JP3465903B2 - 作動因子における対立遺伝子の変動の評価 - Google Patents

作動因子における対立遺伝子の変動の評価

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明は、有害な病的変化を蒙る危険のある個人の同
定手段としての、作動因子における対立遺伝子の変動の
同定方法に関する。本発明の方法は、特にビタミンＤ受
容体遺伝子における対立遺伝子の変動の評価と、それに
よる骨密度を低下または上昇させる病的素質の予知に有
効である。更に、これらの変動は、異なる治療方法に対
する応答の予知とともに、長期にわたる骨粗鬆症の危険
性の予知にも適用可能である。また、他の転写因子の遺
伝子の変動による病理学的または生理学的変異に対する
病的素質の決定または対抗のモデルとしても影響し、そ
の結果、病気の危険性、および治療に対する応答の有す
る危険性が予知される。このような転写の制御因子は、
ステロイド／レチノイド／チロイドホルモン受容体の遺
伝子群のような、リガンドで活性化された遺伝子の制御
因子であってもよいが、それに限定されるものではな
い。
発明の背景 ビタミンＤは、多くの組織中における細胞の分化、お
よび複製という機能とともに、骨、およびカルシウム代
謝の有力な制御因子としての機能を有する。ビタミンＤ
は、高度に特異的なビタミンＤ受容体（１）を介して、
ジヒドロキシ化された代謝産物（1,25−ジヒドロキシビ
タミンＤ、またはカルシトリオール）として作用する。
また、標的となる遺伝子の発現の制御におけるカルシト
リオールの作用には、ここで作動する転写活性因子のタ
ンパクが介在している。ビタミンＤ受容体遺伝子のクロ
ーニングは、それが、チロイドホルモン、およびビタミ
ンＡ派生物（4,5）はもちろん、ステロイドホルモン
（糖質コルチコイド、プロゲステロン、エストロゲン、
アンドロゲン、および鉱質コルチコイド）の受容体や、
多くの自然な生理学的かつ進化的な過程の制御因子を含
む、リガンドで活性化された受容体の上科の一部である
ことを示している。遺伝子の発現に対するこれら受容体
タンパクの介在機構は、多くの研究の対象となってい
る。受容体の機能を低下させ、ヒトや動物の主要な機能
に混乱を生じさせるような、まれに起こる明かな変異に
ついては、既に確認されている。例えば、ビタミンＤ受
容体遺伝子の変異はビタミンＤ抵抗性のくる病を引き起
こし（６）、アンドロゲン受容体遺伝子の変異は、アン
ドロゲンにおける感受性の欠如を引き起こす（７）こと
が報じられている。また、エストロゲン受容体遺伝子で
は、まれに自然発生する多型性が、自発的流産の多くに
関連している（８）。しかしながら、分子レベルの情報
が豊富であるにもかかわらず、受容体遺伝子における自
然な対立遺伝子の変動が通常の生理状態または病的状態
におけるステロイドホルモンへの反応の多様性に対して
およぼす潜在的な寄与については殆ど知られていない。
骨粗鬆症は、多大な治療費と、長時間にわたり影響す
る衰弱とを伴い、殆どの西欧諸国の年配者の間で、健康
上の主要な問題のひとつとなっている（Riggs MEJM）。
発病した骨粗鬆症の治療はおよそ満足ゆくものではない
ため、予防が最善の策となっている。骨粗鬆症の予防
は、成人初期における骨密度最大値の増加と、関連する
年齢、および閉経後における骨の損失を最小に抑える点
とが中心となっている。双子および家族に対する研究か
ら得られた証拠は、骨密度最大値には強い遺伝的影響が
あり、かつそれが、ホルモン的因子、栄養、および生活
習慣により改良可能であることを示している（Kelly
ら、11）。また、双子に関する研究では、軸方向または
付随的な骨の密度は、一卵性双生児の方が二卵性双生児
よりもはるかによく一致していた。これらの研究の結
果、骨密度の変動のうち全体の約75％が遺伝的要因によ
るものと計上され、かつこれについては、母娘による研
究で確認された。本発明者らは、双子をモデルとして、
この遺伝的影響の潜在的な機構について分析し、この遺
伝的影響が、骨の形成の指標であるオステオカルシン
（osteocalcin）のような、骨の転移の生化学的指標と
して確実に現れることを見いだした。更に、二卵生双生
児では、オステオカルシン量の高さが骨密度の低さと関
連していた。本発明者らはまた、この遺伝的影響が、例
えばプロコラーゲンＩ型のＣ末端のプロペプチドのよう
な、骨の形成に関する他の指標と同程度に観察可能で、
かつ例えばプロコラーゲンＩ型のＣ末端のテロペプチド
のような、骨の崩壊に関する他の指標よりも弱く観察可
能であることを見いだした。通常、骨の形成と崩壊とは
密接に連関し、あるいは、双子における骨の転移の生理
学的過程は、互いに「対」となっている。双子における
この多少驚くべき結果は、骨の転移の指標としての骨の
形成の指標から骨密度が予知され、かつ骨の転移の遺伝
的制御が、骨密度に強い遺伝的影響をおよぼす経路であ
ることを示している。双子における骨密度の代表的デー
タは、一つ遺伝子または遺伝子群が、骨密度の遺伝的影
響に対応し得ることを示唆している。しかしながら、こ
の影響が如何に媒介されるか、また、どの遺伝子または
遺伝子群が骨密度に影響するかは明かではない。本発明
者らは、制限されたある長さの断片の多型性を用いた最
近の研究において、ビタミンＤ受容体（VDR）のオステ
オカルシンを示す座位における通常の対立遺伝子の変動
が、年齢、性別、または閉経の有無と独立していること
を明かにした。活性を有するホルモンとしてのビタミン
Ｄ（1,25ジヒドロキシビタミンＤ）に対するビタミンＤ
受容体遺伝子は、骨ならびに腸のカルシウム吸収、骨の
形成、骨再吸収細胞（オステロクラスト）の補充、およ
び骨自体の吸収等のカルシウム代謝はもちろん、パラチ
ロイドホルモンの生産および腎臓でのビタミンＤ自身の
活性化における重要かつ中心的な制御因子である。活性
を有するホルモンとしてのビタミンＤ受容体のあらゆる
配列がこのような広い影響をおよぼし得るものと予想さ
れるため、これら一般的なVDR遺伝子の対立遺伝子が骨
密度に対しておよぼす影響については、双子をモデルと
して調査した。双子のモデルでは、年齢や混乱の元とな
る様々な影響が、比較する組から排除される。
これらの研究は、VDR遺伝子中の一般的な対立遺伝子
の変動から、骨密度の差異が予知されるとともに、脊椎
および股関節部の骨密度における遺伝的要因の50〜75％
が計上されることを示している。
このことは、制御タンパクおよび／または構成タンパ
クをエンコードする遺伝子の転写制御因子における遺伝
子型の変動による、病気に対する感受性および治療とし
ての望ましい対応の決定に関連した、生理学的設定値お
よび生理学的に異常な状態となる傾向の決定の、明かな
例であると思われる。
従って、本発明は、第一に、制御タンパクおよび／ま
たは構成タンパクをエンコードする遺伝子の転写制御因
子における遺伝子型の変動の分析を含む、個人における
生理学的に異常な状態の要因および／または、治療とし
て望ましい対応の評価方法からなっている。
本発明は、第二に、個人のビタミンＤ受容体遺伝子に
おける対立遺伝子の変動の分析を含む、個人における骨
密度の高低の要因の予知方法からなっている。
ここで、本発明の望ましい実施例には、エンドヌクレ
アーゼによる消化を用いた、制限されたある長さの断片
の多型性の分析が含まれる。
また、本発明の更に望ましい実施例では、エンドヌク
レアーゼによる消化に先立ち、ビタミンＤ受容体の一部
分を、ポリメラーゼチェーンリアクション法を用いて増
幅させる。
更にまた、本発明の更に望ましい実施例では、エンド
ヌクレアーゼは、Bsm1、Apa1、EcoR v、およびTaq1から
なるグループより選択され、かつ最も望ましいエンドヌ
クレアーゼはBsm1である。
一方、本発明の他の望ましい実施例として、ビタミン
Ｄ受容体の一部分は、以下に示すグループから選択され
る一組のプライマーを用いて増幅される。
５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′ および、５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′ および、５′−CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG−３′ および、５′−GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA−３′ 本発明の第二の側面には、ポリメラーゼチェーンリア
クション法によるVDR遺伝子の一部分の増幅に用いるた
めの、表５に示すVDR遺伝子の配列から得られるプライ
マーの組が含まれる。このVDR遺伝子の一部には、表５
に示すように、Bsm1、Apa1、またはTaq1による切断部位
が少なくとも１箇所含まれる。
また、この側面に係る望ましい実施例では、このプラ
イマーの組は以下の通りである。
５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′ および、５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′ および、５′−CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG−３′ または、５′−GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA−３′ 骨粗鬆症および／または虚血性心臓病の危険性を測定
するため、エストロゲンおよびアンドロゲン受容体を含
む他の作動因子における対立遺伝子の構成を評価しても
よい。アンドロゲン受容体における対立遺伝子の構成は
また、皮膚病の危険性および治療に対する応答の評価に
も使用可能である。糖質コルチコイド受容体およびレチ
ノイン酸受容体における対立遺伝子の構成を、骨粗鬆症
の危険性の評価のため測定してもよい。また、鉱質コル
チコイド受容体における対立遺伝子の構成を、高血圧の
危険性の評価のため測定してもよく、原腫瘍形成遺伝子
における対立遺伝子の構成を、癌の危険性の評価のため
測定してもよい。更に、組織特異性制御因子の評価は、
骨粗鬆症／癌の危険性の測定に使用可能である。
本発明の本質をよりよく理解するため、本発明の望ま
しい形態について、以下の例および図とともに説明す
る。
図１は、ビタミンＤ受容体の変動による、双子の組に
おける腰部のBMDの差異を示すものである。
図２は、エキソン７からエキソン９の３′末端の非コ
ード領域までのビタミンＤ受容体遺伝子のマップで、研
究に使用した多型性の制限酵素結合位置およびRFLPによ
る同定に使用するためPCR法で増幅した断片が示されて
いる。また、アステリスクは多型性部位を示し、かつア
ステリスクのない部分は不変部位を示す。
図３は、骨密度がVDRの遺伝子型により異なることを
示すもので、対象は女性である。データは、母集団の平
均と標準誤差とで示され、また、ｐ値は、各グループに
て対をなす二者間における、ステューデントのｔ検定の
ためのものである。
図４は、腰椎における骨密度への遺伝的な影響が男性
でも現れていることを示すものである。表示は図３と同
様である。
図５は、遺伝子型に応じた、年齢と腰椎骨中における
無機物密度（BMD）の退行および破壊限界との関連を示
すものである。
図６は、遺伝子型に応じた、年齢と大腿骨頚中におけ
る無機物密度の退行および破壊限界との関連を示すもの
である。
図７は、接合子およびVDR対立遺伝子の一致性に関す
る、双子の間における骨密度の差異を示すものである。
腰椎および大腿中心の骨密度は、MZおよびDZの双子の組
の骨密度における各組の示すパーセンテージの差異内に
示され、かつDZの双子の組におけるVDRの一致または不
一致に応じて示されている。VDRの対立遺伝子が一致す
るDZの双子では、あらゆる部位において、MZの双子との
間で有意な差がないのに対し、一致しないDZの双子で
は、それぞれの部位において、これらグループの双方と
明かに異なっている（ANOVA）。DZのグループ全体とVDR
対立遺伝子の一致するグループの差異をMZの双子と比較
すると、腰椎、骨頚、ワード三角（Ward's triangl
e）、および大腿中心の転子部にて、それぞれ75％,48
％,59％、および90％の遺伝的影響がVDR対立遺伝子によ
り説明可能である。一方、他の転写活性因子であるレチ
ノイン酸受容体α（21q7）では、いかなる部位でも△BM
Dを予知できなかった。
図８は、VDRの不一致の程度に関する、二卵性双生児
間での骨密度の差異を示すものである。双子の間での骨
密度の差異は、０−完全に一致するもの、１−対立遺伝
子が１つ不一致なもの、２−対立遺伝子がいずれも不一
致なもの、の３グループに分けて記入されている。A,B,
C、およびＤの図は、それぞれ腰椎、大腿骨頚、ワード
三角、および転子部のVDR遺伝子における分析結果を示
している。この影響による回帰分析は、腰椎（ｐ＝0.00
01）、ワード三角（ｐ＝0.006）、および転子部（ｐ＝
0.034）にて有意な相関を示し、大腿骨頚（ｐ＝0.055）
では不明確であった。また、同胞対称分散法を用いたと
ころ、それぞれの双子の組における骨密度の差の平方
（△２）と、腰椎、大腿骨頚、およびワード三角のVDR
遺伝子の一致性とは有意な相関を示す一方、大腿中心の
転子部では不明確であった。
腰椎△２ ＝0.015＋0.138＊不一致度（ｒ＝0.43,p＝0.001） 大腿骨頚△２ ＝0.015＋0.016＊不一致度（ｒ＝0.29,p＝0.034） ワード三角△２＝0.017＋0.026＊不一致度（ｒ＝0.34,p＝0.01） 転子部△２ ＝0.015＋0.015＊不一致度（ｒ＝0.27,p＝0.05） 図９は、骨中における無機物密度の高さと、VDR遺伝
子との関連を示すものである。
A. Bsm−１対立遺伝子が不一致な二卵性双生児（ｎ＝2
2）における、腰椎骨の無機物密度を遺伝子型に従って
プロットし、双子の組における骨の無機物密度の値を線
で結んだ。22組のうち21組では、（ｂ）で示す対立遺伝
子が多く存在する程高い骨質量を示した（白丸）が、１
組は逆の傾向を示した（黒丸）。
B.閉経前の無関係な女性の腰椎骨の無機物密度をVDR対
立遺伝子に対応させたものである。個々のMZおよびDZの
双子の組から一人を選び、かつグループ毎の被件者の数
は図示の通りである。図より、遺伝子型がBBであるグル
ープではBMDが低い一方、遺伝子型がbbでグループではB
MDが高いことが明かである。この影響の大きさは、各部
位における骨密度の標準偏差が、年齢に応じた人数に対
応して、約0.11gm/cm2となることからも確認できる。こ
こで、平均±標準誤差の値を図にプロットし、かつ各グ
ループ間の差異の有意差はANOVAにより算出した。ま
た、各組間の比較は、組に依らないステューデントの検
定により行った。なお、異なるグループにおける年齢、
身長、および体重による比較では、有意な差はなかっ
た。
図10は、異なる遺伝子型を有する個人に対するカルシ
トリオール処方の結果を示すものである。
調査１ 方法 本研究には、骨密度の疫学適研究のため募集した288
名の被験者が含まれている。全被験者は、緯度が南緯33
゜52′で、日光の照射が多いシドニー都市圏内から募集
し、コーカサス−英−オーストラリア系（英国およびア
イルランドを遠縁とする）の91名の被験者から、３つの
エンドヌクレアーゼに対し制限されたある長さの断片の
多型性（RFLP）のデータとともに、血清中のオステオカ
ルシンのデータを得た。また、骨疾患を起こすか、オス
テオカルシン量を増加させることが知られている治療を
受けた被験者はおらず、かつ全被験者が、コーカサス系
で、腎機能も正常であることを、血清クレアチニンを用
いて測定した。
血清は、一晩絶食後の翌朝採取し、かつ静脈穿刺前の
被験者へのカルシトリオール投与は行っていない。血清
中のオステオカルシンは、ウサギの抗ヒツジオステオカ
ルシンに基づく内部放射免疫検定により測定した（1
1）。この検定における通常のオステオカルシン量は、
精製したヒツジオステオカルシンを用いた場合、３〜18
ng/mlであった。オステオカルシン測定は最初に独立し
て行い、RFLP分析の結果とともに、コード化して保存し
た。
DNA分析 RFLPの同定に用いるプローブには、ビタミンＤ受容体
cDNAの、全コード化領域を含むがmRNAの３′側の未翻訳
部分を欠く、2.1kbの断片を用いた。血液からのDNA抽出
およびサザンブロティングには常法を用い、制限酵素に
は、Pharmacia−LKBおよびNew−England Biolabs製のも
のを、その取扱説明書に基づき用いた。
統計的方法 RFLPマーカーの相対的結合は、分割表およびX2検定を
用いた棄却検定の自由な組み合せの偏差から、統計的に
評価した。また、分散の解析（ANOVA）には、Statview
＋graphics統計用パッケージ（Abacus Concepts製、カ
リフォルニア州バークレー）を、Macintosh SE/30コン
ピュータにて起動させ使用した。RFLPと血清オステオカ
ルシンとの関係の評価には、Fisherの保護最小有意差
（PLSD）検定を用いた。有意水準の見積りは、あらゆる
影響の棄却検定に対する最初のＦ検定（平均に差がな
い）および個々の類別（RFLP）クラスにおける連続的な
変化の平均の、各組の間における比較の信頼水準のため
に行った。
個々のRFLPマーカーは、ANOVAにおける連続的な可変
物（オステオカルシン）に対する類別クラス（RFLP）の
比較により、それぞれオステオカルシン血清の濃度の連
携しているものと考えられる。オステオカルシンの値
（ng/ml）は通常分別できないが、非母数解析を用いる
ことにより、ln（l+オステオカルシン）として対数に変
換可能である。
結果 ビタミンＤ受容体のcDNAをプローブとして用い、未だ
報告されていない２つのよくあるタイプのRFLP（Bsm I
とEcoR Vにより同定された）を発見し、かつ既に知られ
ているRFLPを、Apa Iにより同定した（18）。このRFLP
は、Aa（Apa I）、Bb（Bsm I）、およびEe（EcoR V）と
してコードされている。ここで、大文字は部位の欠失を
示し、小文字は部位の存在を示す。また、RFLPのメンデ
ル遺伝学的本質は、同様の研究により確認されている
（データ未掲載）。表１は、本研究と無関係な任意抽出
による266名の志願者における、これらのRFLPの頻度を
示すものである。182名の遺伝子型が、これらのRFLPを
全て有すると評価された（表２）が、これらは強度の連
関性の証拠であり、かつこの位置における連鎖の不均衡
を示している。これらのRFLPは、AAとBB、およびEEにお
いて、それぞれ83％および92％という頻度で強く連関
し、また、これに応じて、aaとbb、およびeeとは、それ
ぞれ61％および72％という頻度で連関している。これら
一連の機能的解析結果はハプロタイプによるものではな
いが、可能性のある８つのハプロタイプのうちの２つ
が、被験者のうち53.2％で必要とされている。この明か
な同種接合体から、ａ、ｂ、ｅ、およびＡ、Ｂ、Ｅが、
最も高頻度となる可能性を有するハプロタイプとして示
されている（表２）。
注：オステオカルシン値は、コーカサス−英−オースト
ラリア系（英国およびアイルランドを遠縁とする）の91
名の被験者から、有益な３つのRFLPについて分析した。
オステオカルシン値は通常分別できないため、統計的解
析に先立ち対数に変換した。メジアンは、血清中のオス
テオカルシン値のメジアン、平均は、対数変数値（ln
（l+オステオカルシン））の平均、SDは標準偏差、SEは
平均の標準誤差である。また、Sig.は、同型接合体の平
均値の間（Sig.1）および同型接合体（RFLP部位にはな
い）と異種接合体との間（Sig.2）についての有意性
（このような変化が偶発する可能性）、ｐ値は、あらゆ
る結果にわたるＦ検定のためのものである。
PFLPと血清との関係 91名の正常な被験者のオステオカルシンを、血清中の
オステオカルシンのデータに基づき解析した（表３）。
また、被験者の年齢、性別、および閉経の有無に関する
分散を表４に示した。年齢は、いずれのRFLPの遺伝子型
に対しても大きな影響をおよぼしていない。一方、Bsm
I BBグループは、Bsm I bbグループに比べ有意に高い
（ｐ＝0.0001）オステオカルシン値を示している。同様
の影響は他のRFLPでもあり、Apa I対立遺伝子系では有
意のｐ値（AA対aa、ｐ＜0.0025）を、EcoR V対立RFLPで
はより弱いｐ値（EE対ee、ｐ＝0.015）を示している。
また、これら３つのRFLPの全てにおいて、BB:16.8ng/m
l、Bb:8.9ng/ml、bb:8.8ng/ml（メジアン）等、制限部
位の対立遺伝子（A,B,E）の欠失は高いオステオカルシ
ン値に連動し、制限部位の対立遺伝子（a,b,e）の存在
は低いオステオカルシン値に連動している。なお、未処
理のオステオカルシン値に対する非母数統計解析（Krus
kal−Wallis）からは、Apa I:p＝0.0016、Bsm I:p＝0.0
001、EcoR V＝0.0044と、本質的にANOVAと同様の結果が
得られている。
Bsm IおよびApa I RFLPが最も予知可能なため、被験
者を、これら対立遺伝子の９つの組み合せに従い細分し
た。その結果、血清のオステオカルシン値は、遺伝子型
に応じて明確に分離された（図１）。EcoR Vマーカーの
連関が弱いことは他のマーカーとの不均衡さから確定し
ていたため、EE遺伝子型におけるBsm IおよびApa I対立
遺伝子の分配ならびに被験者のオステオカルシン値につ
いて調査した（図２）。また、Bsm Iマーカーは専ら推
論によるハプロタイプおよび連関するオステオカルシン
値（ｐ＝0.003）を支配している。
血清のオステオカルシン値による遺伝子型の予知は、
男（ｎ＝14）を除くとBsam IおよびApa Iにより維持さ
れる（全ての結果をANOVAにより評価した場合、Bsm I:p
＝0.0001、Apa I:p＝0.0034）。閉経状態は、オステオ
カルシン値の増加と連関し、かつ閉経後の早期には、広
範なオステオカルシン値が観察された（19〜21）。その
ため、閉経状態の役割を、年齢、閉経の有無、およびBs
m I遺伝子型を含む共分散多重回帰解析により評価し
た。すなわち、閉経状態は、血清中のオステオカルシン
濃度の決定にBsm Iの多型性より弱く関与する（ｒ＝−
0.44、ｐ＜0.001）。また、これら２つの因子のANOVAは
同様の結果を示した（Bsm I:p＝0.0002、閉経状態:p＝
0.24）。閉経前および閉経後の女性のデータを別々に解
析したところ異なる結果が得られ、かつ遺伝子型は閉経
状態よりも強く予知に関与した（図１）。
調査２ 材料および方法 被験者 被験社は互いに無関係な535名のボランティア（447名
の女性と88名の男性）で、骨密度への遺伝的影響を調査
し記録した。被験者はシドニー都市圏内から媒体を通じ
て募集したもので、その平均年齢は女性で51.4±13.8歳
（平均±SD、範囲は20〜84歳）、男性で40.6±16.0歳
（範囲は20〜79歳）であった。また、被験者はいずれも
コーカサス−英−オーストラリア系（英国およびアイル
ランドを遠縁とする）であった。閉経状態は、高いFSH
およびLH量と低いエストラジオール量、ならびに少なく
とも過去12年にわたる生理の欠如から確認した。被験者
のうち、骨疾患の経験、疾患、および父母両系にわたる
卵巣除去または薬物使用が有るもの（ホルモン置換療法
を含む）は、骨密度の変化を起こしやすいため調査から
除外した。
骨無機質密度の分析 骨無機質密度（BMD）は、面積当たりの密度（g/cm2）
で表し、腰椎（L2〜４）および骨頚について、既に述べ
られている通り（Pocockら、1987）、二重光子吸収法ま
たは二重エネルギーｘ線吸収法（それぞれLunar DP−３
またはDEXA、Lunar Radiation NCo.製、ウィスコンシン
州マディソン）にて測定した。
DNA解析;PCR（ポリメラーゼチェーンリアクション）お
よびエンドヌクレアーゼ消化によるRFLP解析 集めた血液をヘパリン処理した試験管内に入れ、臨床
遠心分離機を用い、生理食塩水中における沈降により白
血球を分離した。精製した白血球は、白血球溶解バッフ
ァ（10mMのトリス塩酸（pH7.4）、生理食塩水、および
0.5％W/Vのソジウム硫酸ナトリウム（SDS））中に溶解
した。溶解液は50ug/mlのタンパクキナーゼＫ（Applied
Bioscience製、パロ・アルト、米国）とともに65℃で
２時間処理した。更に、Naniatisらの抽出法に従いフェ
ノール−クロロホルム溶液で繰り返しDNAを抽出し、エ
タノールで沈澱させた。このDNAをTEバッファ（10mMの
トリス塩酸、1mMのEDTA（pH8.0））に再溶解し、260nm
における紫外線吸光度から定量した。
更に、エキソン７から３′側の未翻訳部分までのビタ
ミンＤ受容体遺伝子をシークエンスした。この配列を表
５に示す。
上部鎖の下線が引かれたプライマーは前向きのプライ
マー、下部鎖のそれは逆向きのプライマーである。
これらのプライマー、これらのプライマーに基づくプ
ライマー、および周辺の配列の対をなす組み合せは、い
ずれもポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅可
能である。
VDR遺伝子の３′側方部を増幅させるため、４つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。Bsm1結合部位
の同定は、825塩基対の断片を形成させるエキソン７
（５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′）およ
び他のイントロン８（５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−
３′）内で開始される一つのプライマーで、その部位が
またがる部分を増幅することにより促進させた。また、
Apa IおよびTaq I結合部位の同定は、740塩基対の断片
を形成させるイントロン８（５′−CAGAGCATGGACAGGGAG
CAAG−３′）および他のエキソン９（５′−GCAACTCCTC
ATGGCTGAGGTCTCA−３′） を用いた一つのプライマーで１回増幅を行うことによ
り促進させた（図２）。
PCRには、200ngのゲノムDNA、20pmolの各プライマ
ー、200uMのdNTP、50mMの塩化カリウム、10mMのトリス
（pH8.3）、1.5mMの塩化マグネシウム、および1UのTaqD
NAポリメラーゼ（東洋紡製、大阪）を含む20ulの試料を
用いた。そして、個々の試料を、以下に示す37回の増幅
ステップに供した。すなわち、ステップ1:94℃３分、62
℃１分、72℃２分、ステップ２〜6:94℃20秒、62℃１
分、72℃１分、ステップ７〜36:それぞれ５秒、５秒、3
0秒、である。増幅には、あらゆる熱サイクル装置を効
果的に用いるとよい。PCR法の産物は10ulずつ等分した
後、65℃にて５ユニットのBsm1（New England Biolabs.
米国マサチューセッツ州）、37℃にてApa1、または65℃
にてTaq1＊（Promega Co.オーストラリア）の各エンド
ヌクレアーゼにより１時間消化させた。ここで、無関係
な遺伝子のクローンは、Bsm1およびApa1による消化のた
めの分子内制御に使用され、また、Taq1による消化に際
しては、PCR産物自身における不変のTaq1結合部位が分
子内制御に使用された。次いで、消化後のPCR産物を、
0.5ug/mlの臭化エチジウム、0.09Mのトリスホウ酸塩、
および0.002MのEDTAを含む1.2％（Bsm1およびApa1）ま
たは2.0％（Taq1）のアガロースゲル（pH8.3）を用い、
100Vで１時間分離した。アガロースゲル用の分子量の基
準には、EcoR Iで消化されたSPP1マーカー（Bresatec L
imited、アデレード、オーストラリア）を用いた。配列
の多型性を見いだすにあたっては、関連する結合部位の
配列のための他の制限酵素が利用可能であった。例え
ば、Bsm1結合部位には不変のStu I結合部位（Ｂ対立遺
伝子はAGGCCTGCＧCATTCCC、ｂ対立遺伝子では下線のＧ
がＡになる。）が隣接しているが、この配列の変化は、
Aos1、Fsp1、Mst1、Fdi1、Hinp1、Hha1、およびそれら
のアイソチジマーにより検出可能である。多型性を有す
るApa1結合部位の配列は、隣接するPvu2結合部位（Ａ対
立遺伝子はGAGGＧGCCCAGCTG、ａ対立遺伝子では下線の
ＧがＴになる。）内で終わっている。Ｇの存在は、Ban
2、Aoc2、Pss1、Pal1、Hae3、Cfr3 I、Asu1、Sau96 I、
Eco0109 I、Dra2、およびそれらのアイソチジマーによ
り検出可能である。Ban1およびそのアイソチジマーに対
する多型性は、Ｔの存在によるものである。Taq1多型性
の配列は、不変のHba1からHae3結合部位にわたって延
び、そのＴ対立遺伝子はGCGCTGATＴGAGGCC（ｔ対立遺伝
子では下線のＴがＣになる。）である。この多型性はMb
o1、Sau3A、Dpn1、およびそれらのアイソチジマーによ
り検出可能である。
Taq1＊RFLP:血清中のオステオカルシン濃度を予知す
るビタミンＤ受容体中のBsm1およびApa1RFLPについては
既に述べた。これらの多型性部位は、ゲノムDNAのエキ
ソン７から３′側の未翻訳部分（３′−UTR）までの間
に位置している。これら２つの通常のビタミンＤ受容体
の対立遺伝子（ABおよびab）間の差異を特性付けるた
め、本発明者らは、この遺伝子型における同種接合体AA
BB、aabbを含む配列を形成し、15のコード化されていな
い差異を含む多くの配列の差異を同定した。エキソン９
のコード化領域における似たような差異、すなわちイソ
ロイシンコドンのＴとＣの差異（ATTもATCもイソロイシ
ンコドンである。）もあった。
統計的解析 分散の解析（ANOVA）は、Statview＋graphics統計用
パッケージ（Abacus Concepts製、カリフォルニア州バ
ークレー）を、Macintosh SE/30コンピュータにて起動
させ使用した。RFLPとBMD、身長、および体重との関係
の評価には、Fisherの保護最小有意差（PLSD）検定を用
いた。有意水準の見積りは、あらゆる影響の棄却検定に
対する最初のＦ検定（平均に差がない）および個々の類
別（RFLP）クラスにおける連続的な変化の平均の、各組
の間における比較の信頼水準のために行った。組の間に
おける比較は、ステューデントのｔ検定により行った。
また、連続的と絶対的な変化の関係は、多重解析により
評価し、RFLPマーカー間の関係は、分割表およびカイ２
分布により評価した。
結果 535名の被験者におけるRFLPの分布を表６に示す。こ
れらのRFLPは、Bb（Bsm1）、Aa（Apa1）、Tt（Taq1）に
よりコードされ、大文字は結合部位の欠失を、小文字は
結合部位の存在をそれぞれ表している。Bsm1およびApa1
RFLPの分布（表１）も上記と同様の結果を示している。
また、RFLPは高い連携性を有している。（表７）すなわ
ち、AA遺伝子型の分布は、BBおよびttとそれぞれ92.7％
および95.3％という高頻度で連関しているのに対し、aa
は、bbおよびttとそれぞれ61.6％および65.3％という頻
度で連関している。Bsm1とTaq1RFLPの比較では、tt、T
t、およびTT遺伝子型は、BB、Bb、およびbbと、それぞ
れ95.5％、95.1％および96.4％という高頻度で連関し分
布している。Bsm1とTaq1が密接に連関するというこの結
果から、以下の記述ではTaq1とBsm1とを同等とみなし、
Bsm1の結果についてのみ言及する。
腰椎（LS）および骨頚（FN）におけるRFLPとBMDとの
関係について、535名の被験者について調査した。この
被験者の年齢、身長、体重、および閉経の有無の分布を
表８に示す。年齢、身長、および体重は、RFLP遺伝子型
と有意な関連を示さない（表９）。また、女性の場合、
BBおよびAAグループのLS BMDの平均は9.9％（1.107対1.
118）および8.6％（1.049対1.139）で、いずれもbbおよ
びaaグループより低く、BBおよびAAグループのFN BMDの
平均も、5.6％および5.3％と、いずれもbbおよびaaグル
ープより低かった。異種配偶子を有する対立遺伝子が支
配的であることもまた観察された（図３）。すなわち、
より低いLSおよびFN BMDが、いずれも制限部位の対立遺
伝子（BA）と関連していた。LSおよびFNのBBAA遺伝子型
とbbaa遺伝子型におけるBMDの平均の差（それぞれ13.4
％および7.8％）は、BBとbbまたはAAとaaとの間におけ
るそれよりも大きかった（表９）。
注:nは被験者数を、ｐは、ANOVAから得られた変数の遺
伝子型に対する影響を示す。全てのｐ値が、異なる遺伝
子型における平均値が有意の差を有していないことを示
している。
遺伝子型の影響は、女性の場合、年齢（歳）、閉経の
有無（閉経後の平均年数;YPM）、身長（cm）、体重（k
g）、およびBsm1遺伝子型（BB＝１、Bb＝２、bb＝３）
を含む共分散の多重回帰により評価し、等化した。ここ
で、 LS BMD（g/cm2）＝0.419＋0.054・Bsm遺伝子型−0.004
・年齢−0.994・YPM＋0.02・体重＋0.004・身長（ｎ＝4
25）、ｒ＝0.58、ｐ＝0.34 Bsm1 年齢 YPM 体重 身長 ｐ値 0.0001 0.0013 0.0001 0.0045 0.003 Ｆの評点 24.9 16.0 10.4 8.2 8.9 FN BMD（g/cm2）＝0.456＋0.025・Bsm遺伝子型−0.004
・年齢−0.004・YPM＋0.04・体重＋0.02・身長（ｎ＝42
5）、ｒ＝0.68、ｐ＝0.47 Bsm1 年齢 YPM 体重 身長 ｐ値 0.002 0.0001 0.0004 0.0001 0.022 Ｆの評点 9.6 41.7 12.8 35.2 5.3 であった。女性の場合、腰椎および骨頚におけるBMDは
いずれも年齢および閉経の有無と弱く関連し、かつLSお
よびFNにて、Bsm1 RFPはBMDと独立して関連していた。
男性の場合の結果を以下に示す。
LS BMD（g/cm2）＝1.039＋0.058・Bsm遺伝子型（ｎ＝8
5）、ｒ＝0.22、RS＝0.05、ｐ＝0.038、Ｆの評点＝4.9 FN BMD（g/cm2）＝1.046−0.003・年齢（ｎ＝85）、ｒ
＝0.132、R2＝0.10、ｐ＝0.017、Ｆの評点＝5.9 破壊限界への到達 骨粗鬆症による破壊の危険性を増加させるまで低下し
た腰椎のBMDの値は、アーストラリアDubbo市における断
面の調査の結果から得た。この値は0.97gm/cm2で、アメ
リカ人における破壊磁界の値と類似していた。もし、遺
伝子型がBMDおよびその後の骨粗鬆症の可能性に影響し
ているならば、骨質量の変化および破壊限界に到達する
年齢の差異が遺伝子型と関連して現れるはずである。図
５は、女性の場合において、BB、Bb、およびbbの各遺伝
子型でLS BMDの低下を示す線が、破壊限界の値と交差す
る年齢を示す図である。BBとbbでは到達までに10年の差
があり（60.3歳と71.1歳）、かつBb異型遺伝子では中間
的な値（68.1歳）を示した。破壊限界を0.7gm/cm2とし
た骨頚の場合でも、同様の結果が得られた（BB;66歳、B
b;70歳、bb;74歳）。
調査３ 通常のVDR対立遺伝子の骨密度に対する影響を双子を
モデルとして調査した。双子では、年齢や混乱の元とな
る様々な影響が排除される。75のMZと55のDZからなる25
0名のコーカソイドの双子（双子７組の男性MZ双子およ
び６組の男性DZ双子を含む。）について調査を行った。
被験者の年齢は17歳から70歳にわたり、平均年齢はMZで
は45±13歳、DZでは44±11歳（平均±SD）であった。BM
Dは、腰椎および骨頚について、既に述べられている通
り（Pocockら、1987）、二重光子吸収法または二重エネ
ルギーｘ線吸収法（それぞれLunar DP−３またはDEXA、
Lunar Radiation NCo.製、ウィスコンシン州マディソ
ン）にて測定した。女性の双子間における閉経の有無は
全員等しく、閉経後の場合、その年数も等しかった。
骨の変動のマーカーとして既に示した、Bsm−１、Apa
−１、およびEcoR V結合部位として多型性を有する部位
のVDR遺伝子をシークエンスした。これらの部位は、エ
キソン７から３′−UTRまでの間に位置している。コー
ド化領域または潜在的スプライシング部位には多型性部
位はなく、また、イントロン８のＧがＡに置換された、
情報量に富んだBsm−１結合部位を有していた。そし
て、これが、最も通常の２つうの対立遺伝子のコード化
領域における唯一の相違点であった。エキソン９のＴの
代わりにＣが含まれ、ATTがATCに変わる場合もあるが、
エンコードされるアミノ酸（イソロイシン）は変化しな
い。Bsm−１結合部位の側方のDNA配列は、被験者の遺伝
子型決定を容易化するための、エキソン７からエキソン
９まで2.1〜2.2kbの断片を増幅させる、ポリメラーゼチ
ェーンリアクションに基づく方法に用いた。白血球DNA
のPCR増幅は、Bsm−１（New England Biolabs Inc.Gene
Search、ブリスベーン、オーストラリア）によるエン
ドヌクレアーゼ消化の前に、Corbett FTS−１サーマル
シークエンサー（Corbett Research、Mortlake NSW、オ
ーストラリア）を用い、 ５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′ および、５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′ をプライマーとして行った。Bsm−１結合部位の存在に
より、825塩基対の生産物が650塩基対および175塩基対
の断片に分断された。また、Bsm−１による消化と平行
して、１個のBsm−１結合部位を有する4.7kbのプラスミ
ドを、部分的な消化による対立遺伝子の指示ミスを避け
るための内部制御に用いた。
双子を用いた調査結果から、腰椎および大腿中心にお
ける組内のBMDの差異（△BMD％）に対する対立遺伝子の
変動の影響を、DZ双子について検討した（図７）。いず
れの部位でも、VDRの対立遺伝子が一致するものの方
が、不一致なものより有意に近い値を示した。一方、MZ
双子における腰椎の△BMD％とVDR対立遺伝子が一致する
DZ双子の場合とは有意な差を示さず、いずれも、対立遺
伝子が不一致なDZ双子の場合と有意な差（＜0.0001）を
示した。また、大腿中心の場合には、環境的影響が大き
いこともあり、類似ではあるがより弱い影響を示した。
閉経前の双子における制限もこの結果を覆すものではな
かった。身長および体重等の形質による結果のばらつき
を制御すると、VDR遺伝子型は、腰椎（ｐ＝0.0002）お
よび転子部（ｐ＝0.02）では最も強い予知因子である
が、大腿中心の首部ではそうではない。上記のような骨
の変化の指標としてのBsm−１対立遺伝子の支配的な影
響という観点から、本発明者らは、遺伝子型における差
異の程度と双子の組における特徴の差異との間のほぼ一
定の関係が、骨質量の特徴に支配的な影響をおよぼして
いるものと予想した。血縁間における連鎖の解析によれ
ば、ある特徴の差の２乗と、血縁関係のある双子におけ
る相同遺伝子の比率との間の有意な相関は、遺伝的な連
鎖を示し、かつVDR対立遺伝子は、腰椎および大腿中心
の殆どの部分で支配的であった。△BMDをVDR対立遺伝子
における一致の程度と比較すると、不一致な双子では、
1.5〜2.5倍の値を示した（図７および８参照）。また、
VDR対立遺伝子が不一致な22組の双子のうち21組では、
ｂ対立遺伝子が骨密度の高さに関連していた（図9A）。
更に、閉経前の女性では（MZおよびDZの双子の組から１
名ずつ無作為に選択した。）、bb対立遺伝子が骨密度の
高さに関連する一方、BB対立遺伝子が骨密度の低さに関
連し、対立遺伝子の支配的影響が明かであった（図9
B）。
これらのデータは、VDR対立遺伝子の差異が、通常の
個人の集団における骨密度の比率の主要な差異を表すこ
とを証明している。BB、AA、EE、および／またはttの各
VDR遺伝子型は、男女双方で骨密度の低さに関連してい
る。従って、VDR遺伝子のRFLP遺伝子型は、骨における
変化の増加および骨密度の低下傾向や、男女双方におけ
る、骨密度最大値および以後の骨質量の生理的変動を予
知する際に有効である。一方、骨密度や骨の変化に対す
る遺伝的影響の機構はいまだ明らかではない。しかしな
がら、1,25−ジヒドロキシビタミンＤは、VDR遺伝子の
プロモーター中のビタミンＤ応答要素を経てオステオカ
ルシン合成の促進因子として作用している（Morrison 1
989 Science）。本発明者らは、VDR遺伝子における通常
の対立遺伝子の変動が血清中のオステオカルシン量の差
異に関連し、かつこれらのVDR遺伝子における対立遺伝
子の変動から、二卵生双生児における骨密度の差異が予
知できることを示した。
すなわち、これらVDR遺伝子のRFLPは、男女双方にお
いて骨質量の生理的変動のマーカーであり、かつ本発明
者らは、Bsm1RFLPが、LSとFNにおいて、BMDに対し独立
した相関を有することを見いだした。
注:p;相関の程度が有意の差異を有するかを判定するた
めのｐ値。双子のモデルの場合、rMZとrDZとの間の有意
な差異が、係る特徴に対する遺伝的影響の証拠となる。
本発明者らによる、DZ双子における、双子間で同一のVD
R遺伝子型を持つもの（DZ一致）と双子間で異なるVDR遺
伝子型を持つもの（DZ不一致）との比較では、rDZ一致
とrDZ不一致との間における有意に異なる相関は、係る
特徴に対するVDR遺伝子の遺伝的影響の貢献を支持して
いる。
同種配偶子であるBBAAまたはAAtt遺伝子型が低い骨密
度と関連し、かつBBAA配偶子を有するLSおよびFNにおけ
るBMDの平均値は、約12％および８％とbbaa遺伝子型に
比べ男女双方で低くなっていることは重要な点である。
また、これらの遺伝子型の差異は以後の生活に重要であ
る、というのは、この差異が10年間にわたる破壊限界の
差異を表しているからである。これらの対立遺伝子の差
異は、双子の研究で観察される骨質量への遺伝的影響の
機構を示し、かつ低骨質量に係る対立遺伝子の有無の遺
伝的検知方法を提供する。すなわち、ビタミンＤ受容体
の遺伝子型の同定は、重要な骨質量の測定法として、骨
粗鬆症の予防および治療に新たな路を開くものである。
異なった遺伝子型に応じた処理上の差異の説明 以上のデータには、上記したVDR対立遺伝子が異なる
機能を有することが示されている。従って、異なる遺伝
子型を有する個人では、カルシトリオールおよび／また
はその類似体に対して異なる応答を示すと予想される。
このことを、Bsm 1遺伝子型にそれぞれ同型配偶子（BB
およびbb）を有する10名の若い女性にカルシトリオール
を投与し、それに対する応答を、骨カルシウム代謝に係
る３つのマーカー、すなわちオステオカルシン、パラチ
ロイドホルモン（PTH）、および尿中カルシウムを用い
て分析することにより確認した（図10参照）。
BBとbbのグループとでは、基礎的な血清オステオカル
シン値が異なり（ｐ＜0.01）、対立遺伝子がBBであるも
のでは、やはりオステオカルシン値が高かった。カルシ
トリオールの投与後における、基礎的な値からの増加率
はbbのグループの方が高く、BBのグループにおける増加
率は相対的に低かったが、基礎的なオステオカルシン量
が多いため、総反応量はBBのグループの方が多くなっ
た。
パラチロイドホルモンはカルシトリオールにより制御
されることが知られているが、カルシトリオールによる
抑制の程度は、遺伝子型により明かに異なった。すなわ
ち、パラチロイドホルモンによる抑制力は、BBのグルー
プでは弱いがbbのグループでは強かった。これは、カル
シトリオールの投与に対するPTHの応答が明かに異なる
ことを示している。調査期間中における尿中の総カルシ
ウム排出量（グラフの下側）はBBのグループの方が明か
にbbのグループより多い。これは、遺伝子型に応じて、
カルシウムの運用が異なることを示している。また、カ
ルシトリオール処理に伴う抑制によるパラチロイドホル
モンの減少が、尿中におけるカルシウム排出量の増加と
対をなしていることから、骨中カルシウムの流動と両立
可能な、異なるカルシウム代謝機構の存在が示唆され
る。
VDRおよび他の特性 ビタミンＤ受容体およびビタミンＤ内分泌系は、他の
様々な病的および生理的状況に影響している。そして、
ビタミンＤ受容体遺伝子におけるこのような差異を、内
性または外性のカルシトリオールに対する異なった応答
およびビタミンＤ類似体を用いた治療への誘導のみなら
ず、重要な成分の制御にカルシトリオールが影響する他
の疾患を受容し得るまで発達させることも可能である。
ビタミンＤ内分泌系を内部に備える状況または疾患の公
知の例には、エイズウイルス（HIV−Ｉ）の複製、胸部
ガン細胞の増殖、結腸ガン細胞の成長、ケラチン生成細
胞の分化、乾蘚細胞の複製および作用、精子形成、黒色
腫および他のガン細胞等がある。
すなわち、ここに記載したように、本発明の結果、VD
R中の機能的に異なる対立遺伝子が、その感受性、発展
性、予防能力、および種々の処置における治療能力によ
り、ビタミンＤ受容体およびビタミンＤ内分泌系により
制御されている状況または病気に影響をおよぼし得るこ
とは明かである。また、ここに記載したものはビタミン
Ｄ内分泌系に影響される病的および生理的状況の例であ
り、ビタミンＤ内分泌系に影響される他の病的および生
理的状況を排除するものではない。ここに記載したデー
タから、Walters M（「ビタミンＤ内分泌系の新たに同
定された作用」、Endocrine Reviews 13,719−764）に
より最近著されたような、更にはそこで述べられている
論文中に掲載されているような、ビタミンＤ内分泌系に
影響されることが知られているあらゆる病的および生理
的状況を、ここに記載の方法により評価および調査可能
なことは明かである。しかも、これらはビタミンＤ受容
体の遺伝子型に影響されるため、個人の遺伝子型が、ビ
タミンＤ受容体およびビタミンＤ内分泌系を含むあらゆ
る病的および生理的状況に対する感受性、発展性、予防
能力、および処置に重要であることもまた明かである。
これらのデータでは、その生理的機構に係わりなく、
骨密度の制御に関連する遺伝子が当初から同定されてい
た。重要なのは、その影響の大きさが、骨密度に対する
強い遺伝的影響の主な要因として説明されることであっ
て、実際のところ、骨密度にて補正された母集団の変動
のうち半分以上がそれに依っている。これらの発見は、
骨粗鬆症の危険性の増加に対するより早期の干渉を可能
とし、かつ骨密度における母集団の広い分散の機構に対
する重要な洞察を提供するとともに、特異的な対象物に
対する新たな治療法への路を開くものである。また、こ
の１個の遺伝子の多面発現活性は、これまで複雑かつ分
断された遺伝子の制御によるとみなされていた、多くの
病理形態学的過程のモデルの一つでもある。
この研究では、自然に存在する作動因子および転写活
性因子の対立遺伝子の機能付けについて、対象となる遺
伝子の形成と相関させて述べた。また、この受容体対立
遺伝子の差異が、対象となる器官（例えば骨密度）の主
要な差異に関連することをデータとして示した。この方
法による遺伝的分析は、リガンドで活性化された受容体
の上科の遺伝子中における自然な対立遺伝子の変動の機
能的重要性に対する研究の模範を示すものであり、ステ
ロイドホルモン内分泌系のより完全な理解に重要な貢献
をなし得るものである。更に、この方法は、あらゆる種
類の作動的制御因子の対立遺伝子に適用可能である。
制御タンパクおよび／または構造タンパクをエンコー
ドする遺伝子の転写制御因子における遺伝子型の変動
は、病気に対する感受性と、治療に対して起こり得る応
答の測定とに影響する生理的設定値および病理形態学的
状態を決定する。これらの遺伝子型の変動は、病気の予
防および治療に際しての、病気の危険性の測定および治
療法の選択のための一般的なモデルとして使用される。
このモデルの特異的な例として、ビタミンＤ受容体遺
伝子における対立遺伝子の変動による、骨の変化、骨質
量、および環境的要因への感受性の決定がある。これら
の変動は、骨粗鬆症の進行の危険性に対するマーカーで
あり、種々の治療に対して起こり得る応答を示唆するも
のである。
本発明者らは、機能的に異なるビタミンＤ受容体の対
立遺伝子を定義するRFLPマーカーを同定した。ここで述
べたRFLPとは、遺伝的現象と連鎖した物理的マーカーで
あるが、今回定義されたマーカーとの連鎖の範囲に依存
した、他のあらゆるRFLP、物理的マーカー、多型性配
列、または、今回定義されたマーカーに連関し、ビタミ
ンＤ受容体遺伝子または側方のDNA内で認められた遺伝
的影響によっても、上記したマーカーと同様の情報が提
供可能である。従って、本発明の方法は、今回定義され
たマーカーと連鎖する、他の公知または未知のマーカー
によっても説明される。
当業者は、上記した各実施例で示すような本発明に対
し、広範にわたり記載された本発明の意図または目的を
逸脱しない範囲で、多くの変形および／または改良が可
能であることを認めるであろう。すなわち、本発明の実
施例は、記載されたあらゆる点で、本発明を制限するも
のではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイスマン， ジョン アレン オーストラリア国 2070 ニュー サウ ス ウェールズ リンドフィールド チ ェルムスフォード アベニュ 28 (72)発明者 ケリー，ポール ジェームス オーストラリア国 2024 ニュー サウ ス ウェールズ ウェヴェリー カーリ ントン ロード 131 (56)参考文献 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ ｕｐｐ．16Ｃ（1992），ｐ．20，ａｂｓ ｔｒａｃｔ Ｌ131 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，17（1989），ｐ．2150 Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，49 （1991），ｐ．668−673 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，85（1988），ｐ．3294− 3298 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C07H 21/04 C12N 15/00 Ｐｕｂｍｅｄ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ) ＪＩＣＳＴファイル ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＯ ＩＳ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】個人から単離した細胞のビタミンＤ受容体
    遺伝子のエキソン７から3'UTRまでの領域に関連する対
    立遺伝子の変異を分析することを含む、骨粗鬆症に対す
    る個人の傾向および／または骨粗鬆症の進行を分析する
    方法。
  2. 【請求項２】分析が、エンドヌクレアーゼによる消化を
    用いた制限酵素断片長多型を含む、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】ビタミンＤ受容体の一部分を、エンドヌク
    レアーゼによる消化の前に、ポリメラーゼチェーンリア
    クション法を用いて増幅する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】エンドヌクレアーゼが、Bsm1、Apa1、EcoR
    V、Taq1、およびこれらのアイソシゾマーからなる群か
    ら選択される、請求項２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】制限エンドヌクレアーゼがBsm1である、請
    求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】ビタミンＤ受容体の一部分が、 ５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′および ５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′；または ５′−CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG−３′および ５′−GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA−３′； からなる群から選択される一対のプライマーを用いて増
    幅される、請求項３ないし５のいずれか一項に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】分析されるビタミンＤ受容体遺伝子の一部
    分が、ビタミンＤ受容体の可変部、またはBsm1、Apa1、
    EcoR V、およびTaq1切断部位の少なくとも一つと関連し
    た遺伝子領域を示す、請求項１ないし６のいずれか一項
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】プライマー対が、 ５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′および ５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′；または ５′−CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG−３′および ５′−GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA−３′； である、請求項３ないし７のいずれか一項に記載のポリ
    メラーゼチェーンリアクション法において使用するため
    のプライマー対。
  9. 【請求項９】骨粗鬆症の治療応答性を評価するために、
    ポリメラーゼチェーンリアクション法においてVDR遺伝
    子の対立遺伝子の変異に関連する一部分を増幅するため
    の、 ５′−CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA−３′および ５′−AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG−３′；または ５′−CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG−３′および ５′−GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA−３′； から選択されるプライマー対。
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