EP1588172A2 - Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon - Google Patents

Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon

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Publication number
EP1588172A2
EP1588172A2 EP03757804A EP03757804A EP1588172A2 EP 1588172 A2 EP1588172 A2 EP 1588172A2 EP 03757804 A EP03757804 A EP 03757804A EP 03757804 A EP03757804 A EP 03757804A EP 1588172 A2 EP1588172 A2 EP 1588172A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
endothelial cells
brain
protein
cdna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03757804A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sabine Wolf
Martina JÄGER
Thorsten Bangsow
Carmen Bangsow
Dominik Jordan
Bernhard Pelzer
Thomas Oppolzer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Frankgen Biotechnologie AG
Original Assignee
Frankgen Biotechnologie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Frankgen Biotechnologie AG filed Critical Frankgen Biotechnologie AG
Publication of EP1588172A2 publication Critical patent/EP1588172A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the endothelial cells of cerebral capillaries form a selective permeability barrier between the blood and the brain of an organism, the so-called blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • Individual endothelial cells are arranged around the lumen within the capillaries and form a cylindrical, tubular cavity. Close connections between the individual endothelial cells and other cell types associated with the endothelial cells prevent the uncontrolled passive passage of a large number of substances through this cell layer.
  • BMEC brain microvessel endothelial cells
  • the brain does not have enough brain material available, which also includes ethical reasons. Furthermore, the individual individuals from whom the brain mass is derived are usually very different in terms of their genetic information. There are differences, for example, in terms of age, gender, weight, race, etc. Furthermore, the examination material must be within the first hours after entry of death, because after this period there is already a significant change in the protein composition in the cells due to enzymatic degradation and remodeling processes. Previous methods for examining protein expression in brain capillary endothelial cells also have the problem that the test material cannot be obtained in sufficient purity for direct examinations. When brain capillary endothelial cells are isolated by the known method, a mixture with other cell types is usually obtained, so that studies of the protein expression pattern on these samples do not allow adequate assignment exclusively to the brain capillary endothelial cells.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which BBB-specific proteins or fragments thereof can be uniquely identified.
  • the method is said to be particularly suitable for identifying BBB-specific proteins or genes in brain capillary endothelial cells.
  • the method should be easy and gentle to carry out.
  • the method according to the invention is intended to be selective for proteins or fragments thereof which are amplified or formed exclusively in brain capillary endothelial cells and not in a comparative tissue or related cell type.
  • the proteins or fragments thereof identified with the method according to the invention are to be suitable as diagnostic markers for diseases which are associated with a dysfunction of the blood-brain barrier.
  • the proteins identified by the method according to the invention are said to be suitable for the manufacture of medicaments for the treatment of diseases which are associated with a dysfunction of the blood-brain barrier.
  • a method for identifying the presence of a BBB-specific Proteins or fragments thereof in brain capillary endothelial cells characterized in that a) brain capillary endothelial cells freshly isolated from the brain are pre-cleaned in the usual way by enzymatic digestion, b) the digestion obtained in stage a) is treated with a lysis buffer which contains the erythrocytes and apoptotic cells are essentially destroyed and at least 70% of the brain capillary endothelial cells are kept in vital form, c) if necessary, the product obtained in step b) is further purified, d) a subtractive cDNA library is produced from the brain capillary endothelial cells and a subtraction tissue, e) performs a cDNA subtraction by means of one or more differential hybridization steps, f) clones from the subtractive cDNA bank are verified with respect to their respective expression by differential hybridization, g) the cDNA sequence for the BHS
  • the invention further relates to a method for identifying the presence of a BBB-specific protein or fragment thereof in brain capillary endothelial cells, characterized in that a) brain capillary endothelial cells freshly isolated from the brain are pre-purified in the usual manner by enzymatic digestion, b) the in Step a) of the disruption obtained is treated with a lysis buffer which essentially destroys existing erythrocytes and apoptotic cells and at least 70% of the brain capillary endothelial cells is kept in vital form, c) if appropriate, that obtained in step b)
  • BBB-specific proteins or fragments thereof can be uniquely and reliably identified and the invention also relates to the proteins isolated with this method and the transcripts or genes coding for these proteins.
  • the invention also relates to the proteins with the sequences SEQ ID NO: 5, 14, 19, 23, 27, 33, 53 isolated by this method.
  • the invention further relates to the use of the proteins or
  • Fragments thereof for the production of agents or medicines for the diagnosis or therapy of diseases which are based on a dysfunction of the blood-brain barrier.
  • the proteins isolated with the method according to the invention are specific for the BBB. Because of their specificity for the BBB, the proteins isolated with the method according to the invention have a function in or on the BBB. This function can be, for example, a barrier function, a transport function, a function in connection with the nutrient supply of the BBB, a function as a tight junction protein, an enzymatic activity, etc. It is thus possible, based on the identification of the presence of these proteins, to derive specific functions from them in the BBB. This derive fish functions from it in the BHS.
  • the proteins identified with the method according to the invention can be the subject of therapeutic interventions in a targeted manner.
  • the method according to the invention allows for the first time the development of therapeutic concepts for diseases affecting the brain.
  • the detection of changes in the proteins identified by the described method can be used to diagnose diseases based on a dysfunction of the BBB.
  • BMEC primary cells
  • BMEC primary cells
  • BMEC primary cells
  • BMEC dedifferentiate very quickly in culture, i.e. lose their bras properties very quickly.
  • the expression of the proteins specific for the blood-brain barrier in cultured brain capillary endothelial cells is strongly downregulated and disappears completely after only a few passages, as a result of which reliable isolation and identification of BMEC-specific proteins is not possible.
  • pure and vital cells must be isolated in order to ensure cell specificity and to prevent negative or falsifying effects through apoptosis.
  • brain material can be removed from the respective organism by surgical intervention in the living organism.
  • brain samples can also be obtained from the human organism during brain operations.
  • the brain is preferably removed within a period of at most one hour, more preferably about at most 30 minutes, more preferably about at most 15 minutes or even more preferably about 5 minutes after the onset of death.
  • the brain can be taken from any living being, for example humans, cattle, sheep, goats, horses etc. It has now been found that pig brains are a good model for the human brain with a view to examining the brain capillary endothelial cells for BBB-specific Represent proteins and the transferability of the results to humans.
  • the pig brain is very similar to the human brain in terms of both anatomy and morphology. Furthermore, sequence homologies between humans and pigs are generally very high, both at the protein and at the nucleic acid level, so that results obtained from pig material can be reliably transferred to humans and vice versa. This is due to the fact that humans and pigs are phylogenetically more closely related than humans and classic model organisms such as mice or rats.
  • a hypotonic lysis buffer not only lyses erythrocytes, but also bursts dead and apoptotic cells in general through hypotonic shock.
  • the lysis buffer to be used in the method according to the invention receives at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, still more preferably 95% of the brain capillary endothelial cells in vital form. Furthermore, the lysis buffer must be non-toxic and have a pH in the physiological range.
  • the hypotonic buffer used according to the invention should have an ionic strength of 0.1-0.2 M, contain mono- and divalent anions or cations and have a pH of Buffer range of 7.0-8.0. All substances contained must be non-toxic to the cells so that healthy cells in the buffer are not damaged for a short time.
  • the hypotonic buffer preferably contains an ionic strength of 0.1-0.2 M sodium, potassium, ammonium, calcium, magnesium,
  • Chloride and sulfate ions as well as glucose and buffers in a pH range of 7.0-8.0. This allows selective enrichment of vital brain capillary endothelial cells from a mixture of erythrocytes and other cells of varying vitality.
  • the buffer used according to the invention preferably has the following composition at a pH of 7.5:
  • the lysis buffer used more preferably has the following composition:
  • the buffer particularly preferably has the following composition:
  • Such lysis buffers are normally used to isolate lymphocytes or RNA from lymphocytes by first lysing the erythrocytes. Neither the composition of the buffer used according to the invention nor the use of such a buffer for the lysis of apoptotic cells has hitherto been described.
  • the selective lysis of apoptotic cells is of essential importance in the method according to the invention in order to enrich BHS-specific transcripts without simultaneously enriching transcripts of genes which are increasingly expressed during apoptosis.
  • the problem of apoptosis is avoided by culturing the isolated cells.
  • brain capillary endothelial cells change their properties in culture, which leads to a change in the gene expression pattern.
  • the method for cell preparation according to the invention allows for the first time and in a targeted manner the isolation of sufficient quantities of fresh brain capillary endothelial cells by the final lysis step.
  • the brain capillary endothelial cells to be isolated are essentially in the gray matter of the brain.
  • the gray matter of the brain is therefore preferably mechanically prepared from the other parts of the brain.
  • the meninges are first removed and the gray matter is scraped off, crushed and transferred to a suitable medium.
  • a suitable medium is, for example, M199 medium (Gibco / BRL, Grand Island, NY) or Earle's buffer. Before further purification, it is advisable to determine the mass of the gray matter obtained.
  • Earle's buffer NaCl 117.2 mM
  • the brain capillary endothelial cells are pre-cleaned by disrupting the brain substance in at least two successive enzymatic steps.
  • a first enzymatic step the brain substance is digested with the enzyme dispase.
  • the dispase digestion causes the nerve tissue to dissolve.
  • An amount of 5 mg dispase per gram of gray brain substance has proven to be particularly suitable.
  • Dispase digestion is expediently carried out in M199 medium, but other media and buffers are also suitable for this reaction.
  • An appropriately prepared Dispas solution is added to the sample of the gray matter, and the suspension is incubated at 37 ° with stirring. Incubation times of two to four hours, preferably about three hours, have proven to be particularly advantageous.
  • the enzyme concentrations, the solvents or media used and the incubation period must be selected so that as much of the material as possible that surrounds or binds the brain capillaries is broken down or dissolved.
  • the conditions must be set such that the smallest possible part of the brain capillary endothelial cells to be isolated is attacked or killed in the respective enzymatic step and the cells are exposed to the lowest possible load. It is essential that the resulting shear forces are kept as low as possible. This is achieved, for example, by slowly and continuously mixing the enzymatic digestion of the brain mass in spinner bottles.
  • the brain capillaries are obtained in a first cleaning stage by centrifugation in dextran solution. Methods known from the prior art can be used for this. It has proven particularly suitable to mix an amount of the cell suspension from the dispase digestion with the same amount of a 15% dextran solution, 10 min. shake and centrifuge for about ten minutes at 10 ° C at 8650 x g in a fixed angle rotor. After centrifugation, the supernatant is removed and the sediment is fed to the second enzymatic step.
  • the sediment from the centrifugation is digested with Collagenase D.
  • Collagenase D dissolves the basement membrane, among other things.
  • protease inhibitors are expediently added to the second enzymatic step.
  • the protease inhibitor Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK) is particularly suitable for this.
  • the second enzymatic step is expediently carried out with stirring at 37 ° C. for about one hour. It has also proven particularly suitable to use one or more DNAses, such as benzonase, in the second enzymatic step. As a result, the DNA released when digestion of dead cells is broken down, which otherwise increases the viscosity of the suspension.
  • a second cleaning step is carried out by centrifugation in the Percoll density gradient.
  • the density gradient is prepared by, for example, 9.91 ml Percoll, 0.72 ml 10 times concentrated Mix M199 medium and 19.37 ml Earle's buffer and centrifuge in the ultra centrifuge at 37200 xg, 4 ° C in a fixed angle rotor for one hour.
  • the cell suspension from the second enzymatic step is washed by repeated centrifugation at low speed, withdrawing the supernatant and resuspending the centrifugation sediment, ie freed from the added enzymes.
  • the sediment is taken up in a small amount of liquid, such as 6 ml of M199 medium, applied to the prepared Percoll density gradient and centrifuged in the swing-out rotor in the ultracentrifuge at 1400 xg, 4 ° C for ten minutes.
  • Percoll density gradient centrifugation causes the suspended cell material to be separated according to its density, with three discrete bands usually occurring.
  • a first upper band with the lowest density contains cell debris or cell fragments.
  • a second middle band contains the brain capillary endothelial cells to be isolated. Erythrocytes, among other things, collect in a third lower band with the highest density.
  • the second band which contains the brain capillary endothelial cells, is isolated and, according to the invention, fed to a further purification.
  • the isolation can be carried out by pulling off the band with the aid of a cannula or, preferably, by pipetting.
  • the material from the second band obtained from Percoll density gradient centrifugation also contains a large number of other cell types, essentially erythrocytes and apoptotic cells. So far it has not been possible to separate these contaminating cells sufficiently from the brain capillary endothelial cells under gentle conditions.
  • a lysis buffer which contains the following constituents has proven to be suitable according to the invention:
  • a lysis buffer with the following composition is particularly suitable: NaCl 39 mM
  • the suspension After addition of the lysis buffer, the suspension is mixed and washed several times by centrifugation at low speed and resuspension in a suitable medium or buffer, such as M199 or Earle's buffer.
  • a suitable medium or buffer such as M199 or Earle's buffer.
  • the cleaned brain capillary endothelial cells collect in the centrifugate.
  • the purified brain capillary endothelial cells can now be processed in two different ways to identify the presence of BBB-specific proteins or fragments thereof.
  • different proteins or fragments thereof or transcripts can be identified and isolated using the proteomics approach and the genomics approach. Both approaches are described in more detail below.
  • Figure la Northern blot analysis of Itm2A
  • Figure lb Expression of Itm2A in BMEC under ischemia
  • FIG. 1 Expression pattern of Itm2A in cultured BMEC (M: 100 bp marker)
  • Figure 5 Northern blot analysis hybridized with S231 (A) or EMP1 (B) as a probe
  • FIG. 7 Homology comparison of human and murine EMP1 and porcine S231. The membrane domain is highlighted in light, the N-glycosylation site in light gray.
  • Figure 9 Northern blot hybridizes with full-length FLJ13448 / S012 as a probe
  • Figure 10 Homology comparison of human, murine and porcine FLJ13448 / S012. The peptides that serve as signal peptides and are split off are shown in italics.
  • Figure 11 Expression pattern of porcine FLJ13448 / S012 in cultured cells (M: 100 bp marker)
  • Figure 12 NSE2 amino acid sequence of the human protein. The bold, underlined font identifies the peptides identified in the mass fingerprint.
  • Figure 13 Northern blot for NSE2 hybridized with SEQ ID NO: 22 as a probe
  • Figure 15 Homology comparison of human NSE2 and NSEl. Potential phosphorilization sites are shown in a bright font. A possible tyrosine kinase domain (ProSite Pattern Match PS00109) is underlined, the active remainder being shown in bold.
  • FIG. 16 Distribution of PEST domains in NSE2.
  • PEST sequences are regions rich in Pro, Glu, Ser and Thr in proteins that are responsible for a short half-life of such proteins in the cell by controlling the ubiquitinization of these proteins. Phosphorilation of certain Ser or Thr residues in the PEST regions (light) is important for the detection and processing by the Ubiquitin-Proteaso way.
  • Figure 17 The expression of NSE2 in BMEC under ischemia
  • FIG. 18 Amino acid sequence of the human protein DRG-1
  • FIG 19 The homology comparison of human and murine DRG-1 shows 90% identity and 94% homology. Potential phosphorilization sites, a non-conserved potential glycosylation site and the transmembrane domain are shown in a bright font. The N-terminus is located intracellularly.
  • Figure 20 Expression pattern of DRG-1 (M: 100 bp marker)
  • Figure 22 TKA-1 amino acid sequence of the human protein. The bold, underlined font identifies the peptides identified in the mass fingerprint.
  • Figure 23 Northern blot hybridizes with ssTKA-l.ctg as a probe
  • FIG. 24 Expression pattern of TKA-1 in cultivated cells (M: 100 bp marker)
  • FIG. 25 Expression of TKA-1 in BMEC under ischemia
  • Figure 29 Multiple tissue blot hybridized with S064 as a probe
  • Figure 34 Multiple tissue blot hybridizes with 5E7 as a probe
  • Figure 36 Reduced expression rate of TSC-22 in BMEC in ischemia Identification of BBB-specific proteins by differential 2D gel electrophoresis
  • a comparative tissue is used in all electrophoresis.
  • the reference tissue is a tissue that allows targeted identification of transcripts or proteins that are specific for the blood-brain barrier.
  • any endothelial cells can be used as reference tissue, for example macro- and microvascular endothelial cells of the same tissue or also endothelial cells from other organs, e.g. Heart, lungs, kidneys, liver, aorta etc.
  • Dedifferentiated BMEC obtained from culture can also be used.
  • endothelial cell as a reference tissue against brain capillary endothelial cells.
  • Endothelial cells from aorta that do not have a barrier function are preferably used. This has the additional advantage that microvessels can be compared to macrovessels. Other microvascular endothelial cells can also be used.
  • Brain capillary endothelial cells cultured under other conditions are also suitable as comparison tissue, for example under other conditions with regard to pH value, growth matrix, growth factors, for example cytokines.
  • the physiological importance of the identified proteins results from the known properties of the brain capillary endothelial cells compared to the respective comparative tissue.
  • two defined cell types are preferably used: freshly isolated BMEC as the cell type with barrier function and endothelial cells from aorta, which, like BMEC, are also endothelial cells, but have no barrier function.
  • aorta which, like BMEC, are also endothelial cells, but have no barrier function.
  • the vitality of the prepared cells and the proportion of erythrocytes contained in the preparation must first be determined. To determine the vitality, 20 ⁇ l of the suspended cells are removed and 4 ⁇ l of fluorescine diacetate working solution (24 ⁇ M in Earle's buffer) and 2 ⁇ l propidium iodide working solution (70 ⁇ M in Earle's buffer) are added. The suspension is mixed and incubated at 37 ° C for 10 min. The cells are documented under a fluorescence microscope and the ratio of vital to damaged cells is determined.
  • Living cells can be recognized by a green fluorescence (excitation 450 nm and emission 515 nm), damaged cells on the other hand by a red fluorescence located in the nucleus (exitation 488 nm and emission 615 nm).
  • the proportion of erythrocytes is determined by adding 20 ⁇ l of benzidine working solution (15 mM benzidine hydrochloride, 12% (v / v) acetic acid, 2% (v / v) H 2 0 2 ) to 20 ⁇ l cell suspension. The sample is mixed and incubated for 5 min at 25 ° C. A drop of the cells was then pipetted onto a slide and covered with a coverslip.
  • Erythrocytes appear in this test due to the addition of blue crystals in the transmitted light microscope.
  • the ratio of endothelial cells to erythrocytes is determined by counting. With a vitality ratio of 95% vital cells and an erythrocyte contamination of less than 10%, the cells can be used for the subsequent two-dimensional gel electrophoresis.
  • the wet weight of the freshly isolated, sedimented cells is determined and with five times the volume (e.g. 100 mg
  • the sediment is then again in five times the volume of the original wet weight in buffer B pH 7. (10 mM PIPES, 100 M NaCl, 3 mM MgCl 2 , 300 mM sucrose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5% (v / v) Triton X-100) resuspended and incubated on ice for 30 min with vigorous shaking. The sample is then sedimented by centrifugation (5000 g, 4 ° C.) for 10 min, the supernatant is drawn off and stored at ⁇ 20 ° C. until further use.
  • buffer B pH 7. 10 mM PIPES, 100 M NaCl, 3 mM MgCl 2 , 300 mM sucrose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5% (v / v) Triton X-100
  • the sediment is now in 1.7 times the original wet weight in buffer C pH 7.4 (10 mM PIPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM PMSF, 1% (v / v) TWEEN-40, 0.5% ( w / v) deoxycholate) resuspended, transferred to a dounce homogenizer and digested with five strokes. The sample is then transferred back to a 2 ml reaction vessel and incubated for 1 min in an ultrasound bath. The sample is then sedimented by centrifugation (6780 g, 4 ° C, 10 min) and the supernatant is stored at -20 ° C until further use.
  • buffer C pH 7.4 10 mM PIPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM PMSF, 1% (v / v) TWEEN-40, 0.5% ( w / v) deoxycholate
  • the sediment is to be resuspended in 200 - 500 ⁇ l buffer D pH 8.0 (50 mM Tris, 1 mM MgCl 2 ) and is snap frozen in nitrogen. Then the sample is thawed in an ultrasonic bath and then incubated at 37 ° C with 5 - 10 ⁇ l benzonase (25 U / ⁇ l) until a homogeneous, no longer viscous liquid forms. Then 7 times the volume of a 5% (w / v) SDS solution is added and the sample is heated to 90 ° C. for 20 min. Centrifugation for 10 min (7000g, 20 ° C) follows to remove insoluble components. The supernatant was removed and stored at -20 ° C until further use. Any sediment that may be present is discarded.
  • the supernatants are thawed, proportionally combined and mixed.
  • the sample is mixed with 100% acetone (stored at -30 ° C) in a ratio of 20 to 80. After thorough mixing, the precipitation is incubated at -30 ° C for at least 1 h. The precipitated proteins are then sedimented for 15 min at 10,000 g and 4 ° C. The supernatant is decanted and discarded.
  • BSA bovine serum albumin
  • solubilization buffer I or II solubilization buffer I or II. Concentrations of 0.2 mg / ml, 0.4 mg / ml, 0.6 mg / ml, 0.8 mg / ml and 1.0 mg / ml were set for the calibration solutions. 20 ⁇ l each of the calibration solutions, the sample and the reference (solubilization buffer I or II) are placed in a 1.5 ml reaction vessel and 1 ml of the Rotiquant working solution is added. Mixing is carried out in the respective reaction vessel by immediate inverting, after which the sample is incubated at 25 ° C. for 20 minutes. After transferring the sample to a 1 ml cuvette is measured in a spectrophotometer at 560 nm the absorption. The protein content of the samples can be determined by creating a calibration line.
  • BSA bovine serum albumin
  • IPG buffers For the pH gradients used (3.5 - 4.5; 4.0 - 5.0; 4.5 - 5.5; 5.0 - 6.0; 5.5 - 6.7; 6.0 - 9.0) which are used as 24 cm long gels (Immobiline DryStrip; Amersham Biosciences), the appropriate IPG buffers are used.
  • the electrode strips moistened with double-distilled water are positioned on the respective ends.
  • the electrodes are then placed on these strips.
  • 6 loaded stripholders are focused in an ETTAN IPGphor focusing apparatus (Amersham Biosciences) with a program that corresponds to the pH gradient (see Table 1). After focusing, the strips are removed with tweezers and stored at - 80 ° C until further use.
  • Program 1 is used for the pH gradients 3.5 - 4.5, 4.0 - 5.0, 4.5 - 5.5, 5.0 - 6.0 and 5.5 - 6.7, while Program 2 is used for gels with a pH gradient of 6.0 - 9.0.
  • the required SDS-polyacrylamide gels with a concentration of acrylic id of 12.5% are produced in-house.
  • the gel casting apparatus is assembled according to the operating instructions (Amersham Biosciences) and filled with displacement buffer pH 8.8 (0.375 M Tris, 50% (v / v) glycerin, 0.002% (w / v) bromophenol blue) into the intended reservoir.
  • the gel polymerization batch pH 8.8 (12.17% (w / v) acrylamide, 0.33% (w / v) bisacrylamide, 0.375 M Tris, 0.1% (w / v) SDS, 0.05% (w / v) ammonium peroxodisulfate) is mixed in a vessel with a spout and then degassed in an ultrasonic bath for 5 min.
  • the polymerization reaction is then started by adding 0.04% (v / v) TEMED.
  • the vessel is immediately mounted on a tripod and connected to the gel casting apparatus via a hose.
  • the gel solution is allowed to flow into the apparatus until it is about 3 cm below the lower edge of the gel cassettes.
  • the plug of the reservoir for displacement Solution buffer loosened and the buffer displaces the gel solution until it has risen about 1 cm below the glass edge of the cassette.
  • the cast gels are overlaid with water-saturated n-butanol until the polymerization is complete.
  • the reduction buffer is then discarded and the proteins are alkylated with iodoacetamide by adding 15 ml of alkylation buffer (6 M urea, 50 mM Tris, 30% (v / v) glycerol, 4% (w / v) SDS, 260 mM iodoacetamide) , Incubation is also carried out for 15 min at 25 ° C with shaking. The buffer is then also discarded and the gel strip is removed from the tube.
  • alkylation buffer 6 M urea, 50 mM Tris, 30% (v / v) glycerol, 4% (w / v) SDS, 260 mM iodoacetamide
  • the gel is placed on the SDS gels and mixed with 2 ml of liquid agarose solution pH 8.3 (0.5% (w / v) agarose, 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% (w / v) SDS) overlaid and thereby fixed.
  • the electrophoresis chamber ETTAN DALT II (Amersham
  • the power is increased to 55 W per gel, but to a maximum of 180 W and the electrophoresis is continued until the blue control dye (bromophenol blue) has reached the lower end of the gels.
  • the electrophoresis is stopped and the gels removed.
  • 400 ml (7% (v / v) acetic acid, 10% (v / v) methanol) are placed in a bowl per gel, the gel is removed from the glass plates and transferred to the bowls. For fixie The gels are incubated for 30 min at 25 ° C with shaking. In the meantime, 400 ml of SyproRuby staining solution are placed in a black bowl and the fixed gels are transferred to the staining solution after the incubation period.
  • the gels are decolorized in 400 ml fixation for 15 min and for documentation in the FLA 5000 scanner (Fuji) at an excitation wavelength of 473 nm and an emission wavelength of 575 nm with a resolution of 100 ⁇ m and a 16 bit Gradiation scanned.
  • the gels are then sealed in plastic wrap and stored at 4 ° C until further use.
  • the pH gradient was first (3.5 - 4.5; 4.0 - 5.0; 4.5 - 5.5; 5.0 - 6.0; 5.5 - 6.7 ; 6.0 - 9.0) 10 gels each with freshly prepared BMECs and 10 gels from AOECs (Aorta Endothelial Cells) created and scanned. The gels were then compared with Z3 evaluation software (Compugen) and differential spots were annotated. A minimum spot size of 100 pixels was assumed as the filter.
  • the protein spots which were detected in BMECs higher (three times the amount or more) or uniquely, were cut out with a 1000 ⁇ l tip on a blue light table (MoBiTec) and transferred to a 0.2 ml reaction vessel. The cut spots were labeled and stored at -80 ° C until further use.
  • the cut-out protein fixed in the gel matrix was removed from the -80 ° C. refrigerator and washed by adding 100 ⁇ l of bidistilled water. For this purpose, the respective batch was incubated for 20 min at 25 ° C. with shaking and then the supernatant was pipetted off and discarded. The process was still repeated two more times. It was overlaid twice with 100 ⁇ l of 50% (v / v) acetonitrile and incubated for 15 min at 25 ° C. with shaking. The supernatants were discarded again. By adding 100 ⁇ l of 100% acetonitrile and incubating for 15 minutes at 25 ° C. with shaking, the gel piece was completely dehydrated.
  • the gel piece was air-dried for 5 minutes. The gel piece was then rehydrated in 15 ⁇ l hydrolysis buffer (50 mM (NH 4 ) 2 CO 3 , 25 ng-50 ng / 15 ⁇ l trypsin V) and swollen. The proteins were hydrolyzed by
  • the ZipTip-C18 pipette tips used are rehydrated three times prepared with 10 ⁇ l 50% (v / v) acetonitrile and then equilibrated three times with 10 ⁇ l 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid
  • the sample is applied by drawing up the supernatant of the hydrolysis batch seven to ten times the ZipTips then with 10 ⁇ l 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid
  • the peptides are directly mixed with the matrix ( ⁇ -cyanocinnamic acid, 50% (v / v) acetonitrile, 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid) Pipette up and down three or four times onto the MALDI measuring carrier.
  • the samples are first measured and analyzed by mass spectrometry using a MALDI fingerprint.
