CZ158399A3 - Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů - Google Patents

Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů Download PDF

Info

Publication number
CZ158399A3
CZ158399A3 CZ991583A CZ158399A CZ158399A3 CZ 158399 A3 CZ158399 A3 CZ 158399A3 CZ 991583 A CZ991583 A CZ 991583A CZ 158399 A CZ158399 A CZ 158399A CZ 158399 A3 CZ158399 A3 CZ 158399A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cell type
plant extract
rna
treated
protein
Prior art date
Application number
CZ991583A
Other languages
English (en)
Inventor
Albert Beaufour
Jacques-Pierre Moreau
Original Assignee
Societe De Conseils De Recherches Et D´Applications Scientifiques, S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe De Conseils De Recherches Et D´Applications Scientifiques, S. A. filed Critical Societe De Conseils De Recherches Et D´Applications Scientifiques, S. A.
Publication of CZ158399A3 publication Critical patent/CZ158399A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů
Oblast techniky
Vynález se týká genomového screeningu, při němž lze charakterizovat potenciální biologické vlastnosti rostlinného extraktu, které mohou a nemusí souviset s případnými známými etnofarmakologickými vlastnostmi extraktu. Vynález představuje nový přístup k analýze potenciálních mechanismů účinku rostlinných extraktů jakožto podkladu pro terapeutickou účinnost a prostředek pro identifikaci jednotlivých sloučenin, které vykazují zjištěnou biologickou vlastnost, a to za účelem identifikace nového léčiva nebo nového farmaceutického použití pro již známé léčivo.
Dosavadní stav techniky
Mikrobiální, rostlinná a živočišná (např. bezobratlí) říše představují bohaté přírodní zdroje účinných složek s různými fyzikálně chemickými a léčebnými vlastnostmi. Americké a evropské lékopisy jsou plné příkladů léčiv odvozených z přírodních zdrojů — viz Pharmacopeia 1995 (United States Pharmacopeial Convention, 1994) a Martindale, The Extra Pharmacopeia 31 (Royal Pharmaceutícal Society, 1996). Jako přírodní produkty bylo objeveno mnoho antimikrobiálních činidel (např. peniciliny, cefalosporiny a aminoglykosidy), protiplísňových činidel (např. amfotericin B a nystatin), antiparazitických činidel (např. chinin), kardio- a vazoaktivních činidel (např. srdeční glykosidy — digitoxin, námelové alkaloidy, nikotin, oxytocin), protizánětlivých činidel (např. aspirin), muskarinových (např. acetylcholin) a antimuskarínových činidel (např. atropin a skopolamin), neuroaktivních činidel (např. kurare, fyzostigmin a opiáty), antikoagulantů (např. heparin), antineoplastických činidel (např. vínkové alkaloidy, taxol a podofylotoxinový derivát etoposid) a hormonů (např. estrogeny, androgeny, progestiny, peptidové hormony a růstové faktory) — viz např. Goodman & Giiman: The Pharmacological Basis of Therapeutics (9. vydání, McGraw-Hill,
1996). Z těchto příkladů vyplývá, že některé účinné složky v rostlinných extraktech si zachovávají svou biologickou účinnost i po purifikaci.
Ve většině výše uvedených příkladů byly hlavní etnofarmakologické vlastnosti sloučeniny charakterizovány ve známých farmakologických systémech a zkouškách pouze na základě izolace sloučeniny z přírodních zdroje — viz např. Turner, R. A.: Screening Methods
0 0 40 0 04 4 4 4 0
4 4 4 · 0
0 0 0 *0
0 0 0 0 0 40 4 44 4
0* in Pharmacology (Academie Press, 1965) a Turner, R. A., Hebbom, Peter: Screening Methods in Pharmacology (svazek H, Academie Press, 1971). Zatímco způsob určujících nebo charakteristických účinků rostlinných extraktů lze stanovit sereeningem jejich jednotlivých složek, může mít mnoho z těchto extraktů další farmakologické účinky, které nemusí být patrné z případného etnofarmakologického pozadí jednotlivých složek extraktů (např. schopnost ovlivnit transdukci signálu k jádru, změnit specializaci povrchových receptorů buňky a regulovat genomové vyjádření).
