DE69927846T2

DE69927846T2 - Verfahren für die feststellung von asthma suszeptibilität

Info

Publication number: DE69927846T2
Application number: DE69927846T
Authority: DE
Inventors: K. Gurjit HERSHEY
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-12-11
Also published as: WO2000034789A3; JP2002532073A; EP1137947B1; CA2354673A1; EP1137947A2; US6379890B1; ATE307340T1; DE69927846D1; AU2588600A; WO2000034789A2; ES2249061T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Systeme und Verfahren zum Durchtesten von Patienten auf ihre Suszeptibilität für und ihren Schweregrad von Asthma. Genauer gesagt, betrifft diese Erfindung die Bestimmung der Asthmaneigung eines Patienten oder dessen potentiellen Asthma-Schweregrad durch die Analyse des IL-4-Rezeptors.
Beschreibung der verwandten Technik
Asthma ist eine chronische entzündliche Erkrankung und führt bei genetisch anfälligen Individuen zu einer erhöhten Reaktionsbereitschaft der Luftwege auf eine Vielzahl von Stimuli, sowie zu wiederkehrendem Verschluss der Luftwege. Es ist die häufigste chronische Erkrankung im Kindesalter und der häufigste Grund für pädiatrische Hospitalisierung. Obwohl es bekannt ist, dass sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische Einflüsse für die Entwicklung von Asthma wichtig sind, bleibt die Pathogenese dieser Erkrankung unklar.
Mehrere Kandidatengene und -Loci sind mit Asthma und Atopie in Verbindung gebracht worden, einschließlich IL-4, HLA-Komplex, FcεRIβ, dem β2-adrenergen Rezeptor und Chromosomenregionen, wie etwa dem Zytokin-Cluster bei 5q31-32, was für die polygene Natur dieser komplexen Erkrankungen spricht. Die Analyse der Gene, die zur Entwicklung von Asthma beitragen, und die Aufgliederung der Mechanismen, mittels derer diese Gene die Wirtsantwort auf Umweltbelastungen (antigene, virale, etc.) verändern, sind Schlüsselschritte zur Erweiterung unserer Kenntnis der Pathogenese von Asthma.
IL-4 und IL-13 sind Zytokine, die von Th2-Zellen, Mastzellen und basophilen Zellen produziert werden und die zusammen mit Signalen co-stimulierender Moleküle B-Zellen zur Produktion von Antikörpern der Klasse IgE veranlassen. Jüngst ist ein neues Allel der Interleukin-4-Rezeptor-Alpha-Kette (IL-4R) mit der Suszeptibilität für Atopie beim Menschen in Verbindung gebracht worden (Hershey et al., The Association of Atopy with a Gain-of-Function Mutation in the Subunit of the Interleukin-4 Receptor, N. Engl. J. Med., 337, 1721–1725).
Die von Hershey beschriebene allelische Variation resultiert aus einem Adenin-zu-Guanin-Austausch an Nukleotid 1902 der Il-4-Rezeptor-cDNA, die eine Veränderung von Glutamin (Q) zu Arginin (R) an Position 576 in der zytoplasmatischen Domäne von IL-4R voraussagt. Dieses neue Allel wird als die „R576"-Allelvariante bezeichnet.
Nachfolgend wurde berichtet, dass das R576-Allel bei Patienten mit allergisch-entzündlichen Erkrankungen und bei atopischen Erwachsenen vorherrscht (Hershey et al., Association of atopy with a novel IL-4 receptor alpha chain allele", FASEB, 12: Abstract 6268).
Da Asthma mit der Zeit zunehmend schwerer werden kann, ist es wichtig, Individuen zu ermitteln, die in jungendlichem Alter für diese Erkrankung empfindlich sind. Weiterhin ist es bei Individuen, bei denen Asthma diagnostiziert wurde, klinisch wichtig, die Schwere der Erkrankung über den Zeitverlauf vorherzusagen. Was somit für die Technik notwendig ist, ist ein Mechanismus zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Asthma-Risiko besitzt. Zusätzlich wird auch ein Mechanismus zur Vorhersage der Schwere des Asthmas eines Individuums im Verlauf von dessen Alterung benötigt. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Erfordernis.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Entdeckung, dass allelische Variationen des Interleukin-4-Rezeptorgens, die zu gesteigerter Signalerzeugung durch den Rezeptor führen, genetische Vorhersageindikatoren für Asthma sind. Darüber hinaus sind diese Mutationen mit gesteigertem Rezeptorsignal auch vorhersagend für die Schwere von Asthma bei an Asthma erkrankten Individuen.
Genauer gesagt, haben wir entdeckt, dass das R576 IL-4R-Allel eine Rolle bei der Entwicklung von Asthma spielt. Zusätzlich haben wir entdeckt, dass sich die Anwesenheit des R576 IL-4R-Allels bei betroffenen Individuen auf den Schweregrad von Asthma auswirkt. Unsere Versuche haben dargelegt, dass die Anwesenheit des R576-Allels mit dem Schweregrad von Asthma beim Menschen korreliert.
Genauer gesagt besitzt ein Individuum, das für das R576-Allel homozygot ist, ein vergleichsweise größeres Risiko für schweres Asthma als ein Individuum, das entweder für das R576-Allel heterozygot ist oder nur das wildtypische IL-4-Rezeptorgen besitzt (d.h. für das wildtypische Gen homozygot ist). Da es derzeit keine bekannten genetischen Marker für den Schweregrad von Asthma gibt, besitzt diese Entdeckung ein immenses therapeutisches Potential.
Zusätzlich haben wir weitere allelische Varianten der IL-4-Rezeptor-Alphakette identifiziert. Es wurde herausgefunden, dass Individuen, die homozygot für IL-4-Rezeptorvarianten sind, die ein erhöhtes Niveau des Rezeptorsignals bewirken, schwereres Asthma haben als diejenigen Individuen, die für die Rezeptorvariante heterozygot oder für das Wildtyp-Allel homozygot sind.
Dementsprechend beziehen sich Ausführungsformen dieser Erfindung auf Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Asthmarisiko besitzt, indem man die genetische Konstitution des Individuums analysiert. Diejenigen Individuen, die homozygot für ein IL-4-Rezeptorallel sind, das eine erhöhte Signalerzeugung über den Rezeptor vermittelt, besitzen ein stärkeres Risiko für Asthma als Individuen, die nur das wildtypische IL-4-Rezeptorallel tragen.
Zusätzlich können diejenigen Individuen, bei denen bereits Asthma diagnostiziert wurde, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nutzen, um vorherzusagen, wie schwer ihr Asthma mit der Zeit werden könnte. Wie unten dargestellt, haben wir entdeckt, dass der Schweregrad des Asthmas eines Individuums mit der Anwesenheit oder Abwesenheit der IL-4-Rezeptorallele korreliert ist, die eine verstärkte Signalerzeugung durch den Rezeptor vermitteln.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Ergebnisse aus einem Versuch darstellt, bei dem asthmatische Individuen anhand ihres Genotyps am IL-4R 576-Locus in Gruppen unterteilt werden. Der Prozentanteil der Patienten in der jeweiligen Gruppe mit schwerem Asthma (aufwärts gerichtetes Dreieck) gegenüber mildem Asthma (abwärts gerichtetes Dreieck) ist graphisch angezeigt. Die Sternchen bezeichnen eine statistisch signifikante Differenz (p = ,015). Schweres Asthma (basales FEV1 ≤ 60%) und leichtes Asthma (basales FEV1 ≥ 80%) wurden gemäß den Richtlinien für die Diagnose und Behandlung von Asthma (Guidelines for Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2) definiert.
2 ist ein Graph, der einen Vergleich des forcierten Ausatmungsvolumens in einer Sekunde (FEV1) zwischen Individuen zeigt, die die wildtypische IL-4-Rezeptor Alpha-Kette besitzen, die heterozygot für die R576 IL-4-Rezeptor-Alpha-Kette sind, oder die homozygot für die IL-4-Rezeptor-Alpha-Kette sind.
3A ist die Photographie eines Gels, die die Empfindlichkeit IL-4-induzierter Stat6-Phosphorylierung in EBV-transformierten B-Zelllinien vergleicht, die von Individuen stammen, die für R576 oder Q576 homozygot sind. 3B ist ein Graph, der zeigt, dass die maximale IL-4-abhängige Stat6-Phosphorylierung bei der R576-Zelllinie im Vergleich zu den Q576-Zellen etwa zweimal höher lag.
4A ist die Photographie eines Gels, die die Auswirkung von R576 auf den Zeitverlauf der IL-4-abhängigen Stat6-Phosphorylierung zeigt. 4B ist ein Graph, der die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten zeigt, die vier verschiedene Q576- und R576-Zelllinien verwenden, wobei die Quantifizierung durch Densitometrie erfolgte. Es wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen (Fehlerbalken) berechnet, um die Ergebnisse aus 4B zu verdeutlichen.
5 ist ein Paar von Graphen, die die Ergebnisse der Transfektion muriner B-Zelllymphom-Zellen mit der humanen IL-4R-cDNA zeigen, gefolgt von der Behandlung der untransfizierten Kontrolle (5A) oder der transfizierten Zellen (5B) mit humanem IL-4.
6 ist ein linearer Graph, der die Ergebnisse der Scatchard-Analyse der Bindung von rekombinantem, humanem [¹²⁵I]-IL-4 an murine A201.1-Zellen zeigt, die mit humanem IL-4R transfiziert wurden. Es sind zwei repräsentative Klone dargestellt, die wildtypische (Kreise) oder variante (Quadrate) HuIL-4R-Konstrukte exprimieren.
Die 7A und 7B sind Graphen, die zeigen, dass die Antwort transfizierter Klone auf humanes IL4 über den Zeitverlauf bei 100% der murinen Antwort verbleibt.
8 ist ein linearer Graph, der zeigt, dass die polymorphe V75/R576 IL-4R-Variante mit einer gesteigerten Reaktion auf IL-4 assoziiert ist. Vier verschiedene, transfizierte A201.1-Klone, die entweder den Wildtyp I75Q576 (geschlossene Kreise) oder die IL-4R-Variante V75/R576 (offene Kreise) exprimieren, wurden für 48 Stunden mit steigenden Dosen an Il-4 behandelt und dann mittels Durchfluss-Zytometrie unter Verwendung eines FITC-markierten anti-CD23-Antikörpers auf die Expression von CD23 hin untersucht.
Detaillierte Beschreibung
Wir haben mehrere Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Vorliegen und der Schweregrad von Asthma eine Korrelation mit den Individuen aufweist, die das R576-Allel tragen. Diese Versuche und Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen dargestellt. Kurz dargestellt, haben wir entdeckt, dass Individuen, die ein Risiko für schweres Asthma aufweisen, dadurch identifiziert werden können, indem man sie durchtestet, um zu bestimmen, ob sie ein IL-4-Rezeptorallel tragen, das höhere als normale Niveaus des Rezeptorsignals bei Reaktion auf die Stimulierung durch IL-4 verursacht.
Insbesondere haben wir herausgefunden, dass die allelischen Varianten R576 und V75, die höhere Niveaus an IL-4-Rezeptor-Signal erzeugen, auch eine starke Korrelation mit der Schwere des Asthmas eines Individuums aufweisen. Ausgehend von diesen Ergebnissen können denjenigen Individuen, die als homozygot für die Allele R576 und V75 ermittelt wurden, frühzeitig im Laufe ihrer Erkrankung identifiziert werden und Behandlungen verabreicht bekommen, die angemessen für jemanden mit einem erhöhten Risiko für schweres Asthma sind.
Das verstärkte Behandlungsschema kann das Einsetzen von Asthma hinausschieben oder die Stärke der Erkrankung abschwächen. Zusätzlich kann eine frühe Intervention Individuen aufgrund des verzögerten Beginns oder der verminderten Schwere dieser Erkrankung mit einer besseren Lebensqualität ausstatten. Auch Kinder, die ein hohes Risiko für schweres Asthma aufweisen, können durch das Durchtesten dieser Allele identifiziert werden, und es kann äußere Einflussnahme erfolgen, was eine Hinausschiebung oder Abschwächung bewirken oder den Ausbruch von Asthma vollständig verhindern kann.
I. Änderungen der Signalerzeugung durch das R576-Allel
Die Missense-Mutation in dem R576-Allel ist mit einer Funktionszunahme (gain of function) des IL-4-Rezeptors verbunden. Es scheint somit eine Steigerung der Signalerzeugung bei der Bindung von IL-4 an das R576-Allel im Vergleich gegenüber der IL-4-Bindung an den wildtypischen IL-4-Rezeptor aufzutreten.
Die Mutation wird translatiert in den Austausch eines Glutamins (Q) zu einem Arginin (R) in der zytoplasmatischen Domäne, die an einen Schlüssel-Tyrosinrest angrenzt. Die Stelle der Q-zu-R-Substitution kann als Ziel für die Neuentwicklung therapeutischer Mittel verwendet werden, die eingesetzt werden können, um die IL-4-Antwort abzuschwächen oder herunterzuregulieren. Diese Mittel könnten für jeden Krankheitsprozess nützlich sein, an dem allergische Entzündung oder eine Th2-Antwort beteiligt ist.
Die Entdeckung, dass die allelische Variation R576 für den Schweregrad von Asthma vorhersagend ist, kann nützlich zur Entwicklung von Arzneistoffen zur Minimierung der Auswirkungen dieser Krankheit sein. Beispielsweise haben wir herausgefunden, dass die Bindung von IL-4 an das R576-Allel in einem höheren Niveau der zellulären Signalerzeugung resultiert, als dies im Vergleich bei der Bindung von IL-4 an den wildtypischen Rezeptor der Fall wäre, wie unten diskutiert wird.
In früheren Versuchen ist herausgefunden worden, dass das SHP-1-Molekül viel weniger stark an das mutante R576-Allel bindet als an das wildtypische Allel (siehe Hershey et al.). Wie bekannt ist, ist SHP-1 eine Phosphotyrosin-Phosphatase, die an der Signalabschaltung bei vielen Zytokinsystemen, einschließlich des IL4-Rezeptors, beteiligt ist.
Zusammen mit der Entdeckung, dass die R576-Mutante für Asthma vorhersagend ist, kann diese Endeckung dafür verwendet werden, um Arzneistoffe zu entwickeln, die z.B. die Stärke der Bindung von SHP-1 an den mutanten IL-4-Rezeptor erhöhen. Diese Arzneistoffe können dadurch dem schädlichen Effekt des mutanten Rezeptors entgegenwirken und den Patienten einen medizinischen Nutzen bieten.
A. Beispiel 1: Untersuchung 1 der Korrelation zwischen dem R576-Allel und Asthma
Einhundertneunundvierzig nicht miteinander verwandte, erwachsene Asthmapatienten wurden vorab aus Allergiesprechzimmern rekrutiert, die dem Medizinzentrum der Universität von Cincinnati angeschlossen waren. Asthma wurde in Übereinstimmung mit den Kriterien der American Thoracic Society (ATS) diagnostiziert, indem eine 12%ige oder größere Steigerung des FEV1 nach einem Bronchodilator oder nach einem 2-wöchigen Behandlungsversuch mit oralen Corticosteroiden gezeigt wurde. Die Lungenfunktionstestung erfolgte gemäß den 1994 überarbeiteten ATS-Richtlinien unter Nutzung von Pneumatics Dataloop (Norwalk, CT). Die Teilnehmer durchliefen einen Haut-Pricktest mit Positiv- und Negativkontrollen und einer Palette von 14 gebräuchlichen Umweltantigenen, die im Ohio-Tal anzutreffen sind (A. L. K. Laboratories Inc., Wallingford, CT). In Übereinstimmung mit den veröffentlichten Richtlinien wurden sie instruiert, Antihistaminika vor dem Hauttest abzusetzen.
Die Patienten wurden auf Basis der Ergebnisse der Hauttests in allergische und nichtallergische Gruppen eingeteilt. Diejenigen mit positiven Reaktionen (≥ 3 mm Fleck mit Erythem) auf 1 oder mehr der getesteten Antigene, wurden als allergisch eingestuft. Es wurden die basalen FEV1-Werte herangezogen, um die Patienten in milde, moderate und schwere Asthma-Gruppen einzuklassifizieren. Wie in den Richtlinien zur Diagnose und Behandlung von Asthma (Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2) dargelegt, wurden diejenigen mit einem basalen FEV1 von größer als oder gleich 80% des Vorhersagewertes als mildes Asthma klassifiziert, diejenigen mit einem FEV1 zwischen 60 und 80% des Vorhersagewertes wurden als moderates Asthma eingestuft, und diejenigen mit einem basalen FEV1 von weniger als 60% des Vorhersagewertes wurden als schweres Asthma eingestuft.
Es gab gleiche Anteile (24%) an Rauchern (derzeitig oder in der Vergangenheit) bei den allergischen und nicht-allergischen Asthma-Gruppen, und es gab bezüglich Rauchens keine signifikanten Unterschiede zwischen den genotypischen Gruppen. Für die nicht-allergische, nichtasthmatische Kontrollgruppe wurden gesunde, nicht miteinander verwandte Freiwillige vorab aus dem Angestelltenpool des Medizinzentrums der Universität von Cincinnati und dem Medizinzentrum des Kinderkrankenhauses von Cincinnati rekrutiert. Diejenigen Individuen, die über eine Allergiegeschichte, Asthma, chronischen Husten, COPD oder Rauchen berichteten, wurden aus dieser Gruppe ausgeschlossen. Sie durchliefen den Haut-Pricktest gemäß obiger Darstellung, und diejenigen, die keine positiven Reaktionen (mit Ausnahme von Histamin) zeigten, wurden in die Kontrollgruppe einbezogen. Von allen Teilnehmern dieser Studien wurde eine informierte Zustimmung erhalten. Diese Studien wurden von dem institutionellen Prüfungskomitee des Kinderklinik-Medizinzentrums genehmigt.
Die Isolierung einkerniger peripherer Blutzellen (PBMCs), sowie von Derivaten von B-Zelllinien, die mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) transformiert worden waren, wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt. Die EBV-negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie JBAB war ein Geschenk von Dr. Elliot Kieff (Harvard Medical School, Boston). Die Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert, das mit 10 Prozent fetalem Rinderserum supplementiert war, und wurden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 Prozent Kohlendioxid gehalten.
1. Einzelstrangkonformationspolymorphismus(SSCP)-Analyse
cDNA wurde aus den EBV-Zelllinien oder den PBMCs unter Verwendung eines Reverse Transkription-Kits von Promega (Madison, WI) gewonnen und mittels SSCP auf die Q576R IL-4R-Allele gemäß der Beschreibung von Hershey untersucht, wobei Primer von Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Iowa) verwendet wurden. Es wurde eine „nested" Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um die Nukleotide 1840 bis 2125 der Interleukin-4 alpha cDNA zu amplifizieren, wobei die folgenden Primer eingesetzt wurden:
6' GCCCA CACTG GAAGA ATTGT CTTAC '3 (sense) SEQ ID NO: 1
5' TTTTG GGGGT CTGGC TTGAG '3 (antisense) SEQ ID NO: 2
als äußeres Primerpaar. Das innere Primerpaar war:
5' CCGAA ATGTC CTCAA GCATG '3 (sense) SEQ ID NO: 3
5' CCAGT CCAAA GGTGA ACAAG GGG '3 (antisense) SEQ ID NO: 4
Die abschließende PCR-Sequenzierung erfolgte mit dem fmol-Sequenziersystem von Promega (Madison, Wisconsin).
2. PCR-basierter Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Test zur Detektion der Allele Q576 und R576
Genomische DNA, die unter Verwendung des Genomic-Prep Kits von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) aus mit EDTA gegen Koagulation versetztem Vollblut gewonnen wurde, wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf die Anwesenheit der Allele Q576 oder R576 hin analysiert. Der Sense-Primer wurde mit einem Guanin anstelle eines Thymidins an Position 1898 konstruiert. Dies erzeugte eine Pvul-Restriktionsstelle nur bei dem R576-Allel, das an Position 1902 ein Guanin anstelle eines Adenins besitzt. Die verwendeten Primer waren:
TCTCGGCCCCCACCAGTGGCGATC (antisense) SEQ ID NO: 5
GAGGTCTTGGAAAGGCTTATAC (sense) SEQ ID NO: 6
Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 20 Sekunden; 32 Zyklen bei 94°C für 20 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden, und dann 72°C für 5 Minuten. Nach der PCR-Amplifikation wurden 10 μl des Ausgangsvolumens mit 5 Units Pvul (New England Biolabs, Beverly, MA) verdaut, und die Fragmente wurden auf einem 4% NuSieve-Gel (FMC Bioproducts) aufgetrennt. Die Allele Q576 und R576 erbrachten Banden von 209 bp bzw. 186 bp.
3. Ergebnisse
Um die Rolle des R576-Allels bei Asthma zu bestimmen, wurden 149 Individuen gemäß obiger Beschreibung unter Verwendung des oben beschriebenen Tests genotypisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. Die Allelhäufigkeit für die Allele Q576 und R576 bei dieser Population (n = 149) betrug 71% (211/298), bzw. 29% (87/298) im Vergleich zu 81% (92/114) und 19% (22/114) in der nicht-asthmatischen, nicht-allergischen Kontrollgruppe (n = 57). Es wurde ein starker Zusammenhang zwischen Homozygotie für das R576-Allel und Asthma festgestellt, wobei 13% (19/149) der asthmatischen Individuen als homozygot für R576 getestet wurden, bei den Kontrollen im Vergleich dazu jedoch nur 1,7% (1/57) (p = ,03; Chi-Quadrat; relatives Risiko 8,2).
Somit besitzen Individuen, die zwei Allele von R576 aufweisen, ein 8,2fach erhöhtes relatives Risiko im Bezug auf Asthma im Vergleich zu Individuen, die nicht für R576 homozygot sind. Da das R576-Allel mit Atopie in Zusammenhang steht, wurde die Asthma-Population auf Basis des Hautpricktests gegen 14 gängige Umweltantigene in eine allergische und eine nicht-allergische Gruppe unterteilt, um alle Auswirkungen des R576-Allels unabhängig von Atopie aufzudecken. Anhand dieser Kriterien wurden 107 (71,8%) der 149 Asthmatiker als allergisch ermittelt, und 42 (28,2%) waren nicht-allergisch, was annähernd veröffentlichten Berichten über das Vorherrschen von Atopie bei asthmatischen Patienten entspricht.
Es gab einen signifikanten Zusammenhang des R576-Allels mit allergischem Asthma (p = ,034; Chi-Quadrat), wie angesichts des bekannten Zusammenhangs mit Atopie erwartet wurde. Genauer gesagt, betrug die Allelhäufigkeit für R576 bei der allergischen Asthma-Gruppe 31% (66/214) im Vergleich zu 19% (22/114) bei der Kontrollgruppe. Weiterhin war die Homozygotie für das R576-Allel stark mit allergischem Asthma assoziiert (p = ,018; Chi-Quadrat; relatives Risiko 9,8). Somit besitzt ein Individuum, das für R576 homozygot ist, ein 9,8-fach erhöhtes relatives Risiko im Bezug auf allergisches Asthma als ein Individuum mit dem Genotyp Q/Q576 oder Q/R576. Bei der allergischen Asthmagruppe waren 15% (16/107) der Individuen homozygot für R576 im Vergleich zu nur 1,7% (1/57) der Kontrollen.
Der potentielle Zusammenhang zwischen den Allelvarianten R576 und Q576 und dem Schweregrad von Asthma wurde dann untersucht. Es wurden die basalen FEV1-Werte verwendet, um die Patienten in milde, moderate und schwere Asthmagruppen einzuteilen. Wie in den Richtlinien zur Diagnose und Behandlung von Asthma (Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2) dargelegt, wurden diejenigen mit einem basalen FEV1 von größer als oder gleich 80% des Vorhersagewertes als mildes Asthma eingestuft, diejenigen mit einem FEV1 zwischen 60 und 80% des Vorhersagewertes wurden als moderates Asthma eingestuft, und diejenigen mit einem basalen FEV1 von weniger als 60% des Vorhersagewertes wurden als schweres Asthma eingestuft.
Die milden, moderaten und schweren Asthmagruppen wurden dann anhand ihres Genotyps am IL-4R-576-Locus aufgeteilt (1). In der Gruppe, die für das Q576-Allel homozygot war, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der relativen Anzahl milder, moderater oder schwerer Asthmapatienten in der Gruppe. Jedoch hatten in der Gruppe, die für das R576-Allel homozygot war, 52,6% (10/19) schweres Asthma, und nur 10,5% (2/19) hatten mildes Asthma (p = ,015; Chi-Quadrat), was einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Schweregrad von Asthma und der Homozygotie für das R576-Allel zeigt. Des weiteren hatten in der heterozygoten Gruppe, die eine Kopie des R576-Allels trägt, 36,7% (18/49) schweres Asthma, ein Wert, der zwischen denjenigen liegt, die bei den Trägern zweier Kopien von R576 (52,6%, 10/19) und den Q576-Homozygoten (32,1%, 26/81) beobachtet wurden. Der Anteil derer mit mildem Asthma bei der heterozygoten Gruppe (20,4%, 10/49) liegt ebenfalls zwischen den Anteilen, die bei den Gruppen Q/Q576 (27,1%, 22/81) und R/R576 (10,5%, 2/19) beobachtet wurden.
Die mittleren basalen FEV1-Werte für jede Gruppe sind in Tabelle 2 und 2 dargestellt. Ein Vergleich der mittleren FEV1-Werte zwischen den Gruppen zeigte, dass die Gruppe, die für R576 homozygot ist, einen signifikant geringeren mittleren, basalen FEV1-Wert (57,8) besitzt als die Gruppe, die für das wildtypische Q576-Allel homozygot ist, und bei der der Mittelwert = 67,5 ist (p < ,05). Der Median der basalen FEV1-Werte für die Gruppen R/R576, Q/R576 und Q/Q576 zeigte denselben Trend wie die mittleren basalen Werte (59, 66 bzw. 70). Somit ist die Homozygotie für das R576-Allel mit einem schweren Asthma-Phänotyp gemäß der Definition über das basale FEV1 assoziiert.
Die mittleren FEV1/FVC-Verhältnisse waren bei allen Gruppen vergleichbar (Wildtyp 0,67, Heterozygote 0,66 und Homozygote 0,66). Interessanter Weise lagen die Mittelwerte und Mediane für die basalen FEV1-Werte bei den Heterozygoten zwischen den Werten der für Q576 oder R576 homozygoten Gruppen. Demzufolge korreliert die Anwesenheit des R576-Allels mit dem Schweregrad von Asthma.
B. Beispiel 2: Nachweis, dass das R576-IL-4R-Allel mit einem verstärkten IL-4-Signal assoziiert ist
Wie oben diskutiert, haben wir gezeigt, dass die R576-Variante mit einer gesteigerten Reaktionsbereitschaft auf IL-4 verbunden ist. Um die Auswirkung der Substitution Q576R auf das von IL-4 ausgelöste Signal zu bestimmen, erfolgte ein Vergleich zwischen der Empfindlichkeit der IL-4-induzierten Stat6-Phosphorylierung bei EBV-transformierten B-Zelllinien, die von für R576 homozygoten Individuen stammten, und dem IL4-Signal bei Patienten, die für das Q576-Allel homozygot waren (3).
Die mit EBV transformierten Zelllinien, die von den für R576 IL-4R oder Q576 IL-4R homozygoten Individuen stammten, wurden für 15 Minuten mit steigenden Dosen an humanem IL-4 (huIL-4) stimuliert. Die Zelllysate wurden dann durch Immunpräzipitation, gefolgt von Immunoblotting, auf Stat6-Phosphorylierung analysiert. Die in den oberen 2 Tafeln von 3A abgebildeten Nitrozellulosemembranen wurden mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10) immungeblottet.
Wie in den unteren zwei Tafeln von 3B angezeigt, wurden dieselben Membranen „gestrippt" und einer erneuten Markierung mit einem Anti-Stat6-Antikörper unterzogen, um die gleichförmige Beladung der Spuren zu zeigen. Die Ergebnisse von 3 separaten Experimenten unter Verwendung von 4 verschiedenen Q576- und R576-Zelllinien wurden mittels Densitometrie quantifiziert. Die Mittelwerte und Standardabweichungen (Fehlerbalken) sind in Tafel B dargestellt.
Die Anwesenheit der R576-Variante war mit verstärkter Signalerzeugung durch IL-4 assoziiert (3A). Eine maximale Stat6-Phosphorylierung wurde bei beiden IL-4R-Varianten bei einer IL-4-Dosis von 5,0 ng erreicht. Jedoch war die maximale, IL-4-abhängige Stat6-Phosphorylierung bei der R576-Zelllinie im Vergleich zu den Q576-Zellen etwa 2fach größer (3B). Dieser Unterschied wurde bei 3 separaten Experimenten, bei denen 4 verschiedene R576- und Q576-Zelllinien verwendet wurden, reproduziert, und war statistisch signifikant (p < ,001 für die Dosis 5,0 ng und p = ,003 für 50 ng; T-Test).
C. Beispiel 3: Auswirkung von R576 auf den Zeitverlauf der IL4-abhängigen Stat6-Phosphorylierung
Wir haben dann die Auswirkung von R576 auf den Zeitverlauf der IL-4-abhängigen Stat6-Phosphorylierung untersucht (4). Zellen, die entweder die Variante R576 oder Q576 exprimieren, zeigten eine maximale Stat6-Phosphorylierung nach 15–30 Minuten der IL4-Stimulierung.
Die EBV-transformierten Zelllinien stammten von Individuen, die für R576 oder Q576 IL-4R homozygot waren. Die Zelllinien wurden mit 10 ng/ml an huIL-4 für die festgelegten Zeiten stimuliert, wonach die Lysate durch Immunpräzipitation, gefolgt von Immunoblotting, auf Stat6-Phosphorylierung hin analysiert wurden. Wie in 4A gezeigt, wurden die Nitrozellulosemembranen, die in den zwei oberen Tafeln abgebildet sind, mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10) immungeblottet.
Dieselben Membranen wurden gestrippt und mit einem Anti-Stat6-Antikörper erneut markiert, um die gleichförmige Beladung der Spuren zu zeigen. Diese Membranen sind in den beiden unteren Tafeln von 4A abgebildet. In 4A ist nur ein repräsentativer Versuch dargestellt. Die Ergebnisse von 3 getrennten Versuchen unter Verwendung von 4 verschiedenen Q576- und R576-Zelllinien wurden mittels Densitometrie quantifiziert; die Mittelwerte und Standardabweichungen (Fehlerbalken) sind in 4B dargestellt. Die Stat6-Phosphorylierung ist dargestellt als Prozentanteil an phosphoryliertem Stat6 in jeder Spur im Vergleich zur Gesamtmenge an Stat6, die in der jeweiligen Spur detektiert wird. Statistisch signifikante Unterschiede, T-Test, sind durch ein Sternchen angezeigt. Q576: Kreise, R576: Quadrate.
Wie in den Ergebnissen von 4B gezeigt, war die R576-Variante wiederum mit einer größeren Stärke der Stat6-Phosphorylierung assoziiert, wenn man diese mit den wildtypischen Zellen verglich. Dies war am auffälligsten zu den Zeitpunkten 15 und 60 Minuten, bei denen die IL-4-abhängige Stat6-Phosphorylierung bei den R576-Zellen nicht bis auf das Niveau absank, das bei den Q576-Zellen beobachtet wurde (p = ,002 bzw. ,048).
Somit zeigen EBV-transformierte Zelllinien, die die R576-Variante tragen, eine erhöhte maximale IL-4-abhängige Stat6-Phosphorylierung und eine verlängerte Stat6-Aktivierung, wenn man sie mit Zellen vergleicht, die die Q576-Variante aufweisen. Dies unterstützt die Hypothese, dass der R576 IL-4R-Polymorphismus die Signalerzeugung durch IL-4 verändert. Des weiteren fielen die größten Unterschiede zwischen den Q576- und R576-tragenden Zellen mit der Dephosphorylierung von Stat6 zusammen, was nahelegt, dass die Substitution Q576R in einen negativen regulatorischen Schritt beim Signalweg der Stat6-Deaktivierung eingreifen könnte.
II. Weitere IL-4-Allele sind mit Asthma korreliert
A. Beispiel 4: Entwicklung eines in vitro-Transfektionsmodells für die Analyse der funktionellen Konsequenzen der IL-4R-Varianten
Zusätzlich zu der polymorphen IL-4R-Variante R576 sind fünf zusätzliche IL-4R-Polymorphismen entdeckt worden. Für eine Variante, I75V, ist außerdem herausgefunden worden, dass sie mit dem Vorliegen und Schweregrad von Asthma assoziiert ist.
Als Teil unserer Versuche, zu bestimmen, wie der Il-4R funktioniert, haben wir die funktionellen Konsequenzen der IL-4R-Polymorphismen in isolierter Form, sowie in Kombinationen beobachtet, die Haplotypen repräsentieren, welche natürlich vorkommen. Um die funktionellen Konsequenzen jeder spezifischen IL-4R-Aminosäuresubstitution unabhängig von anderen Polymorphismen zu ergründen, haben wir ein Transfektions-Modellsystem entwickelt. Für IL-4 ist herausgefunden worden, dass es absolut Spezies-spezifisch ist. Somit bindet humanes IL-4 nur an den humanen IL-4R und nicht an murinen IL-4R. Entsprechend bindet murines IL-4 nur an den murinen IL-4R.
Zusätzlich ist herausgefunden worden, dass murine Zellen, die mit humaner IL-4R-cDNA transfiziert werden, die Fähigkeit erwerben, humanes IL-4 zu binden und darauf zu reagieren. Um die funktionellen Rollen der allelischen Varianten zu bestimmen, haben wir die cDNA von humanem wildtypischem IL-4R (subkloniert in pREP9, einen Säugerexpressionsvektor) mittels Elektroporation in die murine B-Zelllymphom-Zelllinie A201.1 (ATCC) transfiziert, wobei nach zwei Wochen der Antibiotika-Selektion in Gegenwart von 1000 μg/ml an G418 stabile Transfektanten erhalten wurden.
Genauer gesagt, wurden A201.1-Zellen mit 20 μg humaner IL-4R-cDNA in dem Expressionsvektor pREP9 transfiziert. Nach Durchlauf der Antibiotika-Selektion wurden die Transfektanten auf ihre Fähigkeit hin getestet, auf humanes und murines IL-4 zu reagieren. 5A zeigt die Ergebnisse untransfizierter Zellen, wogegen 5B die Versuchsergebnisse für die transfizierten Zellen zeigt. Wie in 5A dargestellt, wurden die Zellen für 48 Stunden in Gegenwart von Medium alleine (gepunktete Linie), 50 ng/ml an humanem IL-4 (fettgedruckte Linie) oder 50 ng/ml an murinem IL-4 (durchgezogene Linie) für 48 Stunden inkubiert und dann mittels Durchfluss-Zytometrie unter Verwendung eines FITC-markiertem Anti-CD23-Antikörpers auf CD23-Expression hin getestet.
Die A201.1-Zellen wurden für unsere Studien ausgewählt, da sie eine stark positive Antwort auf murines IL-4 zeigten (5A). Die Zellen, die erfolgreich transfiziert wurden, gewannen die Fähigkeit, auf humanes IL-4 zu reagieren (5B), während untransfizierte Zellen nach wie vor nur auf murines IL-4 reagierten.
Die CD23-Expression bei den Transfektanten war nach der Stimulierung mit humanem und murinem IL-4 nahezu äquivalent, was nahelegt, dass die Expression von humanem IL-4R in den transfizierten Zellen annähernd der des endogenen murinen Rezeptors entsprach. Um nachzuweisen, dass die Transfektanten ähnliche Niveaus an IL-4R exprimierten, wurden die transfizierten Zellpools durch limitierende Verdünnung kloniert. Es wurde ein Minimum von 3 Klonen pro Konstrukt auf Basis einer durch humanes IL-4 induzierten CD23-Expression isoliert, die näherungsweise der endogenen murinen Antwort entsprach. Durch die Scatchard-Analyse (6) wurden nahezu gleichwertige Niveaus für die humane IL-4R-Expression und die murine IL-4R-Expression bestätigt.
Wie in 6 gezeigt, sind zwei repräsentative Klone dargestellt, die die HuIL-4R-Konstrukte IQ (Wildtyp; Kreise) oder VQ (Quadrate) exprimieren. Beide Klone exprimierten 1600–1900 Rezeptoren/Zelle mit einer Kd von 1,5–2,0 × 10^–9 M^–1.
Dies belegte, dass die für die Analyse verwendeten Klone ähnliche Niveaus an humanem Oberflächen IL-4R exprimieren und validiert den vorgeschlagenen Vergleich zwischen den Klonen. Unter Verwendung der Scatchard-Analyse bestimmten wir außerdem die Kd-Werte für die transfizierten humanen IL-4R-Varianten, wie in 6 gezeigt. Es gab zwischen diesen beiden Klonen keinen Unterschied der Bindungsaffinitäten für humanes IL-4. Somit veränderte die Mutation V75 nicht die Bindungsaffinität des IL-4R für IL-4.
Murines IL-4 induzierte die CD23-Expression bei den untransfizierten Zellen ebenso gut wie bei den transfizierten Zellen. Demzufolge griff die Überexpression des humanen IL-4R nicht störend in die Expression oder Signalerzeugung des endogenen murinen IL-4R ein. Da sowohl der endogene murine IL-4R als auch der transfizierte humane IL-4R die endogene murine c-Kette verwenden, zeigen diese Daten, dass die c-Kette nicht limitierend wirkt.
Bei den 7A und 7B verblieb die Antwort des transfizierten Klons auf humanes IL-4 über den Zeitverlauf bei 100% der murinen Antwort. A201.1-Zellen, die stabil mit dem humanen IL-4R transfiziert waren, wurden für 48 Stunden in Gegenwart von Medium alleine (gepunktete Linie), 50 ng/ml an humanem IL-4 (fettgedruckte Linie) oder 50 ng/ml an murinem IL-4 (durchgezogene Linie) für 48 Stunden inkubiert und dann mittels Durchfluss-Zytometrie unter Verwendung eines FITC-markierten Anti-CD23-Antikörpers auf CD23-Expression getestet. Es ist ein repräsentativer Klon dargestellt.
Die Stabilität und Homogenität der humanen IL-4R-Expression durch die transfizierten Klone blieb über mehrere Monate in Kultur stabil. Wir haben die Stabilität des Expressionsniveaus außerdem durch Scatchard-Analyse bestätigt. Die Klone exprimierten nach 3–9 Monaten in Kultur nach wie vor etwa 1800 Rezeptoren/Zelle.
B. Beispiel 5: Erzeugung und Transfektion humaner IL-4R cDNA-Konstrukte in murine A201.1-Zellen
Jede der sechs bekannten polymorphen Varianten von IL-4R resultiert aus einer bestimmten Missense-Mutation. Wir haben fünf der Missense-Mutationen in der IL-4R-cDNA durch positionsspezifische Mutagenese unter Verwendung des QUICKCHANGE Mutagenese-Kits (Stratagene, San Diego, CA) erzeugt. Diese Daten sind unten in Tabelle III zusammengefasst. Die wildtypische Sequenz und alle fünf der mutanten Konstrukte sind durch Sequenzierung verifiziert und in den Säugerexpressionsvektor pREP9 (Invitrogen) subkloniert worden.
Tabelle III: Erzeugung und Transfektion der IL-4R-cDNA-Konstrukte, die zur Analyse der IL-4R-Polymorphismen verwendet werden
Ein (+) zeigt an, dass die Aktion erfolgreich abgeschlossen wurde
Die Konstrukte I75Q576 (Wildtyp), I75R576 und V75Q576 sind in erfolgreicher Weise stabil in A201.1-Zellen transfiziert worden. Die Scatchard-Analysen bestätigten, dass die Transfektanten alle ähnliche Niveaus an humanem Oberflächen-IL4-R exprimierten, und zwar etwa 1500–2000 Rezeptoren/Zelle. Weiterhin zeigten die bislang studierten Varianten alle ähnliche Affinitätskonstanten für humanes IL-4 (6), somit beeinflussen die Mutationen Q576R oder I75V in Isolation nicht die Ligandenbindungsaffinität von humanem IL-4R.
C. Beispiel 6: Erzeugung von Varianten mit multiplen allelischen Variationen
Um Kombinationen der allelischen Varianten zu untersuchen, haben wir Konstrukte erzeugt, die 2 oder mehr der polymorphen Mutationen enthielten. Wir haben erfolgreich stabile Transfektanten erzeugt, die die V75R576-Kombination von IL-4R exprimieren. Im Gegensatz entweder zu R576 oder V75 alleine, resultiert die Kombination aus V75 und R576 zusammen in einer verstärkten Reaktionsbereitschaft gegenüber IL-4, wie dies anhand der im Vergleich zum Wildtyp (I75/Q576) (8) erhöhten Empfindlichkeit der V75/R576-Transfektante gegenüber IL-4 nachgewiesen wurde.
Wie in 8 gezeigt, ist die polymorphe V75/R576 IL-4R-Variante mit einer gesteigerten Reaktionsbereitschaft gegenüber IL-4 verbunden. Vier verschiedene transfizierte A201.1-Klone, die entweder die wildtypische IL-4R-Variante I75/Q576 (geschlossene Kreise) oder die IL-4R-Variante V75/R576 (offene Kreise) exprimieren, wurden für 48 Stunden mit steigenden Dosen an IL-4 behandelt und dann mittels Durchfluss-Zytometrie unter Verwendung eines FITC-markierten Anti-CD23-Antikörpers auf CD23-Expression hin getestet. Die CD23-Expression ist dargestellt als Prozentwert bezogen auf die Maximalantwort, die mit murinem IL-4 über den endogenen Rezeptor erreicht wird. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen (Fehlerbalken) für 3 Versuche angegeben, bei denen 4 Klone analysiert werden, die jeweils transfizierte Varianten exprimieren.
Die in 8 dargestellten Daten repräsentieren die Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 getrennten Versuchen, die vier verschiedene Klone der Transfektanten V75/R576 und I75/Q576 (Wildtyp) verwenden. Diese Daten validieren in Kombination mit unseren genetischen Daten, die zeigen, dass R576 mit dem Schweregrad von Asthma korreliert, unsere zentrale Hypothese, dass multiple IL-4R-Polymorphismen das IL-4-Signal verändern, und dass sie, wenn sie in Kombination vorliegen, in konzertierter Weise wirken, um den funktionellen Gesamtzustand von IL-4R und den asthmatischen Phänotyp zu bestimmen.
D. Beispiel 7: Detektion der Ile75- und Val75-Allelvarianten
Genomische DNA wurde aus Individuen isoliert, die bekanntermaßen homozygot für das wildtypische IL-4R-Allel I75, homozygot für das variante V75-Allel oder heterozygot (I75/V75) waren. Die genomische DNA wurde PCR-amplifiziert, wobei die folgenden 5'-intronischen und 3'-exonischen Primer unter Standard-PCR-Bedingungen verwendet wurden:
5'- GGAAGAGTCTGATGCGGTTCC -3' SEQ ID NO: 7
21 Nt-Vorwärts-Primer
5'- CAGCCCACAGGTCCAGTGTATAG -3' SEQ ID NO: 8
23 Nt-Rückwärts-Primer
Diese Primer amplifizierten ein 207 bp-Fragment, das den I75V-Polymorphismus enthielt. Der nachfolgende Verdau dieses Fragments mit MslI erbrachte Fragmente von 164 bp und 43 bp in Gegenwart des I75-Allels, jedoch Banden bei 98 bp, 66 bp und 43 bp in Gegenwart des V75-Allels, da die Substitution in einer zusätzlichen MslI-Stelle in dem V75-Allel resultiert. Im Fall der Heterozygote wurden alle 4 Banden (164 bp, 98 bp, 66 bp, 43 bp) detektiert. Dieses Beispiel liefert einen schnellen und genauen Mechanismus zur Detektion der Anwesenheit des V75-Allels bei einem Individuum.
E. Beispiel 8: Detektion der Allelvarianten Cys431 und Arg431
Genomische DNA wurde aus Individuen isoliert, die bekanntermaßen homozygot für das wildtypische IL-4R-Allel Cys431, homozygot für das variante Allel Arg431 oder heterozygot (Cys431/Arg431) waren. Die genomische DNA wurde PCR-amplifiziert, wobei das folgende 5'- und 3'- Primerpaar unter Standard-PCR-Bedingungen verwendet wurde:
5'- GAAAAAGGGAGCTTCTGTGCATC -3' SEQ ID NO: 9
23 Nt-Vorwärts-Primer
5'- CGTCTCTGTGCAAGTCAGGTTGTC -3' SEQ ID NO: 10
24 Nt-Rückwärts-Primer
Das Arg431-Allel erzeugt bei Verwendung des obigen Primerpaares eine Tsp45 I-Stelle, die im wildtypischen Allel nicht zu finden ist. Somit resultiert die Restriktion des amplifizierten Produkts mit Tsp45 I in den folgenden Fragmenten:
Cys-Allel: 1 Fragment der Größe 324 bp
Arg-Allel: 2 Fragmente der Größen 175 bp und 149 bp
Heterozygote: 149 bp, 175 bp und 324 bp
Folglich stellt das vorangegangene Beispiel einen Mechanismus zur schnellen Bestimmung darüber bereit, ob ein Individuum homozygot für das Cys431-Allel, heterozygot für die Allele Cys431/Arg431 oder homozygot für das Arg431-Allel ist.
F. Beispiel 9: Detektion der Allelvarianten Ser786 und Pro786
Genomische DNA wurde aus Individuen isoliert, die bekanntermaßen homozygot für das wildtypische IL-4R-Allel Ser786, homozygot für das variante Allel Pro786 oder heterozygot (Ser786/Pro786) waren. Die genomische DNA wurde PCR-amplifiziert, wobei das folgende 5'- und 3'- Primerpaar unter Standard-PCR-Bedingungen verwendet wurde:
5'- AACAGTGTCATGGCCAGGAGGATG -3' SEQ ID NO: 11
24 Nt-Vorwärts-Primer
5'- TCCCACGGAGACAAAGTTCACG -3' SEQ ID NO: 12
22 Nt-Rückwärts-Primer
Die unter Verwendung von DdeI an aus diesen Individuen amplifizierten PCR-Fragmenten durchgeführte Restriktion erbrachte für Individuen, die homozygot für das Ser786-Allel, heterozygot für die Allele Ser786/Pro786 oder homozygot für das Pro786-Allel waren, die folgenden Fragmente:
Ser-Allel: 102 bp, 80 bp
Pro-Allel: 130 bp, 102 bp
Heterozygote: 130 bp, 102 bp, 80 bp
Somit kann man durch die PCR-Amplifikation genomischer DNA aus einem Individuum unter Verwendung des oben angegebenen Primerpaares schnell bestimmen, welches Allel in dem Individuum vorkommt.
G. Beispiel 10: Entdeckung von Verbindungen, die die SHP-1-Bindung an R576 unterstützen
Es werden Bindetests durchgeführt, um Verbindungen zu ermitteln, die die Bindung von SHP-1 an das R576-Allel unterstützen. Es werden die folgenden synthetischen Peptide verwendet, die der Y575 SHP-1-Bindestelle an dem IL-4-Rezeptor entsprechen:
NH₃-SAPTSG(pY)QEFVHAVE-COOH SEQ ID NO: 13
(Phosphorylierte wildtypische SHP-1-Bindungsstelle)
NH₃-SAPTSG(pY)REFHAVE-COOH SEQ ID NO: 14
(Phosphorylierte R576 SHP-1-Bindungsstelle)
Die Peptide werden an Affigel 10-Beads (BioRad Laboratories, Hercules, CA) gekoppelt, wobei ein Verhältnis von 3 mg Peptid pro Milliliter Beads verwendet wird.
Um ein Basalniveau der Bindung zellulärer SHP-1-Proteine an wildtypische, synthetische Interleukin-4-Rezeptorpeptide zu bestimmen, werden 20 μl der mit dem Wildtyp-Peptid konjugierten Beads mit BJAB-Zell-Lysaten (2 × 10⁷ Zellen) inkubiert und dann durch Immunoblotting mit spezifischem Antiserum gegen SHP-1 auf die Anwesenheit von mit SHP-1 assoziiertem Peptid analysiert. Das Kaninchen-anti-Mensch-SHP-1-Antiserum ist zuvor von Matthews et al. (Mol. Cell. Bio., 12: 2396–2405, 1992) beschrieben worden.
Um ein Basalniveau der Bindung zellulärer SHP-1-Proteine an synthetische R576-Interleukin-4-Rezeptorpeptide zu bestimmen, werden 20 μl der mit dem R576-Peptid konjugierten Beads mit BJAB-Zell-Lysaten (2 × 10⁷ Zellen) inkubiert und dann durch Immunoblotting mit spezifischem Antiserum gegen SHP-1 auf die Anwesenheit von mit SHP-1 assoziiertem Peptid analysiert. Es wird ermittelt, dass das Niveau der SHP-1-Bindung an wildtypische Peptide etwa dem Zweifachen des Bindungsniveaus an die konjugierten R576-Peptide entspricht.
Die Verbindung X, von der angenommen wird, dass sie die Bindung von SHP-1 an das IL-4-Rezeptorprotein erhöht, wird mit einem BJAB-Zell-Lysat (2 × 10⁷ Zellen) gemischt. Dieses Gemisch wird mit 20 μl an mit R576-Peptid konjugierten Beads inkubiert. Das Niveau der SHP-1-Bindung an die mutanten R576 IL-4-Peptide wird gemessen, wobei ein höheres Bindungsniveau anzeigt, dass die Verbindung X ein potentieller Kandidat zur Asthmabehandlung ist.
III. STAT-6 spielt eine zentrale Rolle bei Asthma
Der Transkriptionsfaktor Stat-6 spielt bekanntermaßen eine zentrale Rolle beim Zustandekommen des IL-4-Rezeptor-vermittelten Signals. Eine Firma, Tularik, hat „Knock out"-Mäuse hergestellt, die ihre Fähigkeit, den Stat-6-Faktor herzustellen, vollständig verloren haben. Es wurde herausgefunden, dass diese Mäuse keine Möglichkeit haben, IgE als Antwort auf eine IL-4-Einwirkung zu produzieren. Vermutlich kann die Fähigkeit, die Stat-6-Spiegel beim Menschen klinisch zu entfernen oder zu verringern, zu einer Behandlung für schweres Asthma führen.
Jedoch wäre es zur Entdeckung einer solchen Behandlung wichtig, alle IL4-Rezeptorallele zu identifizieren, die durch Stat-6 gebunden werden. Beispielsweise könnte ein bestimmter Wirkstoffkandidat das Stat6-Signal bei Zellen mit wildtypischen IL-4-Rezeptoren aufheben, jedoch vollständig unwirksam dafür sein, das Stat-6-Signal in mutanten R576-Zellen zu verhindern. Daher ist es für den zu entwickelnden Test wichtig, dass das Stat-6-Signal mit allen IL-4R-Allelen getestet wird.
A. Beispiel 11: Bestimmung der Niveaus der Stat-6-Signalwirkung von IL-4-Rezeptoren
Der Stat-6-Faktor wird bekanntermaßen bei Bindung von Interleukin 4 an den IL-4-Rezeptor phosphoryliert. Somit könnte man als ein Maß für das IL-4-Rezeptorsignal auf phosphoryliertes Stat-6 testen.
Es werden beispielsweise einkernige periphere Blutzellen (PBMCs) aus einem Patienten entnommen, von dem bekannt ist, dass er für das R576-Allel homozygot ist. PBMCs werden außerdem aus einem Patienten entnommen, der bekanntermaßen für den wildtypischen IL-4-Rezeptor homozygot ist. Diese Zellen werden dann mit einer aktivierenden Dosis von IL-4 behandelt. Nach der Inkubation mit IL-4 wird das Niveau der Stat6-Phosphorylierung mittels konventioneller Techniken als Maß für das IL-4-Rezeptorsignal gemessen.
Sobald dieses basale Niveau des Signals ermittelt ist, wird eine Verbindung, die als wirksames Mittel gegen Asthma vermutet wird, mit dem IL-4 gemischt und mit den PBMCs in Kontakt gebracht, die den wildtypischen IL-4-Rezeptor bzw. den mutanten R576-IL4-Rezeptor aufweisen. Durch Vergleichen der Niveaus von Stat-6 in Gegenwart und Abwesenheit der Verbindung, kann bestimmt werden, ob die Verbindung ein wirksames Mittel gegen Asthma darstellen würde. Da das R576-Allel bei über 20% der getesteten humanen Patienten gefunden wurde, ist es sehr wichtig, potentielle Asthma-Mittel sowohl mit dem wildtypischen Rezeptor als auch mit dem mutanten R576-Rezeptor auf ihre Aktivität hin zu testen.
In einem zusätzlichen, damit in Beziehung stehenden Versuch kann das R576-Allel in Maus-B-Zellen inseriert werden, so etwa mit der murinen A201.1-Zelllinie gemäß obiger Beschreibung. Die Maus-B-Zellen werden dann den mutanten humanen IL-4-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Mauszellen werden im Folgenden ausschließlich durch humanes IL-4 über den humanen R576-Rezeptor aktiviert. Wie bekannt ist, werden die Mausrezeptoren nicht durch humanes IL-4 aktiviert. Somit kann eine Zelllinie erzeugt werden, die Signale als Reaktion auf humanes IL-4 produziert, ohne dass es zu einer Überschneidung mit der Signalerzeugung durch andere, verwandte Rezeptoren kommt. Mittels dieses Systems kann die spezifische Aktivität des R576-Allels untersucht werden.
Bei einem Versuch werden murine A201.1 B-Zellen mittels Standard-Techniken mit dem humanen R576 IL-4-Rezeptorgen transfiziert. Diese Gene werden dann auf der Oberfläche der Mauszelllinie exprimiert. Es wird ein Vergleich zwischen der Aktivierung der Maus-B-Zellen in Gegenwart von IL-4 alleine oder in Gegenwart von IL-4 und einer als Wirkstoffkandidat für Asthma vermuteten Verbindung durchgeführt. Ein Unterschied des Mauszellsignals in Gegenwart der Verbindung im Vergleich zum Niveau des IL-4-Signals ohne die Verbindung zeigt an, ob die Verbindung ein potentielles therapeutisches Mittel zur Behandlung von Asthma ist.
IV. Schlussfolgerung
Die gewöhnliche Natur von Asthma ist wohlbekannt. Es wird zunehmend ersichtlich, dass viele verschiedene Gene die Entwicklung von Asthma beeinflussen. Die vorliegenden Erkenntnisse zeigen, dass das Vorliegen von IL-4-Rezeptorallelen mit dem Vorliegen von Asthma und mit dem Schweregrad von Asthma bei Individuen korreliert. Eine oder zwei Kopien von R576 wurden mit schwererem Asthma gemäß der Definition über das basale FEV1 assoziiert, wenn man sie mit einer Asthmagruppe verglich, die für das wildtypische Q576-Allel homozygot war.
Die Homozygotie für R576 war in signifikanter Weise mit Asthma assoziiert und brachte ein im Vergleich zu Q576 8,2faches relatives Risiko für Asthma und ein 9,8faches relatives Risiko für atopisches Asthma mit sich. Ein Gendosiseffekt wurde sowohl hinsichtlich des Asthma-Phänotyps als auch hinsichtlich der Häufigkeit des Auftretens nahegelegt. Zwei Kopien von R576 waren mit erhöhter Asthma-Häufigkeit und erhöhter Schwere des Asthmas assoziiert, wenn sie mit einer Kopie verglichen wurden. Dies wurde dargelegt durch die heterozygote R/Q576-Gruppe, die im Vergleich zu den Gruppen Q/Q576 und R/R576 intermediäre Mittelwerte und Mediane für FEV1 aufwies, und die intermediäre Anteile schwerer und milder Asthmatiker im Vergleich zu den beiden homozygoten Gruppen enthielt.
Wir haben zuvor gezeigt, dass das R576-Allel die Interaktionen zwischen Y575 und der SH2-Domänen enthaltenden Tyrosin-Phosphatase SHP-1, für die jüngst gezeigt wurde, dass sie das IL-4-Signal herunterreguliert, verändert. IL-4R enthält 5 konservierte Tyrosinreste in seiner zytoplasmatischen Domäne, von denen einer, Y713, Teil einer ITIM (Immunrezeptor-Tyrosinbasiertes inhibitorisches Motiv)-Erkennungssequenz ist, und als eine Andockstelle für SHP-1 impliziert wurde. Da SHP-1 zwei SH2-Domänen enthält, könnten Y575 und Y713 in einer konzertierten Weise wirken, um SHP-1 zu rekrutieren, und so zur Beendigung des IL-4-Signals führen.
Eine Verringerung der Effizienz der Interaktion zwischen IL-4R und SHP-1 aufgrund der Substitution von Q nach R in Nachbarschaft zu Y575 könnte zu einer Fehlregulation der IL-4-Antworten führen. Dies könnte ein Mechanismus sein, der der durch R576 verliehenen genetischen Prädisposition zugrunde liegt. Wenn dies der Fall ist, können Transfektanten, die Q576 oder R576 exprimieren, auf Änderungen der Umsatzrate oder Dephosphorylierung von Stat6 und anderen Signalzwischenprodukten hin untersucht werden. Wir können außerdem die Auswirkungen der IL-4R-Polymorphismen auf andere Signalmoleküle bestimmen, die für den Signalweg von IL-4 wichtig sind, wie etwa die JAK-Kinasen, die als SHP-1-Substrate impliziert wurden.
Wie oben erwähnt, sind fünf weitere Polymorphismen von IL-4R beschrieben worden, und für einen von diesen, lle75, wurde herausgefunden, dass er mit einem verstärkten IL-4-Signal und dem Schweregrad von Asthma assoziiert ist.
Die Homozygotie für R576 bringt ein 8,2fach erhöhtes relatives Risiko für Asthma mit sich und ist mit einem erhöhten Schweregrad von Asthma assoziiert. Die Assoziation von R576 mit dem Schweregrad von Asthma besitzt potentielle klinische Anwendungen. Die frühzeitige Erkennung von Kindern mit Risiko für schweres Asthma mittels der Bestimmung ihres IL-4R-576-Genotyps, gefolgt von einer engmaschigen medizinischen Überwachung und frühzeitiger umweltbezogener und/oder pharmakologischer Intervention kann den Fortschritt ihrer Erkrankung verzögern, abschwächen oder verhindern. Wenn Erwachsene zum Zeitpunkt der Diagnose als „mit Risiko" für schweres Asthma identifiziert werden, können eine engmaschige medizinische Überwachung und die frühzeitige Etablierung einer Therapie die Krankheitsauswirkungen verändern. TABELLE 1 Häufigkeit der IL-4-Rezeptor-Alpha-Allele R576 und Q576 bei allergischem Asthma, nichtallergischem Asthma und Kontrollgruppen

* Assoziation der Homozygotie für R576 und Asthma: p = 0,03, Chi-Quadrat; relatives Risiko: 8,2
** Assoziation der Homozygotie für R576 und allergischem Asthma: p = 0,017, Chi-Quadrat; relatives Risiko: 9,8
# Assoziation des R576-Allels und Atopie: p = 0,034, Chi-Quadrat-Test
+ Assoziation des R576-Allels und Asthma: p = 0,056, Chi-Quadrat-Test
^ Assoziation des R576-Allels und Asthma (unabhängig von Atopie): p = 0,431, Chi-Quadrat-Test

Tabelle 2 Auswirkung der IL-4Rα-Allelvarianten R576 und Q576 auf den Schweregrad von Asthma
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Vorhersage der Schwere von Asthma in einem Individuum, bei dem man eine biologische Probe von einem Individuum hinsichtlich des Vorhandenseins einer R576-Allelvariante des IL-4-Rezeptors analysiert, wobei die R576-Allelvariante ein hohes Rezeptorsignal im Vergleich zu dem Wildtyp-IL-4-Rezeptor liefert und wobei das Vorhandensein der R576-Allelvariante in dem Individuum ein Anzeichen für die Schwere von Asthma in dem Patienten ist.
Verfahren nach dem vorangegangenen Anspruch, wobei das Vorhandensein der Allelvariante in dem Individuum das Vorhandensein eines homozygoten Satzes von Allelvarianten umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Analysieren der biologischen Probe die Polymerase-Kettenreaktion umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Analysieren der biologischen Probe Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Analyse umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Analysieren der biologischen Probe weiterhin das Feststellen einer V75 IL-4-Rezeptorallel umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die biologische Probe genomische DNA umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die biologische Probe eine Blutprobe ist.