JPH05502367A - 悪性高熱病の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性高熱病の診断法 技術分野 本発明は、動物の悪性高熱疾患、悪性高熱に関連した遺伝子のクローニングおよ び特徴付け、及び、悪性高熱に対し感受性の高い個体の検出法に関するものであ る。

背景技術 悪性高熱病は、主として人間の疾患であり、吸入麻酔薬に対する反応として最初 に認められたが、ある種の動物、特にブタにおいても極めて一般的な疾患である ことが知られている。したがって、ブタにおける悪性高熱疾患を検出するための 適切な検定法の開発、ならびに、手術室における生命の危険を回避するため、人 間の検査に適用できる適切な診断法の提供に特に大きな関心がもたれている。

悪性高熱病は、ハロタン等の吸入麻酔薬およびサクシニルコリン等のある種の骨 格筋弛緩薬によって起こる代謝光進症候群（悪性反応）の先天的疾患素因である 。悪性高熱による主要な障害は、筋収縮の原因となる筋細胞繊維質カルシウムの 持続的な増加、Ｎ２０およびＣＯ２の生成ならびに発熱をともなった解糖作用の 増加、および０２消耗量の増加である。その他の症状（悪性高熱病の命名根拠と なった高熱を含む）は、筋収縮および解糖作用の増加による直接的な影響である と考えられている［ＳＬｅｗａｒｄ、　Ｄ、　Ｊ　及びＯ’　Ｃｏｎｎｏｒ、Ｇ 、八、Ｒ１”　Ｍａｌ　ｉｇｎａｎＬ　Ｉｌｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ−Ｔｈｅ　 Ａｃｕｔｅ　Ｃｒ１Ｓｉｓ”　、１ｎＢｒｉｔｔ　Ｂ、＾１編社１」」」Ｌ１２ 旦」　Ｈｅｒｔｈｅｒｍｉａ、　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏ ｆｆ、（＋９８７）］。

本病は、通常、発病の危険性を有する個人が手術時の投与薬物に対し致命的な反 応を示す危険性を有することを認識していないため、人間における重大な健康上 の問題である９本病の発現頻度は、投与薬物によって異なる。ハロタンをサクシ ニルコリンと併用した場合１本病の最高推定発現頻度は、１７４２００である［ ：Ｏｒｄｉｎｇ、　）１．、Ａｎｅｓｔｈ　ＡｉＬＬｊＬＬ６４ニア００−７０ ４．（１９８５）］、本病を誘発する遺伝子を有していても、その多くは発病要 因となる薬物に暴露するとは限らず、そのため当該遺伝子を有するか否か明らか でないことから、実際の遺伝子保有者数はさらに多いものと考えられる。さらに 、ハロタン−サクシニルコリン麻酔誘発後の咀咽筋痙彎の発現頻度は、１　／２ ００である。そのうちの５０％は高熱病生検陽性を示し、したがって、当該形質 の実際の発現頻度はかなり高いと考えられている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ− ＋及びＦｌｅＬｃｈｅｒ、Ｊ、Ｅ、、八ｎＣ５ｔｈ、＾−！ＩＬＬＬＩＬ、６５ ：１６１−１６４．（＋９８６）］、数例の家族を対象として、別の遺伝様式が 報告されているが、多くの場合本病は常染色体優性遺伝を示すことが認められて いる［Ｋａｌｏｖ、Ｗ、、　”　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　％盃土工且旦 ３」」　）Ｉ　ｅｒＬｈｅｒｎｉａ−Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｄ　Ｄａｔａ“′、計已ｔ、８、＾３編肋工邸且肛」追上シュ加■工」ユ（１ ９８７）］本病のモニタ一体制が改善され、またそれに対する関心が高まり、さ らに１９７５年にダントロレン治療が確立したため、その後の北アメリカにおけ る高熱病による死亡率は、１９６０年代における８４％から約７％に低下した［ 　Ｂｒ１ｊ、Ｌ、Ｂ、Ａ、、　”Ｐｒｅｆａｃｅ＾１ＩｉｓＬｏｒｙ　ｏｆ　Ｍ ａｌｉｇｎａｎｔ　Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ　”　、Ｂｒ已Ｌ　Ｂ、４１編４ ｕユニ凹■」肋＝ｔｈｅｒｍユａＢｏｓｔｏｎ、ＭａｒＬｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏ ｆｆ、（１９８７）］。

高熱病反応の初期指標は呼気中の炭酸ガス濃度の顕著な増加であり、また、追跡 調査の結果認められた限りでは、ダントロレンナトリウム（ダントリウム）を用 いた迅速な治療が可能となり、全身的な危険を回避することが可能と思われる１ 世界の多くの国々では。

高熱病による致死率が依然容認できないほど高い（例えば、英国では２４％）、 死亡原因は、劇症悪性高熱の単一症状または複合症状によると思われる。高熱病 反応として骨格筋、平滑（不随意）筋及び心筋に影響がみられる。血管平滑筋の 収縮は高血圧の原因となり、そのため酸素の組織内供給量が低下し、深呼吸が進 行する。症状が進行するにつれて、特に心不全の発現時に、肺水腫が発現すると 思われる。心不全は、心筋の硬化及び血液中のカリウム濃度の上昇によって誘発 される。一旦、体温の上４が始まると、その上昇は極めて急速で（５分間で１℃ ）、最終的に、４６℃に達することが報告されている。

生存者でも、膜障害によりミオグロブリンが血液中に混入すると、腎不全が起こ る。生存者の一部は意識の回復がみられず、また極端な高熱ならびに電解質バラ ンスの喪失による中枢神経系の障害（例えば、麻痺、失明、難聴、知能障害及び 言語障害）がみられる場合もある［Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｄ、Ｊ、及びＯ’　Ｃｏｎ ｎｅｒ、Ｇ、Ａ、Ｒ，、同上、　（１９８７）］。

悪性高熱病を発症する恐れがある人を検出できる精度の高い臨床試験法が望まれ ている。現在、そのための最も優れた検査法は診断薬を用いた筋生検である。

木試峡はＫａｌｏｗらによって報告され［”　Ｍｅｔａｂｏ　ｌ　ｉｃ　ｅｒｒ ｏｒ　ｏｒ　ｍｕｓｃｌｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓＩ！ａｆｔｅｒ　ｒｅｃｏｖｅ ｒｙ　ｆｒｏｍ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ”　、Ｌａｎ ｃｅｔ、２：８９５−８９８．（１９７０）］、カフェインまたはハロタンの単 用、またはそれらの併用による悪性高熱発症筋の異常収縮反応を利用するもので ある０本法は患者にとってかなり苛酷な試験であり、１０〜１５ｇの大腿筋を必 要とする。その上、試験に時間がかかり、精度も高いとはいえない、試験の再現 性が低いため、最初の検査の結果では陽性であっても、２回目の検査では陰性の 結果が得られることもある。また場合によっては、検査結果に重複がみられるこ ともあり、陽性と陰性の判定が不可能なこともある。そのため各検査機関におい て対照値及び診断の゛切り捨て′点を確立する必要性があるため、悪性高熱病の 感受性を検査する検査機関を新規に開設する二とが困難である。さらに、一般大 衆を対象として、非麻酔下でスクリーニングする場合、このような苛酷な手法は 不適当である。したがって、悪性高熱病の危険性がある人を検出するために、Ｄ ＮＡに基づく診断法は極めて有用である。

ブタはハロタン感受性が高いため、悪性高熱病のモデルとして優れている。ブタ における臨床症状は人間における臨床症状と極めてよく似た経過を示し１人間の 場合と同様にダントロレン　ナトリウムの早期投与により症状の進行停止または 完全な回復が可能である、しかし２　ブタの場合過剰検査またはストレスにより 誘発される症状群が現れる場合もある０通常、過剰検査はブタの飼育にとって大 きな問題ではない、しかし、ストレスは、特に出荷または屠殺前にみられるよう に、大きな問題である。悪性高熱病に感受性の高いブタの死亡または肉の汚染に よる養豚業界の損失は１年間数１０万ドルに達する。

ブタにおける悪性高熱病は劣性遺伝とされているが、筋生検検査の結果［Ｂｒ１ Ｌｔ、Ｂ、Ａ、ら”Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　）ｌｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ−ｐａｔ ｔｅｒｎ　ｏｆ　１ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　５ｗ１ｎｅ”　、＾１ｄｒｅ ｔｅ、Ｊ、人９編、第２回国際悪性高熱病シンポジウム、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、 （１９７８）］、異種接合型ブタでも軽度な影響がみもれ、同種接合型Ｍ　Ｈ／ 　Ｍ　Ｈブタでは重度な発症が認められているので、相互優性遺伝であろうと考 えられる。

ハロタン感受性に関与する遺伝子は、その他の遺伝学的マーカー、例えばＳ　（ Ａ−０赤血球抗原の表現に関与するＳ座）、Ｐｈ１（グルコース　ホスフェート イソメラーゼ）、Ｈ（血液群抗体をコード化するＨ座）　、　Ｒｏ２　（ボスト アルブミン−２）及びＰｇＤ（６−ホスフォ−グルコネート脱水素酵素）等を有 するブタに分離する［＾ｒｃｈｉｂａｌｄ、Ａ、Ｌ、及びＩｎ１ａｈ、Ｐ、、＾ ｎｉｍａｌ　Ｂｌｏ。

ｄ　Ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｎｅｔ、、１６：２５３−２ ６３．（１９８５）１．したがって、これらの遺伝子はブタにおける同一染色体 にリンクしているものと思われる。動物界では遺伝的にリンクした群がしばしば 保存されており、上記の遺伝子マーカーのうち三つ（Ｐｈｉ、Ｐｏ２及びＨ）に 相当するものがヒトの染色体１９地図に認められている［Ｓｈｏｗ。

Ｄ、及びＥｉｂｅｒｇ、Ｈ，、Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅ ｅ　ｆｏｒ　ｃｈｒ。

ｍｏｓｏｍｅｓ１７．１８．ａｎｄ１９．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＩＩＬａｐｐｉｎ ｇ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ、、ｖｏｌ　４６．ｎｏｓ、１ ４　、（＋９８７）］ため、ヒトにおける悪性高熱病遺伝子は染色体１９上のこ の遺転子クラスターに存在しているものと考えられる。また、Ｈ遺伝子アナログ は１９Ｑに、Ｐｈｉ遺伝子アナログ（ＧＰＩ）は１９ｑの１９ｑ１２−１９ｑ１ ３バンドにマツプすることから、悪性高熱病遺伝子は染色体１９の長腕（ｑ）に 存在している可能性もある（　Ｓｈｏｗ及びＥ＋ｂｅｒｇ＋同上）。

最近、密接にリンクした遺伝子マーカーを用い、家族内で遺伝的疾病遺伝子を追 跡することが可能となった。最も一般的に用いられている染色体側のマーカーは 、調査対象者の一部では一対の染色体上に存在しく＋）、また別の調査対象者で は一対の染色体の同じ位置に存在していない（−）と考えられる制限酵素の解裂 部位である。それでも個人によっては、上記の染色体の両方をそれぞれ１本ずつ 有する異種接合型（＋／−）であると考えられる［ｔｌｏｔｓＬｅｉｎ、Ａ、ら 、　ＡｌＴｈ、Ｊ、）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、　３２：３＋４−３３１．（１９８ ０）］、（＋）染色体は調査対象者の血液細胞（またはその他の細胞）からＤＮ Ａを抽出し、解裂部位が゛′多形性パ（すなわち、解裂するか、またはしないか ）である制限酵素で処理し、ＤＮＡフラグメントを大きさによって分画すること によって、（−）染色体と区別することができる。解裂部位を有さない染色体に 由来するＤＮＡは、解裂部位を有する染色体に由来するＤＮＡに比較して大きい ことを利用して、解裂部位の有無を検査することができる。制限フラグメント長 多形成性（以下ＲＦＬＰと称する）は遺伝子マーカーを構成し、家族内における 多形性染色体部位の追跡に利用することができる。ＲＦＬＰマーカーを用いて家 族内で追跡（分離）することのできる遺伝的疾病はいずれも当該マーカーにリン クし、すなわち共有する染色体上の当該マーカーの近くにマツプする。

発明の概要 本発明は、ヒト　リアノジン　レセプター及び同等の機能をコード化する高度に 精製したＤＮＡに関するものであり、以下の点を特徴とする。

１　）　５０３２個のアミノ酸を有し、分子量が約５６３，０００ダルトンの蛋 白質をコード化するＤＮＡ。

２）約１５．３ｋｂの長さを有するＤＮＡ。

３）ヒト染色体１９から単離したＤＮＡ。

また、プロセスの側面によると、高度に精製したＣＤＮＡは第２図に示した位置 １から５０３２のアミノ酸をコード化する配列を有する。

また、本発明の別の側面によると、ＤＮＡプローブはヒト　リアノジン　レセプ ターをコード化するＤＮＡフラグメントを含む。

さらに、本発明の別の側面によると、ＲＦＬＰ分析にＤＮＡプローブを用いるこ とにより、検体が悪性高熱病に感受性を有するか否かを検査することができるま た、本発明の別の側面によると、高度（二精製したリアノジン　レセプター蛋白 はその他のヒト蛋白を含まない、当該蛋白は、約５６３．０００ダルトンの分子 量を有し、第２図に示したアミノ酸配列を有する。

また、本発明の別の側面によると、ヒト　リアノジン　レセプター蛋白の蛋白フ ラグメントに特異的で、かつ高度に精製した抗体を開示した。当該抗体は、ポリ クロナール抗体でも、またモノクロナール抗体でもよく１人間または動物の悪性 高熱病に対する感受性を検査するためのアミノ酸分析に使用することができる図 面の簡単な説明 本発明の具体例を以下の図面で説明する。

第１図に制限エンドヌクレアーザ地図及びヒト　１ノアノジン　レセプター（） ＩＲＲ）の配列順序の模式図を示す。

第２図にヒト　リアノジン　レセプターのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのヌクレオチド配列（ 上段）及び推定アミノ酸配列（下段）を示す、精製したレセプター蛋白から決定 したペプチド配列に相当するものを１本の下線で示した。

リン酸化が考えられる部位は２本の下線で示した。

第３図は、ヒト染色体１９上における）ＩＲＲ遺伝子の位置を確認するためにヒ ト−げつ歯類雑種体細胞を用いて行ったサザン法による雑種形成である。

第４図はヒト染色体１９とにおけるＨＲＲ遺伝子の位置をさらに確認するため、 染色体１９の相互転座に由来する雑種体細胞を用いたサザン法による雑種形成で ある。

第５図は、悪性高熱病家系の代表的な２家族について制限フラグメント長多形成 性（ＲＦＬＰ）を分析した結果である。

発明についての記述 悪性高熱病では持続性の筋収縮がみられることから、この疾病における問題は、 筋小胞体（ＳＲ）から筋細胞質中にカルシウムが放出されることによるものであ ることが示唆される。筋のカルシウム放出チャネルは、横細管と呼ばれる模様組 織と筋小胞体の間のギャップを接合している大型蛋白である。近年、この蛋白は 「リアノジン　レセプター１蛋白に相当することを示す証拠が蓄積し、このチャ ネルの欠陥が、悪性高熱病に罹患した人を始めとする動物でみられる根本的な欠 陥ではないかと推測されている。

本発明において、悪性高熱病患者ではリアノジンレセブター遺伝子が欠失してい ることが認められた。

本特許申請書では、ヒト　リアノジン　レセプター蛋白をコード化し、ヒト　リ アノジン　レセプター（ＨＲＲ）遺伝子をヒト染色体１９にマツプし、さらにＭ Ｈ遺伝子を染色体１９の長腕にマツプする遺伝子の単離法を開示し、ヒト　リア ノジン　レセプター遺伝子内のＲＦＬＰマーカーが、悪性高熱病の表現型として １００％分離することを実証した。ヒト　リアノジン　レセプター遺伝子は、悪 性高熱に関与する遺伝子と考えられ５ヒト　リアノジン　レセプター遺伝子のＤ ＮＡプローブは信頼性の高い悪性高熱の診断法の基盤を構成する。

悪性高熱病の主要な障害は、カルシウム調節にあると信じられている。悪性高熱 病に感受性のブタでは、本疾病発症時に筋線維室中のカルシウム濃度が急激に上 昇するが、これはダントロレンの投怪により急速に回復する［’Ｌｏｐｅｚ、Ｊ 、　Ｒ，、＾１ｌｅｎ、Ｐ、、＾ｌａｍｏ、Ｌ、、Ｊｏｎｅｓ　Ｄ、及び５ｒｅ ｔｃｒ　Ｆ、１１ｕｓｃｌｅ　Ｎｃｒｖｅ、Ｉｆ、８２−８８．（１９８８）１ ．悪性高熱廚に罹患した人及びブタの筋肉では、カルシウム−アデノシントリホ スファターゼ蛋白（カルシウムポンプ）機能は正常であると思われるが、カルシ ウムにより誘導されるカルシウム放出チャネルの異常が指摘されている。

悪性高熱病に罹患した筋肉の静市期のカルシウム濃度は、筋線維室中で高いが、 その他の研究によると、悪性高熱に罹患したブタから単離した重い筋小胞体では 、正常なブタから単離された重い筋小胞体と比較して、低いカルシウム閾値でカ ルジム誘導によるカルシウムの放出が活発化され、ハロタンの存在下ではこの閾 値がさらに低くなる。　０ｈＬａ、Ｔ、、Ｅｎｄｏ、Ｍ、、Ｎａｋａｎｏ、Ｔ、 。

Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ、Ｙ、、Ｗａｎｉｋａｗａ、に、及びＯｈｇａ、Ａ、、Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｃ３５８−３６ ７、（１９８９）は、悪性高熱病に感受性のブタの筋肉では、正常なブタと比較 して、カルシウム誘導によるカルシウム放出率が著しく高いことを報告している 。　Ｍｉｃｋｅｌｓｏｎら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：１７１５−１７ ２２．１９８８）もまた、悪性高熱痛感受性の個体では筋肉中のカルシウム誘導 によるカルシウム放出率が高いことを認めている。筋のカルシウム放出チャネル は、横細管と呼ばれる模様組織と筋小胞体の間のギャップを接合する大型蛋白で ある。このチャネルは、カルシウム、カフェイン、ハロタン及びマイクロモル濃 度のリアノジンにより活性化され、ルテニウムレッド、テトラカイン、カルモジ ュリン、高濃度のＭｇＺ＋及びマイクロモル濃度のリアノジンにより抑制される ［Ｌａｉ　Ｆ、＾、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、３３１：３１５−３１９．（１９８８ ）コ、悪性高熱病に罹患したブタでは筋線維室中の静止期のカルシウム濃度が高 ＜　ＣＬｏｐｅｚら、同」二）、悪性高熱罹患ブタにおいてはカルシウム誘導に よるカルシウムの放出が、正常なブタと比較して低いカルシウム閾値で活性化さ れる。この閾値は、ハロタンの存在下ではさらに低くなる（Ｎｅｌｓｏｎ、　１ ９８８）、０ｈｔａら（同上）及びＭｉｃｋｅｌｓｏｎら（同上）は、悪性高熱 痛感受性のブタでは筒中のカルシウム誘導によるカルシウム放出率が高いことを 報告している。後者の研究によると　悪性高熱感受性筋ではリアノジン　レセプ ターのリアノジン結合に対する親和性が高く、リアノジンの結合を抑制するため には、さらに高濃度のカルシウムを必要とする。

リアノジンは、カフェインもしくはハロタンと同様に、ブタ及びヒトのいずれに 対しても、ｉｎ　ｖ已「０で骨格筋の収縮を引き起こし、悪性高熱病に罹患した 筋と正常な筋でこの差が太きいとされている。

ここに提示した研究とは別に、最近ウサギのリアノジンレセブターがクローン化 されている［：Ｔａｋｅｓｈｉｌｌａ、）１、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３９： ４３９−４４５．　（１９８９）］、推定されるアミノ酸配列は、５０３７個の アミノ酸から成る。予想される蛋白構造より、カルシウム放出チャネルは、４つ の膜間ドメイン及び調節機能配列で構成され、分子のＣ−末端部に存在すると考 えられる。残りの蛋白は、横細管と筋小胞体の間のギャップを接合する「手」の 部分を構成するものと推定される。

ヒト　リアノジン　レセプターの推定構造の第５０−末端部は、４〜１０の膜間 セグメントが含まれ、チャネル自体を形成している。カルシウム、カルモジュリ ン、アデノシン三リン酸及びその他のカルシウムチャネル機能モジュレータ−の 推定結合部位も、本分子内に存在すると信じられている。これらの膜間領域のう ちの２カ所は、ニコチン性アセチルコリン　レセプター（ｎＡＣｈＲ）と部分的 相同性を示す、　Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｎＡＣｈＲにおける荷電分布を変えるような 特定のアミノ酸置換が起こると、チャネルの電気伝導度も変化することが知られ ている［　Ｉｍｏｔａ、　Ｋ、　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：６４５−６４８． 　（＋９８８）コ、これより類推すると、ヒト　リアノジン　レセプターでも対 応する膜間セグメントにアミノ酸置換が起こると、カルシウム放出率が変化し、 悪性高熱感受性筋を起こすものと考えられる。

ウサギｃＤＮＡクローンは、精製したウサギのリアノジン　レセプター蛋白上の エピトープに対する精製ポリクローナル抗体に親和性を有するλｇｔｌ１表現ｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得られた［Ｚｏｒｚａｔｏ、Ｆ　ら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１．２６１　：８６３−８７０．　（１９８９）］、その蛋 白配列については、Ｔａｋｅｓｈｉｍａら（同上）により発表されており、従っ てすでに公知の事実である。このライブラリーより、２種類のウサギｃ　ＤＮＡ クローンを単離した。ついで、これらのクローンの制限酵素フラグメントをプロ ーブとして用い、ウサギ新生仔骨格筋のｃＤＮＡライブラリーからさらに長いｃ 　ＤＮＡクローンを単離した０本ライブラリーは公知であり、ＭａｃＬｅｎｎａ ｎ、　Ｄ、　Ｈ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１６：６９６−７００（＋９８５）に より詳しく報告されている２本出願に用いたライブラリーは全て公知！ある。し かし、当該専門家の間では、すでに確立されている方法により骨格筋から作製さ れたライブラリーはいずれも、組織中に存在するＲＮＡ化合物を代表し、従って リアノジン　レセプターのクローン源となりうることが知られている。

それ以上のクローン化は、ウサギ新生仔の筒中のポリＡ＋ＲＮＡを用いたプライ マー・エクステンションライブラリーを用いて行った。

ウサギのリアノジン　レセプターｃＤＮＡプローブを用い、雑種保存に基づいて ヒｉ・　リアノジン　レセプターｃ　ＤＮＡを分離した。ヒト骨格筋のλｇｔｉ 。

ｃ　ＤＮＡ　ライブラリーから、一連の６樺の６ｍクローンを分離した。これら のクローンは、ｃ　ＤＮＡ　１〜６と標識し、第１図に示す、第１図のｃ　ＤＮ Ａクローン７は、ヒト骨格筋ｍＲＮＡがら構成されたプライマー　エクステンシ ョン　ライブラリーから分離した第１図に示した非重複ｃＤＮＡフラグメントに またがるゲノムＤＮＡは、特異的染色体】９ライブラリー、すなわち米国メリー ランド州ロックビルの八ｍｃｒｉｃａｎＴ！／ｌｌｅ　Ｃｕｔい＋ｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎによりＣｈａｒｏｎ　４＾乱ａｗｒｅｎｃｅＬｉｖｅｒｍｏｒｅ 　Ｌｌ、１９ＮＬＯＩ　ヒト染色体１９ライブラリーと命名されているものより 分離した。

第１園は、ヒト　リアノジン　レセプターのｃＤＮＡに関する制限マツプ及び配 列順序を示している。第１列は、ｃＤＮＡの全長をｋｂで示している。第２列は 、ヒドリアノジンレセプターの蛋白をコード化する１５．３ｋｂのｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａの部分的な制限酵素マツプを示している。第３及び第４列は、最初のｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａライブラリーから分離した６種のクローン（１〜６）及びヒトのブライマ ーエクステンションｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから分離した１種のクローン（ ７）を示している。クローン内の矢印は、これらのクローンが全て、２方向に配 列されていることを示す、第５列は、各種クローン間で重なった配列が得られる ようゲノムＤＮＡが配列された領域を示している０本出願に記載したヒト　リア ノジン　レセプターのプローブ１，２，３，４，５゜６はそれぞれ、ｃＤＮＡ１ ，３，４，５，６．７に相当する。

第２図は、ヒト　リアノジン　レセプターをコード化するｃＤＮへのヌクレオチ ド及び推定アミノ酸配列を示す、ヌクレオチドは、イニシエーターであるメチオ ニンコドン残基から始まる正の番号を付す、５′の非翻訳領域を含むヌクレオチ ドは、３′から５′の方向に負の番号を付す、転写解読枠の推定アミノ酸配列は 、ｌ〜５０３２の番号を付す、精製レセプターを用いて決定したペプチド配列は １本の下線で示した。リン酸化可能部位は２本の下線で示した。ＴＧＡ終結コド ンの後に始まる３′の未翻訳領域の長さは、１４２ｂｐである。正準のへ＾へ人 Ｔ＾へＡポリアデニン酸シグナル［Ｐ　ｒ　ｏ　ｕ　ｄｆｏｏｔ、Ｎ、Ｊ、　ａ ｎｄ　Ｒｒｏｗｎｌｃｅ、Ｇ、Ｇ、、Ｎａｔｕｒｅ　２６３：２１１−２１４． （＋９７６＞］は、ポリアデニン酸化部位より上位の１９塩基にみられ、ポリア デニン酸化シグナルとポリアデニン酸化部位の間の配列に特徴的なＴ　Ｇ−リッ チな配列ＴＣＴＧＴＣＧＴＡＣＧがそのすぐ後に続＜　［ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ 、Ｊ、ら、独ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋３：ｌ３４７−１３６８．（ １９８５）］。イニシエーターのメチオニンは、終結コドンの上位１４０９６ｂ ｐにある。イニシエーターのメチオニノコトンは、コンセンサス開始配列のＣＧ ＾（Ｇ）ＣＣＡＴＧＧにきわめて類似した長い配列ＡＣ；ＡＴＣＡＴＧＧに存在 する［にｏｚａｋ、Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ　３０８，２４＋−２４６、（＋９８４） ］　、第２図のヒトｃＤＮＡ配列は、推定分子量が５６３，５８４で、５０３２ 個のアミノ酸を含む蛋白質をコード化する。ここで用いた高度に純粋という用語 は、分離し、精製したＤＮＡまたは蛋白質が、それ以外の動物性ＤＮＡまたは蛋 白質のいずれも含まないことを意味する。また、言うまでもなく、ここで開示さ れ、特許請求範囲に含めたＤＮＡまたは蛋白質配列については、ＤＮＡ配列また は蛋白配列の根本的な機能を損なうことのないＤＮＡ配列または蛋白の可変領域 を、置換することにより得られる相当する各種機能が存在する。

ｃＤＮＡがリアノジン　レセプター遺伝子をコード化していることを証明するい くつかのＭ、拠がある。クローンにより表現される融合蛋白は、精製した３０Ｓ リアノジン　レセプターに対して生成した第２の抗体と反応した［Ｍｅｉｓｓｎ ｅｒ、Ｇ、Ｒｏｕｓｓｅａｕ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｌａｉ、Ｆ、Ａ、ムＢｉｏ１．Ｃ ｈｅｍ、　２６４：１７１５−１７２２．（１９８９）ｌ　さらに別の証拠とし て、ｃＤＮＡのコード領域からのウサギとヒトのプローブは雑種を形成し、ウサ ギ筋肉ｍ　ＲＮ　Ａの約１５ｋｂにメツセージされた。ウサギのリアノジン　レ セプターから作製したトリプシンペプチドの配列を決定した。ＮＡクローンのプ ライマー・エクステンション及びＤＮＡ配列を分析した結果、精製リアノジン　 レセプター蛋白に由来するトリプシンペプチドの配列に一致する４種の推定アミ ノ酸配列が認められた。これらの配列を第２図に下線で示す、さらに、この推定 アミノ酸配列により、分子の第５カルボキシル基の末端部にのみ数種の膜間経路 を有する蛋白が生成されること、またこの蛋白は全体的に親水性であることが認 められたことから、クローンがリアノジン　レセプターをコード化することを示 す証拠が得られた。このように推定蛋白はその蛋白全体と＋７て細胞質性であり 、膜間を占めるのはごく小部分のみであるリアノジン　レセプターの構造ときわ めてよく一致すると思われる［冒ａｇｅｎｋｎｅｃｈｔ、　Ｔ、ら、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３８：１６７−１７０．（＋９８９）］。

ヒト染色体１９上のリアノジン　レセプター遺伝子の位置は、ヒト−げっ線類体 細胞雑種パネルを用いて決定した［ＭａｃＬｅｎｎａｎ、　Ｄ、ｔｌ、　ら、　 ５ｏａａｔ、Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、、　１３：３４］−３４ ６，（１９８７）コ、第３図は、ヒト　リアノジン　レセプター遺伝子のフィル ターハイダブリゼーション法による分析結果を示している。ＤＮＡは、ヒト（レ ーンｌ璽マウス（レーン２）及びマウス−ヒト雑種細胞（レーン３及び４）に由 来している（ＭａｃＬｅｎｎａｎら、同上　）、ＤＮＡはＥｃｏＲｌで消化し、 ヒトｃＤＮＡ配列において８５５０〜９５５０個の塩基から成るヒドリアノジン 　レセプターｃ　ＤＮＡのｌ００１ｂｐ　Ｘｈｏｌ　−１１ｉｎｄ　Ｉｌｌ切断 片であるプローブｐＨＲＲ−Ｘ）ｌ　−１を用いて、サザン法による分析（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った（図２）、レーン３の雑 種細胞には、ヒト染色体１９が含まれるが、レーン４の雑種細胞には含まれてい ない０本試験で用いた第１３雑種体細胞中における染色体１９の有無は、細胞遺 伝学的方法及び染色体１９のＤＮＡプローブを用いて確認した。ヒトのゲノムＤ ＮＡにおける１　５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩバンドは、プローブｐ）ＩＲＲ−Ｘｌ（ −１ｉ：雑種形成サレ６．　ｖウスノ２．４，２．１　及び０．５ｋｂバンドに 交差雑種形成も認められた。第３図に示したように、第１３雑種体細胞は一連の 分析により、染色体１９ならびにヒト　リアノジン　レセプタープローブｐＨＲ Ｒ−ＸＨ−１ｊ：雑種形成サレｔ：　１５　ｋｂ　ＥｃｏＲ１制限切断片が１０ ０％一致することが明らかになった０表１に示すように、Ｘ及びＹ染色体を始め とするその他の全て染色体では、不一致が２３〜７７％の範囲にあり机 表１ ヒドリアノジンレセプター遺伝子の染色体地図染色体番号　不一致　不一致率（ ％） ｐＨＲＲ−Ｘｌ＋−１プローブを用いた染色体１９の遺伝子上の位置の確認は、 ヒト染色体１９に関与する各種の交換転座に由来する体細胞の雑種細胞パネルを 用いて行った。これら雑種細胞の構成及び分析は、すでに計００に、　１．Ｄ、 ら、　Ｈｕｎ、Ｇｅｎｅｔ、６８：２８２−２８５．（＋９８４）、Ｂｕｆｔｏ ｎ、Ｌら　、　八ｍ、Ｊ、Ｉ（ｕｍ、Ｇｅｎｃｔ、３８：４４７−４６０．（１ ９８６）、Ｋｏｒｎｅｌｕｋ。

Ｒ，Ｇ、らＧｅｎｏｏ＋ｉｃｓ　（印刷中）　（＋９８９）、Ｌｕ５ｉｓ、＾、 Ｊ、ら、ニｃ、、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、Ｌｌ、Ｓ、八、８３：３９２ ９−３９３３．　（１９８６）、Ｍｏｈａｎｄａｓ、Ｔ、ら　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌＪ、Ｓ、＾、７７：６７５９−６７６３、　（＋９８ ０＞によって報告されている。第１図には、雑種細胞及び対照細胞から抽出し、 ＥｃｏＲｌで完全に消化し、電気泳動法で分離した後サザノープロテイング法で 分析したときの遺伝子ＤＮＡを示す、この図はｐ＋ＩＲＲ−ＸＨ−１プローブの ＤＮＡへの雑種形成パターンをオートラジオグラフに示したものであり、（１） はＡ９対照マウス、（２）はＥ３６対照ハムスター、（３）はＧ２４八９（＋９ ｐ１３−　＞　１９ｑｔｅｒを保持）、（４）は０２４Ｂ２７Ｇ（戻し淘汰によ りＩｆｌｐ１３−　＞　１９ｑｔｅｒ欠失）、（５）はＧ３５ε４（＋９ｐＬｅ ｒ　−＞　１９ｑ＋３．３保持）、（６）はＢ−９（１９ｑ１３．２　−　）　 １９ｑｔｅｒ保持）、　（７）はＧＭ８９Ａ９０Ｃ７Ｂ（１９ｑ１３゜３　＞１ ９ｑｔｅｒ保持）、（８）はＣＦ＋０４−１９／６（１９ｃｅｎ　−＞Ｑｔｅｒ 保持）、（９）は０８９Ｅ５　（正常なヒトＸ染色体）、（１０）は正常な男性 のＤＮＡ、（１１）は正常女性のＤＮＡである。　ｐＨＲＲ−ＸＨ−１プローブ と雑種を形成するヒト染色体１９に由来するＥｃｏＲ１フラグメントの大きは約 １５ｋｂである。ハムスターのＤＮＡ配列に対するｐ）ＩＲＲ−ＸＨ−１プロー ブの交差雑種形成は６．０ｋｂで認められ、マウスのＥｃｏＲｌでは２，４及び ２．１で認められる。第４図から、ＨＲＲプローブは加水分解されて１９ｑ違位 領域を含む雑種細胞に由来するヒトＤＮＡのゲノム消化物、すなわちｌ）＋３− ）ｑＬｅｒ　（レーン３　）　、　ｐｔｃｒ−＞ｑｌ３．３　（レーン５）及び ｑｌ、３．３−　＞　ｑＬｅｒ（レーン８）を生成する。一方、近位１９ｑ領域 １３２−＞ｑｔｅｒ（レーン６）及びｃｅｎ　−＞　ｑｔｅｒ　（レーン７）を 含む雑種細胞はプローブｐＨＲＲ−Ｘｌ（−１に結合しなかった。これらの結果 から、ＨＲＲプローブはｃｅｎ　−＞ｑｌ３．２の間隔て遠位１９領域に位置し ていることが明らかとなった。

ＨＲＲ遺伝子は、変異をおこしたとき、悪性高熱病の原因となることを実証する ため、ＨＲＲ遺伝子の一部であるＲＦＬＰマーカーは家族内で悪性高熱病遺伝子 （したがって、悪性高熱柄表現型）として分離することが明らかにされている。

このことを明らかにするため、悪性高熱病の家系家族から血液試料を採取し、Ｒ ＦＬＰを分析した。検査したＲ　Ｆ　Ｌ　Ｐには、染色体１９にマツプすること が報告されている遺伝子マーカーが含まれる。さらに重要なことは、いくつかの 新しいＲＦＬＰが記載され、ＨＲＲ遺伝子からｃＤＮＡにより確認される。そこ で、悪性高熱病表現型とともに分離することを直接検査できる悪性高熱病遺伝子 検出手段を確立した。

悪性高熱病遺伝子におけるＲＦＬＰは悪性高熱病遺伝子から得た各種のｃＤＮＡ クーロンを一連の正常な人から得たＤＮＡのサザン法による雑種配列を検出する ためのプローブとして用いて同定した。ＤＮＡの検体試料はそれぞれ数種の制限 酵素で分解し、アガロースゲルを用いた電気泳動法でフラグメントを大きさ別に 分画し、ナイロン膜で濾過した。膜上の変性ＤＮＡを３２Ｐ標識悪性高熱病ｃ　 ＤＮＡプローブを用いた標準手順で雑種形成させた。雑種形成配列の部位は標準 的なオートラジオグラフィー法で測定した。検査した人でフラグメントの大きさ に差がみとめられたプローブ／酵素の組み合わせを全て新規なＲＦＬＰとした。

総計で１１種のＲＦＬＰが悪性高熱病遺伝子で決定された。その性質を表２に示 す。各ＲＦＬＰについて、悪性鳥熱病ｃＤＮΔプローブを第１ＩＩｌに、多形成 性部位を有する酵素を第２欄に、フラグメントの大きさが変動するもの（対立遺 伝子）を第３欄に、フラグメントの大きさが変わらないものを第４欄に、そして 対立遺伝子の頻度を第５欄に示す。

これらのプローブは、第２図に示したヌクレオチドの配列を参照することにより 、さらに正確に規定することができる。ヒト　リアノジン　レセプター１−１６ ００は第２図に示したヌクレオチド＋３６０２から１５２４３を接合する約１． ６ｋｂのフラグメントである。ヒト　リアノジン　レセプター２−２０００は第 ２図に示したヌクレオチド１１６１３から１３６０７を接合する約２ｋｂのフラ グメントである。ヒドリアノジン　レセプター３−３１００は第２図に示したヌ クレオチド８５１５２から１１６１８を接合する約３．１ｋｂのフラグメントで ある。ヒト　リアノジン　レセプター３−１２００はまだヒト　リアノジン　レ セプター３−３１００のサブフラグメントであり、第２図に示したヌクレオチド ９５４９から１０８５１　を接合する約１゜２ｋｂのフラグメントである。ヒト 　リアノジン　レセプター４−２４００は第２図に示したヌクレオチド６１２５ から８４９３を接合する約２．４ｋｂのフラグメントである。ヒト　リアノジン 　レセプター５−３１１１００は第２図に示したヌクレオチド２３９１から６１ ２５を接合する約３．８ｋｂのフラグメントである。さらに、ヒト　リアノジン 　レセプター７Ａ（ヌクレオチド１８６−２３９６）及び７Ｂ（ヌクレオチド１ ０４−５４８）も検査したが、試験した制限酵素のいずれでもＲＦＬＰマーカー は認められなかった。

この一連のヒト　リアノジン　レセプター遺伝子マーカーを用い、悪性高熱病家 系家族で悪性高熱病表現型を有するマーカーを分離することが可能である。検査 の対象とした家族は、トロントのＧｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌで長年検査 を受けているものである。これらの家族では少なくとも２人の知恵遅れの子供（ すなわち、その１人は悪性高熱病遺伝子［一つは正常で一方は突然変異対立遺伝 子］及びヒト　リアノジン　レセプター遺伝子に遺伝子マーカー［各型の対立遺 伝子１個］に対して異種接合型の両親から悪性高熱病遺伝子を引き次いでいた） を有する家族である。家族は、悪性高熱反応または筋生検検査で疑いもなく陽性 の結果が得られた場合、影響を受けたと判定した。ある場合には、片方の親のみ 検査したので、一方の親にっては推定しなければならなかった。筋の生検検定は 、以下に示すごと＜　、　Ｎｏｒｔｈ　Ａ！１Ｉｅｒｉｃａｎ　Ｍａｌｉｇｎａ ｎＬ　ｌｌｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａプロトコール（Ｂｒ１ｔｔ、　１９８８）に 従って行った。少なくともパラメーターのうち２例で一致した結果がえられた場 合、生検検定の結果は信頼性があると判断したが。

中間または不明瞭な結果については判定しなかった。

別々の筋標本について、３種類の生検検査薬、すなわちハロタン、カフェイン及 びカフェイン＋ハロタンを用いて検査した。これらの検査はいずれも正常部標本 及び悪性高熱反応間の収縮の差に基づくものである（表３）。

筋生検検査は発病患者について行い、脂肪を含まない体筒２０ｋｇに対する初期 相対値を測定した。悪性高熱反応がみられてから生検検査による診断までの間、 少なくとも２〜３力月を置いた。検査は亜酸化窒素、イノバー及びミダゾラムを 用いて行った。ダントロレンは、試験の結果に影響がある可能性が考えられたの で、検査前に投与しなかった。検査には外側床筋、腹直筋及び薄筒を用いた。こ れらの筋肉はいずれもカフェイン　ハロタン収縮試験で同程度の反応を示した。

試験前に、各標本で良好な単収縮が認められた。適当な収縮高及び基線を得るた めに、薬剤投与前に約２０分装置いた。全ての標本について、１％ハロタンを用 いた収縮試験を行った。いずれの場合も暴露時間は１０分とした。収縮の振幅を 測定し、１％で０．３及び３％で０．７以上の収縮が認められた場合、異常とし た、カフェイン試験では、０．５ｍ１ｌから３２ｍＭまでの濃度を４分間間隔で 累積投与した。投与４分後に各用量に対する反応による収縮を測定した。静止時 の張力が１ｇ増加するのに要するカフェインの用量（特異的カフェイン濃度）を 算出した。得られた値が４ｍＭ以上の場合、正常と判断した。　０．３５ｍＭ以 下の値が得られた個体は影響があると判断した。結果が陽性か陰性か判断する場 合に用いた基準を表３に示す、一般にカフェイン＋ハロタン試験の結果は最も特 異的と考えられ、またほとんどの場合にカフェイン試験の結果はこの試験の結果 と良く一致した。ハロタン試験（１％ハロタンを使用）では偽陰性の結果が得ら れ、その結果はその他の試験結果がいずれも陽性であった場合無視した。混乱を 回避するため、かけ離れた結果が得られた家族、または染色体優性遺伝の標準的 評価基準にそぐわない家族はＲＦ　Ｌ　Ｐ分析から除外した。このようにして、 試験には１９家族を選んだ。

典型的な例として２家族の結果を第５図ａ及びｂに示す、第５図ａに示した結果 は、家族番号５の結果である。母親が反応（Ｒ）を示し、カフェイン＋ハロタン 試験（Ｋ）でも陽性反応が認められた。彼女の夫は正常と推定した。生検検査の 結果２３人の子供に影響が認められた。３種類のヒト　リアノジン　レセプター 遺伝子ＲＦ　Ｌ　Ｐについて分離を検査したところ、２人の子供でＨＲＲ３陽性 が認められ、１人はＨＲＲ４陽性であった。１本のコンスタント　バンド（Ｃ） が認められた。３対の多形成性フラグメントは、２２及びｌ　９　ｋｂ　（Ｂｃ ｌｌを有する）ＩＲＲ３；　８．４ｈｂ−ｙラグメントと同調する２、９ｋｂフ ラグメントは認められない一表１）及び６．５及び４．４ｋｂ　（Ｐｖｕｌｌ　 を有するＨＲＲ３；４．４ｋｂフラグメントと同調する１、９ｋｂフラグメント は認められない一表１）、各ＲＦ’　Ｌ　Ｐマーカーについて、父親は１方の対 立遺伝子に対し同型接合性であり、母親は２本の対立遺伝子に対し異種接合型で あった６例えば、最初のＲＦＬＰの場合、父親は２２／２であり、母親は２２／ １９であった。３人の子供はいずれも両親から２２ｋｂマーカーを受け継いでい た。すなわち、３人ともは母親から悪性病熱病遺伝子とともに２２ｋｂ対立遺伝 子を受け継いでいた。これらは偶然にも起こりえるおことであるが、悪性高熱遺 伝子はヒト　リアジオレセプター遺伝子と密接にリンケージしているが、相互に よく似ているため、−緒に分離する。この家族で印象的であった別の２種類のＲ ＦＬＰについても同様に説明することができる。

第５図すは家族番号１２の結果である。母親及び２人の子供に影響がみられた。

２種類のＲＦ　Ｌ、　Ｐについて検査したところ、１人は大きさが一定なフラグ メント（Ｃ）及び６．５及び４．４ｋｂ　（第５図ａと同様）の対立遺伝子を有 し、１人は染色体１９上のヒト　リアノジン　レセプター遺伝子の近くにマツプ される＾ｐｏｃＩＩ遺伝子（Ｓｈｏｗ及びＥｉｂｅｒｇ、同上）からのプローブ を用遺伝子を欠いていた。＋ＩＲＲ３ＲＦＬＰマーカーについて、父親は異種接 合性（６，５７４，４）であり、母親は同種接合型（４，４７４，４）であった 、子供は４人とも母親から４．４対立遺伝子を受け継いだはずである。２人の正 常な女子は父親から４．４対立遺伝子を受け継ぎ、２人の影゛響がみられた子供 は父親から６．５ｋｂ対立遺伝子を受け継いでいた。このようなことは画然でも 起こりうるが。

染色体１９上の突然変異悪性病熱病遺伝子とともに分離する対立遺伝子６．５ｋ ｂ及びその他の染色体１９上の正常な悪性高熱遺伝子とともに分離する４、　４ ｋｂ対立遺伝子と一致する。それぞれ影響をうけた兄弟からの反対のへｐｏｌｌ 対立遺伝了を受け継いだ２人の正常な女子でも、同様な結果が認められた。これ は、悪性病熱病遺伝子にリンケージする＾ｐｏｌｌ遺伝子に一致するが、偶然で も起こりうる。

これら２例の代表的な家族の結果は、悪性病熱病遺伝子とリンケージする染色体 マーカーの検出における遺伝学的試験には統計学的分析が必要であることを示し ている。いずれかの家族でも、分離パターンは偶然か、真の遺伝学的リンケージ による疾病と２種のマーカーの共分離により起こりうる。偶然ではなく、リンケ ージによるものであることを実証するにはいくつかの家族を検査し、統計学的分 析を行わなければならない１表４に１９家族の検査結果を要約する。１以上のヒ ト　リアジノン　レセプター遺伝子で、８家族で影響の認めれた両親からの１９ 人の子供で得られたと同様な印象的な結果がえられた。いずれの家族でも影響の 認められた子供はいずれも同じヒト　リアジオンレセプター　マーカーを受け継 ぎ、影響の認められなかったこともは別の型を受け継いでいた。このようなこと が偶然で起こる確率は井筒に低い、標準的なリンケージ分析により、偶然ではな くリンケージによる確率をめた。結果を表４に示す。

表２ ヒト　リ７ノシ゛ン　レセタブローブに関す　る　情報プローブ メントの大　き　さ　へ゛ンド　子 （対立遺伝子）　発現頻度 ）ＩＲＲＩ−６００　Ｂａｎ　ｌ　８．０／１３１０　２２／．７８ＨＲＲ３− １０００　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　１９．０／２２　、０４／．９６ｒ’ｖｕ１１本 　６．５７４．４月．９　、２５／．７５Ｂａｍ　ＨＩ＊　１９．０／１４．０ ，５．０　、７５／．２５ＨＲＲ３−１２００　Ｐｒｕｌ＋　１．９，３．９１ ５．８　、１１／．８９ＨＲＲ４−２４００　Ｔａｑ　Ｉ　１．８／１．１，０ ．７　３．５　、２０／．８０Ｂｃｌ　Ｉ　１１．５／８，４，２．９　４．［ ｉ，３．０　、’７８／．２２Ｅｃｏ　ＲＶ　２８．０／２．５　１１．０ＨＲ Ｒ５−３８００Ｅｃｏ　Ｒ１２４，０／＋６．０，９．０　．１４／、８６Ｔａ ｑ　Ｉ　１．９／１．６，０．３ Ｍ５ｐ　ｌ　１．８／２．２ ＊　Ｉ’ｖｕおよびＢａｍ旧多形成は、相互に完全な連鎖不平衡にあり、単一の 遺伝子マーカーとして取り扱った。

表３ 筋生検試験基準（齢・１０年以上） 正常時　罹患時 ハロタン１％　＜０．２　ｇ　＞０．２　ｇ３％　＜０．７　ｇ　＞０．７　ｇ カフェイン　＞４．ＯｌｉＭ　＜４．０　ｍＭカフェイン＋ハロタン　＞０．５ 　ｍＭ　＜０．３５　ｍＭカフェイン−累積増加した　（１，２，４，８，１６ ，３２ｍ！Ｊ）収縮の測定−基線から横ばい状態になるまでカフェイン＋ハロタ ンー１％ハロタンの投与１０分後に、カフェインを漸次累積投与した（０．２５ ，０．５．１，２，４゜８、１６．３２ｍＭ） 表４ Ｍ　Ｈ遺伝子及びＨＲＲ遺伝子リンケージリンケージ分布（ＣＭ）　Ｌ　ＯＤス コア０．００　３．３１ ０．０＋　３．２２ ０．０２　３．＋５ ０．０５　２．９＋ ０．４０　０．３０ 表にした値は、１０を底とする歩（ｏｄｄｓ）の対数で。

ＬＯＤ評点（ｓｃｏｒｅ）とよばれる、ＨＲＲ遺伝子とＭＨ遺伝子との間の取り 得るいろんな距離を仮定して計算をおこなうと、仮定距離０で歩が最亮値になる ことが立証される。これに最も適当な解釈を与えるのは、二つの遺伝子が同一で あるとすることのように思われる、３というのは１０００の対数であるから、Ｌ ＯＤ評点が３よりも大きいというのは、偶然に対し連関（１１０ｋａｇｅ）の方 が１０００対ｌで歩がよいということを示している、実際にはＨＲＲ遺伝子が突 然変異するとＭＨをひき起す遺伝子になる、と推断するのが筋が通っている。

この推断は、ＨＲＲ遺伝子プローブ（ｐｒｏｂｅ）では情報を与えないが、染色 体１９上でＨＲＲ遺伝子に側接する遺伝標識では情報をり、えた更にもう８家系 の中で、ＭＨ遺伝子と側接標識との間での組換えが、わずか３件しか検出されな かったという事実によって補強される。これは又、ＭＨ遺伝子が染色体上でＨＲ Ｒ遺伝子と同じ部位に位置することの決定的証拠にもなる。

ＨＲＲｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンにより検出されたＲ　Ｆ　Ｌ　Ｐ標識は、１００ ％の時間、上記プローブで情報を与える家系中のＭ　８表現型と分離した。関連 家系員が全て、ＤＮＡテストできると仮定すれば、Ｍ　Ｈ反応または筋肉生検（ ｂｉｏｐｓｙ）をしたことのない家系員のＭＨ現状を確定することができること になる。罹患個体とその親または兄弟でそのＭＨ現状（ｓｔａｔｕｓ）がわかっ ているものとの双方が、利用できなければならない９例えば、片親と一人の子が 罹患しているとして５両親と罹患した子との両方のＤＮＡテストができるのであ れば、家系中の他の子供たちの現状の確定ができることになろう、また別の例と して、親の一方の祖父母の一人との両者が罹患している家系の最初の子孫を診断 することが可能である。この場合、子供だけでなく、両親・祖父母の両方も調べ ることが必要になろう、現在のところ、このテストで必要になるのは、先に定義 した１１の標識中の−が、診断されようとしている家系で情報を与える（ｉｎｆ ｏｒｍａＬｉｙｅ）ことである、ＬＯＤ評点づけに用（＼た１９家系中の８が、 」１記基準に適合する。

ＨＲＲ遺伝子に側接する標識は、この疾患の追跡にも使えるが、組換え発生（こ れによって疾患表現型から標識がはずされる）の惧が、Ｍ　Ｈ遺伝子からの距離 に応じて増太し、結果として誤診重数％ということＣ二なる。ジヌクレオチド繰 返しくｒｅｐｅａｔ）の多様コピー（Ｉｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｐｉｅｓ）につい て、ＨＲＲＣＤＮＡによって検出されるゲノムクローン（ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｃ１ ｏｎｅ＞を選抜することによって、新しい標識を創り出し得る。そうした標識は 、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により解析され、個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉ ｏｎ）中に多様の対立形質を有している。

［Ｗｅｂｅｒ、　Ｊ、　Ｌ、およびＭａｙ、　Ｐ、　Ｅ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕ ｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　４４　：３３Ｂ−３９６、（１９８９）］これらは、諸家 系のより広い範囲について情報を与える遺伝子内プローブを提供し得るものであ り、それによって、疾患表現型との組換えの惧をはらむ側接標識の必要を回避で きる。

現連関データの解析は、人間のＭＨと関連する普通の単模式種の存在を示してい ないが、これはＭＨ遺伝子の多発変異（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ） が見つかるかも知れないことを示している。一般的な個体群選抜用のテスト方法 を開発するためには、突然変異を個別に見つけ、それぞれを特性づけることが必 要であろう。

ここで開示された正常なＨＲＲｃ　Ｄ　Ｎ＾配列の知識から。

ポリメラーゼ連鎖反応を使用して正常及び突然変異遺伝子のセグメントｃＤＮＡ コピーの増幅が可能となる、ヘテロ接合状態（直接的配列に対し）または半接合 状態（クローン配列に対し）において配列が偏倚する（クローンＤＮＡ配列に関 して）ので、突然変異が明らかであろう、ｃＤＮＡを使用することによって、ベ ースの置換、削除、重複または挿入に加えてＲＮＡの経過的突然変異が検出され るであろう。

一旦突然変異が定義されると、正常な配列から読導されるオリゴヌクレオチドが 合成され、そしてその突然変異を攻げき（ｆｌａｎｋ）　Ｌ、正常及び突然変異 体の対立遺伝子の両者を増幅するのに使用できる１次いで、ＨＲＲ遺伝子の突然 変異領域か又は相当するＨＲＲ遺伝子の正常なサイトを含む短かいオリゴヌクレ オチドが合成され、興味の対象領域を含む増幅されたＤＮＡの汚点を試験するた めに、順番に試料として使用される。突然変異体連鎖オリゴヌク１７オチドは、 影響を受けた個体からのＤＮＡとのみ交雑する筈であり、一方、正常な連鎖オリ ゴヌクレオチドは、影響を受けた個体と影響を受けない個体の両者からのＤＮＡ と交雑する。突然変異の配列に基いて対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドを設計 することも可能であり、そして、正常なＨＲＲ配列とともに、オリゴヌクレオチ ドはＰ　ＣＲ反応において、影響を受けた個体中にのみ生成物をつくる。

ボリモルフイズムではなくて潜在的な偏倚が突然変異を表現すると云うことを確 認するために、限定酵素分析（もし突然変異がサイトを創生ずるかまたは破壌す るなら）、対立遺伝子特定増幅、異種ヌクレオチド交雑、化学的細胞分割［コツ トンら、　Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａ１Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、、８５・４３９７〜４４０１．（＋９８５）　］　、ゲル 電気泳動法勾配変性［マイヤーズ（ＭＹｅｒｓ）及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）、Ｃ＋姐工」江二υ」−工肛上幻肛一Σび１二（ハ）ａｎｔ、Ｂ上１工盈 辷」ズ（Ｍｙｅｒｓ）、　Ｒ，Ｍ、　、　ララン（Ｌａｒｉｎ）、Ｊ、、および マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２．（１ ９８５＞　］又はＤＮＡ配列法など適当な手段によって、正常及び影響を受けた 個体の両方におけるそのような配列偏倚を調べなければならない、ＨＲＲ蛋白の アミノ酸構成を変化させ、多くの影響を受けた個体に起り正常個体では決して起 らない偏倚は、確実に突然変異を表現させる。突然変異に密接に結びついた多形 のマーカーのセグレゲーションと云うような別の説明は、共通のＭＨハブロタイ ブが観察されていないことから本当らしくない。

突然変異が確認されたら、さらに診断テストが行われる。

ＨＲＲ遺伝子のためのイントロン−エクソンい口Ｌｒ。

ｎ−ｅｘｏｎ）境界を決定するのにゲノムクローンのＤＮＡ配列が実施される。

これらが確立されると、ｃＤＮＡよりはＤＮＡから増幅が可能となり、筋肉生検 試料が得られない患者に対する検討を可能とし、そして、その検討を拡張して各 々の突然変異が定義される他の多くの患者を含めることが可能となる。そのよう な応用は又、イントロン中又はイントロン／エクソン境界におけるメツセージの 組み継ぎに影響する突然変異を検出可能とさせ、ｃＤＮＡに基く分析からのみ推 論される異常蛋白へ導く。

ＭＨに対する一般的診断テスト開発の容易性は１ＭＨフェノタイプを生じさせる 遺伝子中の突然変異の数によって決まる。各突然変異が追跡されたら、個体がみ られるファミリー中のすべての個体及び突然変異をわかつ他の個体において有用 なテストが行われる。

診断］二の生検を提供する患者のために共通な突然変が選び取られ、そして、一 旦コスト・時間に有効な割合のＭＨ個体からなる突然変異又は複数の突然変異が 記載されると、一般的なポピユレーションテストが行われ得る。

ここで述べたヒトにおけるＲＦＬＰを利用する遺伝子分析様式は豚にも適用でき る。異種交配種のハイブリダイゼーション法によればヒトのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用 いて豚のＲＦＬＰを直接検出できる。豚のＧＰＩのｃＤＮＡ及びＧＰＩ遺伝子に より検出されるＲ　Ｆ　Ｌ　Ｐは、この種の分析方法で巧みに利用されているＨ ａｌ（Ｍ＋−１）と密接に結合している。［デービス、ダブリユウ。

エトアル、アニマルジェネティクス（Ｄａｖｉｓｅｓ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、＾ｎｉ ｍａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９：２０３−２１２．（１９８９）］Ｈａｌは豚 のストレス症候群（ＰＳＳ）及び青白く、柔らかい滲出性の豚肉（ＰＳＥＰ”） の原因となる遺伝子として示されている。ｐｓｓ及びＰＳＥＰは畜殺直後から２ 時間後の筋硬ａ　（ｍｉｏｌａｃｔｏｓｉｓ）に起因する好ましくない肉質の原 因となる。このことは北アメリカ及びヨーロッパに於ける深刻な経済問題であり 、合衆国のみでも年間３億ドルの損失と言われている［Ｈａｒｒｉｓｉｏｎ、Ｇ 、Ｇ、、　”Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｉ（ｙｐｅｒＬｈｅｒｎｉ ａ、ｔｈｅＳａｇａ　ｏｆ　ｔｈｅ　１（ａｔ　Ｐｉｇ”　、ｉｎ　Ｂｒ１ｔｔ 、Ｂ、＾、、Ｅｄ、Ｍ）已マ幻す」ｔ　Ｈｅｒｔｈｅｒｍｉａ、Ｂｏｓｔｏｎ、 Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ、１０３−１３６．（＋９８７）］、　Ｄ　 ＮＡ診ｔＦｉ法ハ特１：’ｔ￥Ｗ計画＋ニオｉｔ６Ｍ　Ｈ状態を決定するのため の安価で信頼できる手段を提供するものである。又、ＤＮＡ診断法は有益な特徴 を保ちなからＨａｌ特性を排除することを目的とする育種計画の設計に役立つも のである。豚におけるＲＦＬＰ分析は幾つかの種族からＨａｌ遺伝子を排除する ことが可能となり、産業上、相当の節約となる。

ここで開示されたようにヒトのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは、ホモ接合の正常な豚 からもホモ接合の冑された豚からも豚のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを単離するため に使用することができる。従って、２つの遺伝子のシーケンスを各々の染色体の 突然変異を確定するために比べることができる。一旦、これらが確認された後は 、豚の突然変異の確実性を試すために及び／又は豚の突然変異を診断するために 上記方法に似た試験法を＃１発することができる。これら突然変異の知識は、病 気に冒されたヘテロ接合の豚の同定をＲＦＬＰ分析に頼らずに行う度が稀な病気 の豚の同定を含む診断方法の有用性を広げるものである。

正常及び変異体ライアノジン受容タンパク質に於ける差を検出するために利用で きる特別なペプチドシーケンスに対するポリクロナール又はモノクロナール抗体 を開発することも可能である０ＭＨＭ体（ヒトも豚も）はタンパク質シーケンス の１ｕｌｌが欠損したり、置き替わった構造を持っていると考えれる。タンパク 質融解抗原を生成するために及び／又はペプチド抗原を合成するために及び特別 なセグメントに対する抗体を生じさせるために、ペプチドシーケンスの特殊なセ グメントを利用することが可能である。置き替わったシーケンス（変異体ＭＨ） よりかようにして生じた抗体は、筋肉内で抗原と反応するので、ヒトのＭＨ個体 、ＭＨ豚及びヘテロ接合豚の筋肉部において圧の免疫染色（１ωｍｕｎｏｓｔａ ｉｎｉＢ）を示す、正常なヒト又は啄個体においては染色は観察されない、正常 なペプチドから生じた抗体の使用によりホモ接合の冒された豚からヘテロ接合の 豚を識別できる。同様に、これらの反応は、より感度の良い技術であるところの 筋肉タンパク質の抽出物のウェスタンブロッティングにより観察されるここに開 示されたＤＮＡ配列は、活性分析及び抗体形成のためのタンパク質の大量の発現 及び形成のために操作され得る。ＨＲＲのため（二晴号化する部分または全長ｃ 　ＤＮＡ配列は、細菌発現ベクターに結さつされるかも知れない、ＤＮＡはまた その存在する前後関係から、他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、 動物ヴイールス、イースト人工染色体、体細胞のような他のクローン化媒体、及 びバクテリア、糸状菌、無を椎動物または植物のような他の単純または複雑な有 機体へ転写できる。ｃＤＮＡ配列（またはその一部分）またはミニジンは真核発 現ベクターに標準的技術によって導入できる。その発現ベクターはまたトランス フェクション、燐酸カルシウムまたはストロンチウム沈澱法、エレクトロポレー ション、ミクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはヴイールスベク ターなどの通常の技術によって受領細胞に導入できる。

ＨＲＲタンパク質のさまざまなエピトープに対する抗体はそのタンパク質の特徴 における広範な情報及び免疫測定に使用できる他の重要な情報を供給するために 高めることができる。その抗体はＨＲＲポリペプチドの明らかにされた部分を含 む融合タンパク質に高められ、または化学合成によって製造されるタンパク質フ ラグメントに高められる。すでに示したように、融合タンパク質は寄主に適合す るベクターの発現によって発生させられるかも知れない、タンパク質の化学的合 成に対してのように、これは当業者によく知られた技術である。

アフィニティークロマトグラフィーによって発生され得る精製されたタンパク質 とともに、そのタンパク質フラグメントは適当なキャリアタンパク質に結合され 、ウサギに注射される。そのタンパク１質フラグメントに対して免疫性を与えら れたウサギの血清はポリクローンの抗体を取り出すために標半的方法によってふ るい分けられる。よく知られた技術によって、モノクローンの抗体はＫｏｈｌａ ｒとＭｉｌｌｓｔｅｉｎの方法論によってもまた取り出せる（Ｎａｔｕｒｅ、２ ５６：４９５（＋９７５））、　ハツカネズミは適当なキャリアと接合されたよ うな選ばれたタンパク質によって免疫性が与えられる。ハイブリッドマスは所望 のモノクローンの抗体を選び出すために発生させられ、ふるい分けられる。ポリ またはモノのどちらかの抗体はタンパク質のあるエピトープの存在を検出するた めに診断決定に用いられる。

ＤＮＡ配列はまた比較機能発現研究のために部位管理された突然変異生成を行わ せても良い、ヒト及びブタ突然変異体の性質が非常に異なるのであれば、ヒト（ 優性）及びブタ（共優性（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ））におけるＭＩ４の遺伝の異 なるモードによって暗示されるように、より密接に各ヒト突然変異体に似ている 動物モデルを作り出すことが望まれるかもしれない、未発達な幹細胞における同 −源の再結合と同時発生的な部位管理された突然変異生成によって、あるいはト ランスジェニックアニマルを創造するためのレトロヴイールスベクターの使用に よって到達できる。

実施例１ ラビット骨格筋肉のＣａＺ＋複合分離チャンネルが、［３１１］リアノジンに結 合して濃縮され、ＣＨＡｌ’Ｓ中で可溶化され、４５Ｃａ２十分離活性され、更 に５〜２０％スクロースを用いる密度階調遠心分離に依って、重質サルコブラス ミック細網膜から単離された。

（Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ、、目」） ［３）１］リアノジンレセブターピークが収集され、濃縮されて再度遠心分離さ れた。

プールされた［３１（］リアノジンレセブターピークの５〜２０％線状ポリアク リルアミド階調ゲル」二の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析は、約４００， ０００　ダルトンの見掛は相対分子量を有する単一の主高分子量帯域を示した。

（Ｌａｉ　ａｔ　ａｌ、、１且２工Ｊ）このように、リアノジンレセブターは、 本性に依って分離され精製された。

親水性トリブチツクペプチドは、精製リアノジンレセブターから相反転ＨＰ　Ｌ 　Ｃに依り分離され、フェニルチオヒダントイン誘導体分析用のオンライン式１ −Ｉ　ＰＬＣシステム付きの＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７０ガス 相配列決定装置で、Ｅｄｍａｎ分解に依り自動式ＮＨ２−ターミナル分析にかけ られた。

実施例２ λｇｔ、１ｌｃＤＮＡ標示ライブラリーは、Ｅｌｌｉｓ、Ｓ、Ｂ。

ｅｔ　ａｍ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６６１−１６６４．（１９８８）の記 載のように、ラビット迅速痙章ｐｓｏａｓ筋肉からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡか ら構築された。

既知の方法に依る骨格筋肉からのライブラリーは、何れも組織中に存在するＲＮ Ａ種を象徴すべきものであり、従って単離されるべきクローンの供給源となり得 るものと当業者では理解されている。

ライブラリーは、親和力精製されたＣａＺ十分離チャンネル用の特殊な多クロー ン性抗体（Ｚｏｒｚａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、鉦囮）にふるい分けされた。

ライブラリーのふるい分けは、Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、Ｐｒ工免」ち １工Ａｃａｄ工Σ立Ｌ２匹」Ｌノエ８０・＋１９４−１１９８．　（１９８３） の方法で実施された。

３Ｘ１０８に再連結されたクローンのふるい分けで、第２図でのヌクレオチド１ ４２８０〜＋４６２９及び１３４３４〜＋３７５８に依り決定された領域の二個 のｃ　Ｉ）　Ｎ　スクリーンに分別された。

これらクローンの配列解析は１両者共ヒトｃ　ＤＮＡの線状配列と対比されて再 調整された。

即ち、これらの分別されたｃ　ＤＮＡクローンからの制限エンドヌクレアーゼフ ラグメントは、既にＭａｃＬｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、、■［が述ぺているよう に、より長く、且つ新生児ラビットの骨格筋肉のｃ　ＤＮＡライブラリーからの 再調整されないｃ　ＤＮＡクローンを分別するためのプローブとして用いられた 。

得られたクローンの最も長いものは、第２図でのヌクレオチド８６１５〜＋５２ ４１により６．８ｋｂとされた。

このクローンは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドベ クターにサブクローンされ配列された。

このクローンは、新生児ラビット筋肉ｐｏｌｙ（Ａ）十ＲＮＡの１１００ｕを用 いてブライマーエクステンションライブラリーの構築に依って伸展された。

プライマーの部位は、第２図のヌクレオチド９１１８〜９１３５に相当する０、 ２５ｎモルの１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて決定された。

ブライマーイクステンションは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓのｃＤＮＡ合成キットを用いて行ったｖｉＬｒｏ　ｐａｃｋ ａｇｉｎｇ　を、Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘＬｒ ａｃｊ　を用いて、各　１ｉｇａｔｉｏｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅの１〜２１目につい て行った。

続いて、増幅されていないライブラリーに就いてスクリーニングを行った。

第一ブライマーイクステンションでは、ｃ　ＤＮＡがヌクレオチド４５２７まで 伸展した。

第二イクステンションでは、第２図での残部４８９２〜４９０９に相当するラビ ットの１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドが、ｃ　ＤＮＡをヌクレオチド３２３１へ 伸展させる為に使用された。

第三及び最終のブライマーイクステンションでは、第２図での残部３４９９〜３ ５１６相当のラビットの１８ｍａｒオリゴヌクレオチドが、配列をｍ　ＲＮ　Ａ の翻訳されていない５′部位へ伸展させる為に使用された。

実施例３ ラビット　ライアノダイン　レセプター　ｃ　ＤＮＡ試料がλｇｔｌｏ中の人骨 格筋ｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーンするために使用された１Ｍ、ケーニッ ヒ（Ｋｏｅｎｉｇ）等のセル（Ｃｅｌｌ）５０巻５０９−５１７（１９８７年） 掲載の方法である。！＆初のスクリーンにおいて、３０以上のクローンを単離し 　その１種のみが内部ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを有しており、この物資は約２ ０００ｂｐであった。（図中のクローン２参照）それ以外の全てはポリ　（Ａ） サイトから＋６４１ｂｐ上流のＥｃｏＲ１制限酵素サイトで終了している。この ことはライブラリーを作るために使われたｃＤＮＡがメチル化十分されておらず 、λｇｔｌｏベクター中に結紮する前に全長のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩサイトで分 裂させていることになる。したがって、まずラビットｃ　ＤＮＡクローンを単離 することが必要であり、その後に同定用の試料としてそれを使用し、新しい人ｃ ＤＮΔクローンを単離することが必要である。！終的には一連の６種のｃＤＮＡ クローンがラビットｃ　ＤＮＡ試料を使用してライブラリーから単離された０人 ｃＤＮＡクローン単離のための複雑な作某のなかで、図２中の基８５０１と８５ １２間にあるアデニン豊富区分がｃＤＮΔ合成にあっては第二プライマー付けの サイトの役を果している。このことはこのサイトのクローン上流の多数の合成を 導出しているが、これは転写を終結させてもいる。したがって、図１中のクロー ン４および５が分離されており、ただし、ＥｃｏＲ１サイトによってではなく、 ｃＤＮＡ中の実際上のギャップによる。クローン６はライブラリーから分離され た最後のｃ　ＤＮＡであって、内部ポリ（Ａ）サイトでプライマーでプライム付 けされたｅ　Ｄ　Ｎ　Ａの５′未満を示している。最終クローン、クローン７は 人骨格筋のｍＲＮＡからプロトコルを使って構築されたプライマー延長ライブラ リーから得られた。ただしこれらプロトコルはラビット骨格筋ｍ　ＲＮ　Ａのプ ライマー延長のために使用されたのである。二の場合には図２に示すように、基 ２６２０を２６３６を修飾する１７の構成より成る。オリゴヌクレオチットであ る各種のＥｃｏＲ１制限酵素のサイトを重ねあわせているゲノムのＤＮＡコーヂ ングした系列および第二のプライマー開始サイトによって導入されているｃ　Ｄ ＮＡ中のギャップは染色体の１９特異的ライブラリーから単離された。その時ア メリカンタイプカルチャーコレクション、（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）メリーランド州ロツクヴイル（Ｍａｒｙｌａ ｎｄ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）によってローレンスリバーモア（Ｌａｗｒｅｎｃｅ 　１．ｉｖｅｒｍｏｒｅ）ＬＬＩ９ＮＬＯ１人染色体１９ライブラリーｉｎ　Ｃ ｈａｒｏｎ　４　Ａと命名された。

実施例４ 筋肉をクランプし、慎重に採取し、実験室のカルボジエン化した。２２℃、ｐ） １７．４に維持したクレプスリンゲル溶液中に移す、その溶液中で生検試料から 脂肪を取り除き、幅１〜５ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、重さ１００〜３００ｍｇ の細片に分割する。未処理の筋肉片のみを利用した。筋肉片をプラスチック電極 枠に絹製の縫線によって固定し、３７℃、　ｐｌ＋７．４のタレブスリンゲル溶 液を含んでいる４０ｍ１の溶液に浸して、９５％の酸素、５％の二酸化炭素の気 体を通気した。筋肉片の他端は筋肉張力を測定するために使用するポリグラフに 結合されている力遷移トランスデユーサ−に固定されている。

この発明の好ましい実施態様は詳細にこのなかに記載されているが、本発明の精 神、あるいは添付の特許請求の範囲の視点から逸脱することなく、変更をこれに 加えることは当業者には容易に理解できることである。

９７−　白） 喝　５ｒ上 ・　ｅ　Ｏ・　・　・　・　Φ　・　・　・嗜　・ａｓ　ｅｘ　・０・・　＾・ 　−・　−・　・０　・・　匈・　−・　ψ０　・・　・０　軸管　響・　啼＾ ・６ｍ管　・・　−Ｎ　御−＃Ｑ　＃響　−・　−＾　・惨　・ａｄ６　＾０　 内−ミリ　−噛　Ｈ−Ｎｌ＋　Ｈ１＋　轡−−・　内―　鍔−＾―　内−＾−＾ −＾−・Ｏ・・　・・　・・　＠６　ｍ＠　・り　・ＯＯＯ・・　・ゆ　ｅ・　 ・ＯａＯ・−ＯＯ匈ψ　雫＠　嘘〜　−ｄ　（１６Ｎ＃　ｅ−暢へ　・暢　・０ １！　９睡ス＝：＝　二＝　ス＝　士＝：＝；二　’：　＋　：＋＋　９ｍ　Ｑ ｌ＋＋　＄＋　＃−。−６０ＯＯ・ａ　ｉｓ６　＠６　８６　＠６　６６　＠６ 　ｅａ　：＠　：：　：：　：：；＝：讐　ニス　：；　言：　：：　：：：　 ：：：　：：　：ｗ　ａ：　＋ｌ−＃＋　−・−Ｎ　ゆ四　Ｉ＋ＮＩ＋Ｎ−内　 −Ｎ　かへ　轡“　ト〜　ト“　・〜　−内　・〜　“〜・６　＠ｇＩ　Ｎａ　 曽ＯψＯ＠ロ　ａａ　〜Ｏ−Ｏ曹Ｏ・６　１＋１６　Ｍ〜　！Ｍ：：：：ミ　＝ ＝　ＨＨ三＝＝＝＝ミ　三：　：：：　：：　＋：：　：補正書の写しく翻訳文 ）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年３月２５日 ２、発明の名称 悪性高熱病の診断法 ３、特許出願人 ザ　ユニヴアーシティー　オブ　トロントイノヴエーションズ　ファウンデーシ ョン（ほか２名） ４、代理人 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番２０号」 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 浄書（内容に変更なし） 請求の節回 １、ヒト　リアノジン　レセプター　をコードする精製されたＤＮＡ配列であっ て、 １）５０３２のアミノ酸および約５６３．０００ダルトンの分子量を有するタン パク質をコードする前記ＤＮＡ　。

ｉｉ）約１５．３ｋｂの長さを有する前記ＤＮＡ　。

１ｉｉ）ヒトのクロモツム１９から単離されたこと；および ｉｖ）図１のリストリクジョンマツプ により特徴付けられるＤＮＡ配列。

２　図２のアミノ酸位置１乃至５０３２をコードする配列を有する精製されたｃ ＤＮＡ。

３、　請求項１．２または３の前記ＤＮＡのフラグメントを含むＤＮＡプローブ 。

４、　適切なラベルが前記ＤＮＡフラグメントに付けられ、ＤＮＡブローブアセ イの中でハイブリダイゼーションを示す請求項３のＤＮＡプローブ。

５、　ｉ）図２のヌクレオチド１３６０２乃至１５２４３をスパンする約１．６ ｋｂのＨＲＲ−１：ｉｉ）図２のヌクレオチド１１６１３乃至１３６０７をスパ ンする約２ｋｂのＨＲＲ−２；１ｉｉ）図２のヌクレオチド８５１５乃至１１６ エ８をスパンする約３．１ｋｂのＨＲＲ−３；ｉｖ）図２のヌクレオチド８５１ ５乃至９５５４をスパンする約１ｋｂのＨＲＲ−３−１０００。

Ｖ）図２のヌクレオチド９５４９乃至１０８５１をスパンする約１．２ｋｂのＨ ＲＲ−３−１２００。

ｖｉ）図２のヌクレオチド６１２５乃至８４９３をスパンする約２．４ｋｂのＨ ＲＲ−４。

ｖｉｉ）図２のヌクレオチド２３９１乃至６１３５をスパンする約３．８ｋｂの ＨＲＲ−５。

ｖｉ　ｉ　ｉ）図２のヌクレオチド１８６乃至２３９６をスパンする約２．２ｋ ｂのＨＲＲ−７Ａ　、およびｉｘ）図２のヌクレオチド１０４乃至５４９をスパ ンする約０．４ｋｂのＨＲＲ−７Ｂ から成るＤＮＡ配列の群から選ばれた１またはそれ以上のＤＮＡ配列を含むＤＮ Ａプローブ。

６、　有害な（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　）ハイパーテルミアに対して無抵抗な（ｓ ｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　）ファミリーのメンバーを検出するファミリーのＲＦＬ Ｐ分析を行う用途のための請求項５の選択された前記ＤＮＡプローブ。

７、　フラグメントまたは全体の請求項１または２のＤＮＡ配列を含むクローニ ングベクター。

８、ＤＮＡを表示するためアダブトされ、対応するコードされたタンパク質を生 成する適切なホストであって、フラグメントまたは全体の請求項１または２のＤ ＮＡ配列を含むベクターをクローニングすることを特徴とするホスト。

９、請求項１又は２のＤＮＡ配列のフラグメント又は全部を含む組換え体ベクタ ーの発現に用いられる適当なホストを培養することにより産生され、かつ、発現 された蛋白質又はアミノ酸フラグメントが図２の全長さの蛋白質又はアミノ酸フ ラグメントに対応しているヒト・リアノジン受容体蛋白質又はそのアミノ酸フラ グメント。

１０、分子量約５６３，０００ダルトンで図２のアミノ酸配列を有するいかなる 異種ヒト蛋白質も含まない純粋なヒト・リアノジン受容体蛋白質。

１１、請求項１０のヒト・リアノジン受容俸のアミノ酸配列を持つ蛋白質である アミノ酸配列を有する異種ヒト蛋白質を含有しない純粋蛋白質フラグメント。

１２、請求項１１の蛋白質フラグメントに特異性のある純粋な抗体。

１３、ポリクローナル抗体である請求項１２の抗体１４、モノクローナル抗体で ある請求項１２の抗体１５、悪性過温症に対し感受性のある人を１Å以上有する 家系で悪性通温症に感受性のある人を検出する、以下のステップより成るＤＮＡ 診断アッセイ。

（ア）被検者の少なくとも染色体１９からＤＮＡを単離し。

（イ）請求項５の選択されたＤＮＡプローブをＲＦＬＰ分析のＲＦＬＰマーカー として用いて、該単離した染色体１９ＤＮＡをＲＦＬＰ分析に付し、（つ）該被 検者が悪性通温症に感受性かどうかを感受性のある家系のもののＲＦＬＰ分析と のリンケージを検出することで検査する。

１６、ブタにおける悪性過温症を検査するために。

請求項５の選択されたＤＮＡプローブを１つ以上を使用する方法。

１７、検体が悪性過温症に感受性かどうかを検査するためのイムノアッセイにお いて請求項１２の抗体を使用する方法。

手続補正書（方式） ％式％ ｌ、事件の表示 平成２年　特許願　第５１３２０８号 ＰＣＴ／ＣＡ９０１００３１２ ２、発明の名称 悪性高熱病の診断法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ザ　ユニヴアーシティー　オブ　トロントイノヴエーションズ　ファウ ンデーション６、補正命令の日付 発送日：　平成４年１１月１７日 ７、補正の対象 タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文 ８、補正の内容 手続補正帯（方式） 平成４年１２月１６日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトリアソジンレセプターをコードする実質的に精製されたＤＮＡ配列であ って、１）５０３２のアミノ酸および約５６３，０００ダルトンの分子量を有す るタンパク質をコードする前記ＰＮＡ：ｉｉ）約１５．３ｋｂの長さを有する前 記ＤＮＡ；およびｉｉｉ）ヒトのクロモソム１９から単離されたことにより特徴 付けられるＤＮＡ配列。
2. ２．前記ＤＮＡが図１のリストリクションマップを有する請求項１のＤＮＡ。
3. ３．図２のアミノ酸位置１乃至５０３２をコードする配列を有する実質的に精製 されたｃＤＮＡ。
4. ４．請求項１，２または３の前記ＤＮＡのフラグメントを含むＤＮＡプローブ。
5. ５．適切なラベルが前記ＤＮＡフラグメントに付けられ、ＤＮＡプローブアセイ の中でハイブリダイゼーションを示す請求項４のＤＮＡプローブ。
6. ６．ｉ）図２のヌクレオチド１３６０２乃至１５２４３をスパンする約１．６ｋ ｂのＨＲＲ−１； ｉｉ）図２のヌクレオチド１１６１３乃至１３６０７をスパンする約２ｋｂのＨ ＲＲ−２； ｉｉｉ）図２のヌクレオチド８５１５乃至１１６１８をスパンする約３．１ｋｂ のＨＲＲ−３； ｉｖ）図２のヌクレオチド８５１５乃至９５５４をスパンする約１ｋｂのＨＲＲ −３−１０００； ｖ）図２のヌクレオチド９５４９乃至１０８５１をスパンする約１．２ｋｂのＨ ＲＲ−３−１２００；ｖｉ）図２のヌクレオチド６１２５乃至８４９３をスパン する約２．４ｋｂのＨＲＲ−４； ｖｉｉ）図２のヌクレオチド２３９１乃至６１３５をスパンする約３．８ｋｂの ＨＲＲ−５； ｖｉｉｉ）図２のヌクレオチド１８６乃至２３９６をスパンする約２．２ｋｂの ＨＲＲ−７Ａ；およびｉｘ）図２のヌクレオチド１０４乃至５４９をスパンする 約０．４ｋｂのＨＲＲ−７Ｂ から成るＤＮＡ配列の群から選ばれた１またはそれ以上のＤＮＡ配列を含むＤＮ Ａプローブ。
7. ７．有害な（ｍａｌｌｇｎａｎｔ）ハイパーテルミアに対して無抵抗な（ｓｕｓ ｃｅｐｌｉｂｌｅ）ファミリーのメンバーを検出するためファミリーのＲＦＬＰ 分析を行う用途のための請求項６の選択された前記ＤＮＡプローブ。
8. ８．フラグメントまたは全体の請求項１，２または３のＤＮＡ配列を含むクロー ニングベクター。
9. ９．ＤＮＡを表示するためアダプトされ、対応するコードされたタンパク質を生 成する適切なホストであって、フラグメントまたは全体の請求項１，２または３ のＤＮＡ配列を含むベクターをクローニングすることを特徴とするホスト。
10. １０．請求項１，２又は３のＤＮＡ配列のフラグメント又は全部を含む組換え体 ベクターの発現に用いられる適当なホストを培養することにより産生されるヒト ・リアノジン受容体蛋白質又はそのアミノ酸フラグメント。
11. １１．分子量約５６３，０００ダルトンで図２のアミノ酸配列を有するいかなる 異種ヒト蛋白質も含まない、実質的に純粋なヒト・リアノジン受容体蛋白質。
12. １２．請求項１１のヒト・リアノジン受容体のアミノ酸配列をもつ蛋白質である アミノ酸配列を有する異種ヒト蛋白質を含有しない蛋白質フラグメント。
13. １３．請求項１２の蛋白質フラグメントに特異性のある実質的に純粋な抗体。
14. １４．ポリクローナル抗体である請求項１３の抗体。
15. １５．モノクローナル抗体である請求項１３の抗体。
16. １６．悪性過温症に対し感受性のある人を１人以上有する家系で悪性過温症に感 受性のある人を検出する以下のステップより成るＤＮＡ診断アッセイ。 （ア）被検者の少なくとも染色体１９からＤＮＡを単離し、 （イ）請求項６の選択されたＤＮＡプローブをＲＦＬＰ分析のＲＦＬＰマーカー として用いて、該単離した染色体１９ＤＮＡをＲＦＬＰ分析に付し、（ウ）該被 検者が悪性過温症に感受性かどうかを感受性のある家系のもののＲＦＬＰ分析と のリンケージを検出することで検査する。
17. １７．プタにおける悪性過温症を検査するために、請求項６の選択されたＤＮＡ プローブを１つ以上を使用する方法。
18. １８．検体が悪性過温症に感受性かどうかを検査するためのイムノアッセイにお いて請求項１３の抗体を使用する方法。