JPS63119698A - 網膜芽腫の診断用ベクタ− - Google Patents
網膜芽腫の診断用ベクタ−Info
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- JPS63119698A JPS63119698A JP62200755A JP20075587A JPS63119698A JP S63119698 A JPS63119698 A JP S63119698A JP 62200755 A JP62200755 A JP 62200755A JP 20075587 A JP20075587 A JP 20075587A JP S63119698 A JPS63119698 A JP S63119698A
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌、特に、網膜芽腫および骨肉腫に関連した
欠損ヒト遺伝子の検出および治療方法に関する。
欠損ヒト遺伝子の検出および治療方法に関する。
網膜芽腫は、はとんどの場合０〜４才の子供に観察され
る、網膜細胞の新生物である。治療されなければ、眼内
腫瘍の悪性新生物網膜細胞は体の他の部分に転移して常
に死に至る制御されない生育を示す病巣をいくつも形成
する。網膜芽腫の現在の治療法は、眼内腫瘍が大きけれ
ば侵された眼の摘出；眼内腫瘍が小さければ放射療法、
レーザー療法、または寒冷療法が好ましい。転移した網
膜的腫瘍には良い治療法が知られていない。したがって
、腫瘍が眼の外へ広がる前に治療できるような網膜芽腫
の早期診断は困難である。
る、網膜細胞の新生物である。治療されなければ、眼内
腫瘍の悪性新生物網膜細胞は体の他の部分に転移して常
に死に至る制御されない生育を示す病巣をいくつも形成
する。網膜芽腫の現在の治療法は、眼内腫瘍が大きけれ
ば侵された眼の摘出；眼内腫瘍が小さければ放射療法、
レーザー療法、または寒冷療法が好ましい。転移した網
膜的腫瘍には良い治療法が知られていない。したがって
、腫瘍が眼の外へ広がる前に治療できるような網膜芽腫
の早期診断は困難である。
網膜芽腫は網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子の両相同性コピーの
機能欠失によって生じることが証明されている。このよ
うに、Ｒｂ遺伝子の１つの欠損アレルを有する個体は一
般にこの病気にかかりやすい。
機能欠失によって生じることが証明されている。このよ
うに、Ｒｂ遺伝子の１つの欠損アレルを有する個体は一
般にこの病気にかかりやすい。
網膜芽腫にかかった眼を１つ有する子供あるいは網膜芽
腫患者の血族である子供は一般にこの病気の素因を持ち
、発病の危険にさらされている。
腫患者の血族である子供は一般にこの病気の素因を持ち
、発病の危険にさらされている。
これらの子供は全身麻酔を必要とする眼の検査を２〜３
ケ月毎に受けて網膜芽腫を試験される。
ケ月毎に受けて網膜芽腫を試験される。
一般に、本発明は、これらの患者のＤＮＡを単離された
正常ヒト網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子またはその個有の下部
領域（“個有の下部領域”とは、Ｒｂ遺伝子に見られる
がヒト染色体の他の部位には見られないＤＮＡ配列をい
う）と比較することによってヒト患者をスクリーニング
する方法を提供する。この比較により、患者の欠損Ｒｂ
アレルを検出してこれらの患者が従来の検査方法によっ
て継続的に監視する必要があるか否かを決定できる。よ
り重要なことは、この比較により欠損Ｒｂアレルを有せ
ず網膜芽腫の発病のおそれがな〈従来の方法で検査する
必要のない患者を見分けられることである。
正常ヒト網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子またはその個有の下部
領域（“個有の下部領域”とは、Ｒｂ遺伝子に見られる
がヒト染色体の他の部位には見られないＤＮＡ配列をい
う）と比較することによってヒト患者をスクリーニング
する方法を提供する。この比較により、患者の欠損Ｒｂ
アレルを検出してこれらの患者が従来の検査方法によっ
て継続的に監視する必要があるか否かを決定できる。よ
り重要なことは、この比較により欠損Ｒｂアレルを有せ
ず網膜芽腫の発病のおそれがな〈従来の方法で検査する
必要のない患者を見分けられることである。
好ましくは、患者のＤＮＡと正常なＲｂ遺伝子との間の
比較は、患者のＤＮＡを単離したＲｂ遺伝子で試験して
大きな欠失かあるいは小さな欠失すなわちＲｂ位置にお
ける点突然変異のいずれであるかを検出することを含む
。患者のＲｂアレルにおける大きな欠失を試験するため
に、患者のＤＮＡを好ましくは、単離した正常Ｒｂ遺伝
子からつくったプローブを使用したＤＮＡハイブリダイ
ゼーションで分析する。本発明によれば、小さな欠失す
なわち点突然変異は２つの技術のいずれによって検出し
てもよい。患者のＲｂアレルと正常なＲｂ遺伝子のヌク
レオチド配列を決定しその相違について比較できる。別
法として、患者のＤＮＡを正常なＲｂ遺伝子でプローブ
し、得られたヘテロ二本鎖における誤対合を決定する。
比較は、患者のＤＮＡを単離したＲｂ遺伝子で試験して
大きな欠失かあるいは小さな欠失すなわちＲｂ位置にお
ける点突然変異のいずれであるかを検出することを含む
。患者のＲｂアレルにおける大きな欠失を試験するため
に、患者のＤＮＡを好ましくは、単離した正常Ｒｂ遺伝
子からつくったプローブを使用したＤＮＡハイブリダイ
ゼーションで分析する。本発明によれば、小さな欠失す
なわち点突然変異は２つの技術のいずれによって検出し
てもよい。患者のＲｂアレルと正常なＲｂ遺伝子のヌク
レオチド配列を決定しその相違について比較できる。別
法として、患者のＤＮＡを正常なＲｂ遺伝子でプローブ
し、得られたヘテロ二本鎖における誤対合を決定する。
また、単離された正常ヒト網膜芽腫遺伝子を使用して、
欠損Ｒｂアレルを有することがわかった個体の蛋白質療
法のための正常Ｒｂ遺伝子産生物を生成できる。
欠損Ｒｂアレルを有することがわかった個体の蛋白質療
法のための正常Ｒｂ遺伝子産生物を生成できる。
もう１つの態様として、本発明は、その不存在がはっき
りした１組の新生物と関連している蛋白質の腫瘍試料に
おける存在を検出する方法を提供する。この方法は、Ｒ
ｂ蛋白質に対する抗体を産生し、該抗体を腫瘍試料と接
触し、免疫複合体を腫瘍試料中の該蛋白質の存在を示す
ものとして検出することからなる。腫瘍がＲｂ遺伝子産
生物を含まないなら、免疫複合体は見出されず、腫瘍が
突然変異体Ｒｂアレルの結果であると結論できる。
りした１組の新生物と関連している蛋白質の腫瘍試料に