  • the Voyager DE PRO PerSeptive Biosyste ms
  • MALDI mass spectrometer measured the samples in positive reflector mode with an acceleration voltage of 20,000 V, a grid voltage of 75%, a turnout wire of 0.02% and a delay time of 220 ns.
  • a mass window is used that takes masses between 700 - 3500 Da into account.
  • the mass lists obtained for each protein spot are used in a data query. Three different programs are used: Mascot, MSFit and Profound.
  • Protein spots in which no database identification is possible despite a good mass fingerprint, are used with ESI mass spectrometry to generate amino acid sequence information.
  • the hydrolysis batch is acidified with 15 ⁇ l of 0.2% (v / v) formic acid and incubated for 30 min with shaking.
  • ZipTip-C18 pipette tips (MilliPore) are rehydrated three times with 10 ⁇ l 50% (v / v) acetonitrile and then equilibrated by washing three times with 10 ⁇ l 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid.
  • the sample is applied by drawing up the supernatant of the hydrolysis batch seven to ten times.
  • the ZipTips are then washed with 10 ⁇ l 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid, then buffered by washing twice with 0.1% (v / v) formic acid and then the peptides by drawing up 2 ⁇ l 50 five to seven times % (v / v) methanol eluted.
  • the peptide mixtures obtained can be analyzed either directly or by means of liquid chromatography (LC) coupled with ESI mass spectrometry.
  • LC liquid chromatography
  • the scanning range is 50 - 1600 Th.
  • the reversed phase (RP) precolumn is first loaded with 2 ⁇ l sample at a flow of 20 ⁇ l / in 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid.
  • the peptides are chromatographically separated on a RP-C18 column (LC packings) with a gradient over 35 min from the initial conditions (0.05% (v / v) formic acid, 10% (v / v) acetonitrile) to Final conditions (0.05% (v / v) formic acid, 76% (v / v) acetonitrile).
  • the HPLC is coupled to the mass spectrometer via a hollow needle (New Objective).
  • the settings of the mass spectrometer are chosen so that two experiments can be carried out during the LC run. In addition to the ion spray voltage (1800 - 2200 V), the parameters set correspond to those already listed above. Both overview spectra and production spectra are recorded alternately during the run. The settings for the production spectra are selected so that the two most intense signals in the overview spectrum, which are loaded twice, three times or four times and whose intensity is greater than 10 cps, are then analyzed using a shock-induced fragmentation. The scan range is 450 - 1600 Th. The evaluation of the spectra obtained is carried out in three stages:
  • Amino acid sequence of the corresponding peptide are first determined using the software program es MASCOT (Mat- rix Sciences) completely compared with public databases. If the peptide cannot be assigned to a protein,
  • BHS-specific proteins or fragments thereof can be specifically identified in brain capillary endothelial cells.
  • process steps can be varied:
  • Corresponding focusing gels from other manufacturers can of course be used for isoelectric focusing. Different lengths and pH gradients can also be used.
  • Mass spectrometers of other types and from other manufacturers can also be used to determine the peptide masses and de novo amino acid sequences.
  • the mass spectrometric conditions can be varied both in terms of equipment and function, according to the sample.
  • the proteins were separated on 12.5% polyacrylamide gels as described above and then transferred to nitrocellulose membrane.
  • the membranes were in TBST buffer (10 mM Tris base,
  • the bound antibodies were detected by incubation with a second antibody conjugated with alkaline phosphatase for 1 h at RT in TBST buffer [anti-rabbit IgG antibody (goat) 1: 5000]. After washing twice with TBST buffer, the membrane was buffered to an alkaline pH by incubation with AP buffer (100 mM Tris base, 100 mM sodium chloride, 5 mM magnesium chloride; pH 9.5). 0.016% (w / v) nitrotetrazolium blue chloride and 0.033% (w / v) 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate disodium salt in AP buffer were used as substrates for the color reaction.
  • AP buffer 100 mM Tris base, 100 mM sodium chloride, 5 mM magnesium chloride; pH 9.5.
  • BBB-specific proteins or fragments thereof in brain capillary endothelial cells using the genomics approach is now described below.
  • the targeted identification of cell- or tissue-specific proteins is carried out using differential methods. This can be done at the protein level by comparing 2D gels from digestions of different tissues or cells and then determining the proteins specific for a tissue or cell type. To from the physical properties of To be independent of proteins (size, solubility), differential methods can also be carried out at the transcript level to identify specific proteins. Such subtractive RNA techniques also have the advantage of requiring less tissue or cell material.
  • BMEC BMEC-derived BMEC
  • the use of freshly isolated BMEC as a starting material is crucial for the identification of BBB-specific proteins.
  • the methods described so far have at best been based on the subtraction of RNA from brain capillaries against RNA from kidney (Li et al., 2001).
  • brain capillaries also contain other cell types such as pericytes and astrocytes in addition to BMEC.
  • the kidney subtraction tissue is very heterogeneous, since it consists of different cell types, of which endothelial cells make up only a small part.
  • a subtraction tissue is to be used which permits targeted identification of transcripts or proteins which are specific for the blood-brain barrier.
  • any endothelial cells can be used as reference tissue, for example macro- and microvascular endothelial cells of the same tissue or also endothelial cells from other organs, for example heart, lung, kidney, liver, aorta etc.
  • Dedifferentiated BMEC obtained from culture can also be used.
  • Endothelial cells from aorta that do not have a barrier function are preferably used. This has the additional advantage that microvessels can be compared to macrovessels. Other microvascular endothelial cells can also be used.
  • Brain capillary endothelial cells cultured under other conditions are also suitable as comparison tissue, for example under different conditions with regard to pH value, growth matrix, growth factors (for example Cytokines etc.). From the known properties of the brain capillary endothelial cells in relation to the respective comparative tissue, the physiological significance of the identified targets results.
  • two defined cell types are preferably used: freshly isolated BMEC as the cell type with barrier function and endothelial cells from aorta, which, like BMEC, are also endothelial cells, but have no barrier function. This approach allows much more targeted transcripts or proteins to be identified that contribute to the formation of the blood-brain barrier.
  • RNA Total RNA is isolated from the cells with Trizol (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The total RNA is then checked for intactness on a denaturing agarose gel. For RNA isolation, 100 mg of tissue or 10 cm 2 of confluently grown cells are mechanically homogenized in 1 ml of trizole and the homogenate is then incubated for 5 min at RT. Then 0.2 ml of chloroform / 1 ml of Trizol (Invitrogen) are added, mixed by vortexing for 15 seconds and incubated at RT for 3 minutes. For phase separation, centrifugation is carried out at 4 ° C. and 12,000 ⁇ g for 15 min and then the upper, aqueous phase is transferred to a fresh vessel.
  • Trizol Invitrogen
  • RNA is sedimented by centrifugation at 4 ° C. and 12,000 ⁇ g for 10 min, washed twice with 75% EtOH, air-dried and dissolved in DEPC-treated water. The concentration is determined spectrophotometrically and the quality checked in a denaturing agarose gel.
  • RNA enrichment 75 ⁇ g of total RNA is denatured for 2 min at 65 ° C., immediately added to 200 ⁇ l Dynabeads 01igo (dT) 25 (Dynal) in double binding buffer and incubated for 5 min with mixing. The supernatant from the magnetic separation is discarded and the Dynabeads are washed twice with washing buffer. The polyA + RNA is finally eluted with 20 ul 10 M Tris-HCl pH 7.5 for 2 min at 85 ° C.
  • the subtractive cDNA library can be produced using commercially available PCR subtraction kits.
  • the PCR-Select cDNA subtraction kit from Clontech can be used according to the manufacturer's instructions.
  • mRNA from BMEC (tester) and AOEC (driver) are transcribed from a oligo (dT) adapter primer with the enzyme AMV reverse transcriptase into single-stranded cDNA.
  • the second strand synthesis is carried out with an enzyme mixture (DNA polymerase I, RNase H and DNA ligase) for two hours at 16 ° C. and then with the addition of T4 DNA polymerase and further incubation at 16 ° C. for 30 minutes.
  • the double-stranded cDNA thus produced is purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the adapters 1 and 2R are now connected to the tester cDNA via the Rsa I ends Enzyme T4 DNA ligase attached. The ligation is checked by PCR.
  • the actual subtraction is carried out by two hybridizations.
  • cDNA from BMEC adapter 1 is hybridized with AOEC cDNA in one approach
  • cDNA from BMEC adapter 2R with AOEC cDNA in another approach.
  • the two approaches from the first hybridization are combined and hybridized with freshly denatured cDNA from AOEC.
  • the product mixture from this first PCR was then used as a template in a nested PCR (nested PCR), the two primers arranged one inside the other coming from the unique area of the two adapters 1 and 2R.
  • This second PCR increases the specificity.
  • the efficiency of the subtraction was checked by comparative PCR on a household gene (GAPDH): in comparison to the two non-subtracted cDNAs from BMEC and AOEC, the cDNA from the subtraction can only be used to produce products after significantly more PCR cycles.
  • GAPDH is expressed as a typical household gene in all tissues and cell types of comparable strength. Therefore, in a subtractive hybridization, it should not be enriched like differentially expressed genes, but the amount of transcript in the subtracted cDNAs (both forward and reverse subtraction) should decrease significantly compared to the cDNAs from BMEC or AOEC before subtraction.
  • the products of the second PCR are cloned into the vector pT-Adv (Clontech) and into TOP10F '(Clontech) chemocompetent E. coli transformed.
  • the products of the second PCR are cloned into the plasmid vector pT-Adv (Clontech).
  • This vector has protruding dT residues at the 5 'ends which are compatible with the 3' dA residues e.g. attached to PCR products by Taq DNA polymerase.
  • This or comparable systems allow the direct cloning of PCR products with high efficiency.
  • the transformation takes place in chemocompetent E. col i TOP10F '(Clontech) as described in the literature (Sambrook et al., 1989).
  • Clones from the subtractive cDNA library are expressed by differential hybridization with respect to their expression BMEC vs. AOEC verified.
  • the PCR-Select Differential Screening Kit (Clontech) is used for this.
  • the reverse subtracted probe was produced using the PCR-Select cDNA subtraction kit from Clontech according to the manufacturer's instructions as described above, with BMEC as driver and AOEC as tester.
  • liquid cultures of the clones are inoculated in microtiter plates with 96 cavities. These are used as templates for amplifying the insertions with the Primers adapter 1 and 2R used. The rest of the liquid cultures are mixed with glycerin and frozen as a permanent culture. The PCR products are checked by gel electrophoresis. For products that were larger than 200 bp, 1 ⁇ l is spotted on two identical HybondN membranes and fixed on them with UV light.
  • RNA from BMEC and AOEC is used for later verification in Northern blot analyzes or RT-PCR experiments to create expression patterns.
  • PCR products from 92 clones from the subtractive cDNA library and two negative controls from the manufacturer are applied to each filter. In addition to the manufacturer's information, a PCR product of a household gene is spotted, which is in BMEC and
  • AOEC is expressed equally strongly, and as a positive control a PCR product to a BBB marker (apolipoprotein AI), which is more strongly expressed in BMEC than in AOEC.
  • BBB marker apolipoprotein AI
  • the filters are then washed stringently. Standard stringency conditions can be used.
  • the filters are advantageously washed 2 ⁇ 20 min at 68 ° C. up to a stringency of 0.2 ⁇ SSC / 0.5% SDS.
  • the signal intensities are determined by exposing the film to different lengths of time using a phosphoimager (FLA-5000, Fuji). Clones that are about five times stronger Signals shown in BMEC as in AOEC are classified as differentially expressed and processed.
  • Liquid cultures are inoculated from positive clones from the permanent culture and the plasmid DNA is isolated using standard methods (Birnboim and Doly, 1979) using Qiagen columns.
  • the plasmid insertions are sequenced with universal primers and optionally additional gene-specific primers. Databases are obtained with the DNA sequences obtained using the BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) and FASTA algorithms
  • Expression patterns are created from the positive clones of interest in BMEC, AOEC and nine other tissues. This is done by RT-PCR and / or Northern blot analysis. •
  • cDNAs are made from total RNA by random priming. All enzymes used and the random hexa ere come from Invitrogen. For this purpose, 10 ⁇ g total RNA in 40 ⁇ l nuclease-free water are mixed with 5 ⁇ l DNase I 10x buffer and 5 ⁇ l DNase I and incubated at 25 ° C. for 15 minutes. 5 ⁇ l of 25 M EDTA are then added and the enzyme is heat-deactivated at 65 ° C. for 15 minutes. 25 ⁇ l are removed from the batch, made up to 100 ⁇ l with nuclease-free water and stored at -80 ° C. as an RT control.
  • the enzyme is then heat deactivated at 70 ° C. for 15 minutes.
  • 3 ⁇ l RNase H are added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
  • make up to 100 ⁇ l with nuclease-free water and store the cDNA at -80 ° C.
  • the quality of the cDNAs is checked by PCR with primers for a household gene (GAPDH) or for the 18S rRNA. It is to be expected here that comparable product quantities with the cDNAs arise from the different tissues or cells.
  • the cDNAs produced in this way are each used to create expression patterns for the transcripts to be examined.
  • RNA from the cells or tissues in denaturing gels is separated according to size, transferred to a nylon membrane and hybridized there with radioactively labeled, gene-specific probes. 6.0 g of agarose is heated in
  • RNA in 10 ⁇ l are denatured with 40 ⁇ l sample buffer (500 ⁇ l deionized formamide, 160 ⁇ l formaldehyde, 100 ⁇ l lOx MOPS, 240 ⁇ l DEPC-treated water) for 15 minutes at 65 ° C and then transferred to ice leads.
  • sample buffer 500 ⁇ l deionized formamide, 160 ⁇ l formaldehyde, 100 ⁇ l lOx MOPS, 240 ⁇ l DEPC-treated water
  • 10 ⁇ l loading buffer 500 ⁇ l glycerol, 2 ⁇ l 500 mM EDTA, 25 ⁇ l 10% bromophenol blue, 473 ⁇ l DEPC-treated water
  • the electrophoresis is carried out at 250 V for 3-4 hours. Then the gel is first swirled in water for 10 minutes, then in lOx SSC for 30 minutes. A Hybond XL filter cut to gel size is swirled in 10X SSC for 15 minutes.
  • Hybond XL filter washed in 2x SSC for 10 minutes.
  • the RNA is now fixed in a UV crosslinker at 70,000 ⁇ J / cm 2 on the Hybond filter.
  • the filter is then stained for 1 minute in staining solution (300 mg methylene blue in 1 L 0.3 M Na acetate) to make the RNA visible and then washed with water for 2 minutes to decolorize the background.
  • the colored filters are documented photographically.
  • the filter is then dried between 3MM paper, wrapped in Saran wrap and stored at -20 ° C.
  • the hybridizations are carried out using radioactively labeled cDNA probes (Rediprime II, Amersham), which were purified using ProbeQuant G-50 columns (Amersham), using ExpressHyb solution (Clontech) according to the manufacturer's instructions. After a first check of the hybridization using the FLA-5000 phosphoimager (Fuji), autoradiograms are made on Biomax MS films (Kodak).
  • the complete cDNA sequences of the BHS-specific clones of interest from the subtractive cDNA bank are determined by screening various cDNA banks and RACE-PCR experiments.
  • a cDNA bank is created from BMEC from Schwein with the SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech) in the vector ⁇ TriplEx2 according to the manufacturer's instructions.
  • total RNA is first isolated with Trizol (Invitrogen) as described above, and polyA + RNA is enriched therefrom using Dynabeads (Dynal). 2 ⁇ g of polyA + -RN ⁇ from BMEC are used to manufacture the bank.
  • the ligations are packaged in vitro with the Gigapack III Gold phage extract (Stratagene) according to the manufacturer's instructions.
  • the number of independent phages from the BMEC cDNA library is 1.3 million pfu, more than 99% of which were recombinant when a blue / white test was carried out (cf. Sambrook et al., 1989). At least half of the inserts have a size of more than 1 kb.
  • the titer is approx. 2 x 10 10 pfu / ml with a total volume of approx. 150 ml. This phage lysate is reduced to 7
  • v / v% DMSO adjusted and stored at -80 ° C.
  • the phage bank described is converted into a plasmid bank according to the manufacturer's instructions (Clontech ClonCapture cDNA Selection Kit) by infecting E. coli BM25.8 with 2 million pfu of the phage bank. This bacterial strain expresses Cre-
  • Recombinase which recognizes the loxP sites in the vector ⁇ TriplEx2 and thus enables the conversion.
  • the conversion of the lamda phages into plasmids takes place by in vivo excision and subsequent circularization of the complete plasmid.
  • the plasmids obtained are then stable in E. coli passed.
  • the plasmid preparation is carried out from plate cultures of infected BM25.8 with the NucleoBond Plasmid Kit (Clontech).
  • Biotinylated cDNA probes are used to screen cDNA plasmid banks with ClonCapture. In a RecA-mediated reaction, these form DNA triplex structures with homologous sequences of the plasmid insertions. The so select Plasmids can be isolated via streptavidin coupled to magnetic beads and used in a transformation. Clones from such an enrichment are then screened by colony hybridization, and the plasmid DNA is isolated and sequenced from the resulting positive clones.
  • the magnetic spheres in the magnet are separated and the supernatant is again quantified using the Geiger counter (post-incubation signal). If biotinylation is successful, the pre-incubation signal is 2-4 times stronger than the post-incubation signal.
  • the clones thus obtained are by colony PCR further verified, using a primer from the amplicon mentioned and a further primer located downstream. Avoid choosing both primers from the amplicon that was used as a probe for ClonCapture to use in colony PCR [a PCR approach is performed in which bacteria from a single colony are placed instead of DNA] to avoid that the product formation does not take place on the plasmids contained in the bacteria, but rather by means of a contaminating probe. Therefore, at least 1 primer should be outside the amplicon, ideally 3 'to it, since this sequence is both known and is contained in all positive clones of the cDNA library.
  • the plasmid DNA was isolated from positive clones by standard methods (Birnboim and Doly, 1979) using Qiagen columns and sequenced using the chain termination method (Sanger et al., 1977).
  • the "ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Version 2.0" (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions can be used for sequencing.
  • the products of the sequencing reactions are analyzed on the "ABI Prism 310 Genetic Analyzer” (Applied Biosystems).
  • RACE-PCR (Froh an et al., 1988) is used to determine unknown cDNA sequences from a known sequence section by cDNA synthesis, followed by the introduction of known, synthetic ends for attachment of the second PCR primer.
  • the 5 'RACE-PCR is carried out with the 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • a cDNA first-strand synthesis with a gene-specific primer (GSP1) and 1 ⁇ g total RNA from BMEC takes place.
  • GSP1 gene-specific primer
  • 1 ⁇ g total RNA from BMEC takes place.
  • the first PCR is carried out on 5 ⁇ l of thawed cDNA with a further gene-specific primer (GSP2) and the abridged anchor primer, which attaches to the oligo-dC tail.
  • GSP2 gene-specific primer
  • the specificity of the PCR was increased with the help of a second, nested PCR, which is carried out with the abridged universal amplification primer and a third gene-specific primer (GSP3) on 5 ⁇ l 1: 100 diluted PCR product from the first PCR.
  • GSP3 gene-specific primer
  • the product of the second PCR may be cloned, for which purpose a ligation with the pGEM-Teasy System II (Promega) and transformation into electrocompetent DH5 ⁇ is carried out.
  • the clones obtained are examined using colony PCR, the plasmid DNA is prepared and finally sequenced in a manner known per se.
  • the 3 'RACE-PCR can be carried out with the 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • the cDNA first strand synthesis is carried out on 5 ⁇ g total RNA from BMEC using the Oligo-dT adapter primer.
  • 2 ⁇ l cDNA with a gene-specific primer (GSP1) and the abridged universal amplification primer are used.
  • a semi-nested second PCR is carried out as described for 5'RACE with a gene-specific primer (GSP2) and the abridged universal amplification primer including the controls. The products are cloned and sequenced as described.
  • BHS-specific proteins or fragments thereof can be specifically identified in brain capillary endothelial cells.
  • process steps can be varied:
  • Isolated BMECs can be sown and a primary culture can be used as a "tester" for the subtraction instead of the fresh BMECs.
  • Another subtraction tissue e.g. dedifferentiated BMEC from the culture (min. passage 2) can be selected.
  • RNA or mRNA can be prepared by any other method known to a person skilled in the art, with the proviso that the RNA is intact or the mRNA can be transcribed into cDNA by reverse transcription.
  • the PCR products from the subtraction can be cloned into any suitable vector system, both via polyerase-related 3 'dA residues, as well as over blunt ends or after restriction.
  • the transformation can be in different E. coli strains occur in both chemically and electro-competent cells, as is well known in the art.
  • the differential hybridization step is optional, but recommended.
  • Other suitable membranes for example positively charged or uncharged nylon membranes
  • Expression patterns can also be determined by quantitative PCR (real-time PCR) with the corresponding cDNAs. The quantitative PCR is expediently carried out using the Opticon (MJ Research). The "QuantiTect SYBR Green PCR Kit" from Qiagen is used to carry out the reaction, PCR conditions being used as described above.
  • BMEC cDNA A series of dilutions is made from BMEC cDNA for quantification, the information is given in picograms of RNA equivalents In the relative quantification, the calculated amounts of target are divided by the calculated amounts of 18S rRNA, then a sample, eg BMEC, is set as 100% and all other samples are related to it.
  • the cDNAs can also be produced using other systems.
  • Northern blot analyzes can also be carried out with other suitable probes and hybridization / washing solutions.
  • cDNAs can also be expanded through database mining with the help of known, overlapping sequences. Any other cDNA banks from cells or tissues in which the searched transcript is found can also be experimentally screened with various systems or RNA from cells or tissues in which the searched transcript occurs can be used in RACE-PCR (see Sambrock, 1989). Any other suitable systems known to a person skilled in the art can be used for RACE-PCRs.
  • the proteins or fragments identified by this method have a specificity for the blood-brain barrier and are also the subject of the present invention. Knowing the specificity of a protein or fragment thereof for the The blood-brain barrier now allows the protein to be found in a targeted manner. As a rule, the function is determined by comparison with known sequence data in available databases, for example using the BLAST algorithm. Knowing the specificity of the identified proteins also allows a targeted modulation of their expression in the blood-brain barrier, whereby pathological conditions can be treated in a targeted manner.
  • agonists or antagonists can be developed to the respective BBB-specific proteins that selectively modulate their activity.
  • the expression of such proteins can also be modulated directly, e.g. by gene transfer or anti-sense RNA.
  • the development of "Trojan horses” is particularly attractive for therapeutic approaches - drugs that are linked to molecules that are actively transported by identified transporters via the BBB.
  • So-called pro drugs substances that are derived from BBB-specific enzymes in the endothelial cells, are also possible be modified and thus achieve their therapeutic effect.
  • BHS-specific proteins perform a variety of functions. For example, they serve to supply nutrients (example glucose transporter GLUT1) or serve as contact proteins (e.g. ZO-1 as a tight junction protein). They also have enzymatic activity (e.g. glutamyl transpeptidase GGT) or act as a transport vehicle for amino acids.
  • the expression behavior of the BBB-specific proteins identified according to the invention in the case of ischemia was examined.
  • the prepared endothelial cells were resuspended after washing and, as in Franke et al. (2000) described in cell culture bottles coated with collagen.
  • the cells were cultivated at 37 ° C. in CO 2 incubators with a constant CO 2 content of 5%. After the cells had reached confluence, they were detached by treatment with trypsin solution and split into prepared transwell dishes (44 cm 2 , Corning). After culturing the cells for 3 days under the conditions already described, the Transwell batch was converted into a dish, on the bottom of which C6-glioma cells (commercially available, for example obtainable from the ATCC) had grown.
  • the two cell types were cultivated for two days in coculture with the addition of hydrocortisone.
  • a medium change was carried out for the experiment for expression under ischemia.
  • the new medium was previously gassed with 0.2% 0 2 , 94.2% N 2 and 5% CO 2 and contained no glucose.
  • the cells were then stored for 24 h at 37 ° C. in CO 2 incubators with 0.2% 0 2 , 94.2% N 2 and 5% CO 2 .
  • a medium change was also carried out during the control.
  • the medium was previously gassed with 21% 0 2 , 74% N 2 and 5% CO 2 and contained glucose.
  • the cells were further cultured for 24 hours under these conditions.
  • the expression of the respective protein was then determined quantitatively, as described above.
  • BMEC freshly isolated and purified from the brain of pigs as described above were cultured in M199 medium (Sigma) with 10 (v / v)% ox serum (PAA) on collagen G (biochrom) and passaged by trypsinization.
  • Total RNA was isolated from cultured BMEC from the primary culture (PO) and from passages 1-3 (PI-3) from a T75 cell culture bottle as described above. This became like already described cDNA produced and examined for their quality. Expression patterns were created with the respective gene-specific primers comparing fresh BMEC and PO-3, each with reference to GAPDH or 18S rRNA. The clones described in this and the following examples were obtained.
  • the subtractive clone S129 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and was therefore selected for sequencing.
  • the sequence of clone S129 is given as SEQ ID N0: 1.
  • the semi-quantitative expression pattern shows that Itm2A is more strongly expressed in BMEC than in AOEC and thus confirms the result of the differential hybridization.
  • the expression in BMEC is also significantly stronger than in Cortex (brain), which is an indication of the specificity for BMEC in the brain.
  • a strong expression can only be seen in the heart, which can possibly be correlated with the expression described in muscle.
  • the expression pattern was verified by Northern blot analysis, the coding region of Itm2A from pig (FIG. 1a) being used as the probe. The specificity for BMEC becomes even clearer in the Northern blot. This expression in BMEC and thus at the BHS has not yet been described.
  • a second, smaller transcript in BMEC can be seen in the Northern blot.
  • the coding region, as well as 5 'and 3' non-coding region were examined with RT-PCR or RACE-PCR in BMEC. It was found that there are two 3 'non-coding regions for Itm2A, the shorter of which results from an alternative polyadenylation signal, as was shown by sequencing. This was also not previously described for Itm2A. Probably two different 3 'regions regulate the transcript frequency via different stabilities and thus also the amount of protein.
  • the experiments described also provided the complete cDNA sequence (complete CDS 119-910) for Itm2A from porcine (SEQ ID NO 4 + SEQ ID NO 5).
  • the expression of the Itm2A / S129 target under ischemic conditions was examined according to the general experimental protocol given above. It was shown that the target S129 in BMEC under ischemia is greatly reduced in expression. This suggests that Itm2A is involved in diseases that are associated with ischemic conditions, such as stroke, heart attack and tumor-associated conditions, such as those that occur with a glioblastoma. The expression pattern found proves on the one hand the usability of the target as a diagnostic marker for these diseases, and on the other hand the therapeutic usability of the target for the causal treatment of the above-mentioned diseases. The expression pattern of Itm2A in BMEC under ischemia compared to a control set up as 100% is shown in FIG. 1b.
  • BMEC were once under ischemia conditions as described in the method section ("Ischemia") and cultivated once under normal conditions ("control”). The expression of targets in both samples was then measured relative to the 18S rRNA. The value obtained was set as 100% for the control and the ischemia sample related to it.
  • Itm2A is also responsible for the special differentiation state of endothelial cells at the BBB. Since Itm2A has been shown to be located in certain states of cells in the plasma membrane, it appears to be a receptor here by possibly forming homo- or hetero-multimers. The extracellular part of such a receptor would bind secreted molecules or surface molecules of other cells, the intracellular part of the receptor complex could in such a model - e.g. by changing the conformation due to the binding - forwarding signals that trigger a response of the cell within signal cascades and thus change its properties.
  • Itm2A was first developed in a differential screen of a cDNA bank from condyles (condyle) from mouse by Delersnijder et al. (1996) found.
