한다.
"엄격성"은 상이한 분자들의 회합에 대해 매우 유사한 분자들의 회합에 유리한 혼성화 반응의 조건들을 말한다. 높은 엄격성 혼성화 조건들은, 50% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨, pH8.0), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 microgram/ml의 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 42℃에서 밤새 배양 이후 대략 65oC에서 0.1 x SSC로 필터를 세척하는 것으로서 정의된다. 낮은 엄격성 조건들은 5 35oC에서 수행되는 혼성화 반응을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법들에서 혼성화를 위해 사용되는 조건들은 높은 엄격성 조건들이다. 핵산은 테스트용 샘플로부터 바람직하게 분리된다. 적합한 방법들이 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려질 것이다.
본 발명의 특정한 실시예들에서, 리보솜 RNA("ribosomal RNA; rRNA")는 박테리아를 구별하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아성 리보솜은 작은 및 큰 서브유닛으로 구성되며, 각각은 추가로 리보솜 RNA 및 단백질들로 구성된다. 작은 서브유닛으로부터의 rRNA는 SSU rRNA라 할 수 있으며, 더 큰 서브유닛으로부터의 rRNA는 LSU rRNA라 할 수 있다. 다수의 rRNA들이 서열분석되었으며, 이들은 다양한 접근가능한 데이터베이스들에서 공개적으로 이용가능하다. 따라서, 일 실시예에서, 프로테우스 속의 박테리아는 게놈 DNA로부터 증폭하는 도데인-수준 PCR 반응에 의해 발생되는 16s 리보솜 RNA(rRNA) 유전자 앰플리콘들을 서열분석함으로써 환자 샘플 내에서 검출된다. 전통적으로, rDNA의 서열분석은 PCR 앰플리콘들의 클로닝 및 생어(모세관 전기이동) 서열분석에 의해 수행된다. 차세대 서열분석의 출현은 16S rRNA 유전자 서열분석을 위한 서열분석 깊이를 상당히 단순화시키고, 증가시켰다. 벤치탑(benchtop) 서열분석기들의 도입은 이제 통상의 지식을 가진 자가, 16S rRNA 서열분석 및 수일에 인하우스 분석을 수행하는 것을 가능하게 한다.
실시예들
실시예 1. 크론병 환자들의 16s 미생물군 프로파일의 식별
CD의 미생물군집의 이해를 개선시키기 위해, 본 발명자들은 수술 후 CD 질환 재발 및 차도를 예측하거나 이에 관련된 16S 미생물군을 식별하기 위해, 수술 시부터 수술 후 18개월까지의, CD 환자들의 잘 특징화된 고유 코호트(unique cohort) 코호트에서 연구를 수행했다. 본 발명자들은 모든 거시적 질환의 절제술 후, 수술 전 및 수술 후에 수집되는 34명의 CD 환자들로부터의 141개의 점막 생검 샘플들에 대해 차세대 서열분석을 수행하였다. 상이한 위치들(회장 및 문합)에 대한 샘플 크기 및 동시 샘플링 및 차세대 서열분석의 사용은 질환과 관련된 미생물군집의 이해에 대한 중요하고 상당한 기여를 나타낸다.
실시예 2. 재료들 및 방법들
대상들 및 윤리 승인
본 연구는 수술 후 크론병(CD)의 관리를 점검하는 연구(수술 후 크론 내시경 재발(Post-Operative Crohn's Endoscopic Recurrence; "POCER") 연구)와 병행하여 실시되었다. 연구는 호주 멜버른의 세인트 빈센트 공공 및 사립 병원들 및 호주 멜버른 왕립 멜버른 병원의 사람 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
POCER 연구는 조기 점막 재발에 대한 수술 후 내시경적 평가 및 치료 단계의 값을 측정하는 것을 목적으로 하는 기대되는 무작위 대조 시험이 있었다. 환자들은 재발의 위험에 따라 층화되었다. 흡연자들, 천공성 질환을 갖는 환자들, 또는 1회 이상의 이전 절제술을 받은 환자들은 "고위험"으로 분류되었고; 다른 모든 이들은 "저위험"이었다. 모든 환자들은 모든 거시적 질환의 절제술을 받았고, 이후, 3개월의 메트로니다졸을 받았다. 고위험 환자들은 또한 매일 아자티오프린(2mg/kg/1일) 또는 6-메르캅토퓨린(1.5mg/kg/1일)을 받았다. 티오푸린에 비내성인 고위험 환자들은 아달리무맙 유도(160mg/80mg)를 받았고, 이후, 2주마다 40 mg을 받았다. 저위험 환자들은 추가 약제를 받지 않았다.