おける存在を検出する方法を提供する。この方法は、Ｒ
ｂ蛋白質に対する抗体を産生し、該抗体を腫瘍試料と接
触し、免疫複合体を腫瘍試料中の該蛋白質の存在を示す
ものとして検出することからなる。腫瘍がＲｂ遺伝子産
生物を含まないなら、免疫複合体は見出されず、腫瘍が
突然変異体Ｒｂアレルの結果であると結論できる。
これにより網膜芽腫、丹肉腫のような突然変異体Ｒｂア
レルによって生起せしめられることが知られているこれ
らの腫瘍、および未知の細胞性の原因にもとづく未解明
の腫瘍に対する病理学的診断ができる。ヒト腫瘍の病理
学的診断のより正確な類別ができよう。
レルによって生起せしめられることが知られているこれ
らの腫瘍、および未知の細胞性の原因にもとづく未解明
の腫瘍に対する病理学的診断ができる。ヒト腫瘍の病理
学的診断のより正確な類別ができよう。
実施例１：サウザーン・プロット分析
Ｒｂ部位における大量の欠損を検出するために、被験個
体からのＤＮＡについてサウザーン・プロット分析を行
なった。このＤＮＡは末梢白血球から得られ、患者が１
つの眼に腫瘍を有するときは該腫瘍から得られた。白血
球ＤＮＡを検査するために、１０ｍ１の血液試料を個体
から得、標準的方法によって該試料中の白血球からゲノ
ムＤＮＡを単離した。このＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼ、たとえばＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロース電
気泳動ゲル上を泳動させ、プロッティングによりニトロ
セルロースフィルターに移した。フィルター上のＤＮＡ
を次いで放射標識されたｐ２ＡＲ３，８およびｐ２ＡＲ
０，９（Ｅ ｃｏＲＩによる切断によって得られたｐ４
．７Ｒからのサブフラグメントを含む）で別々にプロー
ブした（第４図）。検出された異常の位置をより明確に
決定するためには、ｐ４．７Ｒ挿挿入物体よりむしろ２
つ以上の断片を別々に使用することが好ましい。プロー
ブされたフィルターのオートラジオグラムによって、試
験された個体の体細胞または腫瘍ＤＮＡにおけるＲｂ部
位の制限地図が得られた。
体からのＤＮＡについてサウザーン・プロット分析を行
なった。このＤＮＡは末梢白血球から得られ、患者が１
つの眼に腫瘍を有するときは該腫瘍から得られた。白血
球ＤＮＡを検査するために、１０ｍ１の血液試料を個体
から得、標準的方法によって該試料中の白血球からゲノ
ムＤＮＡを単離した。このＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼ、たとえばＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロース電
気泳動ゲル上を泳動させ、プロッティングによりニトロ
セルロースフィルターに移した。フィルター上のＤＮＡ
を次いで放射標識されたｐ２ＡＲ３，８およびｐ２ＡＲ
０，９（Ｅ ｃｏＲＩによる切断によって得られたｐ４
．７Ｒからのサブフラグメントを含む）で別々にプロー
ブした（第４図）。検出された異常の位置をより明確に
決定するためには、ｐ４．７Ｒ挿挿入物体よりむしろ２
つ以上の断片を別々に使用することが好ましい。プロー
ブされたフィルターのオートラジオグラムによって、試
験された個体の体細胞または腫瘍ＤＮＡにおけるＲｂ部
位の制限地図が得られた。
この制限地図を、対照制限地図であって、同一の制限酵
素による切断とプローブを使用して決定した地図と比較
した。適当な対照は、１組の正常な個体からのアデノビ
ールス−形質転換網膜細胞株または白血球のＤＮＡから
得られたＤＮＡであり得る。被験個体が有意に大きな欠
損を含むＲｂアレルを有するならば、彼のＤＮＡの制限
地図は、対照と比較して、Ｒｂ部位における１つのアレ
ルにおける欠失による１つまたはそれ以上の制限断片の
、１つまたはそれ以上のバンドを余計に含み、および／
あるいはサイズの変化によって生じた、強度が５０％低
下した１つまたはそれ以上のバンドを含むか、あるいは
該バンドが全面的に欠除しているであろう。
素による切断とプローブを使用して決定した地図と比較
した。適当な対照は、１組の正常な個体からのアデノビ
ールス−形質転換網膜細胞株または白血球のＤＮＡから
得られたＤＮＡであり得る。被験個体が有意に大きな欠
損を含むＲｂアレルを有するならば、彼のＤＮＡの制限
地図は、対照と比較して、Ｒｂ部位における１つのアレ
ルにおける欠失による１つまたはそれ以上の制限断片の
、１つまたはそれ以上のバンドを余計に含み、および／
あるいはサイズの変化によって生じた、強度が５０％低
下した１つまたはそれ以上のバンドを含むか、あるいは
該バンドが全面的に欠除しているであろう。
正常Ｒｂ遺伝子の単離
網膜芽腫を生起せしめるのに含まれる遺伝子的位置はヒ
ト染色体１３のｑ１４帯域であると決定されている。
（ｐａｒｋｅｒら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０
８ ： １０４２ （１９８０） ） ＤＮＡのこの
領域からのｃＤＮＡクローンであるｐ４．７ＲはＲｂ遺
伝子配列を担持することが示されている。このクローン
は下記一般的技術により得られた。
ト染色体１３のｑ１４帯域であると決定されている。
（ｐａｒｋｅｒら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０
８ ： １０４２ （１９８０） ） ＤＮＡのこの
領域からのｃＤＮＡクローンであるｐ４．７ＲはＲｂ遺
伝子配列を担持することが示されている。このクローン
は下記一般的技術により得られた。
ｃＤＮＡクローンｐ４．７Ｒの単離
ヒト染色体１３ラムダフアージライブラリーから単離さ
れたヒトＤＮＡプローブｐＨ３−８（Ｌａｌａｎｄｅら
。
れたヒトＤＮＡプローブｐＨ３−８（Ｌａｌａｎｄｅら
。
１９８４、 Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ、 Ｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｔ、 １３ ： ２８３）を染色体移動技術にお
いて使用してＨ３−８配列を囲む３０ｋｂの染色体ＤＮ
Ａを単離し地図を作製した。
ｅｎｅｔ、 １３ ： ２８３）を染色体移動技術にお
いて使用してＨ３−８配列を囲む３０ｋｂの染色体ＤＮ
Ａを単離し地図を作製した。
この技術によって生成した１つの断片、すなわちｐ７１
１３０．７Ｒを見出してヒト染色体１３ばかりでなくマ
ウスの染色体にもＤＮＡ配列を確認した。（Ｄｒｙｊａ
ら、 １９８Ｂ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ｔｌｓＡ）ヒトとマウス両方のＤＮＡにつ
