JP3110372B2 - 免疫分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、癌、特に、網膜芽
腫および骨肉腫に関連した欠損ヒト遺伝子の検出および
治療方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】網膜芽腫は、ほとんどの場合０〜４才の
子供に観察される、網膜細胞の新生物である。治療され
なければ、眼内腫瘍の悪性新生物網膜細胞は体の他の部
分に転移して常に死に至る制御されない生育を示す病巣
をいくつも形成する。 【０００３】この網膜芽腫の現在の治療法は、眼内腫瘍
が大きい場合には侵された眼を摘出し、眼内腫瘍が小さ
い場合には、放射療法、レーザー療法、または寒冷療法
が行われていた。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、転移し
た網膜内腫瘍には良い治療法が知られていないため、腫
瘍が眼の外へ広がる前に治療できるような網膜芽腫の早
期診断は困難であった。網膜芽腫は網膜芽腫（Ｒｂ）遺
伝子の両相同性コピーの機能欠失によって生じることが
証明されている。このように、Ｒｂ遺伝子の１つの欠損
アレルを有する個体は一般にこの病気にかかりやすい。
網膜芽腫にかかった眼を１つ有する子供あるいは網膜芽
腫患者の血族である子供は一般にこの病気の素因を持
ち、発病の危険にさらされている。これらの子供は全身
麻酔を必要とする眼の検査を２〜３ヶ月毎に受けて網膜
芽腫の検診が行われている。 【０００５】そこで、本発明は、上記課題に鑑みなされ
たものであり、その目的は網膜芽腫の早期診断としての
網膜芽腫ポリペプチドの検出方法及びこの方法に利用し
得るポリペプチド等を提供する。 【０００６】また、本発明は網膜芽腫を治療するための
組成物を提供する。 【０００７】 【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の単離ポリペプチドは、単離されたヒト網膜
芽腫遺伝子又はその１５塩基以上からなる固有部分領域
によりコードされていることを特徴とする。ここで固有
部分領域とはＲｂ遺伝子に見られるが、ヒト染色体の他
の部位には見られない配列からなる領域をいう。上記単
離ポリペプチドは、網膜芽腫ポリペプチドに対する抗体
の生成や網膜芽腫を治療するための組成物の生成に利用
することができる。 【０００８】また、別の態様として、本発明は、ヒト網
膜芽腫患者において、その不存在がはっきりした１組の
新生物と関連している蛋白質を、腫瘍試料中から検出す
る方法を提供する。この方法は、Ｒｂ蛋白質（ポリペプ
チド）に対する抗体を産生し、該抗体を腫瘍試料と接触
し、免疫複合体を腫瘍試料中の該蛋白質の存在を示すも
のとして検出することからなる。腫瘍がＲｂ遺伝子産生
物（Ｒｂ蛋白質）を含まないなら、免疫複合体は見出さ
れず、腫瘍が突然変異体Ｒｂアレルの結果であると結論
できる。これにより網膜芽腫、骨肉腫のような突然変異
体Ｒｂアレルによって生起せしめられることが知られて
いるこれらの腫瘍、および未知の細胞性の原因にもとづ
く未解明の腫瘍に対する病理学的診断ができる。ヒト腫
瘍の病理学的診断のより正確な類別ができよう。 【０００９】 【実施例】実施例１ ：サザン・ブロット分析 Ｒｂ部位における大量の欠損を検出するために、被験個
体からのＤＮＡについてサザン・ブロット分析を行っ
た。このＤＮＡは末梢白血球から得られ、患者が１つの
眼に腫瘍を有するときは該腫瘍から得られた。白血球Ｄ
ＮＡを検査するために、10 ml の血液試料を個体から標
準的方法によって該試料中の白血球からゲノムＤＮＡを
単離した。このＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、たと
えばHind IIIで切断し、アガロース電気泳動ゲル上を泳
動させ、ブロッティングによりニトロセルロースフィル
ターに移した。フィルター上のＤＮＡを次いで放射標識
されたp2AR3.8 およびp2AR0.9 （ＥcoＲＩによる切断に
よって得られたp4.7R からのサブフラグメントを含む）
をプローブとして別々に探索した（図４）。検出された
異常の位置をより明確に決定するためには、p4.7R 挿入
物全体よりむしろ２つ以上の断片を別々に使用すること
が好ましい。ハイブリダイゼーション後のフィルターの
オートラジオグラムによって、試験された個体の体細胞
または腫瘍ＤＮＡにおけるＲｂ部位の制限地図が得られ
た。 【００１０】この制限地図を、対照制限地図であって、
同一の制限酵素による切断と同一のプローブを使用して
決定した地図と比較した。適当な対照は、１組の正常な
個体からのアデノビールス−形質転換網膜細胞株または
白血球のＤＮＡから得られたＤＮＡであり得る。被検者
が有意に大きな欠損を含むＲｂアレルを有するならば、
被検者のＤＮＡの制限地図は、対照と比較して、Ｒｂ部
位における１つのアレルにおける欠失による１つまたは
それ以上の制限断片の、１つまたはそれ以上のバンドを
余計に含み、および／あるいはサイズの変化によって生
じた、強度が50％低下した１つまたはそれ以上のバンド
を含むか、あるいは該バンドが全面的に欠除しているで
あろう。 【００１１】正常Ｒｂ遺伝子の単離 網膜芽腫を生起せしめるのに含まれる遺伝子的位置はヒ
ト染色体13のｑ14帯域であると決定されている。〔park
erら、サイエンス(Science)208：1042(1980)〕ＤＮＡの
この領域からのｃＤＮＡクローンであるp4.7R はＲｂ遺
伝子配列を担持することが示されている。このクローン
は下記一般的技術により得られた。 【００１２】ｃＤＮＡクローンp4.7R の単離 ヒト染色体13ラムダファージライブラリーから単離され
たヒトＤＮＡプローブpH3-8(Lalande ら、1984,Cancer
Genet.Cytogenet.13：283 ）を染色体移動技術において
使用してＨ３−８配列を囲む30kbの染色体ＤＮＡを単離
し地図を作製した。この技術によって生成した１つの断
片、すなわちp7H30.7Rを見出してヒト染色体13ばかりで
なくマウスの染色体にもＤＮＡ配列を確認した（Dryja
ら、1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA）。ヒトとマウス両方
のＤＮＡについてp7H30.7Rの相同性があることはp7H30.