  • the encoded protein consists of 263 amino acids and is an integral membrane protein of the type II. It has a potential glycosylation site and a possible leucine zipper.
  • the gene which consists of six exons, is most strongly expressed in bone-forming tissues and is a marker for the differentiation of cartilage / bone.
  • Itm2A is a member of a new gene family consisting of three members. The individual members of the family are highly conserved between humans and mice. Conservation among the individual members is only approx. 40%, with the C-terminus in particular being conserved, but not the N-terminus.
  • the leucine zipper motif can only be found at Itm2A, otherwise the family proteins do not contain any known sequence motifs.
  • the subtractive clone S231 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and was therefore selected for sequencing.
  • the sequence of clone S231 is given as SEQ ID NO: 6. In BLAST homology searches, sequence S231 showed the highest homology to EMP1.
  • This semi-quantitative expression pattern shows that S231 is more strongly expressed in BMEC than in AOEC and thus confirms the result of the differential hybridization.
  • the expression in BMEC is also significantly stronger than in Cortex (brain), which is an indication of the specificity for BMEC in the brain.
  • a strong expression can only be seen in the heart, but only weakly in the lungs, colon or brain, although strong expression for these tissues is described in the literature (brain only for rats). This raises the question of whether S231 is really porcine EMP1 or is another member of this gene family.
  • cDNA bank ( ⁇ TriplEx2) from BMEC was screened with S231 as a probe (radioactively marked, standard method).
  • S231 radioactively marked, standard method.
  • Several clones were isolated, of which the two largest clones were each 5 'sequenced. Both sequences again showed the greatest homologies to EMP1, the overlaps each being in the 3 'non-coding area.
  • the product obtained (ssEMPl) was cloned and sequenced.
  • ssEMPl .1 / ssEMPl An expression pattern was created as described above (see FIG.
  • S231 from pigs has different transcript sizes than EMP1 from humans and mice and that the expression pattern continues to some extent. deviates significantly from the literature data on EMP1 from different species. These deviations at the transcript level show that the clone S231 described here does not represent EMPl, but is another member of this gene family as S231. There may be only one EMPL gene in humans that is regulated by two promoters, and in pigs this task is performed by two separate genes - EMPl and S231.
  • the expression pattern in cultured BMEC was examined in comparison to known BBB markers or GAPDH as described in Example 1 (cf. FIG. 8). These data show a rapid decrease in the expression of S231, as is also described for known BBB markers. However, a household gene like GAPDH shows no regulation.
  • S231 is responsible for the special differentiation state of endothelial cells at the BBB and may represent a cell adhesion molecule or a channel (membrane domain most conserved).
  • S231 is responsible for the special differentiation state of endothelial cells at the BBB and may represent a cell adhesion molecule or a channel (membrane domain most conserved).
  • the subtractive clone S012 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and thus selected for sequencing.
  • the sequence of clone S012 is listed in SEQ ID NO 15. Using this sequence, S012 was clearly assigned to the human hypothetical protein FLJ13448.
  • S012 is homologous to the human hypothetical protein FLJ13448 and the corresponding homologue from mouse (XM_129724). A homology comparison of human, murine and procine FLJ13448 / S012 is shown in FIG. 10. The peptides that serve as signal peptides and are split off are each printed in italics.
  • the low conservation of the N-terminal 60 amino acids and the high homology of the C-terminus are striking.
  • the N-terminus is probably a signal peptide that is responsible for the correct localization of the protein in the cell.
  • Bioinformatics studies show mitochondrial localization of the protein in the cell.
  • the function of the protein can be assigned to the highly conserved C-terminus.
  • the expression pattern in cultured BMEC was examined in comparison to known BBB markers or GAPDH as described in Example 1 (cf. FIG. 11).
  • the sample material was prepared as described above under the section “Identification of BBB-Specific Proteins by Differential 2D Gel Electrophoresis”.
  • the differential spot . 1.1.0.1.10.37 showed the following peptide masses in the MALDI-TOF analysis: 861,499; 878.47; 975.50; 1,056.61; 1,132.53; 1,198.71; 1,216.71; 1,227.53; 1,347.69; 1,430.76; 1,438.69; 1,516.71; 1,623.79; 1,790.87; 1,796.81; 1,935.93; 1,954.05; 2,081.02; 2,231.07; 2,375.08; 2,577.09; 2613.1.
  • Spot 1.1.0.1.10.37 was identified as NSE2 by the database queries with Profound in the NCBI database.
  • the human NSE2 has a calculated molecular weight of 34.5 kDa and a pI value of 5.4, both of which agree very well with the observed position of the spot 1.1.0.1.10.37 in the 2D gel.
  • the fat-highlighted, underlined peptide masses could be assigned as identical to the human sequence. In Fig. 12 the coverage of the peptide masses on the human protein sequence is shown.
  • FIG. 14 shows a homology comparison of human NSE2 and NSE1.
  • PEST domains are regions rich in Pro, Glu, Ser and Thr in proteins that are responsible for a short half-life of such proteins in the cell by controlling the ubiquitination of these proteins.
  • Phosphorilation of certain Ser or Thr residues in the PEST regions are important for the detection of processing by the ubiquitin proteasome pathway.
  • Position 81-163 in human NSE2 shows homologies to the NLP / P60 family (pfam domain 00877.4), which was found in several lipoproteins but was not assigned a function.
  • NSE2 This target was also examined under ischemic conditions. It shows that the expression of NSE2 is reduced in BMEC under ischemia (cf. FIG. 17). This suggests NSE2 involvement in diseases associated with ischemic conditions such as stroke, heart attack and tumor associated conditions such as glioblastoma. The expression pattern of NSE2 can thus be used as a diagnostic marker for such diseases. A causal therapy can also start with the modulation of the expression of NSE2.
  • the sample material was prepared as described above under the section “Identification of BBB-Specific Proteins by Differential 2D Gel Electrophoresis”.
  • the differential spot 1.1.0.1.11.12 showed the following peptide masses in the MALDI-TOF analysis: 789.45; 880.47; 890.50; 948.49; 1,204.68; 1,217.64; 1,289.58; 1,428.70; 1,517.79; 1,573.73; 1,753.91; 2,017.08.
  • the database queries with Profound in the NCBI database identified Spot 1.1.0.1.11.12 as a hypothetical protein with the accession number CAB66619.
  • the identical protein is also referred to as dopamine-responsive protein DRG-1, as LYST-interacting protein LIP5 and as HSPC228.
  • CAB66619 / DRG-1 has a calculated molecular weight of 33.8 kDa and a pI value of 6.1, both of which correspond very well with the observed position of the spot 1.1.0.1.11.12 in the 2D gel.
  • the fat-labeled peptide masses could be assigned as identical to the human sequence. 18 shows the coverage of the peptide masses on the human protein sequence.
  • Bioinformatic approaches show a transmembrane domain and suggest that the N-terminus is located intracellularly.
  • the intracellular domain shows a conserved phosphorilization site, extracellularly a glycosylation site is predicted in the human sequence (cf. FIG. 19).
  • the difference found in the 2D gel must therefore be due to a specific post-translational modification of DRG-1 in BMEC. Such a difference can occur, for example, due to the predicted phosphorilation site. Cell-specific phosphorilations can thus determine the activity of the protein.
  • SEQ ID NO 26 + 27 show the partial cDNA sequence of DRG-1 from porcine (CDS1-585, internal section).
  • the sample material was prepared as described above under the section “Identification of BBB-Specific Proteins by Differential 2D Gel Electrophoresis”.
  • the differential spot 1.1.0.1.6.30 resulted in the following peptide masses in the MALDI-TOF analysis: 776.44; 847.47; 900.50; 916.46; 976.52; 1,048.58; 1,085.61; 1,127.66; 1,137.55; 1,167.67; 1,180.68; 1,212.69; 1,234.69; 1,291.67; 1,301.67; 1,303.69; 1,338.72; 1350.70 1370.65; 1,419.70; 1,423.77; 1,434.79; 1,440.79; 1,456.76; 1466.76 1467.71; 1,483.77; 1,547.78; 1,558.85; 1,665.90; 1,714.96; 1,716.90 1740, 80; 1762, 90; 1838, 92; 1897, 99; 2025, 11; 2054, 06; 2234, 15; 2243, 20; 2244, 18th
  • the database contains 3 isoforms of TKA-1, which have the following calculated masses and pl values: CAA90511 with 49.3 kDa / pl 6.7, BAA33216 with 37.4 kDa / pl 7.9,
  • TKA-1 has two PDZ domains that mediate protein-protein interactions. There are several potential phosphorilization sites in these PDZ domains, which may regulate the interactions with other proteins. A potential N-glycosylation site is also preserved.
  • the Northern blot shows that TKA-1 expresses the most in BMEC, t is and that three different transcripts occur in BMEC. The expression is comparatively strong in the lungs, but the small transcript is completely missing here. So far, no connection between TKA-1 and the BBB and also not with endothelial cells has been described in the literature.
  • TKA-1 was also examined with regard to its expression under ischemia in accordance with the instructions given above. It is shown that this target in BMEC is strongly reduced in expression under ischemia. This suggests a functional involvement of TKA-1 in diseases that are associated with ischemic conditions, such as stroke, heart attack and tumor-associated conditions, for example in glioblastoma. The study of the expression of TKA-1 can therefore be used as a diagnostic marker for such diseases.
  • the TKA-1 target is also a suitable starting point for causal therapies against the abovementioned diseases.
  • TKA-1 TKA-1 in BMEC under ischemia compared to a control is shown in Figure 25.
  • BMEC were cultivated as described in the method section once under ischemia conditions ("ischemia") and once under normal conditions ("control").
  • the expression of targets in both samples was then measured relative to the 18S rRNA. The value obtained was set as 100% for the control and the ischemia sample related to it.
  • SEQ ID NO 32 and SEQ ID NO 33 show the partial cDNA
  • the subtractive clone S064 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and was therefore selected for sequencing.
  • the sequence of clone S064 is listed as SEQ ID NO 35. Based on this sequence, S064 could not be assigned to any known gene.
  • BLAST searches revealed a significant homology to the DKFZ cDNA clone p43401317, which apparently does not contain a coding region.
  • a cDNA library from porcine BMEC was screened with the subtractive clone S064. Two independent clones were identified.
  • the sequence of the longest clone S064.3 is as SEQ ID NO 36 listed. This sequence could also not be assigned to any known gene by BLAST searches.
  • sequence of clone S064.3 could be localized in the 10pl2 region by homology comparisons in the human genome.
  • the next gene in the same orientation on this locus is ADP-ribosylation-like factor 8 (ARL8).
  • a link-PCR was carried out to check whether S064 represents a new 3 'end of ARL8.
  • the primers hsARL ⁇ .sl (5 'TAA TGC AGG GAA AAC CAC CAT TCT 3', SEQ ID NO 37) and S064.3R (5 'AAC CAA GAG ACA TGT TGG CAC T 3', SEQ ID NO 38) were also used RNA from BMEC used in a OneStep RT-PCR.
  • the product was diluted 1: 1000 from the OneStep RT-PCR and into a nested PCR with the primers hsARL8.
  • s2 (5 'ATA GCA TTG ACA GGG AAC GAC T 3', SEQ ID NO 39) and S064.GSP2 (5 'CTG CTA GAT TCA AGT CAT CAT GC 3', SEQ ID NO 40).
  • the product obtained was cloned and sequenced. The sequence obtained clearly confirmed that the subtractive clone S064 represents the ARL8 gene.
  • the complete coding cDNA sequence of ARL8 was determined using OneStep RT-PCR with RNA from BMEC and the primers S064cds.sl (5 'CTC GTG ATG GGG CTG ATC TTC 3', SEQ ID NO 41) and S064cds.asl (5 'ATC TCA CAC CAA TCC GGG AGG T 3', SEQ ID NO 42) received.
  • the coding sequence ARL8 from porcine is given as SEQ ID NO 43, the protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO 44.
  • the ARL8 protein is 100% identical to human and mouse ARL8. This high degree of conservation speaks for the important role of this protein.
  • the cDNA sequence of ARL8 (porcine) has 95% and 92% homology in the coding region to the corresponding sequence from human or mouse.
  • an expression pattern for S064 with the primers S064.sl (5 'AAG CCT GAA GCT TGA TGG ATA A 3', SEQ ID NO 45) and S064.asl (5 'CAA TTA CAG CTT TGC TCC TGT G 3' , SEQ ID NO 46), 18 ⁇ rRNA was used as reference.
  • the two primers S064cds. sl / asl were derived from the human sequence due to the high homology between humans and pigs (eg the product of the link-PCR).
  • Primer S064cds.sl contains the ATG start codon in position 7-9 and position 22 in primer S064cds.asl provides the first base of the stop codon.
  • the expression pattern is shown in FIG.
  • ARL ⁇ cds.sl (5 'ATA GCA TTG ACA GGG AAC GAC T 3', SEQ ID NO 47) and ARL ⁇ cds.asl (5 'GAA CTG AGG GTG AGG TAT TTG G 3 ', SEQ ID NO 48).
  • the expression pattern is shown in Figure 28.
  • ARL8 belongs to the RAS superfamily of regulatory GTPases. These are involved in a variety of processes, such as Cell growth, signal transduction, organization of the cytoskeleton and regulation of membrane trafficking (exo- or endocytosis). ARL8 was first developed by Sebald et al. Described in 2003, but these were unable to show expression in the adult brain. The present example shows for the first time the actual expression of ARL8 at the BHS. This confirms the high BBB specificity of this protein. This means that ARL8 is responsible for the special state of differentiation of endothelial cells at the BBB and thus contributes to the functionality of the BBB.
  • the subtractive clone 5G9 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and was therefore selected for sequencing.
  • the sequence of clone 5G9 is listed as SEQ ID NO 49.
  • 5G9 could be assigned to a human transcript (No. BC039195, NCBI database) which codes for a new protein HSNOV1 (AAH39195).
  • AAH39195 a new protein HSNOV1
  • this database entry which describes an mRNA molecule, the open reading frame and the resulting hypothetical protein are given as annotation. This is not experimental data, but computer-based predictions. The derived protein showed no similarities to known proteins and was therefore called novel protein.
  • 18S rRNA was used as reference.
  • the primer pair for determining the expression pattern was derived according to the general rules: melting temperature of the primers from 55-75 ° C; approximately the same melting temperature of the two primers; 18-26 base length; optimal 40-60% GC content; Avoiding hairpins loops; Avoidance of homo- and heterodimer formation; Product size 100-300 bp.
  • the expression pattern is shown in Figure 31.
  • the expression pattern shows that 5G9 is mainly formed on the BBB, in the colon and in the kidney. Expression in the brain appears to be specific for BMEC. This expression in BMEC or at the BHS has not yet been described.
  • HSNOV1 The homology between HSNOV1 and PNOV1 is 94%. It is striking, however, that PNOV1 is N-terminally shortened by 47 amino acids compared to HSNOV1. In HSNOV1, this sequence may represent a signal sequence that will later be split off.
  • the HSNOV1 protein shows no significant homologies to other known proteins.
  • Bioinformatic analyzes show 8 potential transmembrane domains (see FIG. 33).
  • the subtractive clone 5E7 showed a> 5 times stronger signal in the differential screen with the forward probe compared to the reverse probe and was therefore selected for sequencing.
  • the sequence of clone 5E7 is listed as SEQ ID NO 54. Using this sequence, 5E7 was clearly identified as a transforming growth factor beta-stimulated protein TSC-22.
  • Clone 5E7 represents the 3 'end of the TSC-22 transcript.
  • a 5' RACE-PCR was carried out. The product of this PCR was cloned and sequenced.
  • the complete cDNA sequence of porcine TSC-22 is listed as SEQ ID NO 55, the coding region here is from position 243-677.
  • the corresponding protein is listed as SEQ ID NO 56.
  • the porcine protein is 100% identical to the already known human protein TSC-22, which speaks for the special importance of this protein.
  • an expression pattern for 5E7 was created by Northern blot analysis, the subtractive clone 5E7 serving as the probe (cf. FIG. 34).
  • the experiment shows the stronger expression of TSC-22 in BMEC compared to the whole brain and thus shows the specificity for the blood-brain barrier.
  • This expression in BMEC or at the BHS has not yet been described.
  • the expression pattern in cultured BMEC was examined in comparison to known BBB markers or 18S rRNA.
  • the primers 5E7.1 (5 'AAG AGG TGT GGC TTG TCT TTT A 3', SEQ ID NO 57) and 5E7 were used for the quantitative PCR.
  • IR 5 'TTT TTC AAA GTA TTC AAC CAG CTC 3', SEQ ID NO 58 used. The result is shown in FIG. 35.
  • the data show a rapid decrease in the expression of TSC-22 in cultivated BMEC and thus clearly indicate a role of TSC-22 in the BHS.
  • the strong decrease in expression in cultured BMEC suggests that TSC-22 is related to the differentiation state of the cells.
  • TSC-22 is greatly reduced in expression in BMEC under ischemia.
  • TSC-22 is also strongly expressed in the heart, see Fig. 34
  • the study of the expression of TSC-22 can therefore also be used as a diagnostic marker for these diseases. Based on these findings, therapy concepts for diseases associated with a dysfunction of the BBB can be developed.
  • TSC-22 belongs to the class of leucine zipper transcription factors (Kester et al., 1999). It is involved in the signal transduction of TGF-beta and others (Kawamata et al., 1998) and thus plays a role in cell growth and differentiation. It follows that TSC-22 is also responsible for the differentiation state of BMEC.
  • Kester, HA, Blanchelot, C den Hertog, J., van der Saag, PT, and van der Burg, B. (1999): “Transforming growth factor-ß-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and heterodimerize and has transcriptional repressor activity ", J. Biol. Chem. 274: 27439-27447. Li, JY, Boado, RJ, and Pardridge, WM (2001): "Blood-brain barrier genomics", J. Cereb. Blood Flow Metabol. 21, 61-68.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS-spezifischen Proteins/Fragments in Hirnkapillar-Endothelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) frisch aus dem Gehirn isolierte Hirnkapillar-Endothelzellen durch enzymatischen Aufschluss in üblicher Weise vorreinigt, b) den in Stufe a) erhaltenen Aufschluss mit einem Lysepuffer behandelt, der vorhandene Erythrozyten und apoptotische Zellen im Wesentlichen zerstört und wenigstens 70 % der Hirnkapillar-Endothelzellen in vitaler Form erhält, c) gegebenenfalls das in Stufe b) erhaltene Produkt weiter aufreinigt, d) eine subtraktive cDNA-Bank aus den Hirnkapillar-Endothelzellen und einem Subtraktionsgewebe herstellt, e) eine cDNA-Subtraktion mittels differentieller Hybridisierung(en) durchführt, f) Klone aus der subtraktiven cDNA-Bank durch differentielle Hybridisierung hinsichtlich ihrer jeweiligen Expression verifiziert, g) zu den BHS-spezifischen Klonen aus der subtraktiven cDNA-Bank eine vollständige cDNA-Sequenz erstellt und h) das Expressionsmuster der untersuchten Klone zwischen frischen und kultivierten Hirnkapillar-Endothelzellen vergleicht und so die Anwesenheit BHS-spezifischer Proteine/Fragmente identifiziert sowie die mit diesem Verfahren identifizierten Proteine und Fragmente davon.

Description

Verfahren zur Identifizierung BHS-spezifischer Proteine und
Fragmente davon
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS-spezifischen Proteins oder Fragments davon in Hirnkapillar-Endothelzellen sowie die mit diesem Verfahren erhaltenen Proteine oder Fragmente davon (BHS = Blut-Hirn-Schranke) . Ferner betrifft die Erfindung auch die mit diesem Verfahren erhaltenen Gene bzw. Transkripte.
Die Endothelzellen von cerebralen Kapillaren bilden eine selektive Permeabilitätsbarriere zwischen dem Blut und dem Gehirn eines Organismus, die so genannte Blut-Hirn-Schranke (BHS) . Innerhalb der Kapillaren sind einzelne Endothelzellen um das Lumen herum angeordnet und bilden einen zylindrischen, röhrenförmigen Hohlraum. Enge Verbindungen zwischen den einzelnen Endothelzellen und mit den Endothelzellen assoziierten anderen Zelltypen verhindern den unkontrollierten passiven Durchtritt einer Vielzahl von Substanzen durch diese Zellschicht .
Zur Aufrechterhaltung seiner Funktion ist das Gehirn in hohem Maße auf ein konstantes inneres Milieu angewiesen, das durch die Blut-Hirn-Schranke gewährleistet wird. Diese reguliert auch den Stoffaustausch zwischen Blut und Gehirn. Spezifische Transportsysteme vermitteln diesen Austausch. Die Ausbildung dieser Barriere in den Endothelzellen der Hirnkapillaren (brain microvessel endothelial cells, BMEC) ist in der Expression spezifischer Proteine in diesem hochdifferenzierten Zelltyp im Vergleich zu anderen Endothelzellen begründet. Es sind bereits einige für die Blut-Hirn-Schranke spezifische Proteine bekannt, zum Beispiel der Glucosetransporter GLUT-1, der spezifisch für die BMEC ist und die Energieversorgung des Gehirns gewährleistet.
Aufgrund der selektiven Permeabilitätseigenschaften der Blut- Hirn-Schranke ist es schwierig, verschiedene Krankheiten des zentralen Nervensystems zu behandeln, da zahlreiche Arzneimittel die Blut-Hirn-Schranke kaum durchdringen und somit an ihrem Wirkort im Gehirn nur in geringer Konzentration ankommen. Für die Entwicklung von im Gehirn wirkenden Arzneimitteln wäre es daher von großer Bedeutung, die Funktionsweise der Blut-Hirn-Schranke und der daran beteiligten Proteine zu kennen. Insbesondere wäre es von Bedeutung, Kenntnis derjenigen Proteine zu erlangen, die gegenüber anderen Zelltypen in den Hirnkapillar-Endothelzellen in besonders hohem oder beson- ders geringem Maße oder aus bestimmten Spleißvarianten hergestellt werden bzw. spezifische posttranslationale Modifikationen aufweisen.
Die Untersuchung von Hirnkapillar-Endothelzellen ist mit verschiedenen Problemen verbunden. Zum einen steht insbesonde- re zur Untersuchung der Proteinexpression im menschlichen
Gehirn nicht genügend Hirnmaterial zur Verfügung, wobei unter anderem auch ethische Gründe eine Rolle spielen. Ferner sind die einzelnen Individuen, von denen die Hirnmasse abstammt, in der Regel sehr verschieden im Hinblick auf ihre genetische Information. Unterschiede ergeben sich beispielsweise bzgl. Alter, Geschlecht, Gewicht, Rasse etc. Ferner muss das Untersuchungsmaterial innerhalb der ersten Stunden nach Eintritt des Todes entnommen werden, denn nach diesem Zeitraum findet bereits eine erhebliche Veränderung der Proteinzusammensetzung in den Zellen durch enzymatische Ab- und Umbauvorgänge statt. Bisherige Verfahren zur Untersuchung der Proteinexpression in Hirnkapillar-Endothelzellen sind überdies mit dem Problem behaftet, dass das Untersuchungsmaterial nicht in ausreichender Reinheit für direkte Untersuchungen gewonnen werden kann. Bei der Isolierung von Hirnkapillar-Endothelzellen nach dem bekannten Verfahren erhält man üblicherweise ein Gemisch mit anderen Zelltypen, so dass Untersuchungen des Proteinexpressionsmusters an diesen Proben keine ausreichende Zuordnung ausschließlich zu den Hirnkapillar-Endothelzellen erlauben.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem BHS-spezifische Protei- ne oder Fragmente davon eindeutig identifiziert werden können. Das Verfahren soll sich insbesondere zur Identifizierung BHS- spezifischer Proteine bzw. Gene in Hirnkapillar-Endothelzellen eignen. Weiterhin soll das Verfahren einfach und schonend durchführbar sein. Ferner soll das erfindungsgemäße Verfahren selektiv für Proteine oder Fragmente davon sein, die verstärkt oder ausschließlich in Hirnkapillar-Endothelzellen gebildet werden und nicht in einem Vergleichsgewebe bzw. verwandten Zelltyp. Des Weiteren sollen sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Proteine oder Fragemente davon als diagnostische Marker für Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke einher gehen, eignen. Ferner sollen sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Proteine zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke einhergehen, eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS-spezifischen Proteins oder Fragments davon in Hirnkapillar-Endothelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) frisch aus dem Gehirn isolierte Hirnkapillar-Endothelzellen durch enzymatischen Aufschluss in üblicher Weise vorreinigt, b) den in Stufe a) erhaltenen Aufschluss mit einem Lysepuffer behandelt, der vorhandene Erythrozyten und apoptotische Zellen im Wesentlichen zerstört und wenigstens 70% der Hirnkapillar- Endothelzellen in vitaler Form erhält, c) gegebenenfalls das in Stufe b) erhaltene Produkt weiter aufreinigt, d) eine subtraktive cDNA-Bank aus den Hirnkapillar-Endothelzellen und einem Subtraktionsgewebe herstellt, e) eine cDNA-Subtraktion mittels eines oder mehrerer differentieller Hybridisie- rungsschritte durchführt, f) Klone aus der subtraktiven cDNA- Bank durch differentielle Hybridisierung hinsichtlich ihrer jeweiligen Expression verifiziert, g) zu den BHS-spezifischen Klonen aus der subtraktiven cDNA-Bank die cDNA-Sequenz ergänzt und h) das Expressionsmuster der untersuchten Klone zwischen frischen und kultivierten Hirnkapillar-Endothelzellen vergleicht und so die Anwesenheit BHS-spezifischer Proteine oder Fragmente davon identifiziert.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS-spezifischen Proteins oder Fragments davon in Hirnkapillar-Endothelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) frisch aus dem Gehirn isolierte Hirnkapillar-Endothelzellen durch enzymatischen Aufschluss in üblicher Weise vorreinigt, b) den in Stufe a) erhaltenen Aufschluss mit einem Lysepuffer behandelt, der vorhandene Erythrozyten und apoptotische Zellen im Wesentlichen zerstört und wenigstens 70% der Hirnkapillar-Endothelzellen in vitaler Form erhält, c) gegebenenfalls das in Stufe b) erhaltene
Produkt weiter aufreinigt, d) das in Stufe c) erhaltene Produkt in einem geeigneten Puffer solubilisiert, e) eine isoe- lektrische Fokussierung durchführt, f) die Proben aus der isoelektrischen Fokussierung in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht auftrennt, g) differentielle Spots identifiziert und isoliert, h) mit dem Isolat von g) eine mas- senspektrometrische Analyse durchführt, und i) hiervon eine Auswertung mittels gezielter Datenbankanalyse vornimmt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich BHS- spezifische Proteine oder Fragmente davon eindeutig und zuverlässig identifizieren und die Erfindung betrifft auch die mit diesem Verfahren isolierten Proteine sowie die diese Proteine kodierenden Transkripte bzw. Gene. Insbesondere betrifft die Erfindung auch die nach diesem Verfahren isolierten Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 5, 14, 19, 23, 27, 33, 53.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Proteine bzw.