いてｐ７１］３０．７Ｒの相同性があることはｐ７１１
３０．７Ｒが構造遺伝子のコード配列を含むことを示唆
した。
１３０．７Ｒを見出してヒト染色体１３ばかりでなくマ
ウスの染色体にもＤＮＡ配列を確認した。（Ｄｒｙｊａ
ら、 １９８Ｂ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ｔｌｓＡ）ヒトとマウス両方のＤＮＡにつ
いてｐ７１］３０．７Ｒの相同性があることはｐ７１１
３０．７Ｒが構造遺伝子のコード配列を含むことを示唆
した。
この可能性を試験するために、ｐ７１１３０．７Ｒを放
射標識し、３つの網膜芽腫（＃４２． ＃３０および＃
３１）およびアデノビールス１２−形質転換ヒト胎児網
膜細胞株（Ｒｅｔ） （１／ａｅｓｓｅｎら、 ｌ’１
８Ｂ、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ１５ ： ３３５）から
単離されたＲＮＡのノーサーンブロットをプローブした
。このｐ７１１３０．７Ｒプローブは網膜細胞株からの
約４．７ｋｂのＲＮＡ転写物に対してハイブリッド形成
したが、上記３つの腫瘍試料からのＲＮＡ転写物に対し
ては／１イブリ・ノド形成しなかった（第１図）。
射標識し、３つの網膜芽腫（＃４２． ＃３０および＃
３１）およびアデノビールス１２−形質転換ヒト胎児網
膜細胞株（Ｒｅｔ） （１／ａｅｓｓｅｎら、 ｌ’１
８Ｂ、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ１５ ： ３３５）から
単離されたＲＮＡのノーサーンブロットをプローブした
。このｐ７１１３０．７Ｒプローブは網膜細胞株からの
約４．７ｋｂのＲＮＡ転写物に対してハイブリッド形成
したが、上記３つの腫瘍試料からのＲＮＡ転写物に対し
ては／１イブリ・ノド形成しなかった（第１図）。
続いて、アデノビールス形質転換網膜細胞株から単離さ
れたＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを造成した
。このライブラリーを標識されたｐ７Ｈ３０，７Ｒプロ
ーブによってスクリーニングした。
れたＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを造成した
。このライブラリーを標識されたｐ７Ｈ３０，７Ｒプロ
ーブによってスクリーニングした。
類似の制限地図を有するいくつかのｃＤＮＡクローンが
単離された。それらのもつとも大きなものであるｐ４．
７Ｒは４．７ｋｂのゲノムＤＮＡを含んでいた。ｐ４．
７１？の制限地図は第２図に示した。
単離された。それらのもつとも大きなものであるｐ４．
７Ｒは４．７ｋｂのゲノムＤＮＡを含んでいた。ｐ４．
７１？の制限地図は第２図に示した。
ｐ４．７＋？の特定
網膜芽腫（＃４２． ＃３０． ＃４１． ＃３
１） ；骨肉腫（＃１６）およびアデノビールス−形
質転換網膜細胞（Ｒｅｔ）から単離されたＲＮＡ転写物
をスクリーニングするのにｐ４．７クローンを使用した
。第３図に示されるように、ｐ４．７Ｒプローブは、単
離されたＲＮＡ転写物のノーサーンプロット分析におい
て、４つの網膜芽腫および１つの骨肉腫細胞試料におい
て存在しない形質転換網膜細胞における転写物を検出し
た。２．Ｏｋｂ以下のノくンドは、ノーサーンプロット
をラットタブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）を検出するプロー
ブで洗った後に再プローブする（プロットにおけるＲＮ
Ａの存在を示す）ことによって検出された。
１） ；骨肉腫（＃１６）およびアデノビールス−形
質転換網膜細胞（Ｒｅｔ）から単離されたＲＮＡ転写物
をスクリーニングするのにｐ４．７クローンを使用した
。第３図に示されるように、ｐ４．７Ｒプローブは、単
離されたＲＮＡ転写物のノーサーンプロット分析におい
て、４つの網膜芽腫および１つの骨肉腫細胞試料におい
て存在しない形質転換網膜細胞における転写物を検出し
た。２．Ｏｋｂ以下のノくンドは、ノーサーンプロット
をラットタブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）を検出するプロー
ブで洗った後に再プローブする（プロットにおけるＲＮ
Ａの存在を示す）ことによって検出された。
ｐ４．７ＲクローンもゲノムＤＮＡをスクリーニングす
るのに使用した。４０個の網膜穿削、８つの骨肉腫およ
び網膜芽腫の遺伝形質を何する患者の未知の細胞の未確
認腫瘍２つからなる５０人の非血族の患者からの各腫瘍
１組からＤＮＡを単離した。
るのに使用した。４０個の網膜穿削、８つの骨肉腫およ
び網膜芽腫の遺伝形質を何する患者の未知の細胞の未確
認腫瘍２つからなる５０人の非血族の患者からの各腫瘍
１組からＤＮＡを単離した。
単離されたＤＮＡ試料をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プロ
ーブとして放射標識したｐ４．７Ｒを使用してサウザー
ンブロットハイプリダイゼーションにより分析した。こ
の分析により、ゲノムＤＮＡ制限断片の３つの異なった
パターン： すなわち、見掛は上の同型接合欠失を示す全面的に不存
在の断片；見掛は上の異型接合欠失を示す不顕化断片；
および制限部位の部分的欠失または変化のいずれかを示
す、サイズが変化した断片を示した。腫瘍ＤＮＡの少く
とも３０％はこれらの異常のうち１つを示した。比較の
ため、１８人の正常な個体からの白血球ＤＮＡをサウザ
ーンプロット分析して制限断片の均一なパターンを示し
た。
ーブとして放射標識したｐ４．７Ｒを使用してサウザー
ンブロットハイプリダイゼーションにより分析した。こ
の分析により、ゲノムＤＮＡ制限断片の３つの異なった
パターン： すなわち、見掛は上の同型接合欠失を示す全面的に不存
在の断片；見掛は上の異型接合欠失を示す不顕化断片；
および制限部位の部分的欠失または変化のいずれかを示
す、サイズが変化した断片を示した。腫瘍ＤＮＡの少く
とも３０％はこれらの異常のうち１つを示した。比較の
ため、１８人の正常な個体からの白血球ＤＮＡをサウザ
ーンプロット分析して制限断片の均一なパターンを示し
た。
上記結果はｐ４．７Ｒ！：Ｊ＜Ｒｂ遺伝子を欠失するこ
とを示す。１つの骨肉腫ＤＮＡ試料中の欠失パターンは
ｐ４ 、７ＲがＲｂ遺伝子を検出する特に良い証拠を提
供する。このＤＮＡ試料は、ｐ４．７Ｒ領域内に全体が
位置する欠失については同型接合である。丹肉腫表現型
はこの欠失とは関係なく生じるということはとてもあり
そうにない。欠失はｐ４．７１？領域に限定されるので
、この領域は、突然変異を生じたとき非機能Ｒｂ −コ
ード化蛋白質を産生ずるＲｂ遺伝子を含んでいるにちが
いない。
とを示す。１つの骨肉腫ＤＮＡ試料中の欠失パターンは
ｐ４ 、７ＲがＲｂ遺伝子を検出する特に良い証拠を提
供する。このＤＮＡ試料は、ｐ４．７Ｒ領域内に全体が
位置する欠失については同型接合である。丹肉腫表現型
はこの欠失とは関係なく生じるということはとてもあり
そうにない。欠失はｐ４．７１？領域に限定されるので
、この領域は、突然変異を生じたとき非機能Ｒｂ −コ
ード化蛋白質を産生ずるＲｂ遺伝子を含んでいるにちが
いない。
機能Ｒｂ蛋白質が存在しないと新生物の表現型を形成す
る。
る。
用 途
本発明の方法でｐ４．７配列を使用するとＲｂ遺伝子の
突然変異アレルの存在について個体をスクリーニングで
きる。このスクリーニング方法を使用すれば、１つの眼
に網膜芽腫の家族歴または既応症があるため網膜芽腫を
発病するおそれのある個体が現在の眼の検査によって日
常的な検査を受ける必要を決定する。もし、スクリーニ
ングで個体が突然変異Ｒｂアレルを有することが決定さ
れた場合のみ、定期的に検査を行う必要があろう。
突然変異アレルの存在について個体をスクリーニングで
きる。このスクリーニング方法を使用すれば、１つの眼
に網膜芽腫の家族歴または既応症があるため網膜芽腫を
発病するおそれのある個体が現在の眼の検査によって日
常的な検査を受ける必要を決定する。もし、スクリーニ
ングで個体が突然変異Ｒｂアレルを有することが決定さ
れた場合のみ、定期的に検査を行う必要があろう。
２つの正常なＲｂアレルを有する患者は検査を中止でき
る。というのは、Ｒｂ遺伝子の２つの正常な複製物を有
する個体が網膜芽腫を発病する危険性は、アレルを不活
性化するに充分な突然変異を含むＲｂアレルを患者が有
している場合の危険率８０〜９０％に比べて、約２００
００分の１、すなわち０．００５％であるからである。
る。というのは、Ｒｂ遺伝子の２つの正常な複製物を有
する個体が網膜芽腫を発病する危険性は、アレルを不活
性化するに充分な突然変異を含むＲｂアレルを患者が有
している場合の危険率８０〜９０％に比べて、約２００
００分の１、すなわち０．００５％であるからである。
このように、現在定期的に検査されている患者の大部分
が実際には一般的な人々を越える危険にさらされている
わけではなく；網膜芽腫の家族歴も既応症も個体がこの
病気に遺伝的にかかりやすいという包括的な証拠にはな
らない。したがって、実際にＲｂ遺伝子の２つの正常な
複製物を担持しているそのような個体は不必要な高価且
つ外傷性の眼の検査を繰返し受けてきたことになる。
が実際には一般的な人々を越える危険にさらされている
わけではなく；網膜芽腫の家族歴も既応症も個体がこの
病気に遺伝的にかかりやすいという包括的な証拠にはな
らない。したがって、実際にＲｂ遺伝子の２つの正常な
複製物を担持しているそのような個体は不必要な高価且
つ外傷性の眼の検査を繰返し受けてきたことになる。
本発明のスクリーニング方法は好ましくは主として２つ
のタイプからなる： （１）Ｒｂプローブに対する／＞
イブリダイゼーションを妨害するに充分大きなＲｂ位置
における欠失についての個体のＤＮＡを試験すること、
および（２）Ｒｂ位置における小さな欠失すなわち点突
然変異について個体のＤＮＡを試験すること。
のタイプからなる： （１）Ｒｂプローブに対する／＞
イブリダイゼーションを妨害するに充分大きなＲｂ位置
における欠失についての個体のＤＮＡを試験すること、
および（２）Ｒｂ位置における小さな欠失すなわち点突
然変異について個体のＤＮＡを試験すること。
スクリーニングに加えて、本発明は、突然変異体Ｒｂア
レルを含むことが決定され、したがって網膜芽腫を発病
するおそれのある患者のための蛋白質療法を提供するの
に役立つ。
レルを含むことが決定され、したがって網膜芽腫を発病
するおそれのある患者のための蛋白質療法を提供するの
に役立つ。
本発明のもう１つの用途は、上述の如く、たとえば特定
の腫瘍がＲｂ遺伝子の異常によるものか否か決定する免
疫学的診断である。骨肉腫および特定の未確認腫瘍はＲ
ｂ遺伝子の検出可能な障害から生じるので、免疫学的診
断を使用してそのような腫瘍の診断を助けることができ
る。
の腫瘍がＲｂ遺伝子の異常によるものか否か決定する免
疫学的診断である。骨肉腫および特定の未確認腫瘍はＲ
ｂ遺伝子の検出可能な障害から生じるので、免疫学的診
断を使用してそのような腫瘍の診断を助けることができ
る。
下記例により本発明を説明する。
このようにしてサウザーン分析によるスクリーニング方
法は大きな欠失を有する非機能Ｒｂアレルの存在を検出
するであろう。もしこの分析により個体からの被験ＤＮ
Ａが対照の制限地図と異なる制限地図を有することを示
す場合、当該個体が非機能突然変異Ｒｂアレルを含むと
いう大きな可能性がある。この個体は今後網膜芽腫の発
病について厳密に監視されなければならない。
法は大きな欠失を有する非機能Ｒｂアレルの存在を検出
するであろう。もしこの分析により個体からの被験ＤＮ
Ａが対照の制限地図と異なる制限地図を有することを示
す場合、当該個体が非機能突然変異Ｒｂアレルを含むと
いう大きな可能性がある。この個体は今後網膜芽腫の発
病について厳密に監視されなければならない。
もし、被験制限地図が対照と同一であれば、異なるスク
リーニング方法をその個体のＤＮＡについて実施してそ
の個体が小さな欠失すなわち点突然変異を有するＲｂア
レルを含むか否かを決定する。これは該アレルを不活性
化するのに充分であるがプローブとのハイブリダイゼー
ションを防止するには不充分である。スクリーニング方
法は下記例に記載する。
リーニング方法をその個体のＤＮＡについて実施してそ
の個体が小さな欠失すなわち点突然変異を有するＲｂア
レルを含むか否かを決定する。これは該アレルを不活性
化するのに充分であるがプローブとのハイブリダイゼー
ションを防止するには不充分である。スクリーニング方
法は下記例に記載する。
実施例２ ： Ｒｂ位置の精密な構造分析Ｒｂ位置の小
さな欠失または点突然変異について個体のＤＮＡを検査
するために該個体からのＲｂ遺伝子の両方の相同体をク
ローニングしたアレルを次いで下記２つの方法のうちの
１つによって、ｐ４．７Ｒと表わされる正常アレルとの
配列の相違があるか否かについて試験する＝（１）クロ
ーニングしたアレルおよびｐ４．７Ｒの両方のヌクレオ
チド配列を決定し比較する、あるいは（２）Ｉ）４．７
１？からのＲＮＡ転写物を被験者からの一本鎖全ゲツム
ＤＮＡに対してハイブリッド形成させ、得られたヘテロ
二本鎖をＲＮＡ分解分解酵素部理して変性ゲル上で泳動
させて誤対合の位置を検出する。より詳しくは、これら
の方法は下記の如く行なわれる： （１） Ｒｂアレルのクローニング 試験されるべき個体のＲｂ遺伝子のアレルを従来の技術
を使用してクローニングした。普通の方法はたとえばバ
クテリオファージベクターＥ Ｍ Ｂ Ｌ ３ （Ｐｒ
ｉｓｃｈａｕｆら、 １９８３． Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ。
さな欠失または点突然変異について個体のＤＮＡを検査
するために該個体からのＲｂ遺伝子の両方の相同体をク
ローニングしたアレルを次いで下記２つの方法のうちの
１つによって、ｐ４．７Ｒと表わされる正常アレルとの
配列の相違があるか否かについて試験する＝（１）クロ
ーニングしたアレルおよびｐ４．７Ｒの両方のヌクレオ
チド配列を決定し比較する、あるいは（２）Ｉ）４．７
１？からのＲＮＡ転写物を被験者からの一本鎖全ゲツム
ＤＮＡに対してハイブリッド形成させ、得られたヘテロ
二本鎖をＲＮＡ分解分解酵素部理して変性ゲル上で泳動
させて誤対合の位置を検出する。より詳しくは、これら
の方法は下記の如く行なわれる： （１） Ｒｂアレルのクローニング 試験されるべき個体のＲｂ遺伝子のアレルを従来の技術
を使用してクローニングした。普通の方法はたとえばバ
クテリオファージベクターＥ Ｍ Ｂ Ｌ ３ （Ｐｒ
ｉｓｃｈａｕｆら、 １９８３． Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ。
１７０ ： ８２７）を使用する。１０ｍ１の血液試料
を個体から得、ゲノムＤＮＡをこの試料の細胞から単離
した。このＤＮＡをＭｂｏＩで部分的に切断して平均サ
イズ約２０ｋｂの断片にした。１８〜：２１ｋｂの断片
を単離した。得られたＭｂｏＩ−末端断片をＢａｍＨＩ
で完全に切断し、アルカリホスファターゼで処理し、６
８°Ｃに１０分間加熱して接着末端を分断しておいたＥ
ＭＢＬ３ベクターＤＮＡに結合させた。このリゲーショ
ンミックスをインビトロラムダパッケジング反応で使用
し、プレートストックを生育させることにより、パッケ
ージされたファージを増殖させた。〔このクローニング
技術はマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌ
ｎｇ） ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
。
を個体から得、ゲノムＤＮＡをこの試料の細胞から単離
した。このＤＮＡをＭｂｏＩで部分的に切断して平均サ
イズ約２０ｋｂの断片にした。１８〜：２１ｋｂの断片
を単離した。得られたＭｂｏＩ−末端断片をＢａｍＨＩ
で完全に切断し、アルカリホスファターゼで処理し、６
８°Ｃに１０分間加熱して接着末端を分断しておいたＥ
ＭＢＬ３ベクターＤＮＡに結合させた。このリゲーショ
ンミックスをインビトロラムダパッケジング反応で使用
し、プレートストックを生育させることにより、パッケ
ージされたファージを増殖させた。〔このクローニング
技術はマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌ
ｎｇ） ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉ
ｅａｔｌｏｎｓ、 ２５６−２９３頁（１９８２）に一
般的に記載されている〕このプレートストックからの約
５ Ｘ １０５ｐｆｕを使用して３ｍｌの大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） （０，ＯＩＭμｇｓｏ 中〜１，５×
１０９個／ｍｌの菌体）に感染させ、この感染混合物を
３７℃で２０分間インキュベートした。４７℃で頂部を
融解させた寒天６５ｍ１を加え、この混合物を新しく注
入され底部に乾いた寒天を含む１０枚の１５０ｍｍプレ
ート上に塗布した。プラークが〜１．５市の直径となり
互いに接触し始めるようになるまで（約１０〜１２時間
）インキュベートした。
ｅａｔｌｏｎｓ、 ２５６−２９３頁（１９８２）に一
般的に記載されている〕このプレートストックからの約
５ Ｘ １０５ｐｆｕを使用して３ｍｌの大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） （０，ＯＩＭμｇｓｏ 中〜１，５×
１０９個／ｍｌの菌体）に感染させ、この感染混合物を
３７℃で２０分間インキュベートした。４７℃で頂部を
融解させた寒天６５ｍ１を加え、この混合物を新しく注
入され底部に乾いた寒天を含む１０枚の１５０ｍｍプレ
ート上に塗布した。プラークが〜１．５市の直径となり
互いに接触し始めるようになるまで（約１０〜１２時間
）インキュベートした。
二重の円状のニトロセルロースフィルター（ミリポアＨ
ＡＷＰ）を各寒天プレートの表面にそっと置いてバクテ
リオファージＤＮＡを結合させた。これらのフィルター
を１分間後に注意深く取り出し、３０秒間変性溶液（１
，５Ｍ Ｎ ａ Ｃ（１。
ＡＷＰ）を各寒天プレートの表面にそっと置いてバクテ
リオファージＤＮＡを結合させた。これらのフィルター
を１分間後に注意深く取り出し、３０秒間変性溶液（１
，５Ｍ Ｎ ａ Ｃ（１。
０．５Ｍ Ｎａ０Ｈ）に入れ、５分間中和しく１．５
ＭＮａＣρ、０．５ＭトリスーＣΩｐＨ８，０）、８０
’Ｃで２時間真空乾燥した。
ＭＮａＣρ、０．５ＭトリスーＣΩｐＨ８，０）、８０
’Ｃで２時間真空乾燥した。
次いでこれらのニトロセルロースフィルターを放射標識
したｐ４．７Ｒにより／％イブリダイゼーションとオー
トラジオグラフィーによってプローブした。ｐ４．７１
？プローブに対するノ１イブリダイゼーションを示すプ
ラークを上記方法によりプラーク精製し再スクリーニン
グした。再スクリーニングからの陽性プラークを単離し
使用して個体からのＲｂアレルを含むと推定されるＤＮ
Ａをつくった。
したｐ４．７Ｒにより／％イブリダイゼーションとオー
トラジオグラフィーによってプローブした。ｐ４．７１
？プローブに対するノ１イブリダイゼーションを示すプ
ラークを上記方法によりプラーク精製し再スクリーニン
グした。再スクリーニングからの陽性プラークを単離し
使用して個体からのＲｂアレルを含むと推定されるＤＮ
Ａをつくった。
これらの単離されたＥＭＢＬ３ベクターＤＮＡ試料にお
けるＭｂｏＩゲノム種人物舎人物ウザーン分析によりｐ
４．７Ｒと相同の配列の位置について試験した。全Ｒｂ
遺伝子領域を含有するＤＮＡ試料を選択し、これらの試
料からのＲｂ遺伝子を含む適当な制限断片をｐＵＣ９の
ような適当なベクターにサブクローンした。これらのサ
ブクローンは試験される個体のＤＮＡからの１つまたは
両方のＲｂアレルの複製物を含有した。両方のアレルが
発現されているか否か決定するために、当初ファージ単
離物を制限多形性の存在について試験した。サブクロー
ニングしたアレルを下記技術の１つによってｐ４．７Ｒ
との相違についてしらべた。
けるＭｂｏＩゲノム種人物舎人物ウザーン分析によりｐ
４．７Ｒと相同の配列の位置について試験した。全Ｒｂ
遺伝子領域を含有するＤＮＡ試料を選択し、これらの試
料からのＲｂ遺伝子を含む適当な制限断片をｐＵＣ９の
ような適当なベクターにサブクローンした。これらのサ
ブクローンは試験される個体のＤＮＡからの１つまたは
両方のＲｂアレルの複製物を含有した。両方のアレルが
発現されているか否か決定するために、当初ファージ単
離物を制限多形性の存在について試験した。サブクロー
ニングしたアレルを下記技術の１つによってｐ４．７Ｒ
との相違についてしらべた。
（２）配列比較
まず、ｐ４．７Ｒ中の正常Ｒｂ遺伝子のヌクレオチド配
列をｐ４．７１？からの〜５００ｂｐの制限断片をＭ１
３ｍｐ８ファージベクターをサブクローニングし、これ
らのサブクローンをジデオキシ技術により配列すること
によって決定した（ Ｓａｎｇｅｒら、 １９７７゜Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ ＵＳＡ ７
４ ： ５４６３） ｏ これらの個々のサブクローン
配列からＲｂ遺伝子の配列を組立てることができた。こ
の配列はフランキング領域をも示す第７図に示されてい
る。
列をｐ４．７１？からの〜５００ｂｐの制限断片をＭ１
３ｍｐ８ファージベクターをサブクローニングし、これ
らのサブクローンをジデオキシ技術により配列すること
によって決定した（ Ｓａｎｇｅｒら、 １９７７゜Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ ＵＳＡ ７
４ ： ５４６３） ｏ これらの個々のサブクローン
配列からＲｂ遺伝子の配列を組立てることができた。こ
の配列はフランキング領域をも示す第７図に示されてい
る。
単離されたＲｂ遺伝子アレルを下記手順で配列化した。
アレルの制限断片（〜２ ｋｂ）をＭ１３＋ｎｐ８ベク
ターにサブクローニングし、ジデオキシ配列反応におい
てプライマーとしてｐ４．７Ｒから単離された小さな制
限断片を使用していくつかの短い区域（〜５００ｂｐ）
を個別に配列形成した。次いでこの単離されたアレルの
複合ヌクレオチド配列をこれらの個別にプライムされた
配列から造成した。この配列をｐ４．７Ｒから決定され
た正常のＲｂ遺伝子の配列と直接に比較して、欠失また
は点突然変異が単離されたアレルに存在するか否かにつ
いてしらべた。
ターにサブクローニングし、ジデオキシ配列反応におい
てプライマーとしてｐ４．７Ｒから単離された小さな制
限断片を使用していくつかの短い区域（〜５００ｂｐ）
を個別に配列形成した。次いでこの単離されたアレルの
複合ヌクレオチド配列をこれらの個別にプライムされた
配列から造成した。この配列をｐ４．７Ｒから決定され
た正常のＲｂ遺伝子の配列と直接に比較して、欠失また
は点突然変異が単離されたアレルに存在するか否かにつ
いてしらべた。
（３）誤対合のリボヌクレアーゼ開裂
アレルのＤＮＡを正常Ｒｂ遺伝子と比較する別の方法は
ＲＮＡ分解酵素Ａを使用してｐ４．７Ｒ配列とアレル配
列との相違があるか否か検出する。
ＲＮＡ分解酵素Ａを使用してｐ４．７Ｒ配列とアレル配
列との相違があるか否か検出する。
この比較はプローブとしてのｐ４．７Ｒの小さな（〜５
００ｂｐ）制限断片により段階的に行なわれる。
００ｂｐ）制限断片により段階的に行なわれる。
まず、ｐ４．７ＲをＲｂ遺伝子配列を約５ｏｏｂｐの断
片に切断する制限酵素で切断する。これらの断片を電気
泳動ゲル上で単離し、ｐｓＲ６４またはｐＳＰ６５よう
なＳＰ６ベクターに両方向で別個にクローニングした（
Ｍｃｌｔｏｎら、 １９８４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓＲｃｓ、 １２ ： ７０３５） 、ｐ４．７Ｒ
断片の挿入物を含有するＳＦ３に基づいたプラスミドを
、ＳＰ６転写系（当分野で周知）を〔α Ｐ）ＧＴＰ
の存在下に使用してＲｂ遺伝子のｃＤＮＡの二本鎖の放
射標識ＲＮＡ転写物を形成することによってインビトロ
で転写した。
片に切断する制限酵素で切断する。これらの断片を電気
泳動ゲル上で単離し、ｐｓＲ６４またはｐＳＰ６５よう
なＳＰ６ベクターに両方向で別個にクローニングした（
Ｍｃｌｔｏｎら、 １９８４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓＲｃｓ、 １２ ： ７０３５） 、ｐ４．７Ｒ
断片の挿入物を含有するＳＦ３に基づいたプラスミドを
、ＳＰ６転写系（当分野で周知）を〔α Ｐ）ＧＴＰ
の存在下に使用してＲｂ遺伝子のｃＤＮＡの二本鎖の放
射標識ＲＮＡ転写物を形成することによってインビトロ
で転写した。
これらのＲＮＡ転写物を別個に使用してアレルＤＮＡに
よりヘテロ二本鎖を下記の如く形成した。
よりヘテロ二本鎖を下記の如く形成した。
５０ｎｇのアレルサブクローンを使用されるべきＲＮＡ
転写物プローブによってカバーされる領域の外を切断す
る制限酵素で切断した。この切断されたＤＮＡを３０μ
ｇのハイブリダイゼーション緩衝液（８０％ホルムアミ
ド、 ４０ｍＭパイブス（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ６，４、０
，４Ｍ Ｎ ａ ＣΩ、および１ｍＭＥＤＴＡ）中で
放射標識ＲＮＡと混合し、混合物を９０℃で１０分間処
理してＤＮＡを変性した。次いでこの混合物をゆっくり
と４５°Ｃに冷却してＲＮＡを４５℃で３０分間−本鎖
ＤＮＡにアニーリングした。
転写物プローブによってカバーされる領域の外を切断す
る制限酵素で切断した。この切断されたＤＮＡを３０μ
ｇのハイブリダイゼーション緩衝液（８０％ホルムアミ
ド、 ４０ｍＭパイブス（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ６，４、０
，４Ｍ Ｎ ａ ＣΩ、および１ｍＭＥＤＴＡ）中で
放射標識ＲＮＡと混合し、混合物を９０℃で１０分間処
理してＤＮＡを変性した。次いでこの混合物をゆっくり
と４５°Ｃに冷却してＲＮＡを４５℃で３０分間−本鎖
ＤＮＡにアニーリングした。
このＲＮＡ ： ＤＮＡヘテロ二本鎖を３５０μｇのＲ
ＮＡ分解分解酵素液溶液グ７ （Ｓｉｇｍａ）） （
１０ｍＭトリス−ＩＣΩｐＨ７，５、１１］ＩＭＥＤＴ
Ａ、 ０．２ ＭＮａＣ，Ｑおよび０．ＩＭＬｉＣΩ中
４０μｇ／ｍｌの酵素）で処理した。この混合物を渦動
させ２５°Ｃで３０分間インキュベートした。ＲＮＡ分
解酵素Ａ反応を１０μΩのプロテイナーゼＫ （ＬＯｍ
