JPH03504557A - 筋ジストロフィー診断のためのプローブおよびその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 筋ジストロフイー診断のためのプローブおよびその方法光１Ｆと１旦一 本出願は米国特許出願番号第８９０，６９４号の一部継続出願である。

ここに報告されている仕事はＮ、１．Ｈ，基金ＨＤ　１８６５８およびＮ　Ｓ　 ２３７４０を含む米国政府からの基金により保持されている。

政府は本発明にある種の権利を持っている。

本発明は遺伝性疾患の検出および処置に関し、特にデュシエンヌ、ベツカーおよ びアウトリアー筋ジストロフィー（ＭＤ）の種々の方法による検出および診断に 関する。

デュシェンヌ筋ジストロフィー（Ｄ　Ｍ　Ｄ　）はＸ一連鎖劣性遺伝病であり、 約３，３００人の男性の内の１人が冒されている。ＤＭＤに伴われる特徴＜ＤＭ Ｄ表現型）は良く知られており、血清中のクレアチンホスホキナーゼ値の上昇（ 少なくとも正常値の１０倍）、運動筋肉機能の発育遅延、および筋肉サイズの顕 著な変化に付随した筋繊維の脂肪および繊維性組織による置換により特性付けら れる筋肉虚弱などが挙げられる。最近まで、ＤＭＤ家系の保因者の同定は一般的 に、血清中のクレアチンホスホキナーゼの上昇した値を検出することによりなさ れていた。

ベラカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もまたＸ一連鎖劣性遺伝子病であるが、Ｄ ＭＤの頻度の１０％しか起こらない、ＢＭＤは筋ジストロフィーのより良性の型 であり、ＤＭＤより臨床進行は遅い、ＤＭＤおよびＢＭＤの両方ともヒトＸ染色 体短腕のＸｐ２１領域中に位置するＤＭＤ遺伝子の突然変異により引き起こされ る。

アウトリアー筋ジストロフィー（ＯＭ　Ｄ　）は軽度デュシェンヌ／重度ベツカ ー病である。それはＤＭＤに冒された人の約１０パーセントから成る副集団を形 成する。

制限酵素切断片多望は動物集団中のゲノムＤＮＡ配列が変化した場合に現われ、 制限エンドヌクレアーゼで完全に消化すると１つまたはそれ以上の異った大きさ の配列の制限フラグメントの組が生成する。エンドヌクレアーゼにより認識され る部位がＤＮＡ配列中に存在するかしないかにより相異が生じる：配列内に部位 が存在すればエンドヌクレアーゼにより切断され１つの配列を与えるであろうし 、配列中にその部位が存在しなければエンドヌクレアーゼにより切断されないで 他の配列を与えるであろう。

遺伝性疾患と伴う遺伝子の近くに位置しているＲＦＬＰは特定の人が欠陥のある 遺伝子を持つおよびそれ故疾患を持つ見込みを決定するに使用できることが示さ れてきた。Ｂ　ａｋｋｅｒらは、ザランセット、３月２３日、１９８５．６５５ ページにおいて”Ｘ染色体短腕上の−，，１１のＲＦＬＰ−マーカーは、デュシ ェンヌ座位と遺伝子距離で３および２０モルガン単位の間で架橋しているのでＤ ＭＤの診断に有用である。”と記載している。

光ｍ果− 実質的にＭＤ遺伝子に対応し、周囲のゲノムＤＮＡの一部である１４ｋｂのヒト ｅＤＮＡをクローン化した。またマウスの相同座に対応するｃＤＮＡも単離し特 徴づけた。ヒトＭＤ座のポリペプチド生産物であるシストロフィンおよびそのマ ウス相同物（ｓＭＤ＞がＭＤおよびｍＭＤｅＤＮＡの２つの異った領域を含む融 合ポリペプチドに対する抗体を用いて同定された。完全ＭＤｅＤＮＡの一部およ び周囲のゲノムＤＮＡがまたＭＤ突然変異の診断に有用なＸ染色体の短腕のＸｐ ２１領域中のＲＦＬＰの決定に使用された。

失切断点およびＸ、１１（以下に定義）での転座切断点の間のヒトＸ染色体上の ＤＮＡ領域に選択的にハイブリダイズできる実質的に精製された単鎖核酸配列を 持つＭＤプローブを特色とする。

“選択的にハイブリダイズする”とは試料中に遭遇する他の配列へのハイブリダ イゼーションを一般的に妨害するのに充分にストリンジェントな条件下所望の配 列へハイブリダイズすることを意味する。“実質的に精製された”または”実質 的に純粋”とはそれが天然に存在し、本発明に従った検定で作用する環境の他の 要素から充分に分離されている物質を意味する。

好適な実施態様においては、核酸配列はＸ染色体短腕の他の部分とは、即ちＸ　 ｐ２１．３での欠失切断点およびＸ染色体のｐ末端の間のＤＮＡ領域およびＸ； 】１での転座切断点およびＸ染色体の動原体の間のＤＮＡ領域とは選択的にハイ ブリダイズできないや 更なる好適な実施態様においては、ＭＤプローブは６つのｃＤＮＡプローブの仁 君の一つの配列の一部からの少くとも１０塩基対の長さの核酸配列を持ち、それ はヒトＭＤ遺伝子に対応する１４ｋｂｃＤＮＡと一緒につながれ、５７６６６か ら５７６７７までの１２の受入番号で１９８７年７月１５日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ， に供託されている。

各々のプローブは大腸菌中のベクター内へ、精製されたプラスミドの形で供託さ れている。今後、各々のプローブは２つの受入番号で入手可能である。

第二の様相において、本発明はヒトＭＤ遺伝子の少くとも一部と選択的にハイブ リダイズできる実質的にＭ製された単鎖核酸配列を持つＭＤプローブを特色とす る。本明細書で使用するヒトＭＤ遺伝子とは突然変異でＭＤ表現型を生じること ができるＸ染色体短腕上のヒトＤＮＡの一部である。このＤＮＡのエクソンは以 下に議論する１４ｋｂｃＤＮＡ供託物により実質的に示される。このｃＤＮＡの ほとんどの配列が図５に示しである。

本発明はまたＭＤ遺伝伝号のイントロン配列を含むゲノムＤＮＡへ向かうまたは それがら誘導されるプローブも含んでいる。

好適な実施態様においては、核酸７０一ブ配列はＭＤ遺伝伝号のＤＮＡ領域には 選択的にハイブリダイズできない。

本発明のプローブはヒト患者のゲノムＤＮＡ試料の突然変異ＭＤ遺伝子の存在の 分析に使用できる。

第三の様相において、本発明は上に概説したプローブを試料と接触せしめ、これ らのプローブが試料中の核酸とハイブリダイズするかどうかを検出することによ るヒト患者の筋ジストロフィーを診断するための方法を特色とする。

好適な実施態様においては、診断法には一連のプローブが使用され、そこで一連 のものはＭＤ遺伝子を取囲むＭＤ　ＤＮＡまたはＲＮＡの１４ｋｂの配列と組合 わせてつながれている０例えば、本発明に従ったプローブはＭＤ表現型を起こす ＭＤ遺伝伝号の突然変異と密接に会合されたく結合された）ＲＦＬＰを検出する ために使用される。°“密接に会合された”とはＲＦＬＰおよびＭＤ突然変異の 部位の間で起こる遺伝子組換えの見込が非常に低い（５％未満）ことを意味する 。そのようなプローブの利点は、特定のＲＦＬＰ表現型を持つ個人ＤＭＤ歴を持 つ家族内で）がまたＭＤ突然変異を持つであろう可能性を高い確度で予測するの に使用できることである。

第四の様相においては、本発明はＭ　Ｄ　３１！伝子によりコードされている実 質的に純粋な哺乳類のポリペプチド（シストロフィン）を特色とする。このポリ ペプチドはヒトおよびマウスの両方の型を持っている。本発明はまた、シストロ フィンと免疫学的に交差反応をする、またはシストロフィンの１５のアミノ酸配 列と実質的に同じアミノ酸配列を持つ実質的に純粋なポリペプチドも含んでいる 。“ポリペプチド”は大きなポリペプチドおよびタンパク質も含ませるつもりで ある。゛実質的に同一”とはそのような配列中のアミノ酸が等価な側基を持つ他 のアミノ酸に置換されているであろうことを意味する、即ち、保存的な置換は許 容できる。

同一の特定の抗体または特定の抗体の群に結合されるなら、それら二つのポリペ プチドは免疫学的に交差反応性である。交差反応性ポリペプチドの特に有用な型 はシストロフィンと反応する抗体を産生するように動物の免疫性を試験するのに 使用できるようなものである。本発明はまた競合検定に有用なポリペプチドも含 んでいる（即ち、特定の抗体上の結合部位をシストロフィンと競合するポリペプ チド）。

第五の様相においては、本発明はシストロフィンまたはシストロフィンと免疫学 的に交差反応するポリペプチドをコードしている実質的に純粋な核酸を特色とす る。

この核酸の好適な実施態様にはＭＤ遺伝子の核酸配列に対応するｃＤＮＡまたは ＲＮＡの約１４ｋｂ対配列：または４５塩基を越えるそれらの７ラグメントが含 まれている。この核酸はヒトＭＤ遺伝子またはマウス肛回Ａ伝号に対応している 。

第六の様相において、本発明はシストロフィンまたはシストロフィンと免疫学的 に交差反応するポリペプチドに対する抗体を特色とする。

本発明はまた、組織試料（特に筋肉組１！＆）とこれらの抗体の一つと接触せし め抗体−ジストロフィン複合体の存在を検出することからなるＭＤのための免疫 診断法におけるこれらの抗体の使用も含んでいる。複合体は正常な大きさのシス トロフィンの存在を示し、そのような組織に多量にあることは一般的にＭＤがな いことを示している。本発明のこの様相にはＥＬＴＳＡおよびウェスタンプロッ トのごとき免疫診断の多数の周知の方式が含まれている。一つの実３！態様にお いて、この方法は複合体に検出されたシストロフィンまたはそのフラグメントの 分子量（Ｍ、Ｗ、）を正常対照シストロフィンポリペプチドの分子量と比較する ことにより実施する。この方法において、シストロフィンのフラグメントの存在 （即ち、異常な大きさのシストロフィン）または全くシストロフィンが検出でき ないことはＭＤを示している。正常対照はＭＤがない正常個体またはシストロフ ィン相関ＭＤを持たない個体に見い出されるシストロフィンポリペプチドを反復 して分析して確立する。

