JPH0298666A - 抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗体に係り、殊に劣性癌遺伝子の産物に対する
抗体に係る０本発明による抗体は癌の診断に利用するこ
とができる。

〈従来の技術） −ｍ的に知られているｒａｓ等の癌遺伝子は、突然変異
等によって正常細胞を癌化する能力を獲得した遺伝子で
あって、優性の働きを有している。正常細胞と癌細胞と
を融合させて得られた細胞は正常であることから、癌の
形質は、本来、劣性なものであるとされている。

事実、網膜芽腫、ｗｉＩＩＩＳ腫瘍、神経芽細胞腫等で
は染色体の特定部位に異常のあることが見い出されてお
り、これらの腫瘍の発生には劣性の癌遺伝子が関与して
いるものと考えられるに至っている。最近では、このよ
うな特殊な腫瘍のみならず肺癌、腎癌、大腸癌、髄膜腫
、神経芽腫等の一般的な癌や腫瘍にも劣性の癌遺伝子が
関与している更に、最近、網膜芽腫の劣性癌遺伝子Ｒｈ
が分子クローニングされ、その構造が報告された。

（発明の目的） 上記の従来技術に鑑みて、本発明者は、癌や腫瘍の研究
として劣性癌遺伝子、殊にその産物に関する研究が肝要
であると考えるに至った。

従って、本発明の目的は、劣性癌遺伝子産物に対する抗
体を提供し、これによって各種の癌や腫瘍の基礎研究を
発展させ、延いては癌の診断に利用する途を開くことに
ある。

（目的を達成する手段及び作用） 本発明によれば、上記の目的は、アミノ酸配列が Ｌｙ　ｓ　−Ｍｅ　を−人ｓＯ−＾ｇｐ−３ｅｒ−Ｍｅ
ｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ人５ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓであるペプチドを抗原として得られる抗
体により達成される。

本発明による抗体を調製するに際して、抗原性ペプチド
として採択された上記のアミノ酸配列をの推定構造の一
部で、抗原性が高いと想定されたものである。この抗原
性ペプチドを用いて抗血清を得るためには、実際には該
抗原性ペプチドとキャリヤー蛋白とを結合させたものが
抗原として用いられる。キャリヤー蛋白としては、例え
ばキーホールリンベットヘモシアニン（にＬ）Ｉ）、ウ
シ血清アルブミン等を用いることが可能である。キャリ
ヤー蛋白と抗原性ペプチドは公知のサクシニイミドを用
いる方法によって、結合することができる（Ｔ、　Ｋｉ
ｔａｇａｗａ等ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｊ第７９
巻第２３３頁（１９７６年）ｌ。

得られた結合物は、抗原として、マウス、ウサギ、ラッ
ト、ヒツジ等の免疫用の動物に投与される。免疫方法は
通例の方法で可能である。免疫した動物から、本発明に
よる抗体を得る方法も、自体公知の任意の方法を採用す
ることができる０例えば、免疫した動物から採血し、常
法に従い抗血清を調製することができる（この場合にお
ける抗体の存否の判定は、劣性癌遺伝子Ｒｈが発現して
いる細胞、例えばヒト正常線維芽細胞を可溶化し、上記
の抗血清を用いウェスタンプロット法により解析し、分
子量１１５０００のＲｈ遺伝子産物が検出されるか否か
により行うことができる）、又免疫動物のリンパ球を採
取しミエローマと融合させてハイブリドーマとなし、本
発明による抗体を特異的に産生ずるハイブリドーマをス
クリーニングによって分離し、このハイブリドーマを培
養することによりモノクローナル抗体として得ることが
できる。更には、上記の抗体産生ハイブリドーマを動物
に移植して所望の抗体を産生させ、次いで単離すること
により得ることもできる。

このようにして得られた、本発明による抗体は、免疫グ
ロブリンクラスがＩｇＧであり、分子が１４．０であり
、劣性癌遺伝子Ｒｈ産物の特異的認識性を有しているこ
とを特徴としている。

