CH671776A5 - - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung ist auf einen DNA-Transfervektor gerichtet, der nützlich für die Diagnose einer genetischen Anlage für die Entwicklung von Hypercholesterinämie, Atherosklerose und Herzleiden ist. Es handelt sich um rekombinante DNA-Moleküle, welche als Reagentien nützlich sind, die Gegenwart von mutierten Rezeptorgenen von Lipoproteinen von geringer Dichte (LDL) in Individuen festzustellen, welche verdächtig sind, die familiäre Hypercholesterinämie (FH) zu haben.

Die Hälfte aller Todesfälle in den USA werden durch Atherosklerose verursacht, dem Leiden, in welchem sich Cholesterin in den Wänden der Arterien akkumuliert, voluminöse Plaquen bildet, welche den Blutfluss hemmen, bis sich schliesslich ein Gerinnsel bildet, das die Arterie verstopft und eine Herzattacke oder einen Herzschlag verursacht. Das Cholesterin von athero-

sklerotischen Plaquen ist von Partikeln abgeleitet, welche als Lipoproteine von geringer Dichte (LDL) bezeichnet werden, die im Blutstrom zirkulieren. Je mehr LDL im Blut vorhanden ist, desto schneller entwickelt sich die Atherosklerose.

Epidemiologische Daten enthüllen die überraschende Tatsache, dass mehr als die Hälfte der Leute in westlichen Industriestaaten, einschliesslich der USA, einen Spiegel an zirkulierenden LDL aufweisen, welcher sie hohen Risiken für die Entwicklung von Atherosklerose aussetzt. Da solche Konzentrationen so vorherrschend sind, werden sie als «normal» betrachtet, aber sie sind klar nicht wirklich normal. Sie bewirken eine Anfälligkeit auf beschleunigte Atherosklerose und Herzattacken oder Herzschläge.

Einige Antworten auf die Frage, warum die LDL-Spiegel bei vielen Amerikanern so gefährlich hoch sind, gehen aus Studien von speziellen Proteinen, LDL-Rezeptoren genannt, hervor.

Diese Rezeptoren treten aus der Oberfläche von tierischen Zellen hervor. Die Rezeptoren binden LDL-Partikel und extrahieren sie von der Hüssigkeit, in welche die Zellen getaucht sind. Das LDL wird in die Zellen hineingenommen und zerfallt, wobei Cholesterin freigesetzt wird, welches zur Befriedigung der Bedürfnisse jeder Zelle dient. Durch die Versorgung der Zelle mit Cholesterin üben die Rezeptoren eine zweite physiologische Funktion aus, welche für die Prävention der Atherosklerose kritisch ist: sie entfernen das LDL aus dem Blutstrom.

Die Anzahl der Rezeptoren, welche auf der Oberfläche der Zellen ausgebreitet sind, variiert mit der Nachfrage der Zelle nach Cholesterin. Wenn der Bedarf nieder ist, akkumuliert sich ein Überschuss an Cholesterin; die Zellen produzieren weniger Rezeptoren und nehmen das LDL in einer reduzierten Rate auf. Dies schützt die Zelle gegen einen Cholesterinüberschuss, jedoch gegen einen hohen Preis: die Reduktion der Anzahl Rezeptoren vermindert den Grad, bei welchem LDL aus dem Kreislauf entfernt wird, der Blutspiegel des LDL steigt an, und die Atherosklerose wird beschleunigt.

Es ist vorgeschlagen worden, dass ein hoher LDL-Spiegel in vielen Amerikanern einer Kombination von Faktoren zuzuschreiben ist, welche die Produktion der LDL-Rezeptoren vermindert. Die Erkenntnis der zentralen Rolle der Rezeptoren hat zu einer Behandlung für eine ernsthafte genetische Form von Atherosklerose geführt und hat ebenfalls etwas Licht auf die fortlaufende Streitfrage bezüglich der Rolle der Diät in Atherosklerose bei der allgemeinen Bevölkerung geführt.

LDL ist ein grosser, sphärischer Partikel, dessen öliger Kern aus etwa 1500 Molekülen des Fettalkohols Cholesterin zusammengesetzt ist, die je durch eine Esterbindung an eine langkettige Fettsäure gebunden sind. Dieser Kern von Cholesterinestern ist in eine dünne Schicht von Phospholipiden und nicht veresterten Cholesterinmolekülen eingeschlossen. Die Phospholipide sind so angeordnet, dass ihre hydrophilen Enden an der äusseren Seite sind, womit das LDL im Blut oder im intercellularen Fluidum verteilt werden kann. Eingebettet in diesen hydrophilen Mantel ist ein grosses Proteinmolekül, das als Apoprotein B-100 bezeichnet wird.

Es ist das Apoprotein B-100, welches vom LDL-Rezeptor, einem Glycoprotein (einem Protein, an welches Zuckerketten gebunden sind) erkannt und gebunden wird. Der Rezeptor überspannt die Dicke der Plasmamembrane der Zelle und trägt eine Bindungsstelle, welche aus der Zelloberfläche heraustritt. Die Bindungen finden statt, wenn LDL in einer Konzentration von weniger als 10"9-molar auftritt, was bedeutet, dass der Rezeptor ein einziges LDL-Teilchen aus mehr als einer Milliarde Wassermolekülen erkennen kann. Der Rezeptor bindet nur Lipoproteine, welche das Apoprotein B-100 oder ein verwandtes Protein, welches als Apoprotein E bezeichnet wird, aufweisen.

1976 wurde entdeckt, dass die LDL-Rezeptoren in besonderen Regionen büschelweise vorkommen, wo die Zellmembrane Krater zu bilden beginnt, die als coated pits bekannt sind (da die

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innere Oberfläche der Membrane unter ihnen mit dem Protein Clathrin beschichtet ist). Innerhalb von Minuten bei ihrer Bildung stülpen sich die Vertiefungen in die Zelle hinein und werden von der Zelloberfläche abgequetscht, indem sie membrangebundene Säcke bilden, die sogenannten beschichteten Vesikel; und das LDL, welches an einen Rezeptor gebunden ist, wird in die Zelle hineingebracht. Die Rezeptor-vermittelte Endocytose, der Ausdruck wird auf diesen Prozess der Aufnahme durch die beschichtete Vertiefung und die Vesikel angewendet, wird nun als allgemeiner Mechanismus anerkannt, wobei die Zellen viele grosse Moleküle aufnehmen, die jeweils ihren eigenen hochspezifischen Rezeptor besitzen.

Schliesslich wird das LDL vom Rezeptor (welcher durch die Zelloberfläche wieder zurückgeführt wird) abgetrennt und zu einem Lysosom, einem Sack, welcher mit Verdauungsenzymen gefüllt ist, übergeführt. Einige der Enzyme bauen die Hülle des LDL ab, setzen den Cholesterinesterkern frei. Ein anderes Enzym schneidet die Fettsäurereste der Cholesterinester ab, setzt das nichtveresterte Cholesterin frei, welches das Lysosom verlässt.

Alle Zellen bauen das Cholesterin in neu synthetisierte Oberflächenmembranen ein. In gewissen spezialisierten Zellen hat das Cholesterin, welches aus dem LDL extrahiert wird, eine andere Rolle. In der Nebenniere und in den Eierstöcken wird es in die Stereoidhormone Hydrocortison und Oestradiol umgewandelt; in der Leber wird es zu Gallensäuren umgewandelt, welche im Darm eine Verdauungsfunktion besitzen.

Die zentrale Rolle des LDL-Rezeptors bei Atherosklerose wurde erstmals 1974 anerkannt, als gezeigt wurde, dass die Abwesenheit des Rezeptors für das schwere Leiden, welches familiäre Hypercholesterinämie (FH) genannt wird, verantwortlich war. Viel früher, 1939, identifizierte Carl Muller des Gemeindespitals von Oslo in Norwegen, das Leiden als angeborenen Stoffwechselfehler, welcher bei jungen Leuten einen hohen Blutcholesterinspiegel und Herzattacken bewirkt. Er erkannte, dass sie als dominante Anlage, welche durch ein einziges Gen bestimmt wird, übermittelt wird. In den 1960er Jahren wurden zwei Formen der Krankheit beschrieben, eine heterozygote Form und eine ernsthaftere homozygote Form. Die Heterozygoten, welche von einem mutanten Gen vererbt werden, sind recht gewöhnlich: etwa bei einem von 500 Leuten in den meisten ethnischen Gruppen. Ihr LDL-Spiegel im Plasma ist zweimal so hoch wie der normale Spiegel (sogar bei der Geburt), und sie beginnen, an schweren Herzattacken zu leiden zur Zeit, wenn sie 35 sind; unter Leuten unter 60, welche an Herzattacken leiden, hat einer von 20 heterozygote FH.

Wenn zwei FH-Heterozygote heiraten (eine von 250 000 Ehen) hat jedes Kind die Chance von 1:4 zwei Kopien des mutanten Genes zu vererben, eines von jedem Elternteil. Solche FH-Homozygote (etwa eine in 1 Million Personen) besitzen einen zirkulierenden LDL-Spiegel, der mehr als sechsmal höher als normal ist. Herzattacken können im Alter von zwei auftreten und sind nahezu unvermeidlich im Alter von 20. Es ist bemerkenswert, dass diese Kinder keinen anderen Risikofaktor für Atherosklerose als einen erhöhten LDL-Spiegel aufweisen. Sie haben einen normalen Blutdruck, rauchen nicht und haben einen hohen Blutglukosespiegel. Die homozygote FH ist ein anschauliches Experiment der Natur. Es demonstriert unmissverständlich die kausale Relation zwischen einem erhöhten, zirkulierenden LDL-Spiegel und Atherosklerose.

Heterozygote mit der familiären Hypercholesterinämie können oft schon bei Geburt erkannt werden, da das Blutplasma von der Nabelschnur eine zwei- oder dreifache Zunahme der Konzentration von LDL-Cholesterin enthält. Der erhöhte Plasma-LDL-Spiegel bleibt während dem ganzen Leben, jedoch entwickeln sich die typischen Symptome nicht vor dem dritten oder vierten Jahrzent. Das wichtigste klinische Merkmal ist die Frühreife und die beschleunigte koronare Atherosklerose. Myocardinfarkte beginnen bei betroffenen Männern im dritten Jahrzehnt, zeigen ein Spitzenvorkommen im vierten und fünften Jahrzehnt. Im

Alter von 60 besitzen 85% eine Erfahrung eines Myocardinfark-tes. Bei Frauen ist das Vorkommen des Myocardinfarktes ebenfalls erhöht, jedoch ist der Ausbruch im Vergleich zu den Männern um 10 Jahre verschoben. Die Heterozygoten für familiäre Hypercholesterinämie machen etwa 5% aller Patienten aus, welche einen Myocardinfarkt aufweisen.