Charakterizace definovaných účinných přírodních sloučenin, buď odvozených z přírodních zdrojů či semisynteticky produkovaných, tvoří farmaceutickou bázi velké části západní medicíny. Způsob destilace etnofarmakologicky aktivního rostlinného extraktu až na jediný účinný základ může však vést ke ztrátě biologické aktivity, a to z mnoha důvodů (určitá sloučenina je např. nestabilní během extrakce nebo v čisté formě, sloučenina reaguje během purifikace s chemickými entitami v extraktu, sloučenina je během čištění frakčně vydestilována, nebo, což je významnější, etnofarmakologický základ není dán pouze jedinou účinnou sloučeninou přítomnou v extraktu, nýbrž je výsledkem interakce dvou nebo více účinných sloučenin v extraktu). Pravděpodobnost, že k čistému farmakologickému účinku extraktu přispívá více než jedna sloučenina přítomná v rostlinném extraktu, stejně jako genomový prostředek k identifikaci takových sloučenin v přírodním produktu, představují nové farmakologické pojetí.
Podstata vynálezu
Prvním aspektem vynálezu je způsob identifikace léčiva, který zahrnuje tyto kroky: podání rostlinného extraktu určitému buněčnému typu; izolace proteinu nebo RNA (např. mRNA) z buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem; identifikace proteinu nebo RNA, který je v ošetřeném a neošetřeném buněčném typu přítomen v odlišných koncentracích (např. protein nebo RNA, jejichž koncentrace je zvýšena nebo snížena, nebo jejichž produkce je aktivována nebo potlačena působením rostlinného extraktu v buněčném typu); podání jedné nebo více sloučenin nalezených v rostlinném extraktu buněčnému typu; izolace proteinu nebo RNA z buněčného typu ošetřeného sloučeninou nebo sloučeninami; identifikace těch sloučenin, které též souvisí s expresí nebo supresí proteinu nebo RNA, jejichž koncentrace je odlišná oproti neošetřenému buněčnému typu.
9· ···· • fc • fcfcfc • fc fcfc
„Rostlinný extrakt zde znamená soubor různých přírodních sloučenin, které jsou izolovány z rostliny (např. z listů, kmene, plodů, květů, semen nebo kořenů). Příkladem v takového extraktu je extrakt ze stromu Ginkgo biloba. „Buněčný typ zde znamená buď izolovanou buňku (např. odvozenou z lidského nebo zvířecího organismu), nebo buňky obsažené v tkáni nebo orgánu určitého organismu. Buněčný typ je normální, nebo nemocná buňka (např. buňka patologicky nebo fyziologicky odlišná od normálního buněčného typu, např. nádorová buňka).
Rostlinný extrakt a sloučeninu (sloučeniny) lze buněčnému typu podávat buď in vitro, nebo in vivo (např. zdravému zvířeti, jemuž je po ošetření rostlinným extraktem nebo sloučeninou (sloučeninami) odebrán buněčný typ). Pokud je extrakt podáván in vitro, protein nebo RNA lze izolovat okamžitě, nebo až den po podání rostlinného extraktu nebo sloučenin zvířeti. Pokud je extrakt podáván in vivo, protein nebo RNA lze izolovat okamžitě, nebo až den po podání rostlinného extraktu nebo sloučenin zvířeti. Protein může zůstat v buněčném typu, nebo může být vyloučen mimo buněčný typ. Příklady takových proteinů zahrnují receptory, růstové faktory, enzymy nebo transkripční faktoiy.
Dalším aspektem vynálezu je způsob stanovení genomové odpovědi buněčného typu na rostlinný extrakt. Tento způsob zahrnuje následující kroky; podání rostlinného extraktu buněčnému typu; izolace proteinu nebo RNA (např. messenger RNA) z buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem; porovnání proteinu nebo RNA izolovaných z buněčného typu ošetřeného nebo neošetřeného rostlinným extraktem.