ｇ／ｍ１）（ベーリンガー・マンノ＼イム）の添加、続
いて３７°Ｃで２０分間インキュベートすることによっ
て停止させた。水性層をフェノール−クロロホルムおよ
びエタノール沈殿により抽出して蛋白質の混入しない核
酸サンプルを得た。この沈殿した試料を５μｇに再懸濁
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％ポリアクリ
ルアミド、７Ｍ尿素）を変性することによって分析した
（第５図）。
ＮＡ分解分解酵素液溶液グ７ （Ｓｉｇｍａ）） （
１０ｍＭトリス−ＩＣΩｐＨ７，５、１１］ＩＭＥＤＴ
Ａ、 ０．２ ＭＮａＣ，Ｑおよび０．ＩＭＬｉＣΩ中
４０μｇ／ｍｌの酵素）で処理した。この混合物を渦動
させ２５°Ｃで３０分間インキュベートした。ＲＮＡ分
解酵素Ａ反応を１０μΩのプロテイナーゼＫ （ＬＯｍ
ｇ／ｍ１）（ベーリンガー・マンノ＼イム）の添加、続
いて３７°Ｃで２０分間インキュベートすることによっ
て停止させた。水性層をフェノール−クロロホルムおよ
びエタノール沈殿により抽出して蛋白質の混入しない核
酸サンプルを得た。この沈殿した試料を５μｇに再懸濁
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％ポリアクリ
ルアミド、７Ｍ尿素）を変性することによって分析した
（第５図）。
ｐ４．７Ｒ断片と個体からのＲｂアレルサブクローンと
の配列の相違に帰因するＲＮＡ ： ＤＮＡヘテロ二本
鎖に生じた誤対合の結果、ＲＮＡ分解酵素Ａ処理により
ＲＮＡ鎖が開裂した。そのような誤対合は各個体のＲｂ
アレルにおける点突然変異または小さな欠失の結果であ
る。ＲＮＡ鎖の開裂により２つ以上の小さなＲＮＡ断片
が得られ、これらは第６図に示されるように変性ゲル上
をＲＮＡプローブ自体よりも速く泳動した。
の配列の相違に帰因するＲＮＡ ： ＤＮＡヘテロ二本
鎖に生じた誤対合の結果、ＲＮＡ分解酵素Ａ処理により
ＲＮＡ鎖が開裂した。そのような誤対合は各個体のＲｂ
アレルにおける点突然変異または小さな欠失の結果であ
る。ＲＮＡ鎖の開裂により２つ以上の小さなＲＮＡ断片
が得られ、これらは第６図に示されるように変性ゲル上
をＲＮＡプローブ自体よりも速く泳動した。
ＲＮＡ分解酵素技術において、放射標識Ｒｂ遺伝子ＲＮ
Ａをベクターにクローンしておいた個体のＲｂアレルの
一本鎖にハイブリッドした。このＲＮＡ分解酵素技術も
Ｒｂアレルをクローニングしないでも使用できるので便
利である。好ましくは、ゲノムＤＮＡは試験されるべき
個体の血球から単離され、このゲノムＤＮＡは放射標識
ＲｂＲＮＡプローブと直接ハイブリッドを形成して下記
の如く正常Ｒｂ遺伝子との配列上の相違を決定した。単
離されたゲノムＤＮＡ総量のうち５μｇを３０μｇのハ
イブリダイゼーション緩衝液（８０％ホルムアミド、
４０ｍＭパイブスｐＨ８，４。
Ａをベクターにクローンしておいた個体のＲｂアレルの
一本鎖にハイブリッドした。このＲＮＡ分解酵素技術も
Ｒｂアレルをクローニングしないでも使用できるので便
利である。好ましくは、ゲノムＤＮＡは試験されるべき
個体の血球から単離され、このゲノムＤＮＡは放射標識
ＲｂＲＮＡプローブと直接ハイブリッドを形成して下記
の如く正常Ｒｂ遺伝子との配列上の相違を決定した。単
離されたゲノムＤＮＡ総量のうち５μｇを３０μｇのハ
イブリダイゼーション緩衝液（８０％ホルムアミド、
４０ｍＭパイブスｐＨ８，４。
０．４ＭＮａＣΩおよび１［［ＩＭ ＥＤＴＡ）中の
標識ＲＮＡプローブとともに再懸濁し、このハイブリダ
イゼーション混合物を９０℃で１０分間処理してＤＮＡ
を変性した。次いでこの混合物をゆっくり４５°Ｃに冷
却し、この温度で１０時間インキュベートしてＲＮＡプ
ローブをＲｂアレルの一本鎖ＤＮＡ複製物に対してハイ
ブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、上述の如＜
ＲＮＡ分解酵素Ａ処理と電気泳動を行なった。ＲＮＡプ
ローブと各個体のＲｂアレルのゲノム複製物とのヘテロ
二本鎖における誤対合は容易に検出できた。
標識ＲＮＡプローブとともに再懸濁し、このハイブリダ
イゼーション混合物を９０℃で１０分間処理してＤＮＡ
を変性した。次いでこの混合物をゆっくり４５°Ｃに冷
却し、この温度で１０時間インキュベートしてＲＮＡプ
ローブをＲｂアレルの一本鎖ＤＮＡ複製物に対してハイ
ブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、上述の如＜
ＲＮＡ分解酵素Ａ処理と電気泳動を行なった。ＲＮＡプ
ローブと各個体のＲｂアレルのゲノム複製物とのヘテロ
二本鎖における誤対合は容易に検出できた。
実施例３：蛋白質療法
ｐ４．７Ｒと表されるように正常Ｒｂ遺伝子のクローニ
ングしたｃＤＮＡについてのもう１つの用途は、Ｒｂ遺
伝子の欠損アレルを有すると決定された個体の治療のた
めのＲｂ蛋白質を産生ずることである。これらの個体に
おける網膜芽腫の形成を防止するために、Ｒｂ遺伝子産
生物をこれらの個体に治療に有効なように投与する。ｐ
４．７ＲからのＲｂ ｃＤＮＡを適当な哺乳類の発現ベ
クターにクローニングし、このベクターからのＲｂ蛋白
質をインビボ発現系で発現させ、発現系の培地または細
胞からＲｂ蛋白質を単離することによってＲｂ蛋白質が
産生される。一般的なインビトロ発現ベクターおよびシ
ステムは当分野で周知である。
ングしたｃＤＮＡについてのもう１つの用途は、Ｒｂ遺
伝子の欠損アレルを有すると決定された個体の治療のた
めのＲｂ蛋白質を産生ずることである。これらの個体に
おける網膜芽腫の形成を防止するために、Ｒｂ遺伝子産
生物をこれらの個体に治療に有効なように投与する。ｐ
４．７ＲからのＲｂ ｃＤＮＡを適当な哺乳類の発現ベ
クターにクローニングし、このベクターからのＲｂ蛋白
質をインビボ発現系で発現させ、発現系の培地または細
胞からＲｂ蛋白質を単離することによってＲｂ蛋白質が
産生される。一般的なインビトロ発現ベクターおよびシ
ステムは当分野で周知である。
実施例４：免疫学的診断
上述の如く産生されたＲｂ蛋白質をウサギに注射して抗
−Ｒ，ｂ抗体を産生させ、次いでこれを放射能、蛍光な
どで、あるいはアルカリホスファターゼのような酵素で
標識した。この標識した抗体を使用してヒト腫瘍が欠損
Ｒｂ遺伝子由来のものか否か決定した。たとえば、この
腫瘍試料を液化し、通常のＥＬＩＳＡフォーマットを使
用して標識された抗体に対して試験した。別法として、
腫瘍部分を固定し標識抗体と反応させ、免疫複合体を抗
体上の標識のタイプに応じてオートラジオグラフィーま
たは蛍光顕微鏡で検出できる。Ｒｂ遺伝子産生物に対す
る抗体と反応性の抗原を欠く腫瘍は網膜芽腫遺伝子の突
