JP4440905B2 - 多発性嚢胞腎１型遺伝子及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、多発性嚢胞腎１型遺伝子（polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene)、PKD1−関連障害をもつ患者におけるその突然変異、PKD1によりコードされたタンパク質、及び診断及び治療におけるそれらの使用に関する。

発明の背景
以下に述べる文献の全てを、本説明の最後に全て列記し、これを全体として引用により本明細書中に取り込む。文脈が特に明示しない限り、PBP 遺伝子、転写物、配列、タンパク質その他への言及は、それぞれ、PKD1遺伝子、転写物、配列、タンパク質その他を言及するものと読まれることができる。

Dalgaad, 1957 による画期的な研究は、成人多発性嚢胞腎（adult polycystic kidney disease (APKD)) ともいわれる常染色体優性多発性嚢胞腎（autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)) がヒトの一般的な遺伝子病の中の１（約１／1000の罹患個体）であることを示した。この優性疾患の主要な特徴は、一般的に成人期に腎不全を導く嚢胞性腎の顕出である。しかしながら、この簡単な記載は、多様な全身的障害について偽りであり、多くの他の臓器（Gabow, 1990 中でレビューされた）及び子供において場合により存在するもの（Fink, et al., 1983, Zerres, et al., 1993)に影響を及ぼす。腎外顕出は、肝嚢胞（Milutinovic, et al., 1980)、及びより稀には膵臓の嚢胞（Gabow, 1983)及び他の臓器を含む。頭蓋内動脈瘤（Intracranial aneurysms) が、患者の約５％で生じ、そしてタモ膜下出血（subarachnoid haemorrhage) による罹患率及び死亡率のかなりの原因である（Chapman, et al., 1992)。さらに最近、心弁欠陥（Hossack, et al., 1988)、ヘルニア（herniae) (Gabow, 1990)及び結腸憩室（colonic diverticalae) (Scheff, et al., 1980)の増加率が報告されている。

しかしながら、ADPKD における罹患の主要な原因は、大きく膨張した腎臓をもたらす、液で満たされた嚢胞の形成及び拡大を特徴とする進行性腎疾患である。正常組織が嚢胞成長に負けるとき腎機能が悪化し、60歳の年齢までに患者の50％以上が最終段階の腎疾患（end stage renal disease (ESRD)) をもたらし（Gabow, et al., 1992)：ADPKD は、欧州及び米国における全腎移殖及び透析患者の８−10％の原因である（Gabow, 1993)。生化学的研究は、異常上皮細胞成長、細胞外マトリックスへの変更、及び細胞極性及び分泌における変化を含む、嚢胞の形成及び発達のいくつかの潜在的原因を示唆している（Gabow, 1991 ; Wilson and Sherwood, 1991 中にレビューされる）。しかしながら、ADPKD における主要な欠陥は未だ不明であり、そしてかなりの努力がそれ故に、遺伝子アプローチによるこの疾患における欠陥遺伝子（単複）を同定することに適用されてきた。

ADPKD 遺伝子のポジショナル・クローニングへの第１段階は、第16染色体の短腕上のグロブリン・クラスターへの、１の座（以下、多発性嚢胞腎１型（PKD1）座という）の連鎖の立証であった（Reeders, et al., 1985)。

その後、16ｐのマーカーに連鎖しないADPKD をもつファミリー（Kimberling, et al., 1988 ; Romeo, et al., 1988) 及び第２ADPKD 座（PKD2）が最近、染色体領域４ｇ13−ｑ23に指定された（Kimberling, et al., 1993 ; Peters, et al., 1993)。ADPKD の約85％がPKD1を原因とし（Peters and Sandkuijl, 1992) 、そしてPKD2が残りのほとんどの要因であると推定される。PKD2は、より遅い開始及びESRD年齢を伴いより温和な条件で存在する（Parfrey, et al., 1990 ; Gabow, et al., 1992 ; Ravine, et al., 1992) 。

PKD1座の位置は、染色体バンド16ｐ13.3まで区別（refine) され、そして多くのマーカーがその領域から単離された（Breuning, et al., 1987 ; Reeders, et al., 1988 ; Breuning, et al., 1990; Germino, et al., 1990 ; Hyland, et al., 1990 ; Himmelbauer, et al., 1991) 。それらの順番、及びPKD1座の位置は、正常及びPKD1家族における広範な連鎖分析により、そして体細胞ハイブリッドのパネルの使用により決定されてきた（Reeders, et al., 1988; Breuning, et al., 1990 ; Germino, et al., 1990) 。正確なロング・レンジの制限酵素地図（Harris, et al., 1990 ; Germino,et al., 1992) は、マーカーGGG1とSM７の間の約600kb の間にPKD1座を配置する（Harris, et al., 1991 ; Somlo, et al., 1992) （図1a参照）。CpG 島の密度及び多くのmRNA転写物の同定は、この領域が遺伝子配列内で豊富にあることを示した。Germino et al (1992)は、候補領域が約20遺伝子を含んでいると推定した。

この領域内からのPKD1遺伝子の同定は、これ故困難であることが証明され、そしてこの疾患の遺伝子をピンポイントするための他の手段が探索された。連鎖不平衡（Linkage disequilibrium) が、スコットランド集団において、PKD1と近位マーカーVK５の間で（Pound, et al., 1992)そしてスペイン集団において、PKD1とBLu24 の間で（図1a参照）立証された。追加のマーカーによる研究は、各集団の一定の大きさにおいて共通の祖先をもつ証拠を示したが（Peral, et al., 1994 ; Snarey, et al., 1994) 、その会合は、PKD1座に正確に位置しなかった。

細胞遺伝学又はパルスフィールドゲル電気泳動法（pulsed field gel electrophoresis (PFGE))により検出される、疾患関連ゲノム再編成は、各種遺伝病に関連する各種遺伝子の同定における手段となっている。今日まで、PKD1に関連するこのような異常は全く記載されていない。この情況は、16ｐ13.3内に横たわる結節硬化症（tuberous sclerosis) 座のためのもの（TSC2）と対比をなす。この場合には、TSC 関連欠失は、PKD1遺伝子を含むと考えられる間隔内でPFGEにより検出され、そしてそれらの特徴付けは、TSC2遺伝子の迅速な同定に向けての有意義な段階であった（European Chromosome16 Tuberous Sclenosis Consortium, 1993) 。それ故、TSC2遺伝子は、今日まで未同定であったPKD1遺伝子のための候補領域内に地図を描く；多発性嚢胞腎は、TSC とADPKD1に共通の特徴であるので（Bernsteiu and Robbins, 1991)、Kandt et al. (1992) により提案されたような、病理学的関連が考えられた。

我々は、今般、２つの別個の表現型、典型的なADPKD 又はTSC が異なるメンバー内で見られる家系を同定した。この家系においては、ADPKD をもつ２つの個体が、16ｐ13.3内に１つの破断点をもつ均衡染色体転座（a balanced chromosome translocation)のキャリアーであった。我々は、第16染色体転座破断点を位置決めし、そしてこの再編成により破壊された遺伝子を規定した；他のPKD1患者におけるその遺伝子の追加の突然変異の発見は、我々がPKD1遺伝子を同定したことを示している。

発明の要約
従って、１の態様においては、本発明は、単離、精製又は組換え核酸配列であって：
（ａ）PKD1遺伝子又はその相補的ストランド、
（ｂ）上記（ａ）において定めた分子の実質的な部分と実質的に相同であり、又はそれにハイブリダイズすることができる配列、
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）において定めた分子の断片、を含んで成るものを提供する。特に、PKD1遺伝子が図７及び／又は10に記載の部分的核酸配列をもつような配列を提供する。それ故、本発明は：
（ａ）PKD1遺伝子又はその相補的ストランド、
（ｂ）上記（ａ）において定めた分子の実質的な部分と実質的に相同であり、又はそれにハイブリダイズすることができる配列、
（ｃ）図７の部分配列をもつポリペプチドをコードする分子、
（ｄ）上記（ａ）における分子に対応するゲノムDNA ；及び
（ｅ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）のいずれかにおいて定めた分子の断片、
から選ばれたDNA 分子を含む。

本明細書中に記載するPKD1遺伝子は、ヒト第16染色体上にある遺伝子であり、そして本明細書中に記載する家族調査の結果は、このPKD1遺伝子がADPKD の予防又は抑制における役割をもつPKD1タンパク質といわれるタンパク質をコードするということを結論付けるための基礎を形成する。それ故、PKD1遺伝子は、図７と10に示すDNA配列、及び全ての機能的等価物を含む。本遺伝子はさらに、プロモーター、エンハンサー及びターミネーター領域を含むPKD1コーディング配列の発現を制御する調節領域を含む。他のDNA 配列、例えば、最終生成物PKD1 RNA転写物からスプライスされるイントロンも包含される。ヒト遺伝子に関して研究が行われてきたけれども、下等動物において存在する対応遺伝子及び機能的配列も包含される。

それ故、本発明はさらに、図１に記載する部分配列をもつPKD1遺伝子又はその相補ストランドを提供する。特に、本発明は、その遺伝子又はストランドがいくつかのADPKD 患者（より特に、PKD1患者）において突然変異されている図７及び／又は10の部分配列をもつPKD1遺伝子又はその相補ストランドを提供する。

本発明は、さらに、突然変異体PKD1遺伝子、特に、図７及び／又は10に記載の部分配列を含んで成る配列であって：
（ｄ）〔OX114 〕図７に定めるような塩基対1746−2192が欠失されており(446塩基対）；
（ｂ）〔OX32〕図７に定めるような塩基対3696−3831がスプライシング欠陥により欠失されており；
（ｃ）〔OX875 〕図3aに示す２つの XbaＩ部位により隣接された約5.5kb が欠失されており、そしてCW10（41kb）とJH１（18kb）部位を分離するEcoRＩ部位がそれにより非存在であり；
（ｄ）〔WS53〕図６に示すJH１とCW２及びSM６とJH17部位の間にわたる約100kb 、そしてPKD1遺伝子がそれにより非存在であり、その欠失がSM６とJH13の間に近接して横たわり；
（ｅ）〔461 〕18塩基対が、図11に示すような３′配列の3696位におけるプライマー対3A3 C 挿入物により増幅された75塩基対のイントロン内で欠失され；
（ｆ）〔OX1054〕20塩基対が、図11に示すような３′配列の3696位におけるプライマー対3A3 C 挿入物により増幅された75塩基対のイントロン内で欠失され；
（ｇ）〔WS212 〕約75kbが、図12に示すようにSM９−CW９の遠位とPKD1 ３′UTR 近位の間で欠失され；
（ｈ）〔WS−215 〕約160kb が、図12に示すようにCW20とSM６−JH17の間で欠失され；
（ｉ）〔WS−227 〕約50kbが、図12に示すようにCW20とJH11の間で欠失され；
（ｊ）〔WS−219 〕約27kbが、図12に示すようにJH１とJH６の間で欠失され；
（ｋ）〔WS−250 〕約160kb が、図12に示すようにCW20とBLu24の間で欠失され；
（ｌ）〔WS−194 〕約65kbがCW20とCW10の間で欠失されている、配列から選ばれたものを含んで成る核酸配列をさらに提供する。