Xanthome der Sehnen sind eine zweite klinische Hauptoffen-barung des heterozygoten Zustandes. Diese Xanthome sind knötchenartige Schwellungen, welche lypischerweise die Achilles- und andere Sehnen in der Gegend des Knies, des Ellbogens und des Handrückens befallen. Sie werden durch die Ablagerung von LDL-derivierten Cholesterinestern an Gewebemakrophagen, die sich in Darmräumen befinden, gebildet. Die Makrophagen sind mit Lipidtröpfchen aufgequollen und bilden Schaumzellen. Cholesterin wird ebenfalls im weichen Gewebe des Augenlids abgelagert, wobei Xanthelasma gebildet wird und in der Hornhaut der acrus lipoides corneae gebildet wird. Während die Sehnenxant-home im wesentlichen für die familiäre Hypercholesterinämie diagnostisch sind, sind Xanthelasma und acrus lipoides corneae nicht spezifisch. Die letztgenannten Abnormitäten können ebenfalls bei vielen Erwachsenen mit normalen Plasmalipidspiegeln vorkommen. Das Vorkommen der Sehnenxanthome bei familiärer Hypercholesterinämie nimmt mit dem Alter zu. Schliesslich zeigen etwa 75% der befallenen Heterozygoten dieses Zeichen.

Homozygote Individuen haben eine merkliche Erhöhung des LDL-Plasmaspiegels von Geburt an. Ein einmaliger Typ eines planaren, cutanen Xanthomes ist bei der Geburt oft vorhanden und entwickelt sich jeweils innerhalb der letzten 6 Lebensjahre. Diese cutanen Xanthome ragen über die Haut, gelbe plaquenar-tige Verletzungen können an der Spitze der kutanen Traumas vorkommen, wie über den Knien, Ellbogen und Gesässbacken. Xanthome sind nahezu überall im Raum zwischen den Fingern der Hände, insbesondere zwischen Daumen und Zeigefinger vorhanden. Sehnenxanthome, acrus lipoides corneae und Xanthelasma sind ebenfalls charakteristisch. Herzarterien-Atherosklerose hat bei Homozygoten häufig seinen klinischen Ausbruch vor dem Alter von 10, und der Myocardinfarkt wurde sogar für so früh wie das Alter von 18 Monaten beschrieben. Bei Herzatherosklerose wird das Cholesterin häufig in der Aortenklappe abgelagert,

wobei die symptomatische Aortenstenose entsteht Homozygoten unterhegen üblicherweise den Komplikationen des Myocardinfarktes vor dem Alter von 30.

Eine von 500 Personen hat in den meisten Bevölkerungen eine Mutation im LDL-Rezeptorgen, welche die Funktion des Gens zerstört und das klinische Syndrom der heterozygoten familiären Hypercholesterinämie erzeugt. Bei vielen dieser mutierten Genen bleibt die Produktion irgendeines feststellbaren Rezeptors aus. Andere mutierte Gene produzieren eine kleine Anzahl von Rezeptoren; noch andere mutierte Gene produzieren im wesentlichen normale Mengen von defekten Rezeptoren, welche das LDL nicht richtig binden. In anderen betroffenen Individuen wird ein LDL-Rezeptorprotein mit abnormaler Länge produziert. Während die normale Vorläuferform des Rezeptors ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 120 000 Dalton zeigt, wenn mit Gelelektrophorese gemessen, wurde bei anormalen Formen des Proteins, die durch mutierte Gene codiert wurden, festgestellt,

dass sie bei scheinbaren Molekulargewichten von 100 000,

135 000 und 170 000 Dalton wandern. Es ist möglich, dass solche Mutationen, die in LDL-Rezeptorprotein festgestellt wurden, das Resultat (im Gen, welches für die Erzeugung des LDL-Rezeptors verantwortlich ist) einer Deletions- oder einer Insertions-Muta-tion darstellt. Es wurde angenommen, dass sämtliche der oben beschriebenen Mutationen, sich wahrscheinlich in der Nähe des Gens für den LDL-Rezeptor befinden. Demzufolge würde ein Mittel zur direkten Identifizierung dieser Individuen, welche ein imitiertes LDL-Rezeptorgen aufweisen, unsere Fähigkeit zur Identifizierung dieser Individuen mit einer genetischen Anlage zur Entwicklung von Atherosklerose und Herzleiden, stark

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erleichtern. Diese Mutationen könnten identifiziert werden, wenn eine komplementäre DNA (cDNA) für das Rezeptorgen entdeckt würde.

Die Figur 1 ist eine schematische Darstellung der cDNA-Klonstrategie, welche beim Klonen des humanen LDL-Rezeptors verwendet wurde. Humanes A.hl ist ein partielles genomisches Klon, welches dem 3'-Ende des LDL-Rezeptorgens entspricht. Die rekombinanten Plasmide p 101 und p203 enthalten partielle cDNA, welche komplementär zum humanen LDL-Rezeptor mRNA sind. Das Plasmid pLDLR-2 ist eine Fusion, die aus plOl und p203 konstruiert ist und eine cDNA mit nahezu voller Lärfge für die humane LDL-Rezeptor-mRNA enthält. Die Anzahl Klammern bezieht sich auf die Länge der DNA, welche in ein gegebenes Klon eingesetzt wurde.

Die Figur 2 ist eine strukturelle Darstellung des rekombinanten Plasmides pLDLR-2, welches eine cDNA in nahezu voller Länge für das humane LDL-Rezeptorgen enthält. Die codierende Region (schraffiertes Gebiet) umfasst die Nukleotide 1 bis 2580. Dieses Fusionsplasmid wurde konstruiert durch Vereinigung der cDNA-Insertionen von p203 (Nukleotide 1 bis 323) und plOl (Nukleotide 324 bis 5144) über die überlappenden Hgi AI-Stellen. Die festen Bereiche in pLDLR-2 zeigen Regionen im Klonie-rungsvektor, welche SV40 Sequenzen enthalten, einschliesslich des Ursprungs der Replikation, die 16S- und 19S-Donor und Acceptor-Spleissstellen und Polyadenylierungssignale.

Die Figur 3 zeigt die Nukleotidsequenz der cDNA, welche der humanen LDL-Rezeptor-mRNA entspricht und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Rezeptorproteins. Die Nukleotide sind numeriert auf der rechten Seite in der 5'- bis 3'-Richtung; das Nukleotid 1 ist das A des ATG-Codons, welches den Initiator Methionin codiert; negative Nummern beziehen sich auf die 5'-untranslatierte Region. Die Aminosäuren sich unterhalb der Sequenz numeriert; Rest 1 ist das Alanin, welches an NH2-Termi-nus des reifen Proteins gefunden wird; die negativen Nummern beziehen sich auf die gespaltene Signalsequenz. Die Signalsequenz (21 Reste) und die Membranspannungssequenz (22 Reste) sind durch einfache, durchgehende Unterstreichungen angegeben. Die Stellen, an welchen das N-gebundene Kohlenhydrat gebunden weden kann (Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr), sind durch doppelte durchgehende Unterstreichungen angegeben. Die Çysteinre-ste sind eingekreist. Eine Spanne von 48 Resten, die reich an Seri-nen und Threoninen ist, an welche O-gebundene Kohlehydrate befestigt sein können, ist durch eine punktierte Unterstreichung angegeben. Die Alu-Sequenzen in der 3'-untranslatierten Region der cDNA sind im Kasten dargestellt; die direkten Wiederholungen, welche mit der ersten Alu-Sequenz vereinigt sind, sind durch punktierte Zeilen oberhalb der Sequenz angegeben. Drei potentielle Polyadenylierungssignale in der 3'-untranslatierten Region sind durch Über- und Unterstreichungen angegeben.

Figur 4 ist eine Analyse der Xba-I-Restriktionsverdauungen von genomischer DNA eines normalen Subjektes und eines Individuums mit familiärer Hypercholesterinämie (als FH 274 bezeichnet) mit DNA-Proben aus verschiedenen Regionen der LDL-Rezeptor-cDNA. Figur 4A ist ein Diagramm der mRNA für einen humanen LDL-Rezeptor, welcher mit AUG und UGA bezeichnet wird und den Anfang bzw. das Ende der Translationsregion angibt. Die Grösse und die Lage der 32P-markierten cDNA-Proben, welche zur Kartierung des LDL-Rezeptorgens verwendet wurden, sind durch die geschlossenen dicken Striche dargestellt und sind von 1 bis 9 numeriert. Figur 4B ist eine Auto-radiographie eines «Southern blottings», entweder eines norma: len oder mutierten (FH 274) genomischen DNA nach Hybridisierung mit entweder Probe 1 (links) oder Probe 8 (rechts). Die Xba I-Restriktionsfragmente werden mit A-D entlang der rechten Seite jedes Blottings bezeichnet. Die Standards der Molekular-grösse wurden durch eine Hind HI-Spaltung von bakteriophagen DNA gebildet und sind an der linken Seite jedes Blottings angegeben. Die Xbal-Fragmente, welche durch die Proben 2 bis 9 in normalen Subjekten und FH 274 ermittelt wurden, sind unten in Figur 4A angegeben.

Figur 5 ist eine «Southern blotting»-Hybridisierung einer Xby I-gespaltenen genomischen DNA von einem normalen Subjekt, von FH 274 und seinen Eltern. Die genomische DNA (5 g) welche aus kultivierten Fibroblasten des angegebenen Subjektes isoliert wurde, wurde mit Xba I verdaut, einer Elektrophorese unterworfen und in Nitrocellulose transferiert und mit 32P-Probe 1 hybridisiert. Die vier relevanten Xba I-Restriktionsfragmente werden mit A-D entlang der rechten Seite des Blottings bezeichnet. Die Standards der Molekulargrösse wurden durch eine Hind III-Spaltung von bakteriophagen AJDNA gebildet.

Figur 6 ist ein Vergleich von Restriktionskarten des 3'-Endes eines normalen LDL-Rezeptorgens und eines Gens mit einer Deletion von FH 274. Der Massstab unten zeigt die Länge des genomischen DNA in Kilobasen. Die Organisation des normalen LDL-Rezeptorgens ist im Diagramm oben angegeben. Die Exons sind durch die ausgefüllten Segmente und die Grossbuchstaben angezeigt; die dazwischenliegenden Sequenzen (IVS) sind durch offene Segmente und die Kleinbuchstaben angegeben. Die sich wiederholenden Alu-Sequenzen in IVS c und Exon F sind angegeben. Es sind die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, welche zur Definition der Gen-Deletion in FH 274 verwendet wurden, gezeigt.

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Transfervektoren, die DNA-Insertionen enthalten, die zu verschiedenen Teilen des humanen LDL-Rezeptorgens oder des mRNA-Transcripts dieses Genes komplementär sind, gemäss den Definitionen in den Ansprüchen 1 und 2.

Die rekombinanten DNA-Transfervektoren, welche durch die vorliegende Erfindung offenbart sind, brauchen nicht notwendigerweise das gesamte humane LDL-Rezeptorgen zu enthalten, um für die Praxis der Erfindung nützlich zu sein. In ähnlicher Weise braucht der rekombinante Transfervektor nicht ein DNA-Fragment zu enthalten, welches komplementär zum gesamten mRNA-Transcript für dieses Gen ist. Rekombinante Transfervektoren können aus kleineren Subfragmenten konstruiert werden, welche komplementär zum humanen LDL-Rezeptorgen oder zur mRNA dieses Gens sind. Tatsächlich kann die Verwendung von verschiedenen Subfragmenten des Gens als Proben für einzelne spezifische Mutationen in gewissen FH-Individuen notwendig sein. Alles Erforderliche besteht darin, dass diese Fragmente von genügender Länge sind, um einen stabilen Duplex oder Hybrid zu bilden. Solche Fragmente werden als «hybridisierbar» bezeichnet, da sie zur stabilen Duplexbildung fähig sind. Im allgemeinen sind DNA-Fragmente mit mindestens 14 Nukleotidenlänge fähig, einen stabilen Duplex zu bilden (z.B. ein Tetradecamer).