一般に、正常シストロフィンポリペプチドは約４００，０００ダルトンの大きさ であり、Ｄ　Ｍ　Ｄ　患者では存在しないが検出不能である。しかしながら、Ｂ ＭＤ患者およびＤＭＤと診断された患者の数パーセントは異常な大きさく即ち、 より小さなＭ、Ｗ、フラグメントの形で）のシストロフィンな示した。

好適な実施態様において、この方法は試料抗原性ポリペプチドの分子量とＢＭＤ およびＤＭＤ対照の分子量を比較する付加的工程３特色とする。この方法におい てＤ　Ｍ　Ｄの診断はＤ　Ｍ　Ｄ対照に匹敵するパターンの存在によりなされ、 ＢＭＤの診断はＢＭＤ対照に匹敵するパターンの存在によりなされ、ＭＤでない ことは正常対照に匹敵するパターンにより示される。ＢＭＤおよびＤＭＤ対照は ＢＭＤまたはＤＭＤを持つと診断された患者の筋肉試料中のシストロフィンの反 復検定により確立された。

シストロフィンまたはそのフラグメントの分子量がＭＤの各々の型に対して決定 され、記録され、平均されて対照パターンが創り出された。これらの対照に°° 匹敵する”パターンとはこれらの対照と同一または充分に顕似してＭＤの一つの 型（即ちＢＭＤまたはＤＭＤ）の診断ができるようなパターンである。

本発明はまたベクター内へＭ　Ｄ　３１ｉ伝子に対応するｃＤＮＡまたはそのフ ラグメントを挿入し、これらの遺伝的に変えられた細胞を患者に再導入すること を含むＭＤのための治療法も特色とする。細胞は血流または筋肉組織内へ、筋繊 維の変性の制御および筋ＩＩＩｔ維内の結合組織の増殖の制御に有効量注入する 。

本発明の方法は徴候は示さないがＭＤ遺伝子突然変異を運んでいるヘテロ接合性 個体の検出同様に胎児期のスクリーニングに使用できる。

本発明の他の特色および利点は以下のその好適な実施態様の記載および請求の範 囲から明らかになるであろう。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

最初に図について簡単に記載する。

圀−匡 図１はヒトＸ染色体のｐ末端（ｐｔｅｒ）の標準Ｉ　Ｓ　ＣＮ　（１９８１）イ デオグラムであり、クローン化したＤＮＡフラグメントの大体の位置および特定 の欠失および転座切断点を示しており；図２はヒトＸｐ２１染色体からのクロー ン化ＤＮＡの２２０ｋｂの図式的表現であり、何人かのＤＭＤヒト男性中の欠失 した領域を示しており； 図３は本発明のプローブとして使用されたＭＤ遺伝子の２つの部分のＤＮＡ配列 であり； 図４はクローン化ＤＮＡの２２０ｋｂの図式的表現であり、ヒト染色体ＤＮＡの ライブラリーから単離されたクローン化ＤＮＡの位置および大きさを示しており ； 図５はヒトＭＤ遺伝子に対応する１４ｋｂヌクレオチド配列の１３ｋｂを示し； 図６ＡはＭＤ遺伝子をコードしている１４ｋｂ　ｃＤ　Ｎ　Ａの制限地図であり ： 図６Ｂは完全１４ｋｂｅＤＮＡに組合わされてつながれたｅＤＮＡフラグメント の図式的表現であり； 図７Ａおよび７ＢはヒトおよびマウスＭＤｃＤＮＡの部分的ヌクレオチドおよび 予想されるアミノ酸配列であり：図８はシストロフィンポリペプチドのアミノ酸 配列でありマロ９はＤＭＤ家族から単離されたゲノムＤＮＡのサザンプロット分 析の写真（ｐＥＲＴ８７−８で調べられ）、および各々の家族メンバーの遺伝子 型の模式的表現であり、円は女性を表わし、四角は男性を表わし、黒くした領域 はＭＤ突然変異遺伝子の存在を示している。

図１０は、ＤＮＡ家族家族現型現象研究族Ａに対し）の図解であり、各々の縦の 棒はＸ　ｐ２１−　ｐ２２染色体領域を表わし、各々の文字は異った５型のＤＮ Ａセグメントを表わし：図１１ＡおよびＩＩＢはＤ　Ｍ　Ｄ　、　Ｂ　Ｍ　Ｄお よびＯＭ　Ｄ患者の筋肉試料を含むゲルの免疫染色ウェスタンプロットの写真で ある。

図１２はＢＭＤ患者および正常非−ＭＤ対照者の筋肉試料と含むゲルの免疫染色 ウェスタンプロットの写真である。

図１３はシストロフィン生化学的表現型の分布を示す一組の図表である。

ヒトＭＤプローブおよび 本発明のプローブはＭＤ遺伝子のＤＮＡまたはＭＤ遺伝子の近くのＤＮＡの領域 からのＤＮＡに相同の核酸を含んでいる。

セグメントを含むＤＮＡ領域（それに対してプローブが相同）は以下のごとくで ある。

図１を参照するとヒトＸ染色体短腕（ｐ）の標準（ＩＳＣＮ１９８１）イデオグ ラムに関してヒトＸ染色体の前もってクローン化された領域（Ｄ　２　、ＲＣ８ ，９９，６，７５４，ＯＴＣＣ７、Ｂ２４およびＬ１２８）の大体の位置が示し である。ＤＭＡを含む３つのＸ一連鎖疾患の男性患者（ＢＢ）のＸ−染色体中の ＤＮＡ欠失の領域もまた示されている；欠失はＦ　ｒａｎｃｋｅらによりアメリ カンジャーナルオブヒューマンジェネテイックス３７：２５０（１９８５）に記 載されてはＤＮＡ中の２つの切断点Ｘ　ｐ２１．３およびＸ　ｐ２１　、１によ り決められる。切断点Ｘ　；１１（ｐ、２１．１；ａ１３．５）もまた印が付け られており、それはＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎらによるサイトジェネテイックスアン ドセルジェネティックス２７：２６８（１９８０）に記載されている平衡逆転座 に寄与できる（細胞株はキャムデン、Ｎ、Ｊ、のヒト遺伝子突然変異細胞保管所 から入手可能、細胞株保存同定番号Ｇ　Ｍ　１６９５）　。

Ｘｐ２１．３およびＸ；１１の切断点はＤＭＤ遺伝子の境界を大体決定し、それ はＸｐ２１．２染色体帯領域内にある。より特定的には、ＭＤｉ伝子伝号Ｂ欠失 切断点を越えてｐ末端へ向かい、およびＸ；１１転座切断点を越えて動原体に向 かって両方へ約ｌＸ１０’ｂｐ拡がっている。

以下の記載は本発明に適したプローブおよび核酸の実施例である。これらの実施 例は本発明を制限するものではなく、当業者はそのようなプローブを得る適切な 他の方法を認めるであろう、特に、以下に記載されるプローブは等価なりＮＡま たはＲＮＡを単離するため他の動物の他のライブラリーｔ”Ａべろのにも使用で きる。

１：ＥＲＴ８７−ノム　ローン 本発明のプローブを単離するため、ＭＤ遺伝子領域付近からのＤＮＡのライブラ リーを分画ハイブリダイゼーションと用いてこのＤＮＡを濃縮することにより構 成する。この方法はＫｕｎｋｅｌらにより、Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　８７：４７７８（ １９８５）、に詳細に記載されている。それに従って、男性患者ＢＢから２５０ μｓのＤＮＡが単離され、超音波処理により１，０００塩基対（ｈｐ）の平均の 大きさに切断され、Ｐａ１ｅｅｒらにより、セル３７：１７１　（１９８４）に 記載されている４９．ＸＸＸＸ’ｉ’リンパ球細胞株（Ｇ　Ｍ　１２０２）から の屹匝−１切断ＤＮＡの１．２５μ２とハイブリダイズせしめる。ＤＮＡを１０ ０℃にて５分間加熱し、氷上で冷却し最終反応容量２．５ｙ１の７％フェノール に加える。混合物は間欠的に５日間に渡って３７時時間上うする（Ｋｏｈｎｅら 、バイオケミストリー１６：５３２９（１９７７））。クロロホルム抽出および 透析により塩を除去した後、ハイブリダイズしたＤＮＡをエタノールで沈澱せし める。これらの条件はＢＢ男性の欠失したＤＮＡ領域中に相補配列を持たない４ ９゜ＸＸＸＸＹ　ＤＮＡからの性眩−１フラグメントを自己−ハイブリダイズし 、それ故と１−１７ラグメントとしてクローン化される。沈殿したＤＮＡの５μ ２を０゜１μｓの乱ａｍＨ１−切断、脱リン酸化ｐＢＲ３２２と連結し、大腸菌 株Ｍ　Ｃ１０６１内へ形質転換する。（影ａｖａＨＩ末端は連結の際、染色体Ｄ ＮＡの膨呟−１末端と一致する）３，０００コロニーが単離された。

Ｋｕｎｋｅｌら（上記文献）により記載されているごとく、単離されたコロニー は常法を用いてスクリーニングされ、どれが正常個体からのＤＮＡとハイブリダ イズするが、男性ＢＢからのＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡを含むかを決 定する。一つのクローン、ｐＥＲＴ８７．は正常ヒトＤＮＡの１．１ｋｂ現閃■ フラグメントとハイブリダイズしたがＢＢ　ＤＮＡへはしなかつた。ハイブリダ イゼーションの強度は調べたＤＮＡのＸ染色体含量に依存している。無傷のヒト Ｘ染色体を持つげっ歯頚−ヒトハイブリッド細胞株においてもハイブリダイゼー ションが検出されたが、ヒト染色体領域ＸｐＨ，３からＸｑｔｅｒのみのＤＮＡ を持つ細胞株では検出されなかった。それ故、ｐＥＲＴ８７中のクローン化領域 はＸ染色体短腕（ｐ）上にあるものである。

