DE60121346T2

DE60121346T2 - Suppressor-Gen

Info

Publication number: DE60121346T2
Application number: DE60121346T
Authority: DE
Inventors: Ludwig Inst. for Cancer Research Xin LU
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2001-08-06
Publication date: 2007-07-19
Also published as: CN1446228A; EP1313762B1; CA2417368A1; PT1313762E; AU7651501A; CN1310942C; EP1710582A2; WO2002012325A2; DK1313762T3; EP1710582A3; CY1106187T1; WO2002012325A3; AU2001276515B2; US20040053262A1; DE60121346T8; DE60121346D1; ATE332309T1; ES2269430T3; JP2004525605A; HK1057377A1

Description

Die Erfindung betrifft Mitglieder einer Genfamilie, welche für Polypeptide codiert, die in der Lage sind, die pro-apoptotische Aktivität von p53 zu inhibieren.
Tumorsuppressorgene codieren für Proteine, welche funktionieren, indem sie das Zeltwachstum oder die Zellteilung inhibieren, und sie sind daher wichtig beim Erhalten der Proliferation, des Wachstums und der Differenzierung von normalen Zellen. Mutationen in Tumorsuppressorgenen resultieren in anomaler Zellzyklusprogression, wobei die normalen Kontrollpunkte des Zellzyklus, welche den Zellzyklus anhalten, beispielsweise wenn DNA zerstört ist, ignoriert werden und beschädigte Zellen sich unkontrollierbar teilen. Die Produkte von Tumorsuppressorgenen funktionieren in allen Teilen der Zelle (z. B. Zelloberfläche, Zytoplasma, Nucleus), um die Passage von beschädigten Zellen durch den Zellzyklus zu verhindern (d. h. G1, S, G2, M und Zytokinese).
Eine Anzahl von Tumorsuppressorgenen wurde isoliert und sequenziert. Diese beinhalten nur beispielsweise das Retinoblastom-Gen (Rb), das, wenn es mutiert ist, mit Krebsarten wie Knochenkrebs (Osteokarzinom), Blasenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs und Brustkrebs ebenso wie mit Retinoblastom in Verbindung gebracht wird, und das Wilms Tumor I-Gen (WT-1), das, wenn es mutiert ist, mit Nephroblastom und Neurofibromatose in Verbindung gebracht wird.
Die Tumorsuppressorgenfamilie, MAD (Mothers against dpp (decapentapelgisches Gen) und MADR (MAD related genes). wurden in einer Anzahl von Spezien identifiziert. Diese Gene codieren für Proteine, die eine Rolle in den Signaltransduktionswegen spielen, die für das Serin/Threoninrezeptorsignalisieren erforderlich sind. MADR1 ist für die Signalbildung im dpp-Weg essentiell. MADR2 ist ein weiteres MADR, und Mutationen in diesem Gen wurden mit Kolorektalkrebs (6 % der sporadischen Kolorektalkrebse) in Verbindung gebracht. Die Sequenz des MADR2-Gens, auch bekannt als Smad2, ist in WO98/07849 offenbart.
Beispielsweise ist das Tumorsuppressorgen, welches der Gegenstand der intensivsten Forschung bisher war, p53. p53 codiert für ein Protein, welches als Transkriptionsfaktor fungiert und welches ein zentraler Regulator des Zellteilungszyklus ist. Es wurde 1978 (Laue und Crawford, 1979) als Protein entdeckt, von dem gezeigt wurde, dass es mit einer Affinität an das große SV40-T-Antigen bindet. Das p53-Gen codiert für ein Polypeptid mit 393 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 53 kDa.
Gene, die durch die transkriptionelle Aktivität von p53 reguliert werden, enthaften eine p53-Erkennungssequenz in ihren 5'-Bereichen. Diese Gene wegen aktiviert, wenn die zellulären Niveaus von p53 beispielsweise wegen eines DNA-Schadens erhöht sind. Beispiele von Genen, welche auf p53 antworten, beinhalten mdm2 (Momand et al., 1992), Bax (Miyashita und Reed, 1995) und PIG-3 (Polyak et al., 1977). Bax und PIG-3 spielen eine Rolle bei einer der wichtigsten Funktionen von p53, der Induktion von Apoptose. Apoptose, oder programmierter Zelltod, ist ein natürlicher Prozess, welcher zerstörte Zellen entfernt. Dies ist bezüglich vieler zellulärer Prozesse wichtig, einschließlich der Entfernung von präkarzinogenen Zellen, der Zell/Gewebe-Entwicklung und der Homöostase.
Wie oben erwähnt, ist eine der wichtigsten Tumorsuppressorfunktionen von p53 dessen Fähigkeit, Apoptose zu induzieren. Die Fähigkeit, die Expression von einigen der pro-apoptotischen Gene wie Bax hochzuregulieren, stellte einen Nachweis zur Verfügung, wie p53 Apoptose induziert. Jedoch ist durch den Vergleich der Bax-Expression in p53(–/–) und p53(+/+) transgenen Mäusen und Wildtypmäusen klar, dass die Expression von Bax, reguliert durch p53, als Reaktion auf einen DNA-Schaden nur in einer limitierten Gewebezahl vorhanden war. Daher verbleibt unklar, warum die Expression von p53 nur die Expression von Bax auf eine zelltypspezifische Art und Weise induzieren kann. Es wurde kürzlich gezeigt, dass eine Mutation in p53 die Promotorspezifität verändern kann. Zwei der tumorabgeleiteten mutierten p53-Gene waren bei der Transaktivierung des Bax-Promotors defekt, aber in der Lage, andere Promotoren der p53-Targetgene, so wie mdm2 und p21waf1, zu transaktivieren. Diese Beobachtungen suggerierten, dass die Fähigkeit, Gene wie Bax zu transaktivieren, sehr wichtig für die Tumorsuppressionsfunktion von p53 ist.
Es ist bekannt, dass p53 Apoptose auf transkriptional abhängigen und auf transkriptional unabhängigen Wegen induzieren kann. Zusätzlich kann p53-induzierte Apoptose durch das Onkogen bcl-2 blockiert werden. Jedoch inhibiert bcl-2 die Transaktivierungsfunktion von p53 nicht. Bis jetzt ist sehr wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, wie bcl-2 p53-induzierte Apoptose inhibiert.
53BP2 ist ein p53-bindendes Protein, das ursprünglich durch Iwabucchi et al. (1994) entdeckt wurde. 53BP2 wurde im Rahmen eines Yeast-2-Hybrid-Screens isoliert, und es wurde gefunden, dass es aus 528 Aminosäuren vom C-Terminus des Proteins besteht. Es enthält eine prolinreiche Sequenz, vier Ankryinwiederholungen und eine SH3-Domäne. Anschließend wurde es als ein Protein definiert, welches mit Bcl-2 interagiert (Naumovski und Cleary, 1996). Eine längere Version dieses Proteins wurde isoliert und bBP2/53BP2 genannt. Basierend auf den in vitro Translationsdaten haben die Autoren (Naumovski und Cleary, 1996) vorhergesagt, dass das bBP2/53BP2-Protein aus 1005 Aminosäuren besteht.
In einem Versuch, zu verstehen, wie die apoptotische Funktion von p53 in vivo reguliert sein könnte, haben wir Antikörper gegen 53BP2 hergestellt und gezeigt, dass in den meisten der getesteten Zellen das Expressionsniveau von 53BP2 niedrig ist. Wir haben ebenso beobachtet, dass das endogene bBP2/53BP2 unerwarteterweise für ein Protein codiert, das größer als die 1005 Aminosäuren ist, die durch Naumovski und Cleary vorhergesagt wurden. Dieses Protein wird ASP-2 oder ASP-2/53BP genannt.
Wir haben gezeigt, dass die C-terminale Hälfte von bBP2/53BP2 keinen signifikanten Einfluss auf die p53-Aktivität hat. Jedoch stimulierte ASP-2/53BP die Transaktivierungsfunktion von p53. Am interessantesten ist, dass ASP-2/53BP spezifisch die Transaktivierungsfunktion von p53 auf die Promotoren erhöhen kann, die von pro-Apoptose-bezogenen Genen, so wie Bax und PIG-3, abgeleitet sind.