환자들은 6개월(적극적인 치료)에 결장경검사로 또는 결장경검사 없이(표준 치료) 무작화되었다. 6개월에 내시경 재발(Rutgeerts 점수≥ i2)의 경우, 환자들은 티오푸린, 격주로 티오푸린을 갖는 아달리무맙, 또는 매주 아달리무맙이 증가했다. 1차 엔드-포인트는 18개월에 내시경 재발이었다. 내시경적 차도는 Rutgeert의 점수를 사용하여 정의되었다.
무손상 결장을 갖는 장암의 가족력을 갖는 환자들이 건강한 대조군들로 모집되었고, 결장경검사가 정상적인 경우에만 포함되었다. 수술 대조군들은 결장암에 대한 회장-결장 절제술 또는 우결장반절제술을 이전에 받은 감시 결장경검사를 받은 환자들을 포함했다.
CD 환자들로부터의 점막 샘플들은 절제술 시 및 수술 후 6 및/또는 12개월에 결장경검사에, 및 스크리닝 결장경검사 시 단일 시점에서의 대조군에서 수집되었다. 대변 샘플들은 대변 칼프로텍틴(fecal calprotectin; FC)의 측정을 위해 수술 후 6개월 및 18개월에서 얻어졌다.
수술 전 한달 내 항생제들 및 프로바이오틱스를 받은 CD 환자는 없었다. 수결장경검사 전 한달 내 항생제들 및 프로바이오틱스를 받은 건강한 대조군은 없었다. 환자들은 수술 하루 전 폴리에틸렌 글리콘으로 장내 세척을 하였고, 결장경검사 전 환자들 및 건강한 대조군들에 동일한 제제가 사용되었다.
조직 수집 및 DNA 추출 방법들
CD 환자들에서, 5-10 mg의 조직 샘플들은 감염된 회장의 영역에서 절제 시편으로부터 얻어졌다. 6개월 및 18개월의 결장경 검사에서 6개의 조직 샘플들(대략 5-10 mg)은 문합 및 네오-말단 회장에서 동일한 환자들로부터 수집되었다. 건강한 대조군들에서, 생검은 회장으로부터 실시되었고, 수술 대조군들에서, 생검은 문합 및 네오-말단 회장으로부터 얻어졌다. 표준 내시경 겸자가 사용되었고, 조직은 4℃ 밤새 유지되어 완전한 조직 침투를 가능하게 하고, 이후, 분석 전 80℃에서 저장된, 1ml RNA(Ambion)를 포함하는 멸균 튜브 내에 배치되었다. 조직 샘플들은 이후 해동되었고, 균질화되었으며, DNA는 제조자의 지시에 따라 QIAGEN AllPrep Mini 키트를 사용하여 균등액으로부터 추출되었다.
대변 수집
대변 샘플들은 FC의 측정을 위해 수술 후 6개월 및 18개월에 수집되었다. 환자들은, 연구 방문전 3일 전에 대변 샘플들을 수집하거나, 또는, 결장경검사가 수행되는 경우, 결장경검사 3일 전에, 대변 준비를 시작하도록 지시받았다. 샘플들은 환자의 가정용 냉동고에서 -20℃에서 보관되었고, 얼음으로 이송되었으며, 임상 연구의 결론까지 연구 센터에서 -80℃에서 저장되었다.
16s rRNA 유전자 서열분석
박테리아성 16S rRNA 가변 영역 2는 확장 고충실도(Expand High Fidelity) PCR 키트(Roche)를 사용하여 Illumina 인덱스/어댑터들에 의해 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 생성물들은 Qiagen DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제되었고, 양단으로부터 250 bp 서열분석을 가능하게 하는 250 사이클의 화학 공정을 사용하여 호주 게놈 연구 시설(Australian Genome Research Facility; AGRF)에서 수행된 Illumina MiSeq 서열분석 전에 나노드롭(Nanodrop)을 사용하여 정량화되었다.
