DE69333659T2

DE69333659T2 - Einschätzung von in trans-agierenden faktoren der allelen variation

Info

Publication number: DE69333659T2
Application number: DE69333659T
Authority: DE
Inventors: Alexander Nigel MORRISON; Allen John EISMAN; James Paul KELLY
Original assignee: Garvan Institute of Medical Research
Current assignee: Garvan Institute of Medical Research
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-08-02
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2013-08-03
Also published as: JP3465903B2; EP0652975A1; CA2141300C; DE69333659D1; CA2141300A1; US5593833A; DK0652975T3; WO1994003633A1; AU4690093A; JP2004000235A; EP0652975B1; AU673187B2; EP0652975A4; JPH08501933A; JP3645247B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Allelunterschieden bei trans-wirkenden Faktoren als ein Mittel zur Identifizierung von Individuen, bei denen ein Risiko besteht, unter einem abträglichen pathophysiologischen Zustand zu leiden. Das Verfahren der Erfindung ist besonders nützlich bei der Bestimmung von Allelvariationen in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen und dadurch bei der Vorhersage einer Veranlagung für niedrige oder hohe Knochendichte. Darüber hinaus könnten diese Varianten verwendet werden, um ein Osteoporose-Langzeitrisiko vorherzusagen wie auch die Fähigkeit vorherzusagen, auf eine Therapie, die sich auf die Knochendichte bezieht, anzusprechen. Diese Wirkung ist auch ein Modell zur Bestimmung einer Veranlagung für oder einer Resistenz gegen andere pathologische oder physiologische Variationen aufgrund von anderen Transkriptionsfaktor-Genvarianten und folglich für die Bestimmung eines Krankheitsrisikos und eines Ansprechens auf eine Therapie. Solche Transkriptionsregulatoren könnten Liganden-aktivierte Genregulatoren, wie die Steroid/Retinoid/Thyroidhormonrezeptor-Genfamilie, sein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Hintergrund der Erfindung
Vitamin D wirkt als ein hochwirksamer Regulator der Knochen- und Calciumhomöostase wie auch der Zelldifferenzierung und der Replikation in vielen Zielgeweben. Es wirkt als dessen dihydroxylierter Metabolit (1,25-Dihydroxyvitamin D oder Calcitriol) durch den hochspezifischen Vitamin D-Rezeptor (1). Dieses trans-wirkende transkriptionelle Aktivatorprotein vermittelt die Calcitriol-Wirkung bei der Regulation der Expression von Zielgenen. Die Klonierung des Vitamin D-Rezeptorgens (2,3) zeigte, dass dieses ein Mitglied der Ligande n-aktivierten Rezeptor-Superfamilie, die die Rezeptoren für Steroidhormone (Glucocorticoide, Progesteron, Östrogen, Androgen und Mineralocorticoide) wie auch Thyroidhormone und Vitamin R-Derivate (4,5), natürliche Regulatoren einer großen Anzahl von physiologischen und Entwicklungsprozes sen, umfasst, ist. Die Mechanismen, durch welche diese Rezeptorproteine die Regulation der Genexpression vermittteln, sind Gegenstand intensiver Forschung gewesen. Es sind seltene offenkundige Mutationen identifiziert worden, die die Funktion von Rezeptoren beeinträchtigen und die bedeutende funktionale Störungen bei Menschen und Tieren verursachen. Beispielsweise ist über Mutationen in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen, die zu Vitamin D-resistenter Rachitis führen (6), und in dem Androgenrezeptor, die zu Androgen-Unempfindlichkeit führen (7) berichtet worden, und in dem Östrogenrezeptorgen ist ein nicht häufig vorkommender natürlicher Polymorphismus mit einer hohen Rate von Fehlgeburten korreliert worden (8). Trotz einer Fülle von molekularer Information ist jedoch wenig über den potentiellen Beitrag von natürlichen Allelvariationen in Rezeptorgenen zur Verschiedenartigkeit des Ansprechens auf Steroidhormone bei normaler Physiologie und bei Krankheitszuständen bekannt.
Morrison et al. (« Frequent alleles of the human Vitamin D receptor gene are functionally distinct », Journal of Cellular Biochemistry, Nr. (Suppl. 16 c), Februar 1992, Seite 20) geben an, dass häufige RFLPs, die humane Vitamin D-Rezeptor-Allele definieren, das Erfordernis als Marker für funktional unterschiedliche Rezeptorgene erfüllen, indem sie hochgradig mit entweder hohen oder niedrigen Serumkonzentrationen von Osteocalcin in normalen Personen korreliert sind.
Osteoporose ist ein bedeutendes Problem der öffentlichen Gesundheit unter der älteren Generation in den meisten westlichen Ländern, welche sowohl enorme Gesundheitspflegekosten als auch schwächende Langzeitwirkungen (Riggs NEJM) mit sich bringt. Da eine Therapie von bestehender Osteoporose weit entfernt von zufriedenstellend bleibt, ist Prävention die beste Wahl. Präventionsstrategien für Osteoporose müssen sich auf die Entwicklung einer maximalen Knochendichte im frühen Erwachsenenalter und die Minimierung von mit dem Alter in Zusammenhang stehendem und postmenopausalem Knochenverlust konzentrieren. Beweise aus Zwillings- und Familienuntersuchungen haben starke genetische Effekte hinsichtlich der maximalen Knochendichte gezeigt, die durch hormonale Faktoren, Ernährung und Lebensstil modifizierbar sind (Kelly et al., OI) Zwillingsuntersuchungen haben gezeigt, dass monozygote Zwillingspaare eine viel größere Übereinstimmung oder Konkordanz hinsichtlich der den Rumpf und die Gliedmaßen betreffenden Knochendichte auf weisen, als dies dizygote Paare tun. Eine Analyse dieser Daten zeigte, dass diese genetischen Faktoren für ungefähr 75% der gesamten Variation bei der Knochendichte verantwortlich sind. Dieser Effekt ist in Mutter-Tochter-Paar-Untersuchungen bestätigt worden. Die Erfinder analysierten die potentiellen Mechanismen dieses genetischen Effekts in dem Zwillings-Modell. Die Erfinder fanden heraus, dass der genetische Effekt sich in bestimmten biochemischen Indices des Knochenumsatzes, wie Osteocalcin, einem Marker der Knochenbildung, zeigte. Darüber hinaus war unter dizygote n Zwillingen die höhere Osteocalcinkonzentration mit der niedrigeren Knochendichte verbunden. Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass der genetische Effekt mit gleicher Stärke bei einem anderen Marker der Knochenbildung, d.h. dem C-terminalen Propeptid von Procollagen vom Typ I, und weniger stark bei einem Marker des Knochenabbaus, dem C-terminalen Telopeptid von Collagen vom Typ I, gezeigt werden kann. Unter normalen Umständen sind Knochenbildung und Knochenabbau in dem physiologische n Zwillingsprozess des Knochenumsatzes eng verknüpft oder "gekoppelt". So zeigen die etwas überraschen den Ergebnisse aus den Zwillingsuntersuchungen, dass die Knochenbildungsmarker als Marker des Knochenumsatzes die Knochendichte vorhersagen und dass die genetische Regulation des Knochenumsatzes der Mechanismus des starken genetischen Effekts auf die Knochendichte ist.
Die Querschnittsdaten bezüglich der Knochendichte bei Zwillingen legten nahe, dass ein einziges Gen oder ein Satz von Genen für den genetischen Effekt auf die Knochendichte verantwortlich ist. Es war jedoch unbekannt, wie dieser Effekt vermittelt wird und welches Gen oder welche Gen e die Knochendichte beeinflussen. In neueren Untersuchungen unter Verwendung von Restriktionslängenpolymorphismus haben die Erfinder gezeigt, dass eine übliche Allelvariation in dem Vitamin D-Rezeptor (VDR)-Genort Osteocalcin unabhängig von Alter, Geschlecht oder Menopausenstatus vorhersagt (Morrison et al., PNAS) Das Vitamin D-Rezeptor-Gen ist wie die aktive hormonale Form v an Vitamin D (1,25- Dihydroxyvitamin D) ein wichtiger zentraler Regulator der Knochen- und Calciumhomöostase, welcher die Calciumabsorption im Darm, die Knochenbildung, die Rekrutierung von Knochen resorbierenden Zellen (Osteoklasten) und die Knochenresorption per se wie auch die Parathormon-Produktion und die eigene Aktivierung von Vitamin D in der Niere moduliert. Aufgrund der Wahrscheinlichkeit, dass jegliche Veränderungen in dem Rezeptor für die aktive hormonale Form von Vitamin D derart breit gestreute Wirkungen haben könnten, wurde die Wirkung von diesen üblichen VDR-Gen-Allelen auf die Knochendichte unter Verwendung eines Zwillingsmodells untersucht. In dem Zwillingsmodell beseitigen Vergleiche innerhalb eines Paars Alter- und verschiedene Kohorten-Effekte als Verzerrungen bewirkende Elemente.
Die Untersuchungen haben gezeigt, dass übliche Allelvarianten in dem VDR-Gen Unterschiede bei der Knochendichte vorhersagen und für 50 bis 75% der gesamten genetischen Determinierung der Knochendichte in dem Rückgrat und der Hüfte verantwortlich sind.
Es wird angenommen, dass dies ein klares Beispiel ist, dass Genotypveränderungen bei Transkriptionsregulatoren von Genen, die regulatorische und/oder Strukturproteine kodieren, physiologische Sollwerte und eine Veranlagung für pathophysiologische Zustände mit Auswirkungen auf die Anfälligkeit für Krankheiten und für die Determinierung von wahrscheinlichen Reaktionen auf eine Therapie bestimmen.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Veranlagung eines Individuums für niedrige oder hohe Knochendichte und/oder der Fähigkeit, auf eine Therapie, die sich auf die Knochendichte bezieht, anzusprechen, bereit, welches das Analysieren von einer oder mehreren Allelvariation(en) in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen des Individuums umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Analyse einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus unter Verwendung eines Endonukleaseverdaus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird vor dem Endonukleaseverdau ein Abschnitt des Vitamin D-Rezeptors unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Endonuklease aus der Gruppe bestehend aus Bsm1, Apa1, EcoRV und Tag1 ausgewählt und ist am meisten bevorzugt Bsm1.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Abschnitt des Vitamin D-Rezeptors amplifiziert unter Verwendung eines Paars von Primern, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus
Unter einem zweiten Aspekt besteht die Erfindung aus einem Primerpaar, welches von der Sequenz des in Tabelle 5 gezeigten VDR-Gens abgeleitet ist, für eine Verwendung bei der Amplifizierung eines Abschnitts des VDR-Gens unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion, wobei der Abschnitt wenigstens eine der Bsm1-, Apal- oder Tag1-Schnittstellen, wie in Tabelle 5 gezeigt, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das Primerpaar:
Die Allelstruktur von anderen trans-wirkenden Faktoren, die bestimmt werden kann, umfasst Östrogen- und Androgenrezeptoren, um das Risiko für Osteoporose und/oder ischämische Herzerkrankung zu bestimmen. Die Allelstruktur des Androgenrezeptors kann auch verwendet werden, um Risiken und die Fähigkeit, auf eine therapeutische Intervention bei Hautkrankheiten anzusprechen, zu bestimmen. Es kann die Allelstruktur des Glucocorticoidrezeptors und des Retinsäurerezeptors bestimmt werden, um das Osteoporoserisiko zu bestimmen. Die Allelstruktur des Mineralocorticoidrezeptors kann bestimmt werden, um das Bluthochdruckrisiko zu bestimmen, und die Allelstruktur von Proto-Onkogenen kann bestimmt werde n, um ein Krebsrisiko zu bestimmen. Gewebespezifische Regulatoren können ebenfalls bestimmt werden, um ein Osteoporose/Krebsrisiko zu bestimmen.
Damit die Natur der Erfindung klarer verstanden werden kann, werden jetzt bevorzugte Formen davon unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben werden, in denen:
1 lumbale BMD-Unterschiede bei Zwillingspaaren gemäß den Vitamin D-Rezeptor-Allelen zeigt.
2 eine Karte des Vitamin D-Rezeptor-Gens von Exon 7 bis zum Beginn der 3'-nicht kodierenden Sequenz von Exon 9 zeigt, welche die Lage von polymorphen Restriktionsenzymstellen, die im Rahmen dieser Untersuchung verwendet wurden, und der durch PCR amplifizierten Fragmente, die verwendet wurden, um die RFLPs zu detektieren, zeigt. Sternchen markieren polymorphe Stellen, während ein Fehlen des Sternchens eine invariante/unveränderliche Stelle anzeigt.
3 zeigt, dass die Knochenmineraldichte bei verschiedenen VDR-Genotypen: weibliche Patienten, unterschiedlich ist. Die Daten zeigen den Populationsmittelwert ± Mittelwert des Standardfehlers. p-werte sind für die paarweisen zweiseitigen Students-t-Tests für die Gruppen.
4 zeigt, dass der genetische Effekt auf die Knochenmasse bei der Lendenwirbelsäule auch bei männlichen Personen ersichtlich ist. Die Symbole sind die gleichen wie für 3.
5 die altersbezogene Regression der Knochenmineraldichte der Lendenwirbelsäule und den Schnittpunkt mit dem Bruch-Schwellenwert gemäß dem Genotyp zeigt.
6 die altersbezogene Regression der Knochenmineraldichte des Oberschenkelhalses und den Schnittpunkt mit dem Bruch-Schwellenwert gemäß dem Genotyp zeigt.
7 Knochendichteunterschiede zwischen Zwillingspaaren in Bezug auf Zygosität und Übereinstimmung (Konkordanz) bezüglich der VDR-Allele zeigt. Die Knochendichte in der Lendenwirbelsäule und des proximalen Oberschenkelknochens wird als der innerhalb des Paars bestehende prozentuale Unterschied der Knochendichte bei MZ- und DZ-Zwillingspaaren und gemäß dem, ob die DZ-Zwillingspaare bezüglich des VDR konkordant (Übereinstimmung aufweisen) oder diskordant (keine Übereinstimmung aufweisen) sind, ausgedrückt. Die DZ-Zwillinge, die hinsichtlich der VDR-Allele konkordant sind, unterscheiden sich an einer jeglichen Stelle nicht signifikant von den MZ-Zwillingen, während die diskordanten DZ-Zwillinge sich an jeder Stelle von beiden dieser Gruppen signifikant unterschieden (ANOVA) Der Unterschied zwischen der gesamten DZ-Gruppe und jenen, die hinsichtlich der VDR-Allele konkordant waren, verglichen mit den MZ-Zwillingen zeigt, dass 75%, 48%, 59% und 90% des genetischen Effekts an der Lendenwirbelsäule, dem Oberschenkelhals, dem Ward-Trigonum bzw. der trochantären Region des proximalen Oberschenkelknochens durch die VDR-Allele erklärt werden können. Der Genotyp für einen anderen entwicklungsrelevanten Transkriptionsaktivator, den Retinsäurerezeptor α (21q7) sagte an keiner Stelle die ∆BMD voraus.