Unter Verwendung der cDNA-Sequenz von ASP-2 haben wir eine BLAST-Suche ausgeführt und einen Klon identifiziert, der KIAA0771 benannt wurde, der eine signifikante Homologie zu der Nucleinsäuresequenz aufweist, die für bBP2/53BP2 codiert, was suggeriert, dass die neu identifizierte Sequenz ein Mitglied einer Genfamilie ist, welche für Apoptose-stimulierende Proteine (ASPs) codiert. Dieses Familienmitglied wird ASP-1 genannt.
Wir haben die neue Nucleinsäuresequenz ASP-1 (Apoptose-stimulierendes Protein 1) genannt, welche für ein Polypeptid codiert, welches eine Sequenzhomologie zu bBP2/53BP2 aufweist.
Wir haben einen Regulator von ASP-2 identifiziert, welcher den p53-stimulierenden Effekt von ASP-2 inhibiert. Wir haben diesen Regulator I-ASP genannt. I-ASP wurde im Stand der Technik als RAI (Rel1A-assoziierter Inhibitor) (Yang, J.P. et al., JBC 274: 155662 (1999) und in WO 0032628 als ein Inhibitor von NF-αB offenbart. Wir haben herausgefunden, dass in Tumoren, die ASP-1 und ASP-2 exprimieren, die Expression von I-ASP verglichen mit den angepassten normalen Kontrollen hochreguliert ist. Dies suggeriert, dass die Tumorsuppressionsfunktion von p53 positiv und negativ durch ASP und I-ASP in vivo reguliert sein könnte.
Im Folgenden betrifft der Ausdruck "Polypeptid der Erfindung" I-ASP.
Der Umfang der Erfindung wird ausschließlich durch die Ansprüche definiert, die Beschreibung hat lediglich einen illustrativen Zweck.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Antikörper oder ein bindendes Teil davon zur Verfügung gestellt, das an wenigstens einen Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist dieses bindende Teil ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: F(ab')₂-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmenten, Antikörpern, die CDR3-Bereiche umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper humanisiert.
Alternativ ist der Antikörper ein chimärer Antikörper, hergestellt durch rekombinante Verfahren, sein, so dass er einen variablen Bereich des Antikörpers mit einem invarianten oder konstanten Bereich eines humanen Antikörpers enthält.
Chimäre Antikörper sind rekombinante Antikörper, bei denen alle der V-Bereiche eines Maus- oder Rattenantikörpers mit humanen Antikörper-C-Bereichen kombiniert sind. Humanisierte Antikörper sind rekombinante Hybridantikörper, welche die komplimentaritätsbestimmenden Bereiche eines V-Bereiches eines Nagetierantikörpers mit den Rahmenbereichen der V-Bereiche eines humanen Antikörpers verbinden. Die C-Bereiche des humanen Antikörpers werden ebenso verwendet. Die komplimentaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) sind Bereiche innerhalb der N-terminalen Domäne von sowohl der schweren als auch der leichten Kette des Antikörpers, auf die die Mehrzahl der Variation der V-Bereiche begrenzt ist. Diese Bereiche bilden Loops an der Oberfläche des Antikörpermoleküls. Diese Loops stellen die bindende Oberfläche zwischen dem Antikörper und dem Antigen zur Verfügung.
Die Produktion von Antikörpern ist im Stand der Technik gut bekannt. Verschiedene Laborlehrbücher sind für den Durchschnittsfachmann erhältlich. Beispielsweise Antibodies, Lane & Harlow, Cold Spring Harbour Laboratories.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Expression von mRNA und/oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um nach Mitteln zu screenen, die in der Lage sind, die Aktivität des Polypeptids der Erfindung zu modulieren, umfassend:

i) Zur-Verfügung-Stellen einer Zelle oder einer Zelllinie, welche das Polypeptid der Erfindung exprimiert;
ii) Exponieren der Zelle gegenüber wenigstens einem Mittel, das getestet werden soll; und
iii) Aufzeichnen der Wirkungen des Mittels oder der Mittel auf die Aktivität des Polypeptids.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um nach Mitteln zu suchen, die in der Lage sind, die Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu modulieren, umfassend:

i) Zur-Verfügung-Stellen von wenigstens einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung;
ii) Exponieren des Polypeptids gegenüber wenigstens einem Mittel, das getestet werden soll; und
iii) Aufzeichnen des Bindens des Mittels oder der Mittel an das Polypeptid.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Mittel ein Antagonist, welcher die Aktivität des Polypeptids gemäß der Erfindung inhibiert. Vorzugsweise ist das Mittel ein Polypeptid.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Antisense-Nucleinsäuremolekül zur Verfügung gestellt, wobei das Molekül die Antisense-Sequenz der Sense-Sequenz der Erfindung umfasst. Vorzugsweise umfasst das Antisense-Nucleinsäuremolekül die Antisense-Sequenz der Sense-Sequenz, die in 2 dargestellt ist, oder einen Teil davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Antisense-Molekül gemäß der Erfindung umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Antisense-Nucleinsäure mit wenigstens einem chemotherapeutischen Mittel kombiniert. Vorzugsweise ist das Mittel ein Antikrebsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cisplatin; Carboplatin; Cyclosphosphamid; Melphalan; Carmuslin; Methotrexat; 5-Fluorouracil, Cytarabin; Mercaptopurin; Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; Vinblastin; Vincristin; Dactinomycin; Mitomycin C; Taxol; L-Asparaginase; G-CSF; ein Enediyn wie Chalicheamicin oder Esperamicin; Chlorambucil; ARA-C, Vindesin; Bleomycin; und Etoposid. Andere Mittel, die mit den vorangehenden kombiniert werden können, beinhalten Mittel, die auf die Tumorneovaskulatur oder auf die Tumorimmunomodulatoren einwirken. Vorzugsweise ist das Mittel, das auf die Tumorneovaskulatur einwirkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Combrestatin 4, Angiostatin und Endostatin. Vorzugsweise ist der Immunomodulator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-Interferon, γ-Interferon und Tumornekrosefaktor alpha (TNFα).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Mittel Cisplatin.
Die Erfindung beinhaltet somit die Detektion von I-ASP-Polypeptiden, Genen, die für I-ASP codieren, funktionale Modifikationen und Varianten der Vorangegangenen, nützliche Fragmente der Vorangegangenen ebenso wie Therapeutika, die damit in Verbindung stehen. Die Expression dieser Gene bewirkt die Apoptose durch Binden an p53 und verwandte Polypeptide.
Wie hierin in Bezug auf Nucleinsäuren verwendet, bedeutet der Begriff "isoliert": (i) amplifiziert in vitro durch beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR); (ii) rekombinant produziert durch Klonieren; (iii) aufgereinigt, wie durch Spaltung und Geltrennung; oder (iv) synthetisiert durch beispielsweise chemische Synthese. Eine isolierte Nucleinsäure ist eine Nucleinsäure, welche durch rekombinante DNA-Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, leicht manipulierbar ist. Somit wird eine Nucleotidsequenz, die in einem Vektor enthalten ist, in welchem 5'- und 3'-Restriktionsorte bekannt sind oder für welchen Polymerasekettenreaktion (PCR)-Primersequenzen offenbart wurden, als isoliert angesehen, aber eine Nucleinsäuresequenz, die in ihrem nativen Stadium in ihrem natürlichen Wirt existiert, wird nicht als isoliert angesehen. Eine isolierte Nucleinsäure kann im Wesentlichen aufgereinigt sein, sie muss es aber nicht. Beispielsweise ist eine Nucleinsäure, die innerhalb eines Klonierungsvektors oder eines Expressionsvektors isoliert ist, nicht rein in der Hinsicht, dass sie nur einen geringen Prozentsatz des Materials in der Zelle enthalten könnte, in welcher sie sich befindet. Solch eine Nucleinsäure ist jedoch isoliert nach dem Begriff, wie er hierin verwendet wird, da sie leicht durch Standardtechniken, die Fachleuten bekannt sind, manipulierbar ist. Eine isolierte Nucleinsäure, wie sie hierin verwendet wird, ist nicht ein natürlich auftretendes Chromosom.