Individuen mit der familiären Hypercholesterinämie (FH) werden unter Verwendung der vorliegenden Erfindung einer Diagnose unterworfen, indem die Gegenwart einer Mutation im Gen, welches den LDL-Rezeptor codiert, festgestellt wird. Die DNA, die aus rekombinanten cDNA-Klonen isoliert wird, hat zur Diagnose bei einem Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie geführt, welcher eine Deletion im Gen aufwies. Die cDNA oder Fragmente davon sollten ebenfalls bei der Diagnose von anderen Mutationen, einschliesslich deijenigen, welche von einfachem Nukleotidaustausch (Punktmutationen) herrühren, nützlich sein.

Im allgemeinen besteht das Verfahren darin, dass DNA aus Zellen eines Individuums, bei welchem eine Mutation vermutet wird, fragmentiert wird, anschliessend die DNA-Fragmente in einem Muster aufgetrennt werden, in ein Muster gemäss einiger biochemischer Eigenschaften der DNA, z.B. des Molekulargewichtes oder der Grösse der DNA-Fragmente. Die abgetrennte DNA wird dann einer Hybridisierungsprobe mit markierter LDL-Rezeptor-DNA unterworfen, um diejenigen DNA-Fragmente des Individuums zu identifizieren, welche dem LDL-Rezeptorgen entsprechen. Dann kann durch Vergleich der Muster der LDL-Rezeptorfragmente verdächtigten Individuums mit einem ähnli-

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671 ne chen Fragmentmuster eines normalen Individuums bestimmt werden, ob das verdächtigte Individuum eine Mutation zeigt. Wenn das Muster der identifizierten LDL-Rezeptorgen-Fragmente des verdächtigten Individuums eine Änderung bezüglich des Kontrollmusters zeigt, wurde eine Mutation ermittelt.

Ein Verfahren, welches sich als besonders nützlich bei der Fragmentierung der DNA erwiesen hat, verwendet die Restriktionsenzymverdauung. Andere Verfahren, einschliesslich die chemische Spaltung der DNA, könnten ebenfalls in Verfahren eingesetzt werden, welche fähig sind, eine genomische DNA reproduzierbar in gleiche, einzelne Fragmente zu spalten.

Die fragmentierte DNA kann in ein erkennbares Muster gespalten werden, unter Verwendung von verschiedenen Verfahren, die nützlichsten davon besitzen den Vorteil, dass die Grössen der einzelnen DNA variieren. Beispielsweise können DNA-Fragmente entsprechend dem Molekulargewicht mittels Geschwindig-keits-Sedimentation durch einen Dichtegradienten oder mittels des Molekulargewichts durch Gelausschluss-Chromatographie aufgetrennt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besteht jedoch die bevorzugte Technik darin, dass die DNA-Frag-mente mittels Elektrophorese auf einer Agarose- oder Polyacrylamid Matrix aufgetrennt werden.

Die geklonte LDL-Rezeptor-DNA kann üblicherweise mit radioaktiven Nukleiden markiert werden, welche eine leichte Visualisierung der entsprechenden genomischen LDL-Rezeptor-DNA-Fragmentmuster nach Hybridisierung und Autoradiogra-phie erlauben. Andere Markierungstechniken, einschliesslich beispielsweise durch schwere Isotope, wären ebenfalls möglich, könnten jedoch in der Praxis zur Identifizierung der entsprechenden genomischen Sequenzen beschwerlich sein.

Zusätzlich zur Verwendung der geklonten DNA-Fragmente kann die Diagnose im Prinzip mit chemisch-synthetisierten Oligo-nukleiden durchgeführt werden, welche Teilen der hier offenbarten cDNA entsprechen. Die genomische DNA von Individuen mit Einzelbasensubstitutionen im LDL-Rezeptorgen hybridisiert mit solchen Oligonukleotiden weniger stark, als eine DNA eines normalen Individuums. Eine solche abgeschwächte Hybridisierung stellt demzufolge ein Verfahren zur Diagnose bei vielen Patienten mit FH, sowohl in der heterozygoten, wie auch in der homozygoten Form dar.

Der Rezeptor fur Lipoproteine niederer Dichte (LDL) ist ein Zelloberflächenprotein, das eine zentrale Rolle im Cholesterin-stoffwechsel bei Mensch und Tier darstellt. Durch den Endoçyto-seprozess ist der LDL-Rezeptor fur die Bindung des Serumcholesterins verantwortlich und macht es dem cellulären Metabolismus zugänglich. Dies wird möglich durch die Internalisierung des Rezeptor/Cholesterinkomplexes, wobei das Cholesterin durch Katabolismus des internalisierten Komplexes freigesetzt wird. Das freigesetzte Cholesterin reguliert über einen Rückkopplungsmechanismus die Syntheserate des LDL-Rezeptors. Das zunehmende Bedürfnis nach Cholesterin in gewissen stereoidogenen Geweben, wie in der adrenalen Cortex und im Gelbkörper der Eierstöcke, wird durch eine zunehmende Anzahl der LDL-Rezeptoren befriedigt. Das erste unterscheidende Merkmal des LDL-Rezeptors besteht in den Mutationen, welche seine Struktur und Funktion beeinträchtigen und Anlass zu einem der vorherrschendsten humanen genetischen Leiden, der familiären Hypercholesterinämie fuhren.

Die Technologie der rekombinanten DNA liefert einen Zugang, um die Gegenwart von Mutationen in einem Individuum festzustellen, bei welchem FH vermutet wird. Unter Verwendung einer Probe, bestehend aus gereinigtem, humanem LDL-Rezep-toren oder einem hybridisierbaren Unterfragment davon, können Abnormalitäten, die in einem LDL-Rezeptorgen eines besonderen Individuums, identifiziert werden; und dieses Individuum kann dann Ziel von anderen Therapietypen sein, die gegen die Symptome der FH gerichtet sind. Das heisst, wenn einmal FH-Individuen durch das erfindungsgemässe Diagnostik-Verfahren identifiziert sind, können diese Individuen einer gezielten Therapie unterzogen werden, einschliesslich Diätmodifikation, pharmakologische Wege und Chirurgie, alle mit dem Ziel, die Spiegel des zirkulierenden Cholesterins dieser Individuen zu reduzieren. Zusätzlich könnten die Kenntnisse betreffend die genetische Struktur des LDL-Rezeptorgens in FH-Individuen schliesslich zu dramatischeren therapeutischen Vorgehen gegen das Leiden fuhren, einschliesslich des somatischen Genersatzes- oder Modifikation.

Der erste Schritt zum Verständnis und der Identifikation der grundlegenden, genetischen Abnormalitäten in FH-Individuen besteht in der Entwicklung von zweckmässigen Proben, unter Verwendung der Techniken der Gentechnologie, durch welche sowohl die normalen wie die abnormalen LDL-Rezeptorgene studiert werden können. Die idealste genetische Probe zum Studium der Struktur des humanen LDL-Rezeptorgens wäre ein geklöntes humanes LDL-Rezeptorgen oder eine cDNA, welche zur Rezep-tor-mRNA hergestellt wurde. Es bestehen jedoch Schwierigkeiten, diesem Problem direkt entgegenzutreten, da die Isolierung der Probe aus einigen humanen Quellen erforderlich ist. Diese Quelle wäre vorzugsweise die Nebenniere oder die Eierstöcke, worin der Rezeptor und ihre mRNA in grösserer Reichlichkeit vorhanden sind. Dieser Weg ist jedoch etwas unpraktisch, da es schwierig ist, genügende Mengen von zweckmässigem humanem Gewebe zu erhalten. Hier wird ein Weg beschrieben, worin die LDL-Rezep-tor-cDNA aus einer bovinen Quelle geklont wird und die geklonte bovine LDL-Rezeptor-cDNA dann zur Isolierung eines Teiles des humanen Gens aus einer Genbank verwendet wird. Der Teil des humanen Gens wird dann verwendet, um humane cDNA-Klone mit nahezu vollständiger Länge zu isolieren. Dies war zufällig, da es nicht offensichtlich war, bis die humane cDNA geklont und sequentiell worden war, dass die bovinen Sequenzen, welche als Hybridisierungsproben eingesetzt wurden, als korrekte Proben für das humane LDL-Rezeptorgen verwendet werden konnten. In der Retrospektive ist die Homologie zwischen dem bovinen und humanen Gen genügend, um die hier im einzelnen beschriebene Klonierung zu ermöglichen.

Die Isolierung der humanen rekombinanten DNA-BQone, welche Kopien der humanen LDL-Rezeptor-mRNA aufweisen, erleichterten die Entwicklung eines Tests, durch welchen Mutationen des LDL-Rezeptorgens nachgewiesen werden können. Zur Erläuterung der Nützlichkeit dieses Tests wurde eine Fallstudie mit einem Individuum unternommen, welches an der familiären Hypercholesterinämie (nachstehend FH 274 bezeichnet) litt.

Beispiel 1

Klonieren der bovinen LDL-Rezeptorgen-cDNA

Ein bovines LDL-Rezeptorgen-cDNA-Klon, nachstehend als pLDLR-1 bezeichnet, wurde unter Verwendung einer Kombination einer Polysom-Immunoreinigung und einer oligonukleotiden Hybridisierung isoliert. Diese Schritte bestehen aus der (1) Isolierung des bovinen Rezeptorproteins, der (2) Bildung eines poly-klonalen Antikörpers, welcher fähig ist, sich mit dem bovinen LDL-Rezeptorprotein umzusetzen, der (3) spezifischen Immuno-precipitation dieser bovinen Polysome, welche aktiv an der Translation der bovinen Rezeptor-mRNA beteiligt sind, der nachfolgenden Anreicherung der Rezeptor-mRNA, die aus den ausgefällten Polysomen isoliert wurden, der (4) Zubereitung einer cDNA-Klonbank aus der angereicherten mRNA, einem (5) Screening der cDNA-Klonbank, um ein repräsentatives Klon, welches eine bovine LDL-Rezeptor-cDNA-Insertion trägt. Diese Stufen werden nachstehend im einzelnen beschrieben.

Isolierung des bovinen Rezeptors und Bildung eines polyklonalen Antikörpers

Homogenes LDL-Rezeptorprotein wurde aus der bovinen, adrenalen Cortex isoliert, wie durch Schneider, et al., beschrieben, J. Biol. Chem., 257: 2664-2673 (1982), hier als Referenz aufge5

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nommen. Ein polyklonaler Antikörper gegen den bovinen adrenalen LDL-Rezeptor wurde in Kaninchen gebildet und auf Sta-phylokokken-Protein-A-Sepharose gereinigt wie beschrieben durch Tolleshaug, et al., Cell, 30: 715-724 (1982), hier als Referenz aufgenommen. Dieser Antikörper und sein entsprechendes, nicht-immunes Kaninchen-IgG waren frei an starker RNase-Kontamination, wie durch das Fehlen ihrer Fähigkeit das Sedimentationsverhalten von Polysomen oder Saccharosegradienten zu verändern, gezeigt wurde.

