JPH08501933A - 作動因子における対立遺伝子の変動の評価 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高比率でおこる骨からの転向や、骨質量の減少の進行の要因および／または対抗、および治療様式への応答等に対する評価の遺伝的な試験方法を提供する。また、骨粗鬆症の予知ならびに予防または治療に対して起こり得る応答の評価に特異的に用いられるモデルであり、生理的設定値と、特定の病理形態学的状態に対する感受性または抵抗性とを決定する、転写制御因子における対立遺伝子型の変動の一般的なモデルでもある。

Description

【発明の詳細な説明】作動因子における対立遺伝子の変動の評価 発明の利用分野 本発明は、有害な病的変化を蒙る危険のある個人の同定手段としての、作動因 子における対立遺伝子の変動の同定方法に関する。本発明の方法は、特にビタミ ンＤ受容体遺伝子における対立遺伝子の変動の評価と、それによる骨密度を低下 または上昇させる病的素質の予知に有効である。更に、これらの変動は、異なる 治療方法に対する応答の予知とともに、長期にわたる骨粗鬆症の危険性の予知に も適用可能である。また、他の転写因子の遺伝子の変動による病理学的または生 理学的変異に対する病的素質の決定または対抗のモデルとしても影響し、その結 果、病気の危険性、および治療に対する応答の有する危険性が予知される。この ような転写の制御因子は、ステロイド／レチノイド／チロイドホルモン受容体の 遺伝子群のような、リガンドで活性化された遺伝子の制御因子であってもよいが 、それに限定されるものではない。発明の背景 ビタミンＤは、多くの組織中における細胞の分化、および複製という機能とと もに、骨、およびカルシウム代謝の有力な制御因子としての機能を有する。ビタ ミンＤは、高度に特異的なビタミンＤ受容体（１）を介して、ジヒドロキシ化さ れた代謝産物（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、またはカルシトリオール） として作用する。また、標的となる遺伝子の発現の制御におけるカルシトリオー ルの作用には、ここで作動する転写活性因子のタンパクが介在している。ビタミ ンＤ受容体遺伝子のクローニングは、それが、チロイドホルモン、およびビタミ ンＡ派生物（4，5）はもちろん、ステロイドホルモン（糖質コルチコイド、プロ ゲステロン、エストロゲン、アンドロゲン、および鉱質コルチコイド）の受容体 や、多くの自然な生理学的かつ進化的な過程の制御因子を含む、リガンドで活性 化された受容体の上科の一部であることを示している。遺伝子の発現に対するこ れら受容体タンパクの介在機構は、多くの研究の対象となっている。受容体の機 能を低下させ、ヒトや動物の主要な機能に混乱を生じさせるような、まれに起こ る明か な変異については、既に確認されている。例えば、ビタミンＤ受容体遺伝子の変 異はビタミンＤ抵抗性のくる病を引き起こし（6）、アンドロゲン受容体遺伝子 の変異は、アンドロゲンにおける感受性の欠如を引き起こす（7）ことが報じら れている。また、エストロゲン受容体遺伝子では、まれに自然発生する多型性が 、自発的流産の多くに関連している（8）。しかしながら、分子レベルの情報が 豊富であるにもかかわらず、受容体遺伝子における自然な対立遺伝子の変動が通 常の生理状態または病的状態におけるステロイドホルモンへの反応の多様性に対 しておよぼす潜在的な寄与については殆ど知られていない。 骨粗鬆症は、多大な治療費と、長時間にわたり影響する衰弱とを伴い、殆どの 西欧諸国の年配者の間で、健康上の主要な問題のひとつとなっている（Riggs ME JM）。発病した骨粗鬆症の治療はおよそ満足ゆくものではないため、予防が最善 の策となっている。骨粗鬆症の予防は、成人初期における骨密度最大値の増加と 、関連する年齢、および閉経後における骨の損失を最小に抑える点とが中心とな っている。双子および家族に対する研究から得られた証拠は、骨密度最大値には 強い遺伝的影響があり、かつそれが、ホルモン的因子、栄養、および生活習慣に より改良可能であることを示している（Kellyら、11）。また、双子に関する研 究では、軸方向または付随的な骨の密度は、一卵性双生児の方が二卵生双生児よ りもはるかによく一致していた。これらの研究の結果、骨密度の変動のうち全体 の約７５％が遺伝的要因によるものと計上され、かつこれについては、母娘によ る研究で確認された。本発明者らは、双子をモデルとして、この遺伝的影響の潜 在的な機構について分析し、この遺伝的影響が、骨の形成の指標であるオステオ カルシン（osteocalcin）のような、骨の転移の生化学的指標として確実に現れ ることを見いだした。更に、二卵生双生児では、オステオカルシン量の高さが骨 密度の低さと関連していた。本発明者らはまた、この遺伝的影響が、例えばプロ コラーゲンＩ型のｃ末端のプロペプチドのような、骨の形成に関する他の指標と 同程度に観察可能で、かつ例えばプロコラーゲンＩ型のＣ末端のテロペプチドの ような、骨の崩壊に関する他の指標よりも弱く観察可能であることを見いだした 。通常、骨の形成と崩壊とは密接に連関し、あるいは、双子における骨の転移の 生理学的 過程は、互いに「対」となっている。双子におけるこの多少驚くべき結果は、骨 の転移の指標としての骨の形成の指標から骨密度が予知され、かつ骨の転移の遺 伝的制御が、骨密度に強い遺伝的影響をおよぼす経路であることを示している。 双子における骨密度の代表的データは、一つの遺伝子または遺伝子群が、骨密度 の遺伝的影響に対応し得ることを示唆している。しかしながら、この影響が如何 に媒介されるか、また、どの遺伝子または遺伝子群が骨密度に影響するかは明か ではない。本発明者らは、制限されたある長さの断片の多型性を用いた最近の研 究において、ビタミンＤ受容体（VDR）のオステオカルシンを示す座位における 通常の対立遺伝子の変動が、年齢、性別、または閉経の有無と独立していること を明かにした。活性を有するホルモンとしてのビタミンＤ（１，２５ジヒドロキ シビタミンＤ）に対するビタミンＤ受容体遺伝子は、骨ならびに腸のカルシウム 吸収、骨の形成、骨再吸収細胞（オステロクラスト）の補充、および骨自体の吸 収等のカルシウム代謝はもちろん、パラチロイドホルモンの生産および腎臓での ビタミンＤ自身の活性化における重要かつ中心的な制御因子である。活性を有す るホルモンとしてのビタミンＤ受容体のあらゆる配列がこのような広い影響をお よぼし得るものと予想されるため、これら一般的なVDR遺伝子の対立遺伝子が骨 密度に対しておよぼす影響については、双子をモデルとして調査した。双子のモ デルでは、年齢や混乱の元となる様々な影響が、比較する組から排除される。 これらの研究は、VDR遺伝子中の一般的な対立遺伝子の変動から、骨密度の差 異が予知されるとともに、脊椎および股関節部の骨密度における遺伝的要因の５ ０〜７５％が計上されることを示している。 このことは、制御タンパクおよび／または構成タンパクをエンコードする遺伝 子の転写制御因子における遺伝子型の変動による、病気に対する感受性および治 療としての望ましい対応の決定に関連した、生理学的設定値および生理学的に異 常な状態となる傾向の決定の、明かな例であると思われる。 従って、本発明は、第一に、制御タンパクおよび／または構成タンパクをエン コードする遺伝子の転写制御因子における遺伝子型の変動の分析を含む、個人に おける生理学的に異常な状態の要因および／または、治療として望ましい対応の 評価方法からなっている。 本発明は、第二に、個人のビタミンＤ受容体遺伝子における対立遺伝子の変動 の分析を含む、個人における骨密度の高低の要因の予知方法からなっている。 ここで、本発明の望ましい実施例には、エンドヌクレアーゼによる消化を用い た、制限されたある長さの断片の多型性の分析が含まれる。 また、本発明の更に望ましい実施例では、エンドヌクレアーゼによる消化に先 立ち、ビタミンＤ受容体の一部分を、ポリメラーゼチェーンリアクション法を用 いて増幅させる。 更にまた、本発明の更に望ましい実施例では、エンドヌクレアーゼは、Bsml、 Apal、EcoRv、およびTaqlからなるグループより選択され、かつ最も望ましいエ ンドヌクレアーゼはBsmlである。 一方、本発明の他の望ましい実施例として、ビタミンＤ受容体の一部分は、以 下に示すグループから選択される一組のプライマーを用いて増幅される。 5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′ および、5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′ および、5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′ および、5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3′ 本発明の第二の側面には、ポリメラーゼチェーンリアクション法によるVDR遺 伝子の一部分の増幅に用いるための、表５に示すVDR遺伝子の配列から得られる プライマーの組が含まれる。このVDR遺伝子の一部には、表５に示すように、Bsm l、A pal、またはTaqlによる切断部位が少なくとも１箇所含まれる。 また、この側面に係る望ましい実施例では、このプライマーの組は以下の通り である。 5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′ および、5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′ または、5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′ および、5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3′ 骨粗鬆症および／または虚血性心臓病の危険性を測定するため、エストロゲン およびアンドロゲン受容体を含む他の作動因子における対立遺伝子の構成を評価 してもよい。アンドロゲン受容体における対立遺伝子の構成はまた、皮膚病の危 険性および治療に対する応答の評価にも使用可能である。糖質コルチコイド受容 体およびレチノイン酸受容体における対立遺伝子の構成を、骨粗鬆症の危険性の 評価のため測定してもよい。また、鉱質コルチコイド受容体における対立遺伝子 の構成を、高血圧の危険性の評価のため測定してもよく、原腫瘍形成遺伝子にお ける対立遺伝子の構成を、癌の危険性の評価のため測定してもよい。更に、組織 特異性制御因子の評価は、骨粗鬆症／癌の危険性の測定に使用可能である。 本発明の本質をよりよく理解するため、本発明の望ましい形態について、以下 の例および図とともに説明する。 図１は、ビタミンＤ受容体の変動による、双子の組における腰部のBMDの差異 を示すものである。 図２は、エキソン７からエキソン９の３′末端の非コード領域までのビタミン Ｄ受容体遺伝子のマップで、研究に使用した多型性の制限酵素結合位置およびRF LPによる同定に使用するためPCR法で増幅した断片が示されている。また、アス テ リスクは多型性部位を示し、かつアステリスクのない部分は不変部位を示す。 図３は、骨密度がVDRの遺伝子型により異なることを示すもので、対象は女性 である。データは、母集団の平均と標準誤差とで示され、また、p値は、各グル ープにて対をなす二者間における、ステューデントのt検定のためのものである 。 図４は、腰椎における骨密度への遺伝的な影響が男性でも現れていることを示 すものである。表示は図３と同様である。 図５は、遺伝子型に応じた、年齢と腰椎骨中における無機物密度（BMD）の退 行および破壊限界との関連を示すものである。 図６は、遺伝子型に応じた、年齢と大腿骨頚中における無機物密度の退行およ び破壊限界との関連を示すものである。 図７は、接合子およびVDR対立遺伝子の一致性に関する、双子の間における骨 密度の差異を示すものである。腰椎および大腿中心の骨密度は、MZおよびDZの双 子の組の骨密度における各組の示すパーセンテージの差異内に示され、かつDZの 双子の組におけるVDRの一致または不一致に応じて示されている。VDRの対立遺伝 子が一致するDZの双子では、あらゆる部位において、MZの双子との間で有意な差 がないのに対し、一致しないDZの双子では、それぞれの部位において、これらグ ループの双方と明かに異なっている（ANOVA）。DZのグループ全体とVDR対立遺伝 子の一致するグループの差異をMZの双子と比較すると、腰椎、骨頚、ワード三角 （Ward's triangle）、および大腿中心の転子部にて、それぞれ７５％，４８％ ，５９％、および９０％の遺伝的影響がVDR対立遺伝子により説明可能である。 一方、他の転写活性因子であるレチノイン酸受容体α（21q7）では、いかなる部 位でも△BMDを予知できなかった。 図８は、VDRの不一致の程度に関する、二卵性双生児間での骨密度の差異を示 す ものである。双子の間での骨密度の差異は、０−完全に一致するもの、１−対立 遺伝子が１つ不一致なもの、２−対立遺伝子がいずれも不一致なもの、の３グル ープに分けて記入されている。Ａ，Ｂ，Ｃ、およびＤの図は、それぞれ腰椎、大 腿骨頚、ワード三角、および転子部のVDR遺伝子における分析結果を示している 。この影響による回帰分析は、腰椎（p=0.0001）、ワード三角（p=0.006）、お よび転子部（p=0.034）にて有意な相関を示し、大腿骨頚（p=0.055）では不明確 であった。また、同胞対称分散法を用いたところ、それぞれの双子の組における 骨密度の差の平方（△²）と、腰椎、大腿骨頚、およびワード三角のVDR遺伝子の 一致性とは有意な相関を示す一方、大腿中心の転子部では不明確であった。 腰椎△² ＝0.015+0.138 *不一致度（r=0.43,p=0.001） 大腿骨頚△² ＝0.015+0.016 *不一致度（r=0.29,p=0.034） ワード三角△²＝0.017+0.026 *不一致度（r=0.34,p=0.01） 転子部△² ＝0.015+0.015 *不一致度（r=0.27,p=0.05） 図９は、骨中における無機物密度の高さと、VDR遺伝子との関連を示すもので ある。 Ａ．Bsm-1対立遺伝子が不一致な二卵性双生児（ｎ＝２２）における、腰椎骨 の無機物密度を遺伝子型に従ってプロットし、双子の組における骨の無機物密度 の値を線で結んだ。２２組のうち２１組では、（b）で示す対立遺伝子が多く存 在する程高い骨質量を示した（白丸）が、１組は逆の傾向を示した（黒丸）。 Ｂ．閉経前の無関係な女性の腰椎骨の無機物密度をVDR対立遺伝子に対応させ たものである。個々のMZおよびDZの双子の組から一人を選び、かつグループ毎の 被件者の数は図示の通りである。図より、遺伝子型がBBであるグループではBMD が低い一方、遺伝子型がbbでグループではBMDが高いことが明かである。この影 響の大きさは、各部位における骨密度の標準偏差が、年齢に応じた人数に対応し て、約0.11gm／cm²となることからも確認できる。ここで、平均±標準誤差の値 を図にプ ロットし、かつ各グループ間の差異の有意性はANOVAにより算出した。また、各 組間の比較は、組に依らないステューデントの検定により行った。なお、異なる グループにおける年齢、身長、および体重による比較では、有意な差はなかった 。 図１０は、異なる遺伝子型を有する個人に対するカルシトリオール処方の結果 を示すものである。調査１ 方法 本研究には、骨密度の疫学適研究のため募集した２８８名の被験者が含まれて いる。全被験者は、緯度が南緯３３゜５２′で、日光の照射が多いシドニー都市 圏内から募集し、コーカサス−英−オーストラリア系（英国およびアイルランド を遠縁とする）の９１名の被験者から、３つのエンドヌクレアーゼに対し制限さ れたある長さの断片の多型性（RFLP）のデータとともに、血清中のオステオカル シンのデータを得た。また、骨疾患を起こすか、オステオカルシン量を増加させ ることが知られている治療を受けた被験者はおらず、かつ全被験者が、コーカサ ス系で、腎機能も正常であることを、血清クレアチニンを用いて測定した。 血清は、一晩絶食後の翌朝採取し、かつ静脈穿剌前の被験者へのカルシトリオ ール投与は行っていない。血清中のオステオカルシンは、ウサギの抗ヒツジオス テオカルシンに基づく内部放射免疫検定により測定した（11）。この検定におけ る通常のオステオカルシン量は、精製したヒツジオステオカルシンを用いた場合 、３〜１８ng／mlであった。オステオカルシン測定は最初に独立して行い、RFLP 分析の結果とともに、コード化して保存した。 ＤＮＡ分析 RFLPの同定に用いるプローブには、ビタミンＤ受容体cDNAの、全コード化領域 を含むがmRNAの３′側の未翻訳部分を欠く、２．１kbの断片を用いた。血液から のDNA抽出およびサザンブロティングには常法を用い、制限酵素には、Pharmacia -LKBおよびNew-England Biolabs製のものを、その取扱説明書に基づき用いた。 統計的方法 RFLPマーカーの相対的結合は、分割表およびＸ²検定を用いた棄却検定の自由 な組み合せの偏差から、統計的に評価した。また、分散の解析（ANOVA）には、S tatview+graphics統計用パッケージ（Abacus Concepts製、カリフオルニア州バ ークレー）を、Macintosh SE／30コンピュータにて起動させ使用した。RFLPと血 清オステオカルシンとの関係の評価には、Fisherの保護最小有意差（PLSD）検定 を用いた。有意水準の見積りは、あらゆる影響の棄却検定に対する最初のF検定 （平均に差がない）および個々の類別（RFLP）クラスにおける連続的な変化の平 均の、各組の間における比較の信頼水準のために行った。 個々のRFLPマーカーは、ANOVAにおける連続的な可変物（オステオカルシン） に対する類別クラス（RFLP）の比較により、それぞれオステオカルシン血清の濃 度の連携しているものと考えられる。オステオカルシンの値（ng／ml）は通常分 別できないが、非母数解析を用いることにより、ln（l⁺オステオカルシン）とし て対数に変換可能である。結果 ビタミンＤ受容体のcDNAをプローブとして用い、未だ報告されていない２つの よくあるタイプのRFLP（Bsm IとEcoRVにより同定された）を発見し、かつ既に知 られているRFLPを、Apa Iにより同定した（18）。このRFLPは、Aa（Apa I）、Bb （Bsm I）、およびEe（EcoRV）としてコードされている。ここで、大文字は部位 の欠失を示し、小文字は部位の存在を示す。また、RFLPのメンデル遺伝学的本質 は、同様の研究により確認されている（データ未掲載）。表１は、本研究と無関 係な任意抽出による２６６名の志願者における、これらのRFLPの頻度を示すもの である。１８２名の遺伝子型が、これらのRFLPを全て有すると評価された（表２ ） が、これらは強度の連関性の証拠であり、かつこの位置における連鎖の不均衡を 示している。これらのRFLPは、AAとBB、およびEEにおいて、それぞれ８３％およ び９２％という頻度で強く連関し、また、これに応じて、aaとbb、およびeeとは 、それぞれ６１％および７２％という頻度で連関している。これら一連の機能的 解析結果はハプロタイプによるものではないが、可能性のある８つのハプロタイ プのうちの２つが、被験者のうち53.2％で必要とされている。この明かな同種接 合体から、a、b、e、およびA、B、Eが、最も高頻度となる可能性を有するハプロ タイプとして示されている（表２）。 注：オステオカルシン値は、コーカサス−英−オーストラリア系（英国およびア イルランドを遠縁とする）の９１名の被験者から、有益な３つのRFLPについて分 析した。オステオカルシン値は通常分別できないため、統計的解析に先立ち対数 に変換した。メジアンは、血清中のオステオカルシン値のメジアン、平均は、対 数変換値（ln(l⁺オステオカルシン)）の平均、SDは標準偏差、SEは平均の標準誤 差である。また、Sig.は、同型接合体の平均値の間（Sig.1）および同型接合体 （RFLP部位にはない）と異種接合体との間（Sig.2）についての有意性（このよ うな変化が偶発する可能性）、p値は、あらゆる結果にわたるF検定のためのもの である。 PFLPと血清との関係 ９１名の正常な被験者のオステオカルシンを、血清中のオステオカルシンのデ ータに基づき解析した（表３）。また、被験者の年齢、性別、および閉経の有無 に関する分散を表４に示した。年齢は、いずれのRFLPの遺伝子型に対しても大き な影響をおよぼしていない。一方、Bsm I BBグループは、Bsm I bbグループに比 べ有意に高い（p=0.0001）オステオカルシン値を示している。同様の影響は他の RFLPでもあり、Apa I対立遺伝子系では有意のp値（AA対aa、p＜0.0025）を、Eco RV対立RFLPではより弱いp値（EE対ee、p＝0.015）を示している。また、これら ３つのRFLPの全てにおいて、BB：16.8ng／ml、Bb：8.9ng／ml、bb：8.8ng／ml（ メジアン）等、制限部位の対立遺伝子（A，B，E）の欠失は高いオステオカルシ ン値に連動し、制限部位の対立遺伝子（a，b，e）の存在は低いオステオカルシ ン値に連動している。なお、未処理のオステオカルシン値に対する非母数統計解 析（Kruskal-Wallis）からは、Apa I：p=0.0016、Bsm I：p=0.0001、EcoRV：0.0 044と、本質的にANOVAと同様の結果が得られている。 Bsm IおよびApa I RFLPが最も予知可能なため、被験者を、これら対立遺伝子 の９つの組み合せに従い細分した。その結果、血清のオステオカルシン値は、遺 伝 子型に応じて明確に分離された（図１）。EcoRVマーカーの連関が弱いことは他 のマーカーとの不均衡さから確定していたため、EE遺伝子型におけるBsm Iおよ びApa I対立遺伝子の分配ならびに被験者のオステオカルシン値について調査し た（図２）。また、Bsm Iマーカーは専ら推論によるハプロタイプおよび連関す るオステオカルシン値（p=0.003）を支配している。 血清のオステオカルシン値による遺伝子型の予知は、男（ｎ＝１４）を除くと Bsm IおよびApa Iにより維持される（全ての結果をANOVAにより評価した場合、B sm I：p=0.0001、Apa I：p=0.0034）。閉経状態は、オステオカルシン値の増加 と連関し、かつ閉経後の早期には、広範なオステオカルシン値が観察された（１ ９〜２１）。そのため、閉経状態の役割を、年齢、閉経の有無、およびBsm I遺 伝子型を含む共分散多重回帰解析により評価した。すなわち、閉経状態は、血清 中のオステオカルシン濃度の決定にBsm Iの多型性より弱く関与する（r=-0.44、 p<0.001）。また、これら２つの因子のANOVAは同様の結果を示した（Bsm I：p=0 .0002、閉経状態：p=0.24）。閉経前および閉経後の女性のデータを別々に解析 したところ異なる結果が得られ、かつ遺伝子型は閉経状態よりも強く予知に関与 した（図１）。調査２ 材料および方法 被験者 被験社は互いに無関係な５３５名のボランティア（４４７名の女性と８８名の 男性）で、骨密度への遺伝的影響を調査し記録した。被験者はシドニー都市圏内 から媒体を通じて募集したもので、その平均年齢は女性で５１．４±１３．８歳 （平均±SD、範囲は２０〜８４歳）、男性で４０．６±１６．０歳（範囲は２０ 〜７９歳）であった。また、被験者はいずれもコーカサス−英−オーストラリア 系（英国およびアイルランドを遠縁とする）であった。閉経状態は、高いFSHお よびLH量と低いエストラジオール量、ならびに少なくとも過去１２年にわたる生 理 の欠如から確認した。被験者のうち、骨疾患の経験、疾患、および父母両系にわ たる卵巣除去または薬物使用が有るもの（ホルモン置換療法を含む）は、骨密度 の変化を起こしやすいため調査から除外した。骨無機質密度の分析 骨無機質密度（BMD）は、面積当りの密度（g／cm²）で表し、腰椎（Ｌ２〜４ ）および骨頚について、既に述べられている通り（Pocockら、1987）、二重光子 吸収法または二重エネルギーｘ線吸収法（それぞれLunar DP-3またはDEXA、Luna r Radiation NCo．製、ウィスコンシン州マディソン）にて測定した。DNA解析：PCR（ポリメラーゼチェーンリアクション）およびエンドヌクレアーゼ 消化によるRFLP解析 集めた血液をヘパリン処理した試験管内に入れ、臨床遠心分離機を用い、生理 食塩水中における沈降により白血球を分離した。精製した白血球は、白血球溶解 バッファ（１０mMのトリス塩酸（pH7.4）、生理食塩水、および0.5%W/Vのソジウ ム硫酸ナトリウム（SDS））中に溶解した。溶解液は５０ug／mlのタンパクキナ ーゼＫ（Applied Bioscience製、パロ・アルト、米国）とともに６５℃で２時間 処理した。更に、Naniatisらの抽出法に従いフェノール−クロロホルム溶液で繰 り返しDNAを抽出し、エタノールで沈澱させた。このDNAをTEバッファ（１０mMの トリス塩酸、１mMのEDTA（pH8.0））に再溶解し、２６０nmにおける紫外線吸光 度から定量した。 更に、エキソン７から ３′側の未翻訳部分までのビタミンＤ受容体遺伝子を シークエンスした。この配列を表５に示す。 上部鎖の下線が引かれたプライマーは前向きのプライマー、下部鎖のそれは逆 向きのプライマーである。 これらのプライマー、これらのプライマーに基づくプライマー、および周辺の 配列の対をなす組み合せは、いずれもポリメラーゼチェーンリアクションにより 増幅可能である。 VDR遺伝子の３′側方部を増幅させるため、４つのオリゴヌクレオチドプライ マーを合成した。Bsml結合部位の同定は、８２５塩基対の断片を形成させるエキ ソン７（5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′） および他のイントロン８（5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′） 内で開始される一つのプライマーで、その部位がまたがる部分を増幅することに より促進させた。また、ApaIおよびTaqI結合部位の同定は、７４０塩基対の断片 を形成させるイントロン８（5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′）および他のエキ ソン９（5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3′） を用いた一つのプライマーで１回増幅を行うことにより促進させた（図２）。 PCRには、２００ngのゲノムDNA、２０pmolの各プライマー、２００uMのdNTP、 ５０mMの塩化カリウム、１０mMのトリス（pH8.3）、１．５mMの塩化マグネシウ ム、およびIUのTaqDNAポリメラーゼ（東洋紡製、大阪）を含む２０ulの試料を用 いた。そして、個々の試料を、以下に示す３７回の増幅ステップに供した。すな わち、ステップ１：９４℃３分、６２℃１分、７２℃２分、ステップ２〜６：９ ４℃２０秒、６２℃１分、７２℃１分、ステップ７〜３６：それぞれ５秒、５秒 、３０秒、である。増幅には、あらゆる熱サイクル装置を効果的に用いるとよい 。PCR法の産物は１０ulずつ等分した後、６５℃にて５ユニットのBsml（New Eng land Biolabs.米国マサチューセッツ州）、３７℃にてApal、または６５℃にてT aql^*（Promega Co.オーストラリア）の各エンドヌクレアーゼにより１時間消化 させた。ここで、無関係な遺伝子のクローンは、BsmlおよびApalによる消化のた めの分子内制御に使用され、また、Taqlによる消化に際しては、PCR産物自身に おける不変のTaql結合部位が分子内制御に使用された。次いで、消化後のPCR産 物を、0.5ug／mlの臭化エチジウム、0.09Mのトリスホウ酸塩、および0.002MのED TAを含む1.2％（BsmlおよびApal）または2.0％（Taql）のアガロースゲル（pH8. 3）を用い、１００Vで１時間分離した。アガロースゲル用の分子量の基準には、 Eco RIで消化されたSPPlマーカー（Bresatec Limited、アデレード、オーストラ リア）を用いた。配列の多型性を見いだすにあたっては、関連する結合部位の配 列のための他の制限酵素が利用可能であった。例えば、Bsml結合部位には不変の Stu I結合部位 （B対立遺伝子はAGGCCTGCGCATTCCC、b対立遺伝子では下線のGがAになる。）が隣 接しているが、この配列の変化は、Aosl、Fspl、Mstl、Fdil、Hinpl、Hhal、お よびそれらのアイソチジマーにより検出可能である。多型性を有するApal結合部 位の配列は、隣接するPvu2結合部位（A対立遺伝子はGAGGGGCCCAGCTG、a対立遺伝 子では下線のGがTになる。）内で終わっている。Gの存在は、Ban2、Aoc2、Pssl 、Pall、Hae3、Cfr3I、Asul、Sau96I、Eco0109I、Dra2、およびそれらのアイソ チジマーにより検出可能である。Banlおよびそのアイソチジマーに対する多型性 は、Tの存在によるものである。Taql多型性の配列は、不変のHbalからHae3結合 部位にわたって延び、そのT対立遺伝子はGCGCTGATTGAGGCC（t対立遺伝子では下 線のTがCになる。）である。この多型性はMbol、Sau3A、Dpnl、およびそれらの アイソチジマーにより検出可能である。 Taql^*RFLP：血清中のオステオカルシン濃度を予知するビタミンＤ受容体中の ＢsmlおよびApalRFLPについては既に述べた。これらの多型性部位は、ゲノムDNA のエキソン７から３′側の未翻訳部分（３′-UTR）までの間に位置している。こ れら２つの通常のビタミンＤ受容体の対立遺伝子（ABおよびab）間の差異を特性 付けるため、本発明者らは、この遺伝子型における同種接合体AABB、aabbを含む 配列を形成し、１５のコード化されていない差異を含む多くの配列の差異を同定 した。エキソン９のコード化領域における似たような差異、すなわちイソロイシ ンコドンのTとCの差異（ATTもATCもイソロイシンコドンである。）もあった。統計的解析 分散の解析（ANOVA）は、Statview+graphics統計用パッケージ（Abacus Conce pts製、カリフォルニア州バークレー）を、Macintosh SE／30コンピュータにて 起動させ使用した。RFLPとBMD、身長、および体重との関係の評価には、Fisher の保護最小有意差（PLSD）検定を用いた。有意水準の見積りは、あらゆる影響の 棄却検定に対する最初のF検定（平均に差がない）および個々の類別（RFLP）ク ラスにおける連続的な変化の平均の、各組の間における比較の信頼水準のために 行った。組の間における比較は、ステューデントのt検定により行った。また、 連続的と絶 対的な変化の関係は、多重解析により評価し、RFLPマーカー間の関係は、分割表 およびカイ²分布により評価した。結果 ５３５名の被験者におけるRFLPの分布を表６に示す。これらのRFLPは、Bb（Bs ml）、Aa（Apal）、Tt（Taql）によりコードされ、大文字は結合部位の欠失を、 小文字は結合部位の存在をそれぞれ表している。BsmlおよびApa1RFLPの分布（表 １）も上記と同様の結果を示している。また、RFLPは高い連携性を有している。 （表７）すなわち、AA遺伝子型の分布は、BBおよびttとそれぞれ92.7％および95 .3％という高頻度で連関しているのに対し、aaは、bbおよびttとそれぞれ61.6％ および65.3％という頻度で連関している。BsmlとTaq1RFLPの比較では、tt、Tt、 およびTT遺伝子型は、BB、Bb、およびbbと、それぞれ95.5％、95.1％および96.4 ％という高頻度で連関し分布している。BsmlとTaqlが密接に連関するというこの 結果から、以下の記述ではTaqlとBsmlとを同等とみなし、Bsmlの結果についての み言及する。 腰椎（LS）および骨頚（FN）におけるRFLPとBMDとの関係について、５３５名 の被験者について調査した。この被験者の年齢、身長、体重、および閉経の有無 の分布を表８に示す。年齢、身長、および体重は、RFLP遺伝子型と有意な関連を 示さない（表９）。また、女性の場合、BBおよびAAグループのLS BMDの平均は9. 9％（1.107対1.118）および8.6％（1.049対1.139）で、いずれもbbおよびaaグル ープより低く、BBおよびAAグループのFN BMDの平均も、5.6％および5.3％と、い ずれもbbおよびaaグループより低かった。異種配偶子を有する対立遺伝子が支配 的であることもまた観察された（図３）。すなわち、より低いLSおよびFN BMDが 、いずれも制限部位の対立遺伝子（BA）と関連していた。LSおよびFNのBBAA遺伝 子型とbbaa遺伝子型におけるBMDの平均の差（それぞれ13.4％および7.8％）は、 BBとbbまたはAAとaaとの間におけるそれよりも大きかった（表９）。 表７：RFLPマーカーの連関の程度 Bsm-1遺伝子型とAPa-1およびTaq1遺伝子型との連関を表示した。ｎは被験者数 を、カイ２乗およびｐ値は関連のないマーカー間における棄却検定による排除を 反 映している。 表８：被験者の成員構成 性別等 男性 女性 閉経前 閉経後 閉経後の平均年数±SEM 数 88 447 185 262 11.3±0.07 総被験者の身体的平均値（±SEM） 年齢（歳） 49.6+0.6 身長（cm） 163.8+0.4 体重（kg） 64.8+0.5 注：nは被験者数を、pは、ANOVAから得られた変数の遺伝子型に対する影響を示 す。全てのp値が、異なる遺伝子型における平均値が有意の差を有していないこ とを示している。 遺伝子型の影響は、女性の場合、年齢（歳）、閉経の有無（閉経後の平均年数 ；YPM）、身長（cm）、体重（kg）、およびBsml遺伝子型（BB=1、Bb=2、bb=3） を含む共分散の多重回帰により評価し、等化した。ここで、 LS BMD（g／cm²）＝0.419＋0.054・Bsm遺伝子型−0.004・年齢−0.994・YPM＋0. 02・体重＋0.004・身長（n＝４２５）、r＝0.58、p＝0.34 Bsml 年齢 YPM 体重 身長 p値 0.0001 0.0013 0.0001 0.0045 0.003 Fの評点 24.9 16.0 10.4 8.2 8.9 FN BMD（g／cm²）＝0.456＋0.025・Bsm遺伝子型−0.004・年齢−0.004・YPM＋0. 04・体重＋0.02・身長（n＝４２５）、r＝0.68、p＝0.47 Bsml 年齢 YPM 体重 身長 p値 0.002 0.0001 0.0004 0.0001 0.022 Fの評点 9.6 41.7 12.8 35.2 5.3 であった。女性の場合、腰椎および骨頚におけるBMDはいずれも年齢および閉経 の有無と弱く関連し、かつLSおよびFNにて、Bsml RFPはBMDと独立して関連して いた。男性の場合の結果を以下に示す。 LS BMD（g／cm²）＝1.039+0.058・Bsm遺伝子型（n＝８５）、r＝0.22、RS＝0.05 、p＝0.038、Fの評点＝4.9 FN BMD（g／cm²）＝1.046-0.003・年齢（n＝８５）、r＝0.132、R2＝0.10、p＝0 .017、Fの評点＝5.9破壊限界への到達 骨粗鬆症による破壊の危険性を増加させるまで低下した腰椎のBMDの値は、ア ーストラリアDubbo市における断面の調査の結果から得た。この値は0.97gm／cm² で、アメリカ人における破壊限界の値と類似していた。もし、遺伝子型がBMDお よびその後の骨粗鬆症の可能性に影響しているならば、骨質量の変化および破壊 限界に到達する年齢の差異が遺伝子型と関連して現れるはずである。図５は、女 性の場合において、BB、Bb、およびbbの各遺伝子型でLS BMDの低下を示す線が、 破壊限界の値と交差する年齢を示す図である。BBとbbでは到達までに１０年の差 があり（60.3歳と71.1歳）、かつBb異型遺伝子では中間的な値（68.1歳）を示し た。破壊限界を0.7gm／cm²とした骨頚の場合でも、同様の結果が得られた（BB； ６６歳、Bb；７０歳、bb；７４歳）。調査 ３ 通常のVDR対立遺伝子の骨密度に対する影響を双子をモデルとして調査した。 双子では、年齢や混乱の元となる様々な影響が排除される。７５のMZと５５のDZ からなる２５０名のコーカソイドの双子（双子７組の男性MZ双子および６組の男 性DZ双子を含む。）について調査を行った。被験者の年齢は１７歳から７０歳に わたり、平均年齢はMZでは４５±１３歳、DZでは４４±１１歳（平均±SD）であ った。BMDは、腰椎および骨頚について、既に述べられている通り（Pocockら、1 987）、二重光子吸収法または二重エネルギーｘ線吸収法（それぞれLunar DP-3 またはDEXA、Lunar Radiation NCo.製、ウィスコンシン州マディソン）にて測定 した。女性の双子間における閉経の有無は全員等しく、閉経後の場合、その年数 も等しかった。 骨の変動のマーカーとして既に示した、Bsm-1、Apa-1、およびEcoRV結合部位 として多型性を有する部位のVDR遺伝子をシークエンスした。これらの部位は、 エキソン７から３′-UTRまでの間に位置している。コード化領域または潜在的ス プライシング部位には多型性部位はなく、また、イントロン８のGがAに置換され た、情報量に富んだBsm-1結合部位を有していた。そして、これが、最も通常の ２つうの対立遺伝子のコード化領域における唯一の相違点であった。エキソン９ のTの代わりにCが含まれ、ATTがATCに変わる場合もあるが、エンコードされるア ミノ酸（イソロイシン）は変化しない。Bsm-1結合部位の側方のDNA配列は、被験 者の遺伝子型決定を容易化するための、エキソン７からエキソン９まで2.1〜2.2 kbの断片を増幅させる、ポリメラーゼチェーンリアクションに基づく方法に用い た。白血球DNAのPCR増幅は、Bsm-1 （New England Biolabs Inc. Gene Search、 ブリスベーン、オーストラリア）によるエンドヌクレアーゼ消化の前に、Corbet t FTS-1サーマルシークエンサー（Corbett Research、Mortlake NSW、オーストラ リア）を用い、 5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′ および、5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′ をプライマーとして行った。Bsm-1結合部位の存在により、８２５塩基対の生産 物が６５０塩基対および１７５塩基対の断片に分断された。また、Bsm-1による 消化と平行して、１個のBsm-1結合部位を有する4.7kbのプラスミドを、部分的な 消化による対立遺伝子の指示ミスを避けるための内部制御に用いた。 双子を用いた調査結果から、腰椎および大腿中心における組内のBMDの差異（ △BMD％）に対する対立遺伝子の変動の影響を、DZ双子について検討した（図７ ）。いずれの部位でも、VDRの対立遺伝子が一致するものの方が、不一致なもの より有意に低い値を示した。一方、MZ双子における腰椎の△BMD％とVDR対立遺伝 子が一致するDZ双子の場合とは有意な差を示さず、いずれも、対立遺伝子が不一 致なDZ双子の場合と有意な差（p＜0.0001）を示した。また、大腿中心の場合に は、環境的影響が大きいこともあり、類似ではあるがより弱い影響を示した。閉 経前の双子における制限もこの結果を覆すものではなかった。身長および体重等 の形質による結果のばらつきを制御すると、VDR遺伝子型は、腰椎（p=0.0002） および転子部（p=0.02）では最も強い予知因子であるが、大腿中心の首部ではそ うではない。上記のような骨の変化の指標としてのBsm-1対立遺伝子の支配的な 影響という観点から、本発明者らは、遺伝子型における差異の程度と双子の組に おける特徴の差異との間のほぼ一定の関係が、骨質量の特徴に支配的な影響をお よぼしているものと予想した。血縁間における連鎖の解析によれば、ある特徴の 差の２乗と、血縁関係のある双子における相同遺伝子の比率との間の有意な相関 は、遺伝的な連鎖を示し、かつVDR対立遺伝子は、腰椎および大腿中心の殆どの 部分で支配的であった。△BMDをＶＤＲ対立遺伝子における一致の程度と比較す ると、不一致な双子では、1.5〜2.5倍の値を示した（図７および８参照）。また 、ＶＤＲ対立遺伝子が不一致な２２組の双子のうち２１組では、b対立遺伝子が 骨密度の高さに関連していた（図９Ａ）。更に、閉経前の女性では（MZおよびDZ の双子の組から１名ずつ無作為に選択した。）、bb対立遺伝子が骨密度の高さに 関連する一方、BB対立遺伝子が骨密度の低さに関連し、対立遺伝子の支配的影響 が明かであった（図９Ｂ）。 これらのデータは、VDR対立遺伝子の差異が、通常の個人の集団における骨密 度の比率の主要な差異を表すことを証明している。BB、AA、EE、および／または ttの各VDR遺伝子型は、男女双方で骨密度の低さに関連している。従って、VDR遺 伝子のRFLP遺伝子型は、骨における変化の増加および骨密度の低下傾向や、男女 双方における、骨密度最大値および以後の骨質量の生理的変動を予知する際に有 効である。一方、骨密度や骨の変化に対する遺伝的影響の機構はいまだ明かでは ない。しかしながら、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、VDR遺伝子のプロ モーター中のビタミンＤ応答要素を経てオステオカルシン合成の促進因子として 作用している（Morrison 1989 Science）。本発明者らは、VDR遺伝子における通 常の対立遺伝子の変動が血清中のオステオカルシン量の差異に関連し、かつこれ らのVDR遺伝子における対立遺伝子の変動から、二卵生双生児における骨密度の 差異が予知できることを示した。 すなわち、これらVDR遺伝子のRFLPは、男女双方において骨質量の生理的変動 のマーカーであり、かつ本発明者らは、Bsm1RFLPが、LSとFNにおいて、BMDに対 し独立した相関を有することを見いだした。 表１０：双子の年齢および閉経後の年（YSM） Ａ．VDR遺伝子の対立遺伝子が一致または不一致なDZ双子 Ｂ．被験者におけるVDR遺伝子の対立遺伝子の差異 数値は全て平均±SD 図１１Ａ：一卵性および二卵性双生児の間、およびビタミンＤ受容体遺伝子型の 一致と不一致とで分けた二卵性双生児の間における相関の程度 注： p；相関の程度が有意の差異を有するかを判定するためのｐ値。双子のモ デルの場合、rMZとrDZとの間の有意な差異が、係る特徴に対する遺伝的影響の証 拠となる。本発明者らによる、DZ双子における、双子間で同一のVDR遺伝子型を 持つもの（DZ一致）と双子間で異なるVDR遺伝子型を持つもの（DZ不一致）との 比較では、rDZ一致とrDZ不一致との間における有意に異なる相関は、係る特徴に 対するVDR遺伝子の遺伝的影響の貢献を支持している。 表１１Ｂ：接合子およびビタミンＤ受容体遺伝子の対立遺伝子の不一致の程度に 応じた、双子の組における骨無機質密度の比率の差異 数値は全て平均±sem 同種配偶子であるBBAAまたはAAtt遺伝子型が低い骨密度と関連し、かつBBAA配 偶子を有するLSおよびFNにおけるBMDの平均値は、約１２％および８％とbbaa遺 伝子型に比べ男女双方で低くなっていることは重要な点である。また、これらの 遺伝子型の差異は以後の生活に重要である、というのは、この差異が１０年間に わたる破壊限界の差異を表しているからである。これらの対立遺伝子の差異は、 双子の研究で観察される骨質量への遺伝的影響の機構を示し、かつ低骨質量に係 る対立遺伝子の有無の遺伝的検知方法を提供する。すなわち、ビタミンＤ受容体 の 遺伝子型の同定は、重要な骨質量の測定法として、骨粗鬆症の予防および治療に 新たな路を開くものである。異なった遺伝子型に応じた処理上の差異の説明 以上のデータには、上記したVDR対立遺伝子が異なる機能を有することが示さ れている。従って、異なる遺伝子型を有する個人では、カルシトリオールおよび ／またはその類似体に対して異なる応答を示すと予想される。このことを、Bsm 1遺伝子型にそれぞれ同型配偶子（BBおよびbb）を有する１０名の若い女性にカ ルシトリオールを投与し、それに対する応答を、骨カルシウム代謝に係る３つの マーカー、すなわちオステオカルシン、パラチロイドホルモン（PTH）、および 尿中カルシウムを用いて分析することにより確認した（図１０参照）。 BBとbbのグループとでは、基礎的な血清オステオカルシン値が異なり（p＜0.0 1）、対立遺伝子がBBであるものでは、やはりオステオカルシン値が高かった。 カルシトリオールの投与後における、基礎的な値からの増加率はbbのグループの 方が高く、BBのグループにおける増加率は相対的に低かったが、基礎的なオステ オカルシン量が多いため、総反応量はBBのグループの方が多くなった。 パラチロイドホルモンはカルシトリオールにより抑制されることが知られてい るが、カルシトリオールによる抑制の程度は、遺伝子型により明かに異なった。 すなわち、パラチロイドホルモンによる抑制力は、BBのグループでは弱いがbbの グループでは強かった。これは、カルシトリオールの投与に対するPTHの応答が 明かに異なることを示している。調査期間中における尿中の総カルシウム排出量 （グラフの下側）はBBのグループの方が明かにbbのグループより多い。これは、 遺伝子型に応じて、カルシウムの運用が異なることを示している。また、カルシ トリオール処理に伴う抑制によるパラチロイドホルモンの減少が、尿中における カルシウム排出量の増加と対をなしていることから、骨中カルシウムの流動と両 立可能な、異なるカルシウム代謝機構の存在が示唆される。VDRおよび他の特性 ビタミンＤ受容体およびビタミンＤ内分泌系は、他の様々な病的および生理的 状況に影響している。そして、ビタミンＤ受容体遺伝子におけるこのような差異 を、内性または外性のカルシトリオールに対する異なった応答およびビタミンＤ 類似体を用いた治療への誘導のみならず、重要な成分の制御にカルシトリオール が影響する他の疾患を受容し得るまで発達させることも可能である。ビタミンＤ 内分泌系を内部に備える状況または疾患の公知の例には、エイズウイルス（HIV- I）の複製、胸部ガン細胞の増殖、結腸ガン細胞の成長、ケラチン生成細胞の分 化、乾蘚細胞の複製および作用、精子形成、黒色腫および他のガン細胞等がある 。 すなわち、ここに記載したように、本発明の結果、VDR中の機能的に異なる対 立遺伝子が、その感受性、発展性、予防能力、および種々の処置における治療能 力により、ビタミンＤ受容体およびビタミンＤ内分泌系により制御されている状 況または病気に影響をおよぼし得ることは明かである。また、ここに記載したも のはビタミンＤ内分泌系に影響される病的および生理的状況の例であり、ビタミ ンＤ内分泌系に影響される他の病的および生理的状況を排除するものではない。 ここに記載したデータから、Walters M（「ビタミンＤ内分泌系の新たに同定さ れた作用」、Endocrine Reviews 13,719-764）により最近著されたような、更に はそこで述べられている論文中に掲載されているような、ビタミンＤ内分泌系に 影響されることが知られているあらゆる病的および生理的状況を、ここに記載の 方法により評価および調査可能なことは明かである。しかも、これらはビタミン Ｄ受容体の遺伝子型に影響されるため、個人の遺伝子型が、ビタミンＤ受容体お よびビタミンＤ内分泌系を含むあらゆる病的および生理的状況に対する感受性、 発展性、予防能力、および処置に重要であることもまた明かである。 これらのデータでは、その生理的機構に係わりなく、骨密度の制御に関連する 遺伝子が当初から同定されていた。重要なのは、その影響の大きさが、骨密度に 対する強い遺伝的影響の主な要因として説明されることであって、実際のところ 、骨密度にて補正された母集団の変動のうち半分以上がそれに依っている。これ ら の発見は、骨粗鬆症の危険性の増加に対するより早期の干渉を可能とし、かつ骨 密度における母集団の広い分散の機構に対する重要な洞察を提供するとともに、 特異的な対象物に対する新たな治療法への路を開くものである。また、この１個 の遺伝子の多面発現活性は、これまで複雑かつ分断された遺伝子の制御によると みなされていた、多くの病理形態学的過程のモデルの一つでもある。 この研究では、自然に存在する作動因子および転写活性因子の対立遺伝子の機 能付けについて、対象となる遺伝子の形成と相関させて述べた。また、この受容 体対立遺伝子の差異が、対象となる器官（例えば骨密度）の主要な差異に関連す ることをデータとして示した。この方法による遺伝的分析は、リガンドで活性化 された受容体の上科の遺伝子中における自然な対立遺伝子の変動の機能的重要性 に対する研究の模範を示すものであり、ステロイドホルモン内分泌系のより完全 な理解に重要な貢献をなし得るものである。更に、この方法は、あらゆる種類の 作動的制御因子の対立遺伝子に適用可能である。 制御タンパクおよび／または構造タンパクをエンコードする遺伝子の転写制御 因子における遺伝子型の変動は、病気に対する感受性と、治療に対して起こり得 る応答の測定とに影響する生理的設定値および病理形態学的状態を決定する。こ れらの遺伝子型の変動は、病気の予防および治療に際しての、病気の危険性の測 定および治療法の選択のための一般的なモデルとして使用される。 このモデルの特異的な例として、ビタミンＤ受容体遺伝子における対立遺伝子 の変動による、骨の変化、骨質量、および環境的要因への感受性の決定がある。 これらの変動は、骨粗鬆症の進行の危険性に対するマーカーであり、種々の治療 に対して起こり得る応答を示唆するものである。 本発明者らは、機能的に異なるビタミンＤ受容体の対立遺伝子を定義するRFLP マーカーを同定した。ここで述べたRFLPとは、遺伝的現象と連鎖した物理的マー カーであるが、今回定義されたマーカーとの連鎖の範囲に依存した、他のあらゆ るRFLP）物理的マーカー、多型性配列、または、今回定義されたマーカーに連関 し、ビタミンＤ受容体遺伝子または側方のDNA内で認められた遺伝的影響によっ ても、上記したマーカーと同様の情報が提供可能である。従って、本発明の方法 は、今回定義されたマーカーと連鎖する、他の公知または未知のマーカーによっ ても説明される。 当業者は、上記した各実施例で示すような本発明に対し、広範にわたり記載さ れた本発明の意図または目的を逸脱しない範囲で、多くの変形および／または改 良が可能であることを認めるであろう。すなわち、本発明の実施例は、記載され たあらゆる点で、本発明を制限するものではない。 参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 アイスマン， ジョン アレン オーストラリア国 2070 ニュー サウス ウェールズ リンドフィールド チェル ムスフォード アベニュ 28 (72)発明者 ケリー，ポール ジェームス オーストラリア国 2024 ニュー サウス ウェールズ ウェヴェリー カーリント ン ロード 131

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個人における骨密度の高低の要因、骨からの転向の高低の進行、および／ま たは治療に対する応答の評価方法であって、個人のビタミンＤ受容体遺伝子に関 する対立遺伝子の変動の分析を含む評価方法。 ２．分析が、エンドヌクレアーゼによる消化を用いた、制限されたある長さの断 片の多型性を含む特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．ビタミンＤ受容体の一部分が、エンドヌクレアーゼによる消化に先立ち、ポ リメラーゼチェーンリアクション法により増幅される特許請求の範囲第２項に記 載の方法。 ４．エンドヌクレアーゼが、Bsml、Apal、EcoRV、Taql、およびそれらのアイソ チジマーからなるグループより選択される特許請求の範囲第２項または第３項に 記載の方法。 ５．制限エンドヌクレアーゼがBsmlである特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．ビタミンＤ受容体の一部分が、以下に示すグループから選択される一組のプ ライマーを用いて増幅される特許請求の範囲第３項〜第５項のうちいずれか１項 に記載の方法。 5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′ および、5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′ および、5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′ および、5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3′ ７．分析されるビタミンＤ受容体遺伝子の一部分が、ビタミンＤ受容体の可変部 、または、遺伝子の、Bsml、Apal、EcoRV、およびTaql切断部位のうち少なくと も１つに連鎖する部位である特許請求の範囲第１項〜第６項のうちいずれか１項 に記載の方法。 ８．ポリメラーゼチェーンリアクション法によるVDR遺伝子の一部分の増幅に用 いるため、表５に示すVDR遺伝子の配列から得られるプライマーの組であって、 前記一部分が、表５に示すようにBsml、Apal、EcoRV、およびTaql切断部位のう ち少なくとも１つを含むか、または、遺伝子のうち、前記切断部位のうち少なく とも１ つに連鎖する部位であるプライマーの組。 ９．このプライマーの組が、 5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′ および、5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′ および、5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′ および、5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3′ である特許請求の範囲第８項に記載のプライマーの組。 １０．個人における骨密度の高低の要因、骨からの転向の高低の進行、および／ または治療に対する応答の評価方法であって、制御タンパクおよび／または構造 タンパクをエンコードする遺伝子の転写制御因子における対立遺伝子の変動の分 析を含む評価方法。