V jednom provedení zahrnuje způsob dále identifikaci proteinu nebo RNA, které jsou v buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem přítomny v jiné koncentraci než v neošetřeném buněčném typu. V jiném provedení zahrnuje způsob dále sekvenaci proteinu, RNA nebo proteinu kódovaného RNA, které byly identifikovány v buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem v jiné koncentraci než v neošetřeném buněčném typu. V dalším provedení zahrnuje způsob identifikaci genu kódujícího protein nebo RNA, které byly identifikovány v buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem v jiné koncentraci než v neošetřeném buněčném typu.
V jiném provedení je buněčným typ spojen se známým biologickým cílem (např. aktivačním místem) rostlinného extraktu. Pokud je např. známo, že rostlinný extrakt léčí
0000 • · · · 0 0 • · ·
000
00
0··4
00 astma, rakovinu, poruchy krevního oběhu nebo neurologické poruchy, pak je použitým buněčným typem plicní buňka, rakovinná buňka, cévní nebo nervová buňka (v tomto pořadí).
Další rysy a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z detailního popisu vynálezu a z nároků.
Na základě zde uvedeného popisu by měl odborník být schopen využít tento vynález v nej širší možné míře. Následující specifická provedení jsou proto uvedena pouze ilustrativně, bez jakéhokoliv omezení zbývajícího popisu vynálezu.
Pokud není uvedeno jinak, všechny zde užité technické a vědecké termíny mají stejný význam jako v běžné odborné praxi v oblasti, do níž vynález spadá. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a další uvedená odvolání jsou zde včleněny jako odkaz.
Příklady provedení vynálezu
Rostlinné extrakty a jejich jednotlivé sloučeniny
Rostlinné extrakty lze připravit standardními technikami chemické extrakce (např. použití vody při extrakci hydrofilních sloučenin, použití alkoholů a acetonu při extrakci lipofilních sloučenin nebo jejich směsí). Extrakty lze dále čistit, aby byl snížen počet sloučenin přítomných v extraktu, nebo lze dokonce izolovat jedinou sloučeninu nebo třídu sloučenin za použití standardních technik jako chromatografie a krystalizace. Další podrobnosti viz např. Ginkgolides — Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical Perspectives, editoval P. Braquet (J. R. Prous, Science Publishers, Barcelona, Španělsko 1988); Okabe: J. Chem. Soc. (c) str. 2201 (1967); Nakauishi: Pure & Applied Chemistry 19:89(1967).
Identifikace genomového vyjádření izolací proteinu
Z kultury cílových buněčných typů je odebrán vzorek před a po vystavení dané koncentraci rostlinného extraktu (např. extraktu ze stromu Ginkgo biloba). Tento postup lze podobně použít i v případě buněk cílové tkáně nebo orgánu organismu, který byl vystaven jedné nebo několika dávkám rostlinného extraktu. Je provedena lýza buněk a proteiny jsou rozpuštěny v povrchově aktivovaných pufrech (např. Tween 20, SDS nebo NP-40 od Sigma ·· ··♦· ·· **** • · · * · · • » · · · ·· · ·· ·· «φ » · · 1 ··· ·· · • · ·* ··
Chemicals, St. Louis, MO). Proteiny jsou separovány dvojdimenzionální gelovou elektroforézou s izoelektrickou fokusací v první dimenzi a gradientovou gelovou elektroforézou ve druhé dimenzi — viz např. Ausubel, A. M. a kol.: Current Protocols in Molécular Biology, str. 10.3.1 až 10.4.5 (John Wiley & Sons, 1987). Tento způsob je zvláště účinný pro analýzu komplexních směsí proteinů (např. v jediném 2-D gelu lze rozpustit až 1500 proteinů) — viz např. O'Farrell, P. H.: J. Biol. Chem. 250: 4007 až 4021 (1975).