7Rが構造遺伝子のコード配列を含むことを示唆した。 【００１３】この可能性を試験するために、p7H30.7Rを
放射標識し、３つの網膜芽腫（＃42，＃30および＃31）
およびアデノビールス12−形質転換ヒト胎児網膜細胞株
（Ｒｅｔ）（Vaessen ら，1986,EMBO Journal 5 ：335
）から単離されたＲＮＡのノーサーンブロットをプロ
ーブした。このp7H30.7Rプローブは網膜細胞株からの約
4.7 ｋｂのＲＮＡ転写物に対してハイブリッド形成した
が、上記３つの腫瘍試料からのＲＮＡ転写物に対しては
ハイブリッド形成しなかった（図１）。 【００１４】続いて、アデノビールス形質転換網膜細胞
株から単離されたＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリ
ーを造成した。このライブラリーを標識されたp7H30.7R
プローブによってスクリーニングした。類似の制限地図
を有するいくつかのｃＤＮＡクローンが単離された。そ
れらのもっとも大きなものであるp4.7R は4.7kb のゲノ
ムＤＮＡを含んでいた。p4.7R の制限地図は図２に示し
た。 【００１５】p4.7R の特定 網膜芽腫（＃42，＃30，＃41，＃31）；骨肉腫（＃16）
およびアデノビールス−形質転換網膜細胞（Ｒｅｔ）か
ら単離されたＲＮＡ転写物をスクリーニングするのにp
4.7クローンを使用した。図３に示されるように、p4.7R
プローブは、単離されたＲＮＡ転写物のノーサーンブ
ロット分析において、４つの網膜芽腫および１つの骨肉
腫細胞試料において存在しない形質転換網膜細胞におけ
る転写物を検出した。2.0kb 以下のバンドは、洗浄後ノ
ーサーンブロットをラットチューブリン（tubulin)を検
出するプローブで再プローブする（ブロットにおけるＲ
ＮＡの存在を示す）ことによって検出された。 【００１６】p4.7R クローンもゲノムＤＮＡをスクリー
ニングするのに使用した。40個の網膜芽腫、８つの骨肉
腫および網膜芽腫の遺伝形質を有する患者の未知の細胞
の未確認腫瘍２つからなる50人の非血族の患者からの各
腫瘍１組からＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡ試料
をＨind III で切断し、プローブとして放射標識したp
4.7R を使用してサザンブロットハイブリダイゼーショ
ンにより分析した。この分析により、ゲノムＤＮＡ制限
断片の３つの異なったパターン：（１）見掛け上の同型
接合欠失を示す全面的に不存在の断片，（２）見掛け上
の異型接合欠失を示す不顕化断片および（３）制限部位
の部分的欠失または変化のいずれかを有するサイズが変
化した断片を示した。腫瘍ＤＮＡの少なくとも30％はこ
れらの異常のうち１つを示した。比較のため、18人の正
常な個体からの白血球ＤＮＡをサザンブロット分析して
制限断片の均一なパターンを示した。 【００１７】上記結果はp4.7R がＲｂ遺伝子を欠失する
ことを示す。１つの骨肉腫ＤＮＡ試料中の欠失パターン
はp4.7R がＲｂ遺伝子を検出する特に良い証拠を提供す
る。このＤＮＡ試料は、p4.7R 領域内に全体が位置する
欠失については同型接合である。骨肉腫表現型はこの欠
失とは関係なく生じるということはとてもありそうにな
い。欠失はp4.7R 領域に限定されるので、この領域は、
突然変異を生じたとき非機能Ｒｂ−コード化蛋白質を産
生する変異Ｒｂ遺伝子を含んでいるにちがいない。機能
Ｒｂ蛋白質が存在しないと新生物の表現型を形成する。 【００１８】用 途 本発明の方法でp4.7配列を使用するとＲｂ遺伝子の突然
変異アレルの存在について個体をスクリーニングでき
る。このスクリーニング方法を使用すれば、１つの眼に
網膜芽腫の家族歴または既応症があるため網膜芽腫を発
病するおそれのある個体が現在の眼の検査によって日常
的な検査を受ける必要を決定する。もし、スクリーニン
グで個体が突然変異Ｒｂアレルを有することが決定され
た場合のみ、定期的に検査を行う必要があろう。２つの
正常なＲｂアレルを有する患者は検査を中止できる。と
いうのは、Ｒｂ遺伝子の２つの正常な複製物を有する個
体が網膜芽腫を発病する危険性は、アレルを不活性化す
るに充分な突然変異を含むＲｂアレルを患者が有してい
る場合の危険率80〜90％に比べて、約20000 分の１、す
なわち0.005 ％であるからである。このように、現在定
期的に検査されている患者の大部分が実際には一般的な
人々を越える危険にさらされているわけではなく、網膜
芽腫の家族歴も既応症も個体がこの病気に遺伝的にかか
りやすいという包括的な証拠にはならない。したがっ
て、実際にＲｂ遺伝子の２つの正常な複製物を担持して
いるそのような個体は不必要な高価且つ外傷性の眼の検
査を繰返し受けてきたことになる。 【００１９】上記スクリーニング方法は好ましくは主と
して２つのタイプからなる：(1) Ｒｂプローブに対する
ハイブリダイゼーションを妨害するに充分大きなＲｂ位
置における欠失についての個体のＤＮＡを試験するこ
と、および(2) Ｒｂ位置における小さな欠失すなわち点
突然変異について個体のＤＮＡを試験すること。 【００２０】スクリーニングに加えて、本発明は、突然
変異体Ｒｂアレルを含むことが決定され、したがって網
膜芽腫を発病するおそれのある患者のための蛋白質療法
を提供するのに役立つ。 【００２１】さらに、特定の腫瘍がＲｂ遺伝子の異常に
よるものか否か決定する免疫学的診断を行うこともでき
る。骨肉腫および特定の未確認腫瘍はＲｂ遺伝子の検出
可能な障害から生じるので、免疫学的診断を使用してそ
のような腫瘍の診断を助けることができる。 【００２２】下記例により本発明を説明する。 【００２３】このようにしてサザーン分析によるスクリ
ーニング方法は大きな欠失を有する非機能Ｒｂアレルの
存在を検出するであろう。もしこの分析により個体から
の被験ＤＮＡが対照の制限地図と異なる制限地図を有す
ることを示す場合、当該個体が非機能突然変異Ｒｂアレ
ルを含むという大きな可能性がある。この個体は今後網
膜芽腫の発病について厳密に監視されなければならな
い。 【００２４】もし、被験制限地図が対照と同一であれ
ば、異なるスクリーニング方法をその個体のＤＮＡにつ
いて実施してその個体が小さな欠失すなわち点突然変異
を有するＲｂアレルを含むか否かを決定する。これは該
アレルを不活性化するのに充分であるがプローブとのハ
イブリダイゼーションを防止するには不充分である。ス
クリーニング方法は下記例に記載する。 【００２５】実施例２：Ｒｂ位置の精密な構造分析 Ｒｂ位置の小さな欠失または点突然変異について個体の