３つの他のクローンも同様の結果分与えたが各々のクローンは異ったＨｉｎｄｌ ｌｌフラグメントにハイブリダイズする。

ヒトＸ染色体の欠失または転座を持つ種々の細胞株からのＤＮＡとハイブリダイ ズするコロニーの能力を分析する。

ｐＥＲＴ８７はＤＮＡのＸ　ｐ２１−　Ｘ　ｐ２２領域内に位置していた。

ｐＥＲＴ８７の位置はＸ　ｐ２１−　Ｘ　ｔｅｒ領域（細胞株Ｘ：１１を用いて ）および領域ｐ２１−ｐｔｅｒ（Ｘｐ２１．３に切断点を持つ細胞株を用いて、 Ｆ　ｒｙｎｓら、クリニカルフェネティックス２２ニア６（１９８２））とはハ イブリダイズできないことから、および領域Ｘ　ｐ２２−　Ｘ　ｑｔｅｒＣＭａ ｈａｎｄａｓらにより記載されている細胞株を用いて、ＰＮＡＳ７６　：５７７ ９　（１９７９）　）ヘハイブリダイズすることから決定された。

Ｍｏｎａｃｏらにより、ネーチャー現互：８４２（１９８５）　、　ｓ己叙され てし）るごと＜、ｐＥＲＴ８７は５７の血縁ではないＤＭＤ男性のＤＮＡを調べ るのに使用された。ｐＥＲＴ８７は男性の５人からのＤＮＡとはハイブリダイズ せず、ｐＥＲＴ中にクローン化したＤＮＡの周囲にＤＮＡ欠失を持っていなかっ たことを示している。これら５人の男性のＤＭＤ表現型がＭＤ遺遺伝円内欠失の ため生じていると仮定すると、この結果はｐＥＲＴ８７がＭＤ遺遺伝円内ＤＮＡ の領域と相同のＤＮＡを含んでいることの証拠を提供している。

２：ＥＲＴ８７・ ＭＤ領領域らさらにＤＮＡを単離するため、２つのヒトゲノムライブラリーをＭ ｏｎａｃｏ（上記文献）により記載された方法を用い、９ＥＲＴ８７によりスク リーニングした；１つはシャロン３５（Ｌｏｅｎａｎら、ジーン２６：１７１（ １９８３））中に、１つはＥＭＢＬ−３（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら、ジャーナルオ ブモレキュラーバイオロジーυＯ：　８２７　（１９８３）　）中に構築された 。常法により、上記ライブラリーに対するプローブとしてｐＥＲＴ８７を用いて ｐＥＲＴ８７と相同な領域から両方の方向に染色体の“歩行”を実施する。図４ のＷｌおよびＷ　２−　Ｒ？含む５つのバクテリオファージクローンが単離され 、ｐＢＲ３２２中に小さな非反復配列のサブクローン、ｐｕ　Ｃ１８またはブル ースクライブ（ストラータ遺伝子）がｍ築された。これらのサブクローンは制限 地図作りをされ、ヒト反復性要素を含まない小さなフラグメントが同定された。

これらのクローン中のヒト挿入物の一番端の末端に近い非反復配列サブクローン が同じライブラリーの次の歩行工程のためのプローブとして使用される。これら のサブクローンの内の３つ、ｐＥＲＴ８７−１８．−８および−１がゲノムが欠 失した上記５人のＤＭＤ少年に欠けているＤＮＡを含んでいる。これらのサブク ローンを３８ｋｂの領域につなぐ、ＥＭＢＬ−３ライブラリー中の更なる染色体 歩行によりクローン化領域を２２０ｋｂに拡張する（図２および図４に示した） 。これらのクローンはｐＥ　ＲＴ８７７１５．−１４および−２７を含む。

これらのクローン化領域のＭＤＤ伝子に関した位置を決定するため、ＤＭＤまた は関連する疾患でＸ染色体中のＤＮＡに欠失領域を持つ、ベラカー筋ジストロフ ィー（ＢＭＤ）−その遺伝子もまたバンドＸ　ｐ２１内に位置している−に冒さ れた５３人の少年から染色体ＤＮＡが単離された。このＤＮＡは通常のサザンプ ロット分析（下記参照）を用いて、クローン化ＤＮＡに関しての５３人の少年中 のＤＮＡ欠失の切断点を決定するためサブクローンに対し試験された。この事は 最初に図４に示したごとくしてサブクローンを並べ、続いてどのサブクローンが 欠失染色体中に存在するＤＮＡを含み（それ故切断点の外側である）およびどれ が欠失染色体中に存在しないＤＮＡを含む（それ故切断点内のＤＮＡを持つ）か を決定することにより簡単になすことができる。これら２つの型のサブクローン 間に位置し、欠失染色体中に存在するＤＮＡを持つサブクローンは欠失切断点が 存在するＤＮＡを持っていなければならない。一度クローン化ＤＮＡ内の領域に 制限されたら、制限酵素分析を用いて１０〇−１，０ＯＯｂｐ内へ切断点を更に 制限する。これらの実験の結果は図２に要約しである。

図２はｋｂ目盛りでの隣接するヒトゲノムＤＮＡの２２０ｋｂの摸式的図を示し ている。黒くぬったブロックは反復配列の領域を示し、斜線を入れた箱は中程度 に反復した配列を表わし、白い箱は非反復配列を表わしている。これらのブロッ クの下の番号はｐＥＲＴ８７サブクローンを示している。Ｓｉｒ＋ｇｅｔ、セル ２８：４３３（１９８１）により記載されていくごとく、系統配列はＬにより示 されている９図２に示したごとく、クローン化ＤＮＡの左側で切断する１４の欠 失が観察され、動原体へ向って右側の方向へ（矢印参照）拡がっている。反対の 方向へ拡がる９つの欠失が観察された。欠失の大多数は独立した切断点を持って いるが、欠失の単純さは図２に一緒に模式的に示されている。ＤＭＤまたはＢ　 Ｍ　Ｄ表現型を与える欠失切断がｐＥＲＴ８７領域内に起こり両方の方向に拡が っているので、この分析はｐＥＲＴ８７およびサブクローンは明らかにＭ　Ｄ　 ３１！伝子内にあることを示している。

図２のプロフィールはＭＤＤ伝子がＤＮＡの大きなセグメント上に位置している ことを示している。遺伝子中の突然変異により生じる大きな欠失が欠失を持たな い他のＤＭＤの少年に観察されると同様なりＭＤ表表現上なるという事実は、遺 伝子産物が完全に無くなったりまたは異常型であっても類似の臨床像と得ること を示している。Ｍ因となる遺伝子はＸ染色体ＤＮＡの非常に大きなセグメント上 に乗っており、約２，０ＯＯｋｂと推定される（図１）。

図３を参照すると、いくつかのサブクローンのＤＮＡ配列はジデオキシ分析を用 いる常法により法定された。ｐＥＲＴ８７−４（上側の配列）および−２５（下 側の配列）からの代表的配列が示されている。本発明に適したプローブはこれら の配列の任意の部分または以下に記載するＭＤＤ伝子に対応する１４ｋｂ　ｅＤ 　Ｎ　Ａ配列の任意の他の部分から容易に合成できる。そのようなプローブはま た更なる染色体歩行にも使用できる。

大見Ｕ工旦五ノ。

種々のヒト胎児および成人組織からのＲＮＡの標準ノーザン分析は全ＲＮＡまた はｐＥＲＴ８７−２５ヘハイブリダイズする胎児骨格筋のポリＡ−選択ＲＮＡか らの単一＋ｎＲＮＡは１６ｋｂであろうと推定されること分明らかにしな。この 約１６ｋｂ転写体はＭＤ遺伝子の産生物をコードするｍＲＮＡである。通常のハ イブリダイゼーション技術を用いてこのｍ　ＲＮ　Ａおよび本発明のプローブを 単離し、それからｃＤＮＡのライブラリーを調製することが可能である。このｅ 　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー中のクローンは本発明のプローブとしておよび常法に よりヒトゲノムＤＮＡライブラリー中のＭＤ遺伝伝号のイントロンＤＮＡへ向が うおよびＸ；１】およびＸｐ２１．３切断点への染色体歩行による他のクローン の単離に適している。

例えば常法により、ヒト胎児骨格筋からのポリＡ−選択ＲＮＡ試料を用いてファ ージベクターラムダｇｔｌｌ中にオリゴ（、（Ｔ）で満たしたｃＤＮＡライブラ リーが構成される。小さな５′−終結クローンがこのライブラリーから単離され た。同様にＫｏｅｎｉｇらにより、セル５０：５０９−５１７（１９８７）に記 載されているごとき常法を用い、ファージベクターラムダｇｔｌＯ中にヒト胎児 骨格筋ｅＤＮＡライブラリーが構成できる。

そのようなライブラリーは６つのｃＤＮＡ挿入物の単票に使用され、上記５′− 末端プローブにより検出される。６つのすべては推定１００ｂ、間隔内で終結し ていたく５番目に長いものは５゜ｂｐ間隔以内）。この結果は転写体の５′−末 端が多分これらのクローン中に存在していることを示している。これらのブロー ビングからほとんどの３′セグメントクローンを用いて３′方向へ２つの付加的 な“歩行”がなされたが同様にお互い１００ｂｐ以内で終結しており、これらの クローン中に多分転写体の３′末端が存在していることを示している。この結果 のごとく、ヒトＭＤ遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの実際の大きさは 、前に記載した初期の研究で推定された１６ｋｂよりは１４ｋｂ’″Ｃ″あるべ きと知られる。

一度ヒトＭＤ遺伝子転写体の最も５′および最も３′の末端が決定されたら、Ｋ ｏｅｎｉｇらによりセル５０：５０９−５１７（１９８７）に記載されたごとき 常法を用いて１４ｋｂｃＤＮＡ全部が配列決定される。

はとんど完全な配列が図５に記載しである。実際のｅＤＮＡは完全ヒトＭＤ遺伝 子と組合せてつないだＡＴＣＣに供託されている一連のｅＤＮＡから得ることが できる。これらのプローブは１２の受付番号５７６６６から５７６７７で供託さ れており、その順に図６の１４ｋｂＭＤ遺伝子の次に描かれている。

これらのｅＤＮＡクローンは本発明のプローブとしてどのクローンが特に適して いるかを決定するため試験される。常法を用い、クローンをＸ　ｐｚｉ　、３お よびＸ；１１突然変異を持つ細胞株およびヒト細胞株からの蹟ＲＮ　Ａとハイブ リダイズさせる。適したプローブはＸｐ２１．３−　Ｘ　；１１領域内または＋ ｌｌＲＮＡ内からのＤＮＡと相同なものである。図１を参照すると、適したプロ ーブは正常ヒト細胞株に相同性を持つが、そのＤＮＡの少くとも非転座ＤＮＡと 相同性と持っていないであろう。更なる試験はクローンがＸｐ２１．２染色体バ ンドにハイブリダイズするがどうか決定する細胞学的研究を伴い、従って適切で ろう。