Fragemente davon zur Herstellung von Mitteln oder Medikamenten zur Diagnose oder Therapie von Erkrankungen, die auf einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke beruhen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Kombination der vorstehend genannten Verfahrensschritte die eindeutige Identifizierung BHS-spezifischer Proteine in Hirnkapillar- Endothelzellen erlaubt. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Proteine sind für die BHS spezifisch. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Proteine besitzen aufgrund ihrer Spezifität für die BHS eine Funktion in bzw. an der BHS. Bei dieser Funktion kann es sich beispielsweise um eine Barrierefunktion, eine Transportfunktion, eine Funktion im Zusammenhang mit der NährstoffVersorgung der BHS, eine Funktion als Tight-Junction-Protein, eine enzymatische Aktivi- tat etc. handeln. Somit ist es möglich, ausgehend von der Identifizierung der Anwesenheit dieser Proteine gezielt spezifische Funktionen davon in der BHS abzuleiten. Dies fische Funktionen davon in der BHS abzuleiten. Dies eröffnet die Möglichkeit gänzlich neuer Therapiekonzepte, die darauf beruhen, dass Substanzen gezielt durch die BHS geschleust werden können. Ferner können die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Proteine gezielt Gegenstand therapeutischer Interventionen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt erstmalig die Entwicklung von therapeutischen Konzepten für das Gehirn betreffende Erkrankungen. Weiterhin kann der Nachweis von Veränderungen in den nach dem beschriebenen Verfahren identifizierten Proteinen zur Diagnose von Krankheiten benutzt werden, die auf einer Dysfunktion der BHS basieren.
Von besonderer Bedeutung bei den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung von frisch isolierten BMEC (Primärzellen) anstelle von kultivierten BMEC. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass BMEC in Kultur sehr schnell dedifferenzieren, d.h. ihre BHS-Eigenschaften sehr schnell verlieren. Ferner wurde auch gefunden, dass die Expression der für die Blut- Hirn-Schranke spezifischen Proteine in kultivierten Hirnkapil- lar-Endothelzellen stark herabreguliert ist und nach nur wenigen Passagen völlig verschwindet, wodurch keine zuverlässige Isolierung und Identifizierung BMEC spezifischer Proteine möglich ist. Außerdem müssen reine und vitale Zellen isoliert werden, um Zellspezifität zu gewährleisten und negative oder das Ergebnis verfälschende Effekte durch Apoptose zu verhindern.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Entnahme von Gehirnmaterial aus dem jeweiligen Organismus durch operativen Eingriff in den lebenden Organismus erfolgen. Auf diese Weise können beispielsweise auch Hirnproben vom menschlichen Organismus bei Hirnoperationen erhalten werden. Vorteilhafter ist jedoch die Entnahme des vollständigen Gehirns oder von Teilen davon aus dem Organismus möglichst unmittelbar nach Eintritt des Todes. Bevorzugt wird das Gehirn in einem Zeitraum von höchstens einer Stunde, bevorzugter etwa höchstens 30 Minuten, noch bevorzugter etwa höchstens 15 Minuten oder noch weiter bevorzugter etwa 5 Minuten nach Eintritt des Todes entnommen. Das Gehirn kann beliebigen Lebewesen entnommen werden, beispielsweise dem Menschen, Rindern, Schafen, Ziegen, Pferden etc. Es wurde nun gefunden, dass Schweinehirne ein gutes Modell für das menschliche Gehirn im Hinblick auf die Untersu- chung der Hirnkapillar-Endothelzellen auf BHS-spezifische Proteine sowie der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen darstellen.
Das Schweinehirn ist zum menschlichen Gehirn sowohl bezüglich der Anatomie als auch der Morphologie sehr ähnlich. Ferner sind generell Sequenzhomologien zwischen Mensch und Schwein sowohl auf Protein- als auch auf Nukleinsäureebene sehr hoch, so dass sich an Schweinematerial erhaltene Ergebnisse zuverlässig auf den Menschen übertragen lassen und umgekehrt. Dies ist darin begründet, dass Mensch und Schwein phylogenetisch näher verwandt sind als Mensch und klassische Modellorganismen wie Maus oder Ratte.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein hypotonischer Lysepuffer nicht nur Erythrozyten lysiert, sondern auch allgemein tote und apoptotische Zellen durch hypotonischen Schock platzen lässt. Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Lysepuffer erhält wenigstens 70 %, bevorzugt 80 %, bevorzugter 90 %, noch bevorzugter 95 % der Hirnkapillar- Endothelzellen in vitaler Form. Ferner muss der Lysepuffer ungiftig sein und einen pH-Wert im physiologischen Bereich besitzen. Der erfindungsgemäß verwendete hypotonische Puffer sollte eine Ionenstärke von 0,1-0,2 M besitzen, ein- und zweiwertige Anionen bzw. Kationen enthalten und in einem pH- Bereich von 7,0-8,0 puffern. Alle enthaltenen Substanzen müssen ungiftig für die Zellen sein, so dass gesunde Zellen in dem Puffer für kurze Zeit nicht geschädigt werden. Bevorzugt enthält der hypotonische Puffer mit einer Ionenstärke von 0,1- 0,2 M Natium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-,
Chlorid- und Sulfat-Ionen sowie Glukose und puffert in einem pH-Bereich von 7,0-8,0. Dies erlaubt eine selektive Anreicherung vitaler Hirnkapillar-Endothelzellen aus einem Gemisch von Erythrozyten und anderen Zellen variierender Vitalität. Der erfindungsgemäß verwendete Puffer besitzt bevorzugt die folgende Zusammensetzung bei einem pH-Wert von 7,5:
Bevorzugter besitzt der eingesetzte Lysepuffer die folgende Zusammensetzung:
NaCl 30 mM bis 50 mM
KC1 4,5 mM bis 5,5 mM
NH4C1 80 mM bis 100 mM
MgCl2 0, 6 mM bis 0,8 mM
MgS04 0,3 M bis 0,6 mM NaHC03 4,5 M bis 6,5 mM
NaH2P04 0,2 mM bis 0,45 mM
Na2HP04 0,4 M bis 0,65 mM
KH2P0 0,1 mM bis 0,15 M
Glucose 1,5 mM bis 3,0 mM
Besonders bevorzugt besitzt der Puffer die folgende Zusammensetzung:
NaCl 39 mM
KC1 5,1 mM
NH4C1 88 mM
CaCl2 1, 6 mM
MgCl2 0, 69 mM
MgS04 0,46 mM
NaHC03 5, 6 mM
NaH2P04 0,33 M
Na2HP04 0,53 mM
KH2P04 0,12 mM
Glucose 2,24 mM
Normalerweise werden derartige Lysepuffer zur Isolierung von Lymphozyten bzw. von RNA aus Lymphozyten eingesetzt, indem hierbei zuerst die Erythrozyten lysiert werden. Weder die Zusammensetzung des erfindungsgemäß verwendeten Puffers noch die Anwendung eines derartigen Puffers zur Lyse apoptotischer Zellen wurde bisher beschrieben. Die selektive Lyse apoptotischer Zellen ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von wesentlicher Bedeutung, um BHS- spezifische Transkripte anzureichern ohne dabei gleichzeitig Transkripte von Genen anzureichern, die verstärkt während der Apoptose exprimiert werden. Bei anderen Verfahren zur Isolierung von Zellen wird das Problem der Apoptose dadurch umgangen, indem die isolierten Zellen in Kultur genommen werden. Hirnkapillar-Endothelzellen verändern jedoch in Kultur ihre Eigenschaften, was zu einem veränderten Genexpressionsmuster führt. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zur Zellpräparation durch den abschließenden Lyseschritt erstmalig und gezielt die Isolierung ausreichender Mengen an frischen Hirnkapillar-Endothelzellen.
Nach Entnahme des Gehirns aus dem Organismus wird dieses zweckmäßigerweise in einen geeigneten Puffer überführt und auf Eis gekühlt schnellstmöglich zur weiteren Verarbeitung ins Labor transportiert. Die zu isolierenden Hirnkapillar- Endothelzellen befinden sich im Wesentlichen in der grauen Hirnsubstanz. Vor der weiteren Aufreinigung der Zellen wird daher bevorzugt die graue Hirnsubstanz mechanisch aus den übrigen Hirnteilen herauspräpariert. Hierfür wird zunächst die Hirnhaut abgezogen und die graue Hirnsubstanz abgeschabt, zerkleinert und in ein geeignetes Medium überführt. Ein geeignetes Medium ist z.B. M199-Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) oder Earle' s Puffer. Vor der weiteren Aufreinigung ist es zweckmäßig, die Masse der erhaltenen grauen Hirnsubstanz zu bestimmen. Earle' s Puffer: NaCl 117,2 mM
(pH 7,3) KC1 5,3 mM
NaH2P04 x 2 H20 1,0 mM
MgS04 x 7 H20 0,81 mM
CaCl2 x 2 H20 1,8 mM
Glucose x H20 5,6 mM
Erfindungsgemäß erfolgt die Vorreinigung der Hirnkapillar- Endothelzellen durch Aufschließen der Hirnsubstanz in wenigstens zwei aufeinander folgenden enzymatischen Schritten. In einem ersten enzymatischen Schritt wird die Hirnsubstanz mit dem Enzym Dispase verdaut. Der Dispaseverdau bewirkt die Auflösung des Nervengewebes. Als besonders geeignet hat sich eine Menge von 5 mg Dispase pro Gramm graue Hirnsubstanz erwiesen. Der Dispaseverdau erfolgt zweckmäßigerweise in M199- Medium, es sind jedoch auch andere Medien und Puffer für diese Reaktion geeignet. Eine entsprechend vorbereitete Dispaselö- sung wird zur Probe der grauen Hirnsubstanz gegeben, und die Suspension unter Rühren bei 37° inkubiert. Inkubationszeiten von zwei bis vier Stunden, vorzugsweise etwa drei Stunden, haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Enzymkonzentrationen, die verwendeten Lösungsmittel bzw. Medien und die Inkubationsdauer sind jeweils so auszuwählen, dass möglichst viel des Materials abgebaut bzw. aufgelöst wird, welches die Hirnkapillaren umgibt bzw. bindet. Gleichzeitig sind die Bedingungen jedoch so einzustellen, dass ein möglichst geringer Teil der zu isolierenden Hirnkapillar-Endothelzellen bei dem jeweiligen enzymatischen Schritt angegriffen bzw. abgetötet wird und die Zellen einer möglichst geringen Belastung ausgesetzt werden. Wesentlich ist hierbei, dass entstehende Scherkräfte möglichst gering gehalten werden. Dies wird beispielsweise dadurch erzielt, dass der enzymatische Verdau der Hirnmasse in Spinnerflaschen langsam und kontinuierlich gemischt wird.
Nach dem Dispaseverdau werden in einer erster Reinigungsstufe die Hirnkapillaren mittels Zentrifugation in Dextranlösung gewonnen. Hierfür können aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt werden. Als besonders geeignet hat sich erwiesen, eine Menge der Zellsuspension aus dem Dispaseverdau mit der gleichen Menge einer 15%igen Dextranlösung zu mischen, 10 min. zu schütteln und für etwa zehn Minuten bei 10°C bei 8650 x g in einem Festwinkelrotor zu zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgenommen und das Sediment dem zweiten enzymatischen Schritt zugeführt.
Im zweiten enzymatischen Schritt wird das Sediment der Zentrifugation mit Collagenase D verdaut. Collagenase D löst unter anderem die Basalmembran auf. Dem zweiten enzymatischen Schritt werden zweckmäßigerweise ein oder mehrere Proteasein- hibitoren zugegeben. Besonders geeignet ist hierfür der Pro- teaseinhibitor Na-p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethylketon (TLCK) . Der zweite enzymatische Schritt wird zweckmäßigerweise unter Rühren bei 37 °C für etwa eine Stunde durchgeführt. Es hat sich auch als besonders geeignet erwiesen, im zweiten enzymatischen Schritt eine oder mehrere DNAsen, wie Benzonase, einzusetzen. Hierdurch wird die beim Aufschluss toter Zellen frei werdende DNA abgebaut, welche ansonsten die Viskosität der Suspension erhöht .
Nach dem zweiten enzymatischen Schritt wird eine zweite Reinigungsstufe mittels Zentrifugation im Percoll-Dichtegradienten durchgeführt. Der Dichtegradient wird vorbereitet, indem man beispielsweise 9,91 ml Percoll, 0,72 ml 10-fach konzentriertes M199-Medium und 19,37 ml Earle' s Puffer mischt und in der Ultra-Zentrifuge bei 37200 x g, 4°C im Festwinkelrotor für eine Stunde zentrifugiert . Die Zellsuspension aus dem zweiten enzymatischen Schritt wird durch mehrfaches Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit, Abziehen des Überstandes und Resuspendieren des Zentrifugationssediments gewaschen, d.h. von den zugesetzten Enzymen befreit. Nach dem letzten Zentrifuga- tionsschritt wird das Sediment in einer geringen Menge Flüssigkeit, wie z.B. 6 ml M199-Medium, aufgenommen und auf den vorbereiteten Percoll-Dichtegradienten aufgetragen und in der Ultrazentrifuge bei 1400 x g, 4°C für zehn Minuten im Ausschwingrotor zentrifugiert. Die Percoll- Dichtegradientenzentrifugation bewirkt eine Auftrennung des suspendierten Zellmaterials nach seiner Dichte, wobei übli- cherweise drei diskrete Banden auftreten. Eine erste obere Bande mit der geringsten Dichte enthält Zelltrümmer bzw. Zellfragmente. Eine zweite mittlere Bande enthält unter anderem die zu isolierenden Hirnkapillar-Endothelzellen. In einer dritten unteren Bande mit der höchsten Dichte sammeln sich unter anderem Erythrozyten.
Die zweite Bande, welche die Hirnkapillar-Endothelzellen enthält, wird isoliert und erfindungsgemäß einer weiteren Reinigung zugeführt. Die Isolierung kann durch Abziehen der Bande mit Hilfe einer Kanüle oder vorzugsweise durch Abpipet- tieren erfolgen.
Neben den Hirnkapillar-Endothelzellen enthält das Material der aus der Percoll-Dichtegradientenzentrifugation erhaltenen zweiten Bande noch eine Vielzahl anderer Zelltypen, im Wesentlichen Erythrozyten und apoptotische Zellen. Bislang war es nicht möglich, diese verunreinigenden Zellen in ausreichendem Maße von den Hirnkapillar-Endothelzellen unter schonenden Bedingungen zu trennen. Überraschenderweise wurde nun gefun- den, dass dieses Problem gelöst werden kann, wenn die weitere Reinigung der Hirnkapillar-Endothelzellen mit einem Lysepuffer durchgeführt wird, wie er üblicherweise zur Isolierung von Lymphozyten verwendet wird, wobei die Zusammensetzung des Lysepuffers, die Behandlungsdauer und die Behandlungstemperatur so ausgewählt sind, dass vorhandene Erythrozyten und apoptotische Zellen im Wesentlichen vollständig zerstört werden und ein Großteil der Hirnkapillar-Endothelzellen überlebt. Die Vorteile und Eigenschaften dieses Puffers wurden vorstehend dargelegt.
Als erfindungsgemäß geeignet hat sich ein Lysepuffer erwiesen, der die folgenden Bestandteile enthält:
NaCl 30 M bis 50 mM
KC1 4,5 mM bis 5,5 mM
NH4C1 80 mM bis 100 mM
CaCl2 1,0 mM bis 2,0 mM
MgCl2 0,6 mM bis 0,8 mM
MgS04 0,3 mM bis 0,6 mM
NaHC03 4,5 mM bis 6,5 mM
NaH2P04 0,2 M bis 0,45 M
Na2HP04 0,4 mM bis 0,65 mM
KH2P0 0,1 mM bis 0,15 mM
Glucose 1,5 M bis 3,0 mM
Besonders geeignet ist ein Lysepuffer, der die folgende Zusammensetzung hat: NaCl 39 mM
KC1 5,1 mM
NH4C1 88 mM
CaCl2 1, 6 mM
MgCl2 0,69 mM
MgS04 0,46 mM
NaHC03 5, 6 mM
NaH2P04 0,33 mM
Na2HP04 0,53 mM
KH2P04 0,12 mM
Glucose 2,24 mM
Nach Zugabe des Lysepuffers wird die Suspension gemischt und mehrfach durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit und Resuspension in geeignetem Medium bzw. Puffer, wie M199 oder Earle' s Puffer, gewaschen. Im Zentrifugat sammeln sich die gereinigten Hirnkapillar-Endothelzellen.
Die gereinigten Hirnkapillar-Endothelzellen können nun auf zwei verschiedenen Wegen weiter verarbeitet werden um die Anwesenheit BHS-spezifischer Proteine oder Fragmente davon zu identifizieren. So können zum einen über den Proteomics-Ansatz als auch über den Genomics-Ansatz jeweils unterschiedliche Proteine bzw. Fragmente davon bzw. Transkripte identifiziert und isoliert werden. Nachstehend werden beide Ansätze näher beschrieben.
Die folgenden Figuren erläutern den Gegenstand der vorliegenden Erfindung näher:
Figur la: Northern-Blot Analyse von Itm2A Figur lb: Die Expression von Itm2A in BMEC unter Ischämie
Figur 2: Expressionsmuster von Itm2A in kultivierten BMEC (M:100 bp-Marker)
Figur 3: Expressionsmuster von S231 (M:100 bp ladder)
Figur 4: Expressionsmuster von ssEMPl (M:100 bp ladder)
Figur 5: Northern-Blot Analyse hybridisiert mit S231 (A) bzw, EMP1 (B) als Sonde
Figur 6: Western-Blot Analyse von S231
Figur 7 : Homologie-Vergleich von humanem und murinem EMP1 sowie porcinem S231. Die Membrandomäne ist hell hervorgehoben, die N-Glykosilierungsstelle hellgrau.
Figur 8: Expressionsmuster von S231 in kultivierten Zellen (M:100 bp-Marker)
Figur 9: Northern-Blot hybridisiert mit full-length FLJ13448/S012 als Sonde
Figur 10: Homologie-Vergleich von humanem, murinem und porcinem FLJ13448/S012. Kursiv sind jeweils die Peptide dargestellt, die als Signalpeptide dienen und abgespalten werden.
Figur 11: Expressionsmuster von porcinem FLJ13448/S012 in kultivierten Zellen (M:100 bp-Marker)
Figur 12: NSE2 Aminosäuresequenz des humanen Proteins. Durch die fette, unterstrichene Schrift sind die im Massenfingerprint identifizierten Peptide gekennzeich- net . Figur 13: Northern-Blot für NSE2 hybridisiert mit SEQ ID NO: 22 als Sonde
Figur 14: Expressionsmuster von NSE2 in kultivierten Zellen (M:100 bp-Marker)
Figur 15: Homologie-Vergleich von humanem NSE2 und NSEl. In hellem Font sind potentielle Phosphorilierungsstel- len dargestellt. Unterstrichen ist eine mögliche Ty- rosin-Kinase Domäne (ProSite Pattern Match PS00109) , wobei der aktive Rest fett dargestellt ist.
Figur 16: Verteilung von PEST-Domänen in NSE2. PEST-Sequenzen sind Pro, Glu, Ser und Thr reiche Regionen in Proteinen, die für eine kurze Halbwertszeit solcher Proteine in der Zelle verantwortlich sind, indem sie die Ubiquitinilierung dieser Proteine kontrollieren. Phosphorilierung bestimmter Ser oder Thr Reste in den PEST-Regionen (hell) ist für die Erkennung und Prozessierung durch den Ubiquitin-Proteaso Weg wichtig.
Figur 17: Die Expression von NSE2 in BMEC unter Ischämie
Figur 18: Aminosäuresequenz des humanen Proteins DRG-1
(CAB66619) . Durch die fette, unterstrichene Schrift sind die im Massenfingerprint identifizierten Peptide gekennzeichnet.
Figur 19: Der Homologie-Vergleich von humanem und murinem DRG- 1 zeigt 90 % Identität bzw. 94 % Homologie. Potentielle Phosphorilierungsstellen, eine nicht konservierte potentielle Glykosilierungsstelle und die Transmembrandomäne sind in hellem Font dargestellt. Der N-Terminus ist intrazellulär lokalisiert. Figur 20: Expressionsmuster von DRG-1 (M:100 bp-Marker)
Figur 21: Expressionsmuster von DRG-1 in kultivierten Zellen (M:100 bp-Marker)
Figur 22: TKA-1 Aminosäuresequenz des humanen Proteins. Durch die fette, unterstrichene Schrift sind die im Massenfingerprint identifizierten Peptide gekennzeichnet .
Figur 23: Northern-Blot hybridisiert mit ssTKA-l.ctg als Sonde
Figur 24: Expressionsmuster von TKA-1 in kultivierten Zellen (M:100 bp-Marker)
Figur 25: Die Expression von TKA-1 in BMEC unter Ischämie
Figur 26: Western-Blot Analyse von TKA-1
Figur 27: Expressionsmuster von S064
Figur 28: Expressionsmuster von ARL8
Figur 29: Multiple-Tissue-Blot hybridisiert mit S064 als Sonde
Figur 30: Expression von S064/ARL8 in kultivierten BMEC
Figur 31: Expressionsmuster von 5G9
Figur 32: Homologievergleich zwischen HSNOV1 und PNOV1
Figur 33: Vorhersage von Transmembrandomänen innerhalb der Sequenz des Proteins HSNOV1
Figur 34: Multiple-Tissue-Blot hybridisiert mit 5E7 als Sonde
Figur 35: Expressionsmuster von TSC-22 in kultivierten BMEC
Figur 36: Verringerte Expressionsrate von TSC-22 in BMEC bei Ischämie Identifizierung BHS-spezifischer Proteine durch differentielle 2D-Gelelektrophorese
Durch den direkten zweidimensionalen Vergleich der Genprodukte kann ein vollständiges Bild der Hirnkapillar-Endothelzellen erhalten werden. Erfindungsgemäß wird bei allen Elektrophoresen ein Vergleichsgewebe verwendet. Das Vergleichsgewebe ist ein Gewebe, das eine gezielte Identifikation von Transkripten bzw. Proteinen erlaubt, die spezifisch für die Blut-Hirn- Schranke sind. Grundsätzlich können beliebige Endothelzellen als Vergleichsgewebe verwendet werden, beispielsweise makro- und mikrovaskuläre Endothelzellen des gleichen Gewebes oder auch Endothelzellen aus anderen Organen, z.B. Herz, Lunge, Niere, Leber, Aorta etc. Es können auch aus Kultur gewonnene dedifferenzierte BMEC verwendet werden. Es ist jedoch bevor- zugt, einen anderen Endothelzelltyp als Vergleichsgewebe gegen Hirnkapillar-Endothelzellen zu verwenden. Bevorzugt werden Endothelzellen aus Aorta verwendet, die keine Barrierefunktion aufweisen. Dies hat zusätzlich den Vorteil, dass Mikrogefäße gegen Makrogefäße verglichen werden können. Es können ferner auch andere mikrovaskuläre Endothelzellen benutzt werden.
Ebenfalls geeignet sind unter anderen Bedingungen kultivierte Hirnkapillar-Endothelzellen als Vergleichsgewebe, z.B. unter anderen Bedingungen bzgl. pH-Wert, Wachstumsmatrix, Wachstumsfaktoren, z.B. Cytokine. Aus den bekannten Eigenschaften der Hirnkapillar-Endothelzellen gegenüber dem jeweiligen Vergleichsgewebe ergibt sich die physiologische Bedeutung der identifizierten Proteine. Erfindungsgemäß bevorzugt werden zwei definierte Zelltypen verwendet: Frisch isolierte BMEC als der Zelltyp mit Schrankenfunktion und Endothelzellen aus Aorta, die also wie BMEC auch Endothelzellen sind, jedoch keine Schrankenfunktion aufweisen. Insbesondere durch die Verwendung von Schweinegewebe ist es erstmals möglich eine so detaillierte Proteomkarte dieser Zellen zu erstellen.
Probenvorbereitung
Zunächst ist die Vitalität der präparierten Zellen und der An- teil der in der Präparation enthaltenen Erythrozyten zu bestimmen. Zur Bestimmung der Vitalität werden 20 μl der suspendierten Zellen entnommen und mit 4 μl Fluorescindiacetat- Arbeitslösung (24 μM in Earle 's Puffer) und 2 μl Propidium- iodid-Arbeitslösung (70 μM in Earle 's Puffer) versetzt. Die Suspension wird gemischt und 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop dokumentiert und das Verhältnis vitale zu geschädigten Zellen bestimmt. Lebende Zellen sind an einer grünen Fluoreszenz (Exitation 450 nm und Emission 515 nm) , geschädigte Zellen dagegen an einer roten im Kern lokalisierten Fluoreszenz (Exitation 488 nm und Emission 615 nm) zu erkennen. Der Anteil der Erythrozyten wird durch Zugabe von 20 μl Benzidin-Arbeitslösung (15 mM Benzidin- hydrochlorid, 12 % (v/v) Essigsäure, 2 % (v/v) H202) zu 20 μl Zellsuspension bestimmt. Die Probe wird gemischt und 5 min bei 25 °C inkubiert. Danach wurde ein Tropfen der Zellen auf einen Objektträger pipettiert und mit einem Deckglas abgedeckt. Erythrozyten erscheinen in diesem Test durch die Anlagerung blauer Kristalle im Durchlichtmikroskop. Durch Auszählen wird das Verhältnis von Endothelzellen zu Erythrozyten bestimmt. Die Zellen lassen sich bei einem Vitalitätsverhältnis von 95 % vitaler Zellen und bei einer Erythrozytenverunreinigung von unter 10 % für die nachfolgende zweidimensionale Gelelektrophorese verwenden.
Das Feuchtgewicht der frisch isolierten, sedimentierten Zellen wird bestimmt und mit dem fünffachen Volumen (z.B. 100 mg
Zellen mit 500 μl Puffer) Puffer A pH 6.8 (10 mM PIPES, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 150 μM Digitonin) vorsichtig resuspendiert. Die Zellsuspension wurde danach 20 min unter leichtem Schütteln auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation (480 g, 4°C, 10 min), um die Zellen zu Sedimentieren. Der Überstand wird abgezogen und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Das Sediment wird dann wiederum im fünffachen Volumen des ursprünglichen Feuchtgewichtes in Puffer B pH 7. (10 mM PIPES, 100 M NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5% (v/v) Triton X-100) resuspendiert und auf Eis 30 min unter heftigem Schütteln inkubiert. Danach wird die Probe 10 min durch Zentrifugation (5000 g, 4°C) sedimentiert, der Überstand abgezogen und bis zur weiteren Verwendung bei - 20°C gelagert.
Das Sediment wird nun im l,7fachen des ursprünglichen Feuchtgewichtes in Puffer C pH 7.4 (10 mM PIPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1% (v/v) TWEEN-40, 0,5% (w/v) Desoxycholat) resuspendiert, in einen Dounce-Homogenisator überführt und mit fünf Hüben aufgeschlossen. Danach wird die Probe wieder in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 min im Ultraschallbad inkubiert. Die Probe wird dann durch Zentrifugation (6780g, 4°C, 10 min) sedimentiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Das Sediment ist je nach Größe in 200 - 500 μl Puffer D pH 8.0 (50 mM Tris, 1 mM MgCl2) zu resuspendieren und wird in Stickstoff schockgefroren. Danach wird die Probe im Ultraschallbad aufgetaut und anschließend bei 37 °C mit 5 - 10 μl Benzonase (25 U/μl) inkubiert bis sich eine homogene, nicht mehr viskose Flüssigkeit bildet. Dann wird das 7fache Volumen einer 5 % (w/v) SDS-Lösung zugegeben und die Probe 20 min auf 90°C erhitzt. Es folgt eine Zentrifugation für 10 min (7000g, 20°C) zur Entfernung unlöslicher Bestandteile. Der Überstand wurde abgezogen und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Das eventuell vorhandene Sediment wird verworfen.
Die Überstände werden aufgetaut, anteilsmäßig vereinigt und gemischt. Um die in der Probe enthaltenen Detergenzien zu entfernen, erfolgt die Mischung der Probe mit 100 % Aceton (gelagert bei -30 °C) im Verhältnis 20 zu 80. Nach gründlichem Mischen wird die Fällung mindestens 1 h bei -30°C inkubiert. Danach erfolgt die Sedimentierung der gefällten Proteine für 15 min bei 10.000g und 4°C. Der Überstand wird dekantiert und verworfen.
Anschließend wird das Sediment mit 80 % (v/v) Aceton (-30°C kalt) gewaschen und erneut bei -30°C inkubiert. Nach der erneuten Zentrifugation (15 min, 10.000 g, 4°C) wird der Überstand verworfen und das Sediment in der kleinstmöglichen Menge Solubilisierungspuffer I (7 M Harnstoff, 2 M Thio- harnstoff, 4 % (w/v) CHAPS) oder II (8 M Harnstoff, 4 % (w/v) CHAPS) resuspendiert und der Proteingehalt der Proben bestimmt. Dazu werden für die Proteinbestimmung in einem 50 ml Reaktionsgefäß 1 Teil Rotiquant (Roth) und 4 Teile bidestil- liertes Wasser zu einer fertigen Arbeitslösung gemischt und unlösliche Bestandteile über einen Faltenfilter entfernt. Für die Eichgerade werden Verdünnungen von Rinderserumalbumin (BSA) in Solubilisierungspuffer I bzw. II hergestellt. Dabei wurden für die Eichlösungen Konzentrationen von 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml und 1,0 mg/ml eingestellt. Von den Eichlösungen, der Probe und der Referenz (Solubilisierungspuf- fer I oder II) werden je 20 μl in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und mit 1 ml der Rotiquant-Arbeitslösung versetzt. Gemischt wird in dem jeweiligen Reaktionsgefäß durch sofortiges Invertieren, danach erfolgt eine Inkubation der Probe bei 25°C für die Dauer von 20 min. Nach Überführen der Probe in eine 1 ml Küvette wird in einem Spektralphotometer bei 560 nm die Absorption gemessen. Durch Erstellung einer Eichgerade kann der Proteingehalt der Proben bestimmt werden.
Die restlichen Überstände der Proben werden dann bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
Isoelektrische Fokussierung
Für 12 Fokussierungsgele werden 2,5 mg Probe, die in 4,5 ml Solubilisierungspuffer I oder II (für pH-Gradient 4,5-5,5) gelöst vorliegen, mit 1,125 ml Fokussierungspuffer I (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% (w/v) CHAPS, 91 mM DTT, 2,5 % IPG-Puffer) bzw. II (8 M Harnstoff, 4% (w/v) CHAPS, 91 mM, 2,5% IPG-Puffer; für pH-Gradient 4,5-5,5) versetzt, 1 min im Ultraschallbad behandelt und dann 5 min in der Tischzentrifuge (20.000g) zentrifugiert. Für die verwendeten pH-Gradienten (3,5 - 4,5; 4,0 - 5,0; 4,5 - 5,5; 5,0 - 6,0; 5,5 - 6,7; 6,0 - 9,0) die als 24 cm lange Gele (Immobiline DryStrip; Amersham Biosciences) eingesetzt werden, werden die passenden IPG- Puffer eingesetzt.
Anschließend werden je 450 μl Probe in die Rehydratisierungs- Vorrichtung pipettiert und das Immobiline DryStrip-
Fokussierunsgel mit Hilfe von zwei Pinzetten mit der Gelseite nach unten luftblasenfrei auf die Lösung gelegt. Danach wird das Gel mit Paraffinöl überschichtet. Die Rehydratisierungs- dauer beträgt mindestens 12 h bis maximal 16 h. Beim pH- Gradienten 6,0 - 9,0, bei dem die Probe mittels Cup-Loading aufgetragen wird, wird anstelle der Probe mit der entsprechenden Mischung aus Solubilisierungspuffer I (4,5 ml) mit dem entsprechenden Fokussierungspuffer I (1,125 ml) der Gelstreifen rehydratisiert . Nach der Rehydratisierung wird jeder Gelstreifen in einen 24 cm Stripholder überführt und in Falle des „Cup Loadings" zusätzlich der Sample Cup direkt vor die Kathode platziert. Die Probe mit jeweils 200 μg 'Protein wird in den Sample Cup pipettiert und zusammen mit dem Immobiline DryStrip-Gel mit Paraffinöl überschichtet.
Die mit bidestilliertem Wasser angefeuchteten Elektrodenstreifen werden an den jeweiligen Gelenden positioniert. Auf diese Streifen werden dann die Elektroden aufgesetzt. Danach werden jeweils 6 beladene Stripholder in einer ETTAN IPGphor Fokus- sierungsapparatur (Amersham Biosciences) mit einem, dem pH- Gradienten entsprechenden Programm (siehe Tabelle 1) fokus- siert. Nach Abschluss der Fokussierung werden die Streifen mit einer Pinzette entnommen und bis zur weiteren Verwendung bei - 80°C gelagert.
Programm 1 wird für die pH-Gradienten 3,5 - 4,5, 4,0 - 5,0, 4,5 - 5,5, 5,0 - 6,0 und 5,5 - 6,7 angewandt, während Programm 2 bei Gelen mit einem pH-Gradienten von 6,0 - 9,0 zur Anwen- düng kommt .
SDS-Gelelektrophorese
Für die zweite Dimension werden die benötigten SDS- Polyacrylamidgele mit einer Konzentration an Acryla id von 12,5 % (w/v) selbst hergestellt.
Die Gelgießapparatur wird entsprechend der Bedienungsanleitung (Amersham Biosciences) montiert und mit Verdrängungspuffer pH 8,8 (0,375 M Tris, 50 % (v/v) Glycerin, 0,002 % (w/v) Bromphenolblau) in das vorgesehene Reservoir befüllt.
Der Gelpolymerisationsansatz pH 8,8 (12,17 % (w/v) Acrylamid, 0,33 % (w/v) Bisacrylamid, 0,375 M Tris, 0,1 % (w/v) SDS, 0,05 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat) wird in ein Gefäß mit Auslauftülle gemischt und dann 5 min im Ultraschallbad entgast. Danach wird die Polymerisationsreaktion durch Zugabe von 0,04 % (v/v) TEMED gestartet. Sofort wird das Gefäß an einem Stativ montiert und über einen Schlauch mit der Gelgießapparatur verbunden. Die Gellösung wird in die Apparatur fließen lassen bis sie ca 3 cm unter der niedrigeren Kante der Gel-Kassetten steht. Danach wird der Stopfen des Reservoirs für den Verdrän- gungspuffer gelöst und der Puffer verdrängt die Gellösung, bis diese ca 1 cm unter die Glaskante der Kasette gestiegen ist. Die gegossenen Gele werden bis zur vollständigen Polymerisation mit wassergesättigtem n-Butanol überschichtet.
Je ein Fokussierungsgel wird aus dem - 80°C-Gefrierschrank entnommen und in ein Equilibrierungsröhrchen überführt. Durch Zugabe von je 15 ml Reduktionspuffer pH 8.8 (6 M Harnstoff, 50 mM Tris, 30% (v/v) Glycerin, 4% (w/v) SDS, 65 mM DTT) werden die in den Gelen fokussierten Proteine unter Schütteln für 15 min bei 25°C reduziert. Danach wird der Reduktionspuffer verworfen und die Proteine durch Zugabe von 15 ml Alkylie- rungspuffer (6 M Harnstoff, 50 mM Tris, 30% (v/v) Glycerin, 4% (w/v) SDS, 260 mM Iodacetamid) mit Iodacetamid alkyliert. Die Inkubation erfolgt dabei ebenfalls für 15 min bei 25°C unter Schütteln. Der Puffer wird anschließend auch verworfen und der Gelstreifen wird aus dem Röhrchen entnommen. Mit Hilfe einer Pinzette wird das Gel auf die SDS-Gele gelegt und mit 2 ml flüssiger Agaroselösung pH 8,3 (0,5 % (w/v) Agarose, 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% (w/v) SDS) überschichtet und dadurch fixiert. Die Elektrophoresekammer ETTAN DALT II (Amersham
Biosciences) wird mit 10 1 2D-Laufpuffer pH 8,3 (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS) befüllt, die PAA-Gele in das Gerät eingebaut und der Elektrophoreselauf durchgeführt. Dabei wird zunächst eine konstante Leistung von 5 W pro PAA-Gel für 50 min eingestellt. Die Temperatur beträgt konstant 20°C.
Danach wird die Leistung auf 55 W pro Gel maximal jedoch auf 180 W erhöht und die Elektrophorese fortgesetzt bis der blaue Kontrollfarbstoff (Bromphenolblau) das untere Ende der Gele erreicht hat. Die Elektrophorese wird beendet und die Gele entnommen. Je Gel werden in einer Schale 400 ml (7 % (v/v) Essigsäure, 10 % (v/v) Methanol) vorgelegt, das Gel aus den Glasplatten entnommen und in die Schalen überführt. Zur Fixie- rung werden die Gele 30 min bei 25 °C unter Schütteln inkubiert. Währendessen werden 400 ml SyproRuby Färbelösung in einer schwarzen Schale vorgelegt und die fixierten Gele nach Ablauf der Inkubationszeit in die Färbelösung überführt. Nach der Färbung für 16 h unter Schütteln werden die Gele in 400 ml Fixierung 15 min entfärbt und zur Dokumentation im FLA 5000 Scanner (Fuji) bei einer Anregungswellenlänge von 473 nm und einer Emissionswellenlänge von 575 nm bei einer Auflösung von 100 μm und einer 16 bit Gradiation gescannt. Die Gele werden danach in Plastikfolie eingeschweißt und bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Identifikation differentieller Spots
Zur Identifikation differentieller Proteinspots wurden zunächst pro pH-Gradient (3,5 - 4,5; 4,0 - 5,0; 4,5 - 5,5; 5,0 - 6,0; 5,5 - 6,7; 6,0 - 9,0) jeweils 10 Gele mit frisch präparierten BMECs und 10 Gele aus AOECs (Aorta Endothelial Cells) erstellt und gescannt. Die Gele wurden dann mit Z3-Auswerte- software (Compugen) verglichen und differentielle Spots annotiert. Als Filter wurden dabei eine minimale Spotgröße von 100 Pixel angenommen. Die Proteinspots, die in BMECs höher (dreifache Menge oder mehr) oder einzigartig detektiert werden konnten, wurden mit einer 1000 μl-Spitze auf einem Blaulichttisch (MoBiTec) ausgestochen und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt. Die ausgestochenen Spots wurden beschriftet und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
Hydrolyse und massenspektrometrische Analyse der Proteinproben
Das in der Gelmatrix fixierte, ausgestochene Protein wurde aus dem -80°C Kühlschrank entnommen und durch Zugabe von 100 μl bidestilliertem Wasser gewaschen. Dazu wurde der jeweilige Ansatz 20 min bei 25 °C unter Schütteln inkubiert und dann der Überstand abpipettiert und verworfen. Der Vorgang wurde noch zwei weitere Male wiederholt. Daran wurde zweimal mit 100 μl 50% (v/v) Acetonitril überschichtet und jeweils 15 min bei 25°C unter Schütteln inkubiert. Erneut wurden die Überstände verworfen. Durch die Zugabe von 100 μl 100% Acetonitril und 15 minütiger Inkubation bei 25°C unter Schütteln erfolgte eine vollständige Dehydratisierung des Gelstückes. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Gelstück 5 min an der Luft getrocknet. Danach wurde das Gelstück in 15 μl Hydrolysepuffer (50 mM (NH4)2C03, 25 ng - 50 ng/15 μl Trypsin V) wieder rehydratisiert und gequollen. Die Hydrolyse der Proteine erfolgte durch
Inkubation bei 37°C für 18 h. Für die Erstellung eines Peptid- „Fingerprints" mittels Matrix-Assisted Laser Desorption Ioni- zation (MALDI) werden die Hydrolysen mit 15 μl 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure angesäuert. Die verwendeten ZipTip-C18- Pipettenspitzen werden durch dreimaliges Rehydratisieren mit je 10 μl 50% (v/v) Acetonitril und anschließendes dreimaliges Equilibrieren mit je 10 μl 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure vorbereitet. Das Auftragen der Probe erfolgt durch sieben- bis zehnmaliges Aufziehen des Überstandes des Hydrolyseansatzes. Gewaschen werden die ZipTips dann mit 10 μl 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure. Die Peptide werden direkt mit der Matrix (α- Cyanozimtsäure, 50% (v/v) Acetonitril, 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure) durch drei- bis viermaliges Auf- und Abpipettieren auf den MALDI-Messträger eluiert. Nach Trocknen der Proben auf dem Träger werden die Proben zunächst massenspektrometrisch mittels MALDI-Fingerprint gemessen und analysiert. Dazu werden am Voyager DE PRO (PerSeptive Biosystems) MALDI- Massenspektrometer die Proben im „Positive Reflector Mode" mit einer Beschleunigungsspannung von 20000 V, einer Gitterspan- nung von 75%, einem Weichendraht von 0,02% und einer Verzögerungszeit von 220 ns gemessen. Dabei wird ein Massenfenster verwendet, das Massen zwischen 700 - 3500 Da berücksichtigt. Die erhaltenen Massenlisten für jeden Proteinspot werden in eine Datenabfrage eingesetzt. Verwendet werden dabei drei verschiedene Programme: Mascot, MSFit und Profound.
Proteinspots, bei denen trotz eines guten Massen-Fingerprints keine Datenbank-Identifizierung möglich ist, werden mit ESI- Massenspektro etrie zur Generierung von Aminosäuresequenzinformation eingesetzt.
Nach der Hydrolyse wird der Hydrolyseansatz dafür mit 15 μl 0,2% (v/v) Ameisensäure angesäuert und 30 min unter Schütteln inkubiert. ZipTip-C18-Pipettenspitzen (MilliPore) werden währenddessen dreimal mit je 10 μl 50% (v/v) Acetonitril rehydratisiert und anschließend durch dreimal Waschen mit je 10 μl 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure equilibriert . Das Auftragen der Probe erfolgt durch sieben- bis zehnmaliges Aufziehen des Überstandes des Hydrolyseansatzes. Gewaschen werden die ZipTips dann mit 10 μl 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure, anschließend wird durch zweimaliges Waschen mit 0,1% (v/v) Ameisensäure umgepuffert und dann die Peptide durch fünf- bis siebenmaliges Aufziehen von 2 μl 50% (v/v) Methanol eluiert.
Die erhaltenen Peptidgemische können entweder direkt oder mittels Liquid-Chromatographie (LC) gekoppelt mit ESI- Massenspektrometrie analysiert werden.
Für eine Direktmessung wird 1 μl der eluierten Probe in eine Hohlnadel (Protana) gefüllt. Dabei wird zunächst ein Über- sichtsspektrum mit einer Ionensprayspannung von 850 - 1000 V, einem Vorhanggasdruck von 20 psi, einem „Declustering"- Potential von 40 - 50 V, einem Fokussierungspotential von 245 V und der Spannung an der Mehrkanalplatte von 2000 - 2100 V im „Positive Mode" gemessen. Der Scanbereich liegt dabei bei 100 - 1600 oder 410 - 1600 Th. Die im Spektrum detektierten Peptide werden einer stoßinduzierten Fragmentierung unterworfen. Dazu werden Produktionenspektren von jedem Peptid bei einer Ionensprayspannung von 850 - 1000 V, einem Vorhanggasdruck von 20 - 40 psi, einem „Declustering"-Potential von 40 - 50 V, einem Fokussierungspotential von 245 V, einer Quadrupolauflö- sung 0,7 - 1,0 amu, einer Kollisionenergie von 15 - 50 V und einer Spannung an der Mehrkanalplatte von 2100 - 2400 V aufgenommen. Der Scanbereich beträgt dabei 50 - 1600 Th.
Bei der Kopplung der nanoHPLC an das ESI-Massenspektrometer wird zunächst die Reversed phase (RP) -Vorsäule mit 2 μl Probe bei einem Fluss von 20 μl/ in 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure beladen. Die chromatographische Trennung der Peptide erfolgt über eine RP-C18-Säule (LC Packings) mit einem Gradienten über 35 min von den Anfangsbedingungen (0,05 % (v/v) Ameisensäure, 10 % (v/v) Acetonitril) bis zu den Endbedingungen (0,05 % (v/v) Ameisensäure, 76 % (v/v) Acetonitril). Die Kopplung der HPLC mit dem Massenspektrometer erfolgt über eine Hohlnadel (New Objective) . Die Einstellungen des Massenspektrometers werden so gewählt, dass während des LC-Laufes zwei Experimente durchgeführt werden können. Außer der Ionensprayspannung (1800 - 2200 V) entsprechen die dabei eingestellten Parameter den bereits oben aufgeführten. Es werden sowohl Übersichtsspektren als auch Produktionenspektren abwechselnd während des Laufes aufgenommen. Die Einstellungen sind bei den Produktionenspektren so gewählt, dass die beiden intensivsten Signale des Übersichtsspektrums, die 2fach, 3fach oder 4fach geladen und deren Intensität größer als 10 cps sind, anschließend über eine stoßinduzierte Fragmentierung analysiert werden. Der Scanbereich liegt dabei von 450 - 1600 Th. Die Auswertung der erhaltenen Spektren erfolgt in drei Stufen:
A) Die Produktionenspektren, die Informationen über die
Aminosäuresequenz des korrespondierenden Peptides enthalten, werden zunächst mit Hilfe des Softwareprogram es MASCOT (Mat- rix Sciences) vollständig mit öffentlichen Datenbanken abgeglichen. Kann dabei keine Zuordnung des Peptides zu einem Protein erfolgen, werden
B) die Produktionenspektren mit einem Softewaretool des Geräteherstellers zunächst automatisch sequenziert. Die so erhaltenen Aminosäuresequenzen wurden nach Shevchenko et al. über MSBlast mit den öffentlichen Datenbanken verglichen. Konnte das Protein nicht identifiziert werden, wurden
C) die Produktionenspektren manuell ausgewertet und die erhaltenen Aminosäuresequenzen mittels Blast oder FASTA mit den öffentlichen Datenbanken verglichen.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren können gezielt BHS-spezifische Proteine oder auch Fragmente davon in Hirnkapillar-Endothelzellen identifiziert werden. Die vorstehende Beschreibung erlaubt natürlich Routinevariationen, die einem Fachmann offensichtlich sind. Beispielsweise können folgende Verfahrensschritte variiert werden:
Als Aufschlussverfahren können auch andere dem Fachmann bekannte Verfahren zur Gewinnung der Proteine verwendet werden, die in der Standardliteratur beschrieben sind (z.B. „2D-Proteome Analysis Protocols")
Für die isoelektrische Fokussierung können natürlich entsprechende Fokussierungsgele von anderen Herstellern eingesetzt werden. Auch verschiedene Längen und pH- Gradienten können eingesetzt werden.
Für die Trennung in der zweiten Dimension können natürlich entsprechende Gelsysteme anderer Hersteller verwendet werden. Auch ist die Verwendung weiterer Gelgrößen möglich. Standardmäßig können auch andere dem Fachmann bekannte Proteasen zur Herstellung des Peptidmusters verwendet werden.
Zur Bestimmung der Peptidmassen und de novo Aminosäurese- quenzen können auch Massenspektrometer anderer Bauart und anderer Hersteller verwendet werden.
Zur Bestimmung der Peptidmassen und der de novo Aminosäuresequenzierung können die massenspektrometrischen Bedingungen sowohl apparativ als auch funktioneil entsprechend der Probe variiert werden.
Western-Blot der Proteine
Zunächst wurden die Proteine wie vorstehend beschrieben auf 12,5%igen Polyacrylamidgelen getrennt und anschließend auf Nitrocellulosemembran übertragen.
Dazu wurden sieben Whatman-Papiere (Schleicher & Schüll) auf Trenngelgröße zugeschnitten und jeweils mit verscheidenen Puffern getränkt.
Zwei Papiere in Anodenpuffer I (300 mM Tris-Base, 20% (v/v) Methanol) wurden luftblasenfrei auf die Anoden der Blot- Apparatur (BioRad) gelegt, danach folgten zwei Papiere in Anodenpuffer II (25 mM Tris-Base, 20% (v/v) Methanol) . Die ebenfalls in Anodenpuffer II getränkte Nitrocellulosemembran wurde aufgelegt, dann folgte das Polyacrylamidgel . Abschließend wurden noch drei Papiere in Kathodenpuffer (25 mM Tris, 40 mM Aminocapronsäure, 0,1% (w/v) SDS, 20% Methanol) getränkt und aufgelegt. Die Apparatur wurde geschlossen und der Transfer der Proteine erfolgte für eine Stunde bei maximal 25 V und 2,5 mA/cm2 Gel. Danach erfolgte eine immunchemische Färbung der Proteine mit polyklonalen Antiseren aus Kaninchen.
Dazu wurden die Membranen in TBST-Puffer (10 mM Tris-Base,
150 mM Natriumchlorid, 0,05% (v/v) Tween 20; pH 8,0) gewaschen und anschließend 30 min mit Blotto (10 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, 0,05% (v/v) Tween 20, 5% (w/v) Magermilchpulver; pH 8,0) freie Bindungsplätze abgesättigt. Die Inkubation mit dem 1. Antikörper erfolgte für 2 h bei RT in TBST-Puffer [Anti-EMPl-Antikörper (Kaninchen) 1:4000; Anti-TKA-1- Antikörper (Kaninchen) 1:4000], danach wurde dreimal mit TBST- Puffer gewaschen. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte durch Inkubation mit einem mit Alkalischer Phosphata- se konjugierten Zweitantikörper 1 h bei RT in TBST-Puffer [Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Ziege) 1:5000]. Nach zweimali- gern Waschen mit TBST-Puffer, wurde die Membran durch Inkubation mit AP-Puffer (100 mM Tris-Base, 100 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid; pH 9,5) auf einen alkalischen pH-Wert umgepuffert. Als Substrate für die Farbreaktion wurden 0,016% (w/v) Nitrotetrazolium-Blue-chlorid und 0,033% (w/v) 5-Brom-4- chlor-3-indolylphosphat-Dinatriumsalz in AP-Puffer verwendet.
Im Folgenden wird nun die Identifizierung BHS-spezifischer Proteine oder Fragmente davon in Hirnkapillar-Endothelzellen über den Genomics-Ansatz beschrieben.
Identifizierung BHS-spezifischer Transkripte durch cDNA- Subtraktion
Die gezielte Identifizierung zell- oder gewebespezifischer Proteine erfolgt durch differentielle Verfahren. Dies kann auf Proteinebene durch den Vergleich von 2D-Gelen von Aufschlüssen verschiedener Gewebe bzw. Zellen und durch anschließende Ermittlung der für ein Gewebe bzw. einen Zelltyp spezifischen Proteine erfolgen. Um von den physikalischen Eigenschaften von Proteinen (Größe, Löslichkeit) unabhängig zu sein, können zur Identifizierung spezifischer Proteine auch differentielle Verfahren auf Transkriptebene durchgeführt werden. Solche subtraktiven RNA-Techniken haben zusätzlich den Vorteil, weniger Gewebe bzw. Zellmaterial zu benötigen.
Zur Identifizierung BHS-spezifischer Proteine ist die Verwendung frisch isolierter BMEC als Ausgangsmaterial entscheidend. Bisher beschriebene Verfahren beruhten bestenfalls auf der Subtraktion von RNA aus Hirnkapillaren gegen RNA aus Niere (Li et al., 2001). Problematisch hierbei ist, dass Hirnkapillaren neben BMEC auch andere Zelltypen, wie Perizyten und Astrozy- ten, enthalten. Weiterhin ist das Subtraktionsgewebe Niere sehr heterogen, da es aus verschiedenen Zelltypen besteht, von denen Endothelzellen nur einen kleinen Teil ausmachen. Erfin- dungsgemäß ist ein Subtraktionsgewebe zu verwenden, das eine gezielte Identifikation von Transkripten bzw. Proteinen erlaubt, die spezifisch für die Blut-Hirn-Schranke sind. Grundsätzlich können beliebige Endothelzellen als Vergleichsgewebe verwendet werden, beispielsweise makro- und microvaskuläre Endothelzellen des gleichen Gewebes oder auch Endothelzellen aus anderen Organen, z.B. Herz, Lunge, Niere, Leber, Aorta etc. Es können auch aus Kultur gewonnene dedifferenzierte BMEC verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt ein anderer Endothelzelltyp als Vergleichsgewebe gegen Hirnkapillar- Endothelzellen zu verwenden. Bevorzugt werden Endothelzellen aus Aorta verwendet, die keine Barrierefunktion aufweisen. Dies hat zusätzlich den Vorteil, dass Mikrogefäße gegen Makrogefäße verglichen werden können. Es können ferner auch andere mikrovasculäre Endothelzellen benutzt werden. Ebenfalls geeig- net sind unter anderen Bedingungen kultivierte Hirnkapillar- Endothelzellen als Vergleichsgewebe, z.B. unter anderen Bedingungen bzgl. pH-Wert, Wachstumsmatrix, Wachstumsfaktoren (z.B. Zytokine etc.). Aus den bekannten Eigenschaften der Hirnkapillar-Endothelzellen gegenüber den jeweiligen Vergleichsgewebe ergibt sich d,ie physiologische Bedeutung der identifizierten Targets. Erfindungsgemäß bevorzugt werden zwei definierte Zelltypen verwendet: Frisch isolierte BMEC als der Zelltyp mit Schrankenfunktion und Endothelzellen aus Aorta, die also wie BMEC auch Endothelzellen sind, jedoch keine Schrankenfunktion aufweisen. Dieser Ansatz erlaubt viel gezielter Transkripte bzw. Proteine zu identifizieren, die zur Ausbildung der Blut- Hirn-Schranke beitragen.
Herstellung der subtraktiven cDNA-Bank
Gesamt-RNA wird aus den Zellen mit Trizol (Invitrogen) nach den Herstellerangaben isoliert. Die Gesamt-RNA wird anschließend auf einem denaturierenden Agarosegel auf ihre Intaktheit überprüft. Zur RNA-Isolierung werden 100 mg Gewebe bzw. 10 cm2 konfluent gewachsene Zellen in je 1 ml Trizol mechanisch homogenisiert und das Homogenat anschließend 5 min bei RT inkubiert. Danach werden 0,2 ml Chloroform / 1 ml Trizol (Invitrogen) gegeben, 15 sec durch vortexen gemischt and 3 min bei RT inkubiert. Zur Phasentrennung wird 15 min bei 4 °C und 12.000 x g zentrifugiert und im Anschluss daran die obere, wässrige Phase in ein frisches Gefäß überführt. Hierzu wird 0,5 ml Isopropanol / 1 ml Trizol gegeben, gemischt und 10 min bei RT inkubiert. Die RNA wird durch 10 min Zentrifugation bei 4 °C und 12.000 x g sedimentiert, zweimal mit 75 % EtOH gewaschen, an der Luft getrocknet und in DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Die Konzentration wird spektralphoto etrisch bestimmt und die Qualität in einem denaturierenden Agarosegel überprüft .
Ausgehend von Gesamt-RNA wird die mRNA mit Hilfe von Dynabeads (Dynal) nach den Herstellerangaben angereichert. RNA-Anreicherung: 75 μg Gesamt-RNA wird 2 min bei 65 °C denaturiert, sofort zu 200 μl Dynabeads 01igo(dT)25 (Dynal) in zweifach Bindepuffer gegeben und 5 min unter Mischen inkubiert. Der Überstand der magnetischen Seperation wird verwor- fen und die Dynabeads zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Die polyA+-RNA wird schließlich mit 20 μl 10 M Tris-HCl pH 7 , 5 für 2 min bei 85 °C eluiert.
