JPS62501327A - 家族的高コレステロ−ル血症の検知方法および検知用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 家族的高コレステロール血症の検知方法および検知用組成物 本発明は、高コレステロール血症、アテローム硬化症および最終的に心臓疾Φを 発病する遺伝学的疾病素質を診断する際に有用な方法および組成物に関する。更 に詳しくは、本発明は、家族的高コレステロール血症を有すると疑われる人に突 然変異低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）受容体遺伝子が存在するかを調べる為の有用 なプローブとして役に立つ組換えＤＮＡ分子に関連している。

アメリカ合衆国における全死亡数の半数は、アテローム硬化症に起因している。

アテローム硬化症は、動脈の壁に蓄積したコレステロールが、最終的に血餅が形 成されるまで血液の流れを阻害するかさ高いプラークを形成し、動脈をふさぎ、 心臓発作を引き起こす疾病である。アテローム硬化症性プラークのコレステロー ルは、血流中を循環している低密度リボ蛋白質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）と呼ばれる粒子か ら誘導される。血液中にＬＤＬがより多く存在すると、アテローム硬化症がより 速く発病する。

疫学的データによると、アメリカ合衆国を含む西側先進工業国に住む人々の半数 以上は、アテローム硬化症を発病する非常に高い危険性にさらしている程のＬＤ Ｌ循環水準を有しているという、驚くべき事実が判明した。そのような濃度が一 般的である為、それが「正常」であると考えられているが、明らかに実際には正 常ではない。人々は、加速的にアテローム硬化症および心臓発作に向かう傾向に ある。

何故多くのアメリカ人についてＬＤＬレベルが危険なほど高いかという点に関す るいくつかの答えが、ＬＤＬ受容体とよばれる特別な蛋白質の研究から得られて いる。この受容体は、動物細胞の表面から突出している。受容体は、ＬＤＬ粒子 を結合し、細胞を浸している液体から粒子を抽出する。ＬＤＬは細胞に取り込ま れ、破壊されてコレステロールを生成して各細胞の要求を満たす。細胞にコレス テロールを供給すル場合、受容体は、アテローム硬化症を防止するのに重要であ る第二の生理学的機能をはたす。すなわち、受容体は血液流からＬＤＬを除く。

細胞の表面に存在する受容体の数は、コレステロールに対する細胞の要求により 変化する。要求が少ないと、過剰のコレステロールが蓄積し、細胞はより少ない 数の受容体を作り、低い速度でＬＤＬを取り込む。これにより、細胞は、過剰の コレステロールから守られるが、犠牲も大きい。受容体の数の減少は、循環系か らＬＤＬが除かれる速度を低下させ、ＬＤＬの血中濃度が高くなり、アテローム 硬化症が加速される。

多くのアメリカ人における高いＬＤＬ濃度は、ＬＤＬ受容体の生産を減少させる 要因の組み合わせに原因していると言われてきた。受容体の中心的役割が認識さ れたので、アテローム硬化症の激しい遺伝学的形態を治療することになり、一般 的な住民におけるアテローム硬化症に対する食事制限の役割に関する論争に光を 投げかけることになった。

ＬＤＬは、油状液がそれぞれ長鎖脂肪酸にエステル結合で結合している約１５０ ０分子の脂肪アルコールコレステロールから成る大きい球状粒子である。コレス テロールエステルのこの核は、リン脂質および非エステル化コレステロール分子 の層の中に包囲されている。リン脂質は、それらの親水性頭部が外側になるよう に配列されており、ＬＤＬが血液または細胞間液に溶解するのを可能にしている 。この親水性被覆に埋まっているのは、アポ蛋白質Ｂ−１００と命名された１つ の大きい蛋白質分子である。

ＬＤＬ受容体、糖蛋白質（糖鎖が結合されている蛋白質）により認識され結合さ れるのはアポ蛋白質Ｂ−１００である。受容体は、細胞のプラズマ膜の厚さに広 がり、細胞表面から突出する結合部位を担持している。結合は、ＬＤＬカ月０− ９Ｍ以下の濃度で存在する場合に起こる。即ち、受容体は、十億個以上の水分子 から１つのＬＤＬ粒子を拾い出すことができる。受容体は、アポ蛋白質Ｂ−１０ ０またはアポ蛋白質Ｅと命名された関連蛋白質を担持しているリボ蛋白質のみを 結合する。

１９７６年、細胞膜が（下にある膜の内表面が蛋白質クラスリン（ｃｌａｔｈｒ ｉｎ）により被覆されている故に）被覆ピットとして知られているクレイターを 形成しようとする特別な領域において、ＬＤＬ受容体がクラスター化することが 発見された。形成から数分以内に、ピットは細胞内に取り込まれ、表面から切り 離されて、被覆小異と呼ばれる膜境界嚢を形成する。受容体に結合されたＬＤＬ は、細胞内に運ばれる。被覆ピットおよび嚢により取り込まれるこの方法に適用 される用語である受容体仲介エンドサイトシスは、細胞が、それぞれ非常に特異 的な受容体を有する多くの大分子を取り込む一般的な機構として認識されている 。

最終的に、ＬＤＬは受容体から分離され、（受容体は細胞表面へ再循環され）、 ＬＤＬは、消化酵素が詰まっている嚢であるリソソームへ移送される。酵素の一 部はＬＤＬの被覆を破壊し、コレステロールエステル核を露出させる。他の酵素 は、コレステロールエステルの脂肪酸尾部を切り取り、非エステル化コレステロ ールを遊離さ什、これがリソソームを離れる。全細胞は、新たに合成された表面 膜にコレステロールを組み込む。ある特殊な細胞では、ＬＤＬから引き出された コレステロールは、別の役割を持っている。副腎および卵巣では、コレステロー ルはステロイドホルモンコルチソールおよびエストラディオールにそれぞれ変換 され、肝臓では、コレステロールは、腸での消化作用をもつ胆汁酸を生成するよ うに変換される。

アテローム硬化症におけるＬＤＬ受容体の中心的役割は、１９７４年に初めて認 められ、受容体の欠如は、家族的高コレステロール血症（ＦＨ）と呼ばれる激し い疾病に原因することが示された。それよりずっと以前、１９３９年に、ノルウ ェーのオス口・コミユニティ・ホスピタル（Ｏｓｌｏ　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　Ｈ ｏ５ｐｉｔａｌ）のカール・ミュラー（Ｃａｒｌ　Ｍｕｌｌａｒ）は、こ・の病 気は、血中の高コレステロール水準および若年層に心臓発作を引き起こす先天的 代謝異常であると考え、単一の遺伝子により決定される優勢素質として伝達され ると認識した。１９６０年代に、この病気の２つの型、すなわち異型接合型およ びより激しい同型接合型が報告された。異を接合体は、１つの突然変異遺伝子を 遺伝されており、全く一般的である。多くの人種では、５００人当たり約１人で ある。彼等のプラスマＬＤＬ水準は、（誕生以前でさえ）正常水準の２倍であり 、３５歳になるまでに心臓発作に襲われ始める。心臓発作を患っている６０歳以 下の人の内、２０人に１人は異型接合性ＦＨである。

ＦＨ異型接合体の２人が結婚すると（２５００００組に１組）、子供の４人に１ 人は、突然変異遺伝子の２つのコピーを（それぞれ１つを両親それぞれから）遺 伝される可能性がある。そのようなＰＨ同型接合体（１００万人に約１人）は、 普通より６倍以上高い循環ＬＤＬ水準を持ち、２歳から心臓発作を起こすことが あり、２０歳までに心臓発作を起こすことはほとんど避けられない。このような 子供は、高いＬＤＬ水準以外アテローム硬化症の危険因子を有していないことは 注目すべきである。彼等は正常な血圧を持ち、喫煙せず、グルコースの高血中濃 度を持たない。同型接合性ＦＨは、自然の活発な実験である。それは、明らかに 、高いＬＤＬ循環水準とアテローム硬化症の因果関係を示している。

家族的高コレステロール血症を持つ異型接合体は、へその緒からの血液ブラスマ が２倍から３倍高い濃度でＬＤＬ−コレステロールを含んでいるから、しばしば 誕生時に疑うことができる。ブラスマＬＤＬの高い水準は、−生続くが、典型的 には症状は３０代または４０代まで現れない。最も重要な治療的要件は、早期か つ加速的冠状アテローム硬化症である。心筋梗塞が、３０代で男性患者に起こり 始め、４０ないし５０代で発生率がピークになる。６０歳では、約８５％が心筋 梗塞を経験している。女性では、心筋梗塞の発生率はやはり増加するが、開始平 均年令は男性に比べて１０年遅い。家族的高コレステロール血症の異型接合体は 、心筋梗塞患者の約５％を占めている。

鍵黄色腫が、異型接合状態の第２の主要な臨床的兆候である。黄色腫は、アキレ ス社およびひざ、ひじならびに手の甲の周囲の他の社を含む結節腫脹である。そ れは、ＬＤＬ由来コレステロールエステルが間隙空間に存在する組織マクロファ ージに堆積することにより形成される。マクロファージは、脂質小滴により腫脹 され、フォウル（Ｊｏａｌ）細胞を形成する。コレステロールは、まぶたの軟組 織にも堆積し、黄色腫を発生させ、角膜にはリポイド環角膜をもたらす。社黄色 腫は、家族的高コレステロール血症の本質的な兆候であるが、黄色腫およびリポ イド環角膜は、特異的ではない。後二者の異常は、正常なブラスマ脂質レベルの 多くの成人にも生じる。家族的高コレステロール血症における社黄色腫の発生率 は年令と共に増加する。最終的には、異型接合性患者の約７５％がこの兆候を示 す。

同型接合性患者は、誕生時から、著しく高いプラスマ中のＬＤＬ水準を示す。独 特の型の平面的皮膚黄色腫は、しばしば誕生時に存在し、寿命の最後の６年には 常に現れる。このような皮膚黄色腫は、ひざ、ひじおよび尻の上などのような皮 膚の外傷部分に生じる、盛り上がった黄色のプラーク状病変である。黄色腫は、 はとんど常に、指間組織、特に親指と人差し指との間に存在する。鍵黄色腫、リ ポイド環角膜および黄色腫も、特異的である。冠状動脈アテローム硬化症は、同 型接合体では、しばしば１０歳以前に症状が始まり、心筋梗塞は早ければ１８箇 月で報告されている。冠状アテローム硬化症に加え、しばしばコレステロールは 、大動脈弁に堆積し、大動脈狭窄症状をもたらす。通常、同型接合体患者は、３ ０歳前に心筋梗塞の併発により死亡する。

多くの母集団において５００人に１人は、遺伝子の機能を破壊し、異型接合性家 族的高コレステロール血症症候群を引き起こす突然変異をＬＤＬ受容体遺伝子に 有している。これら突然変異遺伝子の多くは、検知しうる受容体を製造すること ができない。他の突然変異遺伝子は、少しの受容体を製造するだけである。さら に他の突然変異遺伝子は、本質的に正常な数であるが、ＬＤＬを適切に結合しな い欠陥受容体を製造する。