생물 정보학 및 통계학적 분석
한 쌍의 말단 서열 리드들을 중첩하여 발생되는 MiSeq는 함께 스티칭되었고, QIME 1.8.0 리드들을 사용하여 수행된 데이터 파이프라인에서 처리되었다. 리드들은 Fastxtoolkit 버전 0.0.14를 사용하여 200 bp로 트리밍되었고, 한 쌍의 말단 리드들은 Flash 버전 1.2.7.16을 사용하여 병합되었다. 병합된 서열들은 다음과 같이 품질이 필터링되었다: 트리밍 전에 허용된 ≤ 3 저품질 bp(Phred 평가 점수< 3), 언콜드 베이스(uncalled bases; Ns)가 없는 ≥189 연속 고품질 bp. 17개의 키메라는 UCHIME 참조-기반 방법을 사용하여 제거되었다. 총 2,464,848개의 서열들이 필터링(7%)되었고, 분석을 위해 35,034,316개를 남겼다. 품질 필터링된 서열들은 Greengenes 97% OTU 참조 집단, 버전
Figure pct00001
을 갖는 QIIME vl.818에서 서브샘플링된 개방 참조 방법을 사용하여 조작분류단위(operational taxonomic units; OTUs)에 할당되었다. 간략하게, 입력 서열들은 서열 분석 에러 가능성이 있는 서열들을 제거하기 위해 60%의 낮은 퍼센트의 일체성에서 참조 집단에 대해 미리 필터링되었다. 다음, 폐쇄형 참조 OTU 피킹이 필터링된 서열들에 적용되었다(폐쇄형 참조 방법은 UCLUST20를 사용하여 데이터베이스에 대한 각 리드를 검색하고, ≥ 97% 서열 일체성에서 최상의 히트(hit)에 기초한 OTU를 읽도록 할당한다). 폐쇄형 참조 단계에서 참조와 일치하지 않는 모든 서열들은 이후, 97% 유사성에서 데노보(de novo) 클러스터링된다. 개체 OTUs는 버려진다. 이는 샘플당 평균 >190,000(75020-465400의 범위)의 분류-할당된 서열들을 야기시켰다.
리드 수는 다양성 계산 전 각각의 75,000개의 리드들의 희박화를 사용하여 정규화되었다. 알파 다양성 측정(Shannon의 인덱스, chaol 및 OTU의 수)은 샘플당 10회의 독립적인 희박화 실행으로 평가되었다. 베타 다양성은 UniFrac 미터법을 사용하여 계산되었다. 주좌표들 분석은 비가중 UniFrac 거리 매트릭스 상에서 수행되었다. 회귀 분석은 보고된 가장 중요한 값을 갖는 제1의 3개의 PCs 상에서 수행되었다.
분류학적 분석에서 통계학적 의의는 < 0.05의 P 값으로서 정의되었고, 다중 비교를 교정하기 위해, 거짓 발견율(false discovery rate; FDR) 조정이 있을 때 및 없을 때 모두 수행되었다.
내시경 시각적 평가
회장-결장경검사에서, 문합 및 네오-말단 회장에서 점막 재발이 내시경 의학자에 의해 Rutgeerts 점수에 따라 측정되었다. 6개월 및 18개월의 결장경검사 동안, 내시경적 차도는 Rutgeerts 점수 iO(병변 없음) 또는 il(< 5 아프타 병변)로서 정의되었고, 재발로서 i2(>5 아프타 병변 또는 문합에 제한된 더 큰 병변), i3(광범위 회장염), 또는 i4(큰 궤양 및/또는 협소부를 갖는 광범위 염증)이 정의되었다. 문합 및 네오-말단 회장의 사진들은 내시경 의학자의 점수 및 환자의 식별 및 치료에 맹검인 2명의 연구원들에 의해 독립적으로 점수화되었다. 최종 합의 점수가 2명의 맹검 평가자들에 의해 결정되었다.
대변 바이오마커 분석
대변 칼프로텍틴(FC)는 환자 데이터의 지식 없이 제조자의 지시에 따라 정량적 효소 면역분석(fCAL™, B
Figure pct00002
hlmann, Schonenbuch, Switzerland)에 의해 측정되었다. 농도는 대변의 μg/g로서 표현되었다. FC > 100μg/g이 수술 후 CD 내시경 재발의 진단에 민감하다는 것을 이전에 나타냈고, 분석을 위한 이러한 절단을 선택했다.
실시예 3. 결과
특이 수술 후 크론병 코호트
34명의 CD 환자들(41% 남성, 중위 연령 28세, 범위 23-43)은 수술 후 6개월 및/또는 18개월의 결정경검사에서, 수술적 절제술 시편(기준선)으로부터 및 회장 및 문합으로부터의 총 141개의 점막 생검 샘플들을 제공했다. 28개의 대조군 샘플들이 얻어졌으며, 이들은 정상 결장을 갖는 12명의 건강한 환자들(건강한 대조군들)로부터의 12개의 결장 샘플들 및 8개의 수술 대조군들로부터의 16개의 회장 및 문합 샘플들을 포함했다. CD 환자들 및 대조군들에 대한 인구 통계가 표 1에 도시되어 있다. CD 환자들의 중위 연령은 건강한 및 수술 대조군 모두의 중위 연령보다 낮았다.