それ故、本発明は、上記DNA 配列のいずれかに対応するRNA 配列を含んで成るRNA 分子にも及ぶ。この分子は好ましくは、PBP といわれる転写物であり、そして図3aの制限酵素マップから同定されることができ、そして約14kbの配列をもつ。

他の態様においては、本発明は、上述のような配列をもつ核酸プローブを提供し；特に、本発明は、先の配列のいずれかのDNA 又はRNA 分子の少なくとも１部分とハイブリダイズする精製核酸プローブに及ぶ。好ましくは、ブローブは、³²Ｐ標識、例えば、放射標識、例えば、³²Ｐ標識を含む。

他の態様においては、本発明は、図７及び／又は10のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質、あるいは、そのタンパク質と相同性をもち、又はそのタンパク質と共通な少なくとも１の機能的ドメイン又は活性部位をもつタンパク質ポリペプチド、をコードする精製DNA 又はRNA を提供する。

上記のDNA 分子は、図７及び／又は10のアミノ酸配列をもつタンパク質、あるいは、そのタンパク質と共通の少なくとも１の機能的ドメイン又は活性部位をもつタンパク質又はポリペプチドを発現するための組換えクローニング・ベクター内に取り込まれることができる。

他の態様においては、本発明は、上述のような配列によりコードされ、又は図７及び／又は10の部分的アミノ酸配列に従うアミノ酸配列をもつポリペプチド、あるいは、そのタンパク質と相同性をもち、又はそのタンパク質と共通な少なくとも１の機能的ドメイン又は活性部位をもつタンパク質又はポリペプチドを提供する。特に、PK１タンパク質又はその突然変異体又は変異体を含んで成り又は上記配列によりコードされた、単離され、精製され又は組換え体のポリペプチド又はPKD1タンパク質と実質的に同じ活性をもつその変異体を提供する。

本発明は、個体が結節硬化症を患っている傾向があるかどうかを決定するインビトロ方法であって、以下の段階：

図７及び／又は10のアミノ酸配列をもつPKD1タンパク質又はポリペプチドの存在及び／又は量を測定するためにその個体からのサンプルを検定する、
を含んで成る方法を提供する。

さらに又はあるいは、サンプルを、図７及び／又は10のアミノ酸配列をもつタンパク質又はポリペプチドをコードするmRNAの存在及び／又は量を決定するために、又は図７及び／又は10のタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の断片の断片長を決定するために、又は図７及び／又は10のアミノ酸配列をもつタンパク質又は相同性を有するタンパク質をコードするDNA における失活突然変異を検出するために、検定されることができる。このスクリーニングは、好ましくは、DNA 配列の断片を増幅するためにそのサンプルに核酸増幅方法を適用することを含む。このような核酸増幅方法は、有利には、本明細書中で同定されるような以下のプライマーのセットの中の少なくとも１を使用する：
AH３ F9 ： AH３ B7
3A３ C1 ： 3A３ C2
AH４ F2 ： JH14 B3

あるいは、このスクリーニング方法は、上記サンプルを消化してEcoRＩ断片を提供し、そして図３（ａ）に同定されたEcoRＩ断片（Ａ）にハイブリダイズするDNA プローブとハイブリダイジングすることを含んで成ることができ、そしてそのDNA プローブは本明細書中に同定されたDNA プローブCW10を含んで成ることができる。

他のスクリーニング方法は、上記サンプルを消化してBamHＩ断片を提供し、そして図３（ａ）において同定されたBamHＩ断片（Ｂ）とハイブリダイズするDNA プローブとハイブリダイジングすることを含んで成ることができ、そしてそのDNA プローブは、本明細書中で同定されたDNA プローブ1A1H.6を含んで成ることができる。

本発明に係る方法は、その疾患をもつか又はそれに対する素因をもつ疑いのある患者におけるPKD1−関連失調を検出することを含んで成ることができ、本法は、その患者から採取されたサンプル中のPKD1 DNA，PKD1 mRNA 及び／又はPKD1タンパク質の存在を検出することそして／又はその特性を評価することを含んで成る。このような方法は、PKD1 DNAが欠失され、失われ、突然変異され、異常であり又は正常なPKD1タンパク質を発現しないかどうかを検出し、そして／又は評価することを含んで成ることができる。このような方法を実施するその方法は：
Ａ．患者から生物学的組織又は生検サンプルを採取し；
Ｂ．第１セットの結果を得るために上記サンプル中のPKD1 DNA，PKD1 mRNA 及び／又はPKD1タンパク質の存在を検出しそして／又はその特性を評価し；
Ｃ．その失調の疑いのない個体の同一又は類似の方法論を使用して得られた第２セットの結果と上記第１セットの結果を比較し；そして上記第１セットの結果と第２セットの結果が、PKD1 DNAが欠失され、失われ、異常であり、突然変異され、又はPKD1タンパク質を発現しない場合に、それが、患者がその失調を顕出する存在、素因又は傾向を示す、
を含んで成る。

本発明に係る特定の方法は、患者からPKD1 DNA又はPKD1 DNAであると疑われるPKD1座からのDNA のサンプルを抽出し、インビトロにおいてそのサンプルを培養し、そして得られたタンパク質を分析し、そしてよく確立されたタンパク質切断テスト（Protein Truncation Test)に従って正常なPKD1タンパク質と得られたタンパク質とを比較することを含んで成る。

より低感度のテストは、RT PCT（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）及びゲノムDNA の検査を使用するRNA の分析を含む。
他方において、上記方法の段階Ｃは：
Ｃ．上記失調又は上記失調（複数）の少なくとも１をもつことが知られている個体における同一又は類似の方法論を使用して得られた第２セットの結果と上記第１セットの結果を比較し；そして第１セットと第２セットの結果が実質的に同一である場合、これが、その患者におけるPKD1 DNAが欠失され、突然変異され又は正常なPKD1タンパク質を発現しないことを示す、
により変更される。

本発明はさらに、PKD1遺伝子内に突然変異をもつ疑いのある被験者内で突然変異を特徴付ける方法であって：
Ａ．上記被験者のPKD1遺伝子内のエクソンの各々を増幅し；
Ｂ．その増幅されたエクソンの相補的ストランドを変性させ；
Ｃ．その変性された別個の相補的ストランドを希釈して、各１本鎖DNA 分子が２次構造コンホメーションを保証することを許容し；
Ｄ．非変性条件下、そのDNA 分子を電気泳動に供し；
Ｅ．正常又はPKD1ヘテロ接合遺伝子型のいずれかをもつ対照個体からの同一の増幅されたエクソンを含む１本鎖分子の電気泳動パターンと、上記１本鎖分子の電気泳動パターンを比較し；そして
Ｆ．上記対照個体のDNA から得たパターンとは異なる電気泳動パターンをもついずれかの増幅された生成物を配列決定する、
を含んで成る方法を提供する。

本発明は、上述のような方法を実施するための診断キットであって、先に定めたDNA 又はRNA 配列の断片を増幅するための核酸プライマーを含んで成るものにも及ぶ。この核酸プライマーは、以下のセット：
AH３ F9 ： AH３ B7
3A３ C1 ： 3A３ C2
AH４ F2 ： JH14 B3
の中の少なくとも１を含んで成ることができる。

キットの他の態様は、先に定めたようなEcoRＩ断片及びDNA プローブを提供するためにサンプルを消化するための１以上の物質を組み合せることができる。

キットのさらなる態様は、先に定めたようなBamHＩ断片及びDNAプローブを提供するためにサンプルを消化するための１以上の物質を含んで成ることができる。

そしてさらに、キットは、先に定めたようなDNA 又はRNA 分子にハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むことができる。

上述の核酸配列を含んで成るベクター（例えば、（Stratageneから入手可能な）Bluescript) ；及びそのベクターによりトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞（例えば、（Stratageneから入手可能な）大腸菌（E. coli)株SL−１ Blue)をも、遺伝子治療及び／又はPKD1−関連失調の治療又は予防のための剤の製造における上述のベクター又は核酸配列の使用と共に、提供する。それ故、PKD1−関連失調を治療し又は予防する方法であって、その中でPKD1タンパク質及び／又はその中で機能的PKD1タンパク質を発現することができる突然変異された染色体（例えば、欠失WS−212 染色体）から作られた転写物の発現を許容するようなやり方で、罹患細胞に機能的PKD1遺伝子を、上記治療等の必要な患者において投与することを含んで成るような方法をも提供する。

本発明は、上述の又は以下の説明中の特徴のいずれかの進歩性のある組み合せにも及ぶ。
図面の詳細な説明
ADPKD 関連転座
PKD1遺伝子の同定のための主要な指針（pointer)を、ADPKD とTSC の両方をもつポルトガル家系（家族77）により提供する。細胞遺伝学的分析は、母、77−２が均衡転座、46XX ｔ（16；22）（ｐ13.3；ｑ11.21)をもち、これが彼女の娘、77−３に遺伝したことを示した。この息子、77−４は、不均衡核型（Karyotype)、45XY−16−22＋der (16) (16qter−−＞16ｐ13.3：：22ｑ11.21 −−＞２qter）をもち、そしてそれ故、16ｐ13.3−−＞16pter並びに22ｑ11.21−−＞22pterについて一染色体的である。この個体は、TSC の臨床的表現型をもち（実験手順参照）；最も妥当な説明は、16ｐ13.3内に位置するTSC2座が上記不均衡核型内で欠失されているということである。

さらなる分析は、上記均衡転座をもつ母（77−２）、と娘（77−３）が、ADPKD の臨床的特徴をもち（実験手順参照）、一方、77−２の両親が細胞遺伝学的に正常であり、TSC の臨床的特徴及び超音波検査に対する腎嚢胞を全くもっていなかった（67と82歳）。腎嚢胞はTSC の特徴であることができるけれども、TSC の他の臨床的徴候が77−２又は77−３において全く同定されず、これは、多発性嚢胞腎がTSC によらなかったことを示している。それ故、我々は、上記転座が16ｐ13.3内のPKD1座を破壊し、そしてその破断点を含む領域を同定し、そしてクローン化するように進行する可能性について調べた。