Vzor exprese proteinů lze zviditelnit vybarvením Coomasie Blue (Ausubel, A. M. a kol.: Current Protocols in Molécular Biology, str. 10.6.1 (John Wiley & Sons, 1987)) nebo stříbrným vybarvením (Ausubel, A. M. a kol.: Current Opinions in Molécular Biology, str. 10.6.1 až 10.6.3 (John Wiley & Sons, 1987)). Buňky lze též označit izotopově značenými aminokyselinami, např. methioninem 35S (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Vzor exprese značeného proteinu ve 2-D gelu lze pak detekovat autoradiografií. V případě, kdy je analyzován vzor post-translačně modifikovaných, např. fosforylováných proteinů, je do inkubačního média přidán donor značeného fosfátu, např. 32Ρ-γΑΤΡ (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) a vzor fosforylovaného proteinu ve 2-D gelu lze zviditelnit autoradiografií — viz např. Hansen, K. a kol.: Electrophoresis 14: 112 až 116 (1996); Guy, R.: Electrophoresis 15: 417 až 440 (1994). V posledním uvedeném případě lze expresi neznačeného fosfoproteinu zviditelnit pomocí protilátek fosfotyrosinu nebo fosfoserinu po přenosu gelu na nitrocelulózu — viz např. Ausubel, A. M. a kol.: Current Protocols in Molécular Biology, str. 10.7.1 až 10.8.6 (John Wiley & Sons, 1987).
Specifická genomová vyjádření se detekují porovnáváním vzoru exprese proteinu před a po vystavení rostlinnému extraktu. Specifické proteinové skrvny v 2-D gelu, které ukazují zvýšenou nebo potlačenou expresi podle intenzity skrvny na proteinové mapě, reprezentují změny v genomové aktivitě způsobené složkami rostlinného extraktu. Způsob je vysoce reprodukovatelný a umožňuje získání malých množství vysoce čistých proteinů pro aminokyselinovou sekvenční analýzu za použití standardních technik (tj. Edmanovo odbourávání koncových aminokyselin) — viz např. Graven a kol.: J. Biol.. Chem. 269: 24446 (1994).
U proteinů, jejichž exprese probíhá v malých množstvích, kdy nelze získat dostatečné množství materiálu pro sekvenaci peptidů, lze proteinové skvrny vyjmout z 2-D gelu a použít přímo pro imunizaci králíků za účelem produkce protilátek — viz Harlow, E. & Lané, D.:
• fc fcfcfcfc • fc fcfcfcfc fcfc fc fcfc fc ··«· fcfcfc fcfcfc fcfcfcfc • fcfc fcfcfcfc · fcfcfc fcfcfc • fcfc fcfcfc · · • fcfc fcfc · fcfc fcfc
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, str. 61. Dosažitelnost protilátky umožňuje imunoafinitní purifikaci větších množství regulovaného proteinu pro identifikaci pěptidové sekvence.
Podle pěptidové sekvence lze na základě redundantního nebo nej výhodnějšího genetického kódu syntetizovat oligonukleotidy, které se pak používají pro screening genetické knihovny c-DNA za účelem získání plné kódovací sekvence genu — viz např. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Identifikace genomového vyjádření izolací m-RNA
Jiným způsobem detekce změn v genomovém vyjádření vyvolaných rostlinným extraktem je monitorování změn messenger RNA (m-RNA) v buňce (Liang, P. & Pardee, A.
B., Science 257: 967-971 (1992)). Kultura buněk je vystavena určité koncentraci rostlinného extraktu, nebo jsou buňky cílové tkáně nebo orgánu v organismu vystaveny lokálně nebo systematicky jedné nebo více dávkám rostlinného extraktu po definovanou dobu a následně extrahovány.
m-RNA se připravuje rutinními totálními extrakčními metodami, jak je popsáno v Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, A. M. a kol.), str. 4.1.2 až 4.3.4 (John Wiley & Sons, 1987). Z této preparace lze získat Poly(A+) RNA oligo-dT chromatografii (Aviv, H. & Leder, P.: J. Mol. Biol. 134: 743 (1972)), jak popisuje Ausubel, A. M. a kol. v Current Protocols in Molecular Biology, str. 4.5.1 až 4.5.3 (John Wiley & Sons, 1987).
Jsou připraveny dva genofondy m-RNA, tj. jeden z buněk před vystavením rostlinnému extraktu a druhý po něm. Specifická genomová vyjádření jsou zastoupena v obou genofondech podle toho, zda je rostlinným extraktem vyvolána suprese genomové aktivity, nebo aktivace exprese genu. V případě, kdy je genová aktivita v odpovědi na rostlinný extrakt potlačena, m-RNA je přítomno ve větším množství v genofondu odvozeném od kontrolních buněk. V případě, kdy je gen v reakci na rostlinný extrakt aktivován, je m-RNA přítomno ve větším množství v genofondu získaném z buněk ošetřených rostlinným extraktem. Pro identifikaci populací m-RNA daných supresí nebo ·« ··« ·
9» · · · · · · · · ··· · · ♦ ···« ··· ···· » ··· ··· • · · ··· · · ·· ♦ ·· · ·♦ ·· 7 aktivací genu lze použít množství technik, např. subtraktivní hybridizaci nebo diferenciální zobrazení.
(a) Subtraktivní hybridizace
Byly vyvinuty techniky subtraktivní hybridizace (Lee, S. W. a kol.: Proč. Nati.
Acad. Sci. 88:2825 (1991)), při nichž je m-RNA z jednoho z genofondů protismyslně přeměněna na první vlákno c-DNA za použití oligo-dT primerů, připojených buď k perlové celulóze nebo k volným primerům, a reverzní transkriptázy — viz např. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2, str. 10.46 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). V případě, kdy je první vlákno připojeno k perlové celulóze, lze provést subtraktivní m-RNA chromatografií s tím výsledkem, že druhý genofond m-RNA sloupcem projde. m-RNA zastoupená v obou genofondech bude hybridizovat (tj. m-RNA z druhého genofondu bude na sloupci hybridizovat na protismyslnou c-DNA a bude ve sloupci zadržena). Proteklá část, která ve sloupci nehybridizovala, obsahuje druhy m-RNA vzniklé na základě změny v genomové aktivitě způsobené účinkem rostlinného extraktu na buňky. Z m-RNA obsažené v proteklé části lze připravit knihovnu c-DNA bakteriofágů — viz např. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2, str. 8.11 až 8.45 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Pokud je knihovna zkoumána sondami značenými 32P na konci řetězce, které vznikly z prvního genofondu, jsou specifické klony nezastoupené v prvním genofondu mRNA identifikovány jako nehybridizující skvrny. Byly popsány i další srovnávací strategie (Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2, str. 10.41 a 10.42 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
Příslušné geny se identifikují DNA sekvenací klonů c-DNA — viz např. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2, str. 13.3 až 13.20 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
(b) Diferenciální zobrazení m-RNA
Tento způsob je dobře popsán ve stavu techniky — viz Liang, P. & Pardee, A. B.: Science 257: 967 až 970 (1992); Callard, D. a kol.: BioTechniques 16: 1096 až 1103 ·· ·ftftft • ft ftftftft ftft ftft· · • ftft · * ft ftftft ftftft· ftftft · · · • ft · ftft ft (1994); Chen, Z. a kol.: BioTechniques 16: 1003 až 1006 (1994) a Zhao, S. a kol.: BioTechniques 20: 400 až 404 (1996). Částečné sekvence c-DNA jsou připraveny reverzní transkripcí m-RNA připravené buď z rostlinného extraktu, nebo z ošetřených či neošetřených buněk — viz např. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kniha 2, str. 10.46 (2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989) — a tyto sekvence jsou rozšířeny polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), např. použitím 5'TnCA jako 3'-primeru a krátkého 5'-primeru (6 až 7 bází). Při této reakci je použita značená a S-dATP. Značené krátké fragmenty vzniklé PCR z každého souboru m-RNA jsou frakcionizovány (tj. zobrazeny) v DNA-sekvenačních gelech. Pásy, které nejsou v obou genofondech přítomny se stejnou intenzitou, jsou vyjmuty z gelu, znovu rozšířeny a použity jako sondy pro screening knihoven c-DNA, jak je popsáno výše, za účelem identifikace genů regulovaných rostlinným extraktem.
Tímto způsobem lze katalogizovat genový profil specifického buněčného typu v odpovědi na vystavení určitému rostlinnému extraktu uvažovaného léčiva, a to bez znalosti aktuálních složek tohoto extraktu. Užitečnost rostlinného extraktu lze pak pomocí některých těchto genů změnit ve specifických biologických procesech. Tímto způsobem lze rozšířit terapeutický potenciál výrobku mimo jeho známé etnofarmakologické vlastnosti, nebo lze také tyto známé etnofarmakologické vlastnosti genomově ověřit. Navíc lze posléze jako terapeuticky účinné identifikovat na základě účinku extraktu na určitý soubor genomových vyjádření i podobně účinkující jednotlivé sloučeniny v extraktu.
ft ftft · • ftft « • ftftft ftftft • ft ft* ftft
Je třeba podotknout, že ačkoliv byl vynález popsán ve spojení s detailním popisem, je tento popis zamýšlen pouze jako ilustrace a nijak neomezuje rozsah vynálezu, který je definován rozsahem přiložených nároků. Další aspekty, výhody a modifikace jsou zahrnuty v nárocích.
Průmyslová využitelnost
Vynález se týká způsobu identifikace léčiva na bázi rostlinného extraktu pomocí genomového screeningu tohoto extraktu. Tímto způsobem lze jednak genomově ověřit již ·· fl··· • fl 9 99 9
9 99
9 · *· 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 « fl · ·«·· ♦ ··· 999
9 9 9 9 9 · 9 flfl fl 99 9 99 99 známé etnofarmakologické vlastnosti, jednak rozšířit terapeutický potenciál léčiva, případně identifikovat nové terapeuticky účinné sloučeniny.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob identifikace léčiva, vyznačující se tím, že zahrnuje podání rostlinného extraktu buněčnému typu, izolaci proteinu nebo RNA z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem, identifikaci proteinu nebo RNA, které byly izolovány z buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem v jiné koncentraci než z neošetřeného buněčného typu, podání jedné nebo více sloučenin nalezených v tomto rostlinném extraktu tomuto buněčnému typu, izolaci proteinu nebo RNA z tohoto buněčného typu ošetřeného těmito sloučeninami (sloučeninou) a identifikaci sloučenin nebo sloučeniny, které též způsobily expresi nebo supresi tohoto proteinu nebo RNA, který je přítomen v neošetřeném buněčném typu v jiné koncentraci než v ošetřeném buněčném typu.
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje izolaci proteinu z tohoto buněčného typu ošetřeného tímto rostlinným extraktem a z tohoto buněčného typu ošetřeného sloučeninou (sloučeninami).
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje izolaci RNA z tohoto buněčného typu ošetřeného tímto rostlinným extraktem a z tohoto buněčného typu ošetřeného sloučeninou (sloučeninami).
  4. 4. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j i c i se t i m, že tato RNA je messenger RNA, tj. mRNA).
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že tento rostlinný extrakt a tato sloučenina (sloučeniny) jsou podávány in vitro.
  6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že tento rostlinný extrakt a tato sloučenina (sloučeniny) jsou podávány in vivo.
  7. 7. Způsob identifikace léčiva, vyznačující se tím, že stanovuje genomovou odpověď buněčného typu na rostlinný extrakt, který zahrnuje podání tohoto rostlinného extraktu tomuto buněčnému typu, izolaci proteinu nebo RNA z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem a porovnání tohoto proteinu nebo RNA izolovaných z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem s proteinem nebo RNA izolovanými z neošetřeného buněčného typu.
  8. 8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že zahrnuje izolaci proteinu z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem.
    ·· fcfc*· fc* fcfc fcfc fcfc fcfc • fc · fcfc · fc··· ··· ··· · · · · • » fc fc··· · fc·· fcfcfc • fcfc fcfcfc · · fcfc · fcfc fc fcfc ··
  9. 9. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t i m, že zahrnuje izolaci RNA z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j i c i se t i m, že tato RNA je messenger RNA, tj. m-RNA).