34명의 CD 환자들 중, 27명이 6개월에 결장경검사를 받았고, 이들 중 17명은 내시경적 차도였고 10명은 질환 재발이 있었다. 18개월에, 27명의 환자들은 결장경검사를 받았고, 이들 중 13명은 내시경적 차도였고 14명은 질환 재발이 있었다.
표 1.인구 통계
Figure pct00003
Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 샘플당 평균 >190,000(범위 75020-465400)의 분류-할당된 16S의 서열들이 얻어졌다. 리드 수(read counts)는 다양성 계산 전 각 샘플을 75000 리드들(희박화)로 무작위하게 서브샘플링함으로써 정규화되었다. 분류군은, 숫자에 관계없이 임의의 리드들이 검출되는 경우 검출되는 것으로 분류되었다. 모든 샘플들의 <10%로 존재하는 임의의 분류군이 제외되었다.
알파 다양성
CD는 건강한 대조군들과 비교하여 계통발생 풍부도(알파 다양성)의 전반적인 감소와 관련이 있었지만, 조작분류단위(OTU) 수(각각 p<0.001 및 p=0.368), Shannon 다양성 인덱스(각각 p=0.002 및 p=0.552) 및 Chao 다양성 인덱스(각각 p<0.001 및 p=0.607)에 의해 측정될 때 수술 대조군들과는 관련이 없었다.
기준선 및 수술 후 샘플들이 비교되었을 때 CD 환자들에서 알파 다양성의 통계학적으로 상당한 차이가 없었다. 6개월 또는 18개월에서 내시경적 차도를 유지했던 이들 대 내시경 재발을 발달시킨 이들 사이의 기준선에서의 차이는 검출될 수 없었다. 내시경적 차도 대 재발(Rutgeerts ≥ i2)사이의 알파 다양성의 통계학적으로 상당한 차이는 없었으며, 점막 정상(Rutgeerts iO) 대 심한 재발(Rutgeerts i3 및 i4) 사이에도 없었다. 흡연자들은 비흡연자들과 비교하여 알파 다양성이 상당히 상이하지 않았다. 재발 및 차도의 별개의 측정으로서, FC > 10C μg/g는 FC ≤ 10C μg/g와 비교할 때 알파 다양성의 상당한 변화와 관련되지 않았다.
CD 코호트 내에, 문합과 비교할 때 네오-말단 회장으로부터 얻어진 샘플들 사이에 알파 다양성의 통계학적으로 상당한 차이는 없었다.
베타 다양성
크론병 및 건강
미생물 조성물은 CD(기준선에서)와 건강한 대조군들(P<O.001) 사이에서 상당히 달랐다. 수술 후 회장 절제술 및 회장-결장 문합을 고려하여, 수술 후 6개월 및 18개월에서 CD는 수술 대조군들과 상당히 달랐다(각각 P=0.022 및 P=0.027), 도 1a.
크론병-시간 및 샘플 위치
미생물 조성물은 CD 환자 내에서 시간 경과에 따라 변화했다. 기준선 절제 샘플들은 6개월(P=0.005) 및 18개월(P=0.001)에서 결장경검사에서 얻어진 샘플들과 상당히 상이했다. 6개월에 샘플들의 조성물은 또한 18개월(P=0.023)에서 얻어진 것들과 상당히 상이했다. 동일한 환자로부터 한번에 얻어진 회장 및 문합으로부터의 한 쌍의 샘플들은 상이한 환자들의 동일한 위치로부터 동시에 얻어진 샘플들과 상당히 보다 유사했다(평균 비가중 Unifrac 각각 0.39 대 0.63, P<0.001), 도 IB 및 1C.
크론병 - 내시경 재발, 대변 칼프로텍틴 및 흡연
내시경 재발을 발달시킨 CD 환자들과, 6개월 또는 18개월(각각 P=0.476 및 P=0.198)에 내시경 차도를 유지했던 이들로부터의 절제 샘플들(기준선)을 비교할 때, 베타 다양성에서 상당한 차이가 없었다. 내시경 재발(i2, i3, 및 i4)을 갖는 CD 환자들과 내시경적 차도(iO 및 il)의 이들 사이의 베타 다양성은, 6개월 또는 18개월(각각 P=0.926 및 P=0.074)에 상당히 상이하지 않았다. CD 중증 내시경 재발(i3 및 i4)은 6개월(n=5 v n=8; 베타 다양성 P=0.847)에서 점막 정상(iO)과 비교하여 상당히 상이하지 않았지만, 18개월(n=7 v n=5; 베타 다양성 P=0.010)에서 상당히 상이했다. FC ≤ 100 μg/g의 환자 대 FC > 100 μg/g(P=0.801 및 P=0.798)의 이들 사이의 베타 다양성의 6개월 또는 18개월에 상당한 차이가 없었으며, 흡연자들과 비흡연자들(각각 P=0.326 및 P=0.448) 사이에도 없었다.