Wie hierin mit Bezug auf Polypeptide verwendet, bedeutet "isoliert" getrennt von dessen natürlicher Umgebung und vorhanden in einer ausreichenden Menge, um dessen Identifizierung oder Verwendung zu erlauben. Isolieren unter Bezugnahme auf ein Protein oder Polypeptid bedeutet beispielsweise: (i) selektiv produziert durch Expressionsklonieren oder (ii) aufgereinigt, wie durch Chromatorgraphie oder Elektrophorese. Isolierte Proteine oder Polypeptide können, aber müssen nicht im Wesentlichen rein sein. Der Begriff "im Wesentlichen rein" bedeutet, dass die Proteine oder Polypeptide im Wesentlichen frei von anderen Substanzen sind, mit welchen sie in der Natur oder in in vivo-Systemen gefunden werden in einem Ausmaß, das praktisch und angemessen für deren vorgesehende Verwendung ist. Im Wesentlichen reine Polypeptide können durch Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Da ein isoliertes Protein mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer pharmazeutischen Präparation vermischt sein kann, kann das Protein nur einen kleinen Gewichtsprozentsatz der Präparation umfassen. Das Protein ist nichtsdestotrotz dahingehend isoliert, dass es von den Substanzen getrennt worden ist, mit welchen es in lebenden Systemen assoziiert sein könnte, d. h. isoliert von anderen Proteinen.
Ein Aspekt der Erfindung sind diejenigen Nucleinsäuresequenzen, welche für I-ASP-Polypeptide codieren und welche mit einem Nucleinsäuremolekül wie hierin vorgesehen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "stringente Bedingungen", wie hierin verwendet, meint Parameter, mit welchen der Stand der Technik vertraut ist. Nucleinsäurehybridisierungsparameter können in Referenzen gefunden werden, welche solche Verfahren zusammenfassen, z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, oder Current kProtocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York. Insbesondere meinen stringente Bedingungen, wie hierin verwendet, beispielsweise eine Hybridisierung bei 65 °C in einem Hybridisierungspufter (3,5 × SSC, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % Bovines Serum Albumin, 2,5 mM NaH₂PO₄ (pH 7), 0,5 % SDS, 2 mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH 7; SDS ist Natriumdodecylsulfat; und EDTA ist Ethylendiamintetraessigsäure. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf welche DNA transferiert wird, mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen und dann mit 0,1-0,5 × SSC/0,1 × SDS bei Temperaturen bis zu 68 °C gewaschen.
Es gibt andere Bedingungen, Reagenzien usw., welche verwendet werden können, welche in einem ähnlichen Grad der Stringenz resultieren. Der begabte Fachmann wird mit solchen Bedingungen vertraut sein, und daher sind sie hier nicht angegeben. Es wird jedoch verstanden werden, dass der begabte Fachmann in der Lage ist, die Bedingungen auf eine Art und Weise zu manipulieren, dass sie die klare Identifizierung von Homologen und Allelen von I-ASP-Nucleinsäuren erlauben. Der begabte Fachmann ist ebenso mit der Methodologie zum Screenen von Zellen und Bibliotheken für die Expression solcher Moleküle vertraut, welche dann routinegemäß isoliert werden, gefolgt durch die Isolation von pertinenten Nucleinsäuremolekülen und durch Sequenzieren.
Im Allgemeinen teilen Homologe und Allele typischerweise wenigstens 90 % Nucleotididentität und/oder wenigstens 95 % Aminosäureidentität zu den offenbarten Nucleotid- bzw: Aminosäuresequenzen, in einigen Fällen werden sie wenigstens 95 % Nucleotididentität und/oder wenigstens 97 % Aminosäureidentität teilen und in anderen Fällen werden sie wenigstens 98 % Nucleotididentität und/oder wenigstens 99 % Aminosäureidentität teilen. Die Homologie kann unter Verwendung von verschiedenen öffentlich erhältlichen Software-Werkzeugen errechnet werden, entwickelt durch NCBI (Bethesda, Maryland), die aus dem Internet erhalten werden können (ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/).
Beispielhafte Werkzeuge beinhalten das BLAST-System, das auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov erhältlich ist, vorzugsweise unter Verwendung von Default-Einstellungen. Paarweise und ClustalW-Alignments (BLOSUM30 Matrix-Einstellung) ebenso wie Kyle-Doolittle hydropathische Analyse kann unter Verwendung der MacVector Sequenzanalysesoftware (Oxford Molecular Group) erhältlich sein. Watson-Crick Komplemente der vorangehenden Nucleinsäuren sind ebenso durch die Erfindung umfasst.
Beim Screenen nach Nucleinsäuren, die für I-ASP-Proteine codieren, mit einer Sequenzhomologie zu den Nucleinsäuren, die hierin beschrieben sind, kann ein Southern Blot unter Verwendung der vorangehenden Bedingungen, gemeinsam mit einer detektierbaren Sonde (z. B. radioaktiv, chemilumineszent) ausgeführt werden. Nach dem Waschen der Membran, auf welche die DNA schließlich übertragen wird, kann das Sondensignal detektiert werden, so wie durch Anordnen der Membran gegenüber einem Röntgenfilm oder gegenüber Phosphorimagerplatten, um das radioaktive Signal zu detektieren, oder durch Weiterverarbeiten der Membran, um das chemilumineszente Signal zu detektieren.
Die Erfindung beinhaltet ebenso degenerierte Nucleinsäuren, welche alternative Codons zu denen enthalten, die in den nativen Materialien vorhanden sind. Beispielsweise wird für Serinreste durch die Codons TCA, AGT, TCC, TCG, TCT und AGC codiert. Jedes der sechs Codons ist äquivalent für den Zweck des Codierens für einen Serinrest. Somit wird es für Fachleute offensichtlich sein, dass jedes der Nucleotidtripletts, die für Serin codieren, verwendet werden kann, um den Proteinsyntheseapparat in vitro oder in vivo so zu dirigieren, dass er einen Serinrest in ein elongierendes Polypeptid einbaut. Auf ähnliche Art und Weise sind Nucleotidsequenztripletts, welche für andere Aminosäurereste codieren, die Folgenden, sind aber nicht hierauf limitiert: CCA, CCC, CCG und CCT (Prolincodons); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA und AGG (Arginincodons); ACA, ACC, ACG und ACT (Threonincodons); AAC und AAT (Asparagincodons); und ATA, ATC und ATT (Isoleucincodons). Andere Aminosäurereste können auf ähnliche Weise durch verschiedene Nucleotidsequenzen codiert werden. Somit umfasst die Erfindung degenerierte Nucleinsäuren, die von den biologisch isolierten Nucleinsäuren in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes differieren.
Die Erfindung stellt ebenso modifizierte Nucleinsäuremoleküle oder Polypeptide zur Verfügung, welche Hinzufügungen, Substitutionen und Deletionen von einem oder mehreren Nucleotiden oder Aminosäuren enthalten. Wie hierin verwendet, bedeutet "eins oder mehr" 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr bis zu einer Anzahl, die die Funktion des Moleküls für diejenigen Moleküle nicht wesentlich verändert, von denen gewünscht ist, dass die Funktion im Wesentlichen ähnlich zu der Funktion der ursprünglichen Nucleinsäure oder des ursprünglichen Polypeptids ist. Eine wesentliche Funktionsveränderung wäre beispielsweise ein dominant negatives Protein oder ein Protein, das eine seiner Funktionen verloren hat.
In bevorzugten Ausführungsformen bleiben diesen modifizierten Nucleinsäuremolekülen und/oder den Polypeptiden, für die sie codieren, wenigstens eine Aktivität oder Funktion des unmodifizierten Nucleinsäuremoleküls und/oder des Polypeptids, so wie p53-Bindung, Antigenizität, transkriptionale Aktivität usw. erhalten. In gewissen Ausführungsformen codiert das modifizierte Nucleinsäuremolekül für modifizierte Polypeptide, vorzugsweise für Polypeptide mit konservativen Aminosäuresubstitutionen, wie an anderer Stelle hierin beschrieben. Die modifizierten Nucleinsäuremoleküle sind strukturell mit den unmodifizierten Nucleinsäuremolekülen verwandt, und in bevorzugten Ausführungsformen sind sie ausreichend strukturell mit den unmodifizierten Nucleinsäuremolekülen verwandt, so dass die modifzierten und unmodifizierten Nucleinsäuremoleküle unter hochstringenten Bedingungen, die Fachleuten bekannt sind, hybridisieren.