  11. 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že dále zahrnuje identifikaci proteinu izolovaného z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem, který je v neošetřeném buněčném typu přítomen v jiné koncentraci.
  12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje sekvenaci tohoto proteinu identifikovaného v tomto buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem, který je v neošetřeném buněčném typu přítomen v jiné koncentraci.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ici se tim, že dále zahrnuje identifikaci genu kódujícího tento protein identifikovaný v tomto buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem, který je v neošetřeném buněčném typu přítomen v jiné koncentraci.
  14. 14. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále zahrnuje identifikaci této RNA izolované z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem, která je v neošetřeném buněčném typu přítomna v jiné koncentraci.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále zahrnuje sekvenaci této RNA identifikované v tomto buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem, která je v neošetřeném buněčném typu přítomna v jiné koncentraci.
  16. 16. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že dále zahrnuje identifikaci genu identifikovaného touto RNA izolovanou z tohoto buněčného typu ošetřeného rostlinným extraktem, která je v neošetřeném buněčném typu přítomna v jiné koncentraci.
  17. 17. Způsob podle nároku 15, v y z n a č u j i c i se t i m, že dále zahrnuje sekvenaci proteinu kódovaného touto RNA identifikovanou v tomto buněčném typu ošetřeném rostlinným extraktem, která je v neošetřeném buněčném typu přítomna v jiné koncentraci.
  18. 18. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že tento rostlinný extrakt je podáván in vitro.
  19. 19. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j i c i se t i m, že tento rostlinný extrakt je podáván in vivo.
  20. 20. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že tento buněčný typ je spojen se známým biologickým cílem tohoto rostlinného extraktu.
CZ991583A 1996-11-07 1997-11-05 Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů CZ158399A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/744,983 US20020018989A1 (en) 1996-11-07 1996-11-07 Method of identifying pharmaceuticals from plant extracts

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ158399A3 true CZ158399A3 (cs) 1999-09-15

Family

ID=24994734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ991583A CZ158399A3 (cs) 1996-11-07 1997-11-05 Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20020018989A1 (cs)
EP (1) EP0938589B1 (cs)
JP (1) JP2001502920A (cs)
KR (1) KR100463639B1 (cs)
AT (1) ATE248229T1 (cs)
AU (1) AU744788B2 (cs)
BR (1) BR9713335A (cs)
CA (1) CA2270115A1 (cs)
CZ (1) CZ158399A3 (cs)
DE (1) DE69724447T2 (cs)
DK (1) DK0938589T3 (cs)
ES (1) ES2206750T3 (cs)
HU (1) HUP0003940A3 (cs)
IL (1) IL129786A (cs)
NZ (1) NZ335534A (cs)
PL (1) PL189322B1 (cs)
PT (1) PT938589E (cs)
RU (2) RU2251690C2 (cs)
WO (1) WO1998020163A1 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211456A1 (en) * 2001-03-27 2003-11-13 Vassilios Papadopoulos Method of profiling a plant extract
ATE320003T1 (de) * 2001-06-05 2006-03-15 Advanced Gene Technology Corp Chip mit pflanzenextrakten auf der oberfläche
KR101674626B1 (ko) 2009-04-17 2016-11-09 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 영양약학적 및 의약적 산물에 대한 품질 조절 생분석법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH663900A5 (de) * 1985-05-06 1988-01-29 Cernitin Sa Pharmazeutisches praeparat zur prophylaktischen behandlung von allergien und verfahren zur herstellung dieses praeparates.
DE3717337A1 (de) * 1987-05-22 1988-12-15 Hoechst Ag Verfahren zum nachweis der antiaggregatorischen wirkung von vasoaktiven stoffen, speziell von phosphodiesterase- und/oder cyclooxygenase-hemmern
DE69214243T2 (de) * 1991-09-23 1997-02-06 Pfizer Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen
US5589358A (en) * 1993-12-29 1996-12-31 Univ Wake Forest Ileal bile acid transporter compositions and methods
US5834248A (en) * 1995-02-10 1998-11-10 Millennium Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods using rchd534, a gene uregulated by shear stress
US5736376A (en) * 1995-12-19 1998-04-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant endothelin converting enzyme-2 and its use in ECE inhibitor screening

Also Published As

Publication number Publication date
US20020018989A1 (en) 2002-02-14
ES2206750T3 (es) 2004-05-16
US20030026857A1 (en) 2003-02-06
RU2244751C2 (ru) 2005-01-20
KR100463639B1 (ko) 2004-12-29
HUP0003940A2 (en) 2001-03-28
DK0938589T3 (da) 2003-11-24
IL129786A0 (en) 2000-02-29
EP0938589A1 (en) 1999-09-01
KR20000053157A (ko) 2000-08-25
DE69724447D1 (de) 2003-10-02
JP2001502920A (ja) 2001-03-06
IL129786A (en) 2004-05-12
AU5104398A (en) 1998-05-29
CA2270115A1 (en) 1998-05-14
EP0938589B1 (en) 2003-08-27
PL189322B1 (pl) 2005-07-29
PL333181A1 (en) 1999-11-22
PT938589E (pt) 2004-01-30
NZ335534A (en) 2000-05-26
DE69724447T2 (de) 2004-06-17
ATE248229T1 (de) 2003-09-15
AU744788B2 (en) 2002-03-07
RU2251690C2 (ru) 2005-05-10
BR9713335A (pt) 2000-05-09
HUP0003940A3 (en) 2002-09-30
WO1998020163A1 (en) 1998-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69535428T2 (de) Verfahren zum Auffinden von differentiel exprimierte Gene
DE60213221T2 (de) Neuartige polynukleotide und polypeptide des ifnalpha-21 gens
CZ158399A3 (cs) Způsob identifikace léčiv z rostlinných extraktů
EP1588172A2 (de) Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon
DE60009530T2 (de) Genetische toxizitätsmarker, herstellung und verwendung
DE10021834A1 (de) mRNA Moleküle zur Verwendung als Indikatoren für den Aktivierungs- und Funktionszustand von T-Lymphozyten
DE10260931B4 (de) Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut
US20060057624A1 (en) Alternatively spliced pre-mRNA transcripts in neurodegenerative disease
MXPA99004285A (en) Method of identifying pharmaceuticals from plant extracts
IL146247A (en) Method of identifying pharmaceuticals from plant extracts
Ebadi et al. Differential stimulation of hepatic and brain metallothioneins by ethanol
EP0778347B1 (de) ATP- und Nukleinsäure-bindendes Protein mit Helikase- und ATPase Eigenschaften
US5262528A (en) cDNA probe differentiating normal and cancer tissues
WO2007036552A1 (de) Variante des humanen sv2a-proteins und deren einfluss auf die therapieantwort bei epilepsie
Paul et al. APP RNA splicing is not affected by differentiation of neurons and glia in culture
WO2002054078A2 (de) Verfahren zur bestimmung der hautalterung in vitro
EP1056857A2 (de) Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel
CN116769009A (zh) 花狭口蛙抗氧化肽及其基因在制备神经退行性疾病药物或保健品中的应用
EP1112365A2 (de) Humaner un muriner g-protein gekoppelter rezeptor edg6 (endothelial differentiation gen) und seine verwendung
Price et al. Molecular approaches to human neurological diseases and their animal models
WO2006027260A1 (de) Verwendung einer genveränderung im gen des humanen cdca3-proteins in der medizinischen diagnostik und therapie
Alrokayan Platelet Derived Growth Factor-A mRNA Levels in Diabetic and Nondiabetic Subjects at Risk of Coronary Heart Disease
US20030216339A1 (en) Gene sequences associated with neural plasticity and methods related thereto
WO2004005542A2 (de) Verfahren zur identifikation infektionsspezifisch regulierter gene der haut
DE10004857A1 (de) MLP-Gen, Nukleinsäuren, Polypeptide und deren Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic