JP3704145B2 - 結節硬化症2遺伝子及びその利用 - Google Patents
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Description
発明の背景
以降に陳述する文献は全て本詳細な説明の最終に列挙し、そしてその内容全体を引用することで本明細書に組入れる。
16Pにおいてのアレルについてのヘテロ接合能の損失がTSC 患者由来の過誤腫において観察され(Green and Yates, 1993;Smith ら、1993)、TSC 表現型を細胞レベルでもたらすのに第2の体細胞性突然変異が必要でありうることを示唆する。この観察は、その他の母斑症、神経線維症1型(NF1)(Legiusら、1993)及び2型(NF2)(Trofatterら、1993)、並びにフォン・ヒッペル−リンド−(von Hippel-Lindau)病(VHL) (Latifら、1993)の原因となる遺伝子の共通の特徴である腫瘍抑制因子として働く染色体16と一致する。Knudson(1971) により提唱されているツーヒットメカニズム(two-hit mechanism) がTSC に適用されるなら、不活化性構成突然変異が予測されるであろう。TSC10 染色体16α−サラセミア/精神遅退症候群(ATR−16)及び前記候補領域の末梢部に及んでいる16p末端欠失を有する個体において認められている(Wilkieら、1990)。従って、本発明の発明者は前記候補領域の基端部の欠失について調べた。
発明の概要
従って、一の観点において、本発明は単離された、精製された、又は組換の核酸配列であって:
(a)TSC 遺伝子又はその相補鎖、
(b)上記(a)において規定する分子の実体部分に対して実質的に相同性の、又はそれにハイブリダイズできる配列、
(c)上記の(a)又は(b)において規定する分子のフラグメント、を含んで成る配列を提供する。
(i)末端小粒染色体バンド16p13.3の中に存在する、
(ii)TSC 患者において突然変異している、
(iii )マーカー GGG1と16AC2との間にある。
(a)〔WS−13〕約32kbが欠失しており、CW13及びCW9が隣接する;
(b)〔WS−9〕約46kbが欠失しており、SM9及びCW12の中に破断点を有する;
(c)〔WS−211 〕約75kbが欠失しており、CW9とCW15との間の末梢側に、及びCW23とCW21との間の基端部側に破断点を有する;
(d)〔WS97〕 BFS2とSM9との間の末梢側にて、及びCW20内の末端部側にて約75kbが欠失している;
(e)〔WS−53〕末梢側でCW23と隣りのJH1との間で約35kbが欠失しており、そして基端部側で TCS2の0.6kb が欠失しており、その欠失はSH6とJH13との間で基端部側にある;
(f)〔WS212 〕図8に示す通り、SM9−CW9の末梢側と TSC23′UTR の基端部側で約75kbが欠失している;
(g)〔WS−215 〕図8に示す通り、CW20とCW10−CW36との間で約160kb が欠失している;
(h)〔WS−227 〕図8に示す通り、CW20とJH11との間で約50kbが欠失している;
(i)〔WS−219 〕図8に示す通り、JH1とJH6との間で約27kbが欠失している;及び
(j)〔WS−250 〕図8に示す通り、CW20において約160kb が欠失している;
配列から選ばれるものを提供する。
A.患者から生物学的な組織又は生検を採取する;
B.試料中の TSC2DNA, TSC2mRNA及び/又は TSC2タンパク質の存在を検査及び/又は特徴を評価して、第1セットの結果を得る;
C.この第1セットの結果を、前記疾病を有するものと予測されていない個体に関して同一又は類似の方法論を利用して得られた第2セットの結果と対比させる:
ことを含んで成り、そしてもしこの第1と第2セットの結果が、 TSC2DNA が欠失している、存在していない、異常である、突然変異している又は TSC2タンパク質を発現しないとの点で相異するなら、それはその患者の前記疾病の存在、素因又はそれを発症する傾向を示唆している。
パク質と対比させることを含んで成る。
C.第1セットの結果を、少なくとも1種の前記疾病を有することのわかっている個体において同一又は類似の方法論を利用して得られた第2セットの結果と対比させる;そしてもしこの第1セットと第2セットの結果が実質的に同一であるなら、このことはその患者における TSC2DNA が欠失している、突然変異している、又は正常な TSC2タンパク質を発現しないことを示唆している。
A.対象体の TSC2遺伝子中の各エクソンを増幅させる;