Beispielsweise können modifizierte Nucleinsäuremoleküle, die für Polypeptide codieren, die einzelne Aminosäureveränderungen aufweisen, hergestellt werden. Jedes dieser Nucleinsäuremoleküle kann ein, zwei oder drei Nucleotidsubstitutionen außer den Nucleotidveränderungen haben, die der Degeneriertheit des genetischen Codes, wie hierin beschrieben, entsprechen. Auf ähnliche Art und Weise können modifizierte Nucleinsäuremoleküle hergestellt werden, die beispielsweise 2-6 Nucleotidveränderungen haben, die für Polypeptide codieren, welche zwei. Aminosäureveränderungen aufweisen. Viele modifizierte Nucleinsäuremoleküle wie diese sind durch den Fachmann leicht vorstellbar, einschließlich beispielsweise Substitutionen von Nucleotiden in Codons, die für Aminosäuren 2 und 3, 2 und 4, 2 und 5, 2 und 6 usw. codieren. In dem vorangehenden Beispiel ist jede Kombination von zwei Aminosäuren in dem Satz an modifizierten Nucleinsäuremolekülen enthalten, ebenso wie alle Nucleotidsubstitutionen, welche für die Aminosäuresubstituionen codieren. Zusätzliche Nucleinsäuremoleküle, die für Polypeptide codieren, die zusätzliche Substitutionen (d. h. 3 oder mehr), Additionen oder Deletionen (z. B. durch Einführung eines Stoppcodons oder eines Spleißorts oder von Spleißorten) haben, können ebenso hergestellt werden und sind durch die Erfindung umfasst, wie für den Fachmann leicht vorstellbar ist. Jegliche der vorangehenden Nucleinsäuren oder Polypeptide können durch Routineexperimente hinsichtlich der Erhaltung der strukturellen Verwandtschaft oder der Aktivität gegenüber den Nucleinsäuren und/oder Polypeptiden getestet werden, die hierin offenbart sind.
Die Erfindung stellt ebenso isolierte Fragmente von I-ASP oder von komplementären Sequenzen davon mit einer ausreichenden Länge zur Verfügung, so dass sie eine Sequenz darstellen, die innerhalb des humanen Genoms einzigartig ist, und das Identifizieren einer Nucleinsäure, die für I-ASP-Polypeptide codiert. Diese Fragmente können als einzigartig dahingehend angesehen werden, dass ein einzigartiges Fragment eines ist, das eine "Signatur" der längeren Nucleinsäure darstellt. Ein einzigartiges Fragment ist beispielsweise lang genug, um sicherzustellen, dass dessen präzise Sequenz nicht in Molekülen außerhalb der I-ASP-Nucleinsäuren, die oben definiert wurden, gefunden wird, d. h. dass es spezifisch die I-ASP-Sequenzen identifiziert. Ein einzigartiges Fragment beinhaltet eine Sequenz aus kontinuierlichen Nucleotiden, welche nicht zu irgendeiner Sequenz identisch ist, die in öffentlich erhältlichen Datenbanken (z. B. GenBank) am Anmeldetag dieser Anmeldung vorhanden ist, auch wenn gewisse Fragmente als ein Teil des Fragments einige vorher bekannte Sequenzen, die in der GenBank hinterlegt wurden, enthalten können. Auf ähnliche Weise können Komplementäre von öffentlich bekannten Sequenzen und Fragmente der öffentlich bekannten Sequenzen und Komplementäre davon einen Teil, aber nicht die Gesamtheit der einzigartigen Fragmente von I-ASP darstellen. Somit schließt ein einzigartiges Fragment per Definition Sequenzen aus, die ausschließlich aus EST und/oder Gensequenzen bestehen, die in öffentlich erhältlichen Datenbanken am Anmeldetag der Sequenzen, die in dieser Anmeldung enthalten sind, hinterlegt wurden. Somit muss ein einzigartiges Fragment eine Nucleotidsequenz enthalten, die sich von der exakten Sequenz von Sequenzen in der GenBank oder von Fragmenten davon unterscheidet. Der Unterschied kann eine Hinzufügung, eine Deletion oder eine Substitution bezüglich der GenBank-Sequenz sein, oder es kann eine Sequenz sein, die von der GenBank-Sequenz vollständig verschieden ist.
Fragmente von I-ASP-Nucleinsäuremolekülen, einschließlich einzigartigen Fragmenten, können als Sonden für Hybridisierungsblotassays verwendet werden (z. B. Southern, Northern), um solche Nucleinsäuren in Nucleaseprotektionsassays zu identifizieren, um die Transkription zu messen, oder können in Amplifikationsassays verwendet werden, wie in solchen, die PCR verwenden. Wie Fachleuten bekannt ist, sind große Sonden, so wie Sonden aus 200, 250, 300 oder mehr Nucleotiden, für gewisse Verwendungen wie Southern oder Northern Blots bevorzugt, während kleinere Fragmente für solche Verwendungen wie PCR bevorzugt sind. Fragmente können ebenso verwendet werden, um Fusionsproteine zur Herstellung von Antikörpern herzustellen oder um das Binden der Polypeptidfragmente zu bestimmen oder um Immunoassaybestandteile herzustellen. Auf ähnliche Weise können Fragmente verwendet werden, um nicht-fusionierte Fragmente der I-ASP-Polypeptide, wie N-terminale oder C-terminale Fragmente, oder die verschiedenen Proteindomänen, die hierin offenbart sind, herzustellen, die beispielsweise bei der Herstellung von Antikörpern, in Immunoassays und als kompetitive Bindepartner von I-ASP-Polypeptiden und/oder anderen Polypeptiden, welche an p53- oder rel-Polypeptide beispielsweise in therapeutischen Anwendungen binden, nützlich sind. Die Fragmente können weiter als Antisense-Moleküle, wie hierin beschrieben, verwendet werden, um die Expression von I-ASP-Nucleinsäuren und Polypeptiden zu inhibieren, insbesondere für therapeutische Zwecke, wie genauer hierin beschrieben ist.
Wie durch Fachleute anerkannt werden wird, wird die Größe des einzigartigen Fragments von dessen Konservierung im genetischen Code abhängen. Somit werden einige Bereiche der I-ASP-Nucleinsäuremoleküle und deren Komplementäre längere Segmente erfordern, um einzigartig zu sein, während andere nur kurze Segmente erfordern werden, typischerweise zwischen 12 und 32 Nucleotiden (z. B. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 und 32 Basen lang). Diese Offenbarung sieht vor, jedes und alle Fragmente von jeder Sequenz zu umfassen, beginnend mit dem ersten Nucleotid, dem zweiten Nucleotid usw. bis zu 8 Nucleotiden vor dem Ende und endend irgendwo ab dem Nucleotid 8, 9, 10 usw. für jede Sequenz, bis zum letzten Nucleotid (vorausgesetzt, dass die Sequenz wie oben beschrieben einzigartig ist). Viele Segmente der I-ASP-Nucleinsäuren oder Komplementäre davon, die 25 oder mehr Nucleotide lang sind, werden. einzigartig sein. Fachleute sind sehr gut in Verfahren versiert, die verwendet werden können, um solche Sequenzen auszuwählen, typischerweise auf der Basis der Fähigkeit des einzigartigen Fragments, selektiv die Sequenz von Interesse von Nicht-I-ASP-Nucleinsäuren zu unterscheiden. Ein Sequenzvergleich des Fragments mit denjenigen auf bekannten Datenbanken ist typischerweise alles, was erforderlich ist, auch wenn zur Bestätigung eine in vitro-Hybridisierung und eine Sequenzierungsanalyse ausgeführt werden kann.