질환 및 재발과 관련된 박테리아
크론병 및 건강
건강한 대조군들과 비교하여, CD(기준선)은 문 수준에서 증가된 프로테오박테리아, 방선균 및 푸소박테륨; 패밀리 수준에서 장내세균 및 속 수준에서 베요넬라, 헤모필루스, 엔터로코커스 및 푸소박테륨; 및 의간균류(문) 및 루미노코쿠스 및 라츠노스피라(속)의 감소를 포함하는, 여러 분류군의 존재량의 변화와 관련되어 있었다.
6개월 및 18개월에 CD를 수술 대조군들과 비교할 때, 알파 다양성의 상당한 차이가 없었으나, 여러 분류군의 존재량은 2개의 시간 모두에서 상당히 달랐다. 수술 후 6개월 및 18개월 모두에, 수술 대조군들과 비교하여, CD 샘플들은 패밀리 크리스텐셀라시아(Christensellacea) 및 프레보텔라 속을 감소시켰고, 트라우불시엘라(Traubulsiella) 속을 감소시켰다. CD와 건강한 대조군들 사이에서 관찰된 대부분의 분류학적 변화들은, CD와 수술 대조군 환자들이 비교되었을 때 관찰되지 않았으며, CD 환자들에서 수술 후 관찰된 많은 미생물 차이들이 염증성 질환의 존재라기보다는, 수술 및 재구성된 해부학의 결과일 수 있다는 것을 제안한다.
절제 및 후속 재발에서의 박테리아
기준선에서, 특정한 분류군의 상당한 차이점들은 내시경 재발을 발달시킨 환자들 대 6개월 또는 18개월에서 차도를 유지했던 이들 사이에서 관찰되었지만, 두개의 시점 모두에서 재발과 관련된 것은 없었다. Faecalibacterium의 존재량 또는 절제 시 프로테우스의 존재 또는 부재는 6개월 또는 18개월에 내시경 재발을 예측할 수 없었다.
시간 경과에 따른 수술 후 크론병 및 내시경 재발
CD의 박테리아성 조성물은 시간 경과에 따라 변했다(표 2). 스트렙토코카시에 및 02d06는 기준선과 6개월 사이에, 및 수술 후 6개월과 18개월 사이에 상당히 증가된 유일한 분류군이였다. 6개월에, 내시경 재발은 차도와 비교하여 프로테우스의 증가된 존재량(P=0.008)과 관련이 있었다. 로지스틱 회귀를 사용하여 흡연 상태를 교정하는 것은, 6개월에 프로테우스의 검출이, 검출가능한 프로테우스가 없을 때[OR 13 (1.1- 150), P=0.039]와 비교하여 제발의 상당히 높은 위험과 관련이 있었다.
18개월에, 내시경 재발은 패밀리 수준에서 데설포비브리나시에(P=0.004) 및 루미노코카시에(P=0.014)의 감소된 존재량 및 속 수준에서 Faecalibacterium(P<O.001), 데설포비브리오(P=0.011) 및 빌로필라(P=0.022)와 관련이 있었다. 흡연 상태를 교정할 때, Faecalibacterium의 단지 낮은 존재량(<0.1%)만이 내시경 재발[OR 14(1.7-110), P=0.013]을 위한 위험 팩터였다.
검출가능할 때, 프로테우스의 존재량은 매우 낮았다. 대조적으로, 검출가능할 때, Faecalibacterium은 더 큰 존재량으로 존재하였다. 프로테우스는 14명의 CD 환자들(21개의 샘플들)에서 어느 시간(기준선, 6개월 및 18개월)에서 검출되었다. 존재할 때 각 샘플로부터의 리드들의 중앙의 수는 35[사분위수 범위(IQR) 7-82]였다. 프로테우스는 건강하거나 또는 수술 대조군에서 검출되지 않았다. 6개월에, 검출된 프로테우스를 갖는 6명의 환자들 중 5명이 내시경 재발이 있었다. 18개월에, 1명의 환자는 검출된 프로테우스를 가졌으며-이러한 환자는 내시경 재발이 있었다.
표 2. 절제 시간으로부터 시간 경과에 따라 크론병의 미생물군 분류군의 존재량의 상당한 변화.
Figure pct00004
7명의 환자들은 기준선에서 및 6개월 또는 18개월에 검출된 프로테우스를 가졌으며; 이들 중 6명은 심한 재발(i3 또는 i4)을 갖는 4명을 포함하여 내시경 재발이 있었다. 한명의 환자는 6개월에 검출가능한 프로테우스에도 불구하고 내싱경적 차도(iO)를 유지했다. 완전한 점막 정상(iO)과 비교하여 18개월에 심한 내시경 재발(Rutgeerts i3 및 i4)은 문 프로테오박테리아(P=0.018)의 증가; 감소된 패밀리 루미노코카시에(P=0.003), 리케넬라시에(P=0.033) 및 튜리시박테라시에(P=0.33), 및 감소된 Faecalibacterium 속(P=0.005), 데설포비브리오(P=0.009), Lachnobacterium(P=0.009), 오실로스피라(P=0.023), 파라프레보텔라(P=0.033), 아토포비움(P=0.033), 오도리박테르(P=0.033) 및 튜리시박테르(P=0.033)와 관련이 있었다. 이들 변화는 6개월에 관찰되지 않았다.
흡연의 효과
이러한 코호트 내의 직접 흡연은 Faecalibacterium 및 프로테우스의 존재에 독립적으로, 내시경 재발[OR 3.3 (1-11) P=0.049]과 관련이 있었다. 직접 흡연은 6개월 및 18개월에 비흡연자들과 비교하여 여러 분류군의 상당한 차이들과 관련이 있었다(표 5). 6개월에 프로테우스는 비흡연자들과 비교하여 흡연자들에서 증가했다(P=0.037).
대변 칼프로텍틴
34명의 CD 환자들에서, FC>100 μg/g는 내시경 재발과 관련이 있었다[OR 6.4(1.02 - 51.4) P = 0.032]. 6개월에, 슈도모나스균 및 파르비모나스의 존재량(각각 P=0.030 및 P=0.042)은 FC > 100 μg/g를 갖는 환자에서 증가했다.
프로테우스, Faecalibacterium, 흡연 및 내시경 재발 사이의 관계
흡연은 수술 후 프로테우스의 증가된 존재량과 관련이 있었다. 프로테우스의 존재 및 Faecalibacterium의 낮은 존재량은 또한 내시경 재발의 증가된 위험과 독립적으로 관련이 있었다. 6개월 및/또는 18개월에 재발이 있는 24명의 환자들 중, 20명이, 낮은 Faecalibacterium 존재량 또는 프로테우스의 존재와 관련이 있었다.
Faecalibacterium의 높은 존재량 및 프로테우스가 없는 경우를 포함하는 6개월 또는 18개월에 미생물 프로파일은 84%의 내시경적 차도, 69%의 특이성, 70%의 양성 예측치(positive predictive value; PPV), 및 83%의 음성 예측치(negative predictive value ; NPV)에 대한 민감성을 가졌다.
내시경 재발의 진단에서, 프로테우스의 존재, Faecalibacterium의 존재량, 및 흡연 상태와 관련하여, 회장 점막의 미생물 분석을 이용하는 정확성은 리시버 작동 특성(receiver operator characteristic; ROC) 곡선 분석을 사용하여 모델링되었고, 내시경 재발(AUC 0.740, 95% CI 0.69-0.79)을 예측하는데 적당한 정확성을 산출했다.
종 수준에서의 분류학적 식별
이러한 연구에서, 코호트 867개의 OTUs는 Faecalibacterium으로서 식별되었다. 이들 중, 857개(99%)가 종 수준에서 F prausnitzii로서 식별되었다.
4개의 별개의 OTUs(Greengenes OTUs 4440497,814112,560629 및 데노보(de novo) OUT; Greengenes 16s rRNA 데이터베이스; greengenes.lbl.gov)는 프로테우스 속에 속하는 것으로 식별되었지만, 이들은 종 수준에서 식별될 수 없었다. 이들 중, OTU 814112는 프로테우스가 검출된 21개의 샘플들 중 19개에서, 가장 풍부하고(모든 리드들 중 65%) 적어도 부분적으로 존재했다. 이러한 OTU에 대한 대표적인 전체 길이 16S 서열이 검사되고 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 블라스트(BLAST) 참조 데이터베이스에 대해 비교되었을 경우, 이는 종 P. mirabilis에 가장 거의 일치했다(쿼리 커버 100%, E값 0.0, 일치성 95%). OTU 560629는 P. mirabilis의 경우 최상의 일치라는 것을 또한 알게 되었다(쿼리 커버 100%, E값 0.0, 일치성 98%).
실시예 4. 논의
CD를 갖는 환자들의 80%가 일생 동안 수술을 받지만, 질환 재발은 수술 1년 이내에 다수의 환자들에서 문합 및 네오-말단 회장에서 식별가능하다. 따라서, 네오-말단 회장에서 미생물 군집의 수술 후 연구들은 원인이 되는 중요성의 생물체들을 식별하는 잠재성을 갖는다.