Polysom-Immunoprecipitation von boviner LDL-Rezeptor-mRNA

Polysome, die an mRNA für den LDL-Rezeptor angereichert waren, wurden folgendermassen zubereitet. Bovines Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff innerhalb von 5 Minuten nach der Schlachtung eingefroren. Die Nebennieren wurden in flüssigem Stickstoff durch einen «Waring blender» pulverisiert und vor der Polysom-Isolierung bei — 70 °C aufbewahrt.

Zehn-Gramm-Aliquote pulverisierte Nebenniere wurden mit einem Brinkmann Polytron homogenisiert in 42 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5/25 mM NaCl/5 mM MgCl2/2% (Vol/Vol) Triton X-100/0,3 mg Heparin pro ml/1 ug Trichodermin pro ml/60 (ig Phenylmethylsulfonylfluorid pro ml. Die Polysome wurden durch Précipitation mit MgCl2 aus dem Homogenisat isoliert, wie durch Palmiter Biochemistry, 13: 3606-3615 (1974) beschrieben (als Referenz hier aufgenommen), und bei — 70 0 C aufbewahrt. 25A260-Einheiten von Polysomen wurden pro Gramm Nebennierenpulver erhalten.

Auf einem Zuckergradienten wurde etwa 70% des A260-Mate-rials als Polysome sedimentiert; die verbleibende Absorption war in den 80S Monosomen vorhanden. Die Polysome (1000 A26o-Einheiten) wurden mittels 10 Minuten Zentrifugation bei 20 000 mal g geklärt, dann bis zu 15 A260/ml verdünnt, mit einem Puffer, der 25 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2 0,1 % Nonidet P-40, Heparin 0,2 mg/ml und Trichodermin 1 Hg/ml enthielt und mit 6,25 mg Anti-Rezeptor IgG oder nichtimmunen IgG verdünnt unter Rühren während 1 Stunde bei 4 °C.

Die Polysom/Antikörperaufschlämmung wurde dann zweimal durch eine Protein-A-Sepharosesäule (0,7 x 13 cm), welche im obengenannten Verdünnungspuffer equilibriert war, mit einer Fliessrate von 8 bis 10 ml/Stunde bei 4 °C durchlaufen gelassen. Die Säule wurde über Nacht mit 120 ml Verdünnungspuffer gewaschen. Die gebundenen Polysome wurden mit einer maximalen Fliessrate mit 20 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5/20 mM EDTA eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden 5 Minuten auf 65 °C erwärmt, in 0,5 M NaCl und 0,2% NaDodS04 gebracht, auf 24 ° C abgekühlt und durch eine 01igo(dT)-Cellulose-Säule (0,8 x 2,3 cm), in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5/0,5 M NaCl equilibriert, durchfliessen gelassen. Die Säule wurde mit 20 ml dieses Puffers gewaschen und die Poly(A)+ wurde mit 5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ausgewaschen. Träger tRNA (50 (ig) aus Hefe wurde zugegeben, und die RNA wurde zweimal mit NaOAc und Ethanol ausgefallt. Diese immuno-gereinigte Poly(A)+ RNA wurde in 20 |il Wasser wieder suspendiert und bei — 70 ° C aufbewahrt.

Die immuno-selektionierte Poly(A)+ mRNA wurde auf die Gegenwart von LDL-Rezeptor-mRNA geprüft durch in vitro Translation in einem Reticulocyten-Lysatsystem. Das Lysatsystem wird folgendermassen beschrieben:

Aliquote Anteile Poly(A)+ mRNA wurden mit 2,5 mM CH3HgOH während 10 Minuten bei 4 °C inkubiert und dann translationiert in Kaninchenreticulocyten-Lysaten translatiert hergestellt, wie durch Pelham and Jackson beschrieben, Eur. J. Bio-chem., 67:247-256 (1970) und mit 80 mM KOAc, 1 mM Mg(OAc)2, 19 Aminosäuren (Methionin ausgeschlossen), 16 uM jede und (35S) Methionin mit 0,2 mCi/ml (1 Ci/ 3,7 x 1010Bq) vervollständigt. Die Endkonzentration von CH3HgOH in der Translationsreaktion war 0,3 mM. Die Translationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf NaDodS04/7% Polyacrylamidge-len analysiert.

Die gesamte Nebennieren Poly(A)+-RNA war auf die Synthese von vielen Proteinen gerichtet, wie durch NaDodS04-Gel-elektrophorese und Fluorographie des synthetisierten Produktes nachgewiesen wurde. Dies Poly(A)+-RNA, welche aus den immuno-gereinigten Polysomen abgeleitet war, war auf die Synthese von mehreren der gleichen Proteinbanden plus einem klaren Zusatz gerichtet: ein Protein, welches mit einem Mr von etwa 120 000 wandert. Dieses Protein war nach der Translation von Poly(A)+-RNA ausgewählt aus den Polysomen mit nicht-immunen IgG nicht nachweisbar. Biosynthetische Studien betreffend den LDL-Rezeptor von Hamstern und Kaninchen haben gezeigt, dass der Rezeptor ursprünglich als scheinbarer 120 000 Mr-Vorläufer (worin Mr für das Molekulargewicht in Daltons steht) vorhanden war, welcher eine Serie von posttranslationalen Glykosie-rungsvorgängen während dem Transport zur Zelloberfläche durchläuft, wobei ein reifes Protein mit einem scheinbaren Mr von 160 000 entsteht. Demzufolge war die Grösse des angereicherten Proteins, welches nach der Translation der immuno-ausgewählten Poly(A)+-RNA bemerkt wurde, mit derjenigen des LDL-Rezeptor-Vorläufers konsistent.

Zubereitung und Screening der bovinen cDNA-Klonbank

Die immuno-ausgewählte Poly(A)+-RNA wurde zur Konstruktion einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Methode von Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol., 2:161-170 (1982), als Referenz hier eingeschlossen, verwendet aus Poly(A)+-RNA, die aus 2000 A260-Einheiten von Polysomen abgeleitet wurde. In den Klonierungsreaktionen, worin Enzyme, die von Life Sciences and P-L Biochemicals erhalten wurden, eingesetzt wurden, wurde 1,4 ^g eines Vektor-Primers mit einem dT-Schwanz und 0,52 pmol eines Linkers mit einem dG-Schwanz verwendet.

Teile der cDNA-Bibliothek wurden verwendet, um Escherichia coli RR1 zur Ampicillinresistenz umzuformen durch das CaCl2-Schockverfahren, welches von Maniatis, et al., in Molecular Cloning beschrieben wurde (Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, N.Y., Seite 250), durch Referenz hier eingeschlossen. Kolonien wurden mit hoher Dichte auf Nitrocellulose-filter beschichtet und zwei Replica-Filter wurden für die Hybridisierung vorbereitet (Maniatis, supra, Seite 316). Zur Reduzierung des nicht-spezifischen Hintergrundes wurden gebackene Filter über Nacht in 50 mM Tris-HCl, pH 8/1 mM EDTA/1 M NaCl/ 0,1 % NaDodS04 bei 36 oder 42 ° C gewaschen und dann bei 65 °C während 3 Stunden in 4 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl/15 mM Natriumeitrat), 10 x Denhardt's Lösung (1 x = 0,02% Polyvinylpyrrolidon/0,02% bovines Serumalbumin/0,02% Ficoll) (Maniatis, supra, Seite 327) und die E. coli DNA bei 1000 ug/ml beschallt und denaturiert.

Die Hybridisierung wurde über Nacht in der letztgenannten Lösung durchgeführt, die 32P-5'-endständig-markierte Oligonu-kleotidmischungen (6 x 10® cpm/pmolbei 1 pmol/ml) enthielt, die, wie nachstehend beschrieben, hergestellt wurden. Die Hybri-disierungstemperatur für eine vorgegebene Oligonukleotidprobe entsprach der minimalen Schmelztemperatur tm, berechnet aus der empirischen Formel tm = 2 ° C x (Anzahl der dA dT bp) + 4 ° C x (Anzahl der dG dC bp), worin bp Basenpaare sind. Die Filter wurden dreimal gewaschen in 4 x SSC bei Hybridisierungs-temperatur, während 30 Minuten pro Waschung, bei Zimmertemperatur getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Die positiven Klone wurden aus der Stammplatte herausgenommen und durch weitere verschiedene Screening-Runden gereinigt.

Die Hybridisierungsproben, die im obgenannten, detaillierten Screening-Protokoll verwendet wurden, wurden auf Basis von Sequenz-Information von Peptid-Fragmenten des LDL-Rezep-torproteins folgendermassen hergestellt.

Der gereinigte LDL-Rezeptor wurde mit CNBr verdaut, ein internes CNBr-Fragment wurde durch Hochdruck-Flüssig-Chro-

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matographie (HPLC) isoliert und seine Teil-Aminosäuresequenz wurde durch den automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die CNBr-Fragmente wurden aus zwei verschiedenen Präparaten von reduziertem und (3H) carboxymethyliertem Rezeptor (1,6 und 1,8 mg Protein) gebildet und durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Brownlee (Santa Clara, CA) RP 300-Säule fraktioniert. Die CNBr-Peptide, die hier beschrieben sind, wurden zwei verschiedenen Läufen in einem automatischen Beckman 890C Sequena-tor unterworfen, wobei ein 0,25 M Quadrai-Programm und der Nicht-Proteinträger Poybrene verwendet wurden. Die Ausbeuten des NH2-terminalen Restes des CNBr-Peptides waren 400 und 1100 pmol für beide Läufe. Die wiederholten Ausbeuten auf Basis der Wiedergewinnung des Phenylthiolhydantion von (3H) Çystein waren im Mittel 91%.

Zwei Familien der synthetischen Oligonukleotid-Proben, welche allen möglichen Codons entsprachen, die die Aminosäuresequenz in zwei benachbarten Regionen dieses CNBr-Fragmentes entsprachen, wurden synthetisiert. Eine Oligonukleotid-Familie, in Tabelle I als A bezeichnet, bestand aus 32 Tetradecameren mit dem Code (Met)-Ala-Glu-Asn-Leu. Die Existenz eines Methio-5 ninrestes am Aminoterminus dieser Sequenz wurde durch die Tatsache verhindert, dass das Peptid durch CNBr-Verdauung gebildet wurde. Eine zweite Tetradecamer-Familie, bezeichnet mit B und B* in Tabelle I wurde mit der Sequenz Pro-Glu-(Asp)-Ile-Val codiert. Die Zuweisung des Asp-Restes in dieser Sequenz war io provisorisch, da es nur in einem der beiden Sequenatorläufe beobachtet wurde. Die B/B*-OHgonukleotid-Familie bestand aus insgesamt 48 Mitgliedern, welche aus zwei Subfamilien von 24 synthetisiert wurden und waren nur in den Codon verschieden, die zur Spezifikation des Pro-Restes verwendet wurden (CCT in B 15 und CCcin B*).