ｍ凡に凡α１肚 本発明のプローブはＤＭＤ表現型を起こす突然変異ＭＤ遺伝子と密接に結合して いるＲＦＬＰの検出に有用である。そのようなＲＦＬＰの検出は突然変異ＭＤ遺 伝子の保因者である女性および突然変異ＭＤ遺伝子を持つ未出生の子供の両方の 於断を可能にする９ ５：　ＥＲＴ８７＝導　乏」ＪＬしｘ−常法を用い、２４の異った制限酵素で切 断されている４人の血縁のない女性からの固定化ＤＮＡ試料を含むニトロセルロ ースフィルターにハイブリダイズさせるせしめることによりｐＥＲＴ８７−８お よびｐＥＲＴ８７−１５のヒトＤＮＡ　　ＲＦＬＰを検出する能力が試験される 。ヒト集団中に観察されるＲＦＬＰの頻度は３７人の血縁のない人から得られた ＤＮＡを試すことにより推定された。調査の結果は下記の表１に示されている。

７つの潜在的多望制限酵素部位が観察された制限フラグメントのパターンにおけ る個々の変異として同定された６２つのサブクローン。

ｐＥＲＴ８７−１およびｐＥＲＴ８７−８の各々が２つの異った酵素の推定ＲＦ 　Ｌ　Ｐを検出し、一方、一つのプローブｐＥＲＴ８７−１５が３つの異った酵 素のＲＦＬＰを検出した。

表１ ２、ｐＥＲＴ８７−Ｉ　　　　ＢｓｔＮｌ　　　３．１．　　２．５１０．６　 ０．６３　０．３７３、　　　　Ｘｍｎ１　８．７７．５　０．６６０．３４４ 、ｐＥＲＴ８７−８　　ＢｓｔＸＩ　　４．４．２．２　０．６０．４５、　　 　　ＴａｑＴ　２．７／１．１　３．８　０．７１０．２９６、ｐＥＲＴ８７− １５　　８ａｍ旧７．１／２．３　　９．４　　　　０．６２　０．３８７、　 　　　Ｔａｑｌ　　３．１　３．３　０．６７０．３３８、　　　　Ｘｍｎ１１ ．６／１．２２．８　０．６８０．３２寧普通の対立遺伝子 次の工程はＤ　Ｍ　Ｄ表現型と結びつけるためのＲＦＬＰクローンのスクリーニ ングである。もし、家系内でＤＭＤ表現型を与える突然変異ＭＤ遺伝子を含んで いるＤＮＡｐ持つ人が、突然変異ＭＤ遺伝子を含まないＤＮＡを持つ家系内の人 の多型分布と異った多型分型を持つなら、特定の家系（家族）内でＲＦＬＰがＭ Ｄ遺伝子に結合される。ＲＦＬＰスクリーニングは突然変異ＭＤ遺伝子が隠れて いることが知られている家系上で実施される。

最初の工程は患者からＤＮＡを得ることである。以下に記載する方法においては 末梢血血液が使用される；他の可能なりＮＡ源は羊水、絨毛膜の絨毛および胎児 栄黄芽層である。

常法を用い、Ａ　Ｉｄｒｉｄｇｅらにより、アメリカンジャーナルオブヒューマ ンジエネテイツクス３６：５４６（１９８４）に記載されたごとく全血白血球の 細胞核からゲノムＤＮＡが単離される。このる。

そのような結合の例は図９に示されている。例においてはいく人かが突然変異し たＭＤ遺伝子を持っている（黒くした記号で指示）家族内の個々からＤＮＡが単 離され、ＤＮＡをＢｓｔＸ　１で切断し、ｐＥＲＴ８７−８で調べた。電気泳動 、プロッティングおよびハイブリダイゼーションは前に記載したごとくである。

ゲノムＤＮＡのＢｓｔＸＩ消化により、ＲＦＬＰのための女性へテロ接合子中の ４．４および２．２ｋｂ　ＢｓｔＸ　ＩフラグメントへｐＥＲＴ８７−８がハイ ブリダイズする。保因者母は４．４／２．２ｋｂＢｓｔＸＩ対立遺伝子のへテロ 接合性パターンを示し、彼女の２人の保因者の娘も同様であった（レーン２．４ ）。より低い対立遺伝子（２，２ｋｂ）は両方の影響を受けたＤＭＤの息子（レ ーン５，６）に存在したが一方より高い対立遺伝子は（４，４ｋｂ）は影響を受 けていない息子（レーン３）にのみ存在した。この家族の父は４．４ｋｂのＢｓ ｔＸｌハイブリダイゼーションフラグメントを持っていた（データは示されてい ない）。レーン２および４の女性の個人は上昇しているＣＰＫ値に基づくとＤＭ Ｄ特性の保因者であると疑われた。フラグメントの大きさは２２ｐ−末端一標識 旦１ｎｄｌｌ−切断入ファージＤＮＡと比較することにより計算された。すなわ ち、突然変異ＭＤ遺伝子はこの家族においてはＢｓｔＸ　ＩＲＦＬＰに結合され ており、２．２ｋｂフラグメントを持つ個人はまた突然変異ＭＤ３１ｉ伝子を持 っている。

表１にリストした各々のＲ’ＦＬＰおよび欠陥ＭＤ遺伝伝号の結合はすべての家 系では起こらない。従って、プローブの組合せ（ＲＦＬＰの大多数の検出）が個 々のＤＮＡを調べる場合好適に使用される０表１のライン２．３，５．６および ７にリストしたＲＦＬＰと適当なプローブの組合せて調べることが、突然変異Ｍ Ｄ遺伝子を持つことが知られている人がいる家系２８のうち２５（８９％）で情 報を与えることが観察された。本発明のプローブはＭＤ遺伝伝号の欠失（１００ ｂｐｓを越えて）のＤＭＤ表現型を持たないヒトの前徴候的スクリーニングのた めの使用が可能であった。

６：ｃＤＮＡプローブを　　して ＲＦＬＡ　ＤＮＡマーカー研究は通常は有用であるが、家族構成員が利用できな いであろうため、しばしば不可能であり、結論を下せず、新規突然変異は信頼し て検出できず、遺伝子内の減数分裂的交差がしばしば起こり、遺伝形質パターン （Ｘ一連鎖対掌染色体）は散発性の場合確実に決定することができない。

本発明の完全遺伝子ｅＤＮＡプローブによる分子欠失の検出はこれらの困難さの ほとんどを除去している。例えば受付番号５７６６６から５７６７７でＡＴＣＣ に供託された本発明のプローブは以下に記載するごとく非常に有用な診断手段で ある。

患者の核ＤＮＡを血液白血球、リンパ芽球細胞株および絨毛膜絨毛から単離し、 制限エンドヌクレアーゼで切断し、ハイボンド（アマ−ジャム）フィルターに移 し、オリゴ−標識プローブと常法によりハイブリダイズせしめる。５′から３′ 方向で完全ＭＤ遺伝子をおおうｃＤＮＡセグメントをＭ１３ベクターブルースク ライブまたはブルースクリプト（ストラータ遺伝子）中にクローン化しプローブ として使用する。例えば、図６はＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

に供託されたプローブを示している。プローブ１−２ａおよび２ｂ−３は最も５ ′の２．６ｋｂ乱吐■−１阻Ｒ１フラグメントを含んでいる。プローブ４−５ａ は１．８ｋｂフラグメントであり、プローブ５ｂ−７は２．６ｋｂ挿入物を持っ ている。プローブ８は０．９ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントである。プローブ９− １４は３′エクソンおよび３′非翻訳領域を含む６．１ｋｂフラグメントである 。

ｃＤＮＡに沿った無作為分布においてはＭＤ遺伝伝号の欠失は起きないが、少数 のプローブのみでは大きなパーセントで欠失が検出できる。血縁でない５３人の ＤＭＤ少年の総数で１０４のＤＮＡ試料ではＭＤ遺伝子の一部の欠失を示した。

診断目的のためには、プローブ８で２７の欠失が検出され、プローブ１−２８で １５の他の欠失が検出された。これらの２つのプローブは欠失のおよそ８０％を 検出する（５３の内４２）。

特に興味をそそることは観察された多数の欠失切断点が１０−ブ５ｂ−７と定義 された単一イントロン内に源を発することである。このプローブ中に含まれるエ クソンで定義された１つのイントロンは１９の欠失切断点を示した（観察された ５３の全欠失の３６％）、明らかにこの特別なイントロンは欠失発生を開始する 性質を告げる特性を含んでいる。多切断は配列−特異的再配置ホットスポットま たはこのイントロンでつながれる異常に大きなゲノム距離のためであろう。

以下の価格−効率の良いＤＭＤ／ＢＭＤ家族のＤＮＡ診断戦略はこれらの結果に 基づいている。最初に、病気に冒された個人、その母、真性保因者および正常男 性および女性対照からのＤＮＡを１ｉＩＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、電気 泳動して、容易に再ハイブリダイズできるナイロン膜上にプロットする。これら のフィルターは最初にプローブ８でハイブリダイズし、Ｘ−線フィルムに曝露し 、順にプローブ１−２８および２に−３で再ハイブリダイズする。欠失が検出さ れなかったら次に１０−プ５ｂ−７および４−５ａを使用し、最終的にはプロー ブ９−１４を使用する。類似の大きさのフラグメントは共−移動し、オートラジ オグラム上で単一のバンドのごとく思われるので２つの異った制限酵素の使用を 助言する。もし共−移動フラグメントのただ１つが欠失されてもそのような欠失 は見逃されるであろう。

この方法により病気に冒された男性の５０％で、および女性保因である。この直 接的方法は、すべての家族の少くとも半分の間接的連関試験の必要性を除き、半 および異種接合性の明瞭な診断を得る。完全ＭＤｅＤＮＡを用いるＭＤの危険の ある家族の日常分析は必要とされる価格および労力を劇的に減少させ、他の診断 法の正確さを非常に高める。

もし欠失が観察されなかったら、前に記載したＤＮＡ多型現象研究を行う、これ らは密接に連結された側面を接した１０−ブまたは上に論議したごとき遺伝子内 マーカー同様に遺伝子の５′および３′末端近くのセグメントが含まれている必 要がある。