본 발명자들은 건강한 대조군들과 비교하여 CD를 갖는 환자들의 미생물 프로파일들의 중요한 차이점들을 확인하였다. 추가의 분류군은 CD와 관련된 것으로 식별되어 왔다(표 2). 이러한 연구는 고처리량 Illumina 서열 분석을 이용해왔으며, 깊은 서열분석 및 낮은 존재량을 갖는 생물체들의 잠재성 식별을 제공했다.
이 연구를 위해 회장 생검의 분석이 선택되었다. 회장은 CD의 주요한 면역학적 유도성 위치인 것으로 생각된다. 추가로, 문합으로부터의 생검은, 회장 또는 결장 점막이 샘플링되었는지 여부에 관하여 부정확하다.
이 연구에서 4개의 중요한 결과들이 나타났다. 첫번째로, 회장-맹장 수술적 절제술(회맹판이 제거된 맹장 수술 및 변형된 해부학을 포함함)은 1차 질환에 관련 없는 변형된 미생물 프로파일과 관련되어 있다. 두번째로, Faecalibacterium prausnitzii 및 프로테우스 spp.는 흡연과는 독립적으로 수술 후 재발과 상당히 관련이 있다. 세번째로, 낮은 등급 점막 염증(상승된 FC에 의해 식별됨)에서 중증 내시경 재발에 이르는 재발 질환의 진행은 시간 경과에 따라 장 미생물 프로파일의 변화와 관련이 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 미생물 및 환경적 팩터들을 포함하는 재발의 모델을 특징으로 하였다.
회장-맹장 절제술 이후 미생물 변화들은 이전에 설명되지 않았다. 이는 단지 절제술, 회맹판의 제거, 또는 맹장의 제거에 관한 것일 수 있다. 맹장은 장 내에 유익한 또는 공생적 미생물들을 보존 및 보호하는 역할을 할 수 있다. 맹장 수술은 궤양성 대장염의 발병을 보호하는 것으로 나타났지만, CD에서 맹장 수술은 질환 발병을 위한 위험 팩터일 수 있다.
이전 연구와 유사하게, F.prausnitzii의 존재량은 수술 후 만성적인 내시경 차도와 관련이 있는 코호트에서 나타났다. F. prausnitzii는 항염증성 특성을 나타내고, 건강한 대조군들과 비교하여 CD를 갖는 환자에서 상당히 더 낮은 존재량인 것으로 나타나며, 이는 이러한 종이 CD의 예방 또는 치료에 보호 또는 치료 역할을 할 수 있다는 추측을 야기한다는 것을 알게 되었다.
본 발명자들은 CD를 갖는 12명의 환자들(41%)에서 프로테우스 spp.을 검출했다. 이는 건강하거나 수술 대조군들에서는 발견되지 않았다. 회장에서 수술 후 6개월에 검출될 때, 이는 흡연과 독립적으로 재발과 크게 관련이 있었으며, 재발 위험을 13배 증가시켰다. 프로테우스 spp.는 장내세균 패밀리의 구성원이며 정상 위장 균무리에서 발견될 수 있다. 전통적으로, 위장관에서 병원균인 것으로 생각되지 않았지만, 프로테우스 spp.는 합병 요로 감염증과 공통적으로 관련되어 있다. 프로테우스 spp.는 류마티스 관절염의 병인학의 원인이 되어 왔다. 이러한 연구에서, 수술 후 질환 재발을 갖는 환자들의 88%(21/24)가 흡연, Faecalibacterium의 낮은 존재량, 또는 프로테우스 spp의 존재 중 하나 이상에 의해, 잠재적으로 설명될 수 있었다. 이들 팩터들 중 적어도 하나는 중증 재발(Rutgeerts i3 및 i4)을 갖는 모든 12명의 환자들에 존재했다.