他の患者では、異常な長さのＬＤＬ受容体蛋白質が製造される。ゲル電気泳動に より測定した場合受容体の正常な前駆体は約１２００００の見掛は分子量を示す が、突然変異遺伝子によりコードされた異常な形の蛋白質は、１０００００、＋ ３５０００および１７００００の見掛は分子量の位置に移動することが分かった 。ＬＤＬ受容体蛋白質に見られるこのような突然変異は、ＬＤＬ受容体生産に責 任のある遺伝子における欠失または挿入突然変異の結果であろう。先に記述した 突然変異の全ては、ＬＤＬ受容体の為の遺伝子中または近傍に存在しているよう に忠われる。

従って、突然変異ＬＤＬ受容体遺伝子を持つ個人を直接見分けることができる手 段があれば、アテローム硬化症および心臓発作をおこす遺伝的疾病素質を持つ個 人を見分ける能力が大きく高められるであろう。もし受容体遺伝子に対する相補 ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）が発見されれば、このような突然変異を確認することがで きるであろう。

第１図は、ヒトＬＤＬ受容体のクローニングに使用したｃＤＮＡクローニング手 法の模式的表現である。ヒトλｈ１は、ＬＤＬ受容体遺伝子の３゛末端に対応す る部分ゲノムクローンである。組換えプラスミドＰＩＯ１およびｐ２０３は、ヒ トＬＤＬ受容体ｍ　ＲＮ　Ａの相補体である部分ＣＤＮＡを含んでいる。プラス ミドｐＬＤＬＲ−２は、ｐｌｏｌおよびｐ２０３の融合構成であり、ヒトＬ　Ｄ 　Ｌ受容体ｍＲＮＡについてのほぼ完全な長さのｃＤＮＡを含んでいる。括弧の 中の数は、与えられたクローンへのＤＮＡインサートの長さを示している。

第２図は、ヒトＬ’ＤＬ受容体遺伝子についてのほぼ完全な長さのＣＤＮＡを含 む組換えプラスミドｐＬＤＬＲ−２の構造的表現である。解読領域（斜線部分） は、ヌクレオチド１〜２５８０を含んでいる。この融合プラスミドは、ｐ２０３ （ヌクレオチド１〜３２３）およびｐｌｏｌ（ヌクレオチド３２４〜５１４４） のｃＤＮＡインサートをＨｇｌＡｌ部位を重ねて結合することにより構成された ものである。ｐＬＤＬＲ−２中の塗り潰した領域は、複製の起源、１６Ｓおよび １９Ｓ供与体および受容体切り継ぎ部位、およびポリアデニル化信号を包含する ＳＶ４０配列を含むクローニングベクター中の領域を示す。

第３図は、ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列お よび受容体蛋白質の予測されるアミノ酸配列を表す。ヌクレオチドは、５°から ３′への方向に右側に番号が付され、ヌクレオチドｌは、イニシエーターメチオ ニンをコード化するＡＴＧコドンのＡである。負の番号は、５°未翻訳領域を示 す。アミノ酸は、配列の下に番号付けされている。残基ｌは、成熟蛋白質のＮ　 Ｈを末端に見られるアラニンである。負の番号は、開裂された信号配列を示す。

信号配列（２１残基）および膜スパン配列（２２残基）は、１本の実線の下線で 示されている。

Ｎ−結合炭水化物が結合することができる部位（Ａｓｎ−Ｘ−９ｅｒまたはＡ　 ５ｎ−Ｘ　−Ｔ　ｈｒ）は、２重実線の下線で示されている。システィン残基は 、丸で囲っである。〇−結合炭水化物が結合することができるセリンおよびスレ オニンに富んでいる４８残基の１範囲は、点線の下線で示されている。ｃＤＮＡ の３゛未翻訳領域中のＡｌｕ配列は、囲っである。第１Ａｌｕ配列に伴う直接反 復は、配列の上の破線矢印で示されている。３°未翻訳領域中の３つの可能なポ リアデニル化信号は、上線および下線により示されている。

第４図は、ＬＤＬ受容体蛋白質ｃＤＮＡの異なる領域から得たＤＮＡプローブを 伴った、通常の人および家族的高コレステロール血症（ＰＨ２７４と命名）の人 のゲノムＤＮＡのＸｂａ上制限消化物の分析結果を示す。第４Ａ図は、翻訳領域 の開始および終了をそれぞれ示ずＡＵＧおよびＵＧＡを有して示されているヒト ＬＤＬ受容体に付いてのｍＲＮＡのダイヤグラムである。ＬＤＬ受容体の遺伝子 地図を作成するのに使用された３′Ｐ−標識化ｃＤＮＡプローブのサイズおよび 位置が、塗り潰した棒で示され、１〜９の番号が付されている。第４Ｂ図は、プ ローブｌ（左）またはプローブ８　（右）により交雑した後の正常（ｎｏｒｍａ ＋）または変異（Ｆｌ−１２７４）ゲノムＤＮＡのいずれかのサザン・プロット （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）のオートラジオグラフである。Ｘｂａｌ−制限 フラグメントは、各プロットの右側にＡ−Ｄで示されている。分子サイズの標準 は、バクテリオファージＤＮＡのＨｉｎｄｌＩｌ開裂により生成させ、各プロッ トの左側に示した。正常人およびＰＨ２７４においてプローブ２〜９にツムＤＮ Ａのサザン・プロット交雑を示す。示した対象人から得た線維芽細胞を培養して 分離したゲノムＤＮＡ　（５μｇ）をＸｂａｌにより消化し、電気泳動に付し、 ニトロセルロースに移し、３Ｎｐ−プローブｌと交■により開裂して生成した。

第６図は、正常ＬＤＬ受容体遺伝子およびＰＨ２７４からの欠失含有遺伝子の３ °末端の制限地図の比較である。下方の目盛りは、ゲノムＤＮＡの長さく単位： キロ塩基）を示す。正常ＬＤＬ受容体遺伝子の組成は図の一番上に示されている 。エクソン（情報配列）は、塗り潰したセグメントおよび大文字で示されている 。介在配列（ＩＶＳ）は、塗っていないセグメントおよび小文字で示されている 。ＩＶｓのＣおよびエクソンのＦ中のＡｌｕ反復配列が示されている。ＰＨ２７ ４中の遺伝子欠失を決定するのに使用した制限酵素認識部位が示されている。

本発明は、ヒト低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）受容体遺伝子のｍＲＮＡ配列に対応 するｃＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ転移ベクターの構成に適した技術を開示す る。加えて、本発明は、ヒトＬＤＬ受容体遺伝子または該遺伝子のｍＲＮＡ転写 のいずれかの種々の部分に対する相補体であるＤＮＡインサートを含む組換えＤ ＮＡ転移ベクターを開示する。

本発明により開示された組換えＤＮＡ転移ベクターは、本発明の実施に有用であ る為にヒトＬＤＬ受容体遺伝子全体を必ずしも含んでいる必要はない。同様に、 組換え転移ベクターは、該遺伝子の全ｍＲＮＡ転写の相補体であるＤＮＡフラグ メントを含む必要はない。組換え転移ベクターは、ヒトＬＤＬ受容体遺伝子また は該遺伝子のｍＲＮＡのいずれかの相補体であるより小さいサブフラグメントか ら構成されていてよい。

実際、プローブとして遺伝子の異なるサブフラグメントを使用することは、ある ＦＨ患者における特定の突然変異を詳らかにする為に必要であろう。必要な全て は、これらフラグメントが、安定な二本鎖またはハイブリッドを形成するのに十 分な長さを持つことである。このようなフラグメントは、安定な二本鎖形成を可 能にするので、「交雑可能」といわれる。一般に、少なくとも１４個のヌクレオ チドを持つＤＮＡフラグメントは、安定な二本鎖（すなわち、テトラデカマー） を形成することができる。

家族的高コレステロール血症（ＰＨ）を持つ人は、本発明を利用して、ＬＤＬ受 容体をコード化する遺伝子中の突然変異の存在を決定することにより、診断され る。組換えｃＤＮＡクローンから分離されたＤＮＡは、遺伝子に欠失を持つ家族 的高コレステロール血症の患者を診断する為に用いられてきている。ｃＤＮＡま たはそのフラグメントは、単一のヌクレオチドの交換（点突然変異）を含む他の 突然変異の診断にもらちろん有用である。

一般に、方法は、突然変異を持つと思われる人の細胞から得たＤＮＡを分断し、 次いでＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡのある物理化学的性質・たとえばＤＮＡフ ラグメントの分子量または寸法に従ってパターンに分離することから成る。分離 されたＤＮＡは、次ぎに、ＬＤＬ受容体遺伝子に対応する成分からＤＮＡのフラ グメントを識別する為に標識化ＬＤＬ受容体ＤＮＡにより交雑プローブする。そ れから、患者と思われる人のＬＤＬ受容体遺伝子フラグメントのパターンを、正 常な人から得た同様のフラグメントパターンと比較することにより、患者と思わ れる人は変異を示すか否かを決定することができる。もし、患者と思われる人か ら得られたＬＤＬ受容体遺伝子フラグメントが、正常なノくターンと比べて違い を示しておれば、遺伝子の変異が検出されたことになる。

ＤＮＡを分断するのに特に有用であることが分かった１つの方法は、制限酵素消 化を用いる方法である。しかし、たとえばＤＮＡの化学的開裂を含む他の方法も 、その方法が再現可能にゲノムＤＮＡを同じ分離されたフラグメントに開裂する ならば、使用することができる。

分断されたＤＮＡは、種々の方法を使って、認識可能なパターンに分離すること ができ、その中で最も有用な方法は、分離ＤＮＡの異なるサイズを利用するもの である。たとえば、ＤＮＡフラグメントは、密度勾配を用いた速度沈降法により 分子量に従って、あるいは排除クロマトグラフィを用いて分子サイズにより分け ることができる。しかしながら、本発明の目的にとって好ましい方法は、アガロ ースまたはポリアクリルアミドゲルマトリックスを用いた電気泳動によりＤＮＡ フラグメントを分けることである。

クローン化ＬＤＬ受容体ＤＮＡは、便利には、交雑およびオートラジオグラフィ 後に対応するゲノムＬＤＬ受容体Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを容易に可視化するこ とができる放射性ヌクレイドにより標識することができる。たとえば重同位体を 含めて他の標識方法も可能であるが、対応するゲノム配列を同定する手段として は実際には面倒であろう。

クローン化ＤＮＡフラグメントの使用に加え、本発明で開示されたｃＤＮＡの部 分に対応する化学的合成オリゴヌクレオチドを用いても原則として診断を行うこ とができる。ＬＤＬ受容体遺伝子に単一の塩基置換を持つ人から得たゲノムＤＮ Ａは、正常な人からのＤＮＡに比べて、そのようなオリゴヌクレオチドと弱く交 雑する。そのような弱くなった交雑は、従って、異型接合形および同型接合形の 両方でＦＨを持つ多くの患者の診断方法となる。

低密度リボ蛋白質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）受容体は、ヒトおよび動物においてコレステロ ールの代謝で中心的な役割を果たしている細胞表面蛋白質である。