以下はｃＤＮＡプローブの使用の例である。家族Ａ（図１０）は普通の臨床状況 を示している。即ちただ１人の男性がＤＭＤに冒されている（ＩＩＩ　−１）、 彼の母１（ＩＴ−２）の保因者状態は未知であり、なぜなら彼女のクレアチンキ ナーゼ値は彼女の母ＩＩ５！（１−２）同様に正常範囲であるからである。彼女 の男の胎児（Ｉ［［−２）には危険性があった。現在の胎児（Ｉ［ｌ−２）が彼 の病気の兄弟が持っているのと同一のｘ−２１領域を相続したかどうかを決定す るためＤＮＡ多型現象研究を実施した０図１０に示した個々の１８の異ったプロ ーブで検出される２１ＤＮＡ多型現象が試験され、そのいくつかはＭＤ座に隣接 し、いくつかは続いて遺伝子自身から誘導されているのが示された。これらのプ ローブでは欠失は見い出されなかった。単相型分析により病気の男性（■−１） は彼のＸｐ２１染色体領域を彼のおじいさん（１−１）から受取っており、明ら かな乗換えなく伝達されていたことが明らかにされた。それ故彼のおばあさん＜ １−２）は保因者であり得ないが、彼のおかあさん（ＩＴ　−２）の保因者状態 はいぜん未知である。彼女または彼女の冒された息子（Ｉｌｌ−１＞の両方とも 新しい突然変異を示すこともできる。ＤＮＡ−マーカーの結果に基づくと、胎児 （Ｉ［１−２）が冒されている危険性は本来の推定の２０％より高いと考えられ た。潜在的に冒されていない胎児の流産を防ぐため、病気に冒されている男性中 の分子的欠陥の検出のための本発明の完全遺伝子ｅＤＮＡプローブの有用性が評 価された。

ｅＤＮＡ研究のため、病気の男性（［１−１）、彼の母親（ＩＩ−２）および彼 の病気に冒されていない母方のおばあさん（，１−１）（彼女からＸ　ｐ２１領 域は誘導される）を含む対照中に失われたまたは異常な大きさの制限フラグメン トが存在しないか全遺伝子が調査された。ゲノムＤＮＡ試料は１力＋ｄｌｌおよ び１吐■で切断され、図６に例示したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、既 知の方法により分析された。ＣＶＳ物質（Ｉ［１−２）から直接抽出されたＤＮ ＡはＨｉｒ＋ＪＩＩ［およびＭＩＩで消化し、家族（１−１゜１１−２．Ｉ［１ −１）、血縁のない男性対照（Ｃ，Ｍｌ−Ｍ５）および正常女性対照（Ｆ）から のＤＮＡと一緒に分析された。

母親（Ｉｔ−２＞は明らかに彼女の息子（Ｉ［ｌ−１）に欠失しているすべての ７ラグメントに対して同型接合性である。２つの隣接するｅＤＮＡのセグメント で検出された欠失は病気に冒されたれ故、胎児の”危険性”は９９％またはそれ 以上の確率で病気に冒されていないと法定された。

マウスＭＤプローブお　び 前記のヒトｅＤＮＡがマウス組織論ＲＮＡのノーザンプロット分析にプローブと して使用された。ヒトｃＤＮＡは１４ｋｂマウスｍＲＮＡ種を検出し、それはマ ウス新生児足および妊娠（１５日）子宮および胎盤を合わせたものの組織抽出物 には非常に低値であったが新生児心臓、おとなの心臓およびおとなの骨格筋では より高い値であった。

これらの研究においては、Ｃｈｉ＋ｇｗｉｎ、　Ｊ　、Ｍ　、らにより、バイオ ゲミストリー］１：５２９４（１９７９）に記載されているごとく、凍結、摩砕 した組織をグアニジウムチオシアナート中でホモゲナイズし、Ｃｓαクッション を通してベレット化することによりマウス組織からＲＮＡを単離した。

マウスＭ　Ｄ　’ＩＩ伝子伝号表するｃＤＮＡを得るため、Ｇｕｂｌｅｒ。

Ｕ、らによりジーン２５：２６３（１９８３）に記載され、Ｈｏｆｆ＋ｅａｎ、 Ｅ、Ｐ。

らにより、サイエンス翻旦：３４７−３５０．ｎ、　１２（１９８７）で改良さ れたごとく成熟マウス心臓からｅＤＮＡライブラリーを構築し、ヒトＭＤ遺伝子 に対応するｅＤＮＡのプローブでスクリーニングする。常法を用い５ｘｌＯ’の 第１次（非増幅）入ｇｔｌＯ組換え体から７つのマウスｃＤＮＡクローンを得た 。

ヒトおよびマウスｃＤＮＡライブラリーの両方において得られたＭＤクローンの 頻度が小さいことはＭＤメツセンジャーＲＮ　Ａ　（＠ＲＮ　Ａ　）が稀であり 、多分筋肉中−ＲＮＡの約０．０１から０．００２％であろう。この相対的存在 比はノーザンプロット分析と一致し、組換え体ＤＭＤクローンのこの頻度は我々 の実験室で構成された４つの他のマウスおよびヒトｃＤＮＡライブラリーからも 得られた。

マウスｅＤＮＡのフラグメントはＨｏｆｆｍａｎらによる、サイエンス２３８： ３４７−３５０（１９８７）に記載されているごとき標準的方法を用い、マウス ゲノムＤＮＡのサザンプロットのためのプローブとして使用される。完全−ＲＮ Ａの１４ｋｂの大きさを考えて、およびゲノムＤＮＡへのｃＤＮＡの一定比を仮 定すると、完全マウスＭＤゲノム座は多分ゲノムＤＮＡの５００ｋｂ以上を含ん でいるであろう、すなわち、上に記載したＸ一連鎖ヒトＭＤｃＤＮＡのハイブリ ダイゼーション特性はまたマウスにおいてもあてはまる。

第１の約４．３ｋｂマウスＭＤｅＤＮＡのＤＮＡ配列が決定され（図７Ａおよび ７Ｂ）、ヒトｃＤＮＡ配列と比較された。４．３ｋｂの全ヌクレオチド配列は全 ＤＭＤｍＲＮＡの３０％近くを示している。

マウスおよびヒトｃＤＮＡの５′末端からの配列の種間比較（図７＆）は最初の ２００ｂｐに複数の挿入／欠失相違および３つの読み枠内に翻訳停止コドンがあ るが８０％は相同であることを示している。さらに、最初の翻訳開始コドンはヒ トおよびマウスで保存されている。

ＤＮＡおよびアミノ酸配列の両方が良く保存されており、ＤＮＡでは８８％の相 同性およびアミノ酸配列では８７％の相同性を示した。マウスおよびヒトアミノ 酸配列のヒドロパシシティプロフィールに特に著しい保存があり、ヒドロパシシ ティはほとんど同一であった。これらのプロフィールはＫｙｔｅらによる、ジャ ーナルオブモレキュラーバイオロジー、１５７：１０５（１９８２）に従って決 定された０本当にヒドロバシシティ値に基づいた保存的アミノ酸置換によるとマ ウスおよびヒトポリペプチドは９５％以上相同となる。

゛　ジス　ロフィンお　　　のツー　メン１４ｋｂヒトまたはマウスＭＤ遺伝子 のためのｃＤＮＡおよび予想アミノ酸配列は組換え体シストロフィン（相当する 筋ジストロフイー遺伝子にちなんで名付けられている）の産生に使用することが できる。シストロフィンのアミノ酸配列は図８に示されている。

例えば、ＭＤｅＤＮＡは適当なベクターに挿入され細胞に導入され、シストロフ ィン産生のためＤＮＡの転写および翻訳が誘導される。同様に、全ｅＤＮＡの一 部のみを用いより小さなフラグメントが産生されるであろう、筋原細胞は適した 発現系である。Ｙａｓｉｎらによるジャーナルオブニューロロジカルサイエンス ３２：３４７−３６０（１９７７）に記載されているごとくして培養され、常法 により筒管形成が誘導される。他の系としては大腸菌、酵母および培養哺乳類細 胞のごとき細菌が含まれる。そのような系においてはシストロフィンは分泌され るかもしれないしされないかもしれず、任意のいくつかの標準的プロモーターま たはターミネータ−と結合されるであろう、シストロフィンはまたシストロフィ ンをコードしている＋ｍＲＮＡの試験管内翻訳によっても産生される。また合成 的にも産生されるであろう。

前記の実施例は本発明を制限しようとするものではなく、いかにしてシストロフ ィンおよびそのフラグメントが産生されるかについての単なる示唆である。

本発明は変更されているが実質的に本明細書で定義されたｃＤＮＡおよびポリペ プチド配列に対応するｅＤ　Ｎ　Ａ　、粕ＲＮ　Ａおよびポリペプチド配列を包 含している。保存的ヌクレオチドまたはアミンｉ！！置換を除いて同一である場 合核酸またはポリペプチド配列は他の与えられた配列に実質的に対応する。

４ニジストロフイン　ムボリベブ　ド 上に記載した４、３ｋｂ（３０％）の−ＭＤ遺伝子のためのＤＮＡおよびアミノ 酸配列は融合ポリペプチドおよび実質的に精製されたマウスシストロフィンの産 生に使用される。

発現ベクターｐＡ　Ｔ　Ｈ２（Ｄ　１ｅｃｋｓａｎｎら、ジャーナルオブバの異 った領域が融合された。この２つの領域は前に記載し、図７Ｂに示したマウス心 臓ｃＤＮＡ配列の大部公示している。−回の構成により約３０ＫＤのｍＭＤシス トロフィンが３３ｋｂ　ｔｒ且Ｅポリペプチドと融合し、一方第二の融合で大体 ６０ＫＤのｍＭＤポリペプチドに融合した。ニＥポリペプチドは不溶性であるの で、誘導融合ポリペプチドの定量的収率は細胞を溶菌し、不溶性ポリペプチドを 沈殿せしめることにより得られる。期待される大きさの新規不溶性融合ポリペプ チドが産生されるがそれはｐＡＴＨ２ベクターのみを含む細菌の溶菌物には存在 しない。

ＬｚＥ　＋　６０　Ｋ　Ｄ融合物を産生ずるには、マウスＭＤｅＤＮＡを独得の ｂす部位で制限分解し、クレノーで平滑端とし、３′ポリリンカー中Ｈｉｎｄ［ ｌで消化する。切り出された１　、４ｋｂのｅＤＮＡフラグメントはゲルにて精 製し、旦μｄおよびＨｉｎｄ■で前もって消化しであるｐＡＴＨ２に連結される ０組換え体はコロニーハイブリダイゼーションにより同定し、続いてのプラスミ ドＤＮＡ制限分析により実証する。得られたプラスミド構築物は虹旦Ｅポリペプ チド（３３ＫＤ）を和ＭＤポリペプチドの４１０アミノ酸（〜６０ＫＤ）に融合 し、等価なヒトｃＤＮＡ地図上の１．３ｋｂから２．７ｋｂの位置に対応する。

ＬｚＥ　＋　３０　Ｋ　Ｄ融合物を産生ずるにはほとんど３′末端のマウスｅＤ ＮＡをその独特の非−メチル化Ｘｂａ１部位、およびＢａｍ８１部位で３′ポリ リンカー中で制限分解する。切り出された７００ｂ、フラグメントをｐＡＴＨ２ に連結し、前に記載したごと＜ＸｂａｌおよびＢａｍＨｌで消化する。このプラ スミド構築物はぜ且Ｅポリペプチドを―ＤＭＤポリペプチドの２６８のアミノ酸 （〜３０ＫＤ）に融合し、等価なヒトｅＤＮＡ地図上の３．７ｋｂから４．４ｋ ｂの位置に対応する。

シストロフィンまｔ・は　のフラグメントに　　る常法により前記の組換え体シ ストロフィンまたはそのフラグメントに対する抗体を高めることができる。さら に天然に存在するシストロフィンもまた使用してもよい。以下はそのような方法 の例示でありこの発明を制限するものではない。

前記の融合ポリペプチドの両方とも分収用５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により（Ｌａｅｍｍｌｉ、ネーチャー２２７：６８０−６８５（１９７０） ）精製され、ウサギおよびヒツジを免疫するのに使用される。ウサギは電気泳動 で溶出した゛自然の’（ＳＤＳを含まない）不溶性抗原で免疫されるが一部ヒツ ジは変性抗原を含む５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル切片で免疫する。

各々のウサギで産生された抗体の力価および特異性は不溶性施される酵素−結合 免疫−検定により常にモニターされる。最高の免疫応答はｍＥ＋３０ＫＤポリペ プチドを用いて得られ、産生された抗体の〉９５％は融合ペプチドのｍＤＭＤ部 分に特異的に対するものであり、免疫後４週の粗血清の１　：１０００希釈液を 用いてもＥＬＩＳＡ検定系の感度を越える力価であった。

虹且Ｅ＋６０ＫＤ抗原はウサギにおいての免疫応答を喚起するのにより長時間（ １２週）を要し、得られた血清は融合ポリペプチドのＭＤ部に対し低い特異性し か示さなかった。

抗血清により同定されるポリペプチド種が、融合ポリペプチドのＭＤ部分に対す る抗体特異性による認識のためであることを確かめるため、３０ＫＤ抗原に対し て向かうウサギおよびヒツジ抗体および６０ＫＤ抗原に対して向かうヒツジ抗体 をアフイニティにより精製した。融合ポリペプチドのＭＤ部分に対して向かう抗 体のアフイニテイ精製（ＡＰ）は部分的に精製した融合ポリペプチドの不溶性に より容易になされる。一般に、免疫血清中の粗不溶性虹且Ｅポリペプチド分画を 単に再懸濁するだけでＵ且Ｅポリペプチドに対する抗体が除去される。ＭＤポリ ペプチドに特異的な抗体は次に融合ポリペプチドと結合せしめることにより単離 される。これらの抗体は５０μ２筋組織中のわずか１０１Ｆのシストロフィンを 検出できる。

例えば、約３りの屓且Ｅポリペプチドの一部精製不溶分画を沈殿せしめ、１０ｍ Ｍトリス（ｐＨ８，０）に再懸濁し、再び沈殿せしめる。ベレットを１．５ｍｌ の免疫血清に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートし、続いて肋旦Ｅ−抗体免 疫複合体をベレットにするため遠心分離し、それは捨てる。上澄み液を前記のご とく洗浄しである約３ｍｇの一部精製融合ポリペプチド（不溶分画）と混合する 。氷上でのインキュベーション後輪ＤＭＤ−抗体免疫複合体を遠心分離して沈殿 せしめる。ベレットを５００μｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２，３）に再懸濁し 、免疫複合体を解離せしめるため氷上で５分間インキュベートし、４℃にて遠心 分離して不溶性抗原を沈殿せしめる。上澄み液は精製された抗−ＭＤイムノグロ ブリンを含み、それは５０μｌのトリス（ｐＨ９，５）で中和され、両方ともＢ ＳＡ（分画Ｖ　、　５　ｗｇ／　Ｉｌ）で安定化するかまたはリン酸緩衝化塩溶 液（ＰＢＳ）に対して何回も透析する。

本発明はまたシストロフィンまたはそのフラグメントに対するモノクローナル抗 体の産生も企図している。そのようなモノクローナル抗体は常法により産生され るハイブリドーマにより分汐・される。

、然シストロフィン 天然に存在するシストロフィンが前記抗体を用いて同定できる０例えば、１０倍 容量のゲル充填緩衝液（１００ｍＭ　）リスｐＨ８，０゜１０％ＳＤＳ、１９＋ ｓＭＥＤＴＡ、５ｋＭＤＴＴ）に組織を直接溶解化させることによりマウス（新 鮮）およびヒト（凍結）組織から全ポリペプチド試料を単離する。もしくは、ワ ーリングブレンダーの全速を用いて０．２５％トリトンＸ−１００中でホモゲナ イズし、不溶性ポリペプチドをベレット化することによりヒトおよびマウス組織 からトリトンＸ−１００不溶性分画を単離する。全ポリペプチド試料（５０μｇ ）を３．０％積層ゲルを用い、３．５％から１２．５％傾斜５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル（Ｌａｅａｎｌｉ、ネーチャー■ヱ：６８０−６８５（１９７０） ）上で電気泳動を行って分離し、ニトロセルロースに移す（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｐ 　Ｎ　Ａ　Ｓ　Ｕ　Ｓ　Ａ　７６：４３５０−４３５４（１９７９））。

分割したポリペプチドの同一のニトロセルロースプロットを３０ＫＤ抗原に対し 向かうアフィニティ精製ウサギ抗体、６０ＫＤ抗原に対して向かうアフィニティ 精製ヒツジ抗体および３０ＫＤ抗原に対し向かうアフィニティ精製ヒツジ抗体（ 各々１　：１０００に希釈しである）とインキュベートする。免疫複合体は１２ ５■−ポリペプチドＡまたはロバ抗−ヒツジＩｇＧ第２抗体と共役したアルカリ ホスファターゼ（ヒツジＴｇＧはポリペプチドＡにわずかしか結合しない）を用 いて検出される。すべての抗体は全部で約４００ＫＤと計算される大きな分子量 の、明らかに存在割合が少ないポリペプチド種を検出した。アルカリ　ホスファ ターゼ染色の高分解能でこのポリペプチドが二重線または三重線に分割されるが 現在まで別に分割されたＭＤｍＲＮＡのイソ型の証拠は何もないのでわずかに小 さなバンドは分解産物を示しているらしい。この４００ＫＤ種は心臓および骨格 筋で観察されたよりも著しく低い値ではあるがマウス平滑筋（胃）中でも明らか に立証された。同一の明らかなポリペプチド種は非常に低い値ではあるがマウス 脳中でも検出可能である。

本発明の抗体により認識される４００ＫＤポリペプチド種は一般的にトリトン− 不溶性であり、骨格筋または平滑筋中よりも心筋の筋原繊維マトリックス分画と より強く会合しているようである。４００ＫＤポリペプチド種は正常およびエエ マウス両方の骨格および心筋に存在している。検出されるポリペプチドは抗血清 の混合物でも各々別々の抗血清で行うのでも同一のように思われ、異った抗原に 対して高められた抗体は同一のポリペプチドを認識していることを示唆している 。両方の抗体とも１五突然変異の両方の対立遺伝子がひそんでいるマウスから単 離された筋組織中の４００ＫＤポリペプチドの検出に失敗した。

免１飢逝− 前記の抗体は生物試料中のシストロフィンまたはそのフラグメントの存在を試験 する種々の免疫学的応用に使用できる。例えば、抗体はラジオイムノアッセイに 使用するために常法により１２Ｓ１％５Ｓ、または３Ｈで標識でき、蛍光検定の ためにはフルオレセインで、酵素免疫検定のためには酵素で、ビオチン−アビジ ン結合検定のためにはビオチンで標識できる。

これらの抗体は望まれるごとく標識してまたは未標識のまシ使用でき、二重抗体 または°゛サンドイツチ検定同様に競合免疫検定にも使用できる。モノクローナ ル抗体もまたシストロフィンとの交差反応性についてポリペプチドを試験する標 準的技術において使用できる。

抗体はまた不溶性樹脂のごとき不溶性相上に固定化することができる。シストロ フィンレベルは不溶性相に結合した量を測定することにより検出される。他の不 溶性相にはラテックス粒子が含まれ、それは新規抗体で被覆され試料中のシスト ロフィンがあるレベルになった場合凝集するであろう。さらに他の不溶性相には 試験管、バイアル、力価検定ウェル等が含まれ、それらに対し本発明に従った抗 体が結合でき、それに結合したシストロフィン“抗原”は二重抗体技術またはタ ンパク質Ａ依存技術により検出される。これらの抗体はまた前に記載したごとく アフィニティ精製によるシストロフィンの精製にも有用である。

特に、本発明に従った抗体はＭＤの免疫於断に使用できる。

さらに、これらの新規抗体はベツカ−ＭＤ（ＢＭＤ）、デュシエンヌＭ　Ｄ　（ Ｄ　Ｍ　Ｄ　”）　、アウトリアー”Ｍ　Ｄ　（ＯＭＤ＞および他の神経筋疾患 間を区別するのに使用できる０例えば、患者の筋肉生検が調製でき、本発明に従 って試験され、高度の正確さで患者がＤＭＤ、ＢＭＤ、ＯＭＤを持っているかＭ Ｄを持っていないかが決定される。

満）を−２０℃にて固い表面上で乳棒およぎプラスチック圧迫ボートを使用して 非常に薄い組織のシートへ押しつぶす。組織断片は４℃で秤量し、直ちに２０容 量の充填緩衝液（１０％ＳＤＳ。

５０ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　、１０ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、０．１Ｍ　）リスｐＨ ８，０，０，００１％ブロモフェノールブルー）中に置き激しく振とうする。試 料は使用するまで４℃で貯蔵する。

試料を煮沸水浴中に２分間置き、遠心分離して５ＤＳ−不溶性ポリペプチドを除 去する。上澄み液（１−２μｌ：５０μ２）を２゜ウェル、０．８ｔｉＸ　１５ ｃ＊Ｘ　１７ｃｙＳ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅ＋＊ｍ１ｉ、ネ ーチャー、荏ヱ：６８０−６８５（１９７０））に充填し、３％（０，１％ビス アクリルアミド）積層ゲルおよび３．５％−１２，５％傾斜溶離ゲルを用いる。

分画したポリペプチドはニトロセルロース（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈら、Ｐ　Ｎ　Ａ、 　Ｓ７６：４３５０−５４（１９７９））に移し、前記アフィニティ精製ヒツジ 抗−マウスシストロフィンとインキュベートする。シストロフィン／抗−ジスト ロフィン免疫複合体はアルカリホスファターゼ（シグマ）と共役したアフィニテ ィ精製ロバ抗−ヒツジＴｇＧ第２抗体を用い、続いての発色により検出する。転 移の効率を決定するため転移後すべてのゲルをコオマジーブルーで染色する。

転移後のコオマジーブルー染色ゲル中の残留ミオシンは生検中に含まれていた筋 肉組織の量の対照として働く、筋肉ポリペプチドのこの残留ミオシン定量法の正 確さはシストロフィン染色完了後のアルファーアクチン免疫染色により、または カルスゲストリン免疫染色により実証された。

７：　・、　　誇 １０３の筋肉生検からの試料が分析された。すべての試料について前記ＭＤ遺伝 子のポリペプチド産生物、シストロフィン、の存在割合および見掛けの大きさが 記録された。

種々の神経筋疾患患者からの１０３の筋肉生検中に含まれるシストロフィンの存 在割合および見掛けの分子量が正常対照と相対的に決定された（実施例は［２１ １１に示しである）、前もってデュシェンヌと診断された患者から得られた生検 は劇的なシストロフィンレベルの減少（図１１ａ、レーン１．２．９−１６；図 １７ｂ、レーン３　、８　、９．１２，１４．１６）を正常対照（図１１ａ、レ ーン１７；図１１ｂレーン１，５．１７）と比較すると示した。一方、前もって デュシエンヌまたはベラカーに関連しない神経筋疾患で苦しんでいると診断され たほとんどの患者は正常と区別できないシストロフィンレベルを示した（図１１ ｂ、レーン６．７）。ベラカー生検試着はより変化しうるシストロフィン表現型 を示したく図１１ａ、レーン３゜５．６．；図１１ｂ、レーン２．４．１０．１ １）、いくつかのベラカー生検は明らかにより小さな分子量のシストロフィンを ほとんど正常の存在割合で含んでいた（図１１８．レーン５．６）、図１１ｂ、 レーン２に示した１つのベラカーは大きさはより大きいが正常の約４０％に減少 した存在割合でシストロフィンを持っているようである。

他のベラカーは正常と区別できないシストロフィン表現型を示しく図１１ｂ、レ ーン４）、一方、別のベラカーはその生検中に検出可能なシストロフィンを含ん でいない（図１１８．レーン３）。

シストロフィンの大きさの変異はしばしば微妙であり、そのため、問題にしてい る試料が正常対照の直ぐ隣で展開されなかったら大きさの相違を明白に決定する のは困難である（２つのベラカー生検図１１ｂレーン１０．１１参照）、この理 由のため、上記分析により検出可能なシストロフィンを含むと決定されたすべて の試料は正常対照に隣接させて再試験した。この分析の例が図１２に示されてい る。３つのベラカー生検はシストロフィンを含むことが示され、それは正常対照 （レーン１，３．５）のものより明らかにより小さい（レーン２．６）かまたは より大きかった（レーン４）。

記載された実験方法が本研究に含まれる１０３の生検の各々に対して報告された 。シストロフィン分子量（正常対異常な大きさ）、および正常対照試料と比較し た存在割合が各々の患者の生検に対して計算された。すべての患者のシストロフ ィンデータを説明する５つのシストロフィン“表現型”が確立され、それは疾患 の型および重篤層に相関しているように思われた。これらのシストロフィン表現 型は°正常°（正常の大きさ、正常存在割合の６０−１００％）から゛重篤゛（ 正常の存在割合の３％未満）の範囲である。各々４つの臨床カテゴリー（デュシ エンヌ、アウトリアー、ベラカー、非−ＤＭＤ／ＢＭＤ）に属する患者の数およ びパーセントを５つのシストロフィン表現型群についての表にした（表２）。

前にデュシェンヌまたはベラカー筋ジストロフィーと関係しない疾病を持つと診 断されている患者の９５パーセント（３８／４０）が完全に正常なシストロフィ ン表現型を示した。一方、前にデュシェンヌ／ベツカージストロフィーを持つと 診断されている思考の９２％（５８７６３）が明らかに異常なシストロフィン表 現呈示した。異常シストロフィン表現型を示しているデュシエンヌ／ベッカー個 人内では臨床的表現型の重篤さおよびシストロフィン表現型の“重篤層”間には 明らかな相関があった（図１３．ローマ数字は表２のカテゴリーに対応している ）。この分析から、デュシェンヌ型患者の大部分ではシストロフィンは検出不可 能なレベルであり、アウトリアー（軽度デュシエンヌ／重度ベツカー；２人の病 気の女性も含む）は正常の大きさで低レベルを示し、一方はとんどのベラカーは 異状な大きさのシストロフィンがほぼ正常のレベルであることを示している。

その臨床表現型が明らかにシストロフィン表現型と相関しない患者がいる（表２ ７ステリスク）、これらの患者は研究された全患者の７．７％であった（８／１ ０３）。

ｌ　　１０３人の患者生検についてのシストロフィン分析の結果臨床診断 シストロフィンデータ ６Ｇ−１００Ｓ　レベル ■、異常な大きさ　　　　　　１（１４，３Ｓ）　　１２（６６，６ｇ）　　　 ２（５，０Ｓ）４０−１００Ｚ　レベル 総計　　３８　　７　　１８　　４０ 浪」１ シストロフィンまたは生物学的に機能するそのフラグメントはまたＭＤの治療の 方法に使用できる。生物学的に機能するポリペプチドフラグメントは正常の完全 ポリペプチドのごとく同じ生物学的効果を起こすことができる。治療の方法は筋 繊維退化および筋ｍｕ内の結合組織増殖の制御に有効量のシストロフィンまたは 生物学的に機能するそのフラグメントを投与することを含む。

前記のごとくシストロフィンおよび関連ポリペプチドは日常の方法により投与で きる０例えば血清の最終濃度が１および５００ｙｙ／＊ｆの間になるように動物 またはヒト患者の血流または筋肉へ直接注射できる。このレベルを保つためこの 用量を反復する。

治療の更なる方法はＭＤ患者から筋肉細胞のごとき細胞を除きそれらにＭＤ　Ｄ ＮＡを取り込ませることを含む０本発明の１４ｋｂｅＤＮＡまたはそのフラグメ ントに適当なプロモーターを結合し適当なベクター内へ挿入する。ベクターは次 に患者から採った細胞内へ導入し遺伝子的に操作した細胞はシストロフィンポリ ペプチドまたは生物学的に機能するそのフラグメントを産生するように誘導する 。これらの細胞は例えば血管内または筋肉内で患者に再導入する。

罷−４ 図５に示した完全１４ｋｂ　ｃＤ　Ｎ　Ａ配列は図６ａに示した６つのｃＤＮＡ プローブの形で供託されている。これら６つのプローブはＡＴＣＣへ受付番号５ ７６６６から５７６７７で寄託されている。寄託は１９８７年７月１５日になさ れた。各々のプローブは精製されたプラスミドおよび大腸菌中のプラスミドのご とくして供託されている。従って各々のプローブは２つの受付番号を持って〜） る。

出願人の譲受人であるチルドレンズメディカルセンターコーポレーションはこの 文書で特許発行された特許の存続期間の満了までは、培養物分譲の最後の請求後 ５年又は３０年間のうちの長い方の期間これらの培養物を置き換えるその責任、 およびそのような特許の発行を寄託機関に知らせるその責任を認め、その時点で 寄託物は一最にも入手可能になることは変更できないようになるであろう。その 時までは寄託物を３７ＣＦ　Ｒセクション１．１４およびセクション１１２の条 件下、特許庁長官は入手することができる。

他の実施態様は以下の請求の範囲に含まれる。

τ’：　Ｃ：Ｇ７Ｃ”：ＴＡＧ７ＧＡＡＧＴｃ′：ｃ、ｔｉＴ−ＡＴ　Ｔ”：： ：ＣＡＡＴＧＴＧＡＴ？ＡＡＡＡτＴＣλ７；５ＴＴＡ”Ｘf：ＣＡＣＣ ＧＣＡＧＴＧλ入τλλＧ入入ＴＴτλＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＴ ＣＡＴλＡＴＣ：ＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴτＣＧλＡτ入τττ丁： Ｃ丁τＧＧＧλττＧτ丁入τＣ″ｒＧＡＧ入λλＴＧＴＧＧτ入τττＣλτ τ：０：：τλＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣ＆ＡＧＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＴＴ ＡＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＡＣＡＧ？ＣＣＴ？ＧＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＧＴＣ ＡＴＣＴＴＴＧＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＧ入ＧＡＡ ＡＡＡＧＣ７ＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧ　入入入λＣＧＴττ：τ丁ＡＴＴ入ＴＴ ＣＴＴτττττ入ＡτＧＣτ入λＧＧλＡＡττλττＡＧＧ入Ｇ入λ入フフ ロλ入Ｃ：ττＧλＧフＴＣ八ττＧへ入ＡＧλＡλＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧτ ＡＧλλＴ入τ：：：入ＴＯλＧＴＣＴＧτＡＧこλＧ入Ｇλλλ：λλλフＦ ＩＧ、　３ 寸 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５　（４の２） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５　（４の３） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５　（４の４） 浄書（内容に変更ない ＦＩＧ、　７Ａ−１ ＦＩＧ、７Ａ−２ Ｇ入入Ｇτ入入λＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＣ入ＡＡＣＡＧＣＴＴＴ入Ｇ入Ａ Ｇλ入ＧＴＡＴＴλＴＣＧＴＧＧＣＴ丁ＣＴＴＴＣＴＥＶＮＬＤＲＹＱＴＡＬＥ ＥＶＬＳＷＬＬＳＦＩＧ、７Ａ−３ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、７Ｂ−２ ＦＩＧ、７Ｂ−３ ＦＩＧ、７Ｂ−４ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、７Ｂ−５ ＫＳＬＨＬｒＱＥＳＬＥＦ ＦＩＧ、　８ ４．４ｋｂ−→−−−− ２３ｂ→−一一一− 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１１Ａ ＦＩＧ、　１１Ｂ ＦＩＧ、Ｉ２ 国際調査報告 １＋＋ｓ〜＋ｍ＋ａ１Ａａｌ＋ｌ＠’ｅ５、。ＰＣＴ／ｕｓ　８Ｂ１０４５０４ 自Ｍ・４１１＋＋ＩＮＩＭＩＡｅ崗ｓ＋ｎ＊ｍｐ（Ｔ／υＳ８８１０４５０４国 際′ｙ４査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．　ヒトＸ染色体上のＸｐ２１．３での欠失切断点およびＸ；１１での転座切 断点間のＤＮＡ領域へ選択的にハイブリダイズできる実質的に精製された単鎖核 酸配列を含むＭＤプローブ。 ２．　５７６６６から５７６７７までの１２の受託番号の下にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ． に供託されているｃＤＮＡプローブから成る群から選択されるｃＤＮＡプローブ の配列の一部からの少くとも１０塩基の長さの核酸配列を含む請求の範囲第１項 記載のＭＤプローブ。 ３．　前記核酸配列が前記Ｘ染色体のＸｐ２１．３での欠失切断点とｐ末端との 間、および前記Ｘ染色体のＸ；１１での転座切断点と動原体との間のヒトＤＮＡ 領域とは選択的にハイブリダイズできない請求の範囲第１項記載のＭＤプローブ 。 ４．少くともＭＤ遺伝子の一部と選択的にハイブリダイズできる実質的に精製さ れた単鎖核酸配列を含むＭＤプローブ。 ５．前記核酸配列が前記ＭＤ遺伝子の外側領域とは選択的にハイブリダイズでヨ ない請求の範囲第４項載のＭＤプローブ。 ６．前記プローブ配列がジストロフィンをコードしているヒト遺伝子の少くとも 一部とハイブリダイズできる請求の範囲１−５記載のうちの１つのＭＤプローブ 。 ７．請求の範囲１から５項の任意の１つのプローブを患者から取った試料にさら し、前記試料中の核酸へ前記プローブがハイブリダイズするかどうかを検出する ことを特徴とするヒト患者中のＭＤを診断する方法。 ８．前記患者からゲノムＤＮＡの試料を得、前記ＤＮＡを１つまたはそれ以上の 制限エンドヌクレアーゼで消化し、 前記ＤＮＡを変性し、 前記変性および消化したＤＮＡをヒトＭＤ遺伝子からの少くとも１５塩基の核酸 配列を含むプローブと接触せしめ、ハイブリッドＤＮＡ複合体を検出し、および 前記複合体の分子量をＭＤの病気でない人から取ったゲノムＤＮＡを同様に変性 および消化して形成した対照複合体と比較し、 それによりＤＭＤ遺伝子中の欠矢突然変異の存在または不在が決定される工程を 更に特徴とする請求の範囲７項記載の方法。 ９．前記プローブが、一緒になって前記ヒトＭＤ遺伝子にまたがる１つまたはそ れ以上のプローブを含む請求の範囲８項記載の方法。 １０．前記プローブが５７６６６から５７６７７までの１２の受託番号下で、Ａ ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されているものから選択される請求の範囲第９項記載の方 法。 １１．実質的に純粋なジストロフィンポリペプチド。 １２．前記ジストロフィンがヒトジストロフィンである請求の範囲第１１項記載 のポリペプチド。 １３．前記ジストロフィンがネズミジストロフィンである請求の範囲第１１項記 載のポリペプチド。 １４．少くともジストロフィンの６つのアミノ酸残基の配列を含む実質的に純粋 なポリペプチド。 １５．ジストロフィンと免疫学的に交差反応する実質的に純粋なポリペプチド。 １６．ジストロフィンまたは免疫学的にジストロフィンと交差反応するポリペプ チドをコードする実質的に精製されている核酸。 １７．ＭＤ遺伝子または少くとも１８塩基対の長さのそのセグメ　ントに対応す る遺伝子工学による核酸配列から合成されるポリペプチド。 １８．ジストロフィンをコードしているｃＤＮＡまたは少くとも１０塩基対の長 さの前記ｃＤＮＡの配列を含むＤＮＡ。 １９．ＭＤ遺伝子ｃＤＮＡの約１４ｋｂ対配列を含む実質的に精製された核酸。 ２０．前記ＭＤ遺伝子がヒトＭＤ遺伝子である請求の範囲１９項記載の核酸。 ２１．前記ＭＤ遺伝子が不ズミＤｍｄ遺伝子である請求の範囲第１９項記載の核 酸。 ２２．請求の範囲１１から１５または１７の任意の１つのポリペプチドにより産 生される抗体。 ２３．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２２項記載の抗体。 ２４．ヒトのＭＤの免疫診断のための方法であって、前記ヒトからの試料を請求 の範囲第２２または２３項記載の抗体と接触せしめ、および 前記試料中の抗体およびジストロフィンまたはそのフラグメントとの複合体の存 在を検出する工程を特徴とする上記方法。 ２５．前記試料が筋肉粗織を含む請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６．前記複合体中の前記ジストロフィンまたはそのフラグメントの分子量を決 定し、 それによりジストロフィンの欠除または異常分子量のジストロフィンの存在がＭ Ｄを指示する工程をさらに特徴とする請求の範囲第２４項記載の方法。 ２７．前記複合体中の前記ジストロフィンまたはそのフラグメントの存在割合を 決定し、 それにより、検出不可能または異常に低いレベルのジストロフィンの存在がＭＤ を指示する工程をさらに特徴とする請求の範囲第２４項記載の方法。 ２８．前記試料からの前記複合体中のジストロフィンまたはそのフラグメントの 前記分子量をＢＭＤ、ＤＭＤまたはＯＭＤ対照および正常ジストロフィンを含む 正常対照の少くとも１つにおいて前記抗体と交差反応性のポリペプチドの分子量 を比較し、それにより前記方法が前記ＤＭＤ対照に匹敵する分子量のポリペプチ ドが前記試料中に存在することからＤＭＤの診断、前記ＢＭＤ対照に匹敵する分 子量のポリペプチドが前記試料中に存在することからＢＭＤの診断、および前記 正常対照に匹敵する分子量のポリペプチドが前記試料中に存在することからＭＤ ではない診断を提供する工程をさらに特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法 。 ２９．前記組織試料中の前記抗体と反応性の多数のフラグメントの分子量を決定 して試料分子量パターンを得、該パターンを前記ＢＭＤ、ＤＭＤおよび前記正常 コントロールパターンと比較し、 それにより前記方法は、ＤＭＤ対照パターンに匹敵するパターンの存在によりＤ ＭＤの診断を、ＢＭＤ対照パターンに匹敵するパターンの存在によりＢＭＤの診 断を、および前記正常対照に匹敵するパターンの存在によりＭＤではないことの 診断を提供する工程をさらに特徴とする請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．前記試料がヒトの成人から得られる請求の範囲第２４から２９項の任意の １つに記載の方法。 ３１．筋繊維退化および筋繊維内の結合組織の増殖を制御するのに有効量の請求 の範囲第１１から１５または１７の任意の１つに記載されているポリペプチドを 投与することからなるＭＤの治療の方法。 ３２．ＭＤ患者から細胞を得、 ジストロフィンまたはそのフラグメントをコードしている核酸をベクター内へ挿 入し、 前記ベクターを前記細胞に導入し、および前記患者内の筋繊維の退化および筋繊 維内の結合組織の増殖を制御するのに充分量のジストロフィンを産生するのに有 効量の前記細胞を前記患者に再導入する工程を特徴とするＭＤの治療の方法。 ３３．ジストロフィンまたはそのフラグメントを精製する方法であって； 前記ジストロフィンに特異的な抗体を提供し、前記抗体を固相に結合し、 前記固相を、前記ジストロフィンが前記固相に結合する条件下で前記ジストロフ ィンを含む溶液と接触させ、および前記固相を、前記結合ジストロフィンが前記 固相から放出される条件下で洗浄する工程を特徴とする上記方法。 ３４．ジストロフィンまたはそのフラグメントを産生する方法であって； 前記ジストロフィンまたは前記フラグメントをコードしている核酸を提供し、 前記核酸を細胞内へ導入し、および 前記核酸の発現を誘導するのに適した条件下で前記細胞を培養して前記ジストロ フィンを産生する工程を特徴とする上記方法。 ３５．ヒト患者のゲノム核酸の試料の突然変異したＭＤ遺伝子の存在を検定する 方法であって； 前記試料のＤＮＡを変性し、および１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアー ゼで前記ＤＮＡを消化し、前記変性および消化されたＤＮＡを請求の範囲第１か ら６項記載の任意の１つに記載のプローブと接触させ、および前記試料中の前記 ＭＤ遺伝子の存在の可能性の指標としてのハイブリッドＤＮＡ複合体を検出する 工程を特徴とする上記方法。 ６．前記核酸が融合ポリペプチドをコードしており、前記ジストロフィンまたは 前記フラグメントが第２のポリペプチドへ結合されているペプチドを持つポリペ プチドとして産生される請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７．前記第２のポリペプチドが大腸菌ポリペアチドの一部を含み、および前記 のジストロフィンフラグメントが３０ＫＤおよび６０ＫＤの間の分子量を持つ請 求の範囲第３６項記載の方法。 ３８．ポリペプチドに特異的な抗体の精製方法であって、次の工程からなる方法 ： 前記ポリペプチドを不溶性の形で提供し、前記ポリペプチドを前記抗体と接触さ せて免疫複合体を形成させ、 前記複合体を洗浄し、および 前記複合体からの前記抗体の放出を起こさせる。 ３９．前記ポリペプチドが不溶性ペプチドへ融合されている請求の範囲第３８項 記載の方法。 ４０．前記試料中のＤＮＡが基質に固定され、および標識プローブにさらされて いる請求の範囲第７項記載の方法。