칼슘-결합 단백질들의 S100 패밀리의 구성원인 칼프로텍틴은 존재하는 염증 정도에 비례하여 조직 내에 존재한다. 수술 후 대변 칼프로텍틴 > 10C μg/g는 내시경적으로 식별가능한 재발을 갖기 쉬운 환자들을 식별한다. 슈도모나스균은 이러한 연구에서 FC > 100 μg/g와 상당히 관련이 있었다. 슈도모나스균 spp.는 건강한 대조군들과 비교하여 CD를 갖는 어린이의 회장 점막 내에 보다 널리 퍼져있다는 것을 알게 되었고, CD의 발병의 원임임을 나타냈다. 현재 연구에서, 슈도모나스균이 상승된 FC과 관련이 있었지만, 내시경 재발을 갖는 환자들에서 보다 풍부하지 않았다. 대조적으로, 프로테우스의 검출 및 F. prausnitzii의 낮은 존재량은 내시경 재발과 관련이 있었지만 증가된 FC와는 관련이 없었다. F. pruausnitzii의 낮은 존재량만이 심한 재발과 관련이 있었으며, 이는, 수술 후 단지 18개월에서, 베타 다양성에서의 상당한 감소 및 다른 분류학적 차이와 함께 관찰되었다. 이러한 결과들은, 재발되는 염증의 상이한 스테이지들의 진화가 있으며, 이들 스테이지들이 상이한 미생물 프로파일들 및 영향들과 관련이 있다는 것을 제시한다.
이러한 연구에서 모든 CD 환자들은 수술 후 첫 번째 3개월 동안 메트로니다졸 치료에 노출되었으며, 일부 환자들은 티오푸린 또는 아달리무맙을 받았다. 약물 치료에 관한 수술 후 회장 미생물군집의 상세한 측정은 임상 연구에서 사용되는 외래 치료 계획들 및 각 약물 계획 코호트의 상대적으로 작은 수에 의해 제한되었다. 약물 치료에 관계없이, 결과들은 재발 자체가 미생물 변화들을 반영하기 쉽다는 것을 나타냈다.
요약하자면, 네오-말단 회장에서 수술 후 검출될 때, 매우 낮은 존재량에서도, 프로테우스 spp.는 조기 수술 후 재발의 발달의 역할을 할 수 있다. 따라서, 크론병 및 수술 후 질환의 재발은 CD 환자들의 위장관 내의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시킴으로써 치료되거나 예방될 수 있다.
광범위하게 설명된 바와 같이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 특정 실시예들에 도시된 바와 같이 많은 변형들 및/또는 수정들이 본 발명에 이루어질 수 있다는 것이 본 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 본 실시예들은 모든 점들에서 예시적이며 제한적이지 않는 것으로 고려된다.
여기에 논의되고/되거나 참조된 공개물은 그 전체가 여기에 포함된다.
본 출원은 AU 2015902286로부터 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.
본 명세서 내에 포함된 임의의 문헌들, 행위들, 재료들, 디바이스들, 물품들 등의 논의는 단지 본 발명의 문맥을 제공하려는 목적이다. 임의의 또는 모든 이들 문제들은 종래 기술의 기초의 일부를 형성하거나, 또는 이 출원의 각 청구 범위의 우선일 전에 존재하기 때문에, 본 발명에 관련된 분야에 공통의 일반적인 지식이라는 승인으로서 여겨져서는 안 된다.

Claims (19)

  1. 환자에서 크론병 치료 방법으로서,
    상기 방법은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 수술적 절제술 이후 환자의 크론병 재발의 치료 또는 예방 방법으로서,
    상기 방법은 환자에서 프로테우스 속의 박테리아 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법은 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 수술적 절제술 이후 환자에게 투여되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 수술적 절제술 이후 내시경 검사, CT 촬영, MRI 및/또는 바이오마커 분석에 의해 질환 재발을 갖는 것으로 식별되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 크론병의 수술 후 재발의 치료를 위한, 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 프로테우스 속의 박테리아를 위한 살균 또는 제균제를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 환자에서 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키기 위해 치료를 위한 환자를 선택하는 단계를 포함하되, 상기 프로테우스 속의 박테리아는 환자로부터 얻어지는 샘플 내에 존재하는 것으로 검출되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 샘플은 수술적 절제술 후 환자로부터 얻어지는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월 내지 약 18개월에 환자로부터 얻어지는, 방법.
  12. 상기 수술적 절제술 이후 질환 재발의 증가된 위험에서 크론병 환자를 식별하는 방법으로서,
    상기 방법은 환자로부터 얻어지는 샘플 내의 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하되, 상기 샘플 내의 프로테우스 속의 박테리아의 존재는 수술적 절제술 후 질환 재발의 증가된 위험을 갖는 환자를 나타내는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 수술적 절제술 후 환자로부터 얻어지는 샘플 내의 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 환자 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월 내지 수술적 절제술 후 약 18개월에서 얻어지는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 환자 샘플은 수술적 절제술 후 약 6개월에 얻어지는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 환자의 회장 점막로부터 얻어지는, 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 치료 과정을 환자에게 추천하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계 및 환자의 프로테우스 속의 박테리아의 수준을 감소시키는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 크론병 치료 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테우스 속의 박테리아의 존재 또는 부재는 16s rRA 서열분석에 의해 결정되는, 방법.
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