B.増幅させたエクソンの相補鎖を変性させる;
C.変性分離した相補鎖を希釈して、各一本鎖DNA 分子が二次構造コンホメーションを帯びるようにする;
D.このDNA 分子を非変性条件下で電気泳動にかける;
E.前記一本鎖分子の電気泳動パターンを、正常又は TSC2ヘテロ接合ゲノタイプのいづれかを有するコントロール個体に由来する同じ増幅させたエクソンを含む一本鎖分子の電気泳動パターンと対比させる;そして
F.コントロール個体のDNA から提供したパターンと異なる電気泳動パターンを有する任意の増幅生成物を配列決定する;
ことを含んで成る。
(a)クローンCW21(WS−9,WS−13, WS−97)及びJH1(WS−53)でプローブしたTSC 患者及びコントロール由来の Mlu1−消化DNA のPFGE。これは正常な個体(N)における〜120kb のフラグメント及びその患者における追加のより小さいフラグメントを検出する。CW21は患者WS−53において欠失しており、従って異常な〜90kbフラグメントを認識しない。WS−97欠失は末梢MluI部位を含む〜75kbを除去し、〜74kbのジャンクションフラグメントを生み出す(図2参照)。
(c)慣用のゲル上で、分離させ、そして欠失に隣接するプローブ(CW9及びCW13)とハイブリダイズさせた正常コントロール(N)及びWS−13(13)由来の EcoRI−消化DNA(図2参照のこと)。同じ7kb破断フラグメント(矢印で示す)が両マーカーで見い出され、これらのプローブにより見い出せるEcoRI フラグメント内において終了する32kb欠失と一致する。
(a)症例5773及び1737におけるサザンブロット分析。患者(P)由来のHindIII −及び−BamHI −消化DNA 並びに無関係のコントロール(N)をcDNAプローブE0.7 とハイブリダイズさせた。このプローブは〜14kb及び2.5kb の隣接のHindIII フラグメント並びに〜14kbの単一BamHI フラグメントを検出する。症例5773において, BamHI フラグメント内の〜1kbの欠失はHindIII 部位を除去し、〜16kbのジャンクションフラグメントを生み出す。症例1737における〜4kbの欠失は〜10kbの新規のHindIII 及びBamHI フラグメントを生み出す。隣りのフラグメントは正常である。
図面の詳細な説明
TSC 候補領域における欠失
TSC 候補領域に及んでいる16P (wilkieら、1990) において構成欠失を有する ATR−16患者(Bo)(図1)をTSC 徴候について特別に再評価したが(臨床評価、腎起音波及び頭蓋CTイメージング)、ネガティブな結果が得られた。本発明はTSC 関連欠失についての研究を候補領域の一層基端部に焦点を当てることを決意した。その領域のほとんどは約340kb のClaI制限フラグメントに広がる(Germinoら、1992, Harrisら、1990)。パルス電場ゲル電気泳動(PFGE)を利用し、SM6を有する 255人の無関係のTSC 患者においてこのフラグメントを検定し、コスミドSMIIから単独のコピープローブを単離した(図1)。患者は全員Gomez により規定された具体的な診断基準(1988)に合格した。構成間隙欠失と一致する異常な小型のフラグメントが5症例において観察された。これらの変化はTSC 遺伝子に関与する傾向があるため、本発明者は欠失を含む更なる領域を特性決定することを決意した。
PFGE欠失及びゲノムクローニングの地図化
コスミド歩行を既に規定されている遺伝子座JCII及びN54から始めた(Germinoら、1990; Himmelbauerら、1991)。基端部方向の歩行はTSC 関連欠失の領域にわたって200kb 広がる一連の重複クローンを確立し、一方末梢方向の歩行は16pの一層基端側の配列に相同性の二本鎖領域により妨げられた(Germinoら、1992)。長いレンジの制限地図にゲノム及びクローニングしたDNA (それは Germinoら(1992)により作られたものとサイズにおいて一致するが、NruI及びMluIについての追加の部位が同定されている)において構築した。 SacII及びBssHI 部位の地図化はメチル化されていない CpG島の位置決めを可能にした(図2)。この領域をEcoRI 及びその他の制限酵素で正確に地図化し、そして数多くのフラグメントをサブクローニングした(詳細は図2及び実検手順)。
パルス電場欠失を担持する領域における遺伝子