ＤＮＡを検査するために該個体からのＲｂ遺伝子の両方
の相同体をクローニングしたアレルを次いで下記２つの
方法のうちの１つによって、p4.7R と表わされる正常ア
レルとの配列の相違があるか否かについて試験する：
(1) クローニングしたアレルおよびp4.7Rの両方のヌク
レオチド配列を決定し比較する、あるいは(2)p4.7Rから
のＲＮＡ転写物を被検者からの一本鎖全ゲノムＤＮＡに
対してハイブリッド形成させ、得られたヘテロ二本鎖を
ＲＮＡ分解酵素Ａで処理して変性ゲル上で泳動させて誤
対合（ミスマッチ）の位置を検出する。より詳しくは、
これらの方法は下記の如く行われる。 【００２６】（１）Ｒｂアレルのクローニング 試験されるべき個体のＲｂ遺伝子のアレルを従来の技術
を使用してクローニングした。普通の方法はたとえばバ
クテリオファージベクターＥＭＢＬ３(Frischaufら，19
83,J.Mol.Biol.170 ：827 ）を使用する。10mlの血液試
料を個体から得、ゲノムＤＮＡをこの試料の細胞から単
離した。このＤＮＡをＭboＩで部分的に切断して平均サ
イズ約20kbの断片にした。そして、18〜21kbの断片を単
離した。得られたＭboＩ末端断片をＢamＨＩで完全に切
断し、アルカリフォスファターゼで処理し、68℃に10分
間加熱して接着末端を分断しておいたＥＭＢＬ３ベクタ
ーＤＮＡに結合させた。このライゲーションミックスを
インビトロラムダパッケジング反応で使用し、プレート
ストックを生育させることにより、パッケージされたフ
ァージを増殖させた〔このクローニング技術はマニアテ
ィス（Maniatis) ら、モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning)：A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Publications,256-293 頁(1982)に一般的に記載
されている〕。 【００２７】このプレートストックからの約５×10⁵ pf
u を使用して３mlの大腸菌（E.coli)(0.01ＭμｇＳＯ₄
中〜1.5 ×10⁹ 個／mlの菌体）に感染させ、この感染混
合物を37℃で20分間インキュベートした。47℃で頂部を
融解させた寒天65mlを加え、この混合物を新しく注入さ
れ底部に乾いた寒天を含む10枚の150mm プレート上に塗
布した。プラークが〜1.5mm の直径となり互いに接触し
始めるようになるまで（約10〜12時間）インキュベート
した。 【００２８】二重の円状のニトロセルロースフィルター
（ミリポアＨＡＷＰ）を各寒天プレートの表面にそっと
置いてバクテリオファージＤＮＡを結合させた。これら
のフィルターを１分間後に注意深く取り出し、30秒間変
性溶液（1.5 Ｍ Ｎａｃｌ，0.5 Ｍ ＮａＯＨ）に入
れ、５分間中和し（1.5 Ｍ Ｎａｃｌ，0.5 Ｍトリス−
塩酸pH8.0)、80℃で２時間真空乾燥した。 【００２９】次いでこれらのニトロセルロースフィルタ
ーを放射標識したp4.7R をプローブとしてハイブリダイ
ゼーションを実行した後、オートラジオグラフィーによ
ってプローブした。p4.7R プローブとハイブリッド形成
したプラークを上記方法によりプラーク精製し再びスク
リーニングした。再スクリーニングからの陽性プラーク
を単離し、これを基に個体からのＲｂアレルを含むと推
定されるＤＮＡをつくった。 【００３０】これらの単離されたＥＭＢＬ３ベクターＤ
ＮＡ試料におけるＭobＩゲノム挿入物を、サザン分析に
よりp4.7R と相同の配列の位置について試験した。全Ｒ
ｂ遺伝子領域を含有するＤＮＡ試料を選択し、これらの
試料からのＲｂ遺伝子を含む適当な制限断片をｐＵＣ９
のような適当なベクターにサブクローンした。これらの
サブクローンは試験される個体のＤＮＡからの１つまた
は両方のＲｂアレルの複製物を含有していた。両方のア
レルが発現されているか否か決定するために、当初ファ
ージ単離物を制限酵素切断片の多形性の存在について試
験した。サブクローニングしたアレルを下記技術の１つ
によってp4.7R との相違についてしらべた。 【００３１】（２）配列比較 まず、p4.7R 中の正常Ｒｂ遺伝子のヌクレオチド配列を
p4.7R からの〜500bpの制限断片をM13mp8ファージベク
ターをサブクローニングし、これらのサブクローニング
をダイデオキシ技術により配列決定した（Sangerら，19
77,Proc.Nat.Acad.Sci USA 74 ：5463）。これらの個々
のサブクローン配列の配列を並べることによりＲｂ遺伝
子の配列を決定することができた。この配列はフランキ
ング領域を含むことが図７〜図１２に示されている。 【００３２】単離されたＲｂ遺伝子アレルを下記手順で
配列決定した。アレルの制限断片（〜２kb）をM13mp8ベ
クターにサブクローニングし、ジデオキシ配列反応にお
いてプライマーとしてp4.7R から単離された小さな制限
断片を使用していくつかの短い領域（〜500bp)を個別に
配列決定した。次いでこの単離されたアレルの複合ヌク
レオチド配列をこれらの個別にプライムされた配列から
造成した。この配列をp4.7R から決定された正常のＲｂ
遺伝子の配列と直接に比較して、欠失または点突然変異
が単離されたアレルに存在するか否かについて調べた。 【００３３】（３）誤対合のリボヌクレアーゼ開裂 アレルのＤＮＡを正常Ｒｂ遺伝子と比較する別の方法は
ＲＮＡ分解酵素Ａを使用してp4.7R 配列とアレル配列と
の相違があるか否か検出する。この比較はプローブとし
てのp4.7R の小さな（〜500bp)制限断片により段階的に
行われる。まず、p4.7R をＲｂ遺伝子配列を約500bp の
断片に切断する制限酵素で切断する。これらの断片を電
気泳動ゲル上で単離し、ｐＳＲ64またはｐＳＰ65のよう
なＳＰ６ベクターに両方向で別個にクローニングした
（Meltonら，1984.Nucleic Acids Res.12 ：7035）、p
4.7R 断片の挿入物を含有するＳＰ６に基づいたプラス
ミドを、ＳＰ６転写系（当分野で周知）を〔α−³²Ｐ〕
ＧＴＰの存在下に使用してＲｂ遺伝子のｃＤＮＡの二本
鎖の放射標識ＲＮＡ転写物を形成することによってイン
ビトロで転写した。 【００３４】これらのＲＮＡ転写物を別個に使用してア
レルＤＮＡによりヘテロ二本鎖を下記の如く形成した。 【００３５】50ngのアレルサブクローンを使用されるべ
きＲＮＡ転写物プローブによってカバーされる領域の外
を切断する制限酵素で切断した。この切断されたＤＮＡ