上記77家族を、16ｐ13.3からの多形態マーカーを用いて分析した。個々の77−４は、MS205.2 とGGG1についてヘミ接合（hemizygous) であったが、GGG1とSM６の間の転座破断点に位置する、SM６及びより近位のマーカーについてヘテロ接合であった（図1a）。TSC2領域、CW9D（図1a中のコスミド１）から、中期スプレッド（metophase spreads)までのコスミドの蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridisation (FISH))は、それが、77−２のder (22)染色体にハイブリダイズすることを示し；CW9Dに近位の断片点を配置し、そして77−４が、彼のTSC 表現型と矛盾しないこの領域についてヘミ接合であったことを示している。上記77家族のメンバーからのDNA は、 ClaＩにより消化され、PFGEにより分離され、そしてSM６とハイブリダイズされ；der (16)染色体をもつ個体内に〜100kb の破断点を表す（図1c）。この小サイズの新規断片は、上記破断点が、ちょうど60kbの領域内でSM６に対し遠位に位置することを可能にする（図1a）。この領域をカバーするコスミドcontigをそれ故、構築した（詳細については実験手順を参照のこと）。

上記転座破断点は、染色体16ｐ（16ｐ13.1）上のいずれかで２倍化した領域内に横たわる。
CW21とＮ54間の領域（図1a）が第16染色体の短腕上のより近位の部位において２倍化されたことが先に記されている（Germino, etal., 1992 ; European Chromoseme 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993) 。図２は、この２倍化領域からのコスミド、CN10III が16ｐ上の２点；遠位の、PKD1領域及び16ｐ13.1内に位置する近位部位にハイブリダイズすることを示している。この２倍化領域の構造は、16ｐ13.1内で２−４図反復された16ｐ13.3内に１回存在する各断片との複合体である（図２参照）。16ｐ13.3内の２倍化領域にわたるコスミドをサブクローン化し（詳細については図3aと実験手順を参照のこと。）、そして制限酵素地図を作成した。PKD1領域のゲノム地図を放射ハイブリッド、すなわち、16ｐの遠位部分を含むが16ｐ13.1内の２倍化部位を含まないHyl45.19を使用して構築した。

上記77転座破断点を位置決めするために、標的領域からのサブクローンを、77−２DNA にハイブリダイズし、 ClaＩにより消化し、そしてPFGEにより分離した。一旦、上記破断点を横切って位置するプローブが同定されれば、それらは、77家族DNA の慣用のサザン・ブロットにハイブリダイズされた。図3bは、新規のBamHＩ断片が、プローブ8S１の遠位部分に局在化した破断（切断）点の動原体及び末端側から検出されたことを示す（図3a）。これ故、この均衡転座は、実質的な欠失と関連せず、そしてその破断点が、TSC2座に対し20kb以上近位に位置する（図3a）。これらの結果は、均衡転座（77−２と77−３）をもつ個体における多発性嚢胞腎がTSC2遺伝子の破壊によるのではないという仮説を支持するが、TSC2に対し直近に位置する別回の遺伝子がPKD1遺伝子であるようであったことを示した。

多発性嚢胞破断（切断）点（polycystic breakpoint (PBP))遺伝子は、転座により破壊される。
上記77破断点の局在化は、PKD1遺伝子のための候補の探索のための正確な領域を同定した。TSC2遺伝子の探索の間、我々は、ゲノム断片CW23とCW21にマップされたcDNAs 3A３とAH４内に部分的に表される大きな転写物（〜14kb）を含むTSC に関連しない他の転写物を同定した（図3a）。この転写物をコードしている遺伝子の方向を、cDNA，AH４：この遺伝子の３′末端はTSC 遺伝子にひじょうに接近して、尾対尾の方向で横たわる、の中のポリＡ域（tract)の同定により決定した（European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993) 。この遺伝子が転座破断点を交差するかどうかを決定するために、重複領域内からのそしてその破断点に隣接するゲノム・プローブをノーザン・ブロットにハイブリダイズした。JH５とJH13の間の上記破断点の両側からのプローブは14kbの転写物を同定した（図3a及び詳細について以下参照）。それ故、先に3A３といわれたが現在PBP 遺伝子といわれるこの遺伝子は、上記77破断点にわたって及び、そして結論としてPKD1遺伝子の候補であった。PBP cDNA contig の範囲を増加させるために歩行を開始し、そしていくつかの新規cDNAs を、単一コピー（非２倍化）領域からのプローブを使用して同定した（詳細については実験手順参照）。２倍化した領域内に〜２kbを含んで〜5.7kb に及ぶcDNA contig を、構築した（図3a）。

PBP 遺伝子の発現
PBP 遺伝子の発現パターンの最初の研究を、単一コピー領域内に全体が位置するcDNAs(例えば、AH４と3A３）を用いて企てた。図4aは、〜14kb転写物が、さまざまな組織特異的セルラインにおいてA3A を用いて同定した。これ及び他のノーザン・ブロットから、我々は、PBP 遺伝子が、しばしば低レベルにあるけれども、テストしたセルラインの企てにおいて発現されたと結論付けた。最高レベルの発現を示す２つのセルラインは、線維芽細胞と星状細胞腫、Ｇ−CCM から得られたセルラインであった。かなりのレベルの発現が、腎臓（G401）と肝臓（Hep3B)から得られたセルライン内でも得られた。ノーザン・ブロッティングによる組織サンプル中でのPBP 遺伝子の計測は困難であることが証明された。なぜなら、このような大きな転写物は、小さなRNA 分離を受け易いからである。しかしながら、単一コピー領域内に位置する遺伝子の領域を使用する、RNAse 保護検定による最初の結果（実験手順参照）は、正常及び多発性嚢胞腎から得られた組織内でのPBP 遺伝子の中程度のレベルの発現を示した（データを示さず）。PBP 遺伝子の広い発現は、ADPKD の全身的性質と矛盾しない。

PBP 転写物と部分的に相同である転写物の同定
新たなcDNAs を、２倍化領域に位置するゲノム断片、JH４とJH８を用いて同定した（図3a及び実験手順参照）。しかしながら、これらのcDNAs がノーザン・ブロットにハイブリダイズしたとき、3A３を用いて見られるよりもより複雑なパターンが観察された。上記〜14kb PBP転写物と同様に３つの他の部分的に相同な転写物が同定され、相同遺伝子−Ａ（HG−Ａ；〜21kb）、HG−Ｂ（〜17kb）及びHG−Ｃ（8.5kb)と命名された（図4b）。これらの結果のために２つの可能性のある説明が存在し、HG転写物がPBP 遺伝子の他のスプライスされた形態であったか、又はHG転写物が16ｐ13.1内に位置する遺伝子によりコードされていたかのいずれかである。HG座のゲノム位置を決定するために、１のHG cDNA(HG−４／1.1)の３′末端からの断片を単離した。HG−４／1.1 は全ての３つのHG転写物にハイブリダイズしたがPBP 転写物にはハイブリダイズせず、そしてハイブリッド・パネル上で、それは、（PKD1領域ではなく）16ｐ13.1に位置決めされた。これらの結果は、HG転写物の全てが、互いに、PBP 転写物との相同性をもつ領域の外側に関連付けられ、そしてHG座が近位（16ｐ13.1）に位置することを示している。

上記77転座に関連する異常転写物
PBP 遺伝子は、染色体上の近位〜遠位方向において、77転座破断点により破壊される領域を横切って転写されたので（図3a）、PBPプロモーターから始まる新規転写物がこの家族において見られるであろうことが可能であった。図4cは、上記破断点に対し主に近位に位置するPBP 転写物に対するプローブを使用して、その転座のder(16)生成物から得られた約９kbの新規転写物(PBP−77）が検出されたことを、示している。面白いことに、 PBP−77転写物は、正常PBP 生成物よりも高いレベルを発現するようである。これらの結果は、77転座がPBP 遺伝子を破壊し、そしてこれがPKD1遺伝子であるという仮説を支持することを確信させた。

他のADPKD 患者におけるPBP 遺伝子の突然変異
PBP 遺伝子がPKD7座において欠陥遺伝子であることを証明するために、我々は、典型的なADPKD をもつ患者における突然変異についてこの領域を分析した。PBP 遺伝子の３′末端は、最も研究し易かった。なぜなら、それが、その２倍化領域の外側に位置するからである。この領域をスクリーニングするために、282 人の明らかに無関係のADPKD 患者からのDNA のBamHＩ消化物を、プローブ1A1H.6とハイブリダイズさせた（図3a参照）。さらに、PBP 遺伝子のかなりの部分を含む大きなEcoRＩ断片（41kb）を、プローブCW10を用いて、167 のADPKD 患者におけるフィールド・インバージョン・ゲル電気泳動（FIGE）により検定した。２つのゲノム再編成を、これらの手順によりADPKD 患者において同定し；各々を両方の方法により同定した。

第１の再編成を、より小さな転写物(PBP−875)を作り出す。PBP遺伝子の３′末端内に5.5kb ゲノム欠失をもつことが示された患者OX875 内で同定した（詳細については、図5a，ｂ及び3aを参照）。このゲノム欠失は、ポリＡ尾に隣接する〜500 塩基対を無傷に残す上記転写物の〜３kbの内部欠失をもたらす。この家族においては、第16染色体とADPKD の関連は、証明されることができなかった。なぜなら、OX875 はADPKD の陽性の家族病歴をもつので、生存した罹患の血縁者が全く存在しなかったからである。しかしながら、彼女の罹患した父（現在、死亡）からのパラフィン埋め込み組織が利用できた。我々は、この個体が、その欠失にわたる220 塩基対断片のPCR 増幅によりOX875 と同じ再編成をもっていたことを立証した（データを示さず）。この結果及び、この欠失をもっていなかったOX875 の２人の非罹患兄弟姉妹の分析は、この突然変異がADPKD と共に伝達されたことを示していた。

ハイブリダイゼーションにより検出された第２の再編成は、ADPKD 患者OX114 における、PBP 遺伝子内の２kbのゲノム欠失であった（臨床細目についての実験手順及び図5c及び3a参照）。異常PBP 転写物は、ノーザン・ブロット分析によっては全く同定されなかったが、その欠失に隣接するプライマーを使用して（実験手順参照）、短くされた生成物がRT−PCR により検出された（図5c）。これをクローン化し、そして配列決定し、そしてそれは、（図７に示す配列の塩基対1746と2192の間の）446 塩基対のフレーム−シフト欠失をもつことが示された。OX114 は、ADPKD をもつ家族の唯一のメンバーであり（彼女は子供をもたない）、そして年齢78（父）と73歳（母）における彼女の両親の超音波分析は、腎嚢胞の証拠を全く示さなかった。体細胞ハイブリッドをOX114 から作り出し、そしてその欠失染色体が、１倍体分析により父起源をもつことが発見された。OX114 の父は現在死亡しているが、PKD1領域からの７つのマイクロサテライト・マーカーを用いたOX114 の兄弟（OX984)からのDNA の分析（実験手順参照）は、彼が、OX114 と同様に、PKD1領域内に、同一の父の染色体を共有していることを示した。腎超音波は、年齢53におけるOX984 内に嚢胞を全く現わさず、そしてDNA 分析によって欠失は全く検出されなかった（図5c）。これ故、OX114 内の欠失は、ADPKD の顕出に関連する新規の出来事である。ADPKD が第16染色体関連であることを示すことはできないけれども、PBP 遺伝子の位置は、これが、新規（de novo) PKD1 突然変異であることを示している。