然変異に帰因する。突然変異Ｒｂ遺伝子によって生起さ
れることが知られている腫瘍は、網膜芽腫および骨肉腫
を含めてわずかなので、Ｒｂ遺伝子産生物を欠く腫瘍の
分別診断はそのような試験によって非常に明確にされる
。
−Ｒ，ｂ抗体を産生させ、次いでこれを放射能、蛍光な
どで、あるいはアルカリホスファターゼのような酵素で
標識した。この標識した抗体を使用してヒト腫瘍が欠損
Ｒｂ遺伝子由来のものか否か決定した。たとえば、この
腫瘍試料を液化し、通常のＥＬＩＳＡフォーマットを使
用して標識された抗体に対して試験した。別法として、
腫瘍部分を固定し標識抗体と反応させ、免疫複合体を抗
体上の標識のタイプに応じてオートラジオグラフィーま
たは蛍光顕微鏡で検出できる。Ｒｂ遺伝子産生物に対す
る抗体と反応性の抗原を欠く腫瘍は網膜芽腫遺伝子の突
然変異に帰因する。突然変異Ｒｂ遺伝子によって生起さ
れることが知られている腫瘍は、網膜芽腫および骨肉腫
を含めてわずかなので、Ｒｂ遺伝子産生物を欠く腫瘍の
分別診断はそのような試験によって非常に明確にされる
。
寄 託
プラスミドｐ２ＡＲ３，８およびｐ２ＡＲ０，９は１９
８７年７月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（メリーランド州、ロックビル）に各々Ａ
ＴＣＣＮｏ、４０．２４１と４０．２４２として寄託さ
れた。
８７年７月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（メリーランド州、ロックビル）に各々Ａ
ＴＣＣＮｏ、４０．２４１と４０．２４２として寄託さ
れた。
本出願人であるマサチューセッツ・アイ・エンド・イア
−・インファーマリ−は、ＡＴＣＣは寄託物の永続性を
保証する寄託機関であって、特許が許可されたときは公
衆に容易に分譲されることを表示する。この寄託物の公
衆への分譲についてのすべての制限は特許の許可と同時
に不可逆的に取り除かれよう。寄託物は、３７ＣＦＲ１
，１４および３５ＬＩＳＣ１２２の下に資格のある長官
によって決定された者に対して、この特許出願係属中分
譲されよう。
−・インファーマリ−は、ＡＴＣＣは寄託物の永続性を
保証する寄託機関であって、特許が許可されたときは公
衆に容易に分譲されることを表示する。この寄託物の公
衆への分譲についてのすべての制限は特許の許可と同時
に不可逆的に取り除かれよう。寄託物は、３７ＣＦＲ１
，１４および３５ＬＩＳＣ１２２の下に資格のある長官
によって決定された者に対して、この特許出願係属中分
譲されよう。
寄託物はそれを生存させておくに要するすべての管理に
より維持され、寄託微生物の試料の提供についてのもっ
とも最近の要請から少くとも５年間、およびとにかく、
寄託の口から少くとも３０年間あるいは特許権の存続期
間のいずれか長い方の間不純物の混入がないように管理
されよう。本出願人は、寄託機関が寄託物の状態に帰因
して、要請のあった試料の提供を行うことができないと
きは寄託物を補充する義務を認める。
より維持され、寄託微生物の試料の提供についてのもっ
とも最近の要請から少くとも５年間、およびとにかく、
寄託の口から少くとも３０年間あるいは特許権の存続期
間のいずれか長い方の間不純物の混入がないように管理
されよう。本出願人は、寄託機関が寄託物の状態に帰因
して、要請のあった試料の提供を行うことができないと
きは寄託物を補充する義務を認める。
他の具体例も前記特許請求の範囲内にある。
第１図はｐ７１１３０．７［？によってプローブされた
ノーサーンプロットからのオートラジオグラムを図示し
たものであり； 第２図はクローンｐ４．７Ｒにおける押入物の制限地図
の概略図であり； 第３図はｐ４．７Ｈによりプローブされたノーサーンプ
ロットのオートラジオグラフィーを図示したものであり
； 第４図は本発明のベクターｐ２ＡＲ３、８とｐ２ＡＲ０
，９の概略図であり； 第５図は誤対合検出技術の概略図であり；第６図は誤対
合検出に使用されたケルを変性する例の概略図であり； 第７図はフランキング領域を有する正常なＲｈ遺伝子の
配列である。 （外４名） （三Ｌｊ ｇ、 ＞ 、−１１＞ 、・１、：”ｉ”ｉ
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−手続補正Ｓ＜ハ） 昭和６２年特許願第２００７５５号 ２、発明の名称 網膜芽腫の診断用ベクター ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人
ノーサーンプロットからのオートラジオグラムを図示し
たものであり； 第２図はクローンｐ４．７Ｒにおける押入物の制限地図
の概略図であり； 第３図はｐ４．７Ｈによりプローブされたノーサーンプ
ロットのオートラジオグラフィーを図示したものであり
； 第４図は本発明のベクターｐ２ＡＲ３、８とｐ２ＡＲ０
，９の概略図であり； 第５図は誤対合検出技術の概略図であり；第６図は誤対
合検出に使用されたケルを変性する例の概略図であり； 第７図はフランキング領域を有する正常なＲｈ遺伝子の
配列である。 （外４名） （三Ｌｊ ｇ、 ＞ 、−１１＞ 、・１、：”ｉ”ｉ
：（＃、！ｉ： ニ′、二、ちミ！ｒｉ し）□
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−手続補正Ｓ＜ハ） 昭和６２年特許願第２００７５５号 ２、発明の名称 網膜芽腫の診断用ベクター ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人
Claims (7)
- （１）ヒト患者を分別する方法であって、該患者のＤＮ
Ａを正常なヒト網膜芽腫遺伝子または該遺伝子個有の下
部領域と比較することからなる方法。 - （２）比較がＤＮＡハイブリダイゼーションによって行
なわれる特許請求の範囲第１項の方法。 - （３）比較が配列比較または配列分析によって行なわれ
る特許請求の範囲第１項の方法。 - （４）比較が、患者のＤＮＡと正常な遺伝子または該正
常な遺伝子からのＲＮＡ転写物とのヘテロ二本鎖におけ
る誤対合の検出によって行なわれる特許請求の範囲第１
項の方法。 - （５）正常なヒト網膜芽腫遺伝子または該遺伝子個有の
下部領域からなるベクター。 - （６）少くとも２０ｂｐの長さを有する特許請求の範囲
第５項の下部領域。 - （７）その不存在が新生物と関連している蛋白質の腫瘍
試料における存在を検出する方法であって、該蛋白質に
対する抗体を産生し、該抗体を上記腫瘍試料と接触させ
、該腫瘍試料中の該蛋白質の存在を表示するものとして
免疫複合体を検出することからなる方法。
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