TSC 関連欠失の領域に広がるコスミドに由来するサブクローニングしたプローブ及びフラグメントを、ヒト胎児脳及びヒト腎臓cDNAライブラリーをスクリーニングするために用いた。標的領域に至る陽性クローンの地図化は誘導16染色体(この領域に隣接する破断点、即ち、末梢例のN−OH1および基端部側のP−MWH2A(図1)を有する)を含む体細胞ハイブリド及び陽性コントロールとしてのこの領域を含む放射線ハイブリドHy145.19のパネルに対するハイブリダイゼーションにより確認した。様々なヒト細胞系に由来するRNA を利用するノーザンブロット分析は、クローンが4種の明らかに無関係な遺伝子に由来することを示唆した。コスミド、ゲノム及びハイブリド DNAの消化物へのcDNAクローンのハイブリダイゼーションは遺伝子のゲノム分布を示す。配列分析は各遺伝子のポリAテールを同定し、そしてその転写方向を確立した。
TSC2発現
ノーザンブロット分析は、 TSC2が、脳、腎臓、皮膚、肝臓、副腎、結腸及び白血球に由来する細胞系を含む試験した全ての細胞系において見い出される5.5kb の転写体と共に幅広く発現されることを示唆した。発現は、肝臓、腎臓及び心臓を含む試験した全ての組織、並びにリンパ球、繊維芽細胞及び胆管表皮細胞においても見い出せた。繊維芽細胞における TSC2発現の高レベルは、正常コントロール及びTSC 患者由来の繊維芽細胞における転写レベルの対比を可能にする。TSC が染色体16p13.3マーカーと一緒に分離するが、突然変異が同定されなかった一の家族において、冒されている者は明確に低下したレベルの TSC2転写体を示した。隣接遺伝子由来の転写体不変の発現レベルを示した。
TSC2に影響を及ぼす遺伝子内突然変異
260人の無関係のTSC 患者由来のDNA 試料を、ハイブリダイゼーションプローブとしてcDNAサブクローンを用い、 TSC2内の確証的な転移(Confirmatory rearrangements)についてのスクリーニングした。試験した患者全員がGomez(1988)の具体的な診断基準に合格し、そしてPFGEにより予め研究されたものの多くを含んでいた。PFGE異常が発見された症例の他に、更に5人の患者において多重制限酵素により異常なバンドが認められた。ゲノムクローンとハブリダイゼーションプローブとしての小さなcDNAフラグメントの組合せを利用するサザン分析は、これらの変化が小さな欠失を示していることを実証した。各欠失セグメントの位置を EcoRI, HindIII 及びBamHI 部位のゲノム地図に相対させて確認した(図5)。患者WS−210において発見された最も5′例の欠失は全体が遺伝子内になく、なぜならそれはOCTS3遺伝子も含んでいたからである。欠失は5〜6kb広がり、そして TSC2コード配列を含むゲノムプローブCW26を除去する。4種のその他の欠失は全て TSC2内に全体的に入っていることが見い出された。患者5773における約1kbの欠失はイントロンのHindIII 部位を除去することが示された。この場合、突然変異は冒された両親においても検出された。更なる2つの症例 (WS−80及び1737)においては、それぞれ約3kb及び5kbの欠失が同定された。これらの症例の両親は冒されてはいないと考えられたが、分析にかけることができず、その変化がde nove 突然変異を示していることを確認することができなかった。一方、患者WS−11の共に臨床学的に冒されていない両親は分析にかけることができ、そして〜5kbの欠失(これはPFGE上では発現されなかった) がde nove 突然変異を示すことを示した。この欠失はイントロンのHindIII 部位及び上流イントロンのEcoRI 部位を除去した。これらの部位にわたって広がり、且つ TSC2転写体を検出するゲノムプローブCW18は欠失しているものと示された。この患者から調製した白血球ポリARNA はノーザン分析で〜4.5kb の異常な TSC2転写体を示した。これらの発見は TSC2が染色体16の結節硬化症決定遺伝子であることを確認した。
TSC2に関与する更なる欠失
TSC が乳児性多嚢胞腎臓病に関連している6人の患者における TSC2及び PKD1の双方に関与する欠失を同定し、そして特性決定した。WS−53における欠失と同様に、WS−215 及びWS−250 におけるものは、 PKD1の既知の分布を基端部側ではるかに超えて広がり、そしておそらくは全遺伝子を欠失させていた。WS−194 における欠失は既知の PKD1の範囲よりも広く広がっていたが、しかし基端部側ではそれほどでなく、一方WS−219 及びWS-227における基端部側の破断点は PKD1自体の中にあった。欠失の外側に広がるプローグJH8による症例WS−219 のノーザン分析は低下したレベルの PKD1転写体を示したが、しかし異常なサイズの転写体の証拠はなかった(データーは示さない)。患者WS−53, WS−215, WS−219, WS−227 及びWS−250 の臨床的に冒された両親由来の試料の分析は、これらの患者における欠失がde novo であることを示した。WS−194の父親は試験できなかった。