エンドサイト−シスの過程において、ＬＤＬ受容体は、血清コレステロールを結 合し、細胞代謝で利用できるようにする責任を有している。これは、受容体／コ レステロール複合体の取り込みにより可能にされ、その後、取り込まれた複合体 の異化によりコレステロールが遊離される。

遊離コレステロールは、フィードバック機構を介して、ＬＤＬ受容体の合成速度 を調節する。副腎皮質および卵巣黄体のようなある種のステロイド生合成組織に おけるコレステロール要求の増加は、ＬＤＬ受容体の数の増加により満足される 。ＬＤＬ受容体の第１に顕著な特性は、その構造および機能に影響を与えている 突然変異が最もよく現れるヒトの遺伝子的疾病の１つである家族的高コレステロ ール血症を引き起こしていることである。

組換えＤＮＡ技術は、ＦＨを持つと考えられる個人における突然変異の存在を検 出する為の１つの方法を提供する。精製ヒトＬＤＬ受容体遺伝子、またはその交 雑可能なサブフラグメントから成るプローブを用いることにより、特定の個人の ＬＤＬ受容体遺伝子に存在する異常を発見することができ、次いで、その個人は 、Ｆ）（の症状に向けられた他の種類の治療を受けることができる。すなわち、 ＰＨ患者が本発明により開示された方法によって見い出されたなら、患者は、食 事制限、医薬投与および手術を含む、患者のコレステロール循環水準を低下させ ることを目的とした治療の対象となすことができる。加えて、ＰＨ患者のＬＤＬ 受容体遺伝子の遺伝子構造に関する知識は、体細胞置換または修飾を含め、この 病気に対する画期的な治療方法を最終的にはもたらすであろう。

ＦＨ患者に存在する遺伝子異常を推定し、確認する場合の第１のステップは、遺 伝子工学の手法を用いて、正常および異常ＬＤＬ受容体遺伝子を研究することが できる適切なプローブの開発である。ヒトＬＤＬ受容体遺伝子の構造を研究する 為の最も理想的な遺伝子学的プローブは、すローン化ヒトＬＤＬ受容体遺伝子ま たは受容体ｍＲＮＡの為に調製されたｃＤＮＡである。しかしながら、この問題 に直接当たるには、あるヒトの原料体からプローブを分離する必要があるという 困難さがある。この原料体は、好ましくは、受容体およびそのｍＲＮＡが非常に 多く存在している副腎または卵巣であろう。この手法は、十分なｍで適切なヒト 組織を得ることが困難であるという点で、幾分実際的ではない。本発明は、ＬＤ Ｌ受容体ｃＤＮＡを生原料からクローン化し、クローン牝牛ＬＤＬ受容体ｃＤＮ Ａを遺伝子ライブラリからヒト遺伝子の部分を分離するのに用いるという思いが けない手法を記載する。ヒト遺伝子の部分は、次いで、はぼ完全な長さのヒトｃ ＤＮＡクローンを分離するのに用いられる。この手法は、交雑用プローブとして 用いられた手配列がヒトＬＤし受容体遺伝子を正しくプローブすることは、ヒト ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａがクローン化されて配列決定されるまでは明らかでないというこ とから、思いがけないものである。振り返って見れば、牛とヒト遺伝子との間の 相同性は、本明細書で詳説するクローニングアプローチを可能にするのに十分で あった。

ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの複製を有しているヒト組換えＤＮＡクローンの分離 が、Ｌ　Ｄ　Ｌ受容体遺伝子突然変異を検出することができる分析の開発を促進 した。この分析の有用性を説明する為に、家族的高コレステロール血症を患って いる患者（以下、ＰＨ２７４と記す。）の症例研究が行なわれた。ここに記載し た症例研究は、患者の特定の遺伝子欠陥の構造に付いて非常に詳細にわたってい るが、そのような測定が診断方法として必要であることを本発明は意図している のではない。しかしながら、この内容は、本発明により利用可能になったこれら 遺伝子技術の能力を示す為にここに含まれているのである。更に、これら技術は 、ＬＤＬ受容体遺伝子における他の多くの欠陥を診断する手段を提供する。

すなわち、本発明は、ＬＤＬ受容体遺伝子における遺伝子欠陥の存在を発見する のみならず、さらに特定の遺伝子欠陥を非常に詳しく列挙することができる方法 を提供する。

本発明者らは、これら技術は、ＬＤＬ受容体遺伝子における遺伝子欠陥の存在に 関して人口を全体としてスクリーニングする方法を提供するものと考えている。

ここに詳述するスクリーニング方法により患者が発見されれば、次ぎには突然変 異ＬＤＬ受容体遺伝子により示された特定の異常を更に詳細に研究することがで きる。従って、本出願人は、本発明は、重大で一般的なヒト遺伝子障害である、 家族的高コレステロール血症を引き起こす遺伝子現象の一層の理解をもたらすも のと考えている。

実施例１ 牛ＬＤＬ受容体遺伝子ｃＤＮＡのクローニング牛ＬＤＬ受容体遺伝子ｃＤＮＡク ローン（以下、ｐＬＤＬＲ−１と記す。

）は、ポリソーム免疫精製およびオリゴヌクレオチド交雑により単離した。一般 に、方法は５つの段階を通して進行した。これら段階は、（１）中受容体蛋白質 の分離、（２）牛ＬＤＬ受容体蛋白質と反応可能なポリクロナール抗体の製造、 （３）生麦容体ｍＲＮＡの翻訳に能動的に関与する牛ポリソームの特定免疫沈降 、それに続く沈降ポリソームから分離された受容体ｍＲＮＡの富化、（４）富化 ｍＲＮＡからのｃＤＮＡクローンバンクの調製、（５）牛ＬＤＬ受容体ｃＤＮＡ インサートを持つ代表的クローンを分離する為のｃＤＮＡクローンバンクのスク リーニング。これら段階を以下に詳述する。

生麦容体の分離とポリクロナール抗体の製造シュナイダー（Ｓ　ｃｈｎｅｉｄｅ ｒ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｒｎ、　）、２５７：　２６６４−２６７３（１９８２）の記載に従っ て、半開腎皮質から、均質なＬＤＬ受容体蛋白質を分離した。半開前ＬＤＬ受容 体に対するポリクロナール抗体は、ラビット中で発生させ、トレスハウグ（Ｔ　 ｏｌ　ｌｅｓｈａｕｇ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、３０：　７１５−７２４　（１ ９８２）の記載に従って、スタフィロコッカス蛋白質Ａ−セファロース上で精製 した。この抗体および対応する非免疫ラビットＩｇＧは、ポリソームまたはしょ 糖の勾配の沈降挙動を変化させ得ないことから示されるように粗リボヌクレアー ゼ汚染物を含んでいなかった。

牛ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡのポリソーム免疫沈降ＬＤＬ受容体に付いてのｍＲＮＡ を富化したポリソームを次のようにして調製した。生組織を液体窒素に浸けて、 ５分以内で殺した。副腎をワーニング（Ｗａｒｎｉｎｇ）ブレンダーにより液体 窒素中で粉砕し、ポリソーム分離を行うまで、−７０℃で貯蔵した。

粉砕副腎１０ｇを、ブリックマン・ポリトロン（Ｂｒｉｃｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔ ｒｏｎ）により、２５ｍＭトリス塩酸４２ｍ１２（ｐＨ７、５、ＮａＣｇ２５ｍ Ｍ、ＭｇＣ（！ｔ５ｍＭ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００２％（ｖ／ ｖ）、ヘパリン０．３ｍｇ／ｍ（！、トリコデルミン（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉ ｎ）　１　ｕｇ／ｍＱ、フェニルメチルスルホニルフルオリドロ０μｇ／ｍの中 で均質化した。バルミタ−（Ｐ　ａｌｍｉｔｅｒ）　、バイオケミストリー（Ｂ 　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１３：　３６０６−３６１５　（１９７４）の記 載に従って、ＭｇＣ（ｂ沈澱により、均質物からポリソームを分離し、−７０℃ で貯蔵した。副腎粉末１ｇ当たりポリソーム２５Ａ、。単位を得た。

しょ糖の直線的勾配上で、Ａ２Ｂ。物質の約７０％がポリソームとして沈降した 。残余の吸収物は、８０Ｓモノソーム中に存在した。ポリソーム（１００ｏＡｆ ＠Ｏ単位）は、２００００　ｘｇで１０分間遠心して澄まし、２５ｍＭトリス塩 酸（ｐＨ７，５、ＮａＣＱｌ　５０ｍＭ、ＭｇＣ（２℃５ｍＭ。

ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４００、１％、ヘパリン０、２　ｍｇ／ ｍＱ、　）リコデルミンｌμｇ／ｍＱ）を含む緩衝液中で１５Ａ２ｓ。／１１１ １２に希釈し、抗受容体１ｇＧまたは非免疫ＩｇＧ６．２５ｍｇと共に、撹拌し ながら４℃で１時間培養した。

次いで、ポリソーム／抗体スラリーを、上記希釈用緩衝液を８〜１０ｍＱ／時間 の流速で流して平衡にした蛋白質Ａ−セファロースのカラム（０，７ｘ１３ｃｍ ）に２回通した。カラムを希釈用緩衝液１２０ｍＣで一夜洗浄した。結合したポ リソームを、２５ｎ＋Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ）２０ｍ １２により最大流速で溶離した。溶離画分を６５°Ｃで５分間加熱し、０．５Ｍ ＮａＣ（！および０．２％ＮａＤｏｄＳＯａに加え、２４℃に冷却し、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７、５，０，５ＭＮａＣので平衡にしたオリゴ（ｄＴ）−セル ロースカラム（０，８ｘ２．３ｃｍ）に通した。

カラムをこの緩衝液２０＋ｎｆ２で洗浄し、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡをＩＯｍＭ） リス塩酸（ｐＨ７，５）５ｍｅで溶離した。イーストキャリアｔＲＮＡ　（５０ μｇ）を加え、Ｎａ０ＡｃおよびエタノールによりＲＮＡを２回沈澱させた。こ の免疫精製したポリ（Ａ）′″ＲＮＡを、水２０μｇに再ｖ、潤し、−７０℃で 貯蔵した。

免疫選択ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの存在に付いて、網状 赤血球リゼイト系中でのイン・ビトロ翻訳により測定した。リゼイト系を以下に 説明する。

ボ１バＡ）”ｍＲＮＡを、２、５　ｍＭ　ＣＨ３Ｔ（ｇｏ　Ｈと共に、４℃で１ ０分間培養し、次いでペルハム（ｐ　ｅｌｈａｍ）およびジャクマン（Ｊ　ａｃ ｋｓｏｎ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、６７：　２４７−２５６　（１９７０）の記載に従っ て調製して８０ｍＭ　ＫＯＡｃＳ　１ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）ｔ、１９アミノ酸（ メチオニンを除く）各１６μＭおよび［３５ｓ］メチオニン０．２ｉＣｉ　（Ｉ 　Ｃ１＝３゜７　ｘ　１０１０Ｂｑ）で補足したラビット網状赤血球リゼイト中 で翻訳した。