Ein Fragment kann ein funktionales Fragment sein. Ein funktionales Fragment eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung ist ein Fragment, welches einige funktionale Eigenschaften des größeren Nucleinsäuremoleküls beibehält, so wie das Codieren für ein funktionales Polypeptid, das Binden an Proteine (z. B. p53), das Regulieren der Transkription von operativ verbundenen Nucleinsäuren, das Codieren für immunologisch erkannte Epitope und Ähnliches. Durchschnittsfachleute können unter Verwendung der Assays, die hierin beschrieben sind, und unter Verwendung von Assays, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmen, ob ein Fragment ein funktionales Fragment eines Nucleinsäuremoleküls ist, ohne von der Verwendung von Routineexperimenten abzuweichen.
Wie oben erwähnt, umfasst die Erfindung Antisense-Oligonucleotide, die selektiv an ein Nucleinsäuremolekül binden, das für ein I-ASP-Polypeptid codiert, um beispielsweise das p53-Binden, die transkriptionale Aktivität oder die Apoptose zu modulieren. Dies ist bei fast sämtlichen medizinischen Umständen wünschenswert, wo eine Modulation der p53-Aktivität wünschenswert ist, so wie bei Krebs und bei Zuständen, die aberrante Apoptose beinhalten.
Wie hierin verwendet, beschreibt der Begriff "Antisense-Oligonucleotid" oder "Antisense" ein Oligonucleotid, das ein Oligoribonucleotid, ein Oligodeoxyribonucleotid, ein modifiziertes Oligoribonucleotid oder ein modifiziertes Oligodeoxyribonucleotid ist, welches unter physiologischen Bedingungen mit DNA, die ein bestimmtes Gen enthält, oder an ein mRNA-Transkript des Gens hybridisiert und dadurch die Transkription des Gens und/oder die Translation der mRNA inhibiert. Die Antisense-Moleküle sind so entworfen, dass sie mit der Transkription oder Translation eines Zielgens nach der Hybridisierung mit dem Zielgen oder dem Transkript interferieren. Fachleute werden erkennen, dass die genaue Länge des Antisense-Oligonucleotids und dessen Grad an Komplementarität mit seinem Ziel von dem Ziel abhängen, das spezifisch ausgewählt wurde, einschließlich der Sequenz des Ziels und der bestimmten Basen, welche die Sequenz umfassen. Es ist bevorzugt, dass das Antisense-Oligonucleotid so konstruiert und arrangiert ist, dass es selektiv an das Target unter physiologischen Bedingungen bindet, d. h. wesentlich mehr mit der Zielsequenz hybridisiert als mit jeglicher anderen Sequenz in der Zielzelle unter physiologischen Bedingungen. Basierend auf den I-ASP-Nucleinsäuresequenzen, die hierin zur Verfügung gestellt sind, oder auf allelischen oder homologen genomischen und/oder cDNA-Sequenzen können Fachleute leicht eines aus einer Anzahl von geeigneten Antisense-Molekülen für die erfindungsgemäße Verwendung auswählen und synthetisieren. Beispielsweise kann ein "Gen-Walk", umfassend eine Serie von Oligonucleotiden von 15-30 Nucleotiden, die die Länge einer I-ASP-Nucleinsäure überspannt, hergestellt werden, gefolgt durch Testen der Inhibierung der entsprechenden I-ASP-Expression. Optional können Lücken von 5-10 Nucleotiden zwischen den Oligonucleotiden belassen werden, um die Anzahl der synthetisierten und getesteten Oligonucleotide zu reduzieren.
Um ausreichend selektiv und potent für die Inhibierung zu sein, sollten solche Antisense-Oligonucleotide wenigstens 10 und mehr bevorzugt wenigstens 15 aufeinander abfolgende Basen umfassen, welche komplementär zum Target sind, auch wenn in gewissen Fällen modifizierte Oligonucleotide, die so kurz wie 7 Basen lang sind, als Antisense-Oligonucleotide erfolgreich verwendet wurden (Wagner et al., Natrue Biotechnol. 14:840-844, 1996). Am meisten bevorzugt umfassen die Antisense-Oligonucleotide eine komplementäre Sequenz von 20-30 Basen. Auch wenn Oligonucleotide ausgewählt werden können, welche antisense zu einem Bereich des Gens oder zu mRNA-Transkripten sind, entsprechen die Antisense-Oligonucleotide in bevorzugten Ausführungsformen den N-terminalen oder 5'-Upstream-Orten, so wie der Translationsinitiierung, der Transkriptionsinitiierung oder den Promotororten. Zusätzlich können 3'-untranslatierte Bereiche als Ziel ausgewählt werden. mRNA-Spleißorte wurden ebenso als Zielorte im Stand der Technik verwendet, aber sie könnten weniger bevorzugt sein, wenn alternatives mRNA-Spleißen auftritt. Zusätzlich wird die Antisense vorzugsweise auf Orte gerichtet, in welchen keine mRNA-Sekundärstrukturen erwartet wird (siehe z. B. Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-357, 1994) und von welchen erwartet wird, dass Proteine nicht an sie binden. Schließlich, auch wenn die I-ASP cDNA-Sequenzen hierin offenbart sind, können Fachleute leicht die genomische DNA ableiten, die diesen cDNAs entspricht. Somit stellt die vorliegende Erfindung ebenso Antisense-Oligonucleotide zur Verfügung, welche komplementär zu I-ASP-genomischer DNA sind. Auf ähnliche Art und Weise werden Antisense-Moleküle zu allelischen oder homologen cDNAs und genomischen DNAs dem Fachmann ohne unangemessenes Herumexperimentieren zugänglich gemacht.
In einem Satz an Ausführungsformen können die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung aus "natürlichen" Deoxyribonucleotiden, Ribonucleotiden oder jeglicher Kombination daraus bestehen. Das heißt, das 5'-Ende eines nativen Nucleotids und das 3'-Ende eines anderen nativen Nucleotids können, wie in natürlichen Systemen, über eine Phosphodiesterinternucleosidverbindung, kovalent verbunden sein. Diese Oligonucleotide können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, welche manuell oder durch einen automatisierten Synthetisierer ausgeführt werden können. Sie können ebenso rekombinant durch Vektoren hergestellt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen können die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung ebenso "modifizierte" Oligonucleotide enthalten. Das heißt, die Oligonucleotide können auf eine Vielzahl von Arten modifiziert sein, welche sie nicht daran hindern, an ihr Ziel zu hybridisieren, aber welche ihre Stabilität oder das Targeting verstärken oder welche auf andere Weise ihre therapeutische Wirksamkeit erhöhen.
Der Begriff "modifiziertes Oligonucleotid", wie hierin verwendet, beschreibt ein Oligonucleotid, in welchem (1) zwei von dessen Nucleotiden kovalent über eine synthetische Internucleosidverbrückung verbunden sind (d. h. eine Bindung außer der Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Ende von einem Nucleotid und dem 3'-Ende eines weiteren Nucleotids) und/oder (2) eine chemische Gruppe, die normalerweise nicht mit Nucleinsäuren in Verbindung steht, kovalent mit dem Oligonucleotid verbunden ist. Bevorzugte synthetische Internucleosidverbindungen sind Phosphorthioate, Alkylphosphonate, Phosphordithioate, Phosphatester, Alkylphosphorthioate, Phosphoramidate, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamidate, Carboxymethylester und Peptide.
Der Begriff "modifiziertes Oligonucleotid" umfasst ebenso Oligonucleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder einem kovalent modifizierten Zucker. Beispielsweise beinhalten modifizierte Oligonucleotide Oligonucleotide mit Backbone-Zuckern, welche kovalent an organische Gruppen mit niedrigem Molekulargewicht außer einer Hydroxylgruppe an der 3'-Position und außer einer Phosphatgruppe an der 5'-Position gebunden sind. Somit können modifizierte Oligonucleotide eine 2'-O-alkylierte Ribosegruppe enthalten. Zusätzlich können modifizierte Oligonucleotide Zucker enthalten, so wie Arabinose anstelle von Ribose. Die vorliegende Erfindung umfasst somit pharmazeutische Präparationen, die modifizierte Antisense-Moleküle enthalten, die komplementär zu und hybridisierbar mit Nucleinsäuren, die für I-ASP-Polypeptide codieren, unter physiologischen Bedingungen sind gemeinsam mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern.
Antisense-Oligonucleotide können als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Solch eine pharmazeutische Zusammensetzung kann die Antisense-Oligonucleotide in Kombination mit irgendeinem physiologisch und/oder pharmazeutisch akzeptablen Standard-Träger umfassen, welcher im Stand der Technik bekannt ist. Die Zusammensetzungen sollten steril sein und eine therapeutisch wirksame Menge des Antisense-Oligonucleotids in einer Gewichts- oder Volumeneinheit enthalten, die für die Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Die Eigenschaften des Trägers werden von dem Verabreichungsweg abhängen. Physiologisch und pharmazeutisch akzeptable Träger beinhalten Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, löslichkeitsfördernde Mittel und andere Materialien, welche im Stand der Technik bekannt sind.
Wie hierin verwendet, kann ein "Vektor" irgendeine einer Anzahl von Nucleinsäuren umfassen, in welche eine gewünschte Sequenz durch Restriktion und Ligation für den Transport zwischen unterschiedlichen genetischen Umgebungen und zur Expression in einer Wirtszelle eingefügt werden kann, Vektoren sind typischerweise aus DNA zusammengesetzt, auch wenn RNA-Vektoren ebenso erhältlich sind. Vektoren beinhalten Plasmide, Phagemide und Virusgenome, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein Klonierungsvektor ist ein Vektor, welcher in der Lage ist, sich in einer Wirtszelle zu replizieren, und welcher typischerweise weiter durch einen oder mehrere Endonucleaserestriktionsorte gekennzeichnet ist, an welchem der Vektor auf eine bestimmbare Art und Weise geschnitten werden kann und in welchen eine gewünschte DNA-Sequenz so ligiert werden kann, dass der neue rekombinante Vektor seine Fähigkeit beibehält, sich in einer Wirtszelle zu replizieren. Im Fall von Plasmiden kann die Replikation der gewünschten Sequenz vielfach auftreten, da die Kopienzahl des Plasmids in dem Wirtsbakterium erhöht wird oder nur ein einziges Mal pro Wirt, bevor der Wirt sich durch Mitose reproduziert. Im Fall des Phagen kann die Replikation aktiv während einer lytischen Phase oder passiv während einer lysogenen Phase auftreten. Ein Expressionsvektor ist einer, in welchem eine gewünschte DNA-Sequenz durch Restriktion und Ligation eingefügt werden kann, so dass sie operabel mit den Regulationssequenzen verbunden ist und als ein RNA-Transkript exprimiert werden kann. Vektoren können weiterhin eine oder mehrere Markersequenzen enthalten, die für die Verwendung bei der Identifizierung von Zellen geeignet sind, welche mit dem Vektor transformiert oder transfiziert wurden oder nicht. Marker beinhalten beispielsweise Gene, die für Proteine codieren, welche entweder die Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika oder anderen Verbindungen erhöhen oder absenken, Gene, die für Enzyme codieren, dessen Aktivitäten durch Standardassays detektierbar sind, die im Stand der Technik bekannt sind (z. B. β-Galactosidase, Luciferase oder alkalische Phosphatase), und Gene, die sichtbar den Phänotyp von transformierten oder transfizierten Zellen, Wirten, Kolonien oder Plaques beeinflussen (z. B. verschiedene Fluoreszenzproteine wie grünes Fluoreszenzprotein, GFP). Bevorzugte Vektoren sind diejenigen, welche zur autonomen Replikation und Expression von strukturellen Genprodukten in der Lage sind, die in den DNA-Segmenten vorhanden sind, mit welchen sie operabel verbunden sind.
Wie hierin verwendet, werden eine codierende Sequenz und eine Regulationssequenz als "operabel" miteinander verbunden bezeichnet, wenn sie kovalent auf solche eine Art und Weise miteinander verbunden sind, dass sie die Expression oder die Transkription der codierenden Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der Regulationssequenz stellen. Wenn es gewünscht ist, das die codierenden Sequenzen in ein funktionales Protein translatiert werden, werden zwei DNA-Sequenzen als operable verbunden bezeichnet, wenn die Induktion eines Promotors in der 5'-Regulationssequenz in der Transkription der codierenden Sequenz resultiert und wenn die Natur der Bindung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) in der Einführung einer Frame-Shift-Mutation resultiert, (2) mit der Fähigkeit der Promotorregion interferiert, die Transkription der codierenden Sequenzen zu steuern oder (3) mit der Fähigkeit des entsprechenden RNA-Transkripts interferiert, in ein Protein translatiert zu werden. Somit wäre ein Promotorbereich operabel mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn der Promotorbereich in der Lage wäre, die Transkription der DNA-Sequenz so zu bewirken, dass das resultierende Transkript in das gewünschte Protein oder Polypeptid translatiert werden könnte.
Die genaue Natur der Regulationssequenzen, die für die Genexpression erforderlich sind, kann zwischen verschiedenen Spezies oder Zelltypen varüeren, sie sollten jedoch im Allgemeinen, wie erforderlich, 5'-nichttranskribierte und 5'-nichttranslatierte Sequenzen enthalten, die bei der Initiierung einer Transkription bzw. einer Translation eine Rolle spielen, so wie die TATA-Box, die Cap-Sequenz, die CAAT-Sequenz und Ähnliches. Insbesondere werden solche 5'-nichttranskribierten Regulationssequenzen einen Promotorbereich beinhalten, welcher eine Promotorsequenz für die transkriptionale Kontrolle des operabel verbundenen Gens enthält. Regulationssequenzen können ebenso Enhancersequenzen oder Upstream-Aktivatorsequenzen enthalten, wenn gewünscht. Die Vektoren der Erfindung können optional 5'-Leader- oder Signalsequenzen enthalten. Die Wahl und das Design eines entsprechenden Vektors befindet sich innerhalb der Fähigkeit und des Ermessens von Durchschnittsfachleuten.
Expressionsvektoren, die alle erforderlichen Elemente für die Expression enthalten, sind kommerziell erhältlich und Fachleuten bekannt. Siehe z. B. Dambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Zellen werden genetisch durch die Einführung von heterologer DNA (RNA), die für das I-ASP-Polypeptid oder ein Fragment oder eine Variante davon codiert, in die Zelle genetisch verändert. Die heterologe DNA (RNA) wird unter der operablen Kontrolle von transkriptionalen Elementen angeordnet, um die Expression der heterologen DNA in der Wirtszelle zu ermöglichen.
Bevorzugte Systeme für die mRNA-Expression in Säugetierzellen sind solche wie pcDNA3.1 und pRc/CMV (erhältlich von Invitrogen, Calsbad, CA), die einen selektierbaren Marker, wie ein Gen, das eine G418-Resistenz verleiht (was die Selektion von stabil transfizierten Zelllinien ermöglicht) und die humanen Cytomegalovirus (CMV)-Enhancer-Promotorsequenzen enthalten. Zusätzlich geeignet für die Expression in Primaten- oder Hundezelllinien ist der pCEP4-Vektor (Invitrogen), welcher einen Epstein-Barr-Virus (EBV)-Replikationsursprung enthält, was die Beibehaltung des Plasmids als ein extrachromosomales Element mit vielen Kopien ermöglicht. Ein weiterer Expressionsvektor ist das pEF-BOS-Plasmid, das den Promotor des Polypeptids Elongationsfaktor 1α, welches die Transkription in vitro effizient stimuliert, enthält. Das Plasmid ist durch Mishizuma und Nagata beschrieben (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990) und dessen Verwendung bei Transfektionsexperimenten ist beispielsweise offenbart durch Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710, 1996). Ein weiterer bevorzugter Expressionsvektor ist ein Adenovirus, beschrieben durch Stratford-Perricaudet, welcher bezüglich der E1- und E3-Proteine defekt ist (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992). Die Verwendung des Adenovirus als eine Adeno.P1A-Rekombinante ist durch Warnier et al. für die intradermale Injektion in Mäuse zum Immunisieren gegen P1A offenbart (Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996).
Die Isolation der I-ASP-Nucleinsäuremoleküle ermöglicht es dem Fachmann ebenso, einen Zustand zu diagnostizieren, der durch die Expression (oder einen relativen Mangel) dieser Moleküle gekennzeichnet ist. Diese Verfahren beinhalten die Bestimmung der Expression der I-ASP-Nucleinsäuren und/oder der Polypeptide, die davon abgeleitet sind. In der ersteren Situation können solche Bestimmungen über Standardnucleinsäurebestimmungsassays ausgeführt werden, einschließlich der Polymerasekettenreaktion, wie in den Beispielen hierunter ausgeführt, oder durch Assays mit markierten Hybridisierungssonden.
Die Erfindung beinhaltet ebenso Mittel wie Polypeptide, welche an I-ASP-Polypeptide und an Komplexe aus I-ASP-Polypeptiden und Bindepartnern wie p53 binden. Solche bindenden Mittel können beispielsweise in Screeningassays, um die Gegenwart oder die Abwesenheit von I-ASP-Polypeptiden und Komplexen aus I-ASP-Polypeptiden und deren Bindepartnern zu detektieren, und in Aufreinigungsprotokollen, um I-ASP-Polypeptide und Komplexe aus I-ASP-Polypeptiden und deren Bindepartnern zu isolieren, verwendet werden. Solche Mittel können ebenso verwendet werden, um die native Aktivität der I-ASP-Polypeptide oder die von deren Bindepartnern beispielsweise durch Binden an solche Polypeptide oder an deren Bindepartner oder an beide zu inhibieren.
Die Erfindung umfasst daher Peptidbindemittel, welche beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente sein können, welche die Fähigkeit haben, selektiv an I-ASP-Polypeptide zu binden. Antikörper umfassen hierbei polyklonale und monoklonale Antikörper, die gemäß konventionellen Verfahren hergestellt werden.
Es ist signifikant und im Stand der Technik gut bekannt, dass nur ein kleiner Teil eines Antikörpermoleküls, das Paratop, in die Bindung des Antikörpers an dessen Epitop involviert ist (siehe im Allgemeinen Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7. Ausg., Blackwell Scientific Publications, Oxford. Die pFc'- und Fc-Bereiche sind beispielsweise Effektoren der Komplementkaskade, aber sie spielen keine Rolle beim Binden von Antigenen. Ein Antikörper, von dem der pFc'-Bereich enzymatisch abgespalten wurde oder welcher ohne den pFc'-Bereich produziert wurde, der als F(ab')₂-Fragment bezeichnet wird, behält beide Antigenbindeorte eines intakten Antikörpers. Auf ähnliche Weise behält ein Antikörper, von welchem der Fc-Bereich enzymatisch abgespalten wurde oder welcher ohne den Fc-Bereich hergestellt wurde, der Fab-Fragment genannt wird, einen der Antigenbindeort eines intakten Antikörpermoleküls bei. Weiterhin bestehen Fab-Fragmente aus der leichten Kette eines Antikörpers, an die kovalent ein Teil der schweren Kette des Antikörpers, die Fd bezeichnet wird, gebunden ist. Die Fd-Fragmente sind die Hauptdeterminanten der Antikörperspezifität (ein einzelnes Fd-Fragment kann mit bis zu zehn unterschiedlichen Leichtketten assoziiert sein, ohne dass dabei die Antikörperspezifität geändert wird) und Fd-Fragmente behalten die Fähigkeit zum Binden an Epitope in der Isolation bei.
Innerhalb des antigenbindenden Teils eines Antikörpers gibt es komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs), welche direkt mit dem Epitop des Antigens interagieren, und Rahmenbereiche (FRs), welche die tertiäre Struktur des Paratops aufrechterhalten (siehe im Allgemeinen Clark, 1986; Roitt, 1991), wie es im Stand der Technik bekannt ist. In sowohl dem Fd-Fragment der schweren Kette als auch in der leichten Kette von IgG-Immunoglobulinen gibt es vier Rahmenbereiche (FR1 bis FR4), getrennt durch drei komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDR1 bis CDR3). Die CDRs, und insbesondere die CDR3-Bereiche und weiterhin insbesondere der CDR3-Bereich der schweren Kette, sind im Wesentlichen verantwortlich für die Antikörperspezifität.
Es ist nun im Stand der Technik gut etabliert, dass die Nicht-CDR-Bereiche eines Säugetierantikörpers durch ähnliche Bereichen von conspezifischen oder heterospezifischen Antikörpern ersetzt werden können, während die Epitopspezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten wird. Dies ist am deutlichsten in der Entwicklung und der Verwendung von "humanisierten" Antikörpern manifestiert, bei welchen nichthumane CdRs kovalent mit humanen FR- und/oder Fc/pFc'-Bereichen verbunden werden, um einen funktionierenden Antikörper herzustellen. Siehe US-Patente 4,816,567, 5,225,539, 5,585,089, 5,693,762 und 5,859,205.
Somit lehrt beispielsweise die PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 92/04381 die Herstellung und Verwendung von humanisierten murinen RSV-Antikörpern, bei welchen wenigstens ein Teil der murinen FR-Bereiche durch FR-Bereiche mit menschlicher Herkunft ersetzt wurde.
Solche Antikörper, einschließlich Fragmenten von intakten Antikörpern mit Antigenbindefähigkeit, werden häufig als "chimäre" Antikörper bezeichnet.
Vollständig humane monoklonale Antikörper können ebenso beispielsweise durch Immunisierung nichthumaner Tiere hergestellt werden, wobei die Tiere transgen für humane Immunoglobulingene sind. Siehe beispielsweise US-Patente 5,814,318, 5,877,397, 6,091,001, 6,114,598.
Somit wird es für Fachleute offensichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung ebenso F(ab')₂-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente; chimäre Antikörper, bei welchen die Fc- und/oder FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3-Bereiche durch homologe humane oder nichthumane Sequenzen ersetzt wurden; chimäre F(ab')₂-Fragmentantikörper, bei welchen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3-Bereiche durch homologe humane oder nichthumane Sequenzen ersetzt wurden; chimäre Fab-Fragmentantikörper, bei welchen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3- Bereiche durch homologe humane oder nichthumane Sequenzen ersetzt wurden; und chimäre Fd-Fragmentantikörper, bei welchen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2-Bereiche durch homologe humane oder nichthumane Sequenzen ersetzt wurden, zur Verfügung stellt. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso sogenannte Einzelkettenantikörper.I
Somit umfasst die vorliegende Erfindung Polypeptide mit vielfältiger Größe und Art, die spezifisch an I-ASP-Polypeptide und an Komplexe aus I-ASP-Polypeptiden und deren Bindepartnern binden. Diese Polypeptide können ebenso aus anderen Quellen als aus der Antikörpertechnologie abgeleitet sein. Beispielsweise können solche Polypeptidbindemittel durch degenerierte Peptidbibliotheken zur Verfügung gestellt werden, welche leicht in Lösung, in immobilisierter Form oder als Phagendisplaybibliotheken hergestellt werden können. Kombinatorische Bibliotheken können ebenso aus Peptiden synthetisiert werden, die eine oder mehrere Aminosäuren enthalten. Die Bibliotheken können ebenso aus Peptoiden und nicht-peptidsynthetischen Einheiten hergestellt werden.
Ein Phagendisplay kann insbesondere darin effektiv sein, bindende Peptide zu identifizieren, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Kurz zusammengefasst stellt man eine Phagenbibliothek her (unter Verwendung von z. B. m13-, fd-, oder lambda-Phagen), die Inserts von 4 bis etwa 80 Aminosäureresten aufzeigen, wobei man konventionelle Verfahren verwendet. Diese Inserts können beispielsweise ein vollständig degeneriertes oder gerichtetes (biased) Array darstellen. Man kann dann Phagen auswählen, die Inserts enthalten, welche an das I-ASP-Polypeptid binden. Dieses Verfahren kann dann mehrfach cyclisch wiederholt werden, wobei Phagen erneut ausgewählt werden, die an das I-ASP-Polypeptid binden. Wiederholte Runden führen zu der Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen enthalten. Eine DNA-Sequenzanalyse kann dann ausgeführt werden, um die Sequenzen der exprimierten Polypeptide zu identifizieren. Der minimale lineare Teil der Sequenz, die an das I-ASP-Polypeptid bindet, kann bestimmt werden. Man kann das Verfahren unter Verwendung einer gerichteten Bibliothek wiederholen, die Inserts enthält, die einen Teil oder sämliche der minimalen linearen Teile enthält, plus eine oder mehrere zusätzliche degenerierte Reste stromaufwärts oder stromabwärts davon. Yeast-2-Hybrid-Screening-Verfahren können ebenso verwendet werden, um Polypeptide zu identifizieren, die an I-ASP-Polypeptide binden. Somit können die I-ASP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon verwendet werden, um Peptidbibliotheken zu screenen, einschließlicih Phagendisplaybibliotheken, um Bindepartner von I-ASP-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zu identifizieren und auszuwählen. Solche Moleküle können wie beschrieben für Screeningassays, für Aufreinigungsprotokolle oder zum direkten Stören der Funktion von I-ASP oder für andere Zwecke, die Fachleuten offensichtlich sein werden, verwendet werden.
Die Erfindung stellt weiterhin effiziente Verfahren zum Identifizieren pharmakologischer Mittel oder von Leitstrukturen für Mittel zur Verfügung, die auf dem Niveau der I-ASP-modulierbaren zellulären Funktion aktiv sind. Insbesondere beinhalten solche Funktionen das Binden an p53 und Apoptose. Im Allgemeinen beinhalten die Screeningverfahren das Suchen nach Verbindungen, welche mit der I-ASP-Aktivität wie dem Binden an p53 usw. inferieren, auch wenn Verbindungen, welche die I-ASP-Aktivität erhöhen, ebenso mit dem Screeningverfahren gesucht werden können. Solche Verfahren sind an das automatisierte High-Throughput-Screening von Verbindungen adaptierbar. Die therapeutischen Zielindikationen für pharmakologische Mittel, die durch die Screeningverfahren detektiert werden, sind nur in der Hinsicht limitiert, dass die zelluläre Zielfunktion ein Gegenstand der Modulation durch die Veränderung der Bildung eines Komplexes ist, wobei der Komplex ein I-ASP-Polypeptid oder ein Fragment davon und ein oder mehrere I-ASP-intrazelluläre Bindeziele, so wie p53, umfasst. Die Zielindikationen beinhalten Apoptose.
Eine breite Vielzahl von Assays für pharmakologische Mittel werden zur Verfügung gestellt, einschließlich markierter in vitro Protein-Protein-Bindeassays, elektrophoretischer Mobilitätsshiftassays, Immunoassays, zellbasierender Assays wie Two- oder Three-Hybrid-Screens, Expressionsassays usw. Beispielsweise werden Hybridscreens verwendet, um die Wirkung von transfizierten Nucleinsäuren auf das intrazelluläre Binden von I-ASP-Polypeptiden oder Fragmenten davon an spezifische intrazelluläre Targets schnell zu untersuchen. Die transfizierten Nucleinsäuren können beispielsweise für kombinatorische Peptidbibliotheken oder Antisense-Moleküle codieren. Bequeme Reagenzien für solche Assays, z. B. GAL4-Fusionsproteine, sind im Stand der Technik bekannt. Ein beispielhafter zellbasierter Assay beinhaltet das Transfizieren einer Zelle mit einer Nucleinsäure, die für ein I-ASP-Polypeptid codiert, das mit eine GAL4-DNA-Bindedomäne fusioniert ist, und einer Nucleinsäure, die für eine p53-Domäne codiert, welche mit I-ASP interagiert, das mit einer Transkriptionsaktivierungsdomäne wie VP16 fusioniert ist. Die Zelle enthält ebenso ein Reportergen, das operabel mit einer regulierenden Genexpressionsregion verbunden ist, so wie ein oder mehrere GAL4-Bindeorte. Die Aktivierung der Reportergentranskription tritt auf, wenn die ASP- und p53-Fusionspolypeptide binden, so dass die GAL4-DNA-Bindedomäne und die VP16- Transkriptionsaktivierungsdomäne nahe zusammengebracht werden, so dass die Transkription des Reportergens ermöglicht wird. Mittel, welche eine I-ASP-Polypeptidvermittelte Zellfunktion modulieren, werden dann durch eine Veränderung der Expression des Reportergens erkannt. Verfahren zum Bestimmen von Veränderungen der Expression eines Reportergens sind im Stand der Technik bekannt.
I-ASP-Fragmente, die in den Verfahren verwendet werden, werden zu einer Assaymischung als isoliertes Polypeptid hinzugefügt, wenn sie nicht durch eine transfizierte Nucleinsäure produziert werden. I-ASP-Polypeptide werden vorzugsweise rekombinant hergestellt, auch wenn solche Polypeptide aus biologischen Extrakten isoliert werden können. Rekombinant produzierte I-ASP-Polypeptide beinhalten chimäre Proteine, umfassend eine Fusion aus einem I-ASP-Protein mit einem anderen Polypeptid, z. B. einem Polypeptid, das in der Lage ist, das Protein-Protein-Binden, das sequenzspezifische Nucleinsäurebinden (so wie GAL4) zur Verfügung zu stellen oder zu verstärken, die Stabilität des I-ASP-Polypeptids unter den Bedingungen des Assays zu verstärken oder eine detektierbare Einheit zur Verfügung zu stellen, so wie das grüne Fluoreszenzprotein oder das Flag-Epitop.
Die Assaymischung umfasst ein natürliches intrazelluläres I-ASP-Bindeziel wie p53 oder einem Fragment davon, das in der Lage ist, mit I-ASP zu interagieren. Während natürliche I-ASP-Bindeziele verwendet werden können, ist es häufig bevorzugt, Teile (z. B. Peptide oder Nucleinsäurefragmente) oder Analoga (d. h. Mittel, welche die I-ASP-Bindeeigenschaften des natürlichen Bindeziels zum Zweck des Assays nachahmen) des I-ASP-Bindeziels zu verwenden, solange der Teil oder das Analogon die Bindeaffinität und -avidität an das I-ASP-Fragment so zur Verfügung stellt, dass sie im Rahmen des Assays messbar ist.
Die Assaymischung umfasst ebenso einen Kandidaten für ein pharmakologisches Mittel. Typischerweise werden eine Vielzahl von Assaymischungen parallel mit unterschiedlichen Mittelkonzentrationen untersucht, um eine unterschiedliche Antwort auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als negative Kontrolle, d. h. eine Konzentration von null des Mittels oder eine Konzentration des Mittels, die unterhalb des Detektionslimits des Assays liegt. Kandidatenmittel umfassen eine Vielzahl von chemischen Klassen, auch wenn typischerweise dies organische Verbindungen sind. Vorzugsweise sind die Kandidaten für pharmakologische Mittel kleine organische Verbindungen, d. h. Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50, jedoch weniger als etwa 2500, vorzugsweise weniger als etwa 1000 und mehr bevorzugt weniger als etwa 500. Kandidatenmittel umfassen funktionale chemische Gruppen, die für strukturelle Interaktionen mit Polypeptiden und/oder Nucleinsäuren erforderlich sind, und enthalten typischerweise wenigstens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, vorzugsweise wenigstens zwei der funktionalen chemischen Gruppen und mehr bevorzugt wenigstens drei der funktionalen chemischen Gruppen. Die Kandidatenmittel können eine cyclische Kohlenstoff- oder eine heterocyclische Struktur und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen umfassen, die mit einer oder mit mehreren der oben identifizierten funktionalen Gruppen substituiert sind. Kandidatenmittel können ebenso Biomoleküle sein, so wie Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Sterole, Isoprenoide, Purine, Pyrimidine, Derivate oder strukturelle Analoga der Obigen, oder Kombinationen daraus und Ähnliches. Wo das Mittel eine Nucleinsäure ist, ist das Mittel typischerweise ein DNA- oder RNA-Molekül, auch wenn modifizierte Nucleinsäuren, wie hierin definiert, ebenso umfasst sind.
Kandidatenmittel werden aus einer breiten Vielzahl von Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken aus synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Beispielsweise ist eine Vielzahl von Mitteln erhältlich für die zufällige und gerichtete Synthese einer breiten Vielzahl an organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich der Expression von randomisierten Oligonucleotiden, synthetischen organischen kombinatorischen Bibliotheken, Pagendisplaybibliotheken von zufälligen Peptiden und Ähnlichem. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von bakteriellen, fungalen, Pflanzen- und Tierextrakten erhältlich oder werden leicht hergestellt. Zusätzlich können natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden. Weiterhin können bekannte pