WO2007036552A1 - Variante des humanen sv2a-proteins und deren einfluss auf die therapieantwort bei epilepsie - Google Patents

Variante des humanen sv2a-proteins und deren einfluss auf die therapieantwort bei epilepsie Download PDF

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Christian Erich Elger
Armin Heils
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Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn
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Definitions

  • the invention relates to a variant of the human synaptic vesicular protein SV2A ("SV2A variant") and to methods for detecting this variant and the DNA coding for it. This evidence is suitable for predicting the efficacy of certain antiepileptic drugs. Furthermore, the invention relates to methods for the identification of drugs against epilepsy, which react with this SV2A mutant and methods for the treatment of epileptics, which include the detection of the SVA2 variant.
  • epilepsy In addition to stroke and headache disorders, epilepsy, with a lifetime prevalence of about 2 percent, is one of the most common neurological diseases. The treatment is primarily medicinal. About two-thirds of patients are treated successfully with classical antiepileptic drugs (eg carbamazepine). About one-third of patients will not be seizure-free with these drugs and will be classified as "difficult to treat" patients. These patients have been using newer antiepileptic drugs for several years. This also includes the substance levetiracetam (LEV, fSj- ⁇ -ethyl-2-oxopyrrolidinacetamide, formula I) (trade name: Keppra, UCB Pharma), the synthesis of which is described in EP-B-0162036.
  • LUV levetiracetam
  • fSj- ⁇ -ethyl-2-oxopyrrolidinacetamide formula I
  • LEV is an ethyl analog of piracetam and is used in particular in add-on therapy for difficult-to-treat epilepsies. Many of the difficult-to-treat patients become “seizure-free" with the use of LEV, but about 20 percent of patients show no positive effect at all (“non-responders"). In contrast to classical antiepileptic drugs, LEV does not have a broad effect via various receptors and / or ion channels, but according to current knowledge, LEV exerts its effect via binding to the protein SV2A (Lynch, BA et al., Proc. Natl. Acad USA 101: 9861-9866 (2004)).
  • EP-A-1426768 describes methods for the characterization of SV2 proteins and for the identification of compounds which influence the activity of SV2A proteins or the binding of LEV to SV2 proteins. However, EP-A-1426768 does not address cases where there is no binding between LEV and SV2 proteins.
  • EP-A-1426768 indicates the possibility of splice variants in SV2A.
  • a splice variant lacking the region encoded by exon 7 in the native human SV2A gene is not described in EP 1426768. Therefore, EP 14216768 does not allow any conclusions to be drawn as to the significance of precisely this splice variant, its fusion proteins and homologues.
  • the aim of the present invention was therefore to provide a method by which a determination of the risk or a prediction is made possible that an epileptic patient, or a patient with another neurodegenerative or seizure-associated disease, not on a therapy with LEV or a Drug with the same action principle as LEV responds.
  • SV2A variant a protein which is a splice variant of the human SV2A protein ("SV2A variant") and in whose amino acid sequence the region lacking exon 7 in the native SV2A gene is absent compared to the wild-type SV2A protein as well as homologues and fusion proteins of said protein; (4) an isolated nucleic acid sequence coding for the protein of (3);
  • Fig. 1 SV2A gene segment in which the polymorphism was found.
  • the primers (gray areas) for the amplification of the gene segment were in
  • the exons 6, 7 and 8 are shown in bold.
  • Intron 6 is highlighted by larger font.
  • Fig. 2 Result of gel electrophoretic separation of cDNA prepared by RT-PCR with mRNA from patients with GG or GA genotype with primers for exons 5 to 9 of SVA2 (see example 3). While the GG genotype (GG) shows only the expected wild-type band of the correct length, in all GA
  • Genotypes two more bands (DeI exon7 and DeI exon6 / 7) with shorter ones
  • mutant and wild-type are used synonymously in the context of the present application. They denote that human SV2A gene or SV2A protein, which normally occurs naturally, that is represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • isolated is a nucleic acid or protein when it is separate from the organism or tissue in which it naturally occurs. This includes purified native nucleic acids and proteins as well as recombinant or chemically produced nucleic acids and proteins.
  • Splice variant refers to a protein variant whose amino acid sequence differs from the wild-type protein in that one or more exons are eliminated by splicing during translation. These exons are then missing in the mature mRNA and are therefore not translated into the corresponding amino acid sequence.
  • SV2A variant an SV2A splice variant according to the invention
  • at least the exon 7 is absent in the mature mRNA underlying the variant, in a preferred embodiment only the exon 7, in a further preferred embodiment the exon 6 and the exon 7 "Patient” basically refers to a person who is suffering from epilepsy or another seizure disorder or neurodegenerative disease.
  • the method of the present invention is preferably suitable for epilepsy patients.
  • "Homologs" of the SV2A variant in the context of the present invention are proteins derived from the amino acid sequence of native SV2A (SEQ ID NO: 3).
  • polystyrene resin within the amino acid sequence of which up to 5 single or consecutive amino acid residues are deleted or inserted.
  • Preferred homologs are those having only one of the changes (i) to (iii) over the native SV2A.
  • fusion proteins encompasses proteins which, in addition to a domain containing the SV2A variant according to the invention, contain a further domain with a functional protein ("further domain"). These domains are either linked via a linker or directly linked together.
  • the "further domain” does not contain a sequence which is encoded by exon 7 or exon 6 and exon 7 of the human SV2A gene.
  • the homologues and fusion proteins of the present invention do not comprise the native SV2A splice variants or full-length proteins (wild-type proteins).
  • the present invention is based on the surprising experimental finding that the gene encoding SV2A is responsible for the different LEV response in epilepsy patients. In the following, it will be described in more detail using the SV2A gene of epilepsy patients who respond to the "add-on" antiepileptic drug LEV or not. However, this is not intended to limit the invention to precisely this one aspect.
  • said antiepileptic drug may also be a piracetam analogue other than LEV.
  • Suitable piracetam analogs are selected from compounds of structure II
  • R ' and R are independently selected from H, Ci-C 3 - Koh Ie n hydrogen chains, n is 0, 1 or 2, and the ring carbon atoms (except for the carbonyl atom) are substituted with R ' .
  • GG genotype GG genotype
  • GA genotype GA genotype
  • GA GA genotype
  • AA genotype AA genotype
  • RT-PCR experiments were performed (Example 3).
  • RT-PCR which amplified the region of exon 5 to 9, revealed only one band in GG, which could be verified by wild-type sequencing.
  • All carriers of the GA genotype showed two additional bands in individually varying degrees in addition to the wild-type band ( Figure 2).
  • sequencing it was verified that these are previously unknown splice variants, namely variants in which either exon 7 or exons 6 and 7 were deleted ("DeI exon7" and "DeI exon6 / 7"). These deletions lead to a truncation of the protein.
  • both are "in-frame” splice variants, there is no frameshift of the reading frame.
  • the detection of the point mutation in the method according to embodiment (1) is carried out either at the DNA, RNA or protein level in a body fluid or a tissue sample of the patient in vitro.
  • the body fluid is selected from blood, saliva and serum, and is preferably venous whole blood.
  • the tissue is selected from brain tissue, skin and oral mucosa and is preferably oral mucosa.
  • the sample can be used directly, especially in the case of body fluids.
  • the nucleic acid contained in the sample to be examined is enriched before carrying out the detection. Such enrichment may be by standard methods for the isolation of DNA or RNA, such as. B. by cell lysis, subsequent precipitation of the nucleic acid (preferably by ethanol addition) and / or chromatographic purification of the nucleic acid.
  • the preferred detection method at the DNA or RNA level in the method according to (1) is a PCR with suitable primer pairs or a hybridization assay with a suitable probe.
  • RT-PCR is used.
  • Particularly suitable primer pairs for PCR or RT-PCR are pairs that are complementary to the point mutation flanking sequences, preferably 15 to 35 nt in length, and / or that hybridize to sequences in exons 5 and 9 of the native SV2A gene. Very particular preference is given to the primer pairs shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, 10 and 11 and 13 and 14, in particular the pair of SEQ ID NO: 12/13.
  • any textbook hybridization method can be used to detect SNP.
  • Particularly suitable hybridization probes are those probes which immediately flank the corresponding point mutation or lie above the point mutation. One or more of these hybridization probes further carry markers suitable for detection, as defined on p. As fluorescent marker or radioactive isotopes.
  • the preferred protein-level detection method in embodiment (1) is the immunological detection of the presence or absence of the point mutation in the SV2A gene. This immunological detection is performed by testing for the presence or absence of the region of the SV2A protein encoded by exon 7 or by exon 6 and 7 in a patient's body fluid or tissue sample as defined above in vitro.
  • the sample can be used directly, especially in the case of body fluids.
  • the protein contained in the sample being tested for immunological detection before Verification with standard methods such.
  • Suitable test systems for immunological detection in the method according to (1) are standard immunoassays, in particular ELISA.
  • an antibody specific for either the region of the SV2A protein encoded by exon 7 in the native SV2A gene or specific for an SVA2 variant encoding it by exon 7 is used Area is missing.
  • the antibody of embodiment (8) is used.
  • the protein according to embodiment (3) preferably also lacks in the amino acid sequence the region encoded by exon 6 in the native SV2A gene.
  • the protein according to (3) is an SV2A protein in which the amino acid residues 396-432 or 396-462 of the wild-type SV2A protein shown in SEQ ID NO: 3 are deleted, or preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acid sequence according to embodiment (4) has in a preferred aspect in the intron 6 at the base pair position 169 (with inverse numbering of the intron 6 according to FIG. 1: position -60) a point mutation from G to A.
  • this nucleic acid sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 9 and is particularly preferably represented by SEQ ID NO: 15.
  • the nucleic acid sequence is an mRNA or its corresponding cDNA which lacks the region of exon 7 or exons 6 and 7 of the SV2A gene.
  • This nucleic acid sequence particularly preferably encodes the proteins of SEQ ID NO: 5 or 7.
  • this nucleic acid sequence has an mRNA or its corresponding cDNA having one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or 6.
  • the cell according to embodiment (6) is preferably a eukaryotic cell, more preferably a vertebrate cell, most preferably a rodent cell.
  • the organism or tissue in embodiment (7) is preferably a vertebrate tissue, more preferably a rodent tissue. Very particular preference is given to mice or rats or their tissues.
  • the detection of a binding between the SV2A variant and the test substance in embodiment (9) is carried out using standard methods for the detection of substance-protein complexes on solid phase or in solution. Such methods include visualization using suitable markers (both the test substance and the SV2A variant or both may be labeled) linked to the test substance, detection of radiolabelled molecules, detection by antibodies, mass spectrometry, etc.
  • markers are all those substances whose chemical or physical properties allow the distinction of labeled and unlabeled substance-protein complexes by physical, chemical or immunological methods.
  • Suitable labeling methods include radioactive labeling, labeling with fluorescent, luminescent or chromophore compounds and labeling with haptens (such as psoralen or DIG).
  • the detection further comprises the detection of the marker, ie scintillation counting (eg by phosphoimager); photo-optical measurement (eg fluorescence measurement) or immunological detection.
  • the method according to embodiment (9) is particularly suitable for the identification of drugs for the treatment of seizures, neurological disorders, endocrinopathies and hormonal disorders, especially of drugs for the treatment of epilepsy suitable.
  • Genotyping in process (12) is preferably done by a method as defined in embodiment (1).
  • DNA extraction is from venous EDTA blood by the method of Miller, SA et al., Nucleic Acids Res. 16: 1215-1218 (1988).
  • the erythrocytes were first lysed and discarded in several washing and centrifugation steps. Subsequently, the leukocytes were broken up chemically and the remaining cell components (proteins, lipids) were broken down (Incubation overnight at 37 0 C). For subsequent protein precipitation, a saturated NaCl solution was added, this mixture was centrifuged again and the salted-out proteins were deposited.
  • the DNA was in the supernatant and precipitated upon addition of 100% ethanol. It was "fished out” and, after a short swing in 70% ethanol, taken up in TE buffer. "In detail, the method included the following steps:
  • Pelleting the leukocytes Centrifugation at 1500 rpm for 15 min at 4 ° C.
  • the DNA had dissolved after a few days and the concentration could be determined photometrically.
  • the dissolved DNA was mixed in a ratio of 1:20 with TE buffer and the absorbance of this solution was measured in the photometer at 260 nm.
  • the DNA concentration was normally between 300-1000 ng / ⁇ l (about 10 ml EDTA blood). Dilutions in the concentration of 10 ng / ⁇ l were then prepared from these DNA solutions.
  • PCR conditions Two-step PCR: RedTaq 50 ⁇ l volume: 25 ⁇ l RedTaq Ready Mix, 1 ⁇ l water, 2 ⁇ l primer dilution (10 pmol / ⁇ l), 10 ⁇ l DNA dilution (10 ng / ⁇ l).
  • Annealing 62 ° C for 10 cycles, 60 0 C for 30 cycles
  • Elongation 1 min 30 s.
  • the PCR product was 1056 bp in size.
  • a polymorphism could be identified in intron 6 (IVS6-60G> A), namely a replacement of the native G for A at position 169 (-60) (SEQ ID NO: 8, native intron 6 sequence, SEQ ID NO: 9 , Variant intron 6 sequence).
  • the PCR products were then applied to a 2% agarose gel (8 g agarose to 400 ml TBE buffer and 30 ⁇ l ethidium bromide).
  • the REDTaq Ready Mix already includes a Loading Buffer to apply to the gel.
  • a length marker was used, which was used to estimate the fragment length.
  • the applied voltage was 170 V (93 mA), running time approx. 45 min. Subsequently, the gel was photographed under UV light.
  • Example 3 RT-PCR for the production of cDNA of the region between exon 5 and exon 9 of SV2A and identification of the polymorphism in intron 6 of the SV2a gene
  • RNA isolation from whole blood was performed using the QIAamp ® Blood RNA Mini Kit unless otherwise indicated in the following by Herstelelran reference.
  • the whole blood used was from 20 "GA” genotypes and 20 "GG” genotypes.
  • a maximum of 1.5 ml of EDTA blood was mixed with 7.5 ml of erythrocyte lysis (EL) buffer in a 50 ml centrifuge tube and incubated on ice for 10 minutes. The intact leukocytes were then pelleted in a refrigerated centrifuge (10 min at 4 0 C and 400xg).
  • EL erythrocyte lysis
  • the leukocyte pellet After centrifugation, the supernatant was decanted, the leukocyte pellet resuspended in 3 ml of EL buffer and then recentrifuged under the same conditions. The supernatant was discarded, the pellet washed with a few milliliters of PBS (phosphate buffered saline, 1.09 g / l Na 2 HPO 4 , 0.32 g / l NaH 2 PO 4 , 9 g NaCl, pH 7.2). By the subsequent addition of 600 .mu.l of the ⁇ -mercaptoethanol-containing buffer RLT and the repeated drawing in the pipette, the leukocytes were lysed.
  • PBS phosphate buffered saline, 1.09 g / l Na 2 HPO 4 , 0.32 g / l NaH 2 PO 4 , 9 g NaCl, pH 7.2
  • the viscous solution was placed on a QIAshredder column for further homogenization, centrifuged in a benchtop centrifuge (2 min at maximum speed) and then mixed with 600 ⁇ l of 70% ethanol.
  • the mixture was pipetted onto a QIAamp column, centrifuged for 30 s at at least 10,000 rpm and the centrifugate was discarded together with the collecting vessel.
  • the RNA now bound to the column was washed several times. For this, the column was placed in a new collecting vessel, loaded with 700 ⁇ l of buffer RWI and centrifuged for 30 seconds at at least 10,000 rpm. Centrifuge and collecting vessel were discarded and the column placed in a new collection vessel.
  • the column was loaded with 500 ⁇ l of RPE buffer and centrifuged under the same conditions as before. The column was then placed in a new collection vessel, loaded with a further 500 ⁇ l of RPE buffer and centrifuged for 3 minutes at 13200 rpm.
  • the purified RNA was rinsed out by adding 50 ⁇ l RNAse-free water to the column in a 1.5 ml Eppendorf tube.
  • RNA content of the solution is then determined in a photometer against HPLC water as a balance.
  • BI RT-PCR was performed according to the manufacturer's instructions with the QIAGEN ® OneStep RT-PCR Kit. For this purpose, per reaction in a 200 ul PCR reaction vessel
  • the following reagents were mixed with ice: 2.5 ⁇ l buffer (5 ⁇ ), 1.5 ⁇ l forward primer (200 ⁇ M), 1.5 ⁇ l reverse primer (200 ⁇ M), 1 ⁇ l dNTP (400 ⁇ M of each dNTP), 1 ⁇ l
  • Enyzm mixture of a reverse transcriptase and a DNA polymerase
  • RNA 0.5 ⁇ g RNA, ad 25 ⁇ l with HPLC-water.
  • reaction vessels were immediately transferred from the ice to the preprogrammed PCR
  • Thermocycler provided.
  • the RT-PCR program involved reverse transcription with a direct subsequent touch-down PCR.
  • the RT-PCR program in detail was as follows:
  • the resulting solution was pipetted onto a column and, by subsequent centrifugation, the DNA from the solution was bound to the column.
  • the DNA was then freed in a plurality of washing steps of salts and gel residues and rinsed in a final centrifugation step with 35 ul HPLC water from the column in an Eppendorf vessel.
  • the DNA thus isolated was used for subsequent sequencing (see below, item D).
  • Control of the quality of cleaning 5 ⁇ l of the purified DNA solution were admixed with 5 ⁇ l Loadingbuffer and applied to a 2% agarose gel. After half an hour of gel electrophoretic separation at 170 V and 93 mA, the quality of the purification was checked under UV light. The size and concentration of the DNA was determined by a running standard. The result of RT-PCR is shown in FIG. D) Sequencing: The sequencing of the purified DNA was carried out at Quiagen, Germany with sequencing primers represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, ie the same primers as used for the RT-PCR (see point B).

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Abstract

1 Zusammenfassung Die Erfindung betrifft eine Variante des humanen synaptischen vesikulären Proteins SV2A (,,SV2A-Variante') und Verfahren zum Nachweis dieser Variante und der dafür codierenden DNA. Dieser Nachweis ist zur Voraussage der Wirksamkeit von 5 bestimmten Antiepileptika geeignet. Des Weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen Epilepsie, welche mit dieser SV2A- Mutante reagieren sowie Verfahren zur Behandlung von Epileptikern, welche den Nachweis der SVA2-Variante umfassen.

Description

Variante des humanen SV2A-Proteins und deren Einfluss auf die Therapieantwort bei Epilepsie Die Erfindung betrifft eine Variante des humanen synaptischen vesikulären Proteins SV2A ("SV2A-Variante") und Verfahren zum Nachweis dieser Variante und der dafür codierenden DNA. Dieser Nachweis ist zur Voraussage der Wirksamkeit von bestimmten Antiepileptika geeignet. Des Weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen Epilepsie, welche mit dieser SV2A- Mutante reagieren sowie Verfahren zur Behandlung von Epileptikern, welche den Nachweis der SVA2-Variante umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Neben dem Schlaganfall und den Kopfschmerzerkrankungen gehört die Epilepsie mit einer Lebenszeitprävalenz von ca. 2 Prozent zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen. Die Behandlung ist primär medikamentös. Etwa zwei Drittel der Patienten sind mit klassischen Antiepileptika (z. B. Carbamazepin) erfolgreich zu behandeln. Etwa ein Drittel der Patienten werden mit diesen Medikamenten nicht anfallsfrei und werden als "schwierig zu behandelnde" Patienten klassifiziert. Bei diesen Patienten kommen seit einigen Jahren neuere Antiepileptika zum Einsatz. Hierzu gehört auch die Substanz Levetiracetam (LEV; fSj-α-Ethyl-2-oxo- pyrrolidinacetamid, Formel I) (Handelsname: Keppra, UCB Pharma), deren Synthese in EP-B-0162036 beschrieben wird.
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I
LEV ist ein Ethylanalogon von Piracetam und wird insbesondere in der "add-on"- Therapie schwer zu behandelnder Epilepsien verwendet. Viele der schwierig zu behandelnden Patienten werden durch den Einsatz von LEV anfallsfrei ("Responder"), etwa 20 Prozent der Patienten zeigen jedoch überhaupt keine Wirkung im positiven Sinne ("Non-Responder"). Im Gegensatz zu den klassischen Antiepileptika besitzt LEV keine breite Wirkung über verschiedene Rezeptoren und/oder Ionenkanäle, sondern nach dem heutigen Kenntnisstand entfaltet LEV seine Wirkung über eine Bindung an das Protein SV2A (Lynch, B. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101 :9861-9866 (2004)). Dieses Protein gehört zu einer Familie synaptisch vesikulärer Proteine, deren Funktion noch weitestgehend unbekannt ist. Es ist lediglich bekannt, dass Mäuse, denen SV2A fehlt, abnormale Neurotransmission zeigen (Crowder, K. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 15268-15273 (1999)). Man geht jedoch davon aus, dass SV2A eine wichtige Rolle bei der Freisetzung von Neurotransmittern spielt. EP-A-1426768 beschreibt Verfahren zur Charakterisierung von SV2-Proteinen und zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität von SV2A-Proteinen oder die Bindung von LEV an SV2-Proteine beeinflussen. Jedoch geht EP-A-1426768 nicht auf Fälle ein, in denen keine Bindung zwischen LEV und SV2-Proteinen stattfindet. Es ist bis zum jetzigen Zeitpunkt völlig unklar, warum ein erheblicher Teil der Patienten, welche nicht auf die klassische Behandlung ansprechen, auch bei (ggf. zusätzlicher) Gabe von LEV keine positive Antwort zeigt. Zudem ist bislang nicht prognostizierbar, welche Patienten zu dieser Gruppe zählen könnten. Dies erschwert die Auswahl von LEV als Therapeutikum; insbesondere in solchen Fällen, in denen wegen selten auftretender Anfälle lange gewartet werden muss, um einen Respons oder Non-Respons feststellen zu können.
EP-A-1426768 weist zwar auf die Möglichkeit von Spleißvarianten in SV2A hin. Eine Spleißvariante, in der derjenige Bereich fehlt, welcher durch das Exon 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird, wird jedoch in EP 1426768 nicht beschrieben. EP 14216768 lässt daher auch keine Rückschlüsse darauf zu, welche Bedeutung genau dieser Spleißvariante, ihren Fusionsproteinen und Homologen zukommen könnte.
Ziel der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem eine Bestimmung des Risikos bzw. eine Voraussage darüber ermöglicht wird, dass ein Epilepsiepatient, oder ein Patient mit einer anderen neurodegenerativen oder mit Anfällen verknüpften Erkrankung, nicht auf eine Therapie mit LEV oder einem Medikament mit demselben Wirkprinzip wie LEV anspricht.
Zusammenfassung der Erfindung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Wirksamkeit (Respons, Non- Respons) von Levetiracetam genetisch determiniert ist und dass eine Punktmutation (Polymorphismus) in Intron 6 des humanen SV2A-Gens hierfür verantwortlich ist. Die Erfindung betrifft somit
(1) ein Verfahren zur Feststellung des Risikos für einen Patienten mit einer neurologischen Erkrankung, insbesondere mit Epilepsie, nicht auf eine Therapie mit einem klassischen Antiepileptikum und/oder einem "add on" Antiepileptikum anzusprechen, welches den ex-v/Vo-Nachweis des Auftretens oder Fehlens einer Punktmutation von G nach A an Position 169 (bei inverser Numerierung des Introns 6 gemäß Fig. 1 : Position -60) des in Fig. 1 gezeigten Intron 6 (SEQ ID NO:8 bzw. SEQ ID NO:9) des SV2A-Gens des Patienten umfasst; (2) einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach (1);
(3) ein Protein, das eine Splice-Variante des humanen SV2A-Proteins ist ("SV2A- Variante") und in dessen Aminosäuresequenz im Vergleich zum Wildtyp-SV2A- Protein derjenige Bereich fehlt, welcher durch das Exon 7 im nativen SV2A-Gen codiert wird, sowie Homologe und Fusionsproteine des genannten Proteins; (4) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für das Protein nach (3) codiert;
(5) einen Expressionsvektor, enthaltend eine wie in (4) definierte Nukleinsäuresequenz;
(6) eine Zelle, die mit dem Expressionsvektor nach (5) transformiert ist und/oder das Protein nach (3) heterolog exprimiert; (7) einen nicht-menschlichen Organismus oder isoliertes Gewebe aus einem derartigen Organismus, der/das das Protein gemäß (3) exprimiert, oder der/das mit einer Nukleinsäuresequenz nach (4) oder dem Expressionsvektor nach (5) transfiziert oder transformiert ist; (8) einen Antikörper, der (i) selektiv ist für ein Protein nach (3), nicht jedoch für ein Protein, dessen Aminosäuresequenz denjenigen Bereich enthält, welcher durch das Exon 7 oder die Exons 6 und 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird; oder (ii) selektiv ist für denjenigen Bereich, welcher durch das Exon 7 oder die Exons 6 und 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird; (9) ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche an die in (3) definierte SV2A-Variante binden, umfassend
(i) die Inkubation einer Testsubstanz mit der isolierten SV2A-Variante, oder mit Zellen oder isoliertem Gewebe, welche die SV2A-Variante enthalten oder exprimieren, in vitro, oder Gabe einer Testsubstanz an einen Organismus wie in (7) definiert in vivo; und
(11) Nachweis einer Bindung zwischen dem SV2A-Protein und der Testsubstanz;
(10) einen Kit für das Verfahren nach (9), welcher isoliertes SV2A-Protein nach (3), eine Expressionsvektor nach (5) und/oder Zellen nach (6) umfasst; (11) einen Wirkstoff, welcher zur Therapie von Anfallserkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, insbesondere von Epilepsie, geeignet ist und durch ein Verfahren nach (9) erhältlich ist;
(12) ein Verfahren zur Therapie von Anfallserkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, insbesondere von Epilepsie, umfassend
(i) die Genotypisierung des Patienten hinsichtlich des SV2A, und
(11) die Auswahl geeigneter Wirkstoffe anhand des ermittelten Genotyps.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1 : SV2A-Genabschnitt, in dem der Polymorphismus gefunden wurde. Die Primer (grau unterlegte Bereiche) für die Amplifikation des Gensegments lagen in
Intron 5 und Intron 8, die Sequenzierprimer (unterstrichene Bereiche) ebenfalls.
Die Exons 6, 7 und 8 sind in Fettdruck wiedergegeben. Die Position des G/A SNP in
Intron 6 ist durch größere Schrift hervorgehoben.
Fig. 2: Ergebnis der gelelektrophoretischen Auftrennung von cDNA, die durch RT- PCR mit mRNA aus Patienten mit GG- oder GA-Genotyp mit Primern für die Exons 5 bis 9 von SVA2 hergestellt wurden (vgl. Bsp. 3). Während der GG-Genotyp (GG) nur die erwartete Wildtyp-Bande mit der korrekten Länge zeigt, sind in allen GA-
Genotypen (GA) zwei weitere Banden (DeI exon7 und DeI exon6/7) mit kürzerer
Sequenzlänge zu erkennen. Fig. 3: Ergebnis der Genotypisierung (vgl. Bsp. 2). Es ergaben sich folgende
Fragmentgrößen :
Proben, die homozygot für den Wildtyp waren (GG) : 136 bp/430 bp/490 bp
Proben, die heterozygot waren (GA) : 136 bp/430 bp/490 bp/566 bp
Proben, die homozygot für die SV2A-Variante waren (AA) : 490 bp/566 bp
Sequenzprotokoll - Freier Text
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Definitionen
Die Begriffe "nativ" und "Wildtyp" werden im Kontext der vorliegenden Anmeldung synonym verwendet. Sie bezeichnen dasjenige humane SV2A-Gen bzw. SV2A- Protein, das normalerweise natürlich vorkommt, also durch SEQ ID NO : 1 bzw. SEQ ID NO: 3 repräsentiert wird.
"Isoliert" ist eine Nukleinsäure oder ein Protein dann, wenn sie/es separat von demjenigen Organismus oder Gewebe vorliegt, in dem sie/es natürlicherweise vorkommt. Dies umfasst gereinigte native Nukleinsäuren und Proteine ebenso wie rekombinant oder chemisch hergestellte Nukleinsäuren und Proteine.
"Splice-Variante" bezeichnet eine Proteinvariante, deren Aminosäuresequenz vom Wildtyp- Protein darin abweicht, dass durch Splicing während der Translation ein oder mehrere Exons wegfallen. Diese Exons fehlen dann in der reifen mRNA und werden demzufolge nicht in die entsprechende Aminosäuresequenz übersetzt. Im Falle einer erfindungsgemäßen SV2A-Splice-Variante ("SV2A-Variante") fehlt in der der Variante zugrundeliegenden reifen mRNA zumindest das Exon 7, in einer bevorzugten Ausführungsform nur das Exon 7, in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Exon 6 und das Exon 7. "Patient" bezeichnet grundsätzlich einen Menschen, welcher an Epilepsie oder einer anderen Anfallserkrankung oder neurodegenerativen Erkrankung erkrankt ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet sich bevorzugt für Epilepsiepatienten. "Homologe" der SV2A-Variante im Kontext der vorliegenden Erfindung sind Proteine, welche ausgehend von der Aminosäuresequenz des nativen SV2A (SEQ ID NO: 3)
(i) bis zu fünf konservative Aminosäureaustausche aufweisen, und/oder (ii) C- oder N-terminale Deletionen oder Additionen von bis zu 10 Aminosäuren haben, und/oder
(iii) innerhalb deren Aminosäuresequenz bis zu 5 einzelne oder konsekutive Aminosäurereste deletiert oder inseriert sind. Bevorzugte Homologe sind solche, die nur eine der Veränderungen (i) bis (iii) gegenüber dem nativen SV2A aufweisen.
Der Begriff "Fusionsproteine" umfasst Proteine, welche neben einer Domäne enthaltend die erfindungsgemäße SV2A-Variante eine weitere Domäne mit einem funktionalen Protein ("weitere Domäne") enthalten. Diese Domänen sind entweder über einen Linker oder direkt miteinander verknüpft. Die "weitere Domäne" enthält dabei keine Sequenz, welche von Exon 7 oder Exon 6 und Exon 7 des humanen SV2A-Gens codiert wird. Die Homologe und Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung umfassen somit nicht die nativen SV2A-Splice-Varianten oder Volllängeproteine (Wildtyp-Proteine). Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden experimentellen Befund, dass das Gen, welches für SV2A kodiert, für die unterschiedliche LEV-Respons in Epilepsie-Patienten verantwortlich ist. Sie wird im folgenden am Beispiel des SV2A- Gens von Epilepsie-Patienten, welche auf das "add-on"-Antiepileptikum LEV ansprechen bzw. nicht ansprechen, näher beschrieben. Dies soll jedoch die Erfindung nicht auf genau diesen einen Aspekt einschränken.
Insbesondere ist im Verfahren nach (1) das erwähnte Antiepileptikum zwar in der bevorzugtesten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Levetiracetam (LEV; fSj-α-Ethyl-2-oxo-pyrrolidinacetamid). Jedoch kann das besagte Antiepileptikum in einer weniger bevorzugten Ausführungsform auch ein anderes Piracetam-Analogon als LEV sein. Geeignete Piracetam-Analoga sind dabei ausgewählt aus Verbindungen der Struktur II
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worin R ' und R unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Ci-C3- Koh Ie n Wasserstoff ketten, n 0, 1 oder 2 ist, und die Ring-C-Atome (bis auf das Carbonylatom) substituiert sind mit R ' .
Bevorzugt ist R ' Wasserstoff, n = 0 und R Methyl oder Ethyl, ganz besonders bevorzugt ist R Ethyl.
Es wurde eine Kohorte von Patienten rekrutiert, welche unterteilt wurde in Responder („R") und Non-Responder („NR"). Das SV2A-Gen beider Gruppen wurde abschnittsweise durch Sequenzierung auf Sequenzvarianten analysiert (Bsp. 1). Durch Sequenzierung des Gens konnte schließlich im Intron 6 ein Polymorphismus identifiziert werden, nämlich die Gegenwart eines A (SEQ IND NO:9; variantes Intron 6) statt des Wildtyp-Nukleotids G (SEQ ID NO:8; Wildtyp-Intron 6) in Position 169 (-60) des Introns 6 (IVS6-60OA) (Bsp. 1; Fig. 1). Die Patienten ließen sich danach in 3 unterschiedliche SV2A-Genotypen unterscheiden : homozygot GG ("GG-Genotyp", "GG"), heterozygot GA ("GA- Genotyp", "GA"), und homozygot AA ("AA-Genotyp", "AA") an Position 169 (-60) des Introns 6 des nativen SV2A.
Eine Assoziationsstudie zeigte, dass der GG-Genotyp signifikant mit positivem Respons assoziiert ist, wohingegen der GA-und der AA-Genotyp mit Therapieversagen assoziiert ist (Tab. 1). Der homozygote AA-Genotyp ist sehr selten und wurde nur bei NR beobachtet.
Tab. 1 : Genotyp-Häufigkeit von GG, GA und AA. Getestet wurden 224 Responder (R) und 140 Non-Responder (NR). χ2 = 8,943; Freiheitsgrade (dF) = 2; Signifikanz (p) = 0,00072; Relatives Risiko (OR) = 4,2; Attributives Risiko (AR) = 32 %
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Das Ergebnis der Assoziationsstudie zeigt, dass Träger des Genotyps GA oder AA ein 4,2-fach höheres Risiko tragen, auf eine Therapie mit LEV nicht positiv anzusprechen. Das attributive Risiko beträgt 32 %; würde der Polymorphismus nicht existieren, gäbe es also 32 % weniger Non-Responder.
Um der Frage nachzugehen, welcher Mechanismus auf molekulargenetischer Ebene dieser Beobachtung zugrunde liegt, wurden RT-PCR Experimente durchgeführt (Bsp. 3). Eine RT-PCR, welche den Bereich von Exon 5 bis 9 amplifizierte, ergab bei GG lediglich eine Bande, welche durch Sequenzierung als Wildtyp verifiziert werden konnte. Alle Träger des GA-Genotyps zeigten in individuell unterschiedlichem Ausmaß zusätzlich zur Wildtyp-Bande zwei zusätzliche Banden (Fig. 2). Durch Sequenzierung wurde verifiziert, dass es sich hierbei um bislang nicht bekannte Splice-Varianten handelt, nämlich Varianten, in denen entweder das Exon 7 oder die Exons 6 und 7 deletiert waren ("DeI exon7" und "DeI exon6/7"). Diese Deletionen führen zu einer Trunkierung des Proteins. Da es sich jedoch in beiden Fällen um "in frame"-Splice-Varianten handelt, kommt es nicht zu einem Frameshift des Leserasters. Der Polymorphismus G/A an bp 169 (-60) des Introns 6 von SV2A hat folglich Einfluss auf das mRNA-Splicing und führt so zu einer Trunkierung zumindest eines Teils der SV2A-Proteine in den Trägern der Genotypen GA und AA. Aufgrund dieser Befunde ist davon auszugehen, dass die Assoziation des A-AIIeIs mit Therapieversagen entweder auf eine verminderte Verfügbarkeit des Wildtyp- SV2a und damit eines verminderten Targets für LEV zurückzuführen ist oder darauf beruht, dass der Angriffspunkt von LEV durch die Trunkierung des SV2a in den Mutanten fehlt. Das Risiko, auf LEV nicht anzusprechen, ist bei Trägern der GA- und AA-Genotypen jedenfalls deutlich erhöht. Durch diese Ergebnisse konnte erstmals auf molekularer Ebene ein pharmakogenetisch relevanter Befund zur Wirkung von LEV erhoben werden. Dieses Ergebnis ist in zweierlei Hinsicht von besonderer Bedeutung:
1. Die Genotypisierung dieses Polymorphismus kann zu einer besseren Einschätzung des individuellen Ansprechens von Patienten auf LEV führen und sogar eine Vorhersage der Therapierespons ermöglichen. Eine unnötige Einnahme von LEV kann somit vermieden werden.
2. Bei der Entwicklung von Nachfolgesubstanzen kann angestrebt werden, das sich die Wirkung auch bei trunkiertem Protein entfaltet. Dazu bietet sich insbesondere die Verwendung des trunkierten Proteins in Testsystemen zum Screening von Wirkstoffkandidaten an. Der Nachweis der Punktmutation im Verfahren gemäß Ausführungsform (1) erfolgt entweder auf DNA-, RNA- oder auf Proteinebene in einer Körperflüssigkeit oder einer Gewebeprobe des Patienten in vitro. Die Körperflüssigkeit ist dabei ausgewählt aus Blut, Speichel und Serum, und ist vorzugsweise venöses Vollblut. Das Gewebe ist ausgewählt aus Hirngewebe, Haut und Mundschleimhaut und ist bevorzugt Mundschleimhaut. Die Probe kann, insbesondere im Falle von Körperflüssigkeiten, direkt verwendet werden. Alternativ und bevorzugt wird die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Nukleinsäure jedoch vor der Durchführung des Nachweis angereichert. Solch eine Anreicherung kann mit Standardmethoden zur Isolierung von DNA oder RNA erfolgen, wie z. B. durch Zelllyse, anschließende Fällung der Nukleinsäure (bevorzugt durch Ethanolzugabe) und/oder chromatographische Reinigung der Nukleinsäure.
Die bevorzugte Nachweismethode auf DNA- oder RNA-Ebene im Verfahren nach (1) ist eine PCR mit geeigneten Primerpaaren oder ein Hybridisierungsassay mit einer geeigneten Sonde. Im Falle des Nachweises auf RNA-Ebene wird RT-PCR eingesetzt. Besonders geeignete Primerpaare für die PCR oder RT-PCR sind Paare, welche komplementär zu die Punktmutation flankierenden Sequenzen sind, vorzugsweise eine Länge von 15 bis 35 nt aufweisen und/oder mit Sequenzen in Exons 5 und 9 des nativen SV2A-Gens hybridisieren. Ganz besonders bevorzugt sind die in SEQ ID NOs: 12 und 13, 10 und 11 sowie 13 und 14 gezeigten Primerpaare, insbesondere das Paar SEQ ID NO: 12/13. Im Falle des Nachweises durch Hybridisierung kann jede Lehrbuch-Hybridisierungsmethode zum Nachweis von SNP eingesetzt werden. Besonders geeignete Hybridisierungssonden sind solche Sonden, die unmittelbar die entsprechende Punktmutation flankieren oder über der Punktmutation liegen. Eine oder mehrere dieser Hybridisierungssonden tragen weiterhin für den Nachweis geeignete Marker wie auf S. 12 definiert, z. B. Fluoreszenzmarker oder radioaktive Isotope.
Die bevorzugte Nachweismethode auf Proteinebene in Ausführungsform (1) ist der immunologische Nachweis der An- oder Abwesenheit der Punktmutation im SV2A- Gen. Dieser immunologische Nachweis erfolgt durch den Test auf An- oder Abwesenheit derjenigen Region des SV2A-Proteins, welche durch das Exon 7 oder durch das Exon 6 und 7 codiert wird, in einer wie oben definierten Körperflüssigkeit oder Gewebeprobe des Patienten in vitro. Die Probe kann, insbesondere im Falle von Körperflüssigkeiten, direkt verwendet werden. Alternativ wird das in der untersuchten Probe enthaltene Protein für den immunologischen Nachweis vor der Durchführung des Nachweis mit Standardmethoden wie z. B. Chromatographie angereichert.
Geeignete Testsysteme für einen immunologischen Nachweis im Verfahren nach (1) sind Standardimmunoassays, insbesondere ELISA. Bevorzugt wird als Antikörper für derartige Tests ein Antikörper, der entweder spezifisch ist für denjenigen Bereich des SV2A-Proteins, welcher durch Exon 7 im nativen SV2A-Gen codiert wird, oder welcher spezifisch ist für eine SVA2-Variante, welcher dieser durch Exon 7 codierte Bereich fehlt. Ganz besonders bevorzugt ist der Antikörper der Ausführungsform (8). Dem Protein gemäß Ausführungsform (3) fehlt vorzugsweise in der Aminosäuresequenz zusätzlich der durch das Exon 6 im nativen SV2A-Gen codierte Bereich. Insbesondere ist das Protein gemäß (3) ein SV2A-Protein, in dem die Aminosäurereste 396 - 432 oder 396 - 462 des in SEQ ID NO: 3 gezeigten Wildtyp- SV2A-Proteins deletiert sind, oder das vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 aufweist.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß Ausführungsform (4) weist in einem bevorzugten Aspekt im Intron 6 an der Basenpaar-Position 169 (bei inverser Numerierung des Introns 6 gemäß Fig. 1 : Position -60) eine Punktmutation von G nach A auf. Vorzugsweise umfasst diese Nukleinsäuresequenz die Sequenz SEQ ID NO:9 und wird besonders bevorzugt durch die SEQ ID NO: 15 repräsentiert.
In einem alternativen bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (4) ist die Nukleinsäuresequenz eine mRNA oder deren korrespondierende cDNA, welcher der Bereich des Exons 7 oder des Exons 6 und 7 des SV2A-Gens fehlt. Besonders bevorzugt kodiert dieser Nukleinsäuresequenz für die Proteine der SEQ ID NO: 5 oder 7. Ganz besonders bevorzugt besitzt ist diese Nukleinsäuresequenz eine mRNA oder deren korrespondierende cDNA mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO:4 oder 6.
Die Zelle gemäß Ausführungsform (6) ist bevorzugt eine Eukaryontenzelle, besonders bevorzugt eine Vertebratenzelle, ganz besonders bevorzugt eine Nagetierzelle.
Der Organismus oder das Gewebe in Ausführungsform (7) ist bevorzugt ein Vertebrat bzw. ein Vertebratengewebe, besonders bevorzugt ein Nagetier bzw. Nagetiergewebe. Ganz besonders bevorzugt sind Mäuse oder Ratten bzw. deren Gewebe. Der Nachweis einer Bindung zwischen der SV2A-Variante und der Testsubstanz in Ausführungsform (9) erfolgt mit Standardmethoden zur Detektion von Substanz- Protein-Komplexen an fester Phase oder in Lösung. Derartige Methoden umfassen die Visualisierung mit Hilfe geeigneter Marker (wobei sowohl die Testsubstanz als auch die SV2A-Variante oder beide markiert sein können), die mit der Testsubstanz verknüpft sind, den Nachweis radioaktiv markierter Moleküle, den Nachweis mit Hilfe von Antikörpern, von Massenspektrometrie usw. "Marker" sind in diesem Zusammenhang all jene Stoffe, deren chemische oder physikalische Eigenschaften die Unterscheidung markierter und unmarkierter Substanz-Protein-Komplexe durch physikalische, chemische oder immunologische Methoden erlauben. Geeignete Markierungsmethoden sind unter anderem radioaktive Markierung, Markierungen mit fluoreszenten, lumineszenten oder chromophoren Verbindungen und die Markierung mit Haptenen (wie Psoralen oder DIG). Der Nachweis umfasst des weiteren die Detektion des Markers, also Szintillationszählung (z. B. per Phosphoimager); photooptische Messung (z. B. Fluoreszenzmessung) bzw. eine immunologische Detektion.
Das Verfahren nach Ausführungsform (9) ist insbesondere zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Behandlung von Anfällen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, vor allem von Wirkstoffen zur Behandlung von Epilepsie, geeignet.
Die Genotypisierung im Verfahren (12) erfolgt vorzugsweise durch ein Verfahren wie in Ausführungsform (1) definiert.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese schränken den Schutzbereich der Erfindung jedoch nicht ein.
Beispiele
Beispiel 1 : Identifikation der Seαuenzvariante IVS6-60G>A in SV2A
Die Identifikation des SV2A-Polymorphismus erfolgte im Rahmen der
Sequenzierung des SV2A-Gens auf der Suche nach Sequenzvarianten. A) Untersuchte Patienten : Es wurden 20 Responder ("R") und 50 Non-Responder ("NR") untersucht.
B) DNA-Isolierung: Die DNA-Extraktion erfolgt aus venösem EDTA-Blut nach der Methode von Miller, S.A. et al., Nucleic Acids Res. 16: 1215-1218 (1988). Dabei wurden in mehreren Wasch- und Zentrifugationsschritten zunächst die Erythrozyten lysiert und verworfen. Anschließend wurden die Leukozyten chemisch aufgebrochen und die restlichen Zellbestandteile (Proteine, Lipide) abgebaut (Inkubation über Nacht bei 37 0C). Zur anschließenden Proteinfällung wurde eine gesättigte NaCI-Lösung zugegeben, diese Mischung wurde erneut zentrifugiert und die ausgesalzenen Proteine setzten sich ab. Die DNA befand sich im Überstand und fiel nach Zugabe von 100 % Ethanol aus. Sie wurde heraus„gefischt" und nach einem kurzen Schwenk in 70 % Ethanol in TE-Puffer aufgenommen. Im Detail umfasste die Methode folgende Schritte:
- 10 ml EDTA-Blut mit 40 ml Lysispuffer vermischt, 15-30 min auf Eis inkubiert
- Pelletieren der Leukozyten : Zentrifugation bei 1500 U/min für 15 min bei 4 0C
- Überstand dekantiert und das Pellet in 10 ml Lysispuffer resuspendiert - erneute Zentrifugation bei 1500 U/min für 15 min bei 4 0C
- Überstand wieder dekantiert
- das Pellet in 5 ml Kernlysispuffer resuspendiert, danach 800 μl 10 %iges SDS (Sodiumdodecylsulfat) zugegeben, leicht gemischt, dann 200 μl Proteinase K zugegeben, gemischt - über Nacht bei 37 0C inkubiert
- am nächsten Tag 3,2 ml gesättigte NaCI (6 M NaCI) zu den Ansätzen gegeben und kräftig geschüttelt
- Zentrifugation bei 4000 U/min für 15 min bei 20 0C
- den Überstand in ein neues Gefäß überführt, das Pellet verworfen - erneute Zentrifugation bei 4000 U/min für 15 min bei 20 0C
- den Überstand in ein neues Gefäß überführt, das Pellet verworfen
- den Überstand mit dem zweifachen Volumen 100 % Ethanol überschichtet und vorsichtig geschwenkt, die DNA herausgefischt
- kurzes Schwenken des Fadens in 70 % Ethanol, den Faden an einem fusselfreien Tuch abgetupft und in ein 1,5 ml Eppendorf-Tube, welches 300 μl TE-Puffer enthielt, gegeben.
Bei 4 0C hatte die DNA sich nach einigen Tagen aufgelöst und die Konzentration konnte photometrisch bestimmt werden. Dafür wurde die gelöste DNA im Verhältnis 1 : 20 mit TE-Puffer gemischt und die Extinktion dieser Lösung im Photometer bei 260 nm gemessen. Die DNA-Konzentration lag normalerweise zwischen 300-1000 ng/μl (bei ca. 10 ml EDTA-Blut). Aus diesen DNA-Lösungen wurden dann Verdünnungen in der Konzentration 10 ng/μl hergestellt.
C) PCR: Die PCR-Amplifikation der SV2A-Genabschnitte erfolgte Exon für Exon mit angrenzenden Intron-Abschnitten mit dafür geeigneten Primern; Intron 6 wurde wegen seiner Kürze ganz amplifiziert. Die Primer für die Amplifikation desjenigen Segmentes, in welchem der
Polymorphismus lokalisiert war, lagen in Intron 5 und Intron 8 (Fig. 1). Die
Sequenz des Forward-Primers lautete: 5" ttc aga gtg gtg agt gca tgc 3" (SEQ ID
NO: 12), die des Reverse-Primers: 5" ctg gtc agc cta cag tac aag 3" (SEQ ID
NO: 13).
PCR-Bedingungen : Two-step PCR: RedTaq 50 μl-Volumen : 25μl RedTaq Ready Mix, llμl Wasser, je 2 μl Primerverdünnung (10 pmol/μl), 10 μl DNA-Verdünnung (10 ng/μl).
Annealing : 62°C für 10 Zyklen, 600C für 30 Zyklen
Elongation : 1 min 30 s. Das PCR-Produkt war 1056 bp groß.
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D) Sequenzierung: Die Sequenzierung beider Stränge der so amplifizierten Abschnitte des SVA2-Gens (Quiagen, Deutschland) erfolgte mit den folgenden Sequenzierprimern : Forward-Primer: 5'-tta gtg tcc tgt gac tac aga agc-3' (SEQ ID NO: 14) und Reverse-Primer (identisch mit dem Reverse-Primer der PCR) : 5'-ctg gtc agc cta cag tac aag-3' (SEQ ID NO: 13).
Es konnte im Intron 6 ein Polymorphismus identifiziert werden (IVS6-60G>A), nämlich ein Austausch des nativen G gegen A an Position 169 (-60) (SEQ ID NO:8, native Intron 6-Sequenz; SEQ ID NO:9, Variante Intron 6-Sequenz).
Beispiel 2: Genotypisierunq von Patienten
A) Untersuchte Patienten : Es wurden 224 Responder ("R") und 140 Non-Responder („NR") untersucht.
B) DNA-Isolierung: Die DNA-Extraktion erfolgt wie in Bsp. IB beschrieben aus venösem EDTA-Blut nach der Methode von Miller, S.A. et al., Nucleic Acids Res. 16: 1215-1218 (1988).
C) PCR: Für die Amplifizierung des SV2A-Gens wurde der "REDTaq Ready Mix PCR Reaction Mix mit MgCI2" (Sigma, Deutschland) nach Herstellerangaben verwendet. Untersucht wurde der SNP (Single nucleotide polymorphism) IVS6-60 G>A im
SV2A-Gen. Die verwendeten Primer lagen in Intron 5 und Intron 8: Primer forward :
5 ' ttc aga gtg gtg agt gca tgc 3 ' (SEQ ID NO: 12) und Primer reverse: 5 ' ctg gtc agc cta cag tac aag 3 ' (SEQ ID NO: 13)
Erwartete (und erhaltene) Fragmentgröße: 1056 bp
Two-step PCR (Annealing-Temperatur: 62 0C für 10 Zyklen, dann 60 0C für 30
Zyklen; Verlängerungsphase bei 72 0C) wurde nach Herstellervorschrift mit Ready
Mix Red Taq PCR Reaction Mix von Sigma durchgeführt. Im Detail :
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Die PCR-Produkte wurden anschließend auf ein 2%iges Agarose-Gel (8 g Agarose auf 400 ml TBE-Puffer und 30 μl Ethidiumbromid) aufgetragen. Der REDTaq Ready Mix beinhaltet bereits einen Loading Buffer zum Auftrag auf das Gel. Außerdem wurde ein Längenmarker mit aufgetragen, der zur Abschätzung der Fragmentlänge diente. Die angelegte Spannung betrug 170 V (93 mA), Laufzeit ca. 45 min. Anschließend wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert.
D) Verdau und Gelelektrophorese: Die durch die PCR amplifizierte DNA wurde nach Herstellervorschrift mit Bsp 143 II (MBI Fermentas) bei 37 0C über Nacht verdaut. Dieses Restriktionsenzym schneiden in SV2A nur die native, nicht jedoch die durch den SNP veränderte Sequenz: Bspl43II schneidet an der Erkennungsstelle 5" PuGCGCPy3\ Die native Sequenz, in welcher der SNP liegt, lautet: 5^ GGCGCC3\ Mit SNP lautet die entsprechende Sequenz: 5^ GGCACC3\ Bei denjenigen Patienten, die den SNP nicht tragen, schneidet das Enzym also das PCR- Produkt, während das PCR-Produkt bei Patienten, die den SNP besitzen, nicht geschnitten wird. Da die Erkennungssequenz des Enzyms in dem für die RT-PCR ausgewählten Fragment noch ein weiteres Mal vorkommt, werden alle PCR- Fragmente mindestens einmal geschnitten. Die PCR-Produkte der Patienten, die den SNP nicht tragen, werden zweimal geschnitten. Für den Verdau wurden je 10 μl des PCR-Produkts mit 0,25 μl BSP 143II, 1,5 μl Tango-Puffer (10 mM TrisHCI (pH 7,5), 250 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,15 % Triton®X-100, 0,2 mg/ml BSA, 50 % Glycerin) und 3,25 μl Wasser vermischt und für mindestens 2 Stunden bei 37 0C inkubiert. Anschließend wurden diese Ansätze wie bei der PCR beschrieben auf ein Agarosegel aufgetragen. In diesem Fall wurde jedoch ein 3%iges Agarosegel (12 g Agarose auf 400 ml TBE-Puffer) benutzt, um eine bessere Auftrennung der Banden zu erreichen. Es ergaben sich folgende Fragmentgrößen (vgl. Fig. 3): Proben, die homozygot für den Wildtyp waren (GG) : 136 bp/430 bp/490 bp Proben, die heterozygot waren (GA) : 136 bp/430 bp/490 bp/566 bp
Proben, die homozygot für die SV2A- Variante waren (AA): 490 bp/566 bp
Beispiel 3 : RT-PCR zur Herstellung von cDNA des Bereichs zwischen Exon 5 und Exon 9 von SV2A und Identifizierung des Polymorphismus in Intron 6 des SV2a- Gens
A) RNA-Isolierung aus Vollblut wurde mit dem QIAamp® RNA Blood Mini Kit soweit im folgenden nicht anders angegeben nach Herstelelrangaben durchgeführt. Das verwendete Vollblut stammte von 20 "GA"-Genotypen und 20 "GG"-Genotypen. Maximal 1,5 ml EDTA-Blut wurden mit 7,5 ml Erythrozyten-Lysis (EL) Puffer in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen vermischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die intakten Leukozyten wurden danach in einer Kühlzentrifuge pelletiert (10 min bei 4 0C und 400xg). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgegossen, das Leukozytenpellet in 3 ml EL-Puffer resuspendiert und anschließend unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit wenigen Millilitern PBS (phosphate buffered saline; 1,09 g/l Na2HPO4, 0,32 g/l NaH2PO4, 9 g NaCI, pH 7,2) gewaschen. Durch die anschließende Zugabe von 600 μl des ß-Mercaptoethanol-haltigen Puffers RLT und das wiederholte Aufziehen in der Pipette wurden die Leukozyten lysiert. Die zähe Lösung wurde zur weiteren Homogenisierung auf eine QIAshredder-Säule gegeben, in einer Tischzentrifuge zentrifugiert (2 min bei maximaler Geschwindigkeit) und im Anschluss mit 600 μl 70%igem Ethanol vermischt. Die Mischung wurde auf eine QIAamp-Säule pipettiert, 30 s bei mindestens 10000 rpm zentrifugiert und das Zentrifugat zusammen mit dem Auffanggefäß verworfen. Die jetzt an die Säule gebundene RNA wurde mehrfach gewaschen. Dazu wurde die Säule in ein neues Auffanggefäß gestellt, mit 700 μl Puffer RWl beladen und 30 Sekunden bei mindestens 10000 rpm zentrifugiert. Zentrifugat und Auffanggefäß wurden verworfen und die Säule in ein neues Auffanggefäß gesetzt. Die Säule wurde mit 500 μl RPE-Puffer beladen und unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein neues Auffanggefäß gestellt, mit weiteren 500 μl RPE-Puffer beladen und 3 min bei 13200 rpm zentrifugiert.
Die so gereinigte RNA wurde durch die Zugabe von 50 μl RNAse-freiem Wasser auf die Säule in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß ausgespült.
Von der RNA-Lösung wurden 5 μl mit 95 μl H P LC- Wasser gemischt, die gesamten
100 μl Lösung in eine Messküvette pipettiert und der RNA-Gehalt der Lösung anschließend in einem Photometer gegen HPLC-Wasser als Abgleich bestimmt.
BI RT-PCR wurde nach Herstellervorschrift mit dem QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit durchgeführt. Hierzu wurden pro Reaktion in einem 200 μl-PCR-Reaktionsgefäß auf
Eis folgende Reagenzien gemischt: 2,5 μl Puffer (5x), 1,5 μl Forward Primer (200 μM), 1,5 μl Reverse Primer (200 μM), 1 μl dNTP (400 μM von jedem dNTP), 1 μl
Enyzm (Mischung aus einer Reversen Transkriptase und einer DNA-Polymerase),
0,5 μg RNA, ad 25 μl mit HPLC-Wasser.
Die Reaktionsgefäße wurden vom Eis unverzüglich in den vorprogrammierten PCR-
Thermocycler gestellt.
Das Programm der RT-PCR umfasste eine reverse Transkription mit einer sich direkt anschließenden Touch-Down-PCR. Das RT-PCR-Programm im Detail war wie folgt:
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Verwendete Primersequenzen : Forward Primer: 5'-GTT CTG CCT ACC AGT TCC ACA GCT G-3' (hybridisiert im Exon 5 des SV2A-Gens; SEQ ID NO: 10) und Reverse Primer: 5'-CCT GGA GAT GGC GGA TCA TGT CAG-3' (hybridisiert im Exon 9 des SV2A-Gens; SEQ ID NO: 11).
O Isolierung der DNA: Nach Beendigung des PCR-Programms wurden jeweils 5 μl der Reaktionsansätze mit 1 μl Loadingbuffer vermischt, in die Taschen eines 2%igen Agarose-Gels (8 g Agarose auf 400 ml TBE) pipettiert und gelelektrophoretisch bei 170 V und 93 mA eine Stunde lang aufgetrennt. Anhand eines gleichzeitig mit auf das Gel aufgetragenen Größenstandards (DNA- Markers) konnte das Produkt nach Größe und Menge beurteilt werden. Zur Detektion der entstandenen Banden wurde das Gel nach der Elektrophorese mit UV-Licht bestrahlt, wodurch die DNA aufgrund des eingelagerten Ethidiumbromids sichtbar wurde. Das Gel wurde zur Dokumentation wird fotografiert. Mit einem Skalpell wurden unter UV-Licht diejenigen Bereiche aus dem Gel ausgeschnitten, welche sichtbare DNA-Banden enthielten. Die ausgeschnittenen Gelblöckchen wurden in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und die DNA mit dem QIAquick®Gel Extraction Kit nach Herstellervorschrift aus dem Gel extrahiert. Dazu wurden die Gelblöckchen in einem Eppendorfgefäß gewogen, mit der dreifachen Menge des Puffers QG versetzt und in einem Thermoblock bei 55 0C aufgeschmolzen.
Die entstandene Lösung wurde auf eine Säule pipettiert und durch anschließende Zentrifugation die DNA aus der Lösung an die Säule gebunden. Die DNA wurde anschließend in mehreren Waschschritten von Salzen und Gelresten befreit und in einem letzten Zentrifugationsschritt mit 35 μl HPLC-Wasser von der Säule in ein Eppendorfgefäß gespült. Die so isolierte DNA wurde für die anschließende Sequenzierung (siehe unten, Punkt D) verwendet.
Kontrolle der Reinigungsqualität: Von der gereinigten DNA-Lösung wurden 5 μl mit 5 μl Loadingbuffer versetzt und auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen. Nach einer halbstündigen, gelelektrophoretischen Auftrennung bei 170 V und 93 mA wurde unter UV-Licht die Qualität der Aufreinigung überprüft. Die Größe und Konzentration der DNA wurde anhand eines mitlaufenden Standards festgestellt. Das Ergebnis der RT-PCR ist in Fig. 2 wiedergegeben. D) Sequenzierung: Die Sequenzierung der gereinigten DNA erfolgte bei Quiagen, Deutschland mit Sequenzierprimern repräsentiert durch SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, also denselben Primern, wie sie für die RT-PCR verwendet wurden (vgl. Punkt B).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Feststellung des Risikos für einen Patienten mit einer neurologischen Erkrankung, insbesondere mit Epilepsie, nicht auf eine Therapie mit einem klassischen Antiepileptikum und/oder einem "add on" Antiepileptikum anzusprechen, welches den ex-v/Vo-Nachweis des Auftretens oder Fehlens einer Punktmutation von G nach A an Position 169 des in Fig. 1 gezeigten Intron 6 (SEQ ID NO:8 bzw. SEQ ID NO:9) des SV2A-Gens des Patienten umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei (i) der Nachweis der Punktmutation auf DNA- oder RNA-Ebene durch eine PCR mit geeigneten Primerpaaren oder einen Hybridisierungsassay mit einer geeigneten Sonde erfolgt; und/oder
(ii) der Nachweis der An- oder Abwesenheit der Punktmutation immunologisch auf Proteinebene erfolgt, wobei vorzugsweise ein Antikörper verwendet wird, der spezifisch ist für denjenigen Bereich des SV2 A- Proteins, welcher durch
Exon 7 oder Exon 6 und 7 im nativen SV2A-Gen codiert wird; und/oder (iii) der Nachweis in einer Körperflüssigkeit des Patienten, bevorzugt in venösem Blut, erfolgt; und/oder (iv) das Antiepileptikum ein Piracetam-Analogon, bevorzugt Levetiracetam (LEV; fSj-α-Ethyl-2-oxo-pyrrolidinacetamid) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nachweis durch PCR erfolgt und hierfür ein Primerpaar verwendet wird, das komplementär zu die Punktmutation flankierenden Sequenzen ist, vorzugsweise eine Länge von 15 bis 35 nt aufweist und/oder mit Sequenzen in Exons 5 und 9 des nativen SV2A-Gens hybridisiert und besonders bevorzugt eines der in SEQ ID Nos: 12 und 13, 10 und 11 oder 13 und 14 gezeigten Primerpaare ist.
4. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3.
5. Protein, das eine Splice-Variante des humanen SV2A-Proteins ist ("SV2A- Variante") und in dessen Aminosäuresequenz im Vergleich zum Wildtyp-SV2A-
Protein derjenige Bereich fehlt, welcher durch das Exon 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird, sowie Homologe und Fusionsproteine des genannten Proteins.
6. Protein nach Anspruch 5, in dessen Aminosäuresequenz zusätzlich der durch das Exon 6 im nativen humanen SV2A-Gen codierte Bereich fehlt.
7. Protein nach Anspruch 5 oder 6, in dem die Aminosäurereste 396 - 432 oder 396 - 462 des in SEQ ID NO:3 gezeigten Wildtyp-SV2A-Proteins deletiert sind, oder das vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO:7 aufweist.
8. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für das Protein nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7 codiert.
9. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die zwischen den Bereichen, die den Exons 6 und 7 im nativen SV2A-Gen entsprechen, ein Intron enthält ("Intron
6"), dessen Anwesenheit zur Translation in die Splice-Variante nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7 führt.
10. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 9, worin das Intron 6 an der Basenpaar- Position 169 eine Punktmutation von G nach A aufweist, und wobei die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO:9 umfasst und besonders bevorzugt durch die SEQ ID NO: 15 repräsentiert wird.
11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, welcher der Bereich des Exons 7 oder der Exons 6 und 7 des nativen SV2A-Gens fehlt, wobei die Nukleinsäuresequenz bevorzugt durch die Sequenz der SEQ ID Nos:4 oder 6 oder durch die korrespodierende mRNA repräsentiert wird.
12. Expressionsvektor, enthaltend eine wie in einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11 definierte Nukleinsäuresequenz.
13. Zelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert ist und/oder das Protein nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7 heterolog exprimiert.
14. Nicht-menschlicher Organismus oder isoliertes Gewebe aus einem derartigen Organismus, der/das das Protein nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7 exprimiert, oder der/das mit einer Nukleinsäuresequenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11 oder dem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transfiziert oder transformiert ist.
15. Antikörper, der
(i) selektiv ist für ein Protein nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, nicht jedoch für ein Protein, dessen Aminosäuresequenz denjenigen Bereich enthält, welcher durch das Exon 7 oder die Exons 6 und 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird; oder
(ii) selektiv ist für denjenigen Bereich, welcher durch das Exon 7 oder die Exons 6 und 7 im nativen humanen SV2A-Gen codiert wird.
16. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche an die in Ansprüchen 5 bis 7 definierte SV2A-Variante binden, umfassend
(i) die Inkubation einer Testsubstanz mit der isolierten SV2A-Variante, oder mit Zellen oder isoliertem Gewebe, welche die SV2A-Variante enthalten oder exprimieren, in vitro, oder Gabe einer Testsubstanz an einen Organismus wie in Anspruch 14 definiert in vivo; und
(ii) Nachweis einer Bindung zwischen dem SV2A-Protein und der Testsubstanz.
17. Verfahren nach Anspruch 16, das zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Behandlung von Anfällen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, insbesondere von Wirkstoffen zur Behandlung von Epilepsie, geeignet ist.
18. Kit für das Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, welcher isoliertes SV2A- Protein nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, eine Expressionsvektor nach Anspruch 12 und/oder Zellen nach Anspruch 13 umfasst.
19. Wirkstoff, welcher zur Therapie von Anfallserkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, insbesondere von Epilepsie, geeignet ist und durch ein Verfahren nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.
20. Verfahren zur Therapie von Anfallserkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Endokrinopathien und hormonellen Störungen, insbesondere von Epilepsie, umfassend
(i) die Genotypisierung des Patienten hinsichtlich des SV2A, und
(ii) die Auswahl geeigneter Wirkstoffe anhand des ermittelten Genotyps.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Genotypisierung durch ein Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 erfolgt.
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