翻訳反応におけるＣ　Ｈ、Ｈｇ　ＯＨの最終濃度は、０、３　ｍＭであった。翻 訳生産物を、ＮａＤｏｄＳＯ４／ポリアクリルアミド７％ゲルを用いた電気泳動 により分析した。

ＮａＤｏｄＳＯ＋ゲル電気泳動および合成産物の蛍光写真法により決定したとこ ろ、全副腎ポリ（Ａ）”　ＲＮＡは、多くの蛋白質の合成に向けられていた。免 疫精製ポリソームから誘導されたポリ（Ａ）”ＲＮＡは、ある種の蛋白質バンド 数種と１つの明らかな追加：約１２００００のＭｒで移動した蛋白質の合成に向 けられていた。°この蛋白質は、非免疫ＩｇＧによりポリソームから選択された ポリ（Ａ）”　ＲＮＡの翻訳後は、証明できかった。ハムスターおよびラビット から’Ｌ　Ｄ　Ｌ受容体を生合成する研究により、受容体は見掛け１２００００ Ｍｒ前駆体（ここで、Ｍｒは、ダルトン単位の分子量を表す。）として最初作ら れ、これが、細胞表面への移送中の一連の翻訳後グリコジル化を受け、その結果 、１６００００の見掛けＭｒを持つ成熟蛋白質となる。従って、免疫選択ポリ（ Ａ）“ＲＮＡの翻訳後に見られる富化蛋白質のサイズは、ＬＤＬ受容体前駆体の サイズと一致していた。

牛ｃＤＮＡクローンバンクの調製およびスクリーニングオカヤマ（Ｏｋａｙａｍ ａ）およびベルブ（Ｂｅｒｇ）　、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ ジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　、２　：　Ｉ　６１−１７０　 （１９８２）の方法によりポリソームの２０００ＡｆＩｌ。単位から誘導された ポリ（Ａ）”　ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを構築するため、免疫選択ポリ（ Ａ）＝　ＲＮＡを用いた。ライフ・サイエンス（Ｌ　１ｒｅＳ　ｃｉｅｎｃｅ） お上びＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した酵 素を使用するクローン反応では、ｄＴ−ティル化ベクタープライマー１．４μｇ およびｄＧ−テイル化リンカ−０，５２ｐｍｏｌを使用した。

マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　［コールド・スプリングス＋ハーバ−・ライブ ラリー、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒ ｂｏｒＬｉｂｒａｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨ ーク］　２５０頁に記載されたＣ　ａ　ＣＱ　ｔショック法により、ニジエリチ ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＲＲＩをアンピシリン耐性に転 換する為、ｃＤＮＡライブラリーの一部ヲ使用した。コロニーをニトロセルロー スフィルター上へ高密度で接種し、交雑の為に２つのレプリカフィルターを調製 した（マニアナイスら、上掲書３１６頁）。非特異的バックグラウンドを減少さ せる為に、焼いたフィルターを、５０ＩＩＩＭトリス塩酸（ｐＨ８，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、ＩＭＮａＣＱ、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ−）中、３７℃または４２℃で 一夜洗浄し、４　Ｘ５ＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２／１５ｍＭク エン酸ナトリウム）、ＩＯＸデンハート（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）溶液（ＩＸ＝０ ．０２％ポリビニルピロリドン１０．０２％牛血清アルブミン１０．０２％フィ コール（Ｆｉｃｏｌｌ）　）　（マニアナイス、上掲書３２７頁）中、６５℃で ３時間培養し、音波処理し、ニジエリチア・コリＤＮＡを１０００μｇ／ｍ（！ で変性した。

交雑は、下記のようにして調製した３ｔｐ　５°−末端標識化オリゴヌクレオチ ド混合物（ｌｐｍｏｌ／ｍＱにおいて６　ｘ　ｌ　０６ｃｐｍ／　ｐｍｏｌ）を 含む後者の溶液中で、−夜行なった。所定のオリゴヌクレオチドプローブに付い ての交雑温度は、経験式：ｔｍ＝２℃Ｘ（ｄＡ　ｄＴ　ｂｐの数）＋４℃Ｘ（ｄ ＧｄＣｂｐ）の数（ここでｂｐは塩基対を意味する。）から計算される最低溶融 温度Ｌｍに対応していた。フィルターを、ＪＸＳＳＣ中、交雑温度において、１ 回３０分間で、３回洗浄し、室温で乾燥し、オートラジオグラフィに付した。陽 性クローンをマスタープレートから取り上げ、数回のスクリーニングにより精製 した。

詳述したスクリーニング手順において使用した交雑プローブは、ＬＤＬ受容体蛋 白質のペプチドサブフラグメントから得た配列情報に基づいて次のようにして調 製した。

精製ＬＤＬ受容体を、ＣＮＢｒにより消化し、内部ＣＮＢｒフラグメントを、高 圧液体クロマトグラフィ　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ’）により分離し、その部分アミノ酸 配列を、自動化エドマン（Ｅ　ｄｍａｎ）減成により決定した。ＣＮＢｒフラグ メントを、減少され［３Ｈ］カルボキシメチル化された受容体（１，６および１ ．８ｍｇの蛋白質）の２種の異なる調製物から発生させ、ブラウンリー（Ｂ　ｒ ｏｗｎｌｅｅ）　［サンタ・クララ（Ｓａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ）、カリフォルニ ア］ＲＰ３００カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより分画した。ここに記載したＣ ＮＢｒペプチドを、０．２５Ｍクアドロール（Ｑ　ｕａｄｒｏｌ）プログラムお よび非蛋白質キャリアポリブレン（Ｐ　ｏｌｙｂｒｅｎｅ）を用いた自動化ベッ クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　８９０　Ｇ配列決定機により２回の別の分離処理に 付した。ＣＮＢｒペプチドのＮＨ，−末端残基の収量は、２回の処理について、 ４００および１１００μｍｏｌであった。［３Ｈ］システインのフェニルチオヒ ダントインの回収量に基づいて計算した反復収率は、平均９１％であった。

このＣＮＢｒフラグメントの２つの隣接領域中のアミノ酸の配列を特定する全て の可能なコドンに対応した合成オリゴヌクレオチドプローブの２つの種を合成し た。第１表でＡと示されているオリゴヌクレオチド（７）１−）（７）種は、（ Ｍｅｔ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕとコード化される３２テトラデカマ ーから成る。この配列のアミノ末端にメチオニン残基が存在することは、ペプチ ドがＣＮＢｒ消化により発生される事実から推測された。第１表でＢおよびＢ＊ と示されているテトラデカマーの第２の種は、Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−（Ａｓｐ）　− １１ｅ−Ｖａｔとコード化される。この配列におけるＡｓｐ残基の帰属は、２回 の配列決定処理中１回のみでこれが認められたので、暫定的である。Ｂ／Ｉ３” オリゴヌクレオチド種は、Ｐｒｏ残基を特定するのに使われたコドンがことなっ ているだけ（ＢではＣＣＴ。

Ｂ＊ではＣＣｏ）のそれぞれ２４のメンバのサブ種として合成された４８メンバ から全体として構成されている。

第１表 ＣＮＢｒペプチド配列およびオリゴヌクレオチド合成Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　（Ａｓｐ　）　Ｉ　ｌｅ　 ＶａｌＣＣＣ Ｔ　Ａ　（、ＣＴ　Ａ　ＣＴ ＡＴＧＧＣＧＡ　ＡＡ　Ｔ　ＣＣＧＡ　ＧＡ　ＡＴ　ＧＴＡ　Ｇ　ＴＴ　Ａ　Ｇ 　Ｔ　Ａ ３０の交雑陽性ｃＤＮＡクローンが、オリゴヌクレオチド種Ｂを用いた上記ｃＤ ＮＡライブラリのスクリーニングにより確認された。これらクローンを、サブ種 ＢまたはＢ＊により別個にプローブすると、１６のクローンは、オリゴヌクレオ チド混合物Ｂと強く交雑したが、Ｂ＊とは交雑しなかった。３０クローンの内１ ２は、混合物Ｂ＊につぃてのみ陽性であった。これら２８の陽性クローンを、次 いで、オリゴヌクレオチド混合物Ａによりスクリーニングし、共に後のグループ の１２から得られた２つのプラスミドは、このプローブと交雑した。これら２つ のクローンは、受容体についてのｃＤＮＡを含んでいるものと考えられたので、 以後の研究の為に選択した。

Ｂ＊およびＡオリゴヌクレオヂドプローブの両方と交雑した２つのクローンから のプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ地図化操作に付したところ、結 果は、これら２つのクローンは同一であることを示した。従って、これらクロー ンは、代表的な牛ＬＤＬ受容体ｃＤＮＡクローンであると見なされた。ｐＬＤＬ Ｒ−１と命名したこれらクローンの一方を、それが真のＬＤＬ受容体クローンを 代表しているかを確認する為に選択した。

ｐＬＤＬＲ−１の同一性を確認する為、全ポリ（Ａ）＝　ＲＮＡを、半開腎およ び肝臓から抽出し、ニック−翻訳５２Ｐ−標識化プラスミドをプローブとして用 いたプロット試験により分析した。ＲＮＡプロット試験は、以下のように行なわ れた。組織または細胞をグアニジニウムチオンアネートにより処理する（マニア ナイス、上掲書１９６頁）ことにより、全ＲＮＡを分離した。ポリ（Ａ）“ＲＮ Ａを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィにより精製し、グリオキサ ールで変性し、４０ｍＭ３−Ｎ−モルフォリノプロパンスルホン酸を含む１．５ ％アガロースゲル（ｐＨ７，０）を用いた電気泳動（２０ボルト、１６時間）に より寸法分画し、次いで、２０ｘＳ！ｌ；Ｃ中のキャピラリープロティングによ りゼータプローブ膜（パイオーラド（Ｂ　ｉｏ　−Ｒａｄ）　）に移した。予備 交雑および交雑は、マニアテイス上掲書３２０頁に記載された通りに行なった。

副腎ＲＮＡの量を増すと、約５、５　ｋｂのｍＲＮＡに対応する交雑シグナルが しだいに強くなった。デンシトメータ走査は、副腎ＲＮＡの所定量に付いて得ら れるシグナルは、肝臓ＲＮＡの同量に付いて得られるシグナルより９倍も強いこ とを示した。先の研究は、官能性ＬＤＬ受容体活性は、牛の肝臓中のものより牛 の副腎中のものの方が約１桁高いことを示していたが、この発見は、先に議論し たｍＲＮＡの量の差に一致している。

ＬＤＬ受容体の数は、培養細胞をコレステロールまたは関連ステロールの存在下 に生長させた場合、著しく減少させることができる。ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを、 ステロールの不存在下（受容体誘導）およびステロールの存在下（受容体抑制） に生長させたヒトＡ−４３１細胞から分離し、ｐＬＤＬＲ−１を用いたプロット により分析した。約５、５　ｋｂのｍＲＮＡからの強い交雑シグナルが、誘導Ｒ ＮＡ中で検出され、このシグナルは、抑制ＲＮＡでは９０％以上減少された。

これらの結果は、ｐＬＤＬＲ−１が牛ＬＤＬ受容体遺伝子の少なくとも一部分の ｃＤＮＡ複製を含んでいることを示している。このクローンは、ＡＴＣＣ＃３９ ９６５として寄託されている。幸いなことに、生麦容体遺伝子とヒト遺伝子との 間には、ヒト遺伝子を分離するプローブとして手配列を使用すること可能にする のに十分な相同性が存在している・これら手順を実施例２に記載する。

実施例２ ヒトＬ　Ｄ　Ｌ受容体遺伝子のクローニングおよび特性材はヒトＬＤＬ受容体に 付いての全長ｃＤＮＡを得る方法を第１図に略解する。ローン（Ｌａｗｎ）ら、 セル（Ｃｅｌｌ）、１５：　１１５７−１１７４（１９７８）の方法により、バ クテリオファージ中でクローンしたヒトゲノムライブラリーをスクリーニングす る為、部分牛ｃＤＮＡ　（ｐＬＤＬＲ−１）を用いた。ヒトゲノムＤＮＡインサ ートを含む約１Ｘ１０６のバクテリオファージを、３２ｐ−標識化ｐＬＤＬＲ− １によりスクリーニングした。交雑は、それほど厳しくない条件：３０％ホルム アルデヒド、５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハート溶液、０．１％ＳＤＳ　（ドデシル硫 酸ナトリウム）、１００　ｔｔ　ｇ／ｍＱサーモン精子ＤＮＡおよびｌμｇ／ｍ Ｉ２ポリ（Ａ）、４２℃において行った。フィルターを、２ＸＳＳＣ，０，１％ ＳＤＳ中、２２℃で１０分間、２回洗浄し、同じ溶液中、５４℃で６０分間、１ 回洗浄した。

このヒトゲノムクローンライブラリーから、単一クローンλｈｌを認識した。こ れは、ヒトＬＤＬ受容体遺伝子の３°末端をコード化しているインサート１１ｋ ｂ（キロ塩基対）を含んでいた。λｈｌを用いて、２３６ｂｐＰｖｕＩＩフラグ メントを発生させた。このフラグメントは、ヒトＬＤＬ受容体ｃＤＮＡのＣ０Ｏ Ｈ末端に付いての特異プローブとして働いた。

ｃＤＮＡライブラリーは、オカヤマおよびバーブ、モレキュラー・アンド・セル ラー・バイオロジー、−；；：−二　ｌ　６　］−１７０（１９８２）の方法に より、ヒト胎児副腎ポリ（Ａ）”　ＲＮＡから構成された。クローニング反応で は、市販の酵素、２μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡ５１．５μｇのｄＴ−テイル化ｐ ｃＤＶ１ベクタ−プライマーおよび０．５２ｐｍｏｌのｄＧ−ティル化リンカ− を用いた。ニジエリチア・コリＨＢＩＯＩへの形質転換に続いて、プラスミドｃ ＤＮＡを約３Ｘ１０５形質転換体から分離し、オヵヤマおよびバーブ、モレキュ ラー・アンド・セルラー・バイオロジー、３：　２８０−２８９　（１９８３） のサブライブラリー法により、より長いｃＤＮＡを富化した（６〜１０ｋｂ）。

ヒトＬＤＬ受容体ｃＤＮＡを、２つのプローブ、すなわち、牛ＬＤＬ受容体蛋白 質のＮ　Ｈを末端に存在するＡｓｎ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｃ ｙｓ　−Ｇｌｕ配列から誘導された３２ヘプタデカマーから成る５°−特異オリ ゴヌクレオチド種およびヒトゲノムクローンλｈｌ　（上述）から誘導した１５ ８ｂｐＣＯＯＨ末端情報配列（エクソン）を含む３“−特異２３６塩基対Ｐｖｕ ＩＩフラグメントを用いて、同定した。オリゴヌクレオチドは、ホスポルアミダ イト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｉ＋１ｄｉｔｅ）法により合成されたものであり、マ ーク・シラー（Ｍａｒｋ　Ｚｏｌｌｅｒ）　（コールド・スプリング・ハーバ− ・ライブラリー）およびレイ・マクドナルド（１”Ｌａｙ　ＭａｃＤｏｎａｌｄ ）（テキサス・ヘルス・サイエンス・センター（Ｔｅｘａｓ　Ｈｅａｌｔｈ　５ ｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ）、ダラス在）から供給された。レプリカフィルター をスクリーニングし、２３９６の組換え体中、５つのコロニーは、５′−および ３゜−特異プローブについて陽性であった。これらのクローン中量も長いｃＤＮ Ａインサートを持つプラスミド（４，９ｋｂ）を、ｐｉ　０１と命名した。

ｐｌｏｔのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列は、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの コード化領域の５°末端を含んでいないことが分かった。このｃＤＮＡのヌクレ オチド配列分析により、５°−オリゴヌクレオチドプローブは、蛋白質の極端な ＮＨｔ末端に対応する領域とは交雑しなかったことが分かった。むしろ、プロー ブは、コード化領域内に生じたＮ　Ｈを末端配列の不完全反復と交雑していた。

オープン読取フレームがｐｌ。

ｌ中のｃＤＮＡインサートの極端な５′末端に続き、予測されたシグナル配列ま たは開始メヂオニンコドンの形跡は無かった。

コード化領域の残部を得る為、ｐｌｏｌ中のｃＤＮＡの５°末端に近い配列に対 応するオリゴヌクレオチドを調製し、鋳型としてヒト胎児副腎ポリ（Ａ）”　Ｒ ＮＡを用いたプライマーエクステンションを行った。Ｉ）ＢＲ３２２中のヒト胎 児副腎ポリ（Ａ）”　ＲＮＡからプライマーエクステンディッドｃＤＮＡライブ ラリーを構成す為、ｍＲＮＡ鎖の相補であり、ｐｌｏｌのｃＤＮＡインサートの ５°末端から６３ヌクレオチドが生じた２０塩基の合成オリゴヌクレオチドを用 いた。このライブラリーを、ｐｌｏｌのｃＤＮＡインサートの５°末端から８ヌ クレオチドが生じた２０塩基の第２ヌクレオチドによりスクリーニングした。ス クリーニングした１０４４の組換え体の内、ｐ２０３と命名した１つのプラスミ ドは、そのｃＤＮＡインサートが８３ヌクレオチドについてｐｌｏｌと重複して おり、ヒトＬＤＬ受容体＋ｎＲＮＡのほぼ５°末端近くまで延長されていること が確認された。

はぼ全長のｃＤＮＡを構成する為、ｐｌｏｌとｐ２０３の適切な部分をリゲート する必要がある（第２図）。便利な制限酵素部位が少ない故に、このリゲーショ ンは、次のように、数回の部分消化と、２つの中間体プラスミドの調製を必要と する。

ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの完全翻訳領域を含むｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、重複したＨ ｇｌＡｌ部位を介してｐ２０３のインサートとｐｔｏｔのインサートとを接合す ることにより構成した。構成は、３回の部分消化、３回のマルチフラグメントリ ゲーションおよび２つの中間体プラスミドを含んでいた。

ｐ２０３を、Ｐｓｔｌにより部分消化し、次いでＰｖｕｌｌにより完全に消化し て３４１ｂｐのフラグメントを生成した。ｐｒ、ｌからＨｉｎｄｌｌＴ−Ｐｓｔ ｌ　（５１８ｂｐ）を精製したが、これは、ＳＶ４０ヴイールスの初期領域ブロ モターおよび切り継ぎ信号を含んでいた（第２図ならびにオカヤマおよびバーブ 、１９８３参照）。これら２つのフラグメントをリゲートし、ＰＢＲ３２２のＨ ｉｎｄｌＩＩ−Ｐｖｕ１１部位にクローン化した。この中間体プラスミドをｐＨ Ｐｌと命名した。ｐｔ　０１の５゛末端からの３９４　ｂｐ　Ｈｇ１ＡＩ−Ｅｃ ｏＲＩフラグメントを、ｐ２０３の３′末端からの１０５ｂｐ　Ｐｖｕｌｌ−Ｈ ｇｉＡ１フラグメントと混合し、ＥｃｏＲ１−ＰｖｕＩＩ消化ｐＢＲ３２２にリ ゲートした。この中間体プラスミドを１）ＥＰＩと命名した。１）ＥＰＩを、Ｐ ｖｕＩＩにより部分消化し、次いで、ＥｃｏＲｌにより完全に消化して、４９９ ｂｐ　ＰｖｕＩｌ−ＥｃｏＲ１フラグメントを生成した。このＤＮＡ７ラグメン トを、ｐＨＰＩからの８５９ｂｐ　Ｈ４ｎｄｌｌＩ−ＰｖｕＩＩインサートと、 かつ３°　８５％のｃＤＮＡならびにクローニングベクターに対応するｐｉ　Ｏ １の７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ　−ＥｃｏＲｌフラグメントと、リゲートした。

最後のｐＬＤＬＲ−２と命名した８、４ｋｂプラスミドは、ＳＶ４０配列に結合 した、ヒトＬＤＬ受容体の全長ｃＤＮＡ複製を含んでいた（第２図）。

この遺伝子操作の結果は、ｐＬＤＬＲ−２であり、これは、ヒトＬＤし受容体ｍ ＲＮＡ　（ＡＴＣＣ＃３９９６６）の全コード化領域、全３゛−未翻訳領域およ び５°未翻訳領域の少なくとも一部分に対応する５　、　３　ｋｂｃＤＮＡイン サートを含むプラスミドであった。

ｐＬＤＬＲ−２のｃＤＮＡインサートは、マキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバ ート（Ｇ　１１ｂｅｒｔ）　、メソッヅ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、６５：　４９９−５００　（＋９８０）ならびにサンガ ー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシーズ。ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、Ｌ±：　５４６３−５７６７　（１９７７）の方法により配列決定さ れた。ヒトＬＤＬ受容体ｃＤＮＡに付いて決定されたヌクレオチド配列を、対応 受容体蛋白質の予測されたアミノ酸配列と共に、第３図に示す。第３図に示した 配列の５°末端の５°側では、プラスミドｐＬＤＬＲ−２は、クローニング反応 中にヘアピンルーズの形成から生じたと思われる無関係なりＮＡを含んでいる。

この無関係ＤＮＡの存在は、この発明により開示された診断目的におけるこのｃ ＤＮＡの有用性には、全く影響を与えない。

実施例３ 正常ＬＤＬ受容体遺伝子に対応するゲノム組換えクローンの分離ヒトＬＤＬ受容 体遺伝子の３°末端をスパンしているゲノムクローンを、バクテリオファージベ クター、λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　４Ａ中で構成したゲノムライブラリーか ら分離した。ライブラリーは、バーバード大学（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ）のマニアティス氏（Ｔ　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）から提供された。組 換えファージは、牛およびヒトＬＤＬ受容体のｃＤＮＡプローブである３２Ｐ− 標識化ｐＬＤＬＲ−１およびｐＬＤＬＲ−２によりスクーニングした（それぞれ 実施例１および２参照）。交雑は、厳格な条件：５０％ホルムアルデヒド、５ｘ ＳＳＰＥ　（１ｘｓｓＰＥ＝０゜１８ＭＮａＣｆ２／１０ｍＭＮａＨｔＰＯ４、 ｐＨ７，４／２ｍＭＥＤＴＡ）、５×デンハート溶液、ｏ、ｉ％ＳＤＳ、１００ μｇ／ｍ（２サーモン精子ＤＮＡおよび１μｇ／ｍ（！ポリ（Ａ）において、４ ２℃で１６時間行った。フィルターは、２ｘＳＳＣ（１ｘｓｓｃ＝０．１５ＭＮ ａＣｌ２１０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中、２２℃、１ ０分間で２回、および０゜１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６０’Ｃ１２時 間またはそれ以上で１回洗浄した。洗浄したフィルターを風乾し、コダックＭＡ Ｒ−５フィルムおよびデュポン・クロネックス・ライティング・プラス・インテ ンシファイイング（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｐｌｕｓ 　Ｉ　ｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ）スクリーンを用いて、−７０℃でオートラジオ グラフィに付した。

第６図に示した正常ＬＤＬ受容体遺伝子の３′末端は、上記の方法で得られたえ クローン：λ３３−２、λ３３−１．お゛よびλｈｔ上に含まれていた。第６図 に示した正常ＬＤＬ受容体遺伝子の制限地図は、エクソンおよびＩＶＳ領域（介 在配列または「イントロン」）の両方も示していることに注意されたい。「エク ソン」なる用語は、ｍＲＮＡに「転写」され、最終的に成熟ｍＲＮＡとして細胞 質中に現れる遺伝子の範囲を意味する。ある１つの遺伝子は、多数のエクソンを 有しており、それらが、−緒になって、構造遺伝子を作っている。エクソンは、 遺伝子内では、「介在配列」またはＩＶＳ領域と呼ばれる領域により離されてい る。ＩＶＳ領域は、ＤＮＡの最初のｒ（ＮＡ転写へと転写される。しかしながら 、エクソンとは違い、■■Ｓ領域は、最初の転写の範囲外で処理され、従って、 究極の蛋白質生産物には表現されない。

）、　３３−２中のＤＮＡインザートは、約１２ｋｂで、エクソンＡ、　Ｂおよ びＣをコードしている。λ３３−１中のインサートは、約１１ｋｂで、エクソン Ｄ、ＥおよびＦをコードしている。そして、λｈｌ中のインサートは、約１１ｋ ｂで、エクソンＥおよびＦをコードしている・第４Ａ図に示した”Ｐ−ｃＤＮＡ プローブは、ＬＤＬ受容体遺伝子の以下の領域に対応しているニブローブ２〜５ は、第６図において約４０ｋｂのＤＮＡとして示されているＬＤＬ受容体遺伝子 の５°末端中のエクソンと交雑する；プローブ６は、エクソンＣと交雑する；プ ローブ７は、エクソンＦの５′半分と交雑する；およびプローブ８と９は、エク ソンＦの３°半分と交雑する。エクソンＣは、受容体の酸素結合糖領域（アミノ 酸残基６９３〜７４９）をコードする；エクソンＤは、酸素結合糖領域と膜スパ ン領域との間の領域および膜スパン領域を構成する２２アミノ酸の８個（残基７ ５０〜７７５）をコードする；エクソンＥは、膜スパン領域の残りおよび細胞質 領域を構成する５０アミノ酸の３９個（残基７７６〜９２８）をコードする；エ クソンＦは、受容体蛋白質の細胞質領域の末端１１アミノ酸（残基８２９〜８３ ９）およびｍＲＮＡの３°未翻訳領域をコードする。

実施例４ 家族性高コレステロール血症の患者の症例研究ＰＨを持つ家族のＬＤＬ受容体に 付いての構造遺伝子における突然変異を特徴付ける為、実施例２および３に開示 した組換えクローンを使用することを、この実施例は記載する。指標ケースは、 若い男子（Ｂ、Ｈ，）であり、以下、ＰＨ２７４と命名する。彼は、同型接合型 ＦＨの臨床的特徴を全て有している。事前の機能的研究により、ＰＨ２７４から 得た培養線維芽細胞は、＋′Ｉ−標識化ＬＤＬと正常量の約３分の１の量で結合 されたことが分かった。しかし、ＰＨ２７４の受容体は、被覆ピットではクラス ター化せず、従って、結合されたＬＤＬを細胞内に移送しなかった。すなわち、 ＰＨ２７４は、機能的には、「インターナライゼーション（１ｎｔｅｒｎａｌｉ ｚａｔｉｏｎ）欠陥」突然変異と分類される。Ｐ　Ｈ２７４の親戚から得た線維 芽細胞の研究により、彼は、２つの異なる突然変異アレルを遺伝してことが分か った。インターナライゼーション欠陥受容体をコードしているアレルは、彼の母 親から遺伝され、機能的受容体蛋白質を作らない無（または休止）アレルは、彼 の父親から遺伝されたことが分かった。

ＰＨ２７４の培養線維芽細胞の予備的生合成研究により、インターナライゼーシ ョン欠陥アレルによりコードされたＬＤＬ受容体蛋白質は、正常の受容体より約 １００００ダルトンだけ分子量が小さいことが分かった。従って、この突然変異 の研究は、ＰＨ２７４および彼の家族から得たゲノムＤＮＡを分析することから 始めた。以下に記述するように、突然変異遺伝子は、２つのエクソンを完全にか つ１つのエクソンを部分的に取り除く大きな欠失を受けていることを見い出した 。

ＰＨ２７４に付いて本発明を実施して発見された欠失突然変異は、２つの反復Ｄ ＮＡ要素：すなわち、受容体の膜スパン領域をコードしていの原因となっている のであろうと考えられる。遺伝子の１つの領域からのＡｌｕ配列は、他の領域か らのＡｌｕと、クロス交雑することがあり、ＤＮＡ中にループを形成する。従っ て、この「ループ」が遺伝子から除かれて不完全な遺伝子を残した場合に、欠失 が起こる。

生成した突然変異遺伝子は、ＰＨ２７４の場合、膜スパン領域および細胞質領域 を失った切りつめられたＬＤＬ受容体を生産する。これら切りつめられた受容体 の大部分は、細胞から隠されるが、それらの幾つかは、細胞の外表面に結合した ままである。この位置で、それらはＬＤＬと結合することができるが、細胞質領 域が欠けているので、これら受容体は被覆ピットにクラスターし、ＬＤＬを細胞 内へ運び込むことができＦＨ患者における欠失突然変異を示す為の本発明の好ま しい態様では、サザン・プロットとしてしられている既知の技術を使用する。簡 単に説明すると、サザン・プロットは、患者のゲノムＤＮＡをまず分離し、各フ ラグメントに分け、アガロースゲルを用いて電気泳動的に分離する方法である。

ゲルから得られたＤＮＡパターンを、次に、安定なマトリックス上に「印刷」す る。ＬＤＬ受容体遺伝子に対応するこれらフラグメントのパターンは、その後、 標識化したＬＤＬ受容体ｃＤＮＡまたはゲノムプローブを印刷したマトリックス と交雑し、標識により遺伝子パターンを視覚化することにより、見えるようにす ることができる。

最初のＤＮＡのフラグメント化を行う際、好ましくはＤＮＡは、制限エンドヌク レアーゼにより、より小さいＤＮＡフラグメントに消化される。しかしながら、 唯一必要なことは、選択した方法がゲノムＤＮＡを再現可能に同じフラグメント パターンに開裂できなければならないということである。このようにして、同等 に開裂された遺伝子フラグメントは、たとえばフラグメント長さによって分離さ れた時、再現性あるパターンを示す。従って、それぞれのＬＤＬ遺伝子パターン におけるシフトを検出する為に、被験者からのＬＤＬ受容体遺伝子フラグメント を対照者の対応フラグメントと比較するだけでよい。対照パターンと比べて被験 者のＬＤＬ受容体遺伝子フラグメントのシフトは、遺伝子中の突然変異の徴候で あろう。

り発現された遺伝子突然変異を示し得ることを決定した。しかしながら、将来の 研究では、他の制限酵素を使用することが必要となるかも知れない、と考えられ る。従って、ある場合には、特定の欠失に対する正しい酵素を発見する為に、酵 素の性能試験が有用であろう。当業者は、そのような消化の性能試験が必要であ ろうことを認識するであろう。

Ｄ　Ｎ　Ａをフラグメント化した後、生成したフラグメントを、次に、個々のフ ラグメントが相互に分離されているパターンに分離する。ＤＮＡフラグメントを 分離するのに好ましい方法は、ＤＮＡをアガロースゲルミックス中で電気泳動に 付して大きさ別にすることである。アガロースゲル電気泳動は、当該技術分野で は周知の手法である。しかし、たとえばカラムクロマトグラフィまたは密度勾配 遠心を含む他の分離技術を用いることも可能である。ゲル電気泳動技術は、分離 されたフラグメントの見掛はサイズの正確な決定を可能にし、かつ分離されたフ ラグメントの取り扱いを容易にするような方法でフラグメントの分離を行うこと ができる点で有用である。さらに、ゲルマトリックス中に存在するＬＤＬ受容体 遺伝子フラグメントは、以下により詳細に説明するサザン・プロット法により直 接見ることができる。

第４Ｂ図は、正常な細胞およびＰＨ２７４から得たゲノムＤＮＡをＸｂａｌで消 化し、いくつかのｅＤＮＡプローブと交雑した後の、サザン・プロットを示す。

より詳しくは、サザン・プロット交雑は、以下のように行なわれた。ゲノムＤＮ Ａ　（４μｇ）を、示された対象からの線維芽細胞の培養物から分離しくマニア ナイス、上掲書）、Ｘｂａ　Ｉ　（−ニーイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　）　、緩衝液Ａ（４０ｍＭ）リスアセテ ート、３ｍＭＮａｔＥＤＴＡ、２０ｏ＋ＭＮａＯＡｃ、および１８ｍＭＮａＣ（ ！、ｐＨ８，１５）を含む１％アガロース中で電気泳動に付し、浸透圧拡散によ りニトロセルロース紙に移した（マニアナイス、上掲書）。紙を、５０％ホルム アミド、１％ＳＤＳ、５×デンハート溶液、５ｘＳＳＰＥおよび１００μｇ／ｍ Ｑニジエリシア・コリＤＮＡ中で３！Ｐ−標識化プローブを用いずに４２℃で１ 時間予備交雑した後、同じ溶液中、適当な５ｔｐ−標識化ｃＤＮＡプローブ（２ 〜４　Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍのと共に４２℃で培養した。交雑の後、紙を、１％ ＳＤＳおよび２ＸＳＳＣにより、２３℃で１５分間洗浄し、次いで、１％ＳＤＳ および０．１Ｘ５ＳＣ（プローブｌ交雑に付いて）または１％ＳＤＳおよび０． ５ＳＳＣ（プローブ２〜９に付いて）中、６８℃で４時間洗浄した。フィルター を、−７０℃で２４時間、増強スクーン付きＸ線フィルムに露光した。プローブ ｌおよび８を用いた代表的なプロット交雑を第４Ｂ図に示す。

ＬＤＬ受容体遺伝子を地図化する為に用いた３１ｐ−標識化ｃＤＮＡプローブの サイズおよび位置を、第４Ａ図に塗り潰した棒により示し、１〜９の番号を付す 。プローブ１　（２本鎖ＤＮＡ）は、ｐｉ　Ｏ１がらの、２．１ｋｂＥｃｏＲＩ −Ｓμリフラグメントと３種の異なる０　、　９　ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフ ラグメントの混合物であり、これらは、−緒になって、遺伝子の翻訳領域の殆ど をスパンした。フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気溶 離により精製し、次いで、ファインバーブ（Ｐ　ｅｉｎｂｅｒｇ）およびフォー ゲルシュタイン（Ｖ　ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）、アナリティカル・バイオケミスト リー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、±３２：　６−１３　（１９８３） に記載の通り、ランダムへキサヌクレオチドプライミングに上り３ｆｐで標識化 した。プローブ２〜９は、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバート（Ｇ　１ １ｂｅｒｔ）　、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−拳オブ・ サイエンス、ニー・ニス・エイ、８１：　１９１１−１９９５　（１９８４）の 方法により、ｐＬＤＬＲ−２のＭ１３サブクローンから、均一に３１ｐ−標識化 された約１００ヌクレオチド長さの１本鎖ＤＮＡとして調製した。全プローブは 、少なくとも５　Ｘ　１０　ｓｃｐｍ／μｇの特性放射能を有していた。

簡潔に述べると、プローブ２を調製する為、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メ ソッズ・イン・エンザイモロジー、１０１工：　２０−７８　（１９８３）に記 載されているように、ヌクレオチド２６７〜１０８０（第３図）を含むＤＮＡフ ラグメントをバクテリオファージＭ１３ｍｐ９ベクターにクローンした。均一に ３２Ｐ−標識化された約１００塩基長さの１本鎖ＤＮＡプローブは、チャーチお よびギルバート、上掲書の方法により得たクローンから、Ｍ＋３万能プライマー 、および３つの未標識化デオキシヌクレオヂドならびに１つのアルファー３２ｐ −標識化デオキシヌクレオチドの存在下にプライマーを延長する為のＤＮＡポリ メラーゼＩのクレノー（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ）フラグメントを用いて、調製した。得 られた放射性プライマー延長物質を、沸騰、変性用アクリルアミドゲル上でのサ イズ分画、電気溶出により鋳型（テンプレート）から変性し、次いで、直接プラ イマーとして用いた。プローブ３〜９は、鋳型として第３図の配列の異なる領域 を含むＭ１３クローンを用いる以外は同様の手順で調製した。

第３図を参照して説明すると、プローブ３は、はぼヌクレオチド番号７１９〜２ ５４４を含み、プローブ４は、はぼヌクレオチド番号２６７〜１０７８を含み、 プローブ５は、はぼヌクレオチド番号１５７３〜３４８６を含み、プローブ６は 、はぼヌクレオチド番号２１５４〜２５４４を含み、プローブ７は、はぼヌクレ オチド番号２５４５〜３９４８を含み、プローブ８および９は、はぼヌクレオチ ド番号４５０８〜４９６た後の正常細胞およびＰＨ２７４からのゲノムＤ　Ｎ　 Ａのサザン・プロットを示す。プローブｌは、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの翻訳領域 の殆どをスパンしたｃＤＮＡの混合物である（第４Ａ図）。このプローブを正常 人からのＸｂａｌ−消化ゲノムＤＮＡと交雑させると、Ａ、ＣおよびＤで示され る３つの帯が２３ｋｂ、１０ｋｂおよび７ｋｂにそれぞれ観察される（第４Ｂ図 ）。これら正常な帯とＢで示される付加的な１３ｋｂの帯の全ては、ＰＨ２７４ のゲノムＤＮＡに存在している。これらの発見は、ＰＨ２７４の突然変異アレル の１つは、正常な制限パターンを持つのに対し、他のアレルは帯Ｂを生じさせる ことを示唆している。

帯Ｂを発生さ仕るＤＮＡセグメントを局在化させる為、ＸｂａＩ消化物を、ＬＤ Ｌ受容体ｃＤＮＡに対応する短いＤＮＡフラグメントによりプローブした（プロ ーブ２〜９、第４Ａ図）。プローブ２〜５は、正常およびＰＨ２７４ＤＮＡにお いて、交雑して同一の帯となった。プローブ６．８および９（プローブ７は除く ）は、交雑して、ＰＨ２７４では異常な１３ｋｂ帯になった。帯Ｂがプローブ７ とは交雑せず、プローブ７のいずれの側のプローブ（すなわち、プローブ６．８ および９）とも交雑することから、このフラグメントは、プローブ７に含まれる ｍＲＮＡをコードする領域を包含するＤＮＡの欠失から生じているものと考えら れる。この欠失は、隣接ＤＮＡフラグメントを融合して１３ｋｂの単一フラグメ ント、すなわち帯Ｂの発生を伴った少なくとの１つのＸｂａ１部位の除去を恐ら く含んでいるのであろう。

ＰＨ２７４により表現された特有の突然変異が、他のＦＨ患者でも見い出される 突然変異の唯一の型であると解釈されることは決してない。

従って・プローブ２〜５はＰＨ２７４に付いては変化したＬＤＬ受容体遺伝子フ ラグメントパターンを示すことはできなかったが、これらプローブは、他のＦＨ 患者における他の突然変異を検出するのにを用であろう。プローブ２〜５は、受 容体遺伝子の５°半分と交雑する。従って、受容体遺伝子のこの領域に発生した 突然変異は、プローブ２〜５を用いて検出されるであろう。同様に、プローブ７ は帯りと交雑するので（第４Ａ図）、この遺伝子領域に発生した突然変異の検出 に有用であろう。

帯Ｂが、母方の（インターナライゼイション欠陥）アレルまたは父方の（無）ア レルのいずれから生じたかを決定する為に、２人の親から得たゲノムＤＮＡのＸ ｂａｌ消化を行った。第５図は、母親のＤＮＡには帯Ｂが存在するが、父親の方 には存在しないことを示しており、これは、欠失がインターナライゼイション欠 陥アレルに存在していたことを示しＬＤＬ受容体遺伝子中の突然変異の存在を検 出することができ、それによりそのような突然変異を特異的に詳細に調べられ、 同定することができる方法を提供する点で、本発明は有用であることを、以下の 実験により示す。

ゲノム組換えクローンおよびＬＤＬ受容体ｃＤＮＡプローブを用いるサザン・プ ロット法を採用して、ＰＨ患者の詳細な制限地図を作ることができる。これらの 遺伝子地図化技術は、現在、当該分野では当業者によく知られている。ＰＨ２７ ４について作られた特定の地図を第６図に示す。第６図は、正常ＬＤＬ受容体遺 伝子とＰＨ２７４からの欠失担持遺伝子の３°末端の制限地図を比較している。

下方の尺度は、ゲノムＤＮＡの長さをキロ塩基単位で示している。正常ＬＤＬ受 容体遺伝子の構成は、図の上方に示されている。エクソンは、塗り潰したセグメ ントおよび大文字により表されている。介在配列（ＩＶＳ）は、空白のセグメン トおよび小文字により表されている。ＩＶＳｃおよびエクソンＦ中のＡｌｕ反復 配列が示されている。ＰＨ２７４における遺伝子欠失を規定するのに用いる制限 酵素認識部位が示されている。

正常受容体遺伝子の制限地図は、３種のゲノムクローン（λ３３−２、λ３３− １．λｈｌ）の研究から作られた。ＰＨ２７４中の遺伝子の地図は、Ｘｂａｌフ ラグメントメン第４Ｂ図および第５図）を含むλＦＨ２７４−１０から作られた （以下参照）。制限地図の上または下の塗り潰された棒は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定 に使用した正常および突然変異遺伝子のセグメントを表す。

λＦ）１２７４−１０を得る為、ＰＨ２７４の線維芽細胞からのゲノムＤＮＡ５ ７０μｇを調製し、Ｘｂａ１１７００単位で消化した。消化されたＤＮＡを、フ ェノール／クロロホルムにより、次いでクロロホルムにより抽出し、７０％エタ ノールおよび８６ａ＋Ｍｆｉ￥酸ナトリウムにより沈澱させ、緩衝液Ｂ（１０ｍ Ｍトリス塩酸および１ｍＭ　Ｎａ＊ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）に溶解させた。ＤＮ Ａ（８０μｇ）をＸｂａｌｌＯＯ単位により再消化し、緩衝液Ａを含む１％低ゲ ル化温度アガロースゲル（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）に加え、４０Ｖ、４ ℃で７２時間、電気泳動に付した。電気泳動後、９〜２３ｋｂにわたるＤＮＡフ ラグメントを含むゲルの２ｍｍｍｍラスライス１０抽出し、濃縮し、緩衝液Ｂ２ ０μＱに溶解した。各ＤＮＡ画分の少量（４μｍ２）、Ｆ）（２７４からのＸ句 ｌ消化ゲノムＤＮＡ５μｇおよび寸法マーカーフラグメントを、緩衝液Ａを含む ０．８％アガロースゲルの個々のレーンに加え、３５Ｖ、２３℃で１６時間、電 気泳動に付した。

ＤＮＡは、上述のように、ニトロセルロース紙に移され　５ａｐ−標識化プロー ブｌと交雑された。得られたオートラジオグラムは、異常１３ｋｂＸｂａ！フラ グメント（フラグメントＢ、第４図）を含んだ両分を認識した。この画分（１０ ０ｎｇ）からの残りのＤＮＡは、λシャロン３５のＸｂａＴ消化アーム５００ｎ ｇと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イングランド・バイオラブズ）４９ ０単位と共に、１４℃で７２時間培養した。リゲート化物質を、イン・ビトロで 、λフアージ粒子（アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）中に包み込んで、全 量で６，７ｘｌＯ”のプラーク形成単位を得た。このライブラリーを、３１ｐ− 標識化クローン８（第１図）によりスクリーンした。このプローブ８は、対応す る正常フラグメント（７ｋｂ）は見える組換えファージを発生するには小さすぎ るので、異常フラグメントのみを検出するものと予想された。１つの組換えクロ ーンが確認され（λＦｌ（２７４−１０）、さらにプラーク精製を１サイクル行 った後に分離した。λＰＩ（２７４−１０への１３ｋｂインサートを、精製ＤＮ Ａから分離し、ｐｓＰ６５（プロメガ・バイオチク（Ｐ　ｒｏｍｅｇａＢｉｏｔ ｅａ）　）にサブクローン化し、制限エンドヌクレアーゼの地図化の為に用いた 。

第６図は、ＩＶＳ　ｃ中のＰｖｕ１１部位およびエクソン中の５ｓｔ１部位が、 正常遺伝子のクローン化フラグメントでは約５、８　ｋｂ離されているが、ＰＨ ２７４の遺伝子のクローン化フラグメントでは約０、６　ｋｂＬ、か離されてい ないことを示している。さらに、Ｐｖｕ１１部位と５ｓｔ１部位との間の数種の 制限酵素部位が、クローン化されたＰＨ２７４遺伝子からは失われていることが 示されている。これらのデータは、上述したゲノムのサザン・プロットによる診 断を確認するものであり、さらに、ＤＮＡの５ｋｂがＰＨ２７４遺伝子から欠失 したことを示唆したものである。

欠失は、ＩＶＳｃの３゛末端、エクソンＤおよびＥの全部ならびにそれらを分離 しているＩＶＳ、およびエクソンＦの５°末端を含んでいた。

５′お上び３°の破壊点の位置およびＰＨ２７４中の欠失結合の構造を正確に決 定する為、第６図の棒により区切られた遺伝子のクローン化部分のヌクレオチド 配列を決定した。これら配列から、欠失結合は、反対方向に配向されたΔｂ種の ２つの反復要素間で起こっていることが分かつた。欠失結合の５°側は、ＩＶＳ ｅ中のＡｌｕ配列から誘導された。欠失結合の３°側は、エクソンＦ中の逆に配 向しＡｌｕ配列から誘導された。

第２のＰＨ患者に付いて、本発明を用いて試験を行ったが、この患者のＬＤＬ受 容体遺伝子の欠失を発見することはできなかった。この働者のＬＤＬ受容体遺伝 子における欠失は、点突然変異に起因するものと考えられる。欠失突然変異に起 因しない欠陥は、別の出願に記載する本発明の改良および拡張により検出するこ とができる。

反復ＤＮＡ配列間の組換えは、欠失の原因であると仮定されるが、本発明者らの 知識によれば、そのような再配列は、真核生物細胞では報告されていない。最も よく特性付けられた哺乳類欠失突然変異、すなわちヒトアルファーおよびベータ ーグロビン遺伝子に起こる突然変異において、欠失破壊点の１つは、卸配列中で しばしば起こるが、他の破壊点は、これまで常にＤＮＡの非反復配列中で起こっ ていた。

本発明を実施する為に好ましい方法であると発明者らが考える例に付いて、本発 明を説明してきた。しかし、決してそれらが本発明を実施する唯一の態様である ことを意味しているのではない。たとえば、制限酵素ＸｂａＩはＰＨ２７４が持 つ特定の突然変異を示すのには有用であったけれども、他のＰＨ患者のある突然 変異を示すには、他の制限酵素が必要であろう。同様に、本発明者らは、サザン ・プロット法が、ＬＤＬ受容体遺伝子フラグメントのパターンを表す為の最良の 方法であると考えているが、他の方法も採用でき、本発明の範囲に含まれると考 えるべきである。たとえば、フラグメントをカラムクロマトグラフィにより分離 し、カラムから溶離されてくる際に遺伝子フラグメントの存在を分析することも 可能である。同様に、本発明を実施する際に使用したプローブは放射性標識され ていたが、放射性標識が、プローブを検知可能にする為の唯一の方法であると考 えてはならない。たとえば、ＤＮＡ交雑プローブは、雷同位体により標識化して もよく、あるいは、ビオチンのようなリガンドを結合することにより標識化して もよい。一般に、独立して検知できる特異的に結合できるリガンドはいずれも使 用することができる。これらおよび他のあらゆる変更は、以下の請求の範囲に含 まれると考えなければならない。

開示された特定のケースは、欠失から生じた突然変更であるが、本発明を更に拡 張することにより、単一ヌクレオチド変化を含む他の種類の原因から生じる突然 変異も検知することができる。後者は、制限酵素開裂部位の損失または獲得に結 び付く場合、サザン・ゲル・プロットで直接検知することができる。単一ヌクレ オチド変化も、ｃＤＮＡの配列に対応した化学合成オリゴヌクレオチドに対する 短いセグメントのｃＤＮＡとの還元交雑により検知することができる。弱くされ た交雑は、突然変異体および正常ＤＮＡ配列が、相互に交雑した後に、「融解」 または解離することにより検知することができる。そのような異常な融解挙動は 、熱、低イオン強度、または尿素およびホルムアミドのような交雑ＤＮＡの鎖を 解離する薬品に対する感受性の増加として検知される。従って、本発明は、ＬＤ Ｌ受容体遺伝子のあらゆる可能な突然変異の診断に有用である。

Ｉ剛−・１ｌｌ−＾ｐ−−１舗ｔ＋、、ＰｃＴ／ＩＪＳ　８５１０２４６１ＡＮ ＮＥＸ　ＴＱ　τＦ、Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＦ、ＲＥＰ ＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡτＩｏＮ　Ｎｏ、　 ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０２４６ｍ　（ＳＡ　１１７３８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＬＤＬ受容体蛋白質をコードする第２ＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能 部分に対して相補的である第１ＤＮＡ配列を有して成る組換えＤＮＡ転移ベクタ ー。 ２．第１ＤＮＡ配列が、ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの少なくとも交雑可能部分に 対して相補的であるｃＤＮＡ配列として更に規定される請求の範囲第１項記載の 組換えＤＮＡ転移ベクター。 ３．第１ＤＮＡ配列が、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分として更 に規定される請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 ４．第１ＤＮＡ配列が、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分として更 に規定される請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 ５．組換えプラスミドとして更に規定される請求の範囲第１項記載の組換えＤＮ Ａ転移ベクター。 ６．組換えバクテリオファージとして更に規定される請求の範囲第１項記載の組 換えＤＮＡ転移ベクター。 ７．プラスミドｐＬＤＬＲ−２として更に規定される請求の範囲第５項記載の組 換えＤＮＡ転移ベクター。 ８．バクテリオファージがバクテリオファージλ３３−１として更に規定される 請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 ９．バクテリオファージがバクテリオファージλ３３−２として更に規定される 請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 １０．バクテリオファージがバクテリオファージλｈＩとして更に規定される請 求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 １１．ヒトＬＤＬ受容体蛋白質をコードする第２ＤＮＡ配列の少なくとも交雑可 能部分に対して棺桶的である第１ＤＮＡ配列を有して成る組換えＤＮＡ転移ベク ターを有する細菌株。 １２．第１ＤＮＡ配列が、ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの少なくとも交雑可能部分 に対して相補的であるｃＤＮＡ配列として更に規定される請求の範囲第１項記載 の組換えＤＮＡ転移ベクター。 １３．第１ＤＮＡ配列が、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分として 更に規定される請求の範囲第１１項記載の細菌株。 １４．細菌株が、ＡＴＣＣ＃３９９６６として確認される請求の範囲第１１項記 載の細菌株。 １５．第３図のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するものとして更に規 定される請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ転移ベクター。 １６．ヒトＬＤＬ受容体蛋白質をコードする第２ＤＮＡ配列の少なくとも交雑可 能部分に対して相補的である第１ＤＮＡ配列を有して成るＤＮＡ配列。 １７．第１ＤＮＡ配列が、ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの少なくとも交雑可能部分 に対して相補的であるｃＤＮＡ配列として更に規定される請求の範囲第１６項記 載のＤＮＡ配列。 １８．第１ＤＮＡ配列が、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分として 更に規定される請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列。 １９．第１ＤＮＡ配列が、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分として 更に規定される請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ配列。 ２０．第１ＤＮＡ配列が、第４Ａ図のプローブ番号１、２、３、４、成るものと して規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５．ＤＮＡフラグメントの分離が、フラグメントをゲルマトリックスを用いた 電気泳動に付すこととして更に規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２６．ゲルマトリックスが、アガロースゲルマトリックスまたはポリアクリルア ミドゲルマトリックスとして更に規定される請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．ＤＮＡフラグメントの分離が、ＤＮＡフラグメントをクロマトグラフィー 分離に付すこととして更に規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８．ＤＮＡフラグメントの分離が、ＤＮＡフラグメントを速度沈降に付すこと として更に規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２９．予備選択された制限エンドヌクレアーゼが、ＸｂａＩである請求の範囲第 ２２記載の方法。 ３０．ＬＤＬ受容体遺伝子に対応するＤＮＡフラグメントのパターンの確認が、 標識化ＬＤＬ受容体遺伝子ＤＮＡフラグメントを、段階（ｂ）５、６、７、８ま たは９である請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列。 ２１．第１ＤＮＡ配列が、第４Ａ図のプローブ番号１、６、８または９である請 求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列。 ２２．人のＬＤＬ受容体遺伝子の突然変異を診断する方法であって、（ａ）人の 細胞からのＤＮＡを分断し、（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡフラグメントを、それら の物理化学的性質に従ってパターンに分離し、（ｃ）ＬＤＬ受容体遺伝子に対応 するＤＮＡフラグメントのパターンを確認し、（ｄ）正常ＬＤＬ受容体遺伝子Ｄ ＮＡフラグメントのパターンと比較して段階（ｃ）のパターンにおける変化を確 認することにより突然変異を診断することから成る方法。 ２３．ＤＮＡの分断が、予備選択された制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡを 消化することとして更に規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．物理化学的性質が、分子量または全電荷の少なくとも１つからで分離され たＤＮＡフラグメントパターンと交雑させ、標識を用いて交雑フラグメントのパ ターンを確認することとして更に規定される請求の範囲第２２項記載の方法。 ３１．標識が放射線標識であり、オートラジオグラフィーにより交雑フラグメン トのパターンを確認する請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２．ＤＮＡフラグメントが、ヒトＬＤＬ受容体蛋白質をコードする第２ＤＮＡ 配列の少なくとも交雑可能部分に対して相補的である第１ＤＮＡ配列の少なくと も交雑可能部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ３３．ＤＮＡフラグメントが、プラスミドｐＬＤＬＲ−２のｃＤＮＡインサート から誘導されたＤＮＡの交雑可能部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方 法。 ３４．ＤＮＡフラグメントが、ヒトＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの少なくとも交雑可能 部分に対して相補的であるｃＤＮＡの少なくとも交雑可能部分を含んで成る請求 の範囲第３０項記載の方法。 ３５．ＤＮＡフラグメントが、第３図のＤＮＡ配列の少なくとも交雑可能部分を 含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ３６．ＤＮＡフラグメントが、プラスミドｐＬＤＬＲ−２の少なくとも交雑可能 部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ３７．ＤＮＡフラグメントが、バクテリオファージλ３３−１の少なくとも交雑 可能部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ３８．ＤＮＡフラグメントが、バクテリオファージλ３３−２の少なくとも交雑 可能部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ３９．ＤＮＡフラグメントが、バクテリオファージλｈ１の少なくとも交雑可能 部分を含んで成る請求の範囲第３０項記載の方法。 ４０．ＤＮＡフラグメントが、第４Ａ図のプローブ番号１、２、３、４、５、６ 、７、８または９である請求の範囲第３０項記載の方法。 ４１．ＤＮＡフラグメントが、第４Ａ図のプローブ番号１、６、８または９であ る請求の範囲第３０項記載の方法。