8 zeigt den Unterschied der Knochendichte zwischen dizygoten Zwillingspaaren in Hinblick auf das Ausmaß von Diskordanz (fehlender Übereinstimmung) hinsichtlich des VDR. Der Unterschied der Knochendichte zwischen Zwillingspaaren ist in drei Gruppen graphisch aufge tragen; 0 – vollständige Konkordanz, 1 – ein Allel unterschiedlich, 2 – beide Allele unterschiedlich. Die Felder A, B, C und D zeigen die Analysen für das VDR-Gen in der Lendenwirbelsäule, dem Oberschenkelhals, dem Ward-Trigonum bzw. der trochantären Region. Eine Regressionsanalyse dieses Effekts zeigt signifikante Beziehungen bei der Lendenwirbelsäule (p = 0,0001), dem Ward-Trigonum (p = 0,006) und der trochantären Region (p = 0,034) und einen Grenzfall bei dem Oberschenkelhals (p = 0,055). Unter Verwendung des Geschwisterpaar-Varianz-Ansatzes wurden signifikante Beziehungen zwischen dem zum Quadrat erhobenen Unterschied bei der Knochendichte innerhalb jedes Zwillingspaars (∆²) und Übereinstimmung oder Konkordanz bei den VDR-Gen-Allelen bei der Lendenwirbelsäule, dem Oberschenkelhals und dem Ward-Trigonum und ein Grenzfall bei der trochantären Region des proximalen Oberschenkelknochens beobachtet.

Lendenwirbelsäule Δ²	= 0,015 + 0,038 * Diskordanzausmaß (r = 0,43, p = 0,001)
Oberschenkelhals Δ²	= 0,015 + 0,016 * Diskordanzausmaß (r = 0,29, p= 0,034)
Ward-Trigonum Δ²	= 0,017 + 0,026 * Diskordanzausmaß (r =0,34, p = 0,01)
Trochantäre Region Δ²	= 0,015 + 0,015 * Diskordanzausmaß (r = 0,27, p = 0, 05)

9 zeigt, dass eine höhere Knochenmineraldichte mit dem b-Allel des VDR-Gens assoziiert ist.
A. Lendenwirbelsäule-Knochenmineraldichten von dizygoten Zwillingspaaren, die hinsichtlich Bsm-l-Allelen diskordant sind (n – 22), werden als Zwillinge und Co-Zwillinge gemäß dem Genotyp graphisch aufgetragen. Geraden verbinden Knochenmineraldichte-Werte für ein Zwillingspaar. Bei 21 von 22 Paaren weist der Zwilling, der eine zusätzliche Anwesenheit der Stelle (b)-Allele trägt, die höhere Knochenmasse auf (leere Kreise). Bei einem einzigen Zwillingspaar (ausgefüllte Kreise) liegt die umgekehrte Situation vor.
B. Knochenmineraldichte bei der Lendenwirbelsäule unter nichtverwandten prämenopausalen Frauen gemäß dem VDR-Genotyp. Eine von jedem (aus prämenopausalen Frauen) bestehenden MZ- und DZ-Zwillingspaar wurde zufällig für diese Analyse ausgewählt und die Zahlen von Individuen sind für jede Gruppe gezeigt. Es ist klar, dass der BB-Genotyp eine geringere mittlere BMD an der Lendenwirbelsäule aufweist, während die bb-Gruppe die höhere mittlere BMD aufweist. Die Größe dieses Effekts kann in Beziehung zu der Standardabweichung der Knochendichte bei einer hinsichtlich des Alters übereinstimmenden Population von ungefähr 0,11 g/cm² an jeder Stelle abgeschätzt werden. Der Mittelwert ± Standardfehler ist graphisch aufgetragen und die Signifikanz des Unterschieds zwischen Gruppen wurde durch ANOVA berechnet. Die paarweisen Vergleiche erfolgten durch ungepaarte Student's-Test. Die verschiedenen Gruppen unterschieden sich hinsichtlich Alter, Größe und Gewicht nicht signifikant.
10 zeigt die Ergebnisse einer Calcitriol-Therapie bei Individuen von unterschiedlichem Genotyp.
UNTERSUCHUNG 1
Methoden
Zweihundertachtundachzig Personen, die für epidemiologische Untersuchungen der Knochendichte rekrutiert wurden, wurden in die Studie aufgenommen. Alle Personen wurden aus dem Stadtgebiet von Sydney, Breite 33°52'S, einer Region mit hoher Sonnenlichtinzidenz, rekrutiert. Bei einundneunzig Personen von kaukasischer britischaustralischer Herkunft (Vereinigtes Königreich- und irischer Hintergrund) mit Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Daten für die drei Endonukleasen standen Serum-Osteocalcin-Daten zur Verfügung. Keine der Personen nahm eine Medikation ein, von der bekannt war, dass sie Knochenerkrankungen verursachte oder die Osteocalcinspiegel beeinflusste. Alle Personen waren Kaukasier und wiesen eine normale Nierenfunktion auf, wie anhand des Serum-Kreatinins bestimmt wurde.
Serum wurde am Morgen nach Fasten über Nacht gesammelt und keine der Personen wurde mit Calcitriol vor der Venenpunktion behandelt. Serum- Osteocalcin wurde durch einen im Hause durchgeführten Radioimmunassay basierend auf Kaninchen-anti-Schwein-Osteocalcin (11) bestimmt. Der normale Bereich von Osteocalcin, der mit diesem Assay ermittelt wird, beträgt 3–18 ng/ml, wenn gereinigtes Schweine-Osteocalcin verwendet wird. Osteocalcinbestimmungen erfolgten vor und unabhängig von der RFLP-Analyse und die Ergebnisse wurden in einer kodierten Weise gespeichert.
DNA-Analyse. Die Sonde, die verwendet wurde, um RFLPs zu identifizieren, war ein 2,1 Kilobasenpaar-Fragment der Vitamin D-Rezeptor-cDNA (3,18), welches die gesamte kodierende Region über spannte, dem aber die 3'-untranslatierte Region der mRNA fehlte. Extraktion von DNA aus Blut und Southern-Blotting erfolgten durch Standardmethoden. Restriktionsenzyme wurden von Pharmacia-LKB und New England Biolabs erhalten und gemäß den Angaben der Lieferanten verwendet.
Statistische Methoden. Die relative Assoziation der RFLP-Marker wurde statistisch hinsichtlich einer Abweichung von der Null-Hypothese der freien Assoziation durch Verwendung von Kontingenztabellen und X²-Tests bestimmt. Das „Statview-plus-graphics statistical package" (Abacus Concepts, Berkeley, CA), welches auf einem Macintosh SE/30-Computer lief, wurde für eine Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Der „protected least-significant-difference" (PLSD)-Test von Fisher wurde verwendet, um die Beziehung zwischen RFLP und Serum-Osteocalcin zu bestimmen. Angegebene Signifikanzniveaus sind für die anfänglichen F-Tests auf der Null-Hypothese (kein Unterschied zwischen den Mittelwerten) des Gesamteffekts und für den Sicherheitsgrad des paarweisen Vergleichs der Mittelwerte der stetigen Variable von jeder Kategorie (RFLP)-Klasse.
Jedes RFLP-Markersytem wurde hinsichtlich seiner Assoziation mit Osteocalcin-Serumkonzentrationen separat durch ANOVA berücksichtigt, indem Kategorie-Klassen (RFLPs) mit der stetigen Variablen (Osteocalcin) verglichen wurden. Die Osteocalcin-Werte (ng/ml) waren nicht normal verteilt und so wurde eine nicht-parametrische Analyse wie auch eine logarithmische Transformation als ln(1 + Osteocalcin) ausgeführt.
Ergebnisse
Durch Verwendung der Vitamin D-Rezeptor-cDNA-Sonde wurden zwei häufige RFLPs (detektiert durch BsmI und EcoRV), über die zuvor noch nicht berichtet worden waren, zusätzlich zu einem durch ApaI detektierten RFLP, über den zuvor berichtet worden war (18), gefunden. Die RFLPs wurden als Aa (ApaI), Bb (BsmI) und Ee (EcoRV) kodiert, wobei der große Buchstabe das Fehlen der Stelle bezeichnet und der kleine Buchstaben die Anwesenheit der Stelle bezeichnet. Die Mendelsche Natur der RFLPs wurde durch Familienuntersuchungen verifiziert (Daten nicht gezeigt). Die Häufigkeiten von diesen RFLPs bei 266 keiner Auswahl unterzogenen Freiwilligen, die mit dieser Untersuchung in keinem Zusammenhang standen, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Genotypen von 182 Individuen wurden mit allen drei RFLPs untersucht (Tabelle 2) Sie zeigten ein starkes Ausmaß an Coassoziation, was ein Kopplungs-Ungleichgewicht bei diesem Genort anzeigt. Die RFLPs waren hochgradig assoziiert, so dass AA mit BB und EE mit Häufigkeiten von 83% bzw. 92% gefunden wurden; entsprechend wurde aa mit bb und ee mit Häufigkeiten von 61% bzw. 72% gefunden. Die nachfolgende Funktionsanalyse hängt nicht von der Haplotypisierung ab; jedoch werden nur zwei von möglichen acht Haplotypen benötigt, um 53,2% der Testpopulation auszumachen. Die offensichtlich Homozygoten definieren die häufigsten möglichen Haplotypen als a b e und A B E (Tabelle 2).
TABELLE 1 Häufigkeiten von RFLP-Allelen
TABELLE 2 Häufigkeiten von RFLP-Genotypen
Die Beziehung zwischen RFLPs und Serum-Osteocalcin wurde bei den 91 normalen Patienten mit Serum-Osteocalcin-Daten analysiert (Tabelle 3) Die Verteilung dieser Population in Hinblick auf Alter, Geschlecht und menopausalen Status ist in Tabelle 4 gezeigt. Das Alter stand in keinem signifikanten Zusammenhang mit einem jeglichen RFLP-Genotyp. Die Osteocalcin-Spiegel der Bsm I-BB-Gruppe sind signifikant höher als jene der Bsm I-bb-Gruppe (P = 0,0001). Die anderen RFLPs zeigen den gleichen Effekt mit hochgradig signifkanten P-Werten für das Apa I-Allel-System (AA gegenüber aa, P < 0,0025) und einem schwächeren P-Wert für den EcoRV-RFLP (EE gegenüber ee, P = 0,015). Bei allen drei RFLPs ist das Fehlen von Restriktionsstellen-Allelen (A, B, E) mit hohen Osteocalcin-Spiegeln und die Anwesenheit von Restriktionsstellen-Allelen (b, a bzw. e) mit niedrigen Osteocalcin-Spiegeln assoziiert. BB, 16,8 ng/ml; Bb, 8,9 ng/ml; und bb, 8,8 ng/ml (Medianwerte). Eine nicht-parametrische statistische Analyse (Kruskalwallis) der Osteocalcin-Rohwerte ergab im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie ANOVA: Apa I, P = 0,0016; Bsm I, P = 0,0001; EcoRV, P = 0,0044.
Da die Bsm I- und Apa I-RFLPs diejenigen mit der größten Vorhersagekraft waren, wurde die Population gemäß den neun möglichen Kombinationen von diesen Allelen unterteilt. Dies erzeugte eine klare Aufsplittung der Serum-Osteocalcin-Werte nach dem Genotyp (1). Da die schwächere Assoziation des EcoRV-Markers durch dessen Ungleichgewicht mit den anderen Markern bestimmt werden kann, untersuchten wir die Verteilung von Apa I- und Bsm I-Allelen und Osteocalcin-Werten innerhalb von Individuen mit dem EE-Genotyp (2). Der Bsm I-Marker diktierte im wesentlichen die daraus ableitbaren Haplotypen und deren damit verbundene Osteocalcin-Werte (P = 0,003).
Die Genotyp-Vorhersage von Serum-Osteocalcin-Spiegeln wurde für Bsm I und Apa I aufrechterhalten, wenn männliche Personen (n = 14) ausgeschlossen wurden (Bsm I, P 0,0001; Apa I, P = 0,0034); ANOVA-Werte für den Gesamt-Effekt). Die Menopause ist mit einer Zunahme der Osteocalcin-Werte in Verbindung gebracht worden, wobei eine breite Streuung bei den Osteocalcin-Werten in den frühen postmenopausalen Jahren beobachtet wird (19–21) Dementsprechend wurde die Rolle des menopausalen Status durch eine multiple Regressionsanalyse und eine Covarianzanalyse, umfassend Alter, menopausalen Status und Bsm I-Genotyp bestimmt. Der menopausale Status war eine schwächere Determinante der Serum-Osteocalcin-Konzentrationen als der Bsm I-Polymorphismus (r –0,44, P<0,001) Eine zwei-Faktor-ANOVA ergab das gleiche Ergebnis; Bsm I, P = 0,0002; menopausaler Status, P = 0,24. Ein getrenntes Analysieren von prämenopausalen und postmenopausalen Frauen veränderte die Ergebnisse nicht, und der Genotyp war ein stärkeres Vorhersagewerkzeug als der menopausale Status (1).
UNTERSUCHUNG 2
Materialien und Methoden
Personen
Die Personen waren 535 miteinander nicht verwandte Freiwillige (447 Frauen und 88 Männer), die in Untersuchungen über die Auswirkung der Genetik auf die Knochendichte aufgenommen worden waren. Die Personen wurden aus Auf rufen durch die Medien im Stadtgebiet von Sydney gewonnen. Das mittlere Alter der Personen betrug 51,4 ± 13,8 Jahre (Mittelwert ± Standardabweichung; Bereich 20–84 Jahre) für Frauen und 40,6 ± 16,0 Jahre (20–79 Jahre) für Männer. In dieser Analyse waren die Personen von kaukasisch britisch-australischer Herkunft (Vereinigtes Königreich- und irischer Hintergrund). Der menopausale Status wurde durch das Vorliegen von erhöhtem FSH und LH und niedrigen Östradiolspiegeln mit einem Fehlen von Menses für wenigstens 12 Monate bestätigt. Personen mit einer Vorgeschichte von Knochenerkrankungen, Krankheit, bilateraler Ovarektomie oder Arzneimittelgebrauch (einschließlich Hormonersatztherapie), die den Knochenumsatz und die Knochendichte beeinflussen könnten, wurden aus dieser Untersuchung ausgeschlossen.
Knochenmineral dichte-Analyse
Die Knochenmineraldichte (BMD), ausgedrückt als flächenbezogene Dichte in g/cm², wurde in der Lendenwirbelsäule (L2-4) und dem Oberschenkelhals unter Anwendung von entweder dualer Photonenabsorptionsmessung oder dualer Energie-Röntgenabsorptionsmessung (Lunar DP3 bzw. DEXA, Lunar Radiation NCo., Madison, WI) gemessen, wie zuvor beschrieben (Pocock et al., 1987).
DNA-Analyse: PCR (Polymerasekettenreaktion) und RFLP-Analyse unter Verwendung eines Endonukleaseverdaus
Blut wurde in mit Heparin behandelte Röhrchen gesammelt und Leukozyten durch Sedimentation durch physiologische Kochsalzlösung in einer klinischen Zentrifuge abgetrennt. Gereinigte Leukozyten wurden in Leukozytenlysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, physiologische Kochsalzlösung und 0,5% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat) lysiert. Das Lysat wurde mit Proteinase K (Applied Biosciences, Palo Alto, USA) in einer Konzentration von 50 μg/ml 2 h bei 65°C behandelt. DNA wurde durch wiederholte Phenol-Chloroform-Lösemittelextraktion extrahiert, wie in Maniatis et al. beschrieben und mittels Ethanol ausgefällt vor. DNA wurde in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) erneut gelöst und durch Ultraviolettabsorption bei 260 nm quantifiziert.
Das Vitamin D-Rezeptor-Gen von Exon 7 bis zu der 3'-untranslatierten Region wurde sequenziert. Die Sequenz ist in Tabelle 5 aufgeführt.
Vier Oligonukleotid-Primer wurden synthetisiert, um die 3'-flankierende Region des VDR-Gens zu amplifizieren. Die Detektion der Bsm1-Stelle wurde vereinfacht durch Amplifizieren einer die Stelle überspannenden Region mit einem Primer, welcher seinen Ursprung in Exon 7 hatte ( 5' - CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA - 3') und einem anderen, welcher seinen Ursprung in Intron 8 hatte (5' – AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG - 3'), wodurch ein 825 Basenpaar-Fragment erzeugt wurde. Die Detektion von ApaI- und TagI-Stellen wurden vereinfacht unter Verwendung einer einfachen Amplifizierung unter Verwendung von einem Primer in Intron 8 (5' - CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG - 3') und dem anderen in Exon 9 ( 5' - GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA - 3'), wodurch ein 740 Basenpaar-Fragment erzeugt wurde (2).
TABELLE 5 Sequenzbereich: 1 bis 2169
Der auf dem oberen Strang unterstrichene Primer ist ein vorwärts-Primer, jene auf dem unteren Strang sind Rückwärts-Primer.
Eine jegliche paarweise Kombination von diesen Primern oder von Primern, die auf dieser und umgebender Sequenz basieren, können die Region durch Polymerasekettenreaktion amplifizieren.
Eine PCR wurde ausgeführt in einem Volumen von 20 μl, enthaltend 200 ng genomische DNA, 20 p mol von jedem Primer, 200 μM dNTPs, 50 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8,3) 1,5 mM MgCl₂ und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (TOYOBO, Osaka, Japan). Jede Probe wurde 37 Amplifizierungszyklen unterworfen, wie folgt: Schritt 1 – 3 min bei 94°C, 1 min bei 62°C, 2 min bei 72°C; Schritt 2 bis 6 – 20 s bei 94°C, 20 s bei 62°C, 1 min bei 72°C, Schritt 7 bis 36 – 5 s, 5 s bzw. 30 s. Amplifizierungsschemata sollten für jedes jeweilige thermische Zyklisierungsgerät optimiert werden. Ein 10 μl-Aliquot von jedem PCR-Produkt wurde mit 5 Einheiten Endonuklease Bsm1 bei 65°C (New England Biolabs, MA, USA), Apa1 bei 37°C oder Taq1* (Promega Co., Australien) bei 65°C 1 h verdaut. Ein Klon eines nicht verwandten Gens wurde als interne Kontrolle sowohl für den Bsm1- als auch den Apa1-verdau verwendet. Für den Tag1-Verdau wurde eine invariante/unveränderliche Taq1-Stelle in dem PCR-Produkt selbst als interne Kontrolle verwendet. Die verdauten PCR-Produkte wurden auf 1,2% (Bsm1 und Apa1) oder 2,0% (Taq1) – Agarosegelen, enthaltend 0,5 μg/ml Ethidiumbromid, 0,09 M Tris-Borat und 0,002 M EDTA, pH 8,3, 1 h bei 100 V aufgetrennt. Ein mit EcoRI verdauter SPP1-Marker (Bresatec Limited, Adelaide, Australien) wurde als Größenstandard für alle Agarosegele verwendet. Aufgrund der Sequenz der relevanten Stellen können mehrere andere Restriktionsenzyme verwendet werden, um diese Polymorphismen zu detektieren. Sequenz der Bsm1-Stelle ausgehend von einer invarianten angrenzenden Stu-1-Stelle; B-Allel AGGCCTGCGCATTCCC, b-Allel: unterstrichenes G ist ein A. Diese Sequenzveränderung kann mit Aos1, Fsp1, Mst1, Fdi2, Hinp1, Hha1 und deren Isoschizomeren detektiert werden. Die Sequenz an der polymorphen Apa1-Stelle, welche in einer angrenzenden invarianten Pvu2-Stelle endet, ist: A-Allel GAGGGGCCCAGCTG, in dem α-Allel ist das unterstrichene G ein T. Die Anwesenheit des G kann durch Bang, Aoc2, Pss1, Pal1, Hae3, Cfr3I, Asu1, Sau96I, Eco0109I, Dra2 und Isoschizomere detektiert werden. Die Anwesenheit des T erzeugt einen Polymorphismus für Ban1 und dessen Isoschizomere. Die Sequenz des Taq1-Polymorphismus, welcher invariante Hba1- bis Hae3-Stellen überspannt, ist: T-Allel GCGCTGATTGAGGCC, in dem t-Allel ist das unterstrichene T ein C. Dieser Polymorphismus kann auch durch Mbol, Sau3A, Dpn1 und deren Isoschizomere detektiert werden.
Tag1*-RFLP: Wir haben zuvor darüber berichtet, dass Bsm1- und Apa1-RFLPs in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen Serum-Osteocalcin-Spiegel vorhersagen. Diese polymorphen Stellen befinden sich in der Region von genomischer DNA von Exon 7 bis zu der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR) Um die Unterschiede zwischen zwei üblichen Vitamin D-Rezeptor-Gen-Allelen (AB und ab) zu charakterisieren, haben wir diese Region in homozygoten Personen bezüglich der Genotypen AABB, aabb sequenziert. Wir haben eine Anzahl von Sequenzunterschieden einschließlich 15 nicht-kodierender Veränderungen identifiziert. Es gibt eine einzige synonyme Veränderung in der kodierenden Region, ein T für C in einem Isoleucin-Codon (ATT zu ATC, Isoleucin-Codons) in Exon 9.
Statistische Analyse
Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde ausgeführt unter Verwendung des „Statview+Graphics statistical package" (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) auf einem Macintosh SE/30-Computer. Der „protected leastsignificant-difference" (PLSD)-Test von Fisher wurde verwendet, um die Beziehung zwischen RFLP und der BMD, der Größe und dem Gewicht zu bestimmen. Angegebene Signifikanzniveaus sind für die anfänglichen F-Tests auf der Null-Hypothese (kein Unterschied zwischen den Mittelwerten) des Gesamteffekts und für den Sicherheitsgrad des paarweisen Vergleichs der Mittelwerte der stetigen Variable von jeder Kategorie (RFLP)-Klasse. Der Student's-Test wurde für paarweise vergleiche verwendet. Beziehungen von stetigen und kategorischen Variablen wurden durch eine multiple Regression ermittelt. Beziehungen zwischen RFLP-Markern wurden durch Kontingenztabellen und Chi-Quadrat ermittelt.
Ergebnisse
Die Häufigkeiten von diesen drei RFLPs bei 535 Personen sind in Tabelle 6 gezeigt. Die RFLPs wurden als Bb (Bsm1), Aa (Apa1) und Tt (Taq1) kodiert, wobei der große Buchstabe das Fehlen der Stelle bezeichnet und der kleine Buchstabe die Anwesenheit der Stelle bezeichnet. Die Häufigkeiten der Bsm1- und Apa1-RFLPs sind ähnlich zu jenen, die oben (Tabelle 1) erläutert wurden. RFLPs hatten ein hohes Ausmaß an Coassoziierung (Tabelle 7) Der AA-Genotyp ist hochgradig mit BB
Tabelle 6 Häufigkeiten von RFLPs in der untersuchten Population
Tabelle 7
RFLP-Marker weisen ein hohes Ausmaß von Coassoziierung auf.
Bsm-1-Genotype n tabellarisch mit Apa-1- und Tag1-Genotypen aufgelistet. n bezieht sich auf die Anzahl von Individuen. Der Chi²-Wert und der p-Wert reflektieren die Zurückweisung der Null-Hypothese von keiner Assoziation zwischen den Markern.
Tabelle 8 Populationsmerkmale der untersuchten Gruppe

Geschlecht Anzahl

Männliche Personen 88

Weibliche Personen 447

Prämenopausal 185

Postmenopausal 262

Mittlere Jahre seit Menopause ± Standardfehler des Mittelwerts 11,3 ± 0,07
Mittelwerte von anthropomorphen Parametern bei den gesamten Personen (± Standardfehler des Mittelwerts)

Alter (Jahre) 49,6 ± 0,6

Größe (cm) 163,8 ± 0,4

Gewicht (kg) 64,8 ± 0,5
Tabelle 9 Mittelwerte von anthropomorphen Parametern gemäß dem Bsm-1-Genotyp
Anmerkungen: n bezieht sich auf die Anzahl, p ist der Wert für den Gesamteffekt des Genotyps hinsichtlich der untersuchten Variable, abgeleitet aus ANOVA. Alle p-Werte geben keine signifikanten Unterschiede bei den Mittelwerten zwischen verschiedenen Genotypen an, und tt mit Häufigkeiten von 97,7 bzw. 95,3 assoziiert; dementsprechend wurde aa mit bb und TT mit Häufigkeiten von 61,6 bzw. 65,3% gefunden. Bei Vergleich des Bsm1- mit dem Tag1-RFLP sind tt, Tt- und TT-Genotypen hochgradig mit BB, Bb und bb mit Häufigkeiten von 95,5, 95,1 bzw. 96,4% assoziiert. Da die Bsm1- und Taq1-Ergebnisse so eng korreliert sind, haben wir in den nachfolgenden Diskussionen Bsm1- und Tag1-Ergebnisse gleich gesetzt und werden nur auf Bsm1-Ergebnisse verweisen.
Die Beziehung zwischen RFLPs und der BMD (Knochenmineraldichte) sowohl bei den LS (Lendenwirbelsäulen)- als auch den FN (Oberschenkelhals)-Stellen wurden in den 535-Patienten analysiert. Die Verteilung dieser Population in Hinblick auf Alter, Größe, Gewicht und menopausalen Status ist in Tabelle 8 gezeigt. Alter, Größe und Gewicht standen in keinem signifikanten Zusammenhang mit irgendeinem RFLP-Genotyp (Tabelle 9). Bei Frauen ist die mittlere LS-BMD der BB- und AA-Gruppe um 9,9% (1.017 gegenüber 1.118) und 8,6% (1.049 gegenüber 1.139) niedriger als jene der bb- bzw. aa-Gruppen. Die FN-BMD der BB- und AA-Gruppen sind ebenfalls um 5,6% bzw. 5,3% niedriger als jene der bb- bzw. aa-Gruppen. Ein heterozygoter Effekt, welcher eine Codominanz von Allelen anzeigt, wurde ebenfalls beobachtet (3). Niedrigere LS- und FN-BMD wurden mit der Abwesenheit von beiden Restriktionsstellen-Allelen (BA) assoziiert. Die Unterschiede der mittleren BMD bei der LS (Lendenwirbelsäule) und dem FN (Oberschenkelhals) zwischen dem BBAA-Genotyp und dem bbaa-Genotyp waren höher (13,4 bzw. 7,8%) als jene von BB und bb oder AA und aa (Tabelle 9).
Der Genotyp-Effekt wurde durch eine multiple Regressions-Covarianzanalyse, umfassend Alter (Jahre), menopausalen Status (Jahre nach der Menopause; JNM), Größe (cm), Gewicht (kg) und Bsm1-Genotyp (BB=1, Bb=2, bb=3) bei Frauen bestimmt, was die Gleichung ergab: LS BMD (g/cm²) = 0, 419 + 0, 054 Bsm1-Genotyp – 0, 004 Alter – 0, 994 JNM + 0, 02 Gewicht + 0,004 Größe (n = 425) r = 0,58 R² = 0,34,
FN BMD (g/cm2) = 0,456 + 0,025 Bsm1-Genotyp – 0,004 Alter – 0,004 JNM + 0,04 Gewicht + 0,02 Größe (n = 425) 4 = 0,68, R2 = 0,47
Sowohl Ledenwirbelsäulen- als auch Oberschenkelhals-BMD waren negativ und unabhängig mit dem menopausalen Status korreliert, das Alter, Bsm1-RFP war auch unabhängig mit der BMD bei der LS und dem F bei Frauen korreliert. Die Ergebnisse für die Männer waren, wie folgt: LS BMD (g/cm2) = 1,039 + 0,058 Bsm1-Genotyp (n = 85)r = 0,22 RS = 0,05, p = 0,038, F-Score 4,9 FN BMD (g/cm2) = 1,046 – 0,003 Alter (n = 85)r = 0,/32 R2 0,10, p = 0,017, F-Score 5,9
Schnittpunkt mit dem Bruch-Schwellenwert
Ein Wert der Lendenwirbelsäulen-BMD, unterhalb von welchem ein erhöhtes Risiko für einen Osteoporose-bedingten Bruch besteht, wurde aus einer großen Querschnittsuntersuchung in der Stadt Dubbo, Australien, abgeleitet. Dieser wert 0,97 g.cm² ist ähnlich zu einem Bruch-Schwellenwert, der ausgehend von einer amerikanischen Population beschrieben worden ist. Wenn der VDR-Genotyp die BMD und nachfolgend die Anfälligkeit gegenüber Osteoporose beeinflusst, sollte ein Unterschied bei dem Schnittpunkt der mit dem Alter in Zusammenhang stehenden Veränderung der Knochenmasse und dem Bruch-Schwellenwert zwischen Genotypen klar ersichtlich sein. 5 zeigt einfache mit dem Alter in Zusammenhang stehende Regressionsgeraden für die weibliche LS-BMD von BB-, Bb- und bb-Genotypen, die den Bruch-Schwellenwert schneiden. Ein vergleich zwischen BB und bb enthüllt einen 10 Jahre-Unterschied bei dem Schnittpunkt (60,3 Jahre gegenüber 71,1 Jahre) mit einem dazwischenliegen den Wert für die Bb-Heterozygoten (68,1 Jahre). Ein ähnliches Ergebnis war für den Oberschenkelhals ersichtlich (6) unter Verwendung eines Bruch-Schwellenwerts von 0,7 g/cm² (BB, 66 Jahre; Bb, 70 Jahre; bb, 74 Jahre).
UNTERSUCHUNG 3
Der Effekt der üblichen VDR-Gen-Allele auf die Knochendichte wurde unter Verwendung des Zwillingsmodells untersucht, in welchem innerhalb eines Paars erfolgende Vergleiche Verzerrungen verursachende, mit dem Alter und in verschiedener Hinsicht mit Kohorten verbundene Elemente beseitigen. 250 kaukasische Zwillinge wurden untersucht, welche 70 MZ- und 55 DZ-Zwillingspaare, einschließlich 7 männlicher MZ-Paare und 6 männlicher DZ-Paare, im Alter zwischen 17 und 70 Jahren umfassten; MZ 45 ± 13 Jahre und DZ 44 ± 11 Jahre, Mittelwert ± Standardabweichung. Die Knochendichte wurde an der Lendenwirbelsäule und dem proximalen Oberschenkelknochen mit einem dualen Lunar-DP3-Photonenabsorptionsmessgerät (LUNAR Corporation, Madison, WI) oder einem dualen Lunar-DEXA-Energie-Röntgenstrahlabsorptionsmessgerät gemessen, wie zuvor beschrieben (Pocock et al., 1987). Alle weiblichen Zwillingspaare waren konkordant hinsichtlich des menopausalen Status und, sofern sie postmenopausal waren, hinsichtlich der Jahre seit der Menopause.
Das VDR-Gen wurde in der Region, welche die polymorphen Stellen für die Bsm-1-, Apa-1- und EcoRV-Stellen, von denen zuvor gezeigt worden ist, dass sie Unterschiede bei Knochenumsatzmarkern vorhersagen, trägt, sequenziert. Diese Stellen befinden sich in der Region des Gens von Exon 7 bis zu der 3'-UTR. Keine der polymorphen Stellen befand sich in d er kodierenden Region oder umfasste potentielle Spleißstellen und es wurde festgestellt, dass die hochgradig informative Bsm-1-Stelle aus einer G-gegen-A-Substitution in Intron 8 resultierte. Es gab nur einen Unterschied in der kodierenden Region zwischen den beiden häufigsten Allelformen. Dieser umfasste eine T-gegen-C-Substitution in Exon 9, wodurch ATT zu ATC verändert wurde, ohne dass die kodierte Aminosäuresequenz (Isoleucin) geändert wurde. Die die Bsm-1-Stelle flankierende DNA-Sequenz wurde in einem auf Polymerasekettenreaktion basierenden Verfahren verwendet, um ein 2,1–2,2 kb-Fragment von Exon 7 bis Exon 9 zu amplifizieren, um die Genotypisierung von Patienten zu vereinfachen. Eine PCR-Amplifizierung von Leukozyten-DNA wurde mit einem Corbett-FTS-1-Thermal Sequencer (Corbett Research, Mortlake NSW, Australien) -PCR-Instrument unter Verwendung der Primer
vor einem Endonukleaseverdau mit Bsm-1 (New England Biolabs Inc., Gene Search, Brisbane, Australien) ausgeführt. Die Anwesenheit der Bsm-1-Stelle schneidet ein 825 bp-Produkt zu 650 bp- und 175 bp-Fragmenten. Ein 4,7 kb-Plasmid mit einer einzelnen Bsm-1-Stelle, welche im Rahmen eines Bsm-1-Verdaus zur Linearisierung führt, wurde als interne Kontrolle verwendet, um eine fehlerhafte Zuordnung der Allelformen aufgrund von partiellen Verdauen zu vermeiden.
Aus Zwillingsuntersuchungen wurde der innerhalb eines Paars bestehende Unterschied bei der BMD (∆BMD%) an der Lendenwirbelsäule und dem proximalen Oberschenkelknochen in Bezug auf Allelvariationen bei DZ-Zwillingspaare n untersucht (7) In beiden Regionen war dieser signifikant geringer bei konkordanten DZ-Zwillingen verglichen mit jenen, die hinsichtlich der VDR-Gen-Allele diskordant waren. Die ∆BMD% für die Lendenwirbelsäule bei den MZ-Zwillingen unterschied sich nicht signifikant von jener bei den DZ-Zwillingen, die hinsichtlich der VDR-Allele konkordant waren, von denen sich beide statistisch von jenen bei DZ-Zwillingen, die hinsichtlich der Allele diskordant waren, unterschieden (p < 0,0001). Ähnliche, aber schwächere Effekte in dem proximalen Oberschenkelknochen sind konsistent mit stärkeren Umwelteinflüssen auf die Knochendichte in dieser Region. Eine Eingrenzung der Analyse auf prämenopausale Zwillinge veränderte die Ergebnisse nicht. Bei einer Kontrolle hinsichtlich poten tieller Verzerrungen durch anthropomorphe Merkmale von Größe und Gewicht blieb der VDR-Genotyp das stärkste Vorhersageinstrument bei der Lendenwirbelsäule (p = 0,0002) und der trochantären Region (p=0,02), obwohl nicht an der Halsregion des proximalen Oberschenkelknochens. Angesichts des zuvor gezeigten co-dominanten Effekts von Bsm-1-Allelen auf die Knochenumsatzindizes würden wir einen co-dominanten Effekt auf das Knochenmassemerkmal mit einer linearen Beziehung zwischen dem Ausmaß des Unterschiedes beim Genotyp und dem Unterschied bei dem Merkmal innerhalb von Zwillingspaaren erwarten (8) Gemäß dem Geschwisterpaar-Kopplungsanalysen-Ansatz zeigt eine signifikante Korrelation zwischen dem zum Quadrat erhobenen Unterschied bei einem Merkmal und dem Anteil von identischen Genen innerhalb eines Geschwisterpaars eine genetische Kopplung an. Anhand von dieser Analyse waren die VDR-Gen-Allele co-dominant bei der Lendenwirbelsäule und an den meisten Stellen des proximalen Oberschenkelknochens. Ein vergleich der ∆BMD% bezüglich des Konkordanzausmaßes für VDR-Allele zeigte 1,5- bis 2,5-fach größere innerhalb eines Paars auftretende Unterschiede für die diskordanten Zwillinge (siehe 7 und 8). Bei 21 von 22 dizygoten Zwillingspaaren, die hinsichtlich der VDR-Allele diskordant waren, war das b-Allel mit höherer Knochendichte assoziiert (9A). Bei prämenopausalen Frauen (aus MZ- und DZ-Zwillingspaare n zufällig als Singleton ausgewählt) war der VDR-bb-Genotyp ebenfalls mit höherer Knochendichte assoziiert (9B), während der BB-Genotyp mit niedrigerer Knochenmasse assoziiert war mit einem klaren co-dominanten Effekt zwischen den Allelen (9B).
Diese Daten zeigen, dass die Unterschiede von VDR-Gen-Allelen einen hauptsächlichen Anteil der Unterschiede bei der Knochendichte in einer Population von normalen Individuen anzeigen. Die BB-, AA-, EE- und/oder tt-VDR-Genotypen sind mit niedriger BMD sowohl bei Frauen als auch Männern assoziiert. Die VDR-Gen-RFLP-Genotypen sind dementsprechend nützliche Vorhersageinstrumente betreffend die Neigung zu hohem Knochenumsatz und geringer Knochenmasse, physiologischer Variabiliät nicht nur bei der Spitzenknochenmasse, sondern auch bei der Knochenmasse im späteren Leben sowohl bei Frauen als auch Männern.
Bis jetzt sind die Mechanismen der genetischen Effekte auf die Knochendichte unklar gewesen. 1,25-Dihydroxyvitamin D ist jedoch ein Verstärker der Osteocalcin-Synthese durch das Vitamin D-responsive Element in dem Promotor des VDR-Gens (Morrison 1989, Science) Die Erfinder haben auch gezeigt, dass übliche Allelvarianten des VDR-Gens mit Unterschieden bei den Serum-Osteocalcin-Spiegeln assoziiert sind. Darüber hinaus sagen diese Allelvarianten des VDR-Gens den Unterschied bei der Knochendichte zwischen dizygoten Zwillingspaaren voraus.
Es wird geschlossen, dass diese VDR-Gen-RFLPs Marker für die physiologische Variabilität bei der Knochenmasse sowohl bei Frauen als auch Männern sind. Die Erfinder haben herausgefunden, dass der Bsm 1-RFLP unabhängig mit der BMD bei der LS (Lendenwirbelsäule) und dem FN (Oberschenkelhals) korrelierte.
Tabelle 10. Alter und Jahre seit der Menopause (JNM) unter Zwillingen. A, jene DZ-Zwillinge, die bezüglich VDR-Gen-Allelen konkordant und diskordant sind; B, Individuen mit unterschiedlichen Allelen für das VDR-Gen. Alle Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung ausgedrückt.
A
B
Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass der homozygote BBAA- oder AAtt-Genotyp mit niedriger Knochendichte assoziiert sind und die mittlere BMD an der LS- und FN-Stelle bei BBAA-Homozygoten ungefähr 12% und 8% niedriger war verglichen mit dem bbaa-Genotyp bei sowohl Frauen als auch Männern. Diese Genotyp-Unterschiede sind wichtig für das spätere Leben, da diese Unterschiede der BMD eine 10 Jahre-Differenz bei dem Bruch-Schwellenwert anzeigen. Diese Allelunterschiede stellen einen Mechanismus für den genetischen Effekt auf die Knochenmasse, der in Zwillingsuntersuchungen beobachtet wird, bereit und ermöglichen einen einfachen genetischen Test des Trägerstatus hinsichtlich niedrige Knochenmasse-Allelen. Die Identifizierung des Vitamin D-Rezeptor-Genotyps als eine wichtige Determinante der Knochenmasse kann neue Wege für die Prävention und Therapie für Osteoporose eröffnen.
Nachweis von Unterschieden bei dem Ansprechen auf eine Behandlung bei unterschiedlichen Genotypen.
Die oben beschriebenen Daten haben gezeigt, dass die oben beschriebenen VDR-Allele funktional unterschiedlich sind. Es würde dementsprechend erwartet werden, dass Individuen mit unterschiedlichem Genotyp unterschiedliche Reaktionen auf eine Behandlung mit Calcitriol und/oder analogen Substanzen zeigen würden. Dies wurde bestätigt durch die Untersuchung von Reaktionen auf eine Calcitriolverabreichung bei 10 normalen jungen Frauen von jedem homozygoten Bsm 1-Genotyp (BB und bb) und durch Analysieren der Reaktionen auf die Behandlung bei drei Markern des Knochen-Calcium-Stoffwechsels, Osteocalcin, Parathormon und Calcium im Urin (siehe 10).
Bei den BB- und bb-Gruppen waren die Osteocalcin-Serumspiegel (p(0,01) bei der Grundlinie unterschiedlich. Der BB-Genotyp hatte wiederum den höheren Osteocalcin-Spiegel. Nach einer Calcitriolbehandlung zeigte die bb-Gruppe eine prozentual stärkere Reaktion oder ein prozentual stärkeres Ansprechen ausgehend von der Grundlinie als die BB-Gruppe. Obwohl die BB-Gruppe eine geringere prozentuale Reak tion zeigte, da sie ein höheres Grundlinien-Osteocalcin aufwies, war die gesamte Reakion höher.
Parathormon wird bekanntermaßen durch Calcitriol reprimiert, jedoch unterschied sich das Ausmaß der Repression durch eine Calcitriol-Behandlung bei den beiden Genotypgruppen signifikant. Parathormon wurde in der BB-Gruppe schwach reprimiert und in der bb-Gruppe stark reprimiert, was substantielle Unterschiede bei der Reaktion von PTH auf eine Calcitriol-Therapie anzeigt. Die gesamte Calciumauscheidung mit dem Urin über den Behandlungszeitraum (Fläche unter der Kurve) war in der BB-Gruppe signifikant höher als in der bb-Gruppe, was unterschiedliche Calcium-Handhabungsreaktionen je nach Genotyp anzeigt. Die verringerte Repression von Parathormon angesichts einer Calcitriol-Behandlung, gekoppelt mit einer erhöhten Calciumausscheidung mit dem Urin zeigt unterschiedliche Calcium-Homöostase-Mechanismen an, die mit einer Mobilisation von Calcium aus dem Skelett verträglich sind.
VDR und andere Zustände/Leiden
Der Vitamin D-Rezeptor und das endokrine Vitamin D-System sind an mehreren anderen pathologischen und physiologischen Zuständen beteiligt. Solche Unterschiede in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen, die zu unterschiedlichen Reaktionen auf endogenes Calcitriol, exogenes Calcitriol und eine Therapie unter Verwendung von Vitamin D-Analoga führen, werden auch zu Unterschieden beim Fortschreiten anderer Erkrankungen, wo eine signifikante Komponente der Regulation durch Calcitriol bewirkt wird, und der Empfindlichkeit gegenüber solchen anderen Erkrankungen führen. Bekannte Beispiele von Zuständen und Erkrankungen, wo durch das endokrine Vitamin D-System und den VDR vermittelte Ereignisse auf treten, umfassen die Replikation des AIDS-Virus (HIV-1) die Proliferation von Brustkrebszellen, die Vermehrung von Kolonkrebszellen, die Keratinozytendifferenzierung, die Replikation und Funktion von Psoriasiszellen, Spermatogenese, Melanome und andere Tumore.
Als ein Ergebnis der hier beschriebenen Erfindung ist dementsprechend offensichtlich, dass funktional unterschiedliche Allele des VDR die Anfälligkeit für, das Fortschreiten, die Prognose und die therapeutische Wirksamkeit von verschiedenen Behandlungen bei solchen Erkrankungen und Zuständen, wo der Vitamin D-Rezeptor und das endokrine Vitamin D-System bekanntermaßen Aspekte des Krankheitsprozesses regulieren, beeinflussen könnten. Obwohl es Beispiele von physiologischen und Krankheitsprozessen gibt, die durch das endokrine Vitamin D-System beeinflusst werden, schließt dies in keiner Weise andere Prozesse, die durch das endokrine Vitamin D-System beeinflusst werden, aus. Angesichts der hier beschriebenen Daten ist offensichtlich, dass alle physiologischen und Krankheitsprozesse, die bekanntermaßen durch das endokrine Vitamin D-System beeinflusst werden, wie in einer neureren verständlichen zusammenfassenden Übersicht von Walters, M. („Newly identified actions of the Vitamin D endocrine system", Endocrine reviews, 13:719-764) und Veröffentlichungen, auf die darin Bezug genommen wird, beschrieben wird, bestimmt und untersucht werden könnten auf die hier beschriebene Weise und dass diese durch den Vitamin D-Rezeptor-Genotyp beeinflusst werden könnten, und dementsprechend wird der Genotyp eines Individuums von Bedeutung für die Prognose, das Fortschreiten, die Anfälligkeit für und die Behandlung von allen Zuständen und Erkrankungen, an denen der Vitamin D-Rezeptor und das endokrine Vitamin D-System beteiligt sind, sein.
Unabhängig von dem physiologischen Mechanismus haben diese Daten erstmals ein Gen identifiziert, das an der Regulation der Knochendichte beteiligt ist. Wichtig ist, dass die Größe des Effekts so ist, dass er einen großen Teil des starken genetischen Effekts auf die Knochendichte und tatsächlich mehr als die Hälfte der Variation bei der Knochendichte in der bereinigten Bevölkerung erklärt. Diese Erkenntnisse, die frühere Interventionen bei jenen mit einem erhöhten Osteoporoserisiko ermöglichen werden, liefern wichtige Einblicke in den Mechanismus der breiten Streuung bei der Knochendichte in der Bevölkerung und öffnen den Weg für die Entwicklung v an neuen, spezifisch zielgerichtet erfolgenden Therapien. Dieses einzelne Gen mit pleiotropen Transkriptions-bezogenen Aktivitäten ist ein Modell für viele pathophysiologische Prozesse, von denen zuvor angenommen worden war, dass sie einer komplexen multifaktoriellen genetischen Regulation unterliegen.
Diese Untersuchung beschreibt eine funktionale Definition von natürlich vorkommen den Allelen eines trans-wirkenden transkriptionellen Aktivators durch Korrelation mit dem Produkt eines Zielgens. Die Daten zeigen auch, dass die Rezeptor-Allelunterschie de auch mit bedeutenden Unterschieden in einem Zielorgan – d.h. der Knochendichte, in Zusammenhang stehen. Diese Methode der genetischen Analyse stellt ein Paradigma für die Untersuchung der funktionalen Bedeutung von natürlichen Allelvariationen innerhalb der Gene der Liganden-aktivierten Rezeptor-Superfamilie dar, das substantiell zu einem vollständigeren Verständnis des endokrinen Steroidhormon-Systems beitragen kann. Es ist auch anwendbar auf die Gene für trans-wirkende Regulatoren aller Art.
Genotypvariationen bei transkriptionellen Regulatoren von Genen, die regulatorische und/oder Strukturproteine kodieren, determinieren physiologische Sollwerte und eine Veranlagung für pathophysiologische Zustände mit Auswirkungen auf die Anfälligkeit für Krankheit und für die Bestimmung von wahrscheinlichen Reaktionen auf eine Therapie. Diese Genotypvarianten sind ein allgemeines Modell für eine Verwendung bei der Bestimmung von Krankheitsrisiken und für die Wahl der Therapie im Rahmen von Verhütung und Behandlung.
Als ein spezielles Beispiel dieses Modells determinieren Allelvarianten in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen Knochenmasse und Empfindlichkeit gegenüber Umweltfaktoren. Als solche sind diese Varianten Marker des Risikos, Osteoporose zu entwickeln, und zeigen wahrscheinliche Reaktionen auf verschiedene Modalitäten einer Therapie an.
Die Erfinder haben RFLP-Marker identifiziert, die funktional unterschiedliche Vitamin D-Rezeptor-Allele definieren. Die hier beschriebenen RFLPs sind körperliche Marker, die mit genetischen Phänomenen gekoppelt sind. Die Erfinder weisen darauf hin, dass es jetzt offen sichtlich ist, dass ein(e) jegliche(r) andere(r) RFLP, physischer Marker, polymorphe Sequenz oder genetischer Effekt, der bzw. die in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen oder flankierender DNA, die mit den gegenwärtig definierten Markern verknüpft ist, nachweisbar ist, den gleichen Informationsgehalt wie die hier beschriebenen Marker liefern könnte abhängig von dem Kopplungs- oder Verknüpfungsausmaß zwischen den hier definierten Markern und einem jeglichen anderen derartigen Marker, bestehend aus RFLP, physischem Marker, polymorpher Sequenz oder genetischem Effekt.
Die vorliegenden Ausführungsformen sollen dementsprechend in jeglicher Hinsicht als der Veranschaulichung dienend und nicht einschränkend aufgefasst werden.
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Claims

Verfahren zur Bestimmung der Veranlagung eines Individuums für niedrige oder hohe Knochendichte und/oder der Fähigkeit, auf eine Therapie, die sich auf die Knochendichte bezieht, anzusprechen, umfassend das Analysieren von einer oder mehreren Allelvariation(en) in dem Vitamin D-Rezeptor-Gen des Individuums.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analyse einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus unter Verwendung eines Endonukleaseverdaus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei vor dem Endonukleaseverdau ein Abschnitt des Vitamin D-Rezeptor-Gens unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Endonuklease aus der Gruppe bestehend aus BsmI, ApaI, EcoRV, TagI und Isoschizomeren davon ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Restriktionsendonuklease BsmI ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Abschnitt des Vitamin D-Rezeptor-Gens amplifiziert wird unter Verwendung eines Paars von Primern, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, in welchem der analysierte Abschnitt des Vitamin D-Rezeptor-Gens einen variablen Abschnitt des Vitamin D-Rezeptors oder Genregionen in Ver bindung mit wenigstens einer der BsmI-, ApaI-, EcoRV- und TagI-Schnittstellen repräsentiert.
Primerpaar, welches von der Sequenz des VDR-Gens abgeleitet ist, für eine Verwendung bei der Amplifizierung eines Abschnitts des VDR-Gens unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion, wobei das Primerpaar:
ist.