を30μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（80％ホルム
アミド，40mMパイプス（Pipes)pH6.4 ，0.4 Ｍ Ｎａｃ
ｌ，および１mM ＥＤＴＡ）中で放射標識ＲＮＡと混合
し、混合物を90℃で10分間処理してＤＮＡを変性した。
次いでこの混合物をゆっくりと45℃に冷却してＲＮＡを
45℃で30分間一本鎖ＤＮＡにアニーリングした。このＲ
ＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を350 μｌのＲＮＡ分解酵素
Ａ溶液〔シグマ(Sigma）〕（10mM トリス−Ｈｃｌ pH
7.5,1mM ＥＤＴＡ，0.2 Ｍ Ｎａｃｌおよび0.1 Ｍ Ｌ
ｉｃｌ中40μｇ／mlの酵素）で処理した。この混合物を
渦動させ25℃で30分間インキュベートとした。ＲＮＡ分
解酵素Ａ反応を10μｌのプロテイナーゼＫ（10mg／ml）
（ベーリンガー・マンハイム）の添加、続いて37℃で20
分間インキュベートすることによって停止させた。水性
層をフェノール−クロロホルムおよびエタノール沈殿に
より抽出して蛋白質の混入しない核酸サンプルを得た。
この沈殿した試料を５μｌに再懸濁し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（４％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿
素）を変性することによって分析した（図５）。 【００３６】p4.7R 断片と個体からのＲｂアレルサブク
ローンとの配列の相違に帰因するＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ
二本鎖に生じた誤対合の結果、ＲＮＡ分解酵素Ａ処理に
よりＲＮＡ鎖が開裂した。そのような誤対合は各個体の
Ｒｂアレルにおける点突然変異または小さな欠失の結果
である。ＲＮＡ鎖の開裂により２つ以上の小さなＲＮＡ
断片が得られ、これらは図６に示されるように変性ゲル
上をＲＮＡプローブ自体よりも速く泳動した。 【００３７】ＲＮＡ分解酵素技術において、放射標識Ｒ
ｂ遺伝子ＲＮＡをベクターにクローンしておいた個体の
Ｒｂアレルの一本鎖にハイブリッドした。このＲＮＡ分
解酵素技術もＲｂアレルをクローニングしないでも使用
できるので便利である。好ましくは、ゲノムＤＮＡは試
験されるべき個体の血球から単離され、このゲノムＤＮ
Ａは放射標識Ｒｂ ＲＮＡプローブと直接ハイブリッド
を形成して下記の如く正常Ｒｂ遺伝子との配列上の相違
を決定した。単離されたゲノムＤＮＡ総量のうち５μｇ
を30μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（80％ホルム
アミド、40mMパイプスpH6.4 ，0.4 Ｍ Ｎａｃｌおよび
１mM ＥＤＴＡ）中の標識ＲＮＡプローブとともに再懸
濁し、このハイブリダイゼーション混合物を90℃で10分
間処理してＤＮＡを変性した。次いでこの混合物をゆっ
くり45℃に冷却し、この温度で10時間インキュベートし
てＲＮＡプローブをＲｂアレルの一本鎖ＤＮＡ複製物に
対してハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、
上述の如くＲＮＡ分解酵素Ａ処理と電気泳動を行った。
ＲＮＡプローブと各個体のＲｂアレルのゲノム複製物と
のヘテロ二本鎖における誤対合は容易に検出できた。 【００３８】実施例３：蛋白質療法 p4.7R と表されるように正常Ｒｂ遺伝子のクローニング
したｃＤＮＡについてのもう１つの用途は、Ｒｂ遺伝子
の欠損アレルを有すると決定された個体の治療のための
Ｒｂ蛋白質を産生することである。これらの個体におけ
る網膜芽腫の形成を防止するために、Ｒｂ遺伝子産生物
（Ｒｂ蛋白質）をこれらの個体に治療に有効なように投
与する。治療に有効なように投与する場合には、前記Ｒ
ｂ遺伝子産生物を薬学的に許可されている賦形剤等と混
合することができる。 【００３９】Ｒｂ蛋白質を生成する具体例としては、p
4.7R からのＲｂ ｃＤＮＡを適当な哺乳類の発現ベク
ターにクローニングし、このベクターからのＲｂ蛋白質
をインビボ発現系で発現させ、発現系の培地または細胞
からＲｂ蛋白質を単離することによってＲｂ蛋白質が産
生される。一般的なインビトロ発現ベクターおよびシス
テムは当分野で周知である。 【００４０】実施例４：免疫学的診断 上述の如く産生されたＲｂ蛋白質をウサギに注射して抗
−Ｒｂ抗体を産生させる。次いでこれを放射能、蛍光な
どで、あるいはアルカリホスファターゼのような酵素で
標識した。この標識した抗体を使用してヒト腫瘍が欠損
Ｒｂ遺伝子由来のものか否か決定した。たとえば、この
腫瘍試料を液化し、通常のＥＬＩＳＡフォーマットを使
用して標識された抗体に対して試験した。別法として、
腫瘍部分を固定し標識抗体と反応させ、免疫複合体を抗
体上の標識のタイプに応じてオートラジオグラフィーま
たは蛍光顕微鏡で検出できる。Ｒｂ遺伝子産生物に対す
る抗体と反応性の抗原を欠く腫瘍は網膜芽腫遺伝子の突
然変異に帰因する。突然変異Ｒｂ遺伝子によって生起さ
れることが知られている腫瘍は、網膜芽腫および骨肉腫
を含めてわずかなので、Ｒｂ遺伝子産生物を欠く腫瘍の
分別診断はそのような試験によって非常に明確にされ
る。 【００４１】寄 託 プラスミドp2AR3.8 およびp2AR0.9 は1987年７月17日に
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリ
ーランド州，ロックビル）に各々ATCCNo.40,241 と40,2
42として寄託された。 【００４２】本出願人であるマサチューセッツ・アイ・
エンド・イアー・インファーマリーは、ATCCは寄託物の
永続性を保証する寄託機関であって、特許が許可された
ときは公衆に容易に分譲されることを表示する。この寄
託物の公衆への分譲についてのすべての制限は特許の許
可と同時に不可逆的に取り除かれよう。寄託物は、37CF
R1.14 および35USC122の下に資格のある長官によって決
定された者に対して、この特許出願係属中分譲されよ
う。寄託物はそれを生存させておくに要するすべての管
理により維持され、寄託微生物の試料の提供についての
もっとも最近の要請から少なくとも５年間、およびとに
かく、寄託の日から少なくとも30年間あるいは特許権の
存続期間のいずれか長い方の間不純物の混入がないよう
に管理されよう。本出願人は、寄託機関が寄託物の状態
に帰因して、要請のあった試料の提供を行うことができ
ないときは寄託物を補充する義務を認める。 【００４３】他の具体例は前記特許請求の範囲内にあ
る。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４５９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 gtcatgccgc ccaaaacccc ccgaaaaacg gccgccaccg ccgccgctgc cgccgcggaa 60 cccccggcac cggccgccgc cccctcctga ggaggaccca gagcaggaca gcggcccgga 120 gacctgcctc tcgtcaggct tgagtttgaa gaaacagaag aacctgattt tactgcatta 180 tgtcagaaat taaagatacc agatcatgtc agagagagag cttggttaac ttgggagaaa 240 gtttcatctg tggatggagt attgggaggt tatattcaaa agaaaaagga actgtgggga 300 atctgtatct ttattgcagc agttgaccta gatgagatgt cgttcacttt tactgagcta 360 cagaaaaaca tagaaatcag tgtccataaa ttctttaact tactaaaaga aattgatacc 420 agtaccaaag ttgataatgc tatgtcaaga ctgttgaaga agtatgatgt attgtttgca 480 ctcttcagca aattggaaag gacatgtgaa cttatatatt tgacacaacc cagcagttcg 540 atatctactg aaataaattc tgcattggtg ctaaaagttt cttggatcac atttttatta 600 gctaaagggg aagtattaca aatggaagat gatctggtga tttcatttca gttaatgcta 660 tgtgtccttg actattttat taaactctca cctcccatgt tgctcaaaga accatataaa 720 acagctgtta tacccattaa tggttcacct cgaacaccca ggcgaggtca gaacaggagt 780 gcacggatag caaaacaact agaaaatgat acaagaatta ttgaagttct ctgtaaagaa 840 catgaatgta atatagatga ggtgaaaaat gtttatttca aaaattttat accttttatg 900 aattctcttg gacttgtaac atctaatgga cttccagagg ttgaaaatct ttctaaacga 960 tacgaagaaa tttatcttaa aaataaagat ctagatgcaa gattattttt ggatcatgat 1020 aaaactcttc agactgattc tatagacagt tttgaaacac agagaacacc acgaaaaagt 1080 aaccttgatg aagaggtgaa tgtaattcct ccacacactc cagttaggac tgttatgaac 1140 actatccaac aattaatgat gattttaaat tcagcaagtg atcaaccttc agaaaatctg 1200 atttcctatt ttaacaactg cacagtgaat ccaaaagaaa gtatactgaa aagagtgaag 1260 gatataggat acatctttaa agagaaattt gctaaagctg tgggacaggg ttgtgtcgaa 1320 attggatcac agcgatacaa acttggagtt cgcttgtatt accgagtaat ggaatccatg 1380 cttaaatcag aagaagaacg attatccatt caaaatttta gcaaacttct gaatgacaac 1440 atttttcata tgtctttatt ggcgtgcgct cttgaggttg taatggccac atatagcaga 1500 agtacatctc agaatcttga ttctggaaca gatttgtctt tcccatggat tctgaatgtg 1560 cttaatttaa aagcctttga tttttacaaa gtgatcgaaa gttttatcaa agcagaaggc 1620 aacttgacaa gagaaatgat aaaacattta gaacgatgtg aacatcgaat catggaatcc 1680 cttgcatggc tctcagattc acctttattt gatcttatta aacaatcaaa ggaccgagaa 1740 ggaccaactg atcaccttga atctgcttgt cctcttaatc ttcctctcca gaataatcac 1800 actgcagcag atatgtatct ttctcctgta agatctccaa agaaaaaagg ttcaactacg 1860 cgtgtaaatt ctactgcaaa tgcagagaca caagcaacct cagccttcca gacccagaag 1920 ccattgaaat ctacctctct ttcactgttt tataaaaaag tgtatcggct agcctatctc 1980 cggctaaata cactttgtga acgccttctg tctgagcacc cagaattaga acatatcatc 2040 tggacccttt tccagcacac cctgcagaat gagtatgaac tcatgagaga caggcatttg 2100 gaccaaatta tgatgtgttc catgtatggc atatgcaaag tgaagaatat agaccttaaa 2160 ttcaaaatca ttgtaacagc atacaaggat cttcctcatg ctgttcagga gacattcaaa 2220 cgtgttttga tcaaagaaga ggagtatgat tctattatag tattctataa ctcggtcttc 2280 atgcagagac tgaaaacaaa tattttgcag tatgcttcca ccaggccccc taccttgtca 2340 ccaatacctc acattcctcg aagcccttac aagtttccta gttcaccctt acggattcct 2400 ggagggaaca tctatatttc acccctgaag agtccatata aaatttcaga aggtctgcca 2460 acaccaacaa aaatgactcc aagatcaaga atcttagtat caattggtga atcattcggg 2520 acttctgaga agttccagaa aataaatcag atggtatgta acagcgaccg tgtgctcaaa 2580 agaagtgctg aaggaagcaa ccctcctaaa ccactgaaaa aactacgctt tgatattgaa 2640 ggatcagatg aagcagatgg aagtaaacat ctcccaggag agtccaaatt tcagcagaaa 2700 ctggcagaaa tgacttctac tcgaacacga atgcaaaagc agaaaatgaa tgatagcatg 2760 gatacctcaa acaaggaaga gaaatgagga tctcaggacc ttggtggaca ctgtgtacac 2820 ctctggattc attgtctctc acagatgtga ctgtataact ttcccaggtt ctgtttatgg 2880 ccacatttaa tatcttcagc tctttttgtg gatataaaat gtgcagatgc aattgtttgg 2940 gtgattccta agccacttga aatgttagtc attgttattt atacaagatt gaaaatcttg 3000 tgtaaatcct gccatttaaa aagttgtagc agattgtttc ctcttccaaa gtaaaattgc 3060 tgtgctttat ggatagtaag aatggcccta gagtgggagt cctgataacc caggcctgtc 3120 tgactacttt gccttctttt gtagcatata ggtgatgttt gctcttgttt ttattaattt 3180 atatgtatat ttttttaatt taacatgaac acccttagaa aatgtgtcct atctatcttc 3240 caaatgcaat ttgattgact gcccattcac caaaattatc ctgaactctt ctgcaaaaat 3300 ggatattatt agaaattaga aaaaaattac taattttaca cattagattt tattttacta 3360 ttggaatctg atatactgtg tgcttgtttt ataaaatttt gcttttaatt aaataaaagc 3420 tggaagcaaa gtataaccat atgatactat catactactg aaacagattt catacctcag 3480 aatgtaaaag aacttactga ttattttctt catccaactt atgtttttaa atgaggatta 3540 ttgatagtac tcttggtttt tataccattc agatcactga atttataaag tacccatcta 3600 gtacttgaaa aagtaaagtg ttctgccaga tcttaggtat agaggaccct aacacagtat 3660 atcccaagtg cactttctaa tgtttctggg tcctgaagaa ttaagataca aattaatttt 3720 actccataaa cagactgtta attataggag ccttaatttt tttttcatag agatttgtct 3780 aattgcatct caaaattatt ctcccctcct taatttggga aggtttgtgt tttctctgga 3840 atggtacatg tcttccatgt atcttttgaa ctggcaattg tctatttatc ttttattttt 3900 ttaagtcagt atggtctaac actggcatgt tcaaagccac attatttcta gtccaaaatt 3960 acaagtaatc aagggtcatt atgggttagg cattaatgtt tctatctgat tttgtgcaaa 4020 agcttcaaat taaaacagct gcattagaaa aagaggcgct tctcccctcc cctacaccta 4080 aaggtgtatt taaactatct tgtgtgatta acttatttag agatgctgta acttaaaata 4140 ggggatattt aaggtagctt cagctagctt ttaggaaaat cactttgtct aactcagaat 4200 tatttttaaa aagaaatctg gtcttgttag aaaacaaaat tttattttgt gctcatttaa 4260 gtttcaaact tactattttg acagttattt tgataacaat gacactagaa aacttgactc 4320 catttcatca ttgtttctgc atgaatatca tacaaatcag ttagttttta ggtcaagggc 4380 ttactatttc tgggtctttt gctactaagt tcacattaga attagtgcca gaattttagg 4440 aacttcagag atcgtgtatt gagatttctt aaataatgct tcagatatta ttgctttatt 4500 gcttttttgt attggttaaa actgtacatt taaaattgct atgttactat tttctacaat 4560 taatagtttg tctattttaa aataaattag ttgttag 4597 配列番号：２ 配列の長さ：８１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Met Ser Phe Thr Phe Thr Glu Leu Gln Lys Asn Ile Glu Ile Ser Val 1 5 10 15 His Lys Phe Phe Asn Leu Leu Lys Glu Ile Asp Thr Ser Thr Lys Val 20 25 30 Asp Asn Ala Met Ser Arg Leu Leu Lys Lys Tyr Asp Val Leu Phe Ala 35 40 45 Leu Phe Ser Lys Leu Glu Arg Thr Cys Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Gln 50 55 60 Pro Ser Ser Ser Ile Ser Thr Glu Ile Asn Ser Ala Leu Val Leu Lys 65 70 75 80 Val Ser Trp Ile Thr Phe Leu Leu Ala Lys Gly Glu Val Leu Gln Met 85 90 95 Glu Asp Asp Leu Val Ile Ser Phe Gln Leu Met Leu Cys Val Leu Asp 100 105 110 Tyr Phe Ile Lys Leu Ser Pro Pro Met Leu Leu Lys Glu Pro Tyr Lys 115 120 125 Thr Ala Val Ile Pro Ile Asn Gly Ser Pro Arg Thr Pro Arg Arg Gly 130 135 140 Gln Asn Arg Ser Ala Arg Ile Ala Lys Gln Leu Glu Asn Asp Thr Arg 145 150 155 160 Ile Ile Glu Val Leu Cys Lys Glu His Glu Cys Asn Ile Asp Glu Val 165 170 175 Lys Asn Val Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Pro Phe Met Asn Ser Leu Gly 180 185 190 Leu Val Thr Ser Asn Gly Leu Pro Glu Val Glu Asn Leu Ser Lys Arg 195 200 205 Tyr Glu Glu Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asp Leu Asp Ala Arg Leu Phe 210 215 220 Leu Asp His Asp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Ser Ile Asp Ser Phe Glu 225 230 235 240 Thr Gln Arg Thr Pro Arg Lys Ser Asn Leu Asp Glu Glu Val Asn Val 245 250 255 Ile Pro Pro His Thr Pro Val Arg Thr Val Met Asn Thr Ile Gln Gln 260 265 270 Leu Met Met Ile Leu Asn Ser Ala Ser Asp Gln Pro Ser Glu Asn Leu 275 280 285 Ile Ser Tyr Phe Asn Asn Cys Thr Val Asn Pro Lys Glu Ser Ile Leu 290 295 300 Lys Arg Val Lys Asp Ile Gly Tyr Ile Phe Lys Glu Lys Phe Ala Lys 305 310 315 320 Ala Val Gly Gln Gly Cys Val Glu Ile Gly Ser Gln Arg Tyr Lys Leu 325 330 335 Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Arg Val Met Glu Ser Met Leu Lys Ser Glu 340 345 350 Glu Glu Arg Leu Ser Ile Gln Asn Phe Ser Lys Leu Leu Asn Asp Asn 355 360 365 Ile Phe His Met Ser Leu Leu Ala Cys Ala Leu Glu Val Val Met Ala 370 375 380 Thr Tyr Ser Arg Ser Thr Ser Gln Asn Leu Asp Ser Gly Thr Asp Leu 385 390 395 400 Ser Phe Pro Trp Ile Leu Asn Val Leu Asn Leu Lys Ala Phe Asp Phe 405 410 415 Tyr Lys Val Ile Glu Ser Phe Ile Lys Ala Glu Gly Asn Leu Thr Arg 420 425 430 Glu Met Ile Lys His Leu Glu Arg Cys Glu His Arg Ile Met Glu Ser 435 440 445 Leu Ala Trp Leu Ser Asp Ser Pro Leu Phe Asp Leu Ile Lys Gln Ser 450 455 460 Lys Asp Arg Glu Gly Pro Thr Asp His Leu Glu Ser Ala Cys Pro Leu 465 470 475 480 Asn Leu Pro Leu Gln Asn Asn His Thr Ala Ala Asp Met Tyr Leu Ser 485 490 495 Pro Val Arg Ser Pro Lys Lys Lys Gly Ser Thr Thr Arg Val Asn Ser 500 505 510 Thr Ala Asn Ala Glu Thr Gln Ala Thr Ser Ala Phe Gln Thr Gln Lys 515 520 525 Pro Leu Lys Ser Thr Ser Leu Ser Leu Phe Tyr Lys Lys Val Tyr Arg 530 535 540 Leu Ala Tyr Leu Arg Leu Asn Thr Leu Cys Glu Arg Leu Leu Ser Glu 545 550 555 560 His Pro Glu Leu Glu His Ile Ile Trp Thr Leu Phe Gln His Thr Leu 565 570 575 Gln Asn Glu Tyr Glu Leu Met Arg Asp Arg His Leu Asp Gln Ile Met 580 585 590 Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cys Lys Val Lys Asn Ile Asp Leu Lys 595 600 605 Phe Lys Ile Ile Val Thr Ala Tyr Lys Asp Leu Pro His Ala Val Gln 610 615 620 Glu Thr Phe Lys Arg Val Leu Ile Lys Glu Glu Glu Tyr Asp Ser Ile 625 630 635 640 Ile Val Phe Tyr Asn Ser Val Phe Met Gln Arg Leu Lys Thr Asn Ile 645 650 655 Leu Gln Tyr Ala Ser Thr Arg Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ile Pro His 660 665 670 Ile Pro Arg Ser Pro Tyr Lys Phe Pro Ser Ser Pro Leu Arg Ile Pro 675 680 685 Gly Gly Asn Ile Tyr Ile Ser Pro Leu Lys Ser Pro Tyr Lys Ile Ser 690 695 700 Glu Gly Leu Pro Thr Pro Thr Lys Met Thr Pro Arg Ser Arg Ile Leu 705 710 715 720 Val Ser Ile Gly Glu Ser Phe Gly Thr Ser Glu Lys Phe Gln Lys Ile 725 730 735 Asn Gln Met Val Cys Asn Ser Asp Arg Val Leu Lys Arg Ser Ala Glu 740 745 750 Gly Ser Asn Pro Pro Lys Pro Leu Lys Lys Leu Arg Phe Asp Ile Glu 755 760 765 Gly Ser Asp Glu Ala Asp Gly Ser Lys His Leu Pro Gly Glu Ser Lys 770 775 780 Phe Gln Gln Lys Leu Ala Glu Met Thr Ser Thr Arg Thr Arg Met Gln 785 790 795 800 Lys Gln Lys Met Asn Asp Ser Met Asp Thr Ser Asn Lys Glu Glu Lys 805 810 815

【図面の簡単な説明】 【図１】 p7H30.7Rによってプローブされたノーサンブ
ロットからのオートラジオグラムを示す図である。 【図２】 クローンp4.7R における挿入物の制限地図の
概略図である。 【図３】 p4.7R によりプローブされたノーサンブロッ
トのオートラジオグラフィーを示す図である。 【図４】 本発明のベクターp2AR3.8 とp2AR0.9 の概略
図である。 【図５】 誤対合検出技術の概略図である。 【図６】 誤対合検出に使用されたゲルを変性する例の
概略図である。 【図７】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝子
の配列を示す図である。 【図８】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝子
の配列を示す図である。 【図９】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝子
の配列を示す図である。 【図１０】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝
子の配列を示す図である。 【図１１】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝
子の配列を示す図である。 【図１２】 フランキング領域を有する正常なＲｂ遺伝
子の配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｔ 33/574 33/574 Ａ (72)発明者 タデュース・ピー・ドライジャ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02186，ミルトン，フォーブス・ロード 85 (72)発明者 スティーブン・フレンド アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02143，サマーヴィル，スペンサー・ア ベニュー 14 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/574 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．新生物が特定タンパクにおける遺伝的な異常に関与
   するか否かを決定する免疫分析方法であって、 前記特定タンパクが、該特定タンパクの機能的な形態の
   欠損により前記新生物を発生させることを特徴とし、 前記特定タンパクに対し特異的に結合する抗体を、前記
   新生物若しくは前記新生物又は前記新生物に発達し得る
   細胞由来の試験検体と接触させる工程と、 前記抗体と前記特定タンパクとによる免疫複合体の形成
   の程度に基づいて、前記新生物が前記特定タンパクの欠
   損の結果生じているかを判定する工程とを含むことを特
   徴とする免疫分析方法。 ２．前記判定手段において、前記試験検体における免疫
   複合体の形成レベルと前記新生物が生じていない個体由
   来の対照検体における免疫複合体の形成レベルとを比較
   し、 前記比較結果から、前記新生物が前記タンパクの機能的
   な形態の欠損により生じているかが判定されることを特
   徴とする請求項１に記載の免疫分析方法。 ３．前記特定タンパクが網膜芽腫タンパクであることを
   特徴とする請求項１または２に記載の免疫分析方法。 ４．前記網膜芽腫タンパクをコードする遺伝子が、ヒト
   の第１３番染色体の長腕１４帯域に位置し、 前記遺伝子のｃＤＮＡが下記に示す制限酵素地図を有す
   ることを特徴とする請求項３に記載の免疫分析方法。 【化１】５．新生物が腫瘍であることを特徴とする請求項１〜４
   のいずれかに記載の免疫分析方法。 ６．新生物が網膜芽腫または骨肉腫であることを特徴と
   する請求項１〜５のいずれかに記載の免疫分析方法。 ７．前記試験検体が新生物に発達する前に採取され、前
   記新生物に発達する可能性が判定されることを特徴とす
   る請求項１〜６に記載の免疫分析方法。