（実施例等） 次に、抗体の製造例及び確認試験例により、本発明を更
に詳細に説明する。

礼り匠 ａ）抗原性ペプチドの調製 網膜芽腫の劣性癌遺伝子Ｒｈの産物に関して既に報告さ
れている推定構造から抗原性が高いと考えられる次のア
ミノ酸配列を有するペプチドを、ベックマン社製の９９
０８自動ペプチド合成装置を用い固相法により合成した
。

Ｌｙｓ−Ｍｅ　１Ａｓｎ−＾ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−＾
５ｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ入５ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ７５％弗化水素／２５ｘアニソール中において
　Ｏ’Ｃで３０分間処理することにより上記の合成ペプ
チドを固相から脱離させ、ＩｍＭジチオスライトール含
有０．０５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，０）によ
り平衡化し、ＳＰ−セファデックスカラム　（２，５×
５０ｃＩＩ）に吸着させた。上記の平衡化用緩衝液５０
０１及びｌｄジチオスライトール含有０．５Ｍ酢酸アン
モニウム溶液（ｐ）！　７．０）　５００ｍ１のグラジ
ェントにより、上記カラムの吸着物を分画溶出させた。

各両分をフルオロレスカミンでチエツクす濃縮した。こ
の濃縮物を、３０％　＃酸溶液で平衡化したセファデッ
クスＧ−１０カラム（１０ｘ　５０ｃｍ）に吸着させ、
上記と同様にしてペプチド含有画分を集めて濃縮し、乾
固させて所望の抗原性ペプチドを得た。

このペプチドをＩＮ塩酸溶液に１２０°Ｃで一晩浸漬し
て加水分解させ、アミノ酸アナライザーによりアミノ酸
組成を調べた結果は、下記の通りであった。

Ｌｙｓ　　２．９１　　Ｍｅｔ　　２．０％＋　　Ａｓ
ｎ　　１．９％・ＡｓＰ　　２．０Ｘ；　　Ｓｅｒ　　
２．０％：　　Ｔｈｒ　　Ｏ，９％：Ｇｌｕ　　２．［
ｌ＄ ｂ）抗原の調製（キャリヤー蛋白との結合）１０＋Ｂ／
ｍｌの割合で１０ｍＭ燐酸緩衝液に溶解させたキーホー
ルリンベットヘモシアニンを　１５ｍｇ／ｓの割合で１
０ｍＡｌ燐酸緩衝液に溶解させたｎ−マレイミド−Ｎ−
ハイドロキシサクシンイミドエステル６３μｍとを混合
し、３０分間室温下に保持して反応させた。　０．１Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）にて平４℃の温度条件下に、
上記の反応液のクロマトグラフィーを行った。

上記のようにして活性化させたキーホールリンベットヘ
モシアニン２．３１と、ｌ０ｍｇ／ｉｔの割合で燐酸緩
衝液（ｐＨ７，３＞に上記のａ）項で得た抗原性ペプチ
ドを溶解させた溶液に５ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液
１）、１ｍｌと混合し、ｐＨを６．５に調整し、更に室
温下で４時間混合することにより所望の抗原（抗原性ペ
プチドとキーホールリンベットヘモシアニンとの結合物
）を得た。この結合物の生成については５ＤＳ−電気泳
動解析により確認された。

Ｃ）　上記のｂ〉項で得られた抗原２００μｇをフロイ
ントの完全アジュバントと共にウサギの手掌部に注射し
た。その後、３週間間隔で２００μｇ宛４回にわたり背
皮下に注射して免疫を施した。最終免疫から１０日目に
採血して血清を得な、この血清を遠心（１００００ｘ　
ｇ）　して得た上清に飽和硫安溶液（ｐＨ７，４）を添
加して、硫安濃度を４０％になした。この溶液を水冷下
で一晩攪拌した後に１００００　ｘ　ｇにて　１０分間
遠心して沈殿物を採取した。得られた沈殿物を蒸留水に
溶解させ、５００倍量のＯ，１５Ｍ　ＮａＣｌに対して
４８時間透析処理して抗血清を得た。