TSC2の特性決定
TSC2遺伝子を更に特性決定するため、進化保存を研究し、そして配列分析を行った。様々な動物種に由来するゲノムDNA を含む「動物園(200)−ブロット」は、 TSC2遺伝子が高等脊椎動物全体で保存されていることを示した。霊長類から強力なシグナル得られ、そして低度の相同性を示すシグナルがげっ歯類、有袋類及びは虫類を含むいく種かのその他の脊椎動物から得られた。魚類又は無脊椎動物種からのシグナルは得られなかった。 TSC2転写体を両鎖において完璧に配列決定した。配列は全て少なくとも2つの独立cDNAクローンにおいて確認した。得られるコード配列は5474bp広がっていた(図6)。反復cDNAライブラリー再スクリーニングにかかわらず、5′を更に超えるクローンは同定できなかった。有効な配列はノーザンブロット分析により決定される転写体サイズに似ていた。cDNAはフクレオチド1から5370に至るオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。2番目に優れた ORFは 402bp以下であった。ヌクレオチド位置19において、我々はKozak 説に適合するフレーム内開始コドンを発見した(Kozak, 1987)。3′末端において、我々はヌクレオチド5425にて2つの部分的に重複したポリアデニル化シグナル(AATAAATAAA)を認識した。このタブレットの発生は異なり合うポリアデニル化を生じせしめうることがあり、なぜなら我々は4種のcDNAクローンの中に15bpまで異なるポリアデニル化部位を発見したからである。推定タンパク質の全長は1784個のアミノ酸であり、計算した分子量は 198kdである。見かけ上のシグナルペプチド又はシグナルペプダーゼ切断部位はなかった。Eisen bergら(1984)により述べられてる方法を利用し、我々は疎水性ドメインを同定し、その4つは膜スパニング領域を示しうる。推定α−ヘリックス構造において、9個のアミノ酸の反復モチーフにより囲まれた22個のアミノ酸の鎖がロイシンジッパー説に合致した(Landschulzら、1988)。タンパク質レベルでの配列相同性の研究は、 TSC2の推定生成物とGTPase活性化タンパク質 GAP3(又はrap1GAP)との類似領域を示した(Rubinfeldら、1991)。この領域は58個のアミノ酸以上に広がり、そして残基同一性レベルはSander and Schneider (1991)の構造相同性についての基準を合格していた。最初の39個のアミノ酸のうち、14個がネズミGAP 及びヒトGAP と同一であった。17残基のコア鎖は同一又は類似のアミノ酸を含み、1個の誤対合のみあった(図4)。
考察
本発明者は結節硬化症において突然変異した染色体16上の遺伝子を同定するのに位置クローニング手法を利用した。TSC の生物学的及びその他の疾病とのその関係を考慮したいくつかの問題が解決できる。 TSC2遺伝子は、Germino ら(1992) により決定された常染色体優性多嚢胞腎臓病1型(ADPKD1)を引き起こす未同定の PKD1遺伝子についての候補領域内に広がる。多嚢胞腎臓はTSC 及び ADPKD1に共通の特徴であるため(Bernstein and Robbins, 1991)、Kandt ら (1992)により提唱されている病因リンクの可能性を考慮せねばならない。しかしながら、腎性嚢胞症が染色体9−関連TSC 家系において報告され(Nellistら、1993)、それ故その存在は染色体16関連TSC に限定されない。更に、TSC 及び ADPKD1嚢胞は巨視的に似ているが、上皮皮膜TSC 関連嚢胞は通常組織学的に異なると考えられている(Bernsteinら、1974)。これらの観察にもかかわらず、TSC 及び ADPKD1の染色体16関連形態はアレル変更であるとの仮設をたてることができうる。しかしながら、本発明者はこれが本当であるとの証拠を何ら発見していない。本発明者がツベリンと呼んでいる推定タンパク質の配列における可能な機能性モチーフについての研究は注目のいくつかの領域を示唆する。膜定着に関与しうる4つの疎水性ドメイン及び4つ潜在的なグリコシル化部位が最後の推定トランスメンブランドメインの下流に観察された。推定アミノ酸のアミノ末端にあるどの配列もvon Heijneにより規定されたシグナルペプチド構造と一致しなかった。