AT502722B1 - Verwendung des interferon induzierten gens 12 (isg 12, ifi 27) zur modulation transkriptioneller aktivitäten von nuklearen rezeptoren - Google Patents

Description

2 AT 502 722 B1

Die Erfindung betrifft die Verwendung von humanem oder Mäuse-ISG12 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von akuten oder chronischen Entzündungserkrankungen, von metabolischen Erkrankungen oder Gefäßerkrankungen sowie ein Verfahren zum Diagnostizieren in vitro der SuszeptibHität oben genannter Erkrankungen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung des Interferon-induzierten Gens 12 (ISG12, IFI27), um die Transkriptionsaktivitäten von Nuklearrezeptoren zu regulieren, sowie die Verwendung von einzelnen Nukleotid-Polymorphismen im humanen ISG12-Gen als Marker für die Empfänglichkeit von Krankheiten.

Status:

Entzündung ist ein Hauptfaktor bei Gefäßverschlusserkrankungen und daher kann Atherosklerose als chronische entzündliche Erkrankung angesehen werden. Es werden Monozyten, Makrophagen und THI-Zellen in frischen und älteren Läsionen gefunden, die dafür verantwortlich sind, dass sie spezifische, den Krankheitsfortschritt fördernde Zytokine generieren. Zusätzlich zu dem Nuklearen Faktor kappa B {NFkB), dem Haupttranskriptionsfaktor, der die Entzündungsreaktion vermittelt, sind Nukleare Rezeptoren auch das Ziel für die Regulierung einer Reihe von Zytokinen. In Bezug auf Nukleare Rezeptoren konnten die Erfinder und andere zeigen, dass NR4A1, als ein Mitglied der NR4A-Familie, von einzelnen Nuklearrezeptoren in dem entzündeten Gefäß, speziell in den Endothelzellen, den glatten Muskelzellen und Monozyten, reguliert wird. In für dominant negative Formen von NR4A1 transgenen Mäusen wurde ein stark erhöhter Grad von Restenosis in einem Karotisarterien-Ligationsmodell gefunden; auch Adeno-virale-Überexprimierung von Wildtyp-NR4A1 verhinderten den Restenoseprozess. Beide Entdeckungen zeigen eine nützliche Rolle von NR4A1 bei Gefäßerkrankungen an. Deshalb ist NR4A1 in Verbindung mit anderen Nuklearrezeptoren, wie dem adaptierten Nuklearrezeptor PPARa und PPARy, in Rückkoppelungsschleifen involviert, die Gefäßpathologien entgegenwirken. NR4A1 (Nur77) gehört zur NR4A-Familie von Nuklearen Rezeptoren mit bis dato unbekannten Liganden für die Transkriptionsregulation. Obwohl kürzlich Prostaglandin A als Transaktivator für NR4A3 beschrieben wurde, wird angenommen, dass die Aktivität von Mitgliedern der NR4A-Familie direkt von Regulierungsexpression und posttranslationaler Modifikation abhängig ist. Obwohl die Aktivitäten von Co-Repressoren und Co-Aktivatoren auch beschrieben wurden, war keiner von diesen Regulatoren dafür bekannt, dass er in Gefäßerkrankungen einbezogen wäre. Die Erfinder forschten deshalb nach weiteren Faktoren, die die Aktivität dieser Nuklearrezeptoren modulieren, die deren nützliche Auswirkung auf Gefäßerkrankungen abschwächen könnten. US 2005/0009067 A1 offenbart die Verwendung der Kombination einer Reihe von <3enen, darunter auch ISG12 zum „gene expression Profiling" von Pankreas Karzinomen. Das hierin beschriebene „Drug screening“ bezieht sich auf den Effekt verschiedener Medikamente auf das Expressionsprofil der beschriebenen Marker in Antwort auf Behandlung mit den entsprechenden Medikamenten oder der Hemmung der Expression der Marker auf nRNA oder durch -allerdings nicht definierte - Antikörper und nicht auf den Effekt von ISG12, das ja eine bislang unbekannte - wenn überhaupt - Wirkung hatte, als Ziel solcher Medikamente, insbesondere zur Modifizierung der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. Das Wesen dieser Offenbarung betrifft eine Methode zur Charakterisierung von Pankreasgewebe, einen Kit zur Charakterisierung und eine Methode zum Screenen von Pankreaszellen hinsichtlich der Auswirkung von Testkomponenten auf Veränderungen von 2 oder mehr der oben bezeichneten Gene. WO 2004/011618 A1 bezieht sich auf eine Methode zur Identifikation von Genen, die in Fettgewebe von unterschiedlichen Mäuse-Stämmen überexprimiert sind, sowie die Verwendung der identifizierten Gene zur Verhinderung der Adipogenese, zur Behandlung von Diabetes und zum Screenen von niedermolekularen Substanzen, die Adipogenese modulieren bzw. zur Behandlung von Diabetes. Eines der gefundenen Gene ist auch ISG12, das nicht überraschend ist, da 3 AT 502 722 B1 bekannter Weise ISG12 durch Interferone reguliert wird. Hierin ist auch ein Bioassay zur Identifizierung von Substanzen geoffenbart, die Fettgewebeansammlung verhindern können, wobei Zellen, die eine der identifizierten Proteine exprimieren, Substanzen ausgesetzt werden und anschließend die Zellen auf Veränderungen in deren Aktivität analysiert werden.

Im Dokument LABRADA, L. et al. Age-dependent resistance to lethal alphavirus encephalitis in mice: analysis of gene expression in the central nervous System and Identification of a novel interferon-inducible protective gene, mouse ISG12. Journal of virology, 2002, Vol. 76, Nr. 22, Seiten 11688 - 11703, wird die unterschiedliche Empfindlichkeit von neugeborenen gegenüber vier Wochen alten Mäusen gegenüber Sindbis Virus Infektionen beschrieben und weiters, dass ISG 12 in den weniger empfindlichen vier Wochen alten Mäusen hochreguliert ist und dass über Überexpression von ISG12 in neugeborenen Mäusen protektiv gegenüber Sindbis Virus ist. JP 2005204549 A beschreibt eine Methode zur Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber dem Fortschreiten einer HCV Infektion. In Populationsstudien wurden SNPs in 103 Genen gefunden, die mit dem Fortschreiten einer HCV Infektion korrelieren. Ebenfalls nicht überraschend ist eines der Gene ISG12, das ja bei Virusinfektionen durch Interferone hochreguliert wird.

Die Erfindung:

Die Erfinder fanden unerwartet einen neuen Modulator für die Aktivitäten von einigen Nuklearrezeptoren und zwar das Interferon-regulierte Gen 12 (ISG12), das unter Basiskonditionen in einer niedrigen Konzentration in der Kernhülle vorkommt. Aus den in vitro erhaltenen Daten, von ISG12-Knock-out-Mäusen in vivo und von der Frequenz von Polymorphismen in dem ISG12-Gen in Patienten, schlossen die Erfinder, dass ISG12 ein neues Gen ist, das in Gefäßen hochreguliert wird, was wiederum den Nuklearen Export von nützlichen Nuklearen Rezeptoren vergrößert und zur Downregulierung deren Transkriptionsaktivitäten beiträgt. ISG12 stellt daher ein Ziel für neue therapeutische Maßnahmen für die Behandlung von Gefäßerkrankungen dar. Dieser überraschende protektive Effekt von ISG12 ist im Stand der Technik in keiner Weise mit der Modulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren in Zusammenhang gebracht.

Gegenstand der Erfindung ist daher einerseits die Verwendung von humanem oder Mäuse-ISG12 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Gefäßverschlusserkrankungen, Atherosklerose, koronare Herzkrankheit, Herzinfarkt, Angina, Schlaganfall, Diabetes Typ II, Bluthochdruck und hohem Blutcholesterin.

Anderseits umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zum Diagnostizieren in vitro der Suszepti-bilät für Gefäßverschlusserkrankungen, Atherosklerose, koronare Herzkrankheit, Herzinfarkt, Angina, Schlaganfall, Diabetes Typ II, Bluthochdruck und hohem Blutcholesterin, wobei hiefür Single-nucleotide-Polymorphismen im humanen ISG12-Gen verwendet wird.

Ergebnisse:

Auffinden von ISG12:

Bei der Suche von NR4A1-interaktiven Proteinen haben die Erfinder eine Sonde von einem trunkierten NR4A1 (Aminosäure 248-557) konstruiert und verwendeten diese in einer Hefe-zwei-Hybrid-Analyse. Als einen der positiven Interaktionspartner fanden sie in zytokinaktivierten, mikrovaskulären Endothelzellen die gesamte cDNA des hiterferon-stimulierten Gens 12 (ISG12, Gl:59925613).

Die Interaktion in der Hefe wurde mittels der "Back Transformation" nachgewiesen (Daten nicht angezeigt). Die Interaktion in Säugetierzellen wurde mittels Co-Immunopraezipitationen von myc-markiertem ISG12 mit einem Antikörper gegen NR4A1, das das endogene NR4A1 erkennt 4 AT 502 722 B1 (Fig. 1, Zeile 1), demonstriert sowie die überexprimierte gesamte NR4A1 (Fig. 1 Zeile 2) in 293 Zellen. Fig. 1 zeigt, dass NR4A1 mit ISG12 reagiert. Co-Immunoprezipitationen in 293 Zellen: NR4A1 wurde in 293 Zellen entweder in Ab- oder Anwesenheit von ISG12 überexprimiert. Lysate von 293 Zellen wurden für 4 Stunden mit Anti-NR4A1 oder Kontroll-IgG immunprezipi-tiert; für das Immunblotting wurde ein monokloner Maus-Anti-Myc-Antikörper verwendet. ISG12 co-prezipitiert mit endogenem und überexprimiertem NR4A1 (n=3).

Um die Stelle in der Zelle zu bestimmen, wo die Interaktion stattfindet, haben die Erfinder Myc-tagged-ISG12 und EGFP-tagged-NR4A1 in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen überexprimiert (HUVECs; Fig. 2a). NR4A1 wurde vorwiegend im Zellkern lokalisiert, wobei ISG12 hauptsächlich im Umkreis des Zellkerns vorkommt, wo es gemeinsam mit NR4A1 im konvokalen Lasermikroskop beobachtet werden konnte (gelber Ring). Diese Daten sind in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Lokalisierung von ISG12 in der Nuklearhülle. Wenn man das Bild von den Z-stacks im konvokalen Lasermikroskop rekonstruiert, konnte die gemeinsame Lokalisation der Nuklearhülle für fast alle Zellkerne nachgewiesen werden (Daten nicht angeführt). Um zu beweisen, dass die gemeinsame Lokalisation nicht aufgrund der Übe-rexprimierung der Proteine auftritt, verwendeten die Erfinder menschliche Nabelschnuerarterien glatter Muskelzellen (HUASMCs) und konnten demonstrieren, dass endogene NR4A1 ebenso in der Nuklearhülle mit überexprimiertem ISG12 gemeinsam lokalisiert ist (Fig. 2b). Fig. 2.a) zeigte die gemeinsame Lokalisation von überexprimiertem NR4A1 mit überexprimiertem ISG12: HUVEC wurden mit EGFP-NR4A1 und myclSG12 transfiziert. Nach 30 Stunden wurden die Zellen fixiert, mit einem monoklonalen Anti-myc-Antikörper (rote Fluoreszenz) immungefärbt und mit einem konvokalem Lasermikroskop sichtbar gemacht. In den gezeigten Abbildungen erschienen die gemeinsam lokalisierten Proteine als gelber Ring um den Zellkern (n=3). Fig. 2b zeigt die gemeinsame Lokalisation von endogenem NR4A1 mit überexprimiertem myclSG12 in vaskulären glatten Muskelzellen (SMCs): 30 Stunden nach der Transfizierung von SMCs mit myclSG12, wurden die Zellen fixiert, immungefärbt mit Anti-NR4A1 (M210, grüne Fluoreszenz) und Anti-myc-Antikörper (rote Fluoreszenz) und durch das konvokale Lasermikroskop sichtbar gemacht. Auch endogene NR4A1 ist gemeinsam mit überexprimiertem ISG12 um den Zellkern lokalisiert (gelb-oranger Ring, Pfeil, (n=2))

Funktion von ISG12: ISG12 vermindert die Nuklearlokalisation von NR4A1: im Laufe dieser Experimente haben die Erfinder beobachtet, dass in Abwesenheit von überexprimiertem ISG12 NR4A1 überwiegend im Zellkern gefunden wurde, während bei der Anwesenheit von überexprimiertem ISG12 es auch im Zytoplasma (Fig. 3) gefunden wurde. Fig. 3 zeigt die Verteilung von überexprimiertem EGFP-NR4A1 allein in HUVECs und in der Anwesenheit von überexprimiertem myclSG12 wurde dies durch das konvokale Lasermikroskop sichtbar gemacht. NR4A1 (grüne Fluoreszenz) ist vorwiegend im Zellkern unter Abwesenheit von ISG12 lokalisiert (linker Teil), während in Anwesenheit von überexprimiertem ISG12, mehr NR4A1 im Zytoplasma (rechter Teil) (n=2) beobachtet wurde.

Um den Effekt von ISG12 in der zellulären Lokalisation von NR4A1 zu quantifizieren, haben die Erfinder die Verteilung von NR4A1 zwischen dem Zytosol und dem Zellkern analysiert, indem subzelluläre Fraktionen von 293 Zellen, in welchen EGFP-markierte NR4A1 in der Ab- oder Anwesenheit von myc-markiertem ISG12 überexprimiert wurden. In der Anwesenheit von ISG12 wurden 20.8±7.4% (Durchschnitt ± SD von 4 Experimenten; p<0.05) mehr NR4A1 im Zytosol als in der Abwesenheit von ISG12 gefunden. Fig. 4 zeigt die Differenz zwischen zytoplasmi-schen und nuklearen Konzentrationen von NR4A1, überexprimierte allein oder zusammen mit myclSG12: Die relative Konzentration wurde durch Western Blots von Zellfraktionsexperimenten in 293 Zellen bestimmt. Ein repräsentatives Beispiel wird gegeben. (n=3)

Wenn dasselbe Experiment mit einem EGFP-markierten NR4A1-Konstrukt-(AA248-580) durchgeführt wird, das nicht von den Zellkernen exportiert werden -kann, wurde kein Einfluss von 5 AT 502 722 B1 ISG12 auf die subzelluläre Verteilung des Konstrukts beobachtet. (Fig. 5) Ähnlich wurde der Effekt von ISG12 auf das NR4A1 in gesamter Länge bei der Anwesenheit von Leptomycin B beeinträchtigt, das den Nuklearexport (Daten nicht angezeigt) verhindert. Das zeigt an, dass ISG12 ein neuer Interaktionspartner von NR4A1 ist, der in der Nuklearhülle lokalisiert ist und der die Nukleare Lokalisation von den einzelnen Nuklearen Rezeptoren NR4A1 durch Vermittlung des Nuklearexports vermindert. Fig. 5 zeigt die Überexprimierung des Nuklearexportdefizienten EGFP-dcNR4A1 (248-580) zusammen mit myclSG12: Die gemeinsame Lokalisation konnte in HUVECs (gelber Ring) um den Zellkern beobachtet werden, aber keinerlei Veränderung in der Verteilung von dem Export fehlender dnNR4A1 (n=2). ISG12 vermindert die Transkriptionsaktivitäten von Nuklearrezeptoren: Von diesen Daten sagten die Erfinder voraus, dass ISG12 die Transkriptionsaktivitäten von NR4A1 ebenso beeinflussen würde. Um dies zu überprüfen richteten die Erfinder ein Luciferase-Reporter-System ein, das aus vierfachen NBRE (NR4A1 monomerische Bindungsseite) Luciferase-Konstrukt besteht ein und analysierten Transkriptionsaktivitäten von NR4A1 in An- und Abwesenheit von co-transfizierten ISG12 (Fig. 6, a). Überexprimierung von NR4A1 verdoppelt die Reporter-Genaktivität, während in der Anwesenheit von überexprimiertem ISG12 die NR4A1-induzierte Regulierung von Transkriptionsaktivitäten auffällig reduziert wurden. Dieser Effekt war von der Menge des transferierten ISG12 abhängig, wie dies durch die Dosisabhängigkeit der ISG12-vermittelten Hemmung in Fig. 6, b gezeigt wurde. Fig. 6 zeigt, dass ISG12 die NR4A1-Transkriptionsaktivitäten downreguliert: In einer Reihe von Experimenten wurde der Effekt der ISG12-Überexprimierung auf NR4A1-regulierte Transkription evaluiert; Luciferase-Daten wurden zu der Expression von Renilla genormt und werden als means±SEM repräsentiert und durch ANOVA analysiert, a) Eine auffällige (p=0,000298) Downregulierung der NR4A1-Repor-teraktivität durch ISG12 wurde in 293 Zellen beobachtet (n=4). b) Die Downregulierung der NR4A1-Reporteraktivität durch ISG12 war Dosisabhängig, wie dies durch den Effekt der unterschiedlichen Menge des transferierten ISG12 in 293 Zellen angezeigt wurde; die Downregulierung von NR4A1 wurde mit abnehmenden Mengen an ISG12 vermindert (p=0,000254, (n=2)).

Um zu demonstrieren, dass der Effekt von ISG12 auf Transkriptionsaktivitäten von NR4A1 nicht auf 293 Zellen und das künstliche NBRE-Konstrukt nicht eingeschränkt ist, haben die Erfinder 293 Zellen durch HUVECs ersetzt und fanden, dass die Verstärkung der durch NR4A1 induzierte Reporteraktivität, wieder signifikant durch ISG12 reduziert war (Fig. 7, a); die Erfinder führten auch analoge Experimente mittels HUVECs und einem Teil des PAI-1 -Promotor gekoppelt an Luciferase durch, ein Konstrukt, das schon früher verwendet wurde um die NR4A1 abhängige PAI-1-Regulierung zu demonstrieren. Wie in Fig. 7, b gezeigt, wurde die PAI-1 Reporteraktivität durch NR4A1 hochreguliert und das mehr als 8 Mal in der Abwesenheit von ISG12, während wenn ISG12 co-transfektiert wurde, war wieder die Transkriptionsaktivität von NR4A1 unterdrückt. Aus diesen Daten haben die Erfinder geschlussfolgert, dass ISG12 nicht nur physikalisch mit NR4A1 interagiert und seine predominante Nuklearlokalisation verändert, sondern es auch auffällig die NR4A1 Transkriptionsaktivitäten vermindert. Fig. 7, a) zeigt eine Reporteranalyse durchgeführt in HUVECs, wo auch gezeigt wird, dass die NR4A1-Reporteraktivität von ISG12 downreguliert wurde (p=0;0118, (n=2)). b) Transkriptionsaktivitäten von NR4A1, wie analysiert bei Verwendung von PAI-1 -Promoter-805-+20 pUB PAI-1 Luciferase-Konstrukt wurde auch durch ISG12 in HUVECs downreguliert (n=3).

Um die Hypothese, dass ISG12 nicht nur die Transkriptionsaktivität von NR4A1 beeinflusst, sondern auch diese von anderen Nuklearrezeptoren, haben die Erfinder wieder ein Luciferase-Reportersystem, das aus dreifachen PPRE (PPAR Respons-Element)-Luciferase-Konstrukt besteht, verwendet und die Transkriptionsaktivitäten von PPARa und PPARy, in An- und Abwesenheit von co-transfektiertem ISG12 (Fig. 8) analysiert. Überexprimierungen von PPARa zusammen mit RXR vermehrte die Reporter-Genaktivitäten mehr als 50-fach, während in der Anwesenheit von überexprimiertem ISG12 die PPARa-induzierte Hochregulation von Transkriptionsaktivitäten ca. auf das 10fache signifikant reduziert wurde (Fig. 8, a). Ein ähnlicher Effekt wurde beobachtet, als PPARa-Aktivitäten in der Anwesenheit des spezifischen PPARa- 6 AT 502 722 B1

Liganden WY14643 (Fig. 8, b) analysiert wurden. Wenn PPARa durch PPARy ersetzt wurde, war wiederum eine Vermehrung der Reporter-Genaktivität in der Anwesenheit von überexpri-mierten ISG12 nicht zu beobachten (Fig. 8, c), ungeachtet dessen, ob die PPARy-Bindung ROSIGLITAZONE anwesend war (Fig. 8, d) oder nicht. Fig. 8 zeigt, dass die ISG12-Transkrip-tionsaktivitäten von PPARa und PPARy-Transkriptionsaktivitäten downreguliert werden, a) Die Transkriptionsaktivität von PPARa, wie in einer Reporteranalyse in 293 Zellen gemessen, die mit einem PPRE-Reporterkonstrukt und RXRa transfiziert sind, ist durch Co-transfektion mit ISG12 auffällig downreguliert (means±SEM, normalisiert zu Renilla-Expression, p=0,000004, (n=3). b) Experimente wie beschrieben in a) wurden in der Anwesenheit von dem PPARa Liganden WY-14643 durchgeführt (100 μΜ). Auch in diesem Fall downreguliert ISG12 PPARa-induzierte Reporteraktivitäten (p=0,0000054, (n=3)). c) Experimente, wie in a) unter Verwendung von PPARy anstatt von PPARa, zeigen ebenfalls, dass die Co-Transfektion mit ISG12 signifikant (p=0,0000088) die Reporteraktivitäten (n=3) reduziert, d) Die Downregulation von PPARy-Reporteraktivitäten durch Co-transfektiertes ISG12 wurde ebenfalls in der Anwesenheit von dem PPARy-Ligand-Rosiglitazone (p=0,0023) in analogen Experimenten beobachtet (n=2). Diese Daten indizierten uns, dass ISG12 nicht nur die Transkriptionsaktivitäten von NR4A1 beeinflusst und downreguliert, sondern auch andere Nuklearrezeptoren beeinflusst, indem sie deren Transkriptionsaktivitäten downregulieren. Tatsächlich konnte eine direkte Interaktion von ISG12 mit anderen Nuklearrezeptoren während ähnlich durchgeführter Experimente unter Verwendung von Antikörpern gegen RXR oder PPAR, mit überexprimierten myc-tagged ISG12 in 293 Zellen, gefunden werden (Fig. 9). Fig. 9 zeigt die Co-Immuno-Prezipitation von myclSG12 in 293 Zellen durch Antikörper gegen RXRa, NR4A1 und PPARa. Lysate von 293 Zellen wurden für 4 Stunden mit den jeweiligen Kaninchen-Antikörpern und einem preimmunen IgG immunoprezipiert; Western blotting wurde mit einem monoklonalen Maus-Anti-Myc-Antikörper durchgeführt. Mit allen 3 spezifischen Antikörpern konnte ISG12 praezipitiert werden, während keine spezifische Bindung beobachtet wurde, wenn man das pre-immune IgG (n=2) verwendete.

Regulierter Expression von ISG12:

Um die potentielle biologische Rolle für die Interaktion von ISG12 mit NR4A1 und dessen hemmenden Effekt auf NR4A1-Transkriptionsaktivitäten aufzuzeigen, haben die Erfinder die Expression von ISG12 im Gefäßsystem bestimmt. Wenn Proben, die von humanen atheroskleroti-schen Gefäßläsionen (mikroskopisch definiert) erhalten wurden und durch die vermehrte Expression von II-8 und MCP-1 (Fig. 10) für die Expression von ISG12 analysiert und mit nicht betroffenen, angrenzenden Arealen verglichen wurden, fanden die Erfinder in den betroffenen Zonen eine ungefähr vierfache Hochregulierung von ISG12. Von diesen Daten schlossen die Erfinder, dass ISG12 in Gefäßläsionen hochreguliert ist. Fig. 10 zeigt regulierte Expressionen von ISG12, die durch QT-PCR analysiert wurden; eine relative Expression wurde zu einem Niveau von PBGD normalisiert und die Daten als means±SEM ausgewiesen. ISG12 ist in humanen Gefäßläsionen parallel mit den Entzündungsmarkergenen IL-8, MCP-1 hochreguliert (n=2).

Diese Daten weisen darauf hin, dass ein Zytokin oder eine Mischung von Zytokinen in den Arterienläsionen, die ISG12 hochregulieren, anwesend ist. Die Erfinder haben deshalb den Effekt von Entzündungszytokin-Anwärtern auf die Regulierung von ISG12 in einer HUVECs-Kultur bestimmt (Fig. 11) Die Erfinder entdeckten, dass von den analysierten Zytokinen, nur Interferon-Gamma (IFNg) und Interferon-alpha (IFNa) ISG12 in Endothelzellen hochreguliert, und dies mehr als 10fach von niedrigem Niveau bei bleibenden unstimulierten Konditionen. Fig. 11 zeigt, dass die Expression von ISG12 in HUVECs durch Stimulierung mit verschiedenen Entzündungs-stimuli (oxPAPC 150 pg/ml, TNFa 100 U/ml, LPS 10 pg/ml, IFNa 1000 U/ml, IFNy 100 ng/ml, TGFßl 6,6 ng/ml) für 0.5 to 7.5 Stunden induziert (n=2).

Generierung von Mäusen mit fehlendem ISG12: 7 AT 502 722 B1

Die ISG12''‘Mäuse wurden gemäß der Vorgangsweise generiert, die vorher in der Literatur schon beschrieben und in Fig. 12 aufgezeichnet wurde. Die ISG12+/"Mäuse und gezüchtete männliche und weibliche ISG^'Mäuse zeigten keine offensichtlich groben phenotypischen Pathologien (Fig. 12), hatten normale Wachstums- sowie Überlebensraten und Fruchtbarkeit. Routinehistologische Analysen zeigten keine Anzeichen von Gewebeschäden. Fig. 12 zeigt die Methode der ISG12-Gendeletion. (a) Black Boxes in der genomischen Struktur repräsentieren Exonsequenzen. Über gleichwertige Rekombinationen ersetzten die neuen Gene ein 2.5 kb genomisches Fragment, das Exons I bis IV umfasste, was zu einer völligen Deletion des ISG12-Gens führte, b) Southern blot-Analysen von maus-genomischer DNA gespalten mit Hindlll und analysiert mit einer 3'- externen Probe, d) ISG12 Mäuse und Wildtypen.

Verwendung von Mäusen mit fehlendem ISG12

Die Erfinder verwendeten Karotid-Arterienligation um den Effekt der ISG12-Gen-Inaktivierung auf Neointima-Formationen zu bestimmen. Wie in Fig. 13, a und b gezeigt, wiesen ISG12_/· Mäuse nur unwesentliche Neointima-Formationen im Vergleich zu Wildtypmäusen auf, während in nicht-ligierten Kontroll-Karotisarterien keine morphologischen Differenzen zwischen Wildtypen und ISG12'/_Mäusen gefunden wurden. Das weist darauf hin, dass die Abwesenheit von ISG12 die vaskuläre Morphologie unter Basiskonditionen nicht beeinflusst, bei denen ISG12 nur in einer niedrigen Rate auch in Wildtyptieren zur Expression kommt. Wenn Verletzung (Ligation) eine Hochregulierung von ISG12 induzieren, so ist, wie in den ISG^" Tieren abwesend, der Mangel von ISG12 für den vaskulären Heilungsprozess nützlich. Fig. 13 zeigt, dass keine Neointima-Formationen nach dem Karotid-Arterien-Ligation-Modell in Mäusen mit fehlendem ISG12 beobachtet werden konnte, a) Immunocyto-chemisches Bild der Carotid-Wand von wildtyp (wt) und ISG^Mäusen, ligiert und unligiert, gefärbt mit Hematoxylin und Eosin b) Quantifizierung von Morphometeranalyse, unterschieden zwischen Neointima zu Media Ratio in wt und ISG12·'' waren statistisch signifikant, *p=0,0038. Ein anderes Beispiel für den Effekt von Mäusen mit fehlendem ISG12 wird in Fig. 14 gezeigt. Hier wird das Überleben von Wild-typ-Mäusen aufgrund von intraperitonealer Injektion von Endotoxin mit ISG 12+Mäusen verglichen. Mäuse mit fehlendem ISG12 zeigen wesentlich besseres Überleben als Wildtypmäuse.

Einzelnukleotider Polymorphismus in ISG12 steht in Beziehung zu vaskulären Krankheiten.

In einer humangenetischen Studie haben die Erfinder 3 nukleotide Polymorphismen (SNP) im humanen ISG12-Gen am Chromosom 14q analysiert (Offizieller Genname: Interferon alpha induzibles Protein 27 (IFI27), NM_005532). Von diesen waren in unseren Proben 2 polymorph (rs2239644 mit 15.0% Heterosygosität und rs2799 mit 4.1% Heterozygosität). Dieser Polymorphismus wurde auf die Verbindung mit koronarer Herzkrankheit (letzter Herzinfarkt oder Angina), Schlaganfall, Diabetes Typ II, arterielle Hypertension und Hypercholesterinemia in 853 kaukasischen Personen, die am Max-Planck Institut für Psychiatrie in München, Deutschland, durchgeführt wurden, zusammen mit einer Fallstudie für unipolare wiederkehrende Depressionen analysiert.

Die Erfinder entdeckten eine auffällige Verbindung von rs2799, das im 3'UTR des Gens angesiedelt ist und der Präsenz von Hypercholesterolemia (p=0.006), Diabetes Typ 2 (p=0.00058) und Schlaganfall (p=0.0008), aber nicht von hohem Blutdruck, Herzinfarkten oder Angina. Alle Assoziationen blieben signifikant in einer logistischen Analyse, wenn auf Alter, Geschlecht und Depressionsstatus kontrolliert wurde. Das lässt vermuten, dass das ISG12-Gen auch für humane Gefäßerkrankungen wichtig sein könnte. Fig. 15 zeigt die Verteilung von rs2799 Genotypen und die Präsenz von Gefäß-Risikofaktoren.

Diskussion:

Die Erfinder fanden einen neuen Modulator der Transkriptionsaktivitäten von einer Reihe von Nuklearen Rezeptoren, das Interferon-regulierte Gen 12 (ISG12), das mit NR4A1 interagiert. 8 AT 502 722 B1

Es wird stark von INFa und INFy reguliert, und überexprimiert in Gefäßverletzungen gefunden. Die Erfinder zeigen weiters, dass hier das ISG12, eine Nuklearhüllenprotein mit bis jetzt unbekannten Funktionen, die nukleozytoplasmische Verteilung von NR4A1 beeinflusst und dessen Transkriptionsaktivität unterdrückt. Wenn Mäuse mit fehlendem ISG12 auf ihre Empfänglichkeit Gefäßverletzungen zu entwickeln, analysiert wurden, fanden die Erfinder, dass ISG127'Mäuse gegen Restenose nach Karotisarterien-Ligationen resistent waren. Wenn man Mäuse mit zweifach fehlendem ISG12 und NR4A1 verwendete, zeigten sie wieder Restenosis auf die Karoti-darterien-Ligationen in einem ähnlichen Umfang wie Wildtypmäuse. Das zeigt an, dass in Gefäßpathologien das Hauptziel für ISG12 das NR4A1 ist. Weitere Unterstützung für eine mögliche Wichtigkeit von ISG12 kommt aus humangenetischen Studien. Die Erfinder konnten zeigen, dass eine starke Verbindung zwischen dem intronischen ISG12-Einzelnukleotid-Polymor-phismus (SNP), rs2799 und der Anwesenheit von Hypercholesterolemia, Diabetes Typ 2 und Schlaganfall besteht. Der GG-Genotyp von diesem Polymorphismus schützt vor dieser Störung. Das veranlasste uns den Effekt von ISG12 auf den angenommenen Nuklearrezepter PPARa und PPARy zu analysieren. ISG12 reguliert die Transkriptionsaktivitäten von PPARa und PPARy in ähnlicherWeise, wie es die Transkriptionsaktivität von NR4A1 tut. In ähnlicherWeise interagiert auch ISG12 physisch mit diesen Nuklearrezeptoren. Diese Daten zeigen an, dass ISG12 ein neues Gen ist, das in den Gefäßen im Bereich von Verletzungen reguliert wird und zu Gefäßpathologien beiträgt, indem es den Nuklearexport von "nützlichen" Nuklearrezeptoren vergrößert und zugleich die Transkriptionsaktivitäten verringert. ISG12 wird daher als Ziel für neue therapeutische Strategien für die Behandlung von Gefäßerkrankungen sein.

Methoden:

Zellkulturen, Vektoren, Transfektionen und Reagenzien.

Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) und humane Nabelschnurarterien glatter Muskeln (HUASMCs) wurden wie vorher beschrieben kultiviert und bis zur 5. Passage verwendet. HUVEC wurde unter Verwendung von Lipofectamine Plus® Reagenzien (Invitrogen, Carls-bad, CA) gemäß der Herstelleranleitung mit 1.5 pg DNA transferiert. Die Zellen wurden über Nacht mit M199 (3% Serum) behandelt. Humane Embryoale Nieren -293 Zellen wurden kultiviert wie empfohlen (ATCC, Manassas, VA). 293 Zellen wurden für den Luciferase-Reporter-Assay oder für Zellfraktionationsexperimente unter Verwendung von Calcium-phosphate und 3 pg DNA transferiert.

Humane ISG12, Gesamtlänge-Wildtypen und Aminosäuren 1-122, wurden in pCMV Myc (BD Biosciences-Clontech, Paolo Alto, CA) und NR4A1 in pCMV Myc geklont (Gesamtlänge 1-598) und dominant negative NR4A1 (248-580) wurde in EGFP-C1 geklont (BD Biosciences-Clontech, Paolo Alto, CA). Das Luciferase-Reporter-Konstrukt NBRE 4x (pGL3 Plasmid enthält 4 kanonischen NBRE-Seiten) und pc DNA 3.1 NR4A1 (1-598 Aminosäuren, Gesamtlänge, wt) wurden bereits beschrieben. Säugetier-Expressionsvektoren für humanes Retinoid X Rezeptor alpha (RXRa), Maus PPARy (mPPARy, Maus PPARa (m PPARa), und das Luciferase Reporter Konstrukt PPRE3-TK-LUC32 wurden von L. Nagy, Debrecen, Hungary, bereitgestellt.

Hefe-2-hybrid-Screening

Der Hefe-2-hybrid-Screen wurde unter Verwendung der MATCHMAKER und Screening Kit (BD Biosciences Clontech, Paolo Alto, CA) gemäß den Herstelleranleitung durchgeführt. Die gesamte RNA wurde von aktiven humanen uterus-microvaskularen Endothelzellen (HUMEC) isoliert, dann mit Endotoxin für 4, 9 und 16 Stunden stimuliert und Tumornekrosefaktor alpha (TNFa) für 2, 4, 9 und 16 Stunden bzw. mit Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA); mRNA wurde mit Oligo (dT)-markierten Magnet-beads gereinigt, (Dynal, Oslo, Norway). Die Regulierung von II-8 wurde durch quantitative rtPCR gezeigt (Roche Diagnostic, Basel, Switzerland) und bestätigte die effiziente Stimulation nach einer TNFa- oder LPS-Behandlung zu den jeweiligen Zeitpunkten (Daten nicht angeführt). Die von den verschieden stimulierten Zellen isolierten mRNAs wurden 9 AT 502 722 B1 vereinigt und die erste Strangsynthese wurde mit SMART technology durchgeführt (modifizierte Oligo (dT) Primers in Kombination mit MMLVRT). Die folgenden PCR, cDNAs und linearisierten pGADT7-Rec-Vektoren, die GAL4-Aktivierungsdamäne (AD) enthalten, wurden zu AH109 Hefe co-transformiert (MATa, trp1 -901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4A, gal80A, LYS2 : GAL1UAS -GAL 1TATA -HIS3, GAL2UAS -GAL2TATA -ADE2, URA3 : : MEL1UAS- MEL1TATA -lacZMELI). Für das Screening wurde ein Konstrukt von NR4A2, das die Aminosäure 248-557 enthält und dem die Transaktivierungsdomäne 2 fehlt, zu pGBKT7, welches die GAL4-Bindungsdomäne enthält, geklont (BD, Paolo ALto, CA)) und das daraus resultierende Konstrukt wurde durch Sequenzieren mit ABI Prism Prism® Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) auf 310 Genetic Analyzer (Perkin Eimer, Wellesley, MA) bestätigt. Die Autoaktivierung wurde durch Co-Transformation mit leerem AD ausgeschlossen. Das Bait-Konstrukt wurde in Y187 Hefeketten transformiert (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4A, gal80A, met -, URA3 : : GAL1UAS -GAL1TATA -lacZMELI). „Mating“ wurde gemäß den Herstelleranleitungen mit einer AH109 Hefe (mikrovaskulären Endothelzellen Library) durchgeführt, (2x106 unabhängige Klone [Clontech, Paolo ALto, CA) beschrieben von Brondyk.W.H. & Macara,I.G. Use of two-hybrid System to identify Rab binding proteins. Methods Enzymol. 257, 200-208 (1995)] resultierend in ca. 1,€x106 Transformanten. Positive Kolonieselektion wurde auf SD medium ohne Leucine, Tryptophane, Adenine und Histidine durchgeführt, und in der Anwesenheit von 35 mM 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT). Die Plasmid-DNA der Hefe wurde mittels der Methode von Liang und Richardson [Liang.Q. & Richardson.T. A simple and rapid method for Screening transformant yeast colonies using PCR. Biotechniques 13, 730-2, 735 (1992)] prepariert, gefolgt von Elektrotransformationen zu HB-101-Bakterien. Die Plasmide wurden von Bakterien durch Fast-Plasmid -TM-mini-kit isoliert (Eppendorf, Hamburg, Germany) und durch ABI Prism® Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) auf 310 Genetic Analyzer sequenziert (Perkin Eimer, Wellesley, MA). Positive Interaktionen von „bait and prey“ wurden durch Retransformation in Hefe bestätigt.

Immunoprezipitation, Western-Blotting

Die 293 transfizierten Zellen wurden mit einer phosphat-gepufferten Salzlösung gewaschen und für 30 min mit einem Zelllösungspuffer, der 2.7mM KCl, 1.5 mM KH2P04, 9.2 mM Na2HP04-2H20, 150 mM NaCI, 0.7% NP40, 0.3% Triton X-100 und komplette Proteasehinhibi-tor-Cocktail enthält, gelöst (Roche Diagnostic, Basel, Schweiz). Eine Konzentration von NaCI wurde dann auf 350 mM gestellt und Zelllysate wurden dann für 3h bei +4° mit 2 pg von entsprechenden Antikörper inkubiert: NR4A1 M210 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Anti PPARa H-98 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), antRXRa ΔΝ 197 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) oder Kaninchen-Immunoglobulinfraktion (DAKO, Milano, Italien) und Protein A-Sepharose-Beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Nach 5-maligem Waschen mit 1xPBS, waren dann die Beads in Laemmli-Puffer resuspendiert.

Immuofluoreszenz und Konfokales Mikroskop HUVECs oder SMCs wurden zu einer 50-80% Dichte auf Deckgläsern gezüchtet (Nalge Nunc International, Naperville, IL) und mit EGFP-NR4A1 (1-598) oder EGFP-dominante negative NR4A1 (248-580) und myclSG12 allein oder diese kombiniert transferiert. 30 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert, danach mit Triton X-100 behandelt und dann für myclSG12 mit anti-myc-Antikörper gefärbt (Oncogene, San Diego, CA) in einer Verdünnung von 1:100 und Alexa Flour 568 konjugiertes Ziege-Antimaus-zweiter-Antikörper in 1:200 Verdünnung (Molecular Probes, Eugene, Oregon). Die Anwesenheit von EGFP des co-transfektierten Vektors pEGFP-NR4A1 und pEGFP-dnNR4A1 wurde auf einem 10 AT 502 722 B1

Olympus AX-70 Mikroskop (HUASMCs) oder LSM510 (HUVECs) Mikroskop (Zeiss, Deutschland) bei 488 nm Excitation und 512 nm Emissionswellenlänge bestimmt und von dem Alexa-Flour-568-Label (Erregungswellenlänge 543 nm, Emissionswellenlänge 603 nm) unterschieden.

Zellfraktionen

Humane embryonale Nierenzellen (293) wurden in einem 6-well zu Subkonfluenz gezüchtet und dann mit EGFP-NR4A1 und myclSG12 zusammen oder separat transfiziert. Die Zellfraktionen wurden 30 Stunden nach der Transfektion behandelt, indem ein MS-Puffer (210 mM Mannitol, 70 mM sucrose, 5 mM Tris-HCI, pH 7.5 und 1 mM EDTA) verwendet wurde, der 1% Protease-Inhibitor-Cocktail enthielt. Nach der 10-maligen Homogenisierung der Zellen mit einer 27' Nadel, wurden die Proben bei 1300xg für 10 min bei 4°C zentrifugiert um die Zellkerne zu pelletieren. Der Überstand, der zytoplasmische und schwere Membranfraktionen enthält, wurde abgegossen und nochmals für 30 min bei 16000xg zentrifugiert um das Zytoplasma zu separieren; danach wurden die Membranen pelletiert. Kernpellets wurden nochmals mit eiskaltem PBS gewaschen und in MS-Puffer resuspendiert. Der Zellkern wurde durch eine zweite Zentrifugation bei 1300xg gereinigt und dann der Kerne durch einen Puffer lysiert, der folgendes enthält: 2.7 mM KC1, 1.5 mM KH2P04, 9.2 mM Na2HP04-2H20, 150 mM NaCI, 0.7% NP40, 0.3% Triton X-100 und kompletten Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostic, Basel, Switzerland). Separierte Kern- und zytoplasmische Fraktionen wurden in Laemmli-Puffer gelöst und nach der Separierung auf ein 9%SDS PAGE Western geblottet unter Verwendung von einem Anti-EGFP-Antikörper (Abcam, Cambridge, UK)

Luciferase Analyse:

Humane embryonale Nierenzellen (293) oder HUVECs wurden wie oben erwähnt mit Renilla-vektor als einer internen Kontrolle transferiert. Im Falle von Experimenten, bei denen PPARs durch ihre Bindungen stimuliert wurden, wurde das Medium 9 Stunden nach der Transfektion gewechselt und die Stimulierung mit WY-14 643 (Biomol, Hamburg, Deutschland) oder Rosigli-tazone Maleate (Alexis Biochemicals, Lausen, Schweiz) 21 Stunden vor der Luciferase bzw. Renilla-Analysen durchgeführt. Luciferase und Renillaanalysen wurden 30 Stunden nach der Transfektion der Zellen in Zelllysaten mit einem Dual-Luciferase-Assay-Kit (Promega, Madison, Wisconsin) gemäß der Herstellerbeschreibung durchgeführt. Die Luciferaseaktivität wurde zu den jeweiligen Renillawerten normalisiert. Alle Experimente wurden in dreifacher bzw. mindestens in zweifacher Ausführung durchgeführt. RNA Isolierung und relative, quantitative reverse transriptase-Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) RNA von stimulierten HUVECs und von humanen und Mausgewebeproben wurden unter Verwendung von Trizol entnommen (Invitrogen, Carlsbad, CA) Reagenzien. Die gesamte RNA (900 ng) wurde mit MuLV-Reverse-Transcriptase unter Verwendung des Gene Amp-RNA-PCR-Kit (Applid Biosystems, Foster City, CA) und Oligo dT16 Primers umkehrtranskribiert. Isolierte Arteriengewebe von Mäusen wurde in eiskaltes RNAIater eingetaucht (Ambion, Austin TX) und in Puffern bei -70° bis zur Isolierung gelagert. Die RNA-Isolierung von gepooltem Arteriengewebe (n=3) wurde wie von Furnkranz.A. et al. Oxidized phospholipids. trigger atherogenic inflam-mation in murine arteries. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 25, 633-638 (2005) beschrieben durchgeführt und 350 ng RNA wurden mit dem selben Set wie zuvor umkehrtranskribiert.

Die mRNA-Sequenzen für die Genanalyse wurden von der GenBank erhalten. Die Primer (von Maus und Mensch) wurden unter Verwendung von PRIMER3 Software (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) konstruiert. Die folgenden Forward- (F) und Reverse-Primers (R) wurden für humanes ISG12 verwendet: F, 5'-TGTGATTGGAGGAGTTGTGG -3'; R, 5'-GAACTTGGTCAATCCGGAGA -3'; Maus ISG125’- CTG CCA TAG GAG GAG CTC TG-3’ and 5’- ATG GCA TTT GTT GAT GTG GA-31; humanes MCP-1; Maus MCP-1; humanes IL-8 F, 1 1 AT 502 722 B1 5’- CTC TTG GCA GCC TTC CTG ATT-3'; R, 5-TAT GCA CTG ACA TCT AAG TTC TTT AGC A-3'. Q-PCR wurde von LightCycler-Technologie unter Verwendung von Fast Start SYBR-Grünem I-Kit für die Verstärkung und den Nachweis durchgeführt (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz). In allen Analysen wurde cDNA durch ein standardisiertes Programm redupliziert (10' Vergällungsschritte und 55 Zyklen von 5' bei 95°C; 15' bei 65°C und 15' bei 72°C; Schmelzpunktanalysen in 0,1° C Schritten; End-Kühlungs-Schritt). Jede Light Cycler-Kapillare wurde mit 1,5 pL MgC12 (25 mM) geladen; 10.1 pLH20; und 0,4 pL von jedem Primer (10 pM). Der Endbetrag der cDNA pro Reaktion bezieht sich auf 2,5 ng totale RNA, die für die Reverstranskription verwendet wurde. Die relative Quantifikation von Ziel-Gen-Expressionen wurde unter Verwendung von mathematischen Modellen von Pfaffl durchgeführt. Die Expression des Zielmoleküls wurde zu der Expression von PBGD mit Primers für humane PBGD F, 5'-TCG AGT TCA GTG CCA TCA TC- 3’ and PBGD R, 5-CAG GTA CAG TTG CCC ATC CT-3' oder Maus PBGD genormt.

Generierung von ISG 12^ und Mäuse mit ISG12"/_ NR4A1"/' doppelt Defizienz

Die ISG^Mäuse wurden gemäß der von Uhrin,P. et al. Disruption of the protein C inhibitor gene results in impaired spermatogenesis and male infertility. J. Clin. Invest 106, 1531-1539 (2000). beschriebenen Vorgangsweise generiert. Das murine Gen besteht aus 4 Exons, das durch 3 relativ kleine Introns separiert wird (Introns I bis III). Die cDNA-Sequenz von mlSG12 wurde verwendet um Primer speziell für die verschiedenen Regionen von mlSG12-Gene zu konstruieren. Bei der Verwendung von 129S/v Genomic-DNA als Template, wurde die PCR-Reaktionen optimiert und für das Screening verwendet (Hindlll von einer 129S/v-Mausgenomic-DANN) und in einen RPCI.22 BAC-Vektor geklont (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die so erhaltenen Genomic-Klone wurden verwendet um die Zielvektoren vorzubereiten, die das ISG12-Gen in embryonalen Stammzellen (ES) inaktivieren. Insgesamt wurden 8,5 kb homologe Sequenzen von dem ISG12-Gen in einen parentalen pPNT-Vektor eingeführt, der neomycine Phospho-transferase (neo) Kassetten und ein Herpes-Simplex-Virus pPNT.mlSG12. enthält. Beim ersten Schritt wurde ein 4,7 kb Xhol-Fragment (das 5'UTR von mlSG12 Gen enthält) mit einem Xhol-Site eines pPNT-generierten Plasmids pPNT1.mlSG12 verbunden. Danach wurde ein 3,8 kb EcoRI-Fragment (das 3'UTR eines mlSG12 Gen umfasst) zu dem EcoRI-site von pBluescript®ll KS (+/-)-Vektor (Stratagene, La Jolla, Ca) geklont. Anschließend wurde ein 3,85 kb Sall-Smal Fragment von diesem Vektor Klenow-gefüllt und mit Asp718 site/Klenow-gefüllten pPNT1.mlSG12 verbunden, in dem der Vektor pPNT.MISG12 entnommen wurde. Die Transfek-tion von Zielvektoren resultierte in 4 aus 200 G418/Ganciclovir-doppelt-resistenten Klonen, die die erwünschte homologe Rekombination durchmachten, wie dies durch das umfassendes Southern Blotting von der isolierten genomischen DNA, die von R1 embryonalen Stammzellen (ES) abgeleitet wurde, bestätigt und zwar von der 129S7v Mauskette (erhalten von A. Nagy, Samuel Lunenfeld Institute, Toronto, Canada).

Chimäre Mäuse (F0), erhalten von 8 Zellenstadium-Embryoaggregaten der ES-Zellenklone, wurden für Keimlinien-Transmissionen mit Swiss-Mäusen testgezüchtet. Sie übertrugen die zerstörten ISG12-Allele zu ihrem Ursprung (50% 129S/v : 50% Swiss-genetischer Hintergrund), indem ISG12+/'Mäuse erhalten wurden. Zwischenkreuzungen dieser Mäuse resultierten in ISG^'Mäusen, wie dies durch die Southern Blot-Analysen der Schwanzspitzen-DNA unter Verwendung der 3'-externen Probe identifiziert wurde. Die korrekte Inaktivierung der ISG12-Gene wurde weiters durch zusätzliche Übersichten unter Verwendung von 5'-externen, 5'-internen, neo-spezifischen und 3'flankierten internen Proben (nicht gezeigt) und durch RT-PCR bestätigt. Wild-typen und heterozygote Kontrollmäuse, die in dem Experiment verwendet wurden, wurden von einem Wurf von den entsprechenden Knockouts genommen. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den institutioneilen Anweisungen durchgeführt und von dem jeweiligen Universitätskommitee überprüft (Österreichische Bewilligung für Tierexperimente No 169/1999).

Um ISG^' doppelt-defiziente Mäuse und die entsprechenden Kontrollmäuse mit einzelner 1 2 AT 502 722 B1 ISG^' oder NR4AT/'-Defizinenz zu generieren, wurden ISG^'Mäuse mit NR4A1‘/‘ Mäusen gekreuzt (in B6 Hintergrund, zur Verfügung gestellt von J. Milbrandt von dem Department für Pathologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA). Die erhaltenen doppeltheterozygoten Mäuse wurden anschließend gezüchtet um ISG12+/+ NR4A1+/+, ISG12+/+ NR4A1'/', ISG12_/‘ NR4A1+/+ and ISG12_/‘ NR4A1"/‘ Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse wurden für Analysen verwendet. Das Genotypisieren der Mäuse in Bezug auf die NR4A1-Allele wurde durch Southern Blotting unter Verwendung einer Exon-2-spezifischen Probe und BamHI geschnittenener genomischer DNA durchgeführt (ein 4,9 kb und eine 6,6 kb Fragments für die Wildtypen beziehungsweise rekombinierte DNA).

Tierexperimente: Für das Restenosis-Mausmodell wurden 8-Wochen alte Mäuse für eine Karotidarterienligation verwendet [veröffentliche Methode von Kumar.A. & Lindner.V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17, 2238-2244 (1997)]. Die linke gemeinsame Caretisarterie von Ketamine/Xylazin-anästhesierten Mäusen wurde in der Nähe der distalen Gabelung ligiert (n=4 bis 7). 2,5 oder 4 Wochen nach der Ligation, wurden die Mäuse anästhesiert und nachträglich das Herz mit PBS durchpumpt und die Karotidarterien entnommen. Für das atherosklerotische Läsionsmodell in Mäusen, wurden Apo E+ und wt-Mäuse im Alter von 6 Monaten mit Ketamine/Xylazine anästhesiert und dann das Herz mit PBS durchpumpt und der Aortenbogen und die Herzmembrane entnommen.

Morphometrie

Die Arterie wurde von der Ligatur zum Aortenbogen abgeschnitten, mit 4% Paraformaldehyde fixiert und dann mit Haematoxylin und Eosin oder mit Aktin für glatte Muskelzellen gefärbt (Klone 1A4-FITC, Sigma) und mit DAPI gegengefärbt (4,6 diamidino-2-phenylindole; Vektor Laboratorien, Burlingame, CA). Ein standardisierter Bezugspunkt wurde gesetzt, bei dem die Gefäßstruktur durch die Ligatur nicht deformiert wurde und die Lamina elastica intakt waren. Schnitte 0,7 mm, 1.7 mm und 2.7 mm vom Bezugspunkt aus wurden unter Verwendung der AnalySiS® Software-Pakt (Soft Imaging System; Münster, Deutschland) auf digitale Bilder der Gefäße morphometrisch analysiert (grüner Kanal: Glatte Muskel-Actine, Blauer Kanal: DAPI und Roter Kanal: Autofluoreszenz der Lamina Elastica), erhalten mit einer F-View-Kamera auf einem Olympus AX-70 Mikroskop. Der Umfang des Lumen, der internen elastischen Lamina und der externen elastischen Lamina wurden gemessen und die Media Area, neointimale Area und neointima/Media Ratio wurden berechnet.

Patientenrekrutierung 853 Personen wurden im Max-Planck-Institut für Psychiatrie in München (Deutschland) im Zusammenhang einer Fallstudie für unipolare, wiederkehrende Depressionen rekrutiert, die zu 88% deutscher und der Rest kaukasischer Abstammung waren. Bei diesen Patienten wurde die psychiatrische Diagnose durch WHO-Beauftrage gemäß DSM-IV unter Verwendung des Plans für Klinische Auswertungen in Neuropsychiatry ermittelt (SCAN). Passende Kontrollen wurden von einem in München ansässigen Kollektiv ausgewählt und auf die Anwesenheit von Angst-und bedingten Depressionen unter Verwendung des Composite International Diagnostic Scree-ners überprüft. Zusätzlich wurden 35 verschiedene medizinische, neurologische und psychiatrische Depressionen in allen depressiven Patienten und bei Gesundenkontrollen und deren Verwandten ersten Grades unter Verwendung eine Selbstbeschreibung bewertet. Für diese Studie wurden auch Krankheiten wie Herzinfarkt oder Angina, Schlaganfall, hoher Blutdruck, hohes Blutcholesterin und Diabetes Typ 2 bei den Patienten und den jeweiligen Kontrollen dokumentiert und für statistische Analysen verwendet. Von den 853 Personen hatten 366 unipolare Depression, 35 Koronare Herzkrankheit oder Angina, 161 zu hohen Cholesterinspiegel, 1 3 AT 502 722 B1 187 Hypertonie, 37 Diabetiker Typ 2 und 11 Schlaganfälle. 67,3% waren weiblich und das Durchschnittsalter betrug 50,8 Jahre (SD=13.8).

Genotypisierung

Zu Beginn dieser Studie wurden 40 ml EDTA-Blut von jedem Patienten entnommen und untersucht. Die DNA wurde von Frischblut unter Verwendung von PuregeneTM Vollblut-DNA-Extraktions-Kit extrahiert (Gentra Systems Inc; MN). 3 SNPs (rs223944, rs223945 and rs2799) wurden aus humanen Chromosomen von ISG12, IFI27 (NM_005532) ausgewählt, die auf dem Chromosom 14q32 (unter Verwendung von dbSNP) lokalisiert ist (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/). Die SNP-search-tool bei http://ihg.gsf.de/ihg/snps.html wurde verwendet um SNP-Sequenzen von öffentlichen Datensätzen herunterzuladen. Hary Weinberg Equilibrium (HWE) wurde in der psychiatrischen Kontroll-gruppe getestet. Beide SNPs waren in Hardy Weinberg Equilibrium in dieser Gruppe von Individuen zu finden (p = 0.20 für rs2799 and p = 0.44 für rs223944).

Das Genotyping wurde auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer (MassArray® System) unter Verwendung der Spectrodesigner Software (Sequenom™; CA) für Primerselektion und Multiplexing durchgeführt und die homogenetische Masse-Extension (hMe) für die Produktion von Primer-Erweiterungsprodukte bearbeitet. Das Genotyping wurde bei Geneticx Research Centre GmbH, München, Deutschland, durchgeführt. Alle Primersequenzen sind auf Anfrage erhältlich.

Statistische Analysen

Experimentelle Werte werden als Durchschnitt ±SEM angegeben. Die statistische Bedeutung von Unterschieden in den Ergebnissen wurden mittels Student's unpaired two-tailed t-test analysiert.

Die Signifikanz von Unterschieden in der Morphometrieanalyse wurde unter Verwendung von nichtparametrischen Mann-Whitney-2-tailed-U-Test bestimmt und als Wahrscheinlichkeitswert ausgedrückt. IFI27-SNPs wurden für den Zusammenhang mit einem Herzinfarkts oder Angina, Schlaganfall, Bluthochdruck, hohem Blutcholesterin und Diabetes Typ 2 getestet. Analysen für diese „Case-Control“ Zusammenhänge wurden unter Verwendung des Armitage's-trend-Tests als statistische Methode bei (http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl) durchgeführt. Die statistischen Tests wurden für die Eingabe ins Internet von Sasieni [Sasieni,P.D. From genotypes to genes: doubling the sample size. Biometrics 53, 1253-1261 (1997)] adaptiert. Zusätzlich wurden Verbindungsanalysen durchgeführt, indem die logistische Regression unter Verwendung von SPSS für Windows berechnet wurde, (Releases 11, SPSS Inc., Chicago, DL) Testeffekte auf dem genotypischen Niveau mit Alter, Geschlecht und Depressionsstatus als Wertpaare.

GenBank-Zugangs-Nummern:

Protein Homo sapiens ISG12, Gl:55925614; Mus musculus ISG12 Gl:44771124; Homo sapiens Nur77 GL21361342, mRNA Homo sapiens ISG12 GL55925613; Mus musculus ISG12 Gl:44771123; Homo sapiens Nur77 GL21361342 mRNA Homo sapiens Hydroxymethylbilane synthase HMBS (PBGD) GI:66933007mRNA Homo sapiens Interleukin 8 (IL8) Gl:28610153 Target für neue therapeutische und diagnostische Strategien bei Entzündung, metabolischen und Gefäßerkrankungen.

Claims (2)

14 AT 502 722 B1 Patentansprüche: 1. Verwendung von humanem oder Mäuse-ISG12 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Gefäßverschlusserkrankungen, Atherosklerose, koronare Herzkrankheit, Herzinfarkt, Angina, Schlaganfall, Diabetes Typ II, Bluthochdruck und hohem Blutcholesterin.

2. Verfahren zum Diagnostizieren in vitro der Suszeptibilät für Gefäßverschlusserkrankungen, Atherosklerose, koronare Herzkrankheit, Herzinfarkt, Angina, Schlaganfall, Diabetes Typ II, Bluthochdruck und hohem Blutcholesterin, dadurch gekennzeichnet, dass hiefür Single-nucleotide-Polymorphismen im humanen ISG12-Gen verwendet wird. Hiezu 15 Blatt Zeichnungen