１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，２＞にて平衡化させたＤ
ＥＡＥ−セルロース　（ワットマンＤＥ　３２）カラム
（１，ＯＸ　１５ｃｍ）に上記の抗血清２ｍｌを流し、
素通り画分として免疫グロブリンＩｇＧ画分を得た。こ
のＩｇＧは抗血清２１がら２４ｍｇの割合で得られる。

集められたＩｇＧを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で透析処理した。

一方、活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ　（ファルマシア
社製）１ｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
０）　５μｍに懸濁させ、これに上記ａ）項で得られた
抗原性ペプチド１ｏＩ１ｇを添加し、室温下に２時間撹
拌することにより、ペプチド結合ＣＨ−セファロース４
Ｂを調製してカラム（０，５ｘ２、Ｏｃ＠）に入れ、こ
のカラムに上記の透析処理済ミＩｇＧ　画分ヲチャーシ
し、０．１５Ｍ　ＮａＣｔｌｏ、００２Ｍ炭酸ナトリウ
ムＭ衝液（ｐ）Ｉ　８．０＞により充分に洗浄し、カラ
ムに吸着しているペプチド抗体を０、１７Ｍグリシン−
塩酸Ｍ衝液（ｐＨ２ｊ）により溶出させた。Ｓめな溶出
液を０．１５Ｍ　ＮａＣ１に対して透析し、限外濾過に
より濃縮させることにより２．５ａ＋ｇ／ｉｆの割合で
所望のＩｇＧ抗体を含有する溶液０．５１１１１を得た
。

１葛ｍ ■）　免疫グロブリンクラスの決定 カッベル社製の抗つサギＩｇＧ抗体、抗つサギＩｇＭ抗
体及び抗つサギＩｇ人士ＩｇＭ　＋　ＩｇＧ抗体を用い
、オフタロニー法により、上記の製造例で得た抗体（Ｉ
製Ｒｂ遺伝子産物抗体）の免疫沈降試験を実施した。即
ち、１％寒天ゲルに形成した穴の中心部に上記の抗つサ
ギＩｇ抗体３種を入れ、周りに形成された穴には、これ
らの抗体に対してＩ／２０１から２倍づつ稀釈した上記
の精製Ｒｈ遺伝子産物抗体を入れ、０℃において一晩放
置した後に、形成された沈降縁を観察した処、Ｒｈ遺伝
子産物抗体は抗つサギＩｇＧ抗体及び抗ウサギｉｇ＾＋
ＩｇＭ　＋　Ｉ；Ｇ抗体によってのみ免疫沈降を示して
いたので、その免疫グロブリンクラスはＩｇＧであるこ
とが確認された。

２）分子量の決定 上記の製造例で得た抗体（精製Ｒｈ遺伝子産物抗体）の
分子量はセファデックスＧ−１００を用いゲル濾過法に
より測定した。即ち、０．０２Ｍ炭酸すトリウム［−液
により平衡化させたセフアゾ・ンクスＣ−１００カラム
（１，Ｏｘ　ｌｏｏｅｍ）に１ｍｇの上記精製Ｒｂ遺伝
子産物抗体をチャージし、上記の緩衝液にて展開させ、
２８０ｎｍの吸光度を測定して溶出蛋白を検出し、分子
量マーカ　［）（イオウ・ンド社製の分子量測定キット
Ｎｏ、　１５１−１９０１であって千ログロブリン（分
子量６７００００）、γ−グロブリン（分子量＋５８０
０θ）、卵白アルブミン（分子量４４０００）、ミオグ
ロビン（分子ｉ　１７０００）及びビタミント１２　（
分子量＋３５０）がセ・ントされたちの１における溶出
パターンと比較した処、精製Ｒｈ遺伝子産物抗体の分子
量は約１５００００であることが判明した。

３）分子吸光係数 １ｍｇの精製Ｒｈ遺伝子産物抗体を１１の炭酸ナトリウ
ムＩＩＩ液（ｐｉ（９，０＞に溶解させ、２８０ｎｍで
吸光度を測定した処、１゜４０であったので、分子吸光
係数はＥ／ＶＦ・１．４０となる。

／（，７ｙ＋ ４）免疫特異性 Ｒｈ遺伝子の発現している正常ヒト線維芽細胞及びＲｈ
遺伝子に異常のある網膜芽細胞腫由来ノＹ７９細胞をＲ
ＩＰＡ　緩衝液（ＩＸ　ＮＰ−４０，０，１％デオキシ
コール酸ナトリウム塩、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭフェ
ニルエチルスル ５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　緩衝液を含有しており
、ｐＨ７．４＞によりそれぞれ可溶化させた後に１００
００　ｘ　ｇにて３０分間遠心して上清を採取し、この
上清液をレムリ　（Ｌａｅｍ．ｍｌｉ）の方法に従い１
０％　ＳＤＳゲル電気泳動法により分離した。

得られた各分離蛋白を、常法に従いニトロセルロース膜
にウェスタントランスファーした後に、上記の製造例に
より得た抗体（精製Ｒｈ遺伝子産サすＩｇＧ抗体（カッ
ベル社製）を用いてＲｂ遺伝子産物の検出を行った。

その結果、Ｒｈ遺伝子の発現しているヒト線維芽細胞で
は精製Ｒｈ遺伝子産物抗体により分子量＋１５０００の
蛋白が認識されたが、Ｒｈ遺伝子に異常のある網膜芽細
胞腫由来のＹ７９細胞では分子量１１５０００の蛋白が
検出されなかった．尚、製造例におけるａ）項に記載の
抗原性ペプチドによりＲｈ遺伝子産物抗体を吸収した後
に、同様の実験を行った処、何れの細胞に関しても、分
子量１１５０００の蛋白を検出することができなかった
。

更に、ヒトに関する癌の診断への応用の可能性を探る目
的で、種々のヒト腫瘍細胞につき、Ｒｂ遺伝子の発現を
検討した。

その結果、ヒト原車細胞癌、大細胞癌及び乳癌で高率に
Ｒｈ遺伝子産物の異常が見い出された。

特に肺小細胞底では検討した９例全例でＲｈ遺伝子産物
が検出されず、異常であることが明らかになった．特筆
すべきことは、ＤＮＡ、ＲＮＡレベルの分析（サザンプ
ロット法、ノーサンプロット法）で異常の見い出されな
かった６例についても本発明による抗体を用いることに
より異常を見い出すことができた点である．即ち、本発
明による抗体を用いることにより、サザンプロット法や
ノーサンプロット法では異常として検出し得ない微少な
欠失や点突然変異による異常も検出できるものと考えら
れる．尚，対照として用いた肺腺癌、扁平上皮癌ではＲ
ｈ遺伝子産物が検出され異常は全く見い出されなかった
．又、肝、腎、肺、リンパ球，胃、脳等における正常組
織はすべてＲｈ遺伝子を発現しており、本発明の抗体を
用いることにより　Ｒｈ遺伝子産物を検出することがで
きた。

これらの事実から、製造例により得られた抗体はＲｈ遺
伝子産物を特異的に認識するものであることが判明した
。

（発明の効果） 本発明による抗体は劣性癌遺伝子の産物を特異的に認識
する．劣性癌遺伝子は特殊な腫瘍のみなの発生に関与す
るものとされているので、これらの基礎研究や診断に応
用することが可能である。

尚、本発明による抗体は、合成ペプチドを抗原とするの
みで、他は当該技術分野において自体周知の手法を利用
して調製することが可能である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸配列が Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａ
   ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
   ｎ−Ｌｙｓ であるペプチドを抗原として得られる抗体。
2. （２）免疫グロブリンクラスがＩｇＧであり、分子量が
   約１５００００、分子吸光係数［▲数式、化学式、表等
   があります▼（２８０ｎｍ）］が１４．０であり、劣性
   癌遺伝子Ｒｂ産物の特異的認識性を有していることを特
   徴とする、請求項（１）に記載の抗体。