Tabelle I

CNBr-Peptidsequenzen und Oligonukleotidsynthese

Met Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu (Asp) Ile Val

C c

TACC TACT

\TGGC GA AA T CC GA GA AT GT

A G TT A G T A

G G

Oligo-Familie A Oligo Familie B und B*

32x14 mere 2x24x14 mere

Dreissig Hybridisierangs-positive cDNA-Klone wurden identifiziert, indem die obige cDNA-Bibliothek mit der Oligonukleotid-Familie B einem Screening unterworfen wurde. Als diese Klone separat mit den Subfamilien B oder B* probiert wurden, hybridisierten 16 Klone stark mit der Oligonukleotidmischung B, jedoch nicht mit B*. Zwölf dieser dreissig Klone waren nur mit Mischung B* positiv. Diese 28 positiven Klone wurden dann mit der Oligonukleotidmischung A einem Screening unterworfen und zwei Plasmide, beide von der letzteren Gruppe von 12, hybridisierten mit dieser Probe. Von diesen beiden Klonen wurde angenommen, cDNAs für den Rezeptor zu enthalten, und sie wurden für die weitere Studie ausgewählt.

Die Plasmid DNAs aus den beiden Klonen, welche sowohl-mit den B* und A Oligonukleotid-Proben hybridisierten, wurden einer Restriktions-Endonukleasen-Kartierung unterworfen und die Resultate zeigten, dass diese beiden Klone identisch waren. Demzufolge wurden die Klone als repräsentative, bovine LDL-Rezeptor-DNA-Klone betrachtet. Eines dieser Klone, das als pLDLR-1 bezeichnet wurde, wurde ausgewählt, um zu bestätigen, dass es ein echtes LDL-Rezeptor-Klon war.

Zur Bestätigung der Identität von pLDLR-1, wurde die gesamte Poly(A)+-RNA aus bovinen Nebennieren und Lebern extrahiert und in Blotting-Versuchen analysiert, unter Verwendung eines nick-translatierten 32P-markierten Plasmides als Probe. Die RNA-Blotting-Versuche wurden folgendermassen durchgeführt. Die gesamte RNA wurde isoliert, indem die Gewebe oder Zellen mit Guanidiniumthiocyanat behandelt wurden (Maniatis, supra, Seite 196). Die Poly(A)+-RNA wurde durch Oligo(dl)-Cellulosenchromatographie gereinigt, mit Glyoxal denaturiert, durch Elektrophorese grössenfraktioniert (20 Volt während 16 Stunden) auf lm5% Agarose-Gel, die 40 mM 3-N-Morpholinopropansulfonsäure (pH 7,0) enthielten und dann auf Zeta Probe membranes (Bio-Rad) durch Kapillar-Blotting in 20 x SSC übertragen. Die Prähybridisierung und Hybridisierung wurden, wie durch Maniatis, supra, Seite 320, beschrieben, durchgeführt.

Die zunehmenden Mengen von Nebennieren-RNA ergaben progressiv stärkere Hybridisierungssignale, entsprechend einer mRNA von etwa 5,5 kb. Ein densitometrisches Scanning zeigte, dass das mit einem gegebenen Anteil adrenaler RNA erhaltene Signal neunmal intensiver war, als dasjenige, welches mit dem gleichen Anteil Leber-RNA erhalten wurde. Vorherige Studien haben gezeigt, dass die funktionelle LDL-Rezeptor-Aktivität etwa eine Grössenordnung reichlicher in der bovinen Nebenniere als in der bovinen Leber vorkommt, eine Entdeckung, welche mit der oben diskutierten Mengendifferenz der mRNAs übereinstimmt.

Die Anzahl der LDL-Rezeptoren kann merklich reduziert werden, wenn die kultivierten Zellen in Gegenwart von Cholesterin oder verwandten Sterinen gezüchtet werden. Poly (A)+-RNA wurde aus humanen A-431-Zellen in Abwesenheit eines Sterins (Rezeptor-induziert) und in Gegenwart von Sterinen (Rezeptorunterdrückt) gezüchtet und durch Blotting mit pLDLR-1 analysiert. Ein starkes Hybridisierungssignal einer mRNA von etwa 5,5 kb wurde in der induzierten RNA festgestellt, und dieses Signal wurde bei der unterdrückten RNA um mehr als 90% reduziert.

Diese Resultate zeigen, dass pLDLR-1 eine cDNA-Kopie mindestens eines Teils des bovinen LDL-Rezeptorgens besitzt. Dieses Klon wurde als ATCC 39965 hinterlegt. Glücklicherweise 60 besteht genügend Homologie zwischen dem bovinen Rezeptorgen und dem humanen Gen, um die Verwendung der bovinen Sequenz als Probe bei der Isolierung des humanen Gens zu verwenden. Diese Verfahren sind im Beispiel II offenbart.

65 Beispiel II

Klonierung und Charakterisierung des humanen LDL-Rezeptorgens

Die verwendete Strategie, um eine cDNA für den humanen

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LDL-Rezeptor in voller Länge zu erhalten, ist in Figur 1 umrissen. Die partielle bovine cDNA (pLDLR-1) wurde verwendet, um eine humane, genomische Genbank zu screenen, die in einem Bakteriophagen nach dem Verfahren von Lawn, et al., Cell, 15: 1157-1174 (1978), durch Referenz hier eingeschlossen, folgendermassen geklont war. Etwa 1 x 106 Bakteriophagen, welche humane, genomische DNA-Insertionen enthielten, wurden mit einer 32P-markierten pLDLR-1 e inem Screening unterworfen. Die Hybridisierung wurde unter Bedingungen reduzierter Schärfe durchgeführt: 30% Formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardt-Lösung, 0, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 100 jig/ml Salmspermien-DNA und 1 p.g/ml Poly(A) bei 42 °C. Die Filter wurden zweimal bei 22 °C während 10 Minuten in 2 x SSC, 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) gewaschen und einmal bei 54 ° C während 60 Minuten in der gleichen Lösung.

Für diese humane, genomische Klonbank wurde ein einziges Klon, Ahl, identifiziert. Es enthielt eine 11 kb (Kilobasen-paar)-Insertion, die am 3'-Ende des humanen LDL-Rezeptorgens codiert war. Ahl wurde zur Bildung eines 236 bp Pvu II-Fragmentes verwendet, welches als einzige Probe für das COOH-terminale Ende der humanen LDL-Rezeptor-cDNA diente.

Eine cDNA-Genbank wurde aus humaner, fötaler, adrenaler Poly(A)+-RNA nach der Methode von Okayama und Berg konstruiert, Mol. Cell. Biol, 2: 161 -170 (1982), die hier durch Referenz eingeschlossen ist. In den Klonungsreaktionen verwendeten wir kommerziell erhaltene Enzyme, 2 ug von Poly(A)+-RNA, 1,5 g pcDVl Vector-Primer mit einem dT-Schwanz und 0,52 pmol eines Linkers mit einem dG-Schwanz. Nach der Transformation in ein E. coli HBIOI-Plasmid wurden die cDNAs aus etwa 3 x 105 Transformanten isoliert und auf längere cDNAs (6 bis 10 kb) angereichert, gemäss der sublibrary method von Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol, 3:280-289 (1983), hier durch Referenz eingeschlossen.

Die humanen LDL-Rezeptor-cDNAs wurden unter Verwendung von zwei Proben identifiziert, eine 5'-spezifische Oligonu-kleotid-Familie, welche aus 32 Heptadecameren bestand, die aus der Sequenz Asn-Glu-Phe-Glu-Cys-Gln bestand, die am NH2-Ter minus des bovinen LDL-Rezeptorproteins vorhanden war und dem 3'-spezifischen 236-Basenpaar Pvu II-Fragment, welches ein 158 bp COOH-terminales Exon enthält, welches vom humanen, genomischen Klon Ahl (oben beschrieben) abgeleitet war. Die Oligonukleotide wurden durch die Phosphoramidit-Methode hergestellt, die durch Mark Zoller (Cold Spring Harbor Laboratory) und Ray Mac Donald (University of Texas, Health Science Center in Dallas) zur Verfügung gestellt. Die Replica-Filter wurden einem Screening unterworfen und fünf Kolonien aus 2396 Rekombinanten waren positiv mit sowohl den 5'- als auch den 3'-spezifischen Proben. Das Plasmid mit der längsten cDNA-Insertion in diesen positiven Klonen (4,9 kb) wurde als p 101 bezeichnet.

Die nukleotide Sequenz der cDNA-Insertion von plOl ergab, dass sie kein 5'-Ende der codierten Region der LDL-Rezeptor-mRNA enthielt. Die Nukleotid-Sequenz-Analyse dieser cDNA ergab, dass die 5'-01igonukleotid-Probe in dieser Region, entsprechend dem extremen NH2-Terminus des Proteins nicht hybridisierend war. Eher hybridisierte die Probe mit einer unvollständigen Wiederholung der NH2-terminalen Sequenz, welche innerhalb der Codierungsregion vorkam. Der offene Leserahmen wurde am extremen 5'-Ende der cDNA-Insertion in p 101 fortgesetzt und es bestand kein Beweis einer vorhandenen Signalsequenz oder eines Initiator-Methionin-Codons. Demzufolge enthielt p 101 nicht die gesamte Codierungsregion.

Um den Rest der Cordierungsregion zu erhalten, wurde ein Oligonukleotid, welches einer Sequenz nahe dem 5'-Ende der cCNA-Insertion in plOl entsprach, hergestellt und eine Primer Extension, unter Verwendung von humaner, fötaler, adrenaler Poly(A)+-RNA als Matrize, wurde durchgeführt. Ein synthetisches Oligonukleotid von 20 Basen, das komplementär zum mRNA-Strand war und 63 Nukleotide vom 5'-Ende der cDNA-Insertion in p 101 hervorbrachte, wurde verwendet, um eine Pri-mer-ausgedehnte cDNA-Genbank von humaner, fötaler, adrenaler Poly(A)+-RNA in pBR322 zu konstruieren. Diese Genbank 5 wurde einem Screening unterworfen mit einem zweiten Oligonukleotid von 20 Basen, welches aus 8 Nukleotiden vom 5'-Ende der cDNA-Insertion von plOl stammte. In den 1044 Rekombinanten, die einem Screening unterworfen wurden, wurde ein Plas-mit, als p203 bezeichnet, identifiziert, dessen cDNA-Insertion mit io derjenigen von plOl für 83 Nukleotide überlappte und nahe dem approximativen 5'-Ende der humanen LDL-Rezeptor-mRNA ausgedehnt war.

Zur Konstruktion einer cDNA in nahezu voller Länge, war es nötig, die zweckmässigen Teile von plOl und p203 (Figur 2) zu 15 verknüpfen. Wegen der Wenigkeit von zweckmässigen Stellen für Restriktionsenzyme, erfordert diese Verknüpfung verschiedene partielle Verdauungen und die Herstellung von zwei Zwischen-plasmiden, wie nachstehend angegeben.

Eine cDNA, welche die gesamte translationierte Region der 20 humanen LDL-Rezeptor-mRNA enthielt, wurde konstruiert, indem die Insertionen von p203 und plOl über die überlappenden Stellen Hgi AI verbunden wurden (Figur 2). Die Konstruktion umfasste drei partielle Verdauungen, drei Multifragment-Verknüpfungen und zwei Zwischenplasmide. P203 wurden mit 25 Pst 1 partiell verdaut und dann vollständig mit Pvu II verdaut, wobei ein Fragment von 341 bp erhalten wurde. Ein Hind III-Pst 1 (518 bp)-Fragment wurde aus pL 1 gereinigt, welches die Signale des Frühregionpromoters und des Spieissens des SB40-Virus enthielt (siehe Figur 2 und Okayama und Berg, 1983). 30 Diese zwei Fragmente wurden verbunden und in die Hind III-Pvu Ii-Stelle von pBR 322 geklont. Dieses Zwischenplasmid wurde als pHPl bezeichnet. Ein 394 bp Hgi AI-Eco Rl-Fragment vom 5'-Ende von plOl wurde mit einem 105 bp Pvu II-Hgi AI-Fragment vom 3'-Ende von p203 gemischt in Eco RI-Pvu II-ver-35 dautem pBR 322 verknüpft. Dieses Zwischenplasmid wurde als pEPl bezeichnet. pEPl wurde partiell mit Pvu II verdaut und dann vollständig mit Eco RI verdaut, wobei ein 499 bp Pvu II-Eco Rl-Fragment erhalten wurde. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem 859 bp Hind III-Pvu II-Insertion von pHPl verknüpft und 40 mit dem 7 kb Hind I II-Eco Rl-Fragment von plOl, entsprechend dem 3' 85% der cDNA und des Kloning Vektors. Das Finale 8,4 kb Plasmid, welches als pLDLR-2 bezeichnet wurde, enthielt eine cDNA-Kopie in voller Länge des humanen LDL-Rezeptors, verbunden mit SV40-Sequenzen (Figur 2).

45 Das Resultat dieses Genetic Engineering war pLDLR2, ein Plasmid, das eine 5,3 kb-cDNA-Insertion enthielt, die der gesamten Codierungsregion der gesamten 3'-untranslatierten Region und mindestens einem Teiles der 5'-untranslatierten Region der humanen LDL-Rezeptor-mRNA entsprach (ATCC 3996 6). so Die cD NA-Insertion von pLDLR-2 wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, Meth. Enzymol., 65:499-500 (1980) und Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463-5467 (1977) sequêniert, wobei beide Publikationen als Referenz eingeschlossen sind. Die für die humane LDL-Rezeptor-cDNA 55 bestimmte Sequenz ist in Figur 3 gezeigt, zusammen mit der vorausgesagten Aminosäuresequenz des entsprechenden Rezeptorproteins. Auf der 5'-Seite des 5'-Endes der in Figur 3 dargestellten Sequenz enthält das Plasmid pLDLR-2 eine fremde DNA, welche von der Bindung einer Haarnadelschlaufe während der 60 Klonierungsreaktionen herzurühren scheint. Die Gegenwart dieser fremden DNA beeinträchtigt in keiner Weise die Nützlichkeit dieser DNA für die diagnostischen Zwecke, welche hier umrissen werden.

65 Beispiel III

Isolierung von genomischen, rekombinanten Klonen, die dem normalen LDL-Rezeptorgen entsprechen

Die genomischen Klone, die sich über das 3'-Ende des huma-

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nen LDL-Rezeptorgens erstrecken, wurden aus einer genomischen Bank hergestellt, die in Bakteriophagen-Vektor, XCharon 4 A konstruiert wurde. Die Genbank wurde uns von T. Maniatis, Harvard University, zur Verfugung gestellt. Der rekombinante Phage wurde mit 32P-markierter pLDLR-1 und pLDLR-2, cD NA-Proben für die bovinen und humanen LDL-Rezeptoren einem Screening unterworfen (siehe Beispiel I, bzw. II). Die Hybridisierung wurde unter strengen Bedingungen durchgeführt: 50% Fomamid, 5 x SSPE (1 x SSPE = 0.18 M NaCl/10 mM NaH2P04, pH 7.4/2 mM EDTA), 5 x Denhardt-Lösung, 0.1% SDS, 100 Lig/ml Lachsspermien DNA und 1 jj.g/ml Poly(A) bei 42 ° C w ährend 16 Stunden. Die Filter wurden zweimal bei 22 °C während 10 Minuten i n 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl/ 0,015 M Natriumeitrat), 0,1% SDS und einmal bei 60 °C für länger oder während 2 Stunden in 0,1 x SSC und 0,1 % SDS gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden luftgetrocknet und einer Autoradiographie unterworfen bei - 70 °C mit einem Kodak XAR-5-Fïlm und Dupont-Cronex-Lighting-plus Intensivierungsschirmen.

Das 3'-Ende des normalen LDL-Rezeptorgens, das in Figur 6 dargestellt ist, ist in drei der Klonen enthalten, die in folgender Weise isoliert wurden: A.33-2, A.33-1 und Mil. Es ist zu beachten, dass die Restriktionskarte des normalen LDL-Rezeptorgens, welche in Figur 6 dargestellt ist ebenso die «Exons» und die IVS-Regionen (dazwischenliegende Sequenzen oder «Introns») zeigen. Der Ausdruck «Exons» bezieht sich auf Genbereiche, welche in mRNA «transcribiert» sind und erscheinen schliesslich im Citoplasma als reife mRNA. Jedes Gen kann zahlreiche Exons aufweisen, welche zusammen das Strukturgen selbst umfassen. Die Exons werden innerhalb des Gens durch Gebiete abgetrennt, welche «dazwischenliegende Sequenzen» oder IVS-Bereiche genannt werden. Die IVS-Bereiche werden in das ursprüngliche RNA-Transkript der DNA transkribiert. Im Unterschied zu den Exons jedoch, werden die IVS-Bereiche aus dem ursprünglichen RNA-Transkript ausgeschlossen und erscheinen demzufolge nie in der Expression des Protein-Endproduktes.

Die DNA-Insertion in XÌ3-2, von etwa 12 kb, codiert die Exons A, B und C; die Insertion in A33-1, von etwa 11 kb, codiert die Exons D, E und F; und die Insertion in A,hl, von etwa 11 kb, codiert die Exons E und F. Die 32P-cDNA-Proben, welche in Figur 4A dargestellt sind, entsprechen den folgenden Regionen des LDL-Rezeptorgens: Die Proben 2-5 hybridisieren gegen die Exons am 5'-Ende des LDL-Rezeptorgens, welchem ungefähr 40 kb DNA in Figur 6 zugeschrieben werden; Probe 6 hybridisiert gegen Exon C; Probe 7 hybridisiert gegen die 5'-Hälfte von Exon F; und die Proben 8 und 9 hybridisieren beide gegen die 3'-HäIfte des Exons F. Das Exon C codiert den O-gebundenen Zuckerbereich des Rezeptors (Aminosäurereste 693 bis 749); das Exon D codiert den Bereich zwischen dem O-gebundenen Zuk-kerbereich und den über die Membrane ausgedehnten Bereich plus 8 der 33 Aminosäuren, welche im Membran-überspannen-den Bereich enthalten sind (Reste 750 bis 775); das Exon E codiert den Rest des Membran-überspannenden Bereiches und 39 der 50 Aminosäuren, welche den Cytoplasma-Bereich ausmachen (Reste 776 bis 828); das Exon F codiert die terminalen 11 Aminosäuren des Cytoplasma-Bereiches des Rezeptorproteins (Reste 829 bis 839) plus die gesamte der 3'-untranslationerte Region der mRNA.

Beispiel IV

Fallstudie an einem Individuum mit familiärer Hypercholesterinämie

Das vorliegende Beispiel offenbart die Verwendung der rekombinanten Klone, die in den Beispielen II und III offenbart sind, um eine Mutation im strukturellen Gen für den LDL-Rezeptor in einer Familie mit FH zu charakterisieren. Der gezeigte Fall ist ein junger Mann (B.H.), nachstehend als FH 274 bezeichnet, welcher alle klinischen Merkmale der homozygoten

FH aufweist. Vorhergehende Funktionsstudien deckten auf, dass kultivierte Fibroblasten von FH 274 ungefähr ein Drittel der normalen Menge I25I-markiertes LDL banden. Die Rezeptoren bei FH 274 bildeten jedoch keine Haufen in den beschichteten Vertiefungen und transportierten demzufolge ihre gebundene LDL nicht in die Zelle. Demzufolge wurde FH der Kategorie der «Internalisierungs-Defekt»-Mutation zugeordnet. Das Studium von Fibroblasten von Verwandten von FH 274 zeigte, dass er zwei verschiedene Allelmutanten vererbt hatte; das Allel, welches den Internalisierungs-defekten Rezeptor codierte, war von seiner Mutter vererbt und das Null (oder stille) Allel, das kein funktionelles Rezeptorprotein produzierte, wurde von seinem Vater vererbt.

Vorhergehende biosynthetische Studien von kultivierten Fibroblasten von FH 274 ergaben, dass das LDL-Rezeptorprotein, welches durch das Internalisierungs-defekte Allel codiert wurde, etwa 10 000 Dalton kleiner war, als der normale Rezeptor. Demzufolge wurde die Studie dieser Mutation begonnen, indem die genomische DNA von FH 274 und seinen Familienmitgliedern analysiert wurde. Wie nachstehend beschrieben,

haben wir gefunden, dass das mutante Gen einer grossen Deletion unterworfen wurde, welches zwei Exons vollständig und ein Exon partiell eliminierte.

Die Deletionsmutation, welche durch die Praxis der voliegen-den Erfindung bei FH 274 aufgedeckt wurde, wurde als Resultat einer Rekombination zwischen zwei wiederholten DNA-Elemen-ten gezeigt: einem Alu-Element in einer Zwischensequenz (IVS), welche sich vor dem Exon befindet, das die Membran-überspan-nende Region des Rezeptors codiert und ein Alu-Element im Exon, welches die 3'-untranslatierte Region des Gens codiert. Alu-Sequenzen sind humane DNA-Sequenzen, welche einen hoch repetitiven Charakter aufweisen. Es wird angenommen, dass die Alu-Sequenzen für eine Anzahl von genetischen Mutationen verantwortlich sein könnten, wegen ihrer hoch repetitiven Natur: eine Alu-Sequenz von einer Region des Gens kann mit einer anderen Alu-Sequenz einer anderen Region übers Kreuz hybridisieren und eine «Schleife» in der DNA bilden. Demzufolge tritt die Deletion auf, wenn diese «Schleife» aus dem Gen herausentwickelt wird, wobei ein unvollständiges Gen zurückbleibt.

Das im Fall FH 274 resultierende, mutierte Gen produziert einen verstümmelten LDL-Rezeptor, dem eine Membran-über-spannende Region und ein Citoplasma-Gebiet fehlt. Die meisten dieser verstümmelten Rezeptoren werden von der Zelle ausgeschieden, einige von ihnen bleiben jedoch an der Oberfläche mit der Zelle verbunden. In dieser Stellung können sie LDL binden, der Mangel eines Cytoplasma-Bereiches macht aber diese Rezeptoren unfähig, Trauben in den beschichteten Vertiefungen zu bilden und das LDL in die Zelle zu transportieren.

Southern Blotting-Analyse der FH 274-DNA im Vergleich zu normaler DNA

Die bevorzugte Art, welche von den Erfindern zum Sichtbarmachen einer Deletionsmutation in ein FH-Individuum in Betracht gezogen wurde, umfasst die Verwendung einer wohlbekannten Technik, die als Southern Blotting bekannt ist. Kurz, Southern Blotting ist ein Verfahren, worin eine genomische DNA zuerst von einem Individuum isoliert und in einzelne Fragmente fragmentiert und elektrophoretisch auf einem Agarose-Gel abgetrennt wird. Das DNA-Muster kann dann vom Gel auf eine stabile Matrix «aufgedruckt» werden. Das Muster dieser Fragmente, welches dem LDL-Rezeptorgen entspricht, kann dann durch Hybridisierung einer markierten LDL-Rezeptor-cDNA oder einer genomischen Probe mit der bedruckten Matrix sichtbar gemacht werdenm und das Genmuster wird mittels des Markers visuali-siert.

Bei der Durchführung der Fragmentierung der ursprünglichen DNA wird die DNA vorzugsweise durch Restriktion-Endonu-klease in kleinere DNA-Fragmente verdaut. Das einzige Erfordernis ist jedoch, dass das ausgewählte Verfahren fähig sein sollte,

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die genomische DNA reproduzierbar in das gleiche Fragmentmuster aufzuspalten. Auf diese Weise zeigen identisch gespaltene Gen-Fragmente bei ihrer Abtrennung ein reproduzierbares Muster, z.B. auf Basis der Länge der Fragmente. Demzufolge können die LDL-Rezeptorgen-Fragmente von Test-Individuen mit entsprechenden Fragmenten von Kontroll-Individuen verglichen werden, um eine Verschiebung des entsprechenden LDL-Musters festzustellen. Eine Verschiebung des Musters der LDL-Rezeptorgen-Fragmente von einem Test-Individuum im Vergleich mit einem Kontrollmuster, könnte indikativ für eine Genmutation sein.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass die Restriktions-Endonuklease Xba I die genetische Mutation aufzeigt, welche FH 274 aufwies. Es muss jedoch in Betracht gezogen werden, dass in zukünftigen Fallstudien es nötig sein könnte, andere Restriktions-Enzyme zu verwenden. Demzufolge könnte eine Batterie von Enzymen in gewissen Fällen nützlich sein, um das korrekte Enzym für einen bestimmten Defekt zu finden. Die Fachleute werden feststellen, dass solch eine Batterie von Verdauungen nötig sein kann.

Nach der Fragmentierung der DNA werden die produzierten Fragmente in Muster aufgetrennt, wobei individuelle Fragmente voneinander abgetrennt werden. Das bevorzugte Mittel für die Abtrennung der DNA-Fragmente besteht darin, die Fragmente gemäss der Grösse aufzutrennen, indem die DNA einer Elektrophorese in einer Agarose-Gel-Matrix unterworfen wird. Die Agarose-Gel-Elektrophorese ist ein auf dem Fachgebiet wohlbekanntes Verfahren. Es können jedoch andere Typen von Trenntechniken verwendet werden, einschliesslich beispielsweise, Säulenchromatographie oder Dichtegradient-Zentrifugation. Die Gel-El ektrophoresentechnik ist insofern nützlich, dass sie die Trennung von Fragmenten in einer Weise erlaubt, welche die präzise Bestimmung der scheinbaren Grösse der abgetrennten Fragmente erlaubt und eine leichte Handhabung der so abgetrennten Fragmente ermöglicht. Im weiteren können die in der Gel-Matrix vorhandenen LDL-Rezeptorgen-Fragmente direkt durch die Southern Blotting-Technik sichtbar gemacht werden, wie dies nachstehend vollständiger beschrieben wird.

Die Figur 4B zeigt ein Southern Blotting einer genomischen DNA von normalen Zellen und von FH 274, nach der Verdauung mit Xba I und der Hybridisierung mit verschiedenen cDNA-Proben. Insbesondere werden die Southern Blotting-Hybridisierungen folgendermassen durchgeführt. Die genomische DNA (4 Hg) wurde aus kultivierten Fibroblasten des angegebenen Individuums isoliert (Maniatis, supra), mit Xba I verdaut (New England Biolabs), elektrophoresiert in 1% Agarose, die den Puffer A enthielt (40 mM Tris-Acetat, 3 mM Na2EDTA, 20 mM NaOA c und 18 mM NaCl bei pH 8.15) und durch osmotische Diffusion aus Nitrocellulose-Papier übertragen (Maniatis, supra). Das Papier wurde während 16 Stunden bei 42 ° C mit der zweckmässigen 32P-markierten cDNA-Probe (2-4 x 106 cpm/ml) in 50% Formamid, 1% SDS, 5 x Denhardt-Lösung, 4 x SSPE und 100 (ig/ml E. coli DNA inkubiert, nach einer Vorhybridisierung während 1 Stunde bei 42 ° C in der gleichen Lösung ohne 32P-mar-kierte Probe. Nach der Hybridisierung wurde das Papier in 1% SDS plus 2 x SSC während 15 Minuten bei 23 °C und dann in 1% SDS plus 0.1 x SSC (für Hypridisierungen mit Probe 1) oder in 1% SDS plus 0.5 x SSC (für Proben 2-9) während 4 Stunden bei 68 °C gewaschen. Ein Röntgenfilm wurde mittels eines Inten-sivierungs-Schirmes während 24 Stunden bei - 70 °C den Filtern ausgesetzt. Zwei repräsentative Blotting-Hybridisierungen der Proben 1 und 8 sind in Figur 4B dargestellt. Die Grössen und Lagen der 32P-markierten cDNA-Proben, welche zur Kartierung des LDL-Rezeptorgens verwendet wurden, sind in Figur 4A durch die geschlossenen Balken dargestellt und sind mit 1-9 numeriert. Die Probe 1 (doppelsträngige DNA) war eine Mischung eines 2,1-kb EcoRI-Smal-Fragmentes und drei verschiedenen 0.9-kb BamHI-XhoI-Fragmenten von plOl, welche zusammen das meiste der translati onierten Region des Gens überspannen. Die Fragmente wurden durch Polyacrylamid -Gel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und dann mit 32P durch «Random hexanucleotide priming» markiert wie durch Feinberg und Vogelstein beschrieben, Analyt. Biochem, 132: 6-13 (1983), als Referenz hier eingeschlossen. Die Proben von 2-9 wurden aus M13-Subklonen von einsträngigen pLDLR-2 einheitlich mit 32P-markierter DNA mit einer Länge von ungefähr 100 Nukleotiden markiert gemäss der Methode von Church und Gilbert, Proc. Naü. Acad. Sei. USA, 81:1991-1995 (1984), als Referenz hier eingeschlossen. Alle Proben hatten eine spezifische Radioaktivität von mindestens 5 x 108 cpm/ug.

Zur Herstellung der Probe 2 wurde kurz gesagt ein DNA-Fragment, welches die Nukleotide 267 bis 1081 (Figur 3) enthielt, in bakteriophagen Ml 3mp9-Vektor geklont, wie durch Messing, Meth. Enzymol., 101:20-78 (1983), beschrieben, als Referenz hier eingeschlossen. Einsträngige, einheitlich mit 32P-markierte DNA-Proben mit einer Länge von etwa 100 Basen, wurden aus dem resultierenden Klon gemäss dem Verfahren von Church und Gilbert, supra, hergestellt, unter Verwendung eines M13-Univer-salprimers und des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I zur Extension des Primers in Gegenwart von drei unmarkierten Desoxidnukleotiden und einem Alpha-32P-markierten Desoxid-nukleotid. Das resultierende radioaktive Primer-Extensions-Pro-dukt wurde durch Kochen von der Schablone denaturiert, auf einem denaturierten Aciylamid-Gel Grössen-fraktioniert, elek-troeluiert und dann direkt als Probe verwendet. Die Proben 3-9 wurden in ähnlicher Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass M13-Klone, welche verschiedene Regionen der Sequenz in Figur 3 enthielten, als Schablonen verwendet wurden.

Unter Bezugnahme auf Figur 3 umfasst die Probe 3 etwa die Nukleotide der Nummern 719 bis 2544; Probe 3 umfasst etwa die Nukleotide 267 bis 1078; Probe 5 umfasst ungefähr die Nukleotide 1573 bis 3486; Probe 6 umfasst etwa die Nukleotide 2154 bis 2544; Probe 7 umfasst etwa 2545 bis 3948; und die Proben 8 und 9 etwa 4508 bis 4962 .

Figur 4B zeigt Southern Blottings von genomischen DNA aus normalen Zellen und von FH 274 nach der Verdauung mit Xbal und Hybridisierung mit verschiedenen cDNA-Proben. Probe 1 war eine Mischung von cDNA-Fragmenten, welche das meiste der translatierten Region der LDL-Rezeptor-mRNA (Figur 4A) überspannte. Als diese Probe mit der Xbal-verdauten, genomischen DNA des normalen Subjektes hybridisiert wurde, wurden drei Banden beobachtet, von 23-, 10-, und 7-kb, die als A, C, bzw. D (Figur 4B) bezeichnet wurden. Alle diese normalen Banden plus eine zusätzliche Bande mit 13-kb, als B bezeichnet, waren in der genomischen DNA von FH 274 vorhanden. Diese Entdeckung lässt schliessen, dass eines der mutierten Allele in FH 274 ein normales Restriktions-Muster zeigt, während das andere Allel den Anlass zur Bande B gab.

Zur Lokalisation des DNA-Segmentes, welches An ass zur Bande B gab, wurden die Xbal-Verdauungsprodukte mit kurzen DNA-Fragmenten probiert, welche diskreten Regionen der LDL-Rezeptor-cDNA entsprachen (Proben 2-9, Figur 4A). Die Proben 2-5 hybridisierten zu identischen Banden bei der normalen und der FH 274-DNÀ. Die Proben 6, 8 und 9 (jedoch nicht Probe 7) hybridisierten zur abnormalen 13-kb-Bande B in der FH 274-DNA. Soweit Bande B nicht mit Probe 7 hybridisierte, jedoch mit Proben auf beiden Seiten von Probe 7 hypridisierte (d.h. Proben 6, 8 und 9) scheint dieses Fragment das Resultat einer Deletion der DNA zu sein, welches die Region codiert, welche die mRNA codiert, welche von Probe 7 umfasst wurde. In diese Deletion ist vermutlich die Entfernung mindestens einer Xbal-Schnittstelle involviert, mit der Fusion der angrenzenden DNA-Sequenzen in ein einziges Xbal-Fragment von 13 kb, nämlich die Bande B.

Die spezifische Mutation, welche FH 274 zeigte, sollte in keiner Weise als einziger Mutationstyp ausgelegt werden, welcher in

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anderen FH-Individuen gefunden werden wird. Trotzdem 2-5 Proben kein verändertes LDL-Rezeptorgen-Fragmentmuster im Fall FH 274 zeigten, werden demzufolge diese Proben nützlich für die Entdeckung von anderen Mutationen in anderen FH-Individuen sein. Die Proben 2-5 hybridisieren die 5'-Hälfte des Rezeptorgens. Demzufolge werden Mutationen, welche in dieser Region des Rezeptorgens vorkommen unter Verwendung der Proben 2-5 nachweisbar sein. Da die Probe 7 zur Bande D hybridisiert (Figur 4A), wird sie in ähnlicher Weise für den Nachweis von Mutationen nützlich sein, welche in dieser Genregion vorkommen.

Zur Bestimmung, ob die Bande B aus den maternalen (Inter-nalisierungs-Defekt) oder paternalen (Null) Allelen stammt,

haben wir Xbal-Verdauungen von genomischer DNA beider Eltern durchgeführt. Die Figur 5 zeigt, dass die Bande B in der DNA der Mutter, jedoch nicht in derjenigen des Vaters vorhanden war, was anzeigt, dass die Deletion auf dem internalisierungs-defekten Allel vorhanden war.

Detaillierte Charakterisierung der Mutation, welche FH 274 zeigte

Der folgende Vesuchssatz demonstriert die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung, indem sie fähig ist, die Gegenwart einer Mutation im LDL-Rezeptorgen nachzuweisen und ein Mittel zur Verfugung zu stellen, wodurch eine solche Mutation spezifisch im einzelnen beschrieben und identifiziert werden kann.

Unter Verwendung der rekombinanten Klone und von Southern Blotting-Techniken mit LDL-Rezeptor-cDNA-Proben kann eine detaillierte Restriktionskarte eines FH-Individuums erzeugt werden. Diese Genkartierungs-Techniken sind nun den Fachleuten wohlbekannt. Die besondere Karte, welche für FH 274 erzeugt wurde, ist in Figur 6 gezeigt. Figur 6 ist ein Vergleich der Restriktions-Karten des 3'-Endes des normalen LDL-Rezeptorgens und des Gens, welches eine Deletion trägt aus FH 274. Die unten angegebene Skala gibt die Länge der genomischen DNA in Kilobasen an. Die Organisation des normalen LDL-Rezeptorgen ist im Diagramm oben angegeben. Die Exons sind durch ausgefüllte Segmente und durch grosse Buchstaben angegeben; die Zwischensequenzen (IVS) sind durch offene Segmente und Kleinbuchstaben angegeben. Die Alu-wiederholten Sequenzen in IVS c und Exon F sind angegeben. Die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, welche zur Definition der Gendefinition in FH 274 verwendet werden, sind dargestellt.

Die Restriktionskarte des normalen Rezeptorgens wurde aus Studien von drei genomischen Klonen gebildet (A33-X, >.33-1, Xhl) (Beispiel III). Die Karte des Gens FH 274 wurde aus À.FH 274-10 gebildet, welches das Xbal -Fragment B (Figuren 4B und 5) (siehen unten) enthält. Die durchgezogenen Striche oben und unten der Restriktionskarte bedeuten Segmente der normalen und mutierten Gene, welche für die DNA-Sequentierung verwendet wurden.

Um FH 274-10 zu erhalten, stellten wir 570 (ig einer genomischen DNA von Fibroblasten von FH 274 her und verdauten sie mit 1700 Einheiten Xbal. Die verdaute DNA wurde mit Phenol/ Chloroform und dann mit Chloroform extrahiert, mit 70% Ethanol und 86 mM Natriumacetat ausgefällt und in 100 ul des Puffers B aufgelöst (10 mM Tris-Chlorid und 1 mM Na2EDTA bei pH 7,5). Die DNA (80 [ig) wurde mit 100 Einheiten Xbal wiederverdaut und auf ein l%iges niedergeliertes Temperatur-Agarose-Gel gegeben (Bethesda Research Laboratories), welches den Puffer A enthielt und mit 40 V während 72 Stunden bei 4 ° C elektropho-resiert.

Nach der Elektrophorese wurden 2-mm- Scheiben des Gels, welches die DNA-Fragmente im Bereich von 9-23 kb enthielt, extrahiert, konzentriert und in 20 jxl des Puffers B aufgelöst. Ein

Aliquot (4 ul) jede DNA-Fraktion, 5 jig Xbal-verdaute genomische DNA von FH 274 und die Grössenmarkierungs-Fragmente wurden auf individuellen Bahnen auf ein 0,8% Agarose-Gel geladen, welches den Puffer A enthielt und bei 35 V während 16 Stunden bei 23 ° C elektrophoresiert.

Die DNA wurde auf Nitrocellulose-Papier transferiert und mit der 32P-markierten Probe 1 wie oben beschrieben hybridisiert. Das resultierende Autoradiogramm identifizierte die Fraktion, welche das abnormale 13-kb Xbal-Fragment (Fragment B, Figur 4) enthielt. Die übrige DNA aus dieser Fraktion (100 ng) wurde mit 500 ng Xbal-verdauten Armen von Charon 35 gemischt und mit 490 Einheiten T4 DNA-Ligase inkubiert (New England Biolabs), während 72 Stunden bei 14 °C. Das verknüpfte Material wurde in vitro in Phagen-Partikel (Amersham) gepackt, wobei insgesamt 6,7 x 103 plaquenbildende Einheiten erhalten wurden. Diese Genbank wurde mit 32P-markierter Probe 8 (Figur 1) einem Screening unterworfen, wobei erwartet wurde, nur ein abnormales Fragment nachzuweisen (13 kb), da das entsprechende normale Fragment (7 kb) zu klein war, um lebensfähige rekombinante Pha-gen zu bilden. Ein rekombinantes Klon wurde identifiziert (XFH 274-10) und isoliert, nach seinem zusätzlichen Kreis der Placken-Reinigung. Die 13-kb-Insertion in À.FH 274-10 wurde aus gereinigter DNA isoliert, in pSP65 (Promega Biotec) subgeklont und für die Restriktions-Endonukleasen-Kartierung verwendet.

Die Figur 6 zeigt, dass die PvuII-Stelle in IVSc und die Sstl-Stelle in Exon F nur durch ungefähr 5,9-kb in den geklonten Fragmenten den normalen Genes, jedoch nur etwa 0,6-kb in den geklonten Fragmenten des FH 274-Gen abgetrennt wurden. Überdies wurden verschiedene Restriktions-Enzymstellen zwischen der PvuII-Stelle und der Sstl-Stelle in geklonten FH 274-Gen vermisst. Diese Daten bestätigen die Diagnose, welche durch das genomische Southern Blotting gemacht wurde, welches oben diskutiert wurde und lassen den Schluss zu, dass 5 kb der DNA aus dem FH 274-Gen deletiert war. Die Deletion umfasste das 3'-Ende von IVSc, alle Exons D und E und die IVS, welche sie trennen, und das 5'-Ende des Exon F.

Zur präzisen Lokalisierung der 5'- und 3'-Bruchstellen und der Struktur in der Deletionsverbindung in FH 274 bestimmten wir die Nukleotid-Sequenzen der geklonten Teile der Gene, die durch die Striche in Figur 6 begrenzt sind. Diese Sequenzen deckten auf, dass die Deletionsverbindung zwischen zwei wiederholten Elementen der Alu-Familie vorhanden war, die in entgegengesetzte Richtungen orientiert waren. Die 5'-Seite der Deletionsverbindung wurde von einer Alu-Sequenz in IVS c abgeleitet. Die 3'-Seite der Deletionsverbindung war von einer entgegengesetzt orientierten Alu-Sequenz im Exon F abgeleitet.

In einem Test, welcher an einem zweiten FH-Individuum, unter Verwendung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde, misslang es, die Deletion im LDL-Rezeptorgen dieses Individuums aufzudecken. Es wird angenommen, dass der Defekt im LDL-Rezeptorgen dieses Individuums auf einer Punktmutation beruht. Defekte, die nicht auf einer Deletionsmutation beruhen, können durch Modifikation und Ausdehnungen der vorliegenden Erfindung aufgedeckt werden.

Trotzdem die Rekombination zwischen wiederholten DAN-Sequenzen als Ursache von Deletionen postuliert worden war,

sind nach dem Wissen der Erfinder der vorliegenden Erfindung solche Umlagerungen in eukaiyotischen Zellen vorher noch nie geschildert worden. In den meisten wohlcharakterisierten Dele-tions-Mutationssätzen von Säugetieren, d.h. in solche, welche in humanen Alpha- und Beta-Globingenen vorkommen, kommt eine der Deletionsbruchstellen häufig innerhalb einer Alu-Sequenz vor, jedoch war die andere Bruchstelle soweit immer in der nichtwiederholten DNA-Sequenz vohanden.

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4 Blatt Zeichnunger

Claims (11)

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   PATENTANSPRÜCHE

   1. Rekombinanter DNA-Transfervektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, welche komplementär zu mindestens einem hybridisierbaren Teil einer DNA-Sequenz ist, welche ein humanes LDL-Rezeptorprotein codiert.
2. 2. Rekombinanter DNA-Transfervektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, welche als eine cDNA-Sequenz definiert ist, welche komplementär zu mindestens einem hybridisierbaren Teil einer humanen LDL-Rezeptor-mRNA ist.
3. 3. Rekombinanter DNA-Transfervektor nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA-Sequenz als mindestens ein hybridisierbarer Teil der DNA-Sequenz gemäss Fig. 3 definiert ist.
4. 4. Rekombinanter DNA-Transfervektor gemäss Anspruch 1, welcher als rekombinantes Plasmid oder als rekombinanter Bakteriophage definiert ist.
5. 5. Rekombinanter DNA-Transfervektor nach Anspruch 4, welcher weiter als Plasmid pLDLR-2 mit der Restriktionskarte gemäss Hg. 2 definiert ist.
6. 6. Rekombinanter DNA-Transfervektor nach Anspruch 4, worin der Bakteriophage als Bakteriophage A.33-1 mit einer DNA-Insertion, welche die Exons D, E und F nach der für das LDL-Rezeptorgen in Hg. 6 dargestellten Restriktionskarte codiert, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 40147 definiert ist.
7. 7. Rekombinanter DNA-Transfervektor nach Anspruch 6, worin der Bakteriophage weiter als Bakteriophage X33-2 mit einer DNA-Insertion, welche die Exons A, B und Cnach der für das LDL-Rezeptorgen in Hg. 6 dargestellten Restriktionskarte codiert, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 40148 definiert ist.
8. 8. Rekombinanter DNA-Transfervektor nach Anspruch 6, worin der Bakteriophage weiter als Bakteriophage Ahl mit einer DNA-Insertion, welche die Exons E und F nach der für das LDL-Rezeptorgen in Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte codiert, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 40149 definiert ist.
9. 9. Bakterienstamm, enthaltend einen rekombinanten DNA-Transfervektor gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3.
10. 10. Bakterienstamm nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pLDLR-2 nach Anspruch 5 enthält, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 39966.
11. 11. Verfahren zur Diagnose einer Mutation im LDL-Rezeptorgen eines Individuums, welches folgende Schritte umfasst:

    a) Fragmentierung von DNA von Zellen des Individuums,

    b) Auftrennen der DNA-Fragmente vom Schritt (a) im Muster gemäss ihrer biochemischen Eigenschaften,

    c) Identifizierung des Musters von DNA-Fragmenten, welches dem LDL-Rezeptorgen entspricht,

    d) Diagnose der Mutation durch Identifikation einer Änderung des Musters von Schritt (c) bezogen auf das Muster von normalen LDL-Rezeptorgen-DNA-Fragmenten mittels eines rekombinanten DNA-Transfervektors nach Anspruch 1.