より多くのPKD1関連突然変異を同定するために、PBP 遺伝子の単一コピー領域を、ADPKD 患者から確立されたリンパ芽細胞腫セルラインから単離されたRNA を用いたRT−PCR により分析した。48の無関係患者からのcDNAを、プライマー対3A3 C を用いて増幅し（実験手順参照）、そして260 塩基対の生成物をアガロース・ゲル上で分析した。１の患者、OX32において、追加の小さな生成物(125塩基対）を同定し、これは、欠失又はスプライシング突然変異と矛盾しない。OX32は、上記疾患が３世代を通して追跡されることができる大家族から生じる。OX32の２人の罹患兄弟姉妹及び彼の両親からのRNA の分析は、その異常転写物がPKD1と共に分離することを示した（図5d）。

3A3 C プライマーを用いた正常ゲノムDNA の増幅は、418 塩基対の生成物を生成し；配列決定は、この領域が、135 塩基対のエクソンに隣接する２つの小さなイントロン（５′，75塩基対、及び３′，83塩基対）を含むことを示した。OX32ゲノムDNA から増幅された生成物は、ゲノム欠失を除き、サイズにおいて正常であった。しかしながら、そのDNA のヘテロ２本鎖分析は、より大きなヘテロ２本鎖バンドを現し、これは、そのゲノム間隔内での突然変異に矛盾しない。この異常OX32，RT−PCR 生成物をクローン化し、そして配列決定し；これは、ゲノムDNA 内に存在するけれども、135 塩基対のエクソンがその異常転写物から失われていることを立証した。OX32ゲノムDNA の配列決定は、135 塩基対エクソン後のスプライス・ドナー部位の＋１におけるＧ−−＞Ｃトランジションを立証した。この突然変異は、酵素BstNＩによる増幅ゲノムDNA の消化により全ての利用可能な罹患家族メンバー内で確認され；１の部位が塩基置換により破壊されている。このスプライシング欠陥は、PBP 転写物から135 塩基対のイン−フレーム欠失（図７に示す配列の3696塩基対〜3831塩基対）をもたらす。

全体として、これらの３つの遺伝子内突然変異は、PBP 遺伝子がPKD1座において欠陥遺伝子であることを確信させる。
TSC2とPKD1遺伝子を破壊する欠失

我々は、TSC2遺伝子とPKD1遺伝子を破壊する欠失（WS−53）を先に同定した（European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993) 。但し、その全体の近位範囲は決定されていない。さらなる研究は、この欠失が〜100kb に及び（詳細については図６参照）、そして全部ではないがほとんどのPKD1遺伝子を欠失していることを示した。この患者はTSC をもつだけでなく、普通でない重篤な多発性嚢胞腎をもつ。より小さな表現型をもつ他の患者も調査下にあった。TSC2とPKD1の両方を含む欠失がTSC が幼児期多発性嚢胞腎に関連した６人の患者において同定され、そして特徴付けされた。WS−53における欠失と同様に、WS−215 とWS−250 におけるものも、PKD1の既知の分布を十分に超えて近位に及び、そしてたぶんその遺伝子全体を欠失している。WS−194 における欠失は、PKD1の既知の範囲を超えて延びるが、さらに近位ではなく、一方、WS−219とWS−227 内の近位破断点は、PKD1自体の内に横たわる。上記欠失の外側に横たわる、プローブJH８を用いたケースWS219 のノーザン分析は、減少されたレベルのPKD1転写物を示したが、異常サイズの転写物の証拠は全く示さなかった（データを示さず）。患者WS−53，WS−215 ，WS−219 ，WS−227 及びWS−250 の臨床的に非罹患親からのサンプルの分析は、これらの患者における欠失が新規（de novo)であることを示した。WS−194 の父は研究に利用されることができなかった。

さらなるケース（WS−212)において、腎超音波は、４年齢において嚢胞を全く示さなかったが、１の欠失であって、TSC2遺伝子全体を除去し、そしてPKD1のポリアデニレーション・シグナルに対して５′側42塩基対にある XbaＩ部位を欠失しているものが同定された。PKD1内の近位破断点の正確な位置を決定するために、３′非翻訳領域（３′UTRP）からの587 塩基対プローブを XbaＩ消化DNA にハイブリダイズした。15kbの XbaＩ破断点断片が、６kbの正常断片とほとんど等しい強度を用いて検出され、これは、PKD1 ３′UTR のほとんどが、この突然変異染色体上に保存されていたことを示している。PKD1転写物がWS−212 内の欠失染色体から作り出されるという証拠は、WS−212 cDNAから生成された新規の小さな生成物を用いた、cDNA末端の３′速同定（３′rabid identification of cDNA ends)（RACE）により得られた。この生成物の特徴付けは、ポリアデニレーションがPKD1の３′UTR(記載のPKD1配列¹⁴の5073塩基対における終結コドンに対し３′側231 塩基対）内の、正常位置に対して５′側546 塩基対に生じていることを示した。無傷のオープン・リーディング・フレームをもつ転写は、これ故、欠失したWS−212 染色体から作られる。機能的PKD1タンパク質がこの転写物から作り出されるようであり、これは、この患者における嚢胞疾患の欠如を説明する。ポリＡ付加の新規部位に先行する配列は： AGTCAGTAATTTATATGGTGTTAAAATGTG(A)n である。AATAAAのコンセンサスに正確に適合しないけれども、このATに富む領域の部分が、このケースにおけるように、正常なシグナルが欠失される場合に（可能性のある配列に下線を引く）他のポリアデニレーション・シグナルとして作用するようである。

WS−212 の欠失は、SM９−CW９遠位とPKD1 ３′UTR 近位の間の75kbである。WS−215 欠失は、CW15とSM６−JH17の間の760kb である。WS−194 は、CW20とCW10−CW36の間で欠失した65kbをもつ。WS−227 は、CW20とJH11の間に50kbの欠失をもち、そしてWS−219 は、JH１とJH６の間に27kbの欠失をもつ。WS−250 欠失の遠位端は、CW20内にあるが、その近位端の正確な位置は、知られていない。しかしながら、320kb の同一破断断片は、隣接 PvuＩ断片上のプローブ、（通常、245kb 断片を検出する）CE18とBLu24 (235kb) を使用して PvuＩ−消化DNA を用いて見られる。これ故、この欠失は、〜160kb と推定されることができる。ｂ．WS−219 内の欠失のPFGE分析。正常対照（Ｎ）とWS−219 からの MluＩ消化DNA は、クローンH2，JH１，CW21及びCW10であって正常個体において〜130kb 断片を検出するものによりプローブされた。CW10は、16ｐ上より近位に位置する２倍化領域からのより小さな断片をも検出する。〜100kb の新規断片は、この患者における欠失に隣接するプローブH2とCW10を用いてWS−219 内で見られる。JH１は、部分的に欠失されるが新規のバンドを弱く検出する。異常断片は、突然変異染色体上で欠失したCW−21によっては検出されない。正常対照（Ｎ）とWS−219 のBamHＩ消化DNA は、慣用のゲル電気泳動により分離され、そして、上記欠失に隣接するプローブJH１とJH６にハイブリダイズする。〜３kbの同一破断点断片が、両プローブを用いて見られ、これは、これらのプローブにより見られるBamHＩ断片内の〜27kbの終了の欠失に矛盾しない。

２つのさらなる欠失
さらに、我々は、典型的なPKD1家族において同定された上記遺伝子の２つのさらなる突然変異を特徴付けた。両ケースにおいて、この突然変異は、プライマー対3A3 C により増幅された75塩基対イントロン内の欠失である（European Polycystic kidney Disease Consortium, 1994)。これらの欠失は、患者461 とOX1054において、それぞれ、18塩基対と20塩基対をもつ。これらの欠失は、そのエクソン／イントロン境界に隣接する高保存配列を破壊しないけれども、それらは、その転写物の異常なスプライシングをもたらす。両ケースにおいて、２つの異常なmRNAs 、正常なものよりも大きなものと小さなものが作り出される。これらのcDNAs の配列決定は、より大きな転写物が欠失されたイントロンを含み、そしてまた、461 において57塩基対のイン−フレーム挿入をもち、一方、OX1054が、55塩基対のフレーム・シフト挿入をもつことを示した。より小さな転写物は、上記欠失イントロンに先行するエクソン内の潜在スプライス部位の活性化により、そして両患者において66塩基対のイン−フレーム欠失をもたらす。PKD1患者におけるこの遺伝子の２つの追加の突然変異の立証は、これがPKD1遺伝子であることをさらに確信させる。

PKD1遺伝子の特徴付け
PKD1遺伝子をさらに特徴付けするために、進化的保存を、Zoc ブロッティングにより分析した。単一コピー、３′領域（3A３）及び上記２倍化領域（JH４，JH８）からのプローブを使用して、PKD1遺伝子は、ウマ、イヌ、ブタ及びげっ歯類を含む他の哺乳動物種内で保存されていた（データを示さず）。関連配列の証拠は、正常ストリンジェンシーにおけるハイブリダイゼーションにより、ニワトリ、カエル又はキイロショウジョウバエ属（drosophila) において見られた。保存の程度は、単一コピー又は２倍化領域からのプローブが使用されたとき、同様であった。

PKD1遺伝子のゲノム範囲の全体は未だ知られていない。但し、ノーザン・ブロットに対するハイブリダイゼーションにより得られた結果は、それがJH13と少なくとも同程度遠くから延びることを示している。いくつかのCpG 島は、PKD1遺伝子の知られた範囲の５′に局在化した（図６）。但し、これらのいずれかがこの遺伝子と関連しているという直接的な証拠は存在しない。

PKD1転写物の３′末端に5631塩基対延びるcDNA contig を配列決定した；ここで、可能性のある１以上のcDNAを分析し、そして全領域内で、両ストランドを配列決定した（図７）。我々は、これが、PKD1転写物の〜40％の原因であると推定した。オープン・リーディング・フレームであって、その配列決定された領域の５′末端から走り、そして4842塩基対にわたり、先に記載したマイクロサテライトKG８（Peral, et al., 1994 ; Snarey, et al., 1994) を含む789 塩基対の３′未翻訳領域を残すものを検出した。ポリアデニレーション・シグナルは、ヌクレオチド5598−5603に存在し、そしてポリＡ尾は、5620位において２つの独立cDNAs(AH４とAH６）内で検出された。２倍の、16ｐ13.1領域内の遺伝子によりコードされた、cDNAs HG−４と11BHS21 との比較は、図７に示す部分的PKD1配列の５′末端における1866塩基対が、この２倍化領域内に横たわることを示す。この利用可能なオープン・リーディング・フレームからの予想アミノ酸配列は、1614残基に及び、そして図７に示される。Blast プログラム（Altschul et al., 1990)を使用した。利用可能なタンパク質配列を用いたswissprot とNBRFデータ・ベースのサーチは、多様なタンパク質群に対する類似性をもつほんの短い領域（特に、アミノ酸 690−770 と1390−1530の間）を同定し；相同性をもつ高く有意な領域は全く認められなかった。類似性をもつ短い領域の重要性は、不明である。なぜなら、Pro Site Programmeを用いたタンパク質モティーフ（motifs) についてのサーチが、PKD1遺伝子内のいずれの認識された機能的タンパク質ドメインをも同定しなかったからである。

PKD1遺伝子を同定し、そして特徴付けるための研究は、他の失調のためのものよりも困難であった。なぜなら、その遺伝子の３クオーター以上が、第16染色体上のいずれかで２倍化されたDNA の領域内に埋め込まれているからである。PKD1領域（16ｐ13.3）内の単一コピーとして存在する、40−50kbのDNA のこのセグメントが、より近位の領域、16ｐ13.1内のいくつかの多様なコピーとして反復される。この近位部位は、各々がポリアデニル化mRNAs を作り出し、そしてPKD1遺伝子に対する実質的な相同性を共有する３つの遺伝子座（HG−Ａ，−Ｂと−Ｃ）を含み；これらの部分的に相同な転写物が機能的タンパク質に翻訳されるかどうかは知られていない。

遺伝子増幅は、進化の間にタンパク質の多様性を創出する主要なメカニズムとして知られているけれども、比較的最近２倍化した領域内に埋め込まれたヒト疾患座の発見は、新たな観察である。この場合において、最近のその反復の性質のために、２倍化したゲノム領域の全体が、そのエキソンだけでなく、高レベルの相同性を保持している。上記２倍化を導く事件の配列であって、その元の遺伝子座を表すものは未だ明らかでない。しかしながら、PKD1遺伝子の３′末端とは異なる３つのHG転写物の３′末端の相同性の初期の証拠は、16ｐ13.1内の座がたぶん、それがその遠位座から分離された後に、この部位における配列のさらなる反復により生じているということを示した。

この２倍化問題の克服を試みるために、我々は、第16染色体のちょうどPKD1部分を含み、そして16ｐ13.1内の２倍化部分を含まない放射ハイブリッド、Hy145.19から単離されたRNA を使用するエクソン連鎖アプローチを使用した。これ故、このハイブリッドは、相同遺伝子（HG−Ａ，HG−ＢとHG−Ｃ）からではなくPKD1遺伝子から転写物を作り出す。我々は、また、コスミドJH2Aからの、PKD1遺伝子を含むゲノム領域のほとんどを配列決定し、そしてそのHG座からの多数のcDNAs を配列決定した。ゲノムDNA 内のPKD1エクソンの妥当な位置を決定するために、我々は、そのゲノム配列に対してHG cDNAs,(HG−４とHG−７）を比較した。次に、我々は、ゲノムDNA に一致する配列をもつプライマーを、HGエクソンにより同定された領域まで消化し、そしてハイブリッドHy145.19から生成されたcDNAを使用して、我々は、PKD1転写物からのセクションを増幅した。ポリメラーゼPfu を、取り込みの誤りを最小化するために使用した。これらの増幅された断片を次にクローン化し、そして配列決定した。その配列を図10に示すPKD1 cDNA contigを、図７に示す（３′−５′）の元の5.7kb の配列、並びにcDNAs ： gapα22(890塩基対）、gap ガンマ(872塩基対）、大きなエクソンに一致するクローンJH８からのゲノムDNA のセクション(2.724塩基対）、S9−S3(733塩基対）、S3−S4(1,589塩基対）及びS4−S13 (1,372塩基対）から作る。全体として、これらは、未だ特徴付けされていない転写物の極５′末端（extreme ５′end)をもつ13,807塩基対のcDNAを作る。PKD1 contig からのこれらのcDNAs を配列決定するとき、オープン・リーディング・フレームは、そのcontigの出発から先に同定された終結コドン、13,018塩基対の領域、まで走ることが発見された。PKD1転写物によりコードされた予想タンパク質も図10に示され、そしてこれは4,339 アミノ酸残基をもつ。

それ故、我々は、PKD1遺伝子の突然変異がADPKD の典型的な表現型を引き起こすという強制的証拠をもつ。PKD1候補領域内のこの遺伝子の位置及び突然変異をもつ家族からの利用可能な遺伝的証拠は、これがPKD1遺伝子であることを示す。それ故、本発明は、PKD1遺伝子それ自体及び記載される６つのPKD1−関連突然変異：その表現型と共にその後に伝達された１つのde novo 転座；２つの遺伝子内欠失（１のde novo 事件）；２つのさらなる欠失；及び１のスプライシング欠陥を含む。PKD1が、嚢胞上皮を引き起こすために必要な第２の体突然変異と共に、その細胞レベルにおいて劣性であることができたということが先に論議された（Reeders, 1992)。この“２ヒット（two hit)”過程は、いくつかの優性疾患、例えば、神経線維芽細胞腫（Legius, et al., 1993) と脈管硬化症（Green, et al., 1994)であって、細胞成長の制御における欠陥から生じるものを引き起こす突然変異性のメカニズムであると考えられる。しかしながら、本ケースが上記ケースである場合には、我々は、構成的PKD1突然変異の大部分が、これらの他の失調において見られるように欠失を失活させるであろうということを期待することができたかもしれない。

しかしながら、PKD1突然変異の位置は、いくつかの確認されたバイアス（ascertainment bias) を反映することができる。なぜなら、この単一コピー領域が突然変異について最も熱心にスクリーニングされたからである。それにも拘らず、その遺伝子の大きな部分がFIGEによりスクリーニングされたときに追加の欠失は全く検出されず、そしてPFGEによる研究が75PKD1患者におけるこの領域の大きな欠失を全く示さなかった。これまで検出された突然変異は、機能の獲得を通して病気を引き起こす異常タンパク質の生産をもたらすことができる。しかしながら、これらの突然変異がこの染色体から機能的タンパク質の生産を除去し、そして１倍体不十分性（haploinsufficiency) により、又は体突然変異による第２PKD1相同体の損失後にだけ、PKD1表現型をもたらすことも可能である。

PKD1遺伝子全体を欠失するようである少なくとも１の突然変異体が同定されたが（WS−53）、この場合には、それは、その隣接TSC2遺伝子も破壊し、そして得られた表現型は、重度の嚢胞腎疾患をもつTSC をもつ。腎嚢胞は、この場合におけるPKD1の欠失の表現型の意義を評価するのが困難であるようにTSC において一般的である。TSC における腎嚢胞疾患の全ての場合がPKD1遺伝子の破壊を原因としないということははっきりしており；第９染色体連鎖TSC (TSC1)家族も嚢胞腎を顕出し、そして我々は、PKD1遺伝子の欠失をもたない、腎嚢胞をもつ多くのTSC2患者を分析した。

PKD1タンパク質配列の初歩的分析は、PKD1遺伝子の可能性のある機能にいくつかの手掛かりを提供する２つの領域を目立たせた。上記特徴付けされた領域の極５′末端に、特徴的なアミノ−フランキング（アミノ酸６−28）及びカルボキシ・フランキング配列（アミノ酸76−133)により隣接された２つのロイシンに富む反復（リピート）（LRRs) （アミノ酸29−74）が在る（Rothberg et al, 1990)。LRRsは、タンパク質−タンパク質相互作用に関係すると考えられ（Kobe and Deisenhofer, 1994) そしてそのフランキング配列は、細胞外タンパク質内にだけ見られる。アミノ及びカルボキシ側上に隣接されたLRRsをもつ他のタンパク質は、レセプターであり、又は接着又は細胞シグナリング（signalling) に関係する。上記タンパク質上のさらなる３′（アミノ酸 350−515)は、Ｃ−タイプ・レクチン・ドメイン（Curtis et al, 1992) である。これは、この領域がカルボキシラーゼに結合し、そしてまた細胞外にある傾向があることを示している。これらの相同性をもつ２つの領域は、PKD1タンパク質の５′部分は細胞外にあり、そしてタンパク質−タンパク質相互作用に関連する。このタンパク質は、細胞外マトリックス（ECM)の構成成分であり、又はその構築において役割を演じることができ、そしてECM 中の接着性タンパク質として働くことができる。このタンパク質の細胞外部分は、他の細胞に対するシグナリングにおいても重要であることができる。PKD1タンパク質のほとんどの機能は未だ十分に知られていないが、いくつかの疎水性領域の存在は、このタンパク質が細胞膜を貫通することができることを示している。

家族研究は、de novo 突然変異がたぶん、全てのADPKD ケースのほんの僅かなものの原因であることを示しており；最近の研究は、209 家族内で５つの可能性のある新たな突然変異を検出した（Davies, et al., 1991) 。しかしながら、我々の研究においては、検出された３つの遺伝子内突然変異の中の１が新たな突然変異であり、そしてPKD1関連転座もde novo 事件であった。さらに、上記の２家族ケースにおいて検出された突然変異は、局所的PKD1のかなりの部分の原因ではない。OX875 欠失は、282 の無関係ケースの中の１においてのみ検出され、そしてそのスプライシング欠陥は、48の無関係ケースの中の１の中でのみ見られた。それにもかかわらず、連鎖不均衡の研究は、いくつかの集団の部分内でPKD1に関連する共通１倍体の証拠を発見し（Peral, et al., 1994 ; Snarey, et al., 1994) 、これは、共通の突然変異が同定されるであろうことを示唆している。

一旦、より大きなレンジの突然変異が特徴付けされれば、突然変異のタイプ及び位置が疾患の重度を決定するかどうかを、そして突然変異と腎外顕出の間の相関が存在するかどうかを評価することを可能にするであろう。先の研究は、脳動脈瘤（cerebral aneurysms) の危険が家族内に“現実にあり（runs true)”（Huston, et al., 1993) 、そしていくつかのPKD1家族がかなり温和な表現型を示す（Ryynanen, et al., 1987) といういくつかの証拠を提供した。最近の研究は、特に、その疾患がその母を通じて伝達される場合に、ADPKD 家族における予知の証拠が存在するということを結論付けた（Fink, et al., 1994) 。さらに、ADPKD の初期顕出をもつ家族の分析は、かなりの家族内再発危険が存在し、そして子供のケースは最もしばしば母から伝達されるということを示している（Fink, et al., 1993 ; Zerres, et al., 1993)。このパターンの遺伝は、広がったトリヌクレオチド反復が（Mandel, 1993中にレビューされた）突然変異機構であることが発見された疾患内で見られるものを思い出させる。しかしながら、PKD1と相関関係のある広がった反復についての証拠は、この領域内には発見されていない。但し、このような配列は、除されることはできない。

PKD1の初期の徴候前診断が有効であるという多くの証拠がある。なぜなら、それが、合併症、例えば、高血圧及び尿道感染がモニターされ、そして迅速に処置されることを許容するからである（Ravine, et al., 1991) 。家族内での突然変異の同定は、その家族及びそれと同一の突然変異をもつ他の家族の迅速なスクリーニングを許容するであろう。しかしながら、遺伝子連鎖分析は、徴候前診断にとって重要であるものとして残るようである。連鎖に基づく診断の精度及び容易性は、その遺伝子の３′未翻訳領域内のマイクロサテライト（KG−８）として、PKD1遺伝子の同定により改良されるであろうし、そしていくつかのCA反復が、その遺伝子の５′に位置する（図1a及び６；Peral, et al., 1994 ; Snarey, et al., 1994参照）。

実験手順
患者の臨床的詳細事項
家族77
77−２と77−３は、それぞれ、48と17歳であり、そして典型的なADPKD をもつ。両者は、両側の多発性嚢胞腎をもち、そして77−２は、腎機能が低下している。いずれの患者も、臨床及び眼科学的検査又はその脳のCTスキャンにより、（嚢胞腎とは別の）いずれのTSC の徴候を顕出しない。

77−４は13歳であり、重度精神遅延であり、そして皮脂腺腫（adenoma sebaceum) 、脱色斑紋（depigmented macules)及びCTスキャン上での脳室周囲カルシウム沈着（periventricular calcification)を含むTSC の多くの徴候をもつ。腎超音波は、少数の両側腎嚢胞を現す。

ADPKD 患者
OX875 はADPKD からESRDに進行し、年齢46である。腎機能における進行性減退が17年間にわたり観察された；超音波検査は、広汎性の低い肝嚢胞疾患をもつ拡大性多発性嚢胞腎を立証した。両方の腎臓が腎移植後に取り出され、そして病理学的検査が、1920ｇと3450ｇ（正常平均 120ｇ）の重さの腎臓中に典型的な嚢胞疾患を示した。

OX114 はADPKD からESRDに進行し、54歳であった：診断を、25歳の腹痛の病歴の間放射線学検査により行った。腎機能における進行性の低下及び高血圧の進行をその後に観察した。超音波検査は、より重度の低い肝関連症を伴う、典型的な嚢胞疾患をもつ拡大された腎臓を立証した。

OX32は、いくつかのメンバーがESRDに進行した典型的なADPKD に罹患した大きな血縁のメンバーである。この患者自身は、多発性嚢胞腎の超音波立証後、進行性腎不全及び高血圧を伴って12間観察された。

TSC の徴候は、ADPKD 患者のいずれの臨床的検査の間には観察されなかった。

DNA 電気泳動及びハイブリダイゼーション
DNA 抽出、制限酵素消化、電気泳動、サザン・ブロッティング、ハイブリダイゼーション及び洗浄を、先に記載されたように（Harris, et al., 1990) 又は標準的な方法により行った。FIGEを、25−50kbから断片を分離するためにプログラム５を使用してBiorad FIGE Mapperを用いて行った。PFGEについての高分子量DNA を、アガロース・ブロック中で単離し、そして適当な条件を使用してBiorad CHEF DRII機器上で分離した。

ゲノムDNA プローブ及び体細胞ハイブリッド
本研究に使用されたDNA プローブの多くは先に記載されている：MS205.2 (D16S309 ; Royle, et al., 1992) ; GGG1 (D16S259 ; Germino, et al., 1990)；Ｎ54 (D16S139 ; Himmelbauer, et al., 1991)；SM６ (D16S665), CW23, CW21、及びJH1 (European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993)。１倍体分析のためのマイクロサテライト・プローブは、KG８とW5.2（Snarey, et al., 1994),SM６，CW３及びCW２（Peral, et al., 1994), 16AC2.5 (Thompson, et al., 1992)；SM７（Harris, et al., 1991), VK5AC (Aksentijevich, et al., 1993)であった。

本研究の間に単離された新たなプローブは：JH４，JH５，JH６、それぞれ、11kb，６kb及び６kbのBamHＩ断片、並びにJH13及びJH14、それぞれ、４kb及び2.8kb のBamHＩ−EcoRＩ断片、全てコスミドJH2A由来であった：JH８とJH10は、それぞれ、4.5kb と２kbの SacＩ断片であり、そしてJH12は、0.6kb の SacＩ−BamHＩ断片であり、全てJH４由来；8S１と8S３は、それぞれ、2.4kb と0.6kb の SacII断片であり、JH８由来；CW10は、SM25A の0.5kb NotＩ− MluＩ断片であり；JH17は、NM17の２kb EcoRＩ断片である。

体細胞ハイブリッドＮ−OH１（Germino, et al., 1990), Ｐ−MWH2A (European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993)及びHy145.19 (Himmelbauer, et al., 1991)は先に記載されている。OX114 からの、父由来 (BP２−10）及び母由来（BP２−９）染色体を含む体細胞ハイブリッドを、Deisseroth and Hendrick (1979)の方法により作り出した。

コスミドcontig（cosmid contig)の構築
コスミドを、第16染色体特異的、かつ、全てのゲノム・ライブラリーから単離し、そしてcontigを、先に記載された（European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993) 方法及びライブラリーを使用して構築した。コスミドが、最初に（２倍化16ｐ13.1領域ではなく）その16ｐ13.3領域から得られることを確保するために、その単一コピーからのプローブ（例えば、CW21及びＮ54）を、ライブラリーをスクリーニングするために使用した。２つのコスミド、CW10III とJC10.2B が、上記２倍化領域内に全て位置決め（mapped) された。これらがPKD1領域由来であることを確立するために、それらについて制限地図を作成し、そしてプローブCW10とハイブリダイズさせた。検出された断片サイズを、16ｐ13.3領域だけを含むハイブリッド（Hy145.19) 又は16ｐ13.1領域だけを含むハイブリッド（Ｐ−MWH2A)を用いて得られた結果と比較した。

FISH
FISHを、本質的に先に記載したように（Buckle and Rack, 1993)行った。このハイブリダイゼーション混合物は、100ng のビオチン−II−dUTP標識コスミドDNA と2.5mg ヒト cot−１ DNA（BRL)を含んでおり、これを、42℃における一夜のハイブリダイゼーションに先立って変性させ、そして37℃においてアニールした。ストリンジェントな洗浄後、ハイブリダイゼーションの部位を、フルオレセイン−結合アビジン（５mg／ml）とビオチン化抗−アビジン（５mg／ml）の連続層（Vector Laboratories)により検出した。スライドを、１mg／mlのプロピジウム・ヨージド（propidiumiodide)と１mg／mlの４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）を含むVectashield (Vector Laboratories) 中に置き、UV光下同時Ｇ−バンド分析に供した。結果を分析し、そして画像を、 Bio−Rad MRC 600 共焦レーザー走査顕微鏡を使用して撮影した。

cDNA走査及び特徴付け
ｌファージ内の胎児脳cDNAs ライブラリー（Clonetech and Stratagene) を、（CW23とCW21に等価な）単一コピー領域内のゲノム断片を用いて、又はAH３の0.8kb の PvuII−EcoRＩ単一コピー断片を用いて、標準的な方法によりスクリーニングした。６つのPBP cDNAs であって、２つの先に記載された、AH４（1.7kb)、3A３ (2.0kb) (European Chnomosome 16 Tuberous Sclerosis Cousortium, 1993) 、並びに４つの新規cDNAs AH３（2.2kb)，AH６（2.0kb)，A1C (2.2kb) 及びB1E (2.9kb) を含むものを特徴付けた。Striatamライブラリー（Stratagene) を、JH４を用いてスクリーニングし、そしてHG−Ｃ cDNA, 11BHS21 (3.8kb)を単離した；21ｐ.9は、このcDNAの0.9kb PvuII−EcoRＩサブクローンである。HG−Ａ又はHG−Ｂ cDNA,HG−４（７kb）も、JH８を用いた胎児脳ライブラリー（Stratagene) のスクリーニングにより単離した。HG−４／1.1 は、HG−４の３′末端からの1.1kb PvuII−EcoRＩ断片である。1A1H.6は、上記Clonetech ライブラリーから単離された、TSC2 cDNA,1A−１（1.7kb)の0.6kb HindIII −EcoRＩサブクローンである。各cDNAを、Blue script にサブクローニングし、そしてDyeDeoxy Terminators (Applied Biosystems) とADI 373 A DNA Sequencer (Applied Biosystems)を使用して、又は“Sequenase ”T7 DNAポリメラーゼ（USB)を用いて手動により、逐次的切断とオリゴヌクレオチドプライマーとの組合せを使用して配列決定した。

RNA 手順
全RNA を、Chomczynski and Sacchi (1981) の方法によりセルラインと組織から単離し、そしてPolyAT域mRNA Isolation System (Promega) を使用してmRNAの濃縮を行った。RNA 電気泳動のために、 0.5％アガロース変性ホルムアルデヒド・ゲルを使用し、これをノーザン・ブロットし、ハイブリダイズさせ、そして標準的な手順により洗浄した。0.24−9.5kb RNA (Gibco BRL) サイズ標準を使用し、そして全線維芽細胞RNA 内の13kb Utrophin 転写物（Love, et al., 1989) への上記プローブ（１−9B3)のハイブリダイゼーションを、その大きな転写物のためのサイズ・マーカーとして使用した。

RT−PCR を、ランダム・ヘキサマー・プライマーを用いるBrownet al (1990)の方法により2.5mg の全RNA を用いて行った。但し、 AMV−逆転写酵素（Life Science) を使用した。OX114 内のPBP 転写物の欠失を特徴付けるために、我々は、0.5mM MgCl₂ を含むPCR
バッファー（Dode, et al., 1990) を含むDMSO中で以下のプライマー：
AH３ F9 ５′TTT GAC AAG CAC ATC TGG CTC TC ３′
AH３ B7 ５′TAC ACC AGG AGG CTC CGC AG ３′
並びに：94℃，１分間；61℃，１分間；72℃，２分間の36サイクルプラス10分間の最終的伸長を使用した。OX32 cDNA 及びDNA を増幅するために使用した3A3 C プライマーは：
3A３ C1 ５′CGC CGC TTC ACT AGC TTC GAC ３′
3A３ C2 ５′ACG CTC CAG AGG GAG TCC AC ３′
であった。

これらを、１mM MgCl₂を含む先に記載されたPCR バッファー及びサイクル（Harris, et al., 1991) 中で使用し、そして61℃のアニーリング温度を用いた。
配列決定するためのPCR 生成物を、 Pfu−１（Stratagene) を用いて増幅し、そして Srf−１の存在中 PCR−Script (Stratagene)内の Srf−１部位内にライゲートした。

RNAase生産
正常及び最終段階多発性嚢胞腎からの組織を、グアニジニウム・チオシアネート（guanidinium thiocyarate)中で直ちにホモジェナイズした。RNA を塩化セシウム勾配上で精製し、そして30mgの全RNA を、上記3A3, Cプライマーを用いて作ったゲノム鋳型を使用してMelton, et al., (1984)の方法によるRNAase保護により検定した。

ヘテロ２本鎖分析
ヘテロ２本鎖分析を本質的にKeen et al (1991) により記載されたように行った。サンプルを、3A3, Cプライマーを用いてゲノムDNA から増幅し、そして５分間95℃において加熱し、そしてHydrolink ゲル（AT Biochem) 上にローディングする前少なくとも30分間含浸においてインキュベートした。Hydrolink ゲルを 250Ｖにおいて12−18時間走らせ、そして断片を、臭化エチジウムによる染色後に観察した。

パラフィン固定DNA の抽出及び増幅
ホルマリン固定した、パラフィン・ウックス埋め込み腎組織からのDNA を、Wright and Maros (1990) の方法により調製した。但し、55℃における一夜のプロティナーゼＫ消化の後に、そのDNA を、エタノール沈降前に、フェノール・プラス・クロロホルムを用いて抽出した。約50ngのDNA を、1.5mM MgCl₂ 並びに40サイクルの、94℃１分間、59℃１分間及び72℃40秒間、プラス72℃における10分間伸長を用いたPCR のために使用した。OX875 のゲノム欠失を横断して増幅させるために改作されたオリゴヌクレオチド・プライマーは：
AH4F2 ： ５′− GGG CAA GGG AGG ATG ACA AG −３′
JH14B3： ５′− GGG TTT ATC AGC AGC AAG CGG−３′
であり、これは、OX875 欠失をもつ個体内に〜220 塩基対の生成物を作り出した。

WS−212 の３′RACE分析
３′RACEを本質的に記載されたように（European Polycystic Kidney Disease Consortium (1994)) 遂行した。逆転写を、先に記載された条件（Fronman et al., (1988)) を使用して、 0.5μｇのハイブリッドdT₁₇アダプター・プライマーを用いて５μｇ全RNA をもって行った。特定の３′RACE生成物を、プログラム：57℃，60秒間；72℃，15分間及び30サイクルの95℃，40秒間；57℃，60秒間；72℃，60秒間プラス72℃，10分間を使用して、0.5mM MgCl₂ 中でプライマーF5 adnアダプター・プライマーを用いて増幅した。この増幅された生成物を、TAクローニング・システム（Invitrogen) を使用してクローン化し、そして常法により配列決定した。

図1a（上図）：遺伝子連鎖分析により定められるPKD1候補領域を示す第16染色体の短腕の末端領域の長レンジマップ。１倍体について使用された選択されたDNA プローブ及びマイクロサテライト（microsatellites)の位置、連鎖又はヘテロ接合性分析を示す。連鎖不均衡試験において先に記載されたマーカーをボールドで示す（由来：Harris, et al., 1990 ; Harris, et al., 1991 ; Germino, etal., 1992 ; Samlo, et al., 1992 ; Peral, et al., 1994 ; Snarey, et al., 1994) 。 （下図）：PKD1候補領域の遠位部分の詳細マップであって：16Ｐ13.1内で重複した16ｐ13.3の領域（平行線）；Ｃ， ClaＩ制限部位；体細胞ハイブリッド、Ｎ−OH１とＰ−MWH 2A内の破断点；DNA プローブ及びTSC2遺伝子を示すもの。ヘテロ接合性（77−４内）及びPFGE（ｃ及びテキスト参照）の証拠により決定された、家族−77（ｂ参照）内にある転座破断点の位置の限界をも示す。この77破断点領域をカバーするcontigは、コスミド：１，CW9D；２，ZDS5；３，JH2A；４，REP59 ; ５，JC10.2B ; ６，CW10III ；７，SM25A ; ８，SMII；９，NM17から成る。 図1b：16；22転座を分離する家族77の家系；各被験者の染色体組成を示す。個体77−２と77−３は、上記交換の均衡生成物をもち、そしてPKD1をもつ；77−４は、16ｐ13.3−−＞16pterと22ｑ11.21−−＞22pterについて一染色体的（monosomic)であり、そしてTSCをもつ。 図1c：77家族のメンバー：77−１（１）；77−２（２）；77−３（３）；77−４（４）からのDNA のPFGEであって； ClaＩにより消化され、そしてSM６によりハイブリダイズされたもの。340 の正常断片及び480kb の部分的消化断片に加えて、約100kb の近位破断点（矢印）が個体、77−２，77−３及び77−４において見られ；これは、der (16)染色体の分離と一致する。 図２：正常雄性中期に対するコスミドCW10III （コスミド６；図1a）のFISH。この座の２倍化は、10ｐに対するハイブリダイゼーションの２つの部位により示され；その遠位部位（PKD1領域）を矢印で示す。その近位部位（16ｐ13.1）からのシグナルはその遠位からのものよりも強く、これは、CW10III との配列相同性が16ｐ13.1内で反復されていることを示している。 図3a：77破断点及び16ｐ13.1内で２倍化された領域（平行線）の正確な位置を示す77転座領域の詳細なマップ。DNA プローブ（白箱）；転写物、PKD1及びTSC2（黒箱；矢印により示す転写方向をもつ）及びcDNAs(灰色箱）を上記ゲノム地図の下に示す。各遺伝子の既知のゲノム範囲を上記ダイアグラムの下に示し、そして各cDNAの凡そのゲノムの位置をそのゲノム地図の下に示す。PKD1患者において見られるゲノム欠失の位置、OX875 とOX114 をも示す。EcoRＩについての制限部位（Ｅ）及びBamHＩについての不完全マップ（Ｂ）； SacＩ（Ｓ）と XbaＩ（Ｘ）を示す。SM３は、上記遺伝子の５′末端において示される２kb BamHＩ断片である。 図3b：左パネル、8S３及び右パネル、8S１（ａ参照）とハイブリダイズした個体：77−１（１）；77−２（２）；及び77−４（４）からのBamHＩ消化DNA のサザン・ブロット。8S３は、77−４ではなく77−２内のder (22)染色体と関連した破断点の末端側（telomeric side) 上に新規の断片を検出し（12kb：矢印）；8S１は、77−２と77−４において−der (16)染色体と関連した−破断点の動原体側（centromeric side) 上に新規の断片を同定する。 上記末端破断断片は、8S１（矢印）を用いても弱く見られ、これはその破断点が8S１の遠位部分内に横たわることを示している。8S３と8S１座は、両方２倍化し；これらのプローブによる16ｐ13.3部位において検出された正常BamHＩ断片は11kbであるが（ａ参照）、類似のサイズの断片は16ｐ13.1部位においても検出される。結果として、上記破断点断片は、正常（16ｐ13.1プラス16ｐ13.3）バンドよりもより微弱である。 図4a：組織特異的セルラインのレーン：レーン１，MJ， EBV−形質転換リンパ球；レーン２，K562，赤白血病（erythroleukaemia)；レーン３，FS１、正常線維芽細胞；レーン４，HeLa、子宮頸癌腫；レーン５，G401、腎Wilm's腫瘍；レーン６，Hep3B ，肝癌；レーン７，HT29，結腸腺癌；レーン８，SW13、副腎（adrenal)癌腫；レーン９，Ｇ−CCM 、星状細胞腫（astrocytoma)、当り１mgポリＡ選択mRNAを含むノーザン・ブロットにハイブリダイズしたPBP cDNA，3A３。約14kbの単一の転写物が見られ；最高レベルの発現は、線維芽細胞及び星状細胞腫セルライン、Ｇ−CCM にある。この比較実験においては、僅かな発現がレーン１，４及び７において見られるけれども、我々は、他のノーザン・ブロットの間に及びRT−PCR(以下参照）によりこれらのセルラインにおける少なくとも低レベルの発現を立証した。 図4b：20mgの、セルラインＧ−CCM 由来全RNA を含むノーザン・ブロットは、BPP 遺伝子のさまざまな部分を同定するcDNAs 又はゲノム・プローブとハイブリダイズした。左パネル、一本の〜14kb転写物が、単一コピー領域、3A３からのcDNAを用いて見られる。右パネル、cDNA，21P.9 であって、２倍化している領域の部分と相同であるもの（JH12, JH８及びJH10；図3a参照）は、PBP 転写物及び３つの新規の転写物；HG−Ａ（〜21kb）、HG−Ｂ（〜17kb）及びHG−Ｃ（8.5kb)にハイブリダイズする。転写物の類似のパターンが、JH８領域を除き、JH５とJH13の間の領域にハイブリダイズするcDNAsとゲノム断片を用いて見られる。中央パネル、JH８は、HG−Ｃにではなく、転写物PBP ，HG−Ａ及びHG−Ｂにハイブリダイズする。 図4c：正常対照（Ｎ）；77−２（２）；77−４（４）；からの20mgの全線維芽細胞RNA のノーザン・ブロットは、16；22転座破断点（図３参照）を含む8S１とハイブリダイズした。〜９kbの転写物(PBP−77）は、正常対照ではなくこの転座をもつ２患者において同定される。 PBP−77は、この転座により形成されたキメラPBP 転写物であり、そして上記破断点の遠方に位置するプローブを用いて77−２又は77−４ RNAにおいて見られない。 図5a：EcoRＩにより消化され、そして左パネル、CW10；中央パネル、JH１とハイブリダイズする、正常（Ｎ）及びADPKD 患者OX875(875) ：由来DNA のFIGE。41kbの正常断片（プラス16ｐ13.1部位からの31kb断片）、CW10、及び18kb，JHＩをこれらのプローブを用いて同定する；OX875 は追加の53kbのバンドをもっている（矢印）。これらの２つの断片を分離するEcoRＩ部位は、欠失により除去される（図3a参照）。右パネルは、（上記の）BamHＩ消化DNA のサザン・ブロットが1A1H.6とハイブリダイズすることを示す。9.5kb の新規断片は、OX875 DNA 並びに正常15kb断片内で見られる。これらの結果は、OX875 が5.5kb 欠失をもつことを示しており；その位置は、この欠失に隣接する２つの XbaＩ部位（図3a参照）に対してマッピングすることによりより正確に決定された。 図5b：（ａ）と同様の、全線維芽細胞RNA のノーザン・ブロットは、cDNAs ，AH４，3A３及びAH３とハイブリダイズした。〜11kbの新規の転写物(PBP−875)はAH４（このバンドは強度において減少されている。なぜなら、このプローブが部分的に欠失されているからである。）及びAH３（矢印）であってこの欠失に隣接するものを用いて見られるが、完全に欠失される3A３（図3a）を用いては見られない。２倍化した領域からの転写物HG−Ａ，HG−Ｂ及びHG−ＣはAH３を用いて見られる（図4b参照）。 図5c：左パネル；EcoRＩにより消化され、そしてCW10とハイブリダイズする、正常（Ｎ）及びADPKD 患者OX114 (114) ：由来DNA のFIGE；39kbの新規断片（矢印）がOX114 内で見られる。中央パネル；上記のようなDNA 、プラス、BamHＩにより消化され、そしてCW21とハイブリダイズする、OX114 の正常母（Ｍ）＋兄弟（Ｂ）。19kbの正常断片よりも大きいもの（矢印）が、BamHＩ部位の欠失により他の家族メンバーではなくOX114 内で検出され；これらの結果は共に２kb欠失（図3a参照）と矛盾しない。右パネル；上記のようなRNA のRT−PCT 、プライマーがOX114 欠失に隣接する（実験手順参照）。810 塩基対の新規断片（矢印）は、OX114 内で見られ、これは、PBP 転写物内の446 塩基対の欠失を示す。 図5d：3A３からのＣプライマー対を使用する、ADPKD 患者OX32（32）プラスそのプロバンド、正常母（Ｍ）及び罹患父（Ｆ）及び兄弟姉妹（sibs）（１）と（２）：由来RNA のRT−PCR(実験手順参照）。125 塩基対の新規断片は各罹患個体において検出された。 図６：TSC2及びPBP 遺伝子であって患者WS−53内において欠失された領域を示すもの並びに77転座破断点の位置を含む領域のマップ。WS−53欠失の遠位端の局在化は、先に記載されており（European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, 1993) 、そして我々は、今日、SM６とJH17の間に近位端を位置決めしている。JH１とJH17により検出された、WS−53内の異常 MluＩ断片のサイズは90kbであり、そしてこれらのプローブは、それぞれ、120kb と70kbの隣接 MluＩ断片上に横たわる。それ故、WS−53欠失は、〜100kb である。 MluＩ（Ｍ）； NruＩ（Ｒ）； NotＩ（Ｎ）のための制限部位；及び SacII（Ｓ）及びBssHII（Ｈ）のための部分的マップを示す。DNA プローブ（白箱）並びにTSC2及びPBP 転写物（黒箱）を上記線の下に、それらの既知ゲノム範囲（括弧）と共に示す。そのマイクロサテライトKG８とSM６の位置も示す。 その遺伝子の３′末端まで5631塩基対延びるPKD1転写物の部分的ヌクレオチド配列（cDNA）。その対応予想タンパク質（配列番号：４においても示す）が、上記配列の下に示され、そして上記ヌクレオチド配列の出発から延びる。GT−反復、KG８は、5430−5448塩基対の間の３′未翻訳領域内にある。この配列は、GenBank 受託番号第L33243号に対応し、そして配列番号：３において示される。 その遺伝子の３′末端まで5631塩基対延びるPKD1転写物の部分的ヌクレオチド配列（cDNA）。その対応予想タンパク質（配列番号：４においても示す）が、上記配列の下に示され、そして上記ヌクレオチド配列の出発から延びる。GT−反復、KG８は、5430−5448塩基対の間の３′未翻訳領域内にある。この配列は、GenBank 受託番号第L33243号に対応し、そして配列番号：３において示される。 その遺伝子の３′末端まで5631塩基対延びるPKD1転写物の部分的ヌクレオチド配列（cDNA）。その対応予想タンパク質（配列番号：４においても示す）が、上記配列の下に示され、そして上記ヌクレオチド配列の出発から延びる。GT−反復、KG８は、5430−5448塩基対の間の３′未翻訳領域内にある。この配列は、GenBank 受託番号第L33243号に対応し、そして配列番号：３において示される。 その遺伝子の３′末端まで5631塩基対延びるPKD1転写物の部分的ヌクレオチド配列（cDNA）。その対応予想タンパク質（配列番号：４においても示す）が、上記配列の下に示され、そして上記ヌクレオチド配列の出発から延びる。GT−反復、KG８は、5430−5448塩基対の間の３′未翻訳領域内にある。この配列は、GenBank 受託番号第L33243号に対応し、そして配列番号：３において示される。 その遺伝子の３′末端まで5631塩基対延びるPKD1転写物の部分的ヌクレオチド配列（cDNA）。その対応予想タンパク質（配列番号：４においても示す）が、上記配列の下に示され、そして上記ヌクレオチド配列の出発から延びる。GT−反復、KG８は、5430−5448塩基対の間の３′未翻訳領域内にある。この配列は、GenBank 受託番号第L33243号に対応し、そして配列番号：３において示される。 図８：（配列番号：５においても示す）プローブ1A1H0.6 の配列。 図９：約0.5kb であるプローブCW10の配列（配列番号：６）。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 （配列番号：２においても示す）その対応予想タンパク質と共にその遺伝子の３′末端へ２塩基から13807 塩基対まで延びるPKD1転写物（cDNA）のより大きな部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）。この大きな部分配列は、配列番号：３内のアミノ酸第2726番からの図７の（より小さな）部分的配列を包含し、そしてその直５′末端とは別の全体PKD1遺伝子配列に関する。 図11：PKD1患者461 とOX1054内に見られるゲノム欠失の位置を示す３′配列の3696位におけるプライマー・セット3A3 C 挿入物により増幅された75塩基対イントロンのマップ。 図12：患者WS−215 ，WS−250 ，WS−212 ，WS−194 ，WS−227及びWS−219 ; またWS−53（但し、図６参照）内で罹患された領域を示すTSC2及びPKD1遺伝子を含む第16染色体の領域のマップ。酵素 MluＩ（Ｍ）， ClaＩ（Ｃ）， PvuＩ（Ｐ）及び NruＩ（Ｒ）のためのゲノム部位を示す。欠失についてスクリーニングするために使用された単一コピー・プローブとコスミドの位置を、〜400kb のゲノムDNA を表す線の下に示す。約45kb TSC2 遺伝子のゲノム分布とPKD1遺伝子の知られた範囲を上に示す。平行線領域は、染色体16ｐ上でより近位で２倍化する〜50kb領域を表す。

Claims (6)

1. ＰＫＤ１関連失調キャリアーであるか又はＰＫＤ１関連失調をもつと疑われる患者からの生物学的サンプル中の、核酸の配列をもつＰＫＤ１ ＤＮＡ又はＰＫＤ１ ＲＮＡの存在を検出する方法であって、当該存在は、ＰＫＤ１関連失調キャリアーであるか又はＰＫＤ１関連失調をもつ患者を指標し、ここで、該核酸は、以下の：
   （ａ）〔ＯＸ１１４〕配列番号３の内の塩基対１７４６〜２１９２が欠失されているもの（４４６ｂｐ）；
   （ｂ）〔ＯＸ３２〕配列番号３の内の塩基対３６９６〜３８３１がスプライシング欠陥により欠失されているもの；
   （ｃ）〔ＯＸ８７５〕以下の制限酵素地図：
   

   

   に示す２つのＸｂａＩ部位に隣接する５．５ｋｂが欠失され、かつ、配列番号６に相当する遺伝子座と、European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium 1993に記載されるＪＨ１プローブに相当する遺伝子座（１８ｋｂ）とを分離するＥｃｏＲＩ部位がそれにより存在しないもの；
   （ｄ）〔ＷＳ５３〕European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium 1993に記載されるＪＨ１プローブに相当する遺伝子座とEuropean Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium 1993に記載されるＣＷ２１プローブに相当する遺伝子座と、Ｄ１６Ｓ６６５と命名されたＳＭ６プローブに相当する遺伝子座とＪＨ１７部位との間に延びる１００ｋｂが以下の制限酵素地図：
   

   

   に示すように欠失され、そしてそれゆえＰＫＤ１遺伝子が存在しない；
   から選ばれる突然変異ＰＫＤ１遺伝子を含む核酸、又は以下の：
   （ａ）〔４６１〕以下の制限酵素地図（Ａ）に示す３′配列の３６９６位において、以下のプライマー対３Ａ３Ｃ挿入物：
   ３Ａ３ Ｃ１ ５′ ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ３′、
   ３Ａ３ Ｃ２ ５′ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＣ ３′により増幅された７５ｂｐイントロン内で、１８ｂｐが欠失されたもの；
   （ｂ）〔ＯＸ１０５４〕以下の制限酵素地図（Ａ）に示す３′配列の３６９６位において、以下のプライマー対３Ａ３Ｃ挿入物：
   ３Ａ３ Ｃ１ ５′ ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ３′、
   ３Ａ３ Ｃ２ ５′ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＡＣ ３′により増幅された７５ｂｐイントロン内で、２０ｂｐが欠失されたもの；
   

   

   （ｃ）〔ＷＳ２１２〕以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＳＭ９−ＣＷ９遠位とＰＫＤ１
   ３′ＵＴＲ近位の間で、７５ｋｂが欠失されたもの；
   （ｄ）〔ＷＳ−２１５〕以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＣＷ２０と、配列番号６に示すＣＷ１０プローブＣＷ３６に相当する遺伝子座との間で、１６０ｋｂが欠失されたもの；
   （ｅ）〔ＷＳ−２２７〕以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＣＷ２０とＪＨ１１との間で、５０ｋｂが欠失されたもの；
   （ｆ）〔ＷＳ−２１９〕European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium 1993に記載のＪＨ１プローブに相当する遺伝子座と、以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＪＨ６との間で、２７ｋｂが欠失されたもの；
   （ｇ）〔ＷＳ−２５０〕以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＣＷ２０とＢｌｕ２４との間で、１６０ｋｂが欠失されたもの；
   （ｈ）以下の制限酵素地図（Ｂ）に示すＣＷ２０と配列番号６に示すＣＷ１０プローブに相当する遺伝子座との間で、６５ｋｂが欠失されたもの；
   

   

   から選ばれる突然変異ＰＫＤ１遺伝子を含む核酸である、前記方法。
2. 前記方法は、核酸増幅方法を、前記サンプルに適用して、ＰＫＤ１ ＤＮＡ又はＰＫＤ１ ＲＮＡに相当するｃＤＮＡの断片を増幅することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸増幅方法は、以下のプライマー・セット：
   ＡＨ３ Ｆ９：ＡＨ３ Ｂ７（配列番号７と８）
   ３Ａ３ Ｃ１：３Ａ３ Ｃ２（配列番号９と１０）
   ＡＨ４ Ｆ２：ＪＨ１４ Ｂ３（配列番号１１と１２）
   の内の少なくとも１つを使用する、請求項２に記載の方法。
4. 前記サンプルをＥｃｏＲＩ断片に消化し、そしてＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここで、当該ＤＮＡプローブは、以下の制限酵素地図：
   

   

   中（Ｅ）で同定されたＥｃｏＲＩ断片に対する配列番号６を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記サンプルをＢａｍＨＩ断片に消化し、そしてＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここで、当該プローブは、以下の制限酵素地図：
   

   

   中（Ｂ）で同定されたＢａｍＨＩに対する配列番号５を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記の方法の結果が、ＰＫＤ１関連失調キャリアーでもなく、ＰＫＤ１関連失調をもってもいない患者から採取した生物学的サンプルの対応の結果と比較される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

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