Die Herstellung der subtraktiven cDNA-Bank kann mit handelsüblichen PCR Subtraktionskits durchgeführt werden. Beispielswei- se kann der PCR-Select cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech nach den Herstellerangaben verwendet werden.
Hierzu werden jeweils 2 μg mRNA aus BMEC (Tester) und AOEC (Driver) ausgehend von einem Oligo (dT) -Adapterprimer mit dem Enzym AMV Reverse Transkriptase in einzelsträngige cDNA umge- schrieben. Direkt im Anschluss daran wird die Zweitstrangsynthese mit einem Enzymgemisch (DNA Polymerase I, RNase H und DNA Ligase) für zwei Stunden bei 16°C und mit anschließender Zugabe von T4 DNA Polymerase und weiterer Inkubation bei 16°C für 30 Minuten durchgeführt. Die so hergestellte doppelsträn- gige cDNA wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol- Fällung gereinigt.
Zur Einführung geeigneter Enden für die spätere Adapterligati- on sowie zur Erzeugung einer einheitlicheren Größenverteilung der cDNA-Fragmente erfolgt nun eine Restriktion mit Rsa I. Die so hergestellten doppelsträngigen cDNA-Fragmente werden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung gereinigt. Die Produkte der cDNA-Synthesen sowie der Restriktionen werden gelelektrophoretisch auf Reinheit überprüft.
Für die spätere Amplifikation durch PCR werden nun die Adapto- ren 1 und 2R über die Rsa I-Enden an die Tester-cDNA mit dem Enzym T4 DNA Ligase angehängt. Die Ligation wird mittels PCR überprüft.
Die eigentliche Subtraktion erfolgt durch zwei Hybridisierungen. Für die erste Hybridisierung wird in einem Ansatz cDNA aus BMEC-Adapter 1 mit AOEC cDNA hybridisiert, in einem anderen Ansatz cDNA aus BMEC-Adapter 2R mit AOEC cDNA. In der zweiten Hybridisierung werden die beiden Ansätze aus der ersten Hybridisierung vereinigt und mit frisch denaturierter cDNA aus AOEC hybridisiert.
Die Produkte aus der Hybridisierung werden schließlich als
Matrize (Template) in eine erste PCR-Reaktion eingesetzt; als Primer dient hier ein Oligonukleotid aus dem gemeinsamen Bereich der beiden Adaptoren 1 und 2R.
Das Produktgemisch dieser ersten PCR wurde nun als Matrize in eine verschachtelte PCR (nested PCR) eingesetzt, wobei die beiden ineinander angeordneten Primer jeweils aus dem einzigartigen Bereich der beiden Adaptoren 1 und 2R stammen. Diese zweite PCR erhöht die Spezifität.
Die Effizienz der Subtraktion wurde durch vergleichende PCR an einem Haushalts-Gen (GAPDH) überprüft: Mit der cDNA aus der Subtraktion kann im Vergleich zu den beiden nicht subtrahierten cDNAs aus BMEC und AOEC erst nach signifikant mehr PCR- Zyklen eine Produktbildung erfolgen. GAPDH wird als typisches Haushaltsgen in allen Geweben und Zelltypen in vergleichbarer Stärke expri iert. Es sollte deshalb bei einer subtraktiven Hybridisierung nicht wie differentiell exprimierte Gene angereichert werden, sondern die Transkriptmenge sollte in den subtrahierten cDNAs (sowohl forward als auch reverse subtrac- tion) im Vergleich zu den cDNAs aus BMEC bzw. AOEC vor der Subtraktion stark abnehmen. Experimentell wird dies bestätigt, indem die beiden cDNAs vor der Subtraktion bzw. die jeweils subtrahierten cDNAs in eine PCR mit GAPDH-spezifischen Primern eingesetzt werden. Da mit den subtrahierten cDNAs eine erste Produktbildung erst nach zusätzlichen 16 Zyklen im Vergleich zu den beiden nicht subtrahierten cDNAs erzielt wird, findet folglich durch die Hybridisierung eine Anreicherung um mindestens den Faktor 50.000 statt. Diese Anreicherung ermöglicht die gezielte Identifizierung BHS-spezifischer Transkripte und stellt auch bereits eine erste Validierung der isolierten Sequenzen dar.
Die Produkte der zweiten PCR werden in den Vektor pT-Adv (Clontech) kloniert und in TOP10F' (Clontech) chemokompetente E . coli transformiert. Die Produkte der zweiten PCR werden in den Plasmid-Vektor pT-Adv (Clontech) kloniert. Dieser Vektor besitzt an den 5'Enden überstehende dT-Reste, die zu den 3' dA-Resten kompatibel sind, die z.B. durch Taq DNA-Polymerase an PCR-Produkte angehängt werden. Dieses bzw. vergleichbare Systeme erlauben die direkte Klonierung von PCR-Produkten mit hoher Effizienz. Die Transformation erfolgt in chemokompetente E . col i TOP10F' (Clontech) wie in der Literatur beschrieben (Sambrook et al., 1989).
Differentielle Hybridisierung
Klone aus der subtraktiven cDNA-Bank werden durch differentielle Hybridisierung bezüglich ihrer Expression BMEC vs . AOEC verifiziert. Hierzu wird das PCR-Select Differen tial Screening Ki t (Clontech) benutzt. Die reverse subtracted probe wurde mit dem PCR-Select cDNA Subtra ction Ki t der Firma Clontech nach Herstellerangaben wie oben beschrieben hergestellt, wobei BMEC als Driver und AOEC als Tester dient.
Entsprechend den Herstellerangaben werden in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten Flüssigkulturen der Klone angeimpft. Diese werden als Template zur Amplifizierung der Insertionen mit den Primern Adaptor 1 und 2R eingesetzt. Der Rest der Flüssigkulturen wird mit Glycerin versetzt und als Dauerkultur eingefroren. Die PCR-Produkte werden gelelektrophoretisch überprüft. Von Produkten, die größer als 200 bp waren, wird jeweils 1 μl auf zwei identische HybondN-Membranen gespottet und auf diesen mit UV-Licht fixiert. Abweichend von den Herstellerangaben werden jeweils nur zwei Filter ä 92 Klone hybridisiert: ein Filter mit der forward subtra cted probe, in der BMEC- spezifische Transkripte angereichert sind, und der andere Filter mit der reverse subtracted probe, in der AOEC- spezifische Transkripte angereichert sind. Auf die Hybridisierung zweier weiterer Filter mit cDNA aus BMEC bzw. AOEC wurde verzichtet, da hieraus keine relevante Zusatzinformation zu entnehmen ist. Statt dessen wird RNA aus BMEC und AOEC bei der späteren Verifizierung in Northern-Blot-Analysen bzw. RT-PCR- Experimenten zur Erstellung von Expressionsmustern eingesetzt. Pro Filter werden PCR-Produkte von 92 Klonen aus der subtraktiven cDNA-Bank sowie zwei Negativkontrollen des Herstellers aufgetragen. Zusätzlich zu den Herstellerangaben wird je ein PCR-Produkt eines Haushaltsgens gespottet, das in BMEC und
AOEC gleich stark exprimiert wird, sowie als Positivkontrolle ein PCR-Produkt zu einem BHS-Marker (Apolipoprotein AI) , der in BMEC stärker exprimiert ist als in AOEC.
Die Hybridisierungen werden wie vom Hersteller beschrieben mit Sonden gleicher Aktivität bei 72 °C mit „ExpressHyb"-Lösung
(Clontech) durchgeführt und die Filter anschließend stringent gewaschen. Es können übliche Bedingungen der Stringenz verwendet werden. Günstigerweise werden die Filter 2 x 20 min bei 68°C bis zu einer Stringenz von 0,2 x SSC/0,5% SDS gewaschen. Die Signalintensitäten werden durch Expositionen verschiedener Zeitdauer auf einem Film mit Hilfe eines Phosphoimagers (FLA- 5000, Fuji) ermittelt. Klone, die ein ca. fünfmal stärkeres Signal in BMEC als in AOEC zeigten, werden als differentiell exprimiert eingestuft und weiterverarbeitet.
Von positiven Klonen werden aus der Dauerkultur Flüssigkulturen angeimpft und die Plasmid-DNA nach Standardmethoden (Birn- boim and Doly, 1979) mit Hilfe von Qiagen-Säulen isoliert. Die Insertionen der Plasmide werden mit Universalprimern und gegebenenfalls zusätzlichen genspezifischen Primern sequenziert. Datenbanken werden mit den erhaltenen DNA-Sequenzen mit Hilfe der Algorithmen BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) und FASTA
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33) auf Homologien durchsucht.
Weitere Verifizierung BHS-spezifischer Transkripte: Expressionsmuster
Von den interessierenden positiven Klonen werden Expressions- muster in BMEC, AOEC und neun weiteren Geweben erstellt. Dies erfolgt durch RT-PCR und/oder Northern-Blot-Analysen. •
Für RT-PCR Experimente werden cDNAs ausgehend von Gesamt-RNA durch random priming hergestellt. Alle benutzten Enzyme sowie die random Hexa ere stammen von Invitrogen. Hierzu werden jeweils 10 μg Gesamt-RNA in 40 μl Nuklease-freiem Wasser mit 5 μl DNase I lOx Puffer sowie 5 μl DNase I versetzt und 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Anschließend werden 5 μl 25 M EDTA zugegeben und das Enzym für 15 Minuten bei 65°C hitzedeaktiviert. Von dem Ansatz werden 25 μl entnommen, mit Nuklea- se-freiem Wasser auf 100 μl aufgefüllt und als -RT Kontrolle bei -80°C gelagert. Zu den restlichen 25 μl Gesamt-RNA aus dem DNase I-Verdau werden 8 μl random primer (100 ng/μl) , 3 μl dNTP-Mix (je 10 M) und 2 μl Nuklease-freies Wasser gegeben. Nun werden für 5 Minuten bei 65°C die RNA Sekundärstrukturen aufgelöst und die Probe anschließend sofort auf Eis gestellt. Es werden 10 μl 5x Ist Strand buff r, 6 μl DTT (100 mM) und 3 μl RNaseOUT zugegeben, 10 Minuten bei 25 °C zur Primeranlage- rung inkubiert und anschließend 2 Minuten auf 42 °C temperiert. Nun werden 3 μl SuperScript II Reverse Transcriptase zugegeben und 50 Minuten bei 42 °C inkubiert. Danach wird das Enzym 15 Minuten bei 70 °C hitzedeaktiviert. Um die Gesamt-RNA von der cDNA abzubauen, werden 3 μl RNase H zugegeben und 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Abschließend wird mit Nuklease-freiem Wasser auf 100 μl aufgefüllt und die cDNA bei -80°C gelagert. Die Qualität der cDNAs wird durch PCR mit Primern für ein Haushaltsgen (GAPDH) bzw. für die 18S rRNA überprüft. Hierbei ist zu erwarten, dass jeweils vergleichbare Produktmengen mit den cDNAs aus den verschiedenen Geweben bzw. Zellen entstehen. Die so hergestellten cDNAs werden jeweils zur Erstellung von Expressionsmustern für die zu untersuchenden Transkripte eingesetzt.
Für Northern-Blot-Analysen zur Erstellung von Expressionsmustern wird Gesamt-RNA aus den Zellen bzw. Geweben in denaturierenden Gelen nach Größe getrennt, auf eine Nylon-Membran übertragen und dort mit radioaktiv markierten, genspezifischen Sonden hybridisiert. 6,0 g Agarose wird unter Erhitzen in
290 ml DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Danach wird im Wasserbad auf 60°C abgekühlt und 40 ml lOx MOPS-Puffer (200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA) sowie 70 ml Formaldehyd zugegeben. Schließlich wird ein Maxigel mit einem großen Taschenformer (12 Spuren) im Abzug gegossen und dort erstarren lassen. Jeweils 15 μg Gesamt-RNA in 10 μl werden mit 40 μl Probenpuffer (500 μl deionisiertes Formamid, 160 μl Formaldehyd, 100 μl lOx MOPS, 240 μl DEPC-behandeltes Wasser) für 15 Minuten bei 65°C denaturiert und anschließend auf Eis über- führt. Nun werden 10 μl Beladungspuffer (500 μl Glycerin, 2 μl 500 mM EDTA, 25 μl 10% Bromphenolblau, 473 μl DEPC-behandeltes Wasser) zugegeben und die Probe auf das mit lx MOPS-Puffer überschichtete Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wird für 3- 4 h bei 250 V durchgeführt. Danach wird das Gel erst 10 Minuten in Wasser geschwenkt, anschließend 30 Minuten in lOx SSC. Ein auf Gelgröße zugeschnittener Hybond XL-Filter wird 15 Minuten in lOx SSC geschwenkt.
Aufbau des Blots (von unten nach oben) : Salzbrücke (taucht in Pufferreservoir mit lOx SSC ein) , Gel, Filter, 5 3MM (vorher in lOx SSC eingelegt) , ca. 7 cm grüne Tücher (Zellstofftücher) , Glasplatte, Gewicht von ca. 0,5 kg. Das Blotting er- folgt für 16-20 h. Danach wird der Blot abgebaut und der
Hybond XL-Filter für 10 Minuten in 2x SSC gewaschen. Die RNA wird nun in einem UV-Crosslinker mit 70.000 μJ/cm2 auf dem Hybond Filter fixiert. Danach wird der Filter 1 Minute in Färbelösung (300 mg Methylenblau in 1 L 0,3 M Na-Acetat) gefärbt, um die RNA sichtbar zu machen und danach zum Entfärben des Hintergrunds 2 Minuten mit Wasser gewaschen. Die gefärbten Filter werden photographisch dokumentiert. Anschließend wird der Filter zwischen 3MM-Papier getrocknet, in Saran Wrap eingepackt und bei -20 °C gelagert.
Die Hybridisierungen erfolgen mit radioaktiv markierten cDNA- Sonden (Rediprime II, Amersham) , die über ProbeQuant G-50 Säulen (Amersham) gereinigt wurden, unter Benutzung von Ex- pressHyb Lösung (Clontech) nach den Herstellerangaben. Nach einer ersten Überprüfung der Hybridisierung mit Hilfe des Phosphoimagers FLA-5000 (Fuji) werden Autoradiogramme auf Biomax MS-Filmen (Kodak) angefertigt.
Vervollständigung von cDNA-Seguenzen
Zu interessierenden BHS-spezifischen Klonen aus der subtraktiven cDNA-Bank werden die vollständigen cDNA-Sequenzen durch Durchmusterung von verschiedenen cDNA-Banken und RACE-PCR Experimente ermittelt. Eine cDNA-Bank wird aus BMEC von Schwein mit dem SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech) im Vektor λTriplEx2 nach den Herstellerangaben angelegt. Hierzu wird zuerst wie oben beschrieben Gesamt-RNA mit Trizol (Invitrogen) isoliert und daraus polyA+-RNA mit Hilfe von Dynabeads (Dynal) angereichert. Zur Herstellung der Bank werden 2 μg polyA+-RNÄ aus BMEC eingesetzt. Abschließend werden die Ligationen in vi tro mit dem Phagenextrakt Gigapack III Gold (Stratagene) nach den Herstellerangaben verpackt. Die Anzahl unabhängiger Phagen der cDNA- Bank aus BMEC beträgt 1,3 Millionen pfu, von denen mehr als 99% bei Durchführung eines Blau/Weiß-Tests (vgl. Sambrook et al., 1989) rekombinant waren. Mindestens die Hälfte der In- serts hat eine Größe von mehr als 1 kb. Nach Amplifikation der kompletten Bank beträgt der Titer ca. 2 x 1010 pfu/ml bei einem Gesamtvolumen von ca. 150 ml. Dieses Phagenlysat wird auf 7
(v/v) % DMSO eingestellt und bei -80°C gelagert. Die beschriebene Phagenbank wird in eine Plasmidbank nach Herstellerangaben (Clontech ClonCapture cDNA Selection Kit) konvertiert, indem E. coli BM25.8 mit 2 Millionen pfu der Phagenbank infi- ziert wurden. Dieser Bakterienstamm exprimiert Cre-
Rekombinase, welche die loxP-Stellen in dem Vektor λTriplEx2 erkennt und so die Konvertierung ermöglicht. Die Umwandlung der lamda-Phagen in Plasmide erfolgt hierbei durch in vivo- Exzision und anschließende Zirkularisierung des vollständigen Plasmids. Die erhaltenen Plasmide werden dann stabil in E . coli weitergegeben. Die Plasmidpräparation erfolgt von Plattenkulturen infizierter BM25.8 mit dem NucleoBond Plasmid Kit (Clontech) .
Zur Durchmusterung von cDNA-Plasmidbanken mit ClonCapture werden biotinylierte cDNA-Sonden eingesetzt. Diese bilden in einer RecA-vermittelten Reaktion DNA-Triplexstrukturen mit homologen Sequenzen der Plasmidinsertionen. Die so selektier- ten Plasmide können über an magnetische Kügelchen gekoppeltes Streptavidin isoliert und in eine Transformation eingesetzt werden. Klone aus einer solchen Anreicherung werden dann durch Koloniehybridisierung durchmustert, von daraus resultierenden positiven Klonen wird die Plasmid-DNA isoliert und sequenziert.
Die Isolierung positiver Klone durch ClonCapture wird genau nach Herstellerangaben (Clontech) durchgeführt. Zur Sondenherstellung wurde zuerst eine PCR mit genspezifischen Primern an einem geeigneten Plasmid optimiert, so dass nur ein Produkt entstand. Hierzu werden die Primer so gestaltet, dass sie maximal um 1°C voneinander abweichende Schmelztemperaturen haben sowie keine Primerdimere und keine stabilen Loops ausbilden. Die Annealinςr-Temperatur wird mit 2-5°C unter der nach der Formel Tm = [ (G+C) x 4] + [ (A + T) x 2] berechneten
Schmelztemperatur relativ hoch gewählt. Dies führt zu spezifischer Produktbildung, was sich bei der Kontrolle durch Gelelektrophorese in nur einer Bande äußert. Von diesem Produkt wird mit einer sterilen Pasteur-Pipette ein Stück aus einem Agarosegel entnommen und in 200 μl steriles Wasser überführt. Durch Verwirbeln und 30-minütige Inkubation bei 70°C wird die DNA aus dem Gelstück eluiert und dient als Matrize zur Sondenherstellung. Mit dieser Matrize werden Kontrollreaktionen mit und ohne Biotin-21-dUTP durchgeführt und in einem Agarosegel analysiert, da Biotin die PCR inhibieren kann. Bei erfolgreicher Kontrollreaktion wird nun in einer präparativen PCR die biotinylierte Sonde unter gleichzeitiger Zugabe von 10 μCi [α32P]dCTP hergestellt. Nach 20 Zyklen werden 5 μl aus dem Ansatz auf einem Agarosegel überprüft und eventuell noch 5 weitere Zyklen angeschlossen. Anschließend wird das PCR- Produkt mit dem NucleoSpin Extraction Ki t (Clontech) nach Herstellerangaben gereinigt und mit 35 μl Elutionspuffer eluiert. Hiervon werden 2 μl gelelektrophoretisch analysiert und das Produkt spektralphotometrisch quantifiziert. Zur Überprüfung der Biotinylierung werden 2 μl des gereinigten PCR-Produktes zu 15 μl Magnetkügelchen gegeben und das Präin- kubationssignal mit einem Geigerzähler ermittelt. Nach 30
Minuten Inkubation unter leichtem Schütteln werden die Magnetkügelchen im Magneten abgetrennt und der Überstand erneut mit dem Geigerzähler quantifiziert (Postinkubationssignal) . Bei erfolgreicher Biotinylierung ist das Präinkubationssignal 2-4 mal stärker als das Postinkubationssignal.
Für das Capturing werden 50 (200 bp) - 100 (600 bp) ng bioti- nyliertes PCR-Produkt in Wasser 5 Minuten bei 100°C denaturiert und danach sofort auf Eis überführt. Nun werden alle Komponenten außer der Plasmid-DNA zugegeben, wobei 2 μg RecA- Protein pro 50 ng Sonde eingesetzt werden. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37 °C wird 1 μg der Plasmid-Bank zugegeben und weitere 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. In der Zwischenzeit werden 15 μl Magnetkügelchen mit Heringssperma-DNA unspezifisch abgesättigt und für die Reinigung des Capturings vorbe- reitet. Zum Capturing werden EcoR V geschnittene λ-DNA gegeben und nach Zugabe von SDS ein Proteinase K-Verdau für 10 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Diese Reaktion wird schließlich durch Zugabe von PMSF abgestoppt und der Capturingansatz wird über die Magnetkügelchen aufgereinigt . Die isolierten Plasmide werden mit 100 μl Elutionspuffer eluiert, gefällt und anschließend in 10 μl Wasser gelöst.
2 μl der über ClonCapture angereicherten Plasmidbank werden in elektrokompetente E . coli DH5α transformiert und auf LB-Amp Platten ausplattiert. Positive Klone werden durch Kolonie- hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden (gleiches
Amplikon wie bei Biotinylierung) nach Standardverfahren identifiziert. Die so erhaltenen Klone werden durch Kolonie-PCR weiter verifiziert, wozu ein Primer aus dem erwähnten Amplikon und ein weiterer, stromabwärts gelegener Primer benutzt wird. Es ist zu vermeiden beide Primer aus dem Amplikon zu wählen, das als Sonde für ClonCapture benutzt wurde, um bei der Kolo- nie-PCR [es wird ein PCR-Ansatz durchgeführt, in den anstelle von DNA Bakterien aus einer einzelnen Kolonie gegeben werden] zu vermeiden, dass die Produktbildung nicht an den in den Bakterien enthaltenen Plasmiden, sondern durch kontaminierende Sonde erfolgt. Deshalb sollte mindestens 1 Primer außerhalb des Amplikons liegen, am besten 3' dazu gelegen sein, da diese Sequenz sowohl bekannt ist als auch in allen positiven Klonen der cDNA-Bank enthalten ist. Von positiven Klonen wurde die Plasmid-DNA nach Standardverfahren (Birnboim and Doly, 1979) mit Hilfe von Qiagen-Säulen isoliert und nach dem Kettenab- bruchverfahren sequenziert (Sanger et al., 1977). Zur Sequenzierung kann der „ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Version 2.0" (Applied Biosystems) nach Herstellerangaben benutzt werden. Die Produkte der Sequenzierreaktionen werden auf dem „ABI Prism 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems) analysiert.
Die RACE-PCR (Froh an et al., 1988) dient zur Ermittlung unbekannter cDNA-Sequenzen ausgehend von einem bekannten Sequenzabschnitt durch cDNA-Synthese gefolgt von der Einführung bekannter, synthetischer Enden zur Anlagerung des zweiten PCR-Primers.
Die 5' RACE-PCR wird mit dem 5 'RACE System for Rapid Amplifica - tion of cDNA Ends , Version 2. 0 (Invitrogen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierbei erfolgt zuerst eine cDNA- Erststrangsynthese mit einem genspezifischen Primer (GSP1) und 1 μg Gesamt-RNA aus BMEC. An das 3' Ende dieser cDNA wird nach Reinigung der cDNA über GlassMAX-Säulen in einem zweiten Schritt mit Hilfe des Enzyms Terminale Desoxynukleotidtransfe- rase ein Oligo-dC-Schwanz angehängt. Die erste PCR erfolgt an 5 μl getauter cDNA mit einem weiteren genspezifischen Primer (GSP2) und dem abridged anchor primer, der sich an den Oligo- dC-Schwanz anlagert. Die Spezifität der PCR wurde mit Hilfe einer zweiten, verschachtelten PCR erhöht, die mit dem abridged universal amplifi ca tion primer und einem dritten genspezifischen Primer (GSP3) an 5 μl 1: 100-verdünntem PCR-Produkt aus der ersten PCR durchgeführt wird. Als Kontrolle dienen bei der zweiten PCR Ansätze mit jeweils nur einem Primer sowie eine Wasserkontrolle. Nach gelelektrophoretischer Analyse wird eventuell das Produkt der zweiten PCR kloniert, wozu eine Ligation mit dem pGEM-Teasy System II (Promega) und Transformation in elektrokompetente DH5α durchgeführt wird. Die erhaltenen Klone werden mit Hilfe von Kolonie-PCR untersucht, die Plasmid-DNA wird präpariert und schließlich in an sich bekannter Weise sequenziert.
Die 3' RACE-PCR kann mit dem 3 'RACE System for Rapid Amplifica tion of cDNA Ends (Invitrogen) nach Herstellerangaben durchgeführt werden. Bei der 3' RACE-PCR erfolgt die cDNA-Erststrang- synthese an 5 μg Gesamt-RNA aus BMEC mit dem Oligo-dT adapter primer. Für die erste PCR werden 2 μl cDNA mit einem genspezifischen Primer (GSP1) und dem abridged universal amplifica tion primer eingesetzt. Eine semi-nested zweite PCR wird wie bei der 5'RACE beschrieben mit einem genspezifischen Primer (GSP2) und dem abridged universal amplifica tion primer inklusive der Kontrollen durchgeführt. Die Produkte werden wie beschrieben kloniert und sequenziert.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren können gezielt BHS-spezifische Proteine oder auch Fragmente davon in Hirnka- pillar-Endothelzellen identifiziert werden. Die vorstehende Beschreibung erlaubt natürlich Routinevariationen, die einem Fachmann offensichtlich sind. Beispielsweise können folgende Verfahrensschritte variiert werden:
• Es können isolierte BMEC ausgesät werden und eine Primärkultur anstelle der frischen BMECs als „Tester" bei der Subtraktion verwendet werden.
• Es kann ein anderes Subtraktionsgewebe („Driver ), z.B. dedifferenzierte BMEC aus der Kultur (min. Passage 2) gewählt werden.
• RNA bzw. mRNA können nach jeder anderen einem Fachmann bekannten Methode präpariert werden, mit der Maßgabe, dass die RNA intakt ist bzw. die mRNA sich durch Reverse Transkription in cDNA umschreiben lässt.
• Die PCR-Produkte aus der Subtraktion können in jedes geeignete Vektorsystem kloniert werden, sowohl über Poly e- rase-bedingte 3' dA-Reste, als auch über glatte Enden oder nach Restriktion. Die Transformation kann in verschiedene E . coli-Stämme erfolgen, sowohl in chemisch- als auch in elektrokompetente Zellen, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
• Der Schritt der differentiellen Hybridisierung ist optional, aber empfehlenswert. Hierbei können auch andere geeignete Membranen (z.B. positiv geladene oder ungeladene Nylon-Membranen) sowie andere Hybridisierlösungen benutzt werden. Stringentes Waschen der Membranen kann auch bei an- deren Temperaturen bzw. mit anderen Lösungen erreicht werden (z.B. niedrige Temperaturen und niedriger Salzgehalt bzw. höhere Temperatur und höherer Salzgehalt, z.B. T=50- 70°C, 0,5-0,05 x SSC/0,1% 5DS) . • Expressionsmuster können auch durch quantitative PCR (real- time PCR) mit den entsprechenden cDNAs ermittelt werden. Zweckmäßigerweise wird die quantitative PCR mit dem Opticon (MJ Research) durchgeführt. Zur Durchführung der Reaktion wird das „QuantiTect SYBR Green PCR Kit" von Qiagen benutzt, wobei PCR-Bedingungen wie vorstehend beschrieben verwendet werden. Zur Quantifizierung wird jeweils eine Verdünnungsreihe aus BMEC cDNA hergestellt, die Angaben erfolgen in Picogramm eingesetzten RNA-Äquivalenten. Zur Durchführung der relativen Quantifizierung werden jeweils die berechneten Mengen an Target durch die berechneten Mengen an 18S rRNA geteilt. Abschließend wird eine Probe, z.B. BMEC, als 100 % gesetzt und alle anderen Proben darauf bezogen.
• Die cDNAs können auch mit Hilfe anderer Systeme hergestellt werden. Northern-Blot Analysen können auch mit anderen geeigneten Sonden und Hybridisier-/Waschlösungen durchgeführt werden.
• cDNAs können auch durch da tabase mining mit Hilfe bekann- ter, überlappender Sequenzen erweitert werden. Experimentell können auch beliebige andere cDNA-Banken aus Zellen bzw. Geweben, in denen das gesuchte Transkript vorkommt, mit verschiedenen Systemen durchmustert werden bzw. RNA aus Zellen bzw. Geweben, in denen das gesuchte Transkript vor- kommt, in die RACE-PCR eingesetzt werden (vgl. Sambrock, 1989) . Für RACE-PCRs können beliebige andere, geeignete, einem Fachmann bekannte Systeme benutzt werden.
Die mit diesem Verfahren identifizierten Proteine oder Fragmente besitzen eine Spezifität für die Blut-Hirn-Schranke und sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Kenntnis der Spezifität eines Proteins oder Fragments davon für die Blut-Hirn-Schranke erlaubt nun die gezielte Auffindung der Funktion des Proteins. In der Regel erfolgt die Funktionsermittlung mittels Vergleich mit bekannten Sequenzdaten in verfügbaren Datenbanken, zum Beispiel unter Verwendung des BLAST-Algorithmus. Die Kenntnis der Spezifität der identifizierten Proteine erlaubt ferner eine gezielte Modulation ihrer Expression in der Blut-Hirn-Schranke, wodurch pathologische Zustände gezielt therapiert werden können.
So können Agonisten oder Antagonisten zu den jeweiligen BHS- spezifischen Proteinen entwickelt werden, die selektiv deren Aktivität modulieren. Die Expression solcher Proteine kann auch direkt moduliert werden, z.B. durch Gentransfer oder anti-sense RNA. Für therapeutische Ansätze besonders attraktiv ist die Entwicklung „Trojanischer Pferde" - Medikamente, die an Moleküle gekoppelt sind, welche aktiv von identifizierten Transportern über die BHS transportiert werden. Möglich sind auch sogenannte pro drugs, Substanzen, die von BHS- spezifischen Enzymen in den Endothelzellen modifiziert werden und so ihre therapeutische Wirkung erlangen.
BHS-spezifische Proteine erfüllen vielfältige Funktionen. Zum Beispiel dienen sie der Nährstoffversorgung (Beispiel Glucose- transporter GLUT1) oder dienen als Kontaktproteine (z.B. ZO-1 als tight junction-Protein) . Ferner besitzen sie enzymatische Aktivität (z.B. Glutamyltranspeptidase GGT) oder fungieren als Transportvehikel für Aminosäuren.
Expression BHS-spezifischer Proteine bei Ischämie
Das Expressionsverhalten der erfindungsgemäß identifizierten BHS-spezifischen Proteine bei Ischämie wurde untersucht. Dazu wurden die präparierten Endothelzellen nach dem Waschen re- suspendiert und wie bei Franke et al. (2000) beschrieben in mit Kollagen beschichtete Zellkulturflaschen ausgesät. Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 °C in C02-Inkubatoren mit einem konstanten C02-Gehalt von 5%. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie durch eine Behandlung mit Trypsinlösung abgelöst und in dafür vorbereitete Trans- wellschalen (44 cm2, Corning) gesplittet. Nach 3 Tagen Kultivierung der Zellen unter den bereits beschriebenen Bedingungen wurde der Transwell-Ansatz in eine Schale umgesetzt, an deren Boden C6-Glioma-Zellen (handelsüblich, z.B. zu beziehen von der ATCC) gewachsen waren. Die zwei Zelltypen wurden zwei Tage in Kokultur unter Zusatz von Hydrocortison weiterkultiviert. Für das Experiment zur Expression unter Ischämie wurde ein Mediumwechsel vorgenommen. Das neue Medium wurde vorher mit 0,2% 02, 94,2% N2 und 5% C02 begast und enthielt keine Glukose. Anschließend wurden die Zellen für 24 h bei 37 °C in C02- Inkubatoren mit 0,2% 02, 94,2% N2 und 5% C02 aufbewahrt . Bei der Kontrolle wurde ebenfalls ein Mediumwechsel vorgenommen. Das Medium wurde vorher mit 21% 02, 74% N2 und 5% C02 begast und enthielt Glukose. Die Zellen wurden für 24 h unter diesen Bedingungen weiterkultiviert. Danach wurde die Expression des jeweiligen Proteins quantitativ - wie vorstehend beschrieben - bestimmt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden nun die folgenden Proteine an der Blut-Hirn-Schranke identifiziert.
Beispiel 1: Identifizierung von S129 = ITM2A
Frisch aus dem Gehirn von Schweinen wie vorstehend beschrieben isolierte und gereinigte BMEC wurden in M199-Medium (Sigma) mit 10 (v/v) % Ochsen-Serum (PAA) auf Kollagen G (Biochrom) kultiviert und durch Trypsinieren passagiert. Aus kultivierten BMEC wurden von der Primärkultur (PO) sowie von den Passagen 1-3 (Pl-3) aus jeweils einer T75 Zellkulturflasche Gesamt-RNA wie oben beschrieben isoliert. Hieraus wurde wie bereits beschrieben cDNA hergestellt und auf ihre Qualität untersucht. Expressionsmuster wurden mit den jeweiligen genspezifischen Primern vergleichend zwischen frischen BMEC und PO-3 erstellt, jeweils unter Bezug auf GAPDH bzw. 18S rRNA. Es wurden die in diesem und in den folgenden Beispielen beschriebenen Klone erhalten.
Der subtraktive Klon S129 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein > 5mal stärkeres Signal und wurde somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons S129 ist als SEQ ID N0:1 angegeben.
Anhand dieser Sequenz wurde S129 eindeutig als Itm2A identifiziert .
Zuerst wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für Itm2A mit den Primern Itm2a.s2 (5' ACC TCC ATT GTT ATG CCT CCT A 3'= SEQ ID NO 2) und Itm2a.as2 (5' GTT GCC TCT CAC TCT TGA CAG A 3' = SEQ ID NO 3) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt. Das Expressionsmuster wurde mittels RT-PCR erhalten (nicht dargestellt) .
Das semi-quantitative Expressionsmuster zeigt, dass Itm2A in BMEC stärker exprimiert ist als in AOEC und bestätigt somit das Ergebnis der differentiellen Hybridisierung. Außerdem ist die Expression in BMEC auch deutlich stärker als in Cortex (Gehirn) , was ein Hinweis auf die Spezifität für BMEC im Gehirn ist. Lediglich im Herzen ist eine starke Expression zu sehen, was eventuell mit der beschriebenen Expression in Muskel korreliert werden kann. Das Expressionsmuster wurde durch Northern-Blot-Analyse verifiziert, als Sonde diente hierbei die kodierende Region von Itm2A aus Schwein (Figur la) . Im Northern Blot wird die Spezifität für BMEC noch deutlicher. Diese Expression in BMEC und somit an der BHS ist bisher nicht beschrieben.
Weiterhin kann man im Northern Blot ein zweites, kleineres Transkript in BMEC erkennen. Um dieses zu charakterisieren wurden die kodierende Region, sowie 5' und 3' nichtkodierende Region mit RT-PCR bzw. RACE-PCR in BMEC untersucht. Hierbei ergab sich, dass für Itm2A zwei 3' nichtkodierende Regionen existieren, wovon die kürzere durch ein alternatives Polyade- nylierungssignal entsteht, wie sich durch Sequenzierung zeigte. Auch dies war bisher für Itm2A nicht beschrieben. Wahrscheinlich wird durch zwei verschiedene 3' Regionen die Transkripthäufigkeit über verschiedene Stabilitäten reguliert und somit auch die Proteinmenge. Die beschriebenen Experimente lieferten auch die vollständige cDNA-Sequenz (vollständige CDS 119-910) für Itm2A aus Schwein (SEQ ID NO 4 + SEQ ID NO 5) .
Die Expression des Targets Itm2A/S129 unter ischämischen Bedingungen wurde gemäß der vorstehend angegebenen allgemeinen experimentellen Vorschrift untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Target S129 in BMEC unter Ischämie in der Expression stark vermindert ist. Dies spricht für eine Beteiligung von Itm2A bei Krankheiten, die mit ischämischen Bedingungen verbunden sind, wie beispielsweise Schlaganfall, Herzinfarkt und tumorassoziierte Zustände, wie sie beispielsweise bei einem Glio- blastom vorkommen. Das festgestellte Expressionsmuster belegt zum einen die Verwendbarkeit des Targets als diagnostischer Marker bei diesen Erkrankungen, zum anderen die therapeutische Verwertbarkeit des Targets zur ursächlichen Behandlung der oben genannten Erkrankungen. Das Εxpressionsmuster von Itm2A in BMEC unter Ischämie verglichen mit einer als 100% angesetzten Kontrolle ist in Figur lb gezeigt. BMEC wurden wie im Methodenteil beschrieben einmal unter Ischämie-Bedingungen („Ischämie") und einmal unter Normalbedingungen („Kontrolle") kultiviert. Anschließend wurde die Expression von Targets in beiden Proben relativ zur 18S rRNA gemessen. Der erhaltene Wert wurde für die Kontrolle als 100% gesetzt und die Ischä- mie-Probe darauf bezogen.
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von Itm2A an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH untersucht. Das Resultat ist in Figur 2 dargestellt. Diese Daten zeigen eine schnelle Abnahme der Expression vor Itm2A, wie auch für bekannte BHS-Marker beschrieben ist. Ein Haushaltsgen wie GAPDH zeigt dagegen keine Regulation.
Die Daten weisen deutlich auf eine Funktion von Itm2A an der BHS hin. Berücksichtigt man die Rolle des Proteins bei der Differenzierung in Chondrozyten und T-Zellen, kann man folgern, dass Itm2A auch für den besonderen Differenzierungszustand von Endothelzellen an der BHS verantwortlich ist. Da Itm2A nachweislich in bestimmten Zuständen von Zellen in der Plasmamembran lokalisiert ist, stellt es hier dem Anschein nach einen Rezeptor dar, indem es eventuell Homo- oder Hetero- multimere bildet. Der extrazelluläre Anteil eines solchen Rezeptors würde sekretierte Moleküle oder Oberflächenmoleküle anderer Zellen binden, der intrazelluläre Anteil des Rezeptorkomplexes könnte in einem solchen Modell - z.B. durch Konfor- mationsänderungen aufgrund der erfolgten Bindung - Signale weiterleiten, die innerhalb von Signalkaskaden eine Antwort der Zelle auslösen und so deren Eigenschaften verändern.
Itm2A wurde in einem differentiellen Screen einer cDNA-Bank aus Kondylen (Gelenkkopf) aus Maus zuerst durch Delersnijder et al . (1996) gefunden. Das kodierte Protein besteht aus 263 Aminosäuren und stellt ein integrales Membranprotein vom Typ II dar. Es besitzt eine potentielle Glykosilierungsstelle sowie einen möglichen leucine zipper. Das Gen, das aus sechs Exons besteht, ist am stärksten in knochenbildenden Geweben exprimiert und stellt einen Marker für die Differenzierung Knorpel/Knochen dar. Itm2A ist Mitglied einer neuen Genfamilie, die aus drei Mitgliedern besteht. Zwischen Mensch und Maus sind die einzelnen Mitglieder der Familie jeweils hoch konserviert. Die Konservierung unter den einzelnen Mitgliedern beträgt nur ca. 40%, wobei vor allem der C-Terminus konser- viert ist, jedoch nicht der N-Terminus. Das leucine zipper Motiv findet sich nur bei Itm2A, ansonsten enthalten die Proteine der Familie keinerlei bekannte Sequenzmotive.
Beispiel 2 : Identifizierung von S231
Der subtraktive Klon S231 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein > 5mal stärkeres Signal und wurde somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons S231 ist als SEQ ID NO: 6 angegeben. Bei BLAST-Homologiesuchen zeigte die Sequenz S231 die höchste Homologie zu EMP1.
Zuerst wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für S231 mit den Primern S231.1 (5' CCA TAA CTC TTT CAC GCA ACT G 3'= SEQ ID NO 7) und Ξ231.1R (5' ACA ACA GAG GAG TTG GCT GTT T 3' = SEQ ID NO 8) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt (siehe Figur 3) .
Dieses semi-quantitative Expressionsmuster zeigt, dass S231 in BMEC stärker exprimiert ist als in AOEC und bestätigt somit das Ergebnis der differentiellen Hybridisierung. Außerdem ist die Expression in BMEC auch deutlich stärker als in Cortex (Gehirn) , was ein Hinweis auf die Spezifität für BMEC im Gehirn ist. Lediglich im Herzen ist eine starke Expression zu sehen, jedoch nur schwach in Lunge, Colon oder Gehirn, obwohl für diese Gewebe eine starke Expression in der Literatur (Gehirn nur für Ratte) beschrieben ist. Dies legt die Frage nahe, ob S231 wirklich EMP1 aus Schwein darstellt oder ein anderes Mitglied dieser Genfamilie ist.
Um dies zu klären wurde die cDNA-Bank (λTriplEx2) aus BMEC mit S231 als Sonde (radioaktiv markiert, Standardverfahren) durchmustert. Es wurden mehrere Klone isoliert, von denen die beiden größten Klone jeweils 5' ansequenziert wurden. Beide Sequenzen zeigten wieder die größten Homologien zu EMP1, wobei die Überlappungen jeweils im 3' nichtkodierenden Bereich lagen.
Zur Untersuchung, ob es sich bei S231 tatsächlich um EMP1 aus Schwein handelt, wurde mit den Primern hsEMPl.sl (5' GGT ATT GCT GGC TGG TAT CTT T 3' = SEQ ID NO 9) und hsEMPl.asl (5' ATG TAG GAA TAG CCG TGG TGA T 3' = SEQ ID NO 10), die aus der kodierenden Region des humanen EMP1 abgeleitet wurden, eine RT-PCR mit BMEC durchgeführt. Das erhaltene Produkt (ssEMPl) wurde kloniert und sequenziert. Aus dieser Sequenz wurde der Primer ssEMPl.1 (5' GGT CTT TGT GTT CCA GCT CTT C 3' = SEQ ID NO 11) abgeleitet. Ein zweiter Primer ssEMPl. IR (5' TTC TCA GGA CCA GAT AGA GAA CG 3' = SEQ ID NO 12) wurde aus einem Abschnitt absoluter Übereinstimmung zwischen der kodierenden Sequenz des humanen EMP1 und dem EST F23116 aus Schwein abgeleitet. Mit diesen beiden Primern ssEMPl .1/ssEMPl . IR wurde ein Expressionsmuster wie oben beschrieben erstellt (vgl. Figur
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Die Expressionsmuster mit den Primern aus Klon S231 und aus ssEMPl sind zwar ähnlich, jedoch keineswegs identisch. Deshalb ist zu postulieren, dass S231 ein anderes Mitglied aus der pmp-22/emp/mp20-Genfamilie darstellt. Beide Expressionsmuster wurden nun durch Northern-Blot- Analysen verifiziert, wobei als Sonde der Klon S231 (Fig. 5A) bzw. das PCR-Produkt hsEMPl. sl/hsEMPl . asl (EMP1) (Fig. 5B) benutzt wurde (vgl. Figur 5) .
Im Northern Blot wird die Spezifität für BMEC noch deutlicher. Diese Expression in BMEC und somit an der BHS ist bisher nicht beschrieben.
Auffällig ist die im Northern Blot stärkere Expression in Plexus (hier war allerdings auch ca. die 2-3fache RNA-Menge aufgetragen) und Colon, wohingegen die Expression durch RT-PCR stärker im Herzen war. Weiterhin ist das Verhältnis der beiden Transkripte in BMEC deutlich verschieden, abhängig von der benutzten Sonde. Mit S231 ist das Verhältnis von größerem zu kleinerem Transkript annähernd gleich, wohingegen bei EMP1 als Sonde das kleinere Transkript bedeutend stärker erscheint.
Im Vergleich zu Expressionsdaten von EMP1 in der Literatur fällt auf, dass S231 aus Schwein andere Transkriptgrößen als EMP1 aus Mensch und Maus aufweist und dass weiterhin das Expressionsmuster z.T. stark von den Literaturdaten zu EMP1 aus verschiedenen Spezies abweicht. Diese Abweichungen auf Transkriptebene zeigen, dass der hier beschriebene Klon S231 nicht EMPl darstellt, sondern als S231 ein anderes Mitglied dieser Genfamilie ist. Möglicherweise gibt es beim Menschen nur ein Gen EMPl, das von zwei Promotoren reguliert wird, und beim Schwein wird diese Aufgabe jedoch von zwei getrennten Genen - EMPl und S231 - wahrgenommen.
Um die vollständige kodierende Region von S231 aus Schwein zu erhalten, wurde die cDNA-Bank aus BMEC in pTriplEx2 mit EMPl als ClonCapture-Sonde durchmustert. Hierbei wurden mehrere positive Klone isoliert, welche die vollständige kodierende Region enthielten. Diese wurde nun sequenziert und daraus die Proteinsequenz abgeleitet (SEQ ID NO 13 und SEQ ID NO 14).
Die Identität von S231 aus Schwein zu humanem EMPl beträgt auf Aminosäureebene nur 78%, zu Maus beträgt sie 76%. Dies stärkt weiterhin die These, dass S231 nicht EMPl darstellt, da normalerweise Proteine zwischen Mensch und Schwein 85-95% identisch sind (vgl. Figur 7).
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von S231 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht (vgl. Figur 8). Diese Daten zeigen eine schnelle Abnahme der Expression von S231, wie auch für bekannte BHS-Marker beschrieben ist. Ein Haushaltsgen wie GAPDH zeigt dagegen keine Regulation.
Die gemäß der vorstehend gegebenen Vorschrift durchgeführte Western-Blot-Analyse für S231 bestätigt die Ergebnisse, die auf RNA-Ebene erhalten wurden. In BMEC ist eine starke Expression des Proteins zu erkennen, jedoch nicht in AOEC. Weiterhin zeigt der Western Blot, dass S231 hauptsächlich in der Memb- ranfraktion vorkommt. In kultiviertem BMEC nimmt die Expression ab, allerdings ist verstärkt ein Protein mit geringerem Molekulargewicht nachzuweisen. Möglicherweise handelt es sich hierbei um zwei verschiedene Homo- bzw. Heterodimere von S231. Der Western Blot ist in Figur 6 gezeigt.
Die Daten weisen deutlich auf eine Funktion von S231 an der BHS hin. Berücksichtigt man die beschriebene Rolle des Proteins bei der Differenzierung anderer Zelltypen, kann man folgern, dass S231 für den besonderen Differenzierungszustand von Endothelzellen an der BHS verantwortlich ist und möglicherwei- se ein Zelladhäsionsmolekül oder einen Kanal (Membrandomänen am stärksten konserviert) darstellt. Beispiel 3: Identifizierung von S012
Der subtraktive Klon S012 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein >5mal stärkeres Signal und somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons S012 ist in SEQ ID NO 15 aufgeführt. Anhand dieser Sequenz konnte S012 eindeutig dem humanen hypothetischen Protein FLJ13448 zugeordnet werden.
Zuerst wurde wie vorstehend beschrieben ein Expressionsmuster für S012 mit den Primern S012.sl (5' GTA TCG GGA GTG GAG GAT TAC A 3' = SEQ ID NO 16) und S012.asl (5' CCC GAG GTA TAT TTG TTT CTG G 3' = SEQ ID NO 17) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt (Expressionsmuster nicht gezeigt) .
Dieses semi-quantitative Expressionsmuster zeigt, dass S012 in BMEC stärker exprimiert ist als in AOEC und bestätigt somit das Ergebnis der differentiellen Hybridisierung. Außerdem ist die Expression in BMEC auch deutlich stärker als in Cortex (Gehirn) , was ein Hinweis auf die Spezifität für BMEC im Gehirn ist. Lediglich im Herzen ist eine starke Expression zu sehen. Die full-length cDNA von porcinem S012/FLJ13448 wurde durch überlappende 5' und 3' RACE-PCR erhalten und ist zusammen mit der Proteinsequenz in SEQ ID NO 18 und SEQ ID NO 19 gezeigt .
Das Expressionsmuster wurde durch Northern-Blot-Analyse verifiziert, als Sonde diente hierbei der full -length Klon FLJ13448/S012 (SEQ ID NO 18) (vgl. Fig. 9).
Im Northern-Blot wird die Spezifität für BMEC noch deutlicher. Diese Expression in BMEC und somit an der BHS ist bisher nicht beschrieben. S012 ist homolog zu dem humanen hypothetischen Protein FLJ13448 und dem entsprechenden Homologon aus Maus (XM_129724). Ein Homologievergleich von humanem, murinem und procinem FLJ13448/S012 ist in Fig. 10 dargestellt. Die Pepti- de, die als Signalpeptide dienen und abgespalten werden, sind jeweils kursiv gedruckt.
Auffällig ist die geringe Konservierung der N-terminalen 60 Aminosäuren bzw. die hohe Homologie des C-Terminus. Wahrscheinlich stellt der N-Terminus ein Signalpeptid dar, das für die korrekte Lokalisation des Proteins in der Zelle verantwortlich ist. Bioinformatische Untersuchungen zeigen eine mitochondriale Lokalisation des Proteins in der Zelle. Die Funktion des Proteins ist dem stark konservierten C-Terminus zuzuordnen.
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von FLJ13448/S012 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH untersucht wie in Beispiel 1 beschrieben (vgl. Fig. 11) .
Diese Daten weisen eindeutig auf eine Rolle von FLJ13448/S012 an der BHS hin. Die starke Expressionsabnahme in kultivierten BMEC spricht dafür, dass FLJ13448/S012 mit dem Differenzierungszustand der Zellen in Zusammenhang steht.
Beispiel : Identifizierung von NSE2
Das Probenmaterial wurde wie vorstehend unter dem Abschnitt „Identifizierung BHS-spezifischer Proteine durch differentiel- le 2D-Gelelektrophorese" beschrieben aufbereitet.
Der differentielle Spot .1.1.0.1.10.37 ergab in der MALDI-TOF- Analyse folgende Peptidmassen: 861,499; 878,47; 975,50; 1056,61; 1132,53; 1198,71; 1216,71; 1227,53; 1347,69; 1430,76; 1438,69; 1516,71; 1623,79; 1790,87; 1796,81; 1935,93; 1954,05; 2081,02; 2231,07; 2375,08; 2577,09; 2613,1.
Durch die Datenbankabfragen mit Profound in der NCBI-Datenbank wurde Spot 1.1.0.1.10.37 als NSE2 identifiziert. Das humane NSE2 hat ein berechnetes Molekulargewicht von 34,5 kDa und einen pl-Wert von 5,4, was beides sehr gut mit der beobachteten Lage des Spots 1.1.0.1.10.37 im 2D-Gel übereinstimmt. Die fettmarkierten, unterstrichenen Peptidmassen konnten als der humanen Sequenz identisch zugeordnet werden. In Fig. 12 ist die Abdeckung der Peptidmassen auf der humanen Proteinsequenz gezeigt.
Zuerst wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für NSE2 mit den Primern ssNSE2.sl (5' CGC GTG GTG AAT GAT CTG TA 3' = SEQ ID NO 20) und ssNSE2.asl (5' CTC CAT GAT CAG GTC CTC CAG 3' = SEQ ID NO 21) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt .
Dieses semi-quantitative Expressionsmuster zeigt, dass die Expression von NSE2 im Herzen am höchs-ten ist, gefolgt von BMEC und Cortex (nicht gezeigt) . Dieses Ergebnis wurde durch Northern-Blot-Analyse bestätigt (vgl. Figur 13). Zur Hybridisierung wurde die partielle cDNA-Sequenz von NSE2 aus Schwein verwendet (SEQ ID NO 22 und SEQ ID NO 23) (partielle CDS 1- 192, codiert C-Terminus), die durch 3'RACE-PCR erhalten wurde.
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von NSE2 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. Das Ergebnis ist in Figur 14 gezeigt. Diese Daten zeigen eine schnelle Abnahme der Expression von NSE2 und weisen somit auf eine Funktion von NSE2 an der BHS hin. Figur 15 zeigt einen Homologie-Vergleich von humanem NSE2 und NSEl.
Potentielle Phosphorilierungsstellen sind in hellem Font dargestellt. Unterstrichen ist eine mögliche Tyrosin- Kinasedomäne (ProSite Pattern Match PS00109), wobei der aktive Rest fett dargestellt ist. Figur 16 zeigt die Verteilung von PEST-Domänen in NSE2. PEST-Sequenzen sind Pro-, Glu-, Ser- und Thr-reich Regione in Proteinen, die für eine kurze Halbwertszeit solcher Proteine in der Zelle verantwortlich sind, indem sie die Ubiquitinilierung dieser Proteine kontrollieren.
Phosphorilierung bestimmter Ser- oder Thr-Reste in den PEST- Regionen (hellgrau) sind für die Erkennung von Prozessierung durch den Ubiquitinproteasomeweg wichtig.
Position 81-163 in humanem NSE2 zeigt Homologien zur NLP/P60- Familie (pfam-Domäne 00877.4), die in mehreren Lipoproteinen gefunden aber der keine Funktion zugeordnet wurde.
Auch dieses Target wurde unter ischämischen Bedingungen untersucht. Dabei zeigt es sich, dass NSE2 in BMEC unter Ischämie in seiner Expression vermindert ist (vgl. Figur 17). Dies spricht für eine Beteiligung von NSE2 bei Krankheiten, die mit ischämischen Zuständen verbunden sind, wie beispielsweise Schlaganfall, Herzinfarkt und tumorassoziierte Zustände, wie beispielsweise bei einem Glioblastom. Das Expressionsmuster von NSE2 kann somit als diagnostischer Marker bei derartigen Erkrankungen verwendet werden. Ferner kann eine ursächliche Therapie an der Modulation der Expression von NSE2 ansetzen.
Beispiel 5 : Identifizierung von DRG-1
Das Probenmaterial wurde wie vorstehend unter dem Abschnitt „Identifizierung BHS-spezifischer Proteine durch differentiel- le 2D-Gelelektrophorese beschrieben" aufbereitet. Der differentielle Spot 1.1.0.1.11.12 ergab in der MALDI-TOF- Analyse folgende Peptidmassen: 789,45; 880,47; 890,50; 948,49; 1204,68; 1217,64; 1289,58; 1428,70; 1517,79; 1573,73; 1753,91; 2017,08.
Durch die Datenbankabfragen mit Profound in der NCBI-Datenbank wurde Spot 1.1.0.1.11.12 als hypothetisches Protein mit der Accession Number CAB66619 identifiziert. Das identische Protein wird in anderen Eintragungen der Datenbank auch als dopami - ne responsive protein DRG-1, als LYST-interacting protein LIP5 und als HSPC228 bezeichnet. Das hypothetische Protein
CAB66619/DRG-1 hat ein berechnetes Molekulargewicht von 33,8 kDa und einen pl-Wert von 6,1, was beides sehr gut mit der beobachteten Lage des Spots 1.1.0.1.11.12 im 2D-Gel übereinstimmt. Die fettmarkierten Peptidmassen konnten als der huma- nen Sequenz identisch zugeordnet werden. In Fig. 18 ist die Abdeckung der Peptidmassen auf der humanen Proteinsequenz gezeigt .
Ein Homologievergleich zwischen Mensch (CAB66619) und Maus (XP_125508) zeigt sehr große Homologien, vor allem im Bereich der AS 1-180. Bioinformatische Ansätze zeigen eine Transmembrandomäne und sprechen dafür, dass der N-Terminus intrazellulär lokalisiert ist. Die intrazelluläre Domäne zeigt eine konservierte Phosphorilierungsstelle, extrazellulär wird in der humanen Sequenz eine Glykosilierungsstelle vorhergesagt (vgl. Fig. 19) .
Zuerst wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für DRG-1 mit dem CAB66619.sl (5' CGA GAC CCT GTG GTG GCT TAT TAC 3' = SEQ ID NO 24) und CAB66619.asl (5' CTG GTG TAT TAG CTG GAG CGT GTG 3' = SEQ ID NO 25) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt. Dieses semi-quantitative Expressionsmuster (Figur 20; das durch Northern-Blot-Analyse bestätigt wurde) zeigt, dass DRG-1 aus Schwein in BMEC schwächer exprimiert ist als in AOEC und widerspricht somit dem Ergebnis des 2D-Gels. Allgemein ist DRG-1 zwar unterschiedlich stark aber recht ubiquitär exprimiert. Somit muss der im 2D-Gel gefundene Unterschied auf eine spezifische posttranslationale Modifikation von DRG-1 in BMEC zurückzuführen sein. Ein solcher Unterschied kann z.B. aufgrund der vorhergesagten Phosphorilierungsstelle auftreten. Zellspezifische Phosphorilierungen können so die Aktivität des Proteins bestimmen.
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von DRG-1 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht (vgl. Figur 21). Diese Daten zeigen eine deutliche Abnahme der Expression von DRG-1 und weisen somit auf eine Funktion von DRG-1 an der BHS hin.
SEQ ID NO 26 + 27 zeigen die partielle cDNA-Sequenz von DRG-1 aus Schwein (CDS1-585, interner Abschnitt) .
Beispiel 6: Identifizierung von TKA-1
Das Probenmaterial wurde wie vorstehend unter dem Abschnitt „Identifizierung BHS-spezifischer Proteine durch differentiel- le 2D-Gelelektrophorese beschrieben" aufbereitet.
Der differentielle Spot 1.1.0.1.6.30 ergab in der MALDI-TOF- Analyse folgende Peptidmassen: 776,44; 847,47; 900,50; 916,46; 976,52; 1048,58; 1085,61; 1127,66; 1137,55; 1167,67; 1180,68; 1212,69; 1234,69; 1291,67; 1301,67; 1303,69; 1338,72; 1350,70 1370,65; 1419,70; 1423,77; 1434,79; 1440,79; 1456,76; 1466,76 1467,71; 1483,77; 1547,78; 1558,85; 1665,90; 1714,96; 1716,90 1740 , 80 ; 1762 , 90 ; 1838 , 92 ; 1897 , 99 ; 2025 , 11 ; 2054 , 06 ; 2234 , 15 ; 2243 ,20 ; 2244 , 18 .
Durch die Datenbankabfragen mit MSFIT in der NCBI-Datenbank wurde Spot 1.1.0.1.6.30 als TKA-1 identifiziert. Die fettmar- kierten, unterstrichenen Peptidmassen konnten als der humanen Sequenz identisch zugeordnet werden. In Fig. 22 ist die Abdeckung der Peptidmassen auf der humanen Proteinsequenz gezeigt.
In der Datenbank sind 3 Isoformen von TKA-1 zu finden, die folgende berechneten Massen und pl-Werte besitzen: CAA90511 mit 49,3 kDa / pl 6,7, BAA33216 mit 37,4 kDa / pl 7,9,
AAB53042 mit 36,2 kDa / pl 8,2. Die Lage im 2D-Gel spricht eindeutig gegen die große Isoform. Somit wurde hier experimentell eindeutig die BAA33216-Isoform gefunden, da in dem Protein mit der Accession-Number AAB53042 das Peptid DGSAWKQΣXPFQ (kursiv in Figur 22) fehlt, das jedoch teilweise (fett) innerhalb eines Trypsin-Fragmentes bei der MALDI-Analyse nachgewiesen wurde.
Das Alignment von TKA-1 zwischen Mensch, Maus und Ratte zeigt eine sehr hohe Konservierung. TKA-1 besitzt zwei PDZ-Domänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. In diesen PDZ-Domänen befinden sich mehrere potentielle Phosphorilie- rungsstellen, wodurch möglicherweise die Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Konserviert ist auch eine potentielle N-Glykosilierungsstelle .
Zuerst wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für TKA-1 mit den Primern ssSLC9A3R2. sl (5' AAA AGG CCC CCA GGG TTA CG 3' = SEQ ID NO 28) und ssSLC9A3R2. asl (5' GGA GTG GGC AGC AGG TGA GC 3' = SEQ ID NO 29) erstellt, als Kontrolle wurde GAPDH benutzt . Das Expressionsmuster wurde durch Northern-Blot-Analyse verifiziert, als Sonde diente hierbei das 550 bp große PCR-Produkt ssTKA-l.ctg zwischen den beiden Primern ssTKA-lctg. sl (5' TTA ACC TGC ACA GCG ACA AGT 3' = SEQ ID NO 30) und ssTKA-lctg . asl (5' TTG CTG AAG ATC TCA CGC TTC 3' = SEQ ID NO 31) .
Der Northern Blot (Figur 23) zeigt, dass TKA-1 in BMEC am stärksten exprimier,t ist sowie dass in BMEC drei verschiedene Transkripte vorkommen. Die Expression ist vergleichbar stark in Lunge, allerdings fehlt hier das kleine Transkript vollkom- men. Bisher ist in der Literatur kein Zusammenhang von TKA-1 zur BHS und auch nicht zu Endothelzellen beschrieben.
Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von TKA-1 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht (vgl. Figur 24). Diese Daten zeigen eine deutliche Abnahme der Expression von TKA-1 und weisen somit auf eine Funktion von TKA-1 an der BHS hin.
Das Target TKA-1 wurde ebenfalls im Hinblick auf seine Expression unter Ischämie gemäß der vorstehend angegebenen Vor- schrift untersucht. Dabei zeigt es sich, dass dieses Target in BMEC unter Ischämie stark in der Expression vermindert ist. Dies spricht für eine funktioneile Beteiligung von TKA-1 an Krankheiten, die mit ischämischen Bedingungen einhergehen, wie beispielsweise Schlaganfall, Herzinfarkt und tumorassoziierte Zustände, zum Beispiel beim Glioblastom. Die Untersuchung der Expression von TKA-1 kann deshalb als diagnostischer Marker bei derartigen Erkrankungen verwendet werden. Ebenso ist das Target TKA-1 ein geeigneter Ansatzpunkt für ursächliche Therapien gegen die oben genannten Erkrankungen.
Das Expressionsmuster von TKA-1 in BMEC unter Ischämie verglichen mit einer Kontrolle ist in Figur 25 gezeigt. BMEC wurden wie im Methodenteil beschrieben einmal unter Ischämie- Bedingungen („Ischämie") und einmal unter Normalbedingungen („Kontrolle") kultiviert. Anschließend wurde die Expression von Targets in beiden Proben relativ zur 18S rRNA gemessen. Der erhaltene Wert wurde für die Kontrolle als 100% gesetzt und die Ischämie-Probe darauf bezogen.
Die Western-Blot-Analyse für TKA-1 bestätigt die Ergebnisse, die auf RNA-Ebene erhalten wurden. In BMEC ist eine starke Expression des Proteins zu erkennen, in AOEC jedoch kaum. Weiterhin zeigt der Western Blot, dass TKA-1 hauptsächlich membranassoziiert und im Zellkern vorkommt. In kultiviertem BMEC nimmt die Expression sehr schnell ab und ist bereits in der ersten Passage nicht mehr zu detektieren. Die Western- Blot-Analyse von TKA-1 ist in Figur 26 gezeigt.
SEQ ID NO 32 und SEQ ID NO 33 zeigen die partielle cDNA-
Sequenz von TKA-1 aus Schwein (partielle CDS 1-741, codiert den C-Terminus) .
Beispiel 7 : Identi izierung von S064/ARL8
Der subtraktive Klon S064 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein >5mal stärkeres Signal und wurde somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons S064 ist als SEQ ID NO 35 aufgeführt. Anhand dieser Sequenz konnte S064 keinem bekannten Gen zugeordnet werden. BLAST-Suchen ergaben eine signifikante Homolo- gie zu dem DKFZ cDNA-Klon p43401317, der jedoch scheinbar keine kodierende Region enthält.
Um das korrespondierende Protein zu identifizieren, wurde mit dem subtraktiven Klon S064 eine cDNA-Bank aus BMEC von Schwein durchmustert. Hierbei wurden zwei unabhängige Klone identifi- ziert. Die Sequenz des längsten Klons S064.3 ist als SEQ ID NO 36 aufgeführt. Auch diese Sequenz konnte durch BLAST-Suchen keinem bekannten Gen zugeordnet werden.
Allerdings konnte die Sequenz von Klon S064.3 durch Homologievergleiche im humanen Genom in der Region 10pl2 lokalisiert werden. Das nächste Gen in der gleichen Orientierung auf diesem Locus ist ADP-ribosylation-like factor 8 (ARL8) . Um zu überprüfen, ob S064 ein neues 3' Ende von ARL8 darstellt, wurde eine link-PCR durchgeführt. Hierzu wurden die Primer hsARLδ.sl (5' TAA TGC AGG GAA AAC CAC CAT TCT 3', SEQ ID NO 37) und S064.3R (5' AAC CAA GAG ACA TGT TGG CAC T 3', SEQ ID NO 38) mit RNA aus BMEC in einer OneStep RT-PCR eingesetzt. Zur Überprüfung der Produktspezifität wurde das Produkt aus der OneStep RT-PCR 1:1000 verdünnt und in eine nested PCR mit den Primern hsARL8. s2 (5' ATA GCA TTG ACA GGG AAC GAC T 3', SEQ ID NO 39) und S064.GSP2 (5' CTG CTA GAT TCA AGT CAT CAT GC 3', SEQ ID NO 40) eingesetzt. Das hierbei erhaltene Produkt wurde kloniert und sequenziert. Die erhaltene Sequenz bestätigte eindeutig, dass der subtraktive Klon S064 das Gen ARL8 repräsentiert.
Die vollständige kodierende cDNA-Sequenz von ARL8 wurde mit Hilfe einer OneStep RT-PCR mit RNA aus BMEC und den Primern S064cds.sl (5' CTC GTG ATG GGG CTG ATC TTC 3', SEQ ID NO 41) und S064cds.asl (5' ATC TCA CAC CAA TCC GGG AGG T 3', SEQ ID NO 42) erhalten. Die kodierende Sequenz ARL8 aus Schwein ist als SEQ ID NO 43 angegeben, das hiervon kodierte Protein ist in SEQ ID NO 44 gezeigt. Das Protein ARL8 ist 100 % identisch zu ARL8 aus Mensch und Maus. Dieser hohe Konservierungsgrad spricht für die wichtige Rolle dieses Proteins. Die cDNA- Sequenz von ARL8 (Schwein) weist 95% bzw. 92% Homologie im kodierenden Bereich zur entsprechenden Sequenz aus Mensch bzw. Maus auf. Es wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für S064 mit den Primern S064.sl (5' AAG CCT GAA GCT TGA TGG ATA A 3', SEQ ID NO 45) und S064.asl (5' CAA TTA CAG CTT TGC TCC TGT G 3', SEQ ID NO 46) erstellt, als Referenz wurde 18Ξ rRNA benutzt. Die beiden Primer S064cds. sl/asl wurden aufgrund der hohen Homologie zwischen Mensch und Schwein (z.B. des Produkts der link-PCR) anhand der humanen Sequenz abgeleitet. Neben den allgemeinen Kriterien des Primerdesigns wurde darauf geachtet, dass die beiden Primer die komplette kodierende Sequenz flan- kieren: so enthält Primer S064cds.sl in Position 7-9 das ATG- Startcodon und die Position 22 in Primer S064cds.asl stellt die erste Base des Stopcodons dar. Das Expressionsmuster ist in Figur 27 gezeigt.
Das Expressionsmuster wurde mit einem anderen Primerpaar aus der kodierenden Region von ARL8 wiederholt: ARLδcds.sl (5' ATA GCA TTG ACA GGG AAC GAC T 3', SEQ ID NO 47) und ARLδcds.asl (5' GAA CTG AGG GTG AGG TAT TTG G 3', SEQ ID NO 48) . Das Expressionsmuster ist in Figur 28 gezeigt.
Weiterhin wurde das Expressionsmuster durch Northern-Blot Analyse verifiziert, als Sonde diente hierbei der Klon S064. Das Ergebnis ist in Figur 29 gezeigt.
Alle drei Experimente zeigen die sehr hohe Spezifität von ARL8 für BMEC und somit für die Blut-Hirn-Schranke. Diese Expression in BMEC bzw. an der BHS ist bisher nicht beschrie- ben. Diese hohe Spezifität weißt auf eine sehr wichtige Rolle von ARL8 an der BHS hin.
Um Hinweise auf die Art der Funktion von ARL8 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. GAPDH untersucht. Das Ergebnis ist in Figur 30 gezeigt. Die Daten zeigen eine schnelle Abnahme der Expression von ARL8 in kultivierten BMEC und weisen somit deutlich auf eine tatsächliche Funktion von ARL8 an der BHS hin.
ARL8 gehört zur RAS-Superfamilie der regulatorischen GTPasen. Diese sind an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt, wie z.B. Zellwachstum, Signaltransduktion, Organisation des Cytoske- letts und Regulation des membrane traffickings (Exo- bzw. Endocytose) . ARL8 wurde erstmals von Sebald et al. 2003 beschrieben, jedoch konnten diese keine Expression im adulten Gehirn zeigen. Das vorliegende Beispiel zeigt erstmalig die tatsächliche Expression von ARL8 an der BHS. Dies bestätigt die hohe BHS-Spezifität dieses Proteins. Daraus ergibt sich, dass ARL8 für den besonderen Differenzierungszustand von Endothelzellen an der BHS verantwortlich ist und somit zur Funktionsfähigkeit der BHS beiträgt.
Beispiel 8 : Identifizierung von 5G9/PNOV1
Der subtraktive Klon 5G9 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein >5mal stärkeres Signal und wurde somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons 5G9 ist als SEQ ID NO 49 aufgeführt.
Anhand dieser Sequenz konnte 5G9 einem humanen Transkript (Nr. BC039195, NCBI-Datenbank) zugeordnet werden, das für ein neues Protein HSNOV1 kodiert (AAH39195) . In diesem Datenbankeintrag, der ein mRNA-Molekül beschreibt, sind als Annotation der offene Leserahmen und das daraus resultierende hypothetische Protein angegeben. Dabei handelt es sich nicht um experimentelle Daten, sondern um Computer-gestützte Vorhersagen. Das abgeleitete Protein zeigte keine Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinen und wurde deshalb als novel protein bezeichnet.
Es wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für 5G9 mit den Primern 5G9.1 (5' TGT ATA TGT GGG ACA GCC ATC A 3', SEQ ID NO 50) und 5G9.1R (5' GTC CGA GCA GGA TAT ACT TCC A 3', SEQ ID NO
51) erstellt, als Referenz wurde 18S rRNA benutzt. Das Primerpaar zur Ermittlung des Expressionsmusters wurde nach den allgemeinen Regeln abgeleitet: Schmelztemperatur der Primer von 55-75°C; annähernd gleiche Schmelztemperatur der beiden Primer; 18-26 Basen Länge; optimal 40-60% GC-Gehalt; Vermeidung von hairpins loops; Vermeidung von Homo- und Heterodimer- bildung; Produktgröße 100-300 bp. Das Expressionsmuster ist in Figur 31 gezeigt.
Das Expressionsmuster zeigt, dass 5G9 vor allem an der BHS, im Colon und der Niere gebildet wird. Im Gehirn scheint die Expression spezifisch für BMEC zu sein. Diese Expression in BMEC bzw. an der BHS ist bisher nicht beschrieben.
Um das korrespondierende Protein aus Schwein zu identifizie- ren, wurde ausgehend von der Sequenz des Klons 5G9 durch 5' und 3' RACE-PCR die vollständige cDNA PNOV1 aus Schwein isoliert (SEQ ID NO 52) . Dieses Transkript kodiert von Position 480-1466 für ein Protein mit der SEQ ID NO 53. Der Homologievergleich zwischen HSNOV1 und PNOV1 ist in Figur 32 gezeigt.
Die Homologie zwischen HSNOV1 und PNOV1 beträgt 94%. Auffällig ist jedoch, dass PNOV1 N-terminal um 47 Aminosäuren verkürzt ist im Vergleich zu HSNOV1. Diese Sequenz stellt in HSNOV1 möglicherweise eine Signalsequenz dar, die später abgespalten wird.
Das Protein HSNOV1 zeigt keine signifikanten Homologien zu anderen bekannten Proteinen. Bioinformatische Analysen zeigen 8 potentielle Transmembrandomänen (vgl. Figur 33).
Außerdem konnten mehrere Domänen (z.B. InterPro-Domäne ipr002657) gefunden werden, die auf eine Funktion als Trans- porter hinweisen. Diese Daten sprechen dafür, dass PNOV1/HSNOV1 einen neuen Transporter an der BHS darstellt, der auch im Colon und in der Niere, zwei Geweben mit hohen Transportaktivitäten für viele Substanzen, vorkommt.
Beispiel 9: Identifizierung von 5E7/TSC-22
Der subtraktive Klon 5E7 zeigte im differentiellen Screen mit der forward probe im Vergleich zur reverse probe ein >5mal stärkeres Signal und wurde somit zur Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenz des Klons 5E7 ist als SEQ ID NO 54 aufgeführt. Anhand dieser Sequenz konnte 5E7 eindeutig als transforming growth factor beta-stimula ted protein TSC-22 identifiziert werden.
Der Klon 5E7 repräsentiert das 3' Ende des Transkriptes TSC- 22. Um die vollständige cDNA aus Schwein zu erhalten, wurde eine 5' RACE-PCR durchgeführt. Das Produkt dieser PCR wurde kloniert und sequenziert. Die vollständige cDNA-Sequenz von TSC-22 aus Schwein ist als SEQ ID NO 55 aufgeführt, die kodierende Region liegt hier von Position 243-677. Das hierzu korrespondierende Protein ist als SEQ ID NO 56 aufgeführt. Das porcine Protein ist 100 % identisch zu dem bereits bekannten humanen Protein TSC-22, was für eine besondere Bedeutung dieses Proteins spricht.
Es wurde wie beschrieben ein Expressionsmuster für 5E7 durch Northern-Blot Analyse erstellt, als Sonde diente hierbei der subtraktive Klon 5E7 (vgl. Figur 34).
Das Experiment zeigt die stärkere Expression von TSC-22 in BMEC im Vergleich zum Gesamthirn und zeigt somit die Spezifität für die Blut-Hirn-Schranke. Diese Expression in BMEC bzw. an der BHS ist bisher nicht beschrieben. Um Hinweise auf eine mögliche Rolle von TSC-22 an der BHS zu erhalten, wurde das Expressionsmuster in kultivierten BMEC im Vergleich zu bekannten BHS-Markern bzw. 18S rRNA untersucht. Für die quantitative PCR wurden die Primer 5E7.1 (5' AAG AGG TGT GGC TTG TCT TTT A 3', SEQ ID NO 57) und 5E7. IR (5' TTT TTC AAA GTA TTC AAC CAG CTC 3', SEQ ID NO 58) benutzt. Das Ergebnis ist in Figur 35 gezeigt.
Die Daten zeigen eine schnelle Abnahme der Expression von TSC- 22 in kultivierten BMEC und weisen somit eindeutig auf eine Rolle von TSC-22 an der BHS hin. Die starke Expressionsabnahme in kultivierten BMEC spricht dafür, dass TSC-22 mit dem Differenzierungszustand der Zellen in Zusammenhang steht.
Auf die gleiche Weise wurde die Expression von TSC-22 in BMEC unter Ischämie untersucht. Das Ergebnis ist in Figur 36 ge- zeigt.
Das Target TSC-22 ist in BMEC unter Ischämie stark in seiner Expression vermindert. Dies belegt eine mögliche funktionelle Rolle von TSC-22 bei Krankheiten, die mit ischämischen Bedingungen verbunden sind. Hierzu gehören Schlaganfall, Herzin- farkt (TSC-22 ist auch im Herzen stark exprimiert, s. Fig. 34) und die Bedingungen in einem Tumor, z.B. beim Glioblastom. Die Untersuchung der Expression von TSC-22 lässt sich deshalb auch als diagnostischer Marker bei diesen Erkrankungen verwenden. Basierend auf diesen Erkenntnissen können Therapiekonzepte gegen Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion der BHS einhergehen, entwickelt werden.
TSC-22 gehört zu der Klasse von Transkriptionsfaktoren mit leucine zipper (Kester et al., 1999). Es ist an der Signaltransduktion u.a. von TGF-beta beteiligt (Kawamata et al., 1998) und spielt somit eine Rolle beim Zellwachstum und der Zelldifferenzierung. Daraus ergibt sich, dass TSC-22 mit für den Differenzierungszustand von BMEC verantwortlich ist.
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS- spezifischen Proteins oder Fragments davon in Hirnkapil- lar-Endothelzellen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man
a) frisch aus dem Gehirn isolierte Hirnkapillar- Endothelzellen durch enzymatischen Aufschluss in üblicher Weise vorreinigt,
b) den in Stufe a) erhaltenen Aufschluss mit einem Lysepuffer behandelt, der vorhandene Erythrozyten und a- poptotische Zellen im Wesentlichen zerstört und wenigstens 70% der Hirnkapillar-Endothelzellen in vitaler Form erhält,
c) gegebenenfalls das in Stufe b) erhaltene Produkt weiter aufreinigt,
d) eine subtraktive cDNA-Bank aus den Hirnkapillar- Endothelzellen und einem Subtraktionsgewebe herstellt,
e) eine cDNA-Subtraktion mittels einer oder mehrerer dif- ferentieller Hybridisierungen durchführt,
f) Klone aus der subtraktiven cDNA-Bank durch differen- tielle Hybridisierung hinsichtlich ihrer jeweiligen Expression verifiziert,
g) zu den BHS-spezifischen Klonen aus der subtraktiven cDNA-Bank die cDNA-Sequenz ergänzt und
h) das Expressionsmuster der untersuchten Klone zwischen frischen und kultivierten Hirnkapillar-Endothelzellen vergleicht und so die Anwesenheit BHS-spezifischer Proteine oder Fragmente davon identifiziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der Lysepuffer in Stufe b) die folgende Zusammensetzung besitzt:
Na+ 30,0 mM bis 60,0 mM
K+ 5, 0 mM bis 7,5 mM
NH4 80,0 mM bis 100,0 mM
Mg2+ 6,0 mM bis 9,0 mM
Cl" 125,0 mM bis 175,0 mM
HC03 " 4,5 mM bis 6,5 mM
H2P04 " 0,5 mM bis 2,5 mM
S04 2" 0,3 mM bis 0, 6 mM
HP04 2" 0,4 mM bis 0,7 mM
Glukose 1,5 mM bis 3,0 mM
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der Lysepuffer die folgende Zu- sammensetzung besitzt: NaCl 30 mM bis 50 mM
KC1 4,5 mM bis 5,5 mM
NH4C1 80 mM bis 100 mM
CaCl2 1,0 mM bis 2,0 mM
MgCl2 0,6 mM bis 0,8 mM
MgS04 0,3 mM bis 0,6 mM
NaHC03 4,5 mM bis 6,5 mM
NaH2P04 0,2 mM bis 0,45 mM
Na2HP04 0,4 mM bis 0,65 mM
KH2P04 0,1 mM bis 0,15 mM
Glucose 1,5 mM bis 3,0 mM
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass das Subtraktionsgewebe in Stufe f) Aortenendothelzellen sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man die vollständige cDNA-Sequenz in Stufe i) durch Durchmustern, von cDNA- Banken und RACE-PCR erstellt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Hirnkapillar- Endothelzellen aus dem Menschen oder dem Schwein stammen,
7. Protein mit BHS-Spezifität oder ein Fragment davon, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Protein nach Anspruch 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass es eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:19, oder SEQ ID NO: 53 besitzt.
9. Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines BHS- spezifischen Proteins oder Fragments davon in Hirnkapil- lar-Endothelzellen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man
a) frisch aus dem Gehirn isolierte Hirnkapillar- Endothelzellen durch enzymatischen Aufschluss in üblicher Weise vorreinigt,
b) den in Stufe a) erhaltenen Aufschluss mit einem Lysepuffer behandelt, der vorhandene Erythrozyten und a- poptotische Zellen im Wesentlichen zerstört und wenigstens 70% der Hirnkapillar-Endothelzellen in vitaler Form erhält,
c) gegebenenfalls das in Stufe b) erhaltene Produkt weiter aufreinigt,
d) das in Stufe c) erhaltene Produkt in einem geeigneten Puffer solubilisiert,
e) eine isoelektrische Fokussierung durchführt,
f) die Proben aus der isoelektrischen Fokussierung in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht auftrennt,
g) differentielle Spots identifiziert und isoliert,
h) mit dem Isolat von g) eine massenspektrometrische Analyse durchführt, und
i) hiervon eine Auswertung mittels gezielter Datenbankanalyse vornimmt.
0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der Lysepuffer in Stufe b) die folgende Zusammensetzung besitzt:
Na+ 30,0 mM bis 60, 0 mM
K+ 5, 0 mM bis 7, 5 mM
NH4 + 80,0 mM bis 100,0 mM
Ca ,22+ 1,0 mM bis 2, 0 mM
Mg .22+ 6,0 mM bis 9,0 mM
Cl" 125,0 mM bis 175,0 mM
HC03 ~ 4, 5 mM bis 6, 5 mM
H2P04 " 0,5 mM bis 2,5 mM
S04 2" 0,3 mM bis 0, 6 mM
HPO4 2" 0,4 mM bis 0,7 mM
Glukose 1,5 mM bis 3,0 mM
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der Lysepuffer die folgende Zusammensetzung besitzt:
NaCl 30 mM bis 50 mM
KC1 4, 5 mM bis 5, 5 mM
NH4CI 80 mM bis 100 mM CaCl2 1,0 mM bis 2,0 mM
MgCl2 0,6 mM bis 0,8 mM
MgS04 0,3 mM bis 0,6 mM
NaHC03 4,5 mM bis 6,5 mM
NaH2P04 0,2 mM bis 0,45 mM
Na2HP0 0,4 mM bis 0,65 mM
KH2P04 0,1 mM bis 0,15 mM
Glucose 1,5 mM bis 3,0 mM
12. Protein mit BHS-Spezifität oder ein Fragment davon, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
13. Protein nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass es eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NO 23, SEQ ID N0:27, SEQ ID NO:33 besitzt.
14. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 7 bis 8 oder 12 bis 13 zur Herstellung eines Medikaments zum Transport von Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke.
15. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 7 bis
8 oder 12 bis 13 zur Herstellung eines Mittels oder Medikaments zur Diagnose oder Therapie von Erkrankungen, die auf einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke beruhen.
16. Mittel zur Diagnose von Erkrankungen, die auf einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke beruhen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass es ein Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 8 oder 12 bis 13 umfasst.
17. Mittel zur Therapie von Erkrankungen, die auf einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke beruhen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass es ein Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 8 oder 12 bis 13 umfasst.
18. Verwendung einer oder mehrerer DNA-Sequenz (en) ausgewählt aus SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, zur Herstellung eines Mittels zur Diagnose von Krankheiten, die mit ischämischen Bedingungen verbunden sind.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Diagnose von Schlaganfall, Herzinfarkt oder tumorassoziierten Zuständen.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnose über die Kontrolle der Expression der von den genannten DNA-Sequenzen codierten Proteine erfolgt.
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