しかしながら、見かけ上のシグナルペプチドのないいくつかのトランスメンブランドメインの存在が、嚢胞繊維芽症関連タンパク質CFTRにおいて認められた(Riordanら、1989) 。我々はまたタンパク質間相互作用に関連する構造であるロインシン残基の周期配列(ロイシンジッパー)を見い出した。同定された配列モチーフの機能的な有意性に至る識見を担うであろうツベリンの細胞局在を決定する実験を進めた。高度に多様性であるTSC 表現型を理由に、患者の近親者の遺伝状態はかなり診断的研究を経た後でさえも不明のままでありうる。(Al−Gazaliら、1989;Fryeo 3,1990)。この状況において、原因的な突然変異の同定は非常に有用であろう。この研究においては比較的少ない数の突然変異しか報告していないが、 TSC2遺伝子配列がわかっている今ではその他の手法、例えばSSCP分析(Oritaら、1989)を適用することができうる。染色体9上の TSC1遺伝子の同定も、TSC における完全な突然変異スペクトル及びDNA ベース診断の実用性が評価される前に達成できる。本発明者は無関係なTSC 患者においてTSC 2遺伝子の異なる部分に影響を及ぼす多数の欠失突然変異を同定した。冒された個体におけるこのパターン及び見い出せる TSC2の められた発現性は、TSC における構成突然変異が不活化である傾向にあることを示唆する。TSC 関連損傷の斑状病巣の性質及びそれらが示すヘテロ接合能の損失(Green and Yatcs, 1993)はホモ接合のない状態への低下が、細胞増殖の前及び分化が無秩序となる前に必要であることを示唆する。不活化構成及び体細胞突然変異の組合せが網膜芽腫におけるRb遺伝子において (Horowitzら、1989)、そしてより近年、神経繊維肉腫において(Legiusら、1993)明確に示された;それはNF2(Rouleauら、1993)及びVHL (Latifら、1993)においても提唱されている。従って、 TSC2はKnudson の発癌理論(Knudson, 1971)により規定の腫瘍抑制遺伝子としてもふるまうようであろう。これらの所見の見地において、ツベリンが、p21ras と拮抗すると考えられているGTP 結合性タンパク質であるp21rap1のGTPase活性を強める GAP3に対して相同性の領域を含むということは興味深い。この相同性領域は GAP3の触媒活性に必要であることで知られている領域内にある(Rubinfeldら、1992)。ツベリンはp21rap1、又は細胞の増殖を及び分化のコントロールに関与するその他のGAP タンパク質についてのGAP 活性を有しうる可能性がある。NF1において似たような状況が既に実証されており、それではp21rasの正常な調節がrasGAP相同性ニューロフィブロミンに影響を及ぼす突然変異により破綻される (Xuら、1990及びMartinら、1990)。様々な母斑症に関与するタンパク質が同定されるに従い、その機能及び考えられる相互関係が確立されるであろう。
実験手順
パルス電場電気泳動
高分子量DNA を標準の方法(Hermannら、1987) によりマガロースプラグ中で末梢血液から単離し、そして製造者の推奨に従って消化した。ブロックを1%のアガロースゲルのウェルに載せ、そしてBioRad CHEF DRII又は類似の装置及び必要な様々な解像度に適するプログラムを用いて電気泳動を行った。
サガンブロット分析
ゲノムDNA を標準の方法により末梢血液から抽出した。5〜8μgのDNA を制限酵素で消化し、アガロースゲルで電気泳動し、そして記載の通りにしてナイロンフィルターにブロッティングした (Sambrook3,1989)。プローブをランダム・プライマー法(Feinbergand Vogelstein, 1984)によりラベル化した。反復要素を含むプローブについては、10ngのラベル化DNA を、ハイブリダイゼーションの1〜5hr前に 650Cで全容量 200μlにおいて 0.1〜1mgの変性音波処理全ヒトDNA と予め結合させた。必要な、フィルターを更に 100μg/mlの変圧音波処理全ヒトDNA 及びサケ精子DNA とプレハイブリダイズした。フィルターをハイブリダイズし、記載の通りに洗い (Sambrookら、1989)、そして−70℃で塩酸スクリーンを用いてオートラジオグラフィーフィルムに暴露した。
DNA プローブ及び体細胞ハイブリド
この試験において用いたいくつかのプローブは既に述べられている:MS205.2(D16S309 ,Royle ら、1992); GGG1(D16S259;Germino ら、1990);16AC2.5(D16S291 ;Thompsonら、1992)及びN54(D16S139 ;Himmelbauer ら、1991)。いくつかの新しいプローブもこの試験中に単離された:SM6, SMII由来の2.3kb の Sau3Aフラグメント; BFS2, CC1−2の1.8kb のBssHIIフラグメント;SMa, CBFS1の7kbのRcoRI フラグメント;CW9,CBFS1の1kbの EcoRI/NotIセグメント;CW15, CW9Dの10kdのEcoRI /NotIフラグメント;CW24及びCW26はCW9Dのそれぞれの0.9kb 及び0.4kb の SacII及び SacII/ SacIフラグメントである;CW13及びCW12はCW9D由来のそれぞれ2.2kb 及び2.0kb のEcoRI /NotIフラグメントである;CW18M, CW20 はCW12I 由来のそれぞれ3kb及び16kbの EcoRI/NotIフラグメントである;JH1はCW12I の4.4kb のBamHI フラグメントである;そしてCW23及びCW21はそれぞれJHIKの14kb及び3.5kb のNotI/EcoRI フラグメントである。SM6, BFS2,CW26及びCW21を除く新しいプローブは全て反復配列を含み、そして変性音波処理ヒトDNA(75mg/ml) とハイブリダイズさせ、そして0.05×SSC, 0.2%のSDS の中で65℃で洗った。
RNA 単離及びノーザンブロット分析
RNA をChomczynski and Sacchi (1987) の酸フェノール法により細胞系及び組織から抽出した。mRNAをビオチニル化オリゴ(dT) プライマー及びストレプトアビジン複合型強磁性粒子(PolyATtract mRNA lsolatim System, Promega)を用い全RNA から単離した。RNAを変性ホルムアルデヒドゲルの中で分け、そして標準の手順によりノーザンブロッティングした。ノーザンブロットのハイブリダイゼーション及び洗浄はサザンについて記載の通りとした。
コスミド歩行
コスミドはいく種かのライブラリーから得た。Los Alamos染色体16特異性ライブラリー(Stallingsら、1990) 並びに全ゲノムコスミドライブラリー412 及びIG328(Integrated Genetics)及び961200(Stratagene)。連続コスミド歩行は各コスミドを地図化し、末端のクローンを単離し、そして必要なら反復配列を抑制する条件を利用してライブラリーを再ハイブリダイズさせることにより行った。コスミド/ゲノムEcoRI 地図を作り、そしてコスミドの位置をハイブリドパネル上での地図化、PFGE及びin situ ハイブリダイゼーションでの蛍光によりチェックした。
cDNA単離及び特性決定
cDNAについてのスクリーニングは標準のファージプレーティング、フィルターリフト及びクローン精製技術を利用して、ヒト胎児脳(Clonetech, Stratagene) 及びヒト成人腎臓(Clonetech) 由来の市販のライブラリーで実施した。反復配列は上記の通りに抑制させた。 650℃で一夜のハイブリダイゼーションの後、フィルターを記載の通りに洗った(Sambrook, 1989)。陽性クローン全てをpBluescript 又はpUC ベクターのいづれかにサブクローニングし、そしてPharmacia A.L.F.又はABI モデル 373A自動シーケンサーによりその製造者のプロトコールに従って、又はマニュアルで配列決定した。
Claims (5)
- 前記 TSC2DNA 又はTSC2RNAが突然変異しているか又は欠失しているかを検査及び/又は評価することを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記スクリーニングが、前記TSC2DNA 又は前記TSC2RNA に対応するcDNAのフラグメントを増幅するために、前記試料に核酸増幅過程を適用することを含む、請求項1又は2記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の方法を実施するための診断キットであって、請求項1項規定するTSC2DNA又は対応のTSC2RNAを増幅するための核酸プライマーを含んで成るキット。
- 対象者が TSC2関連疾病キャリヤーであるか又は TSC2関連疾病を有する患者であるかを決定するための方法を実施するための診断キットであって、請求項1に規定するTSC2DNA又は対応のTSC2RNAにハイブリダイズすることのできる核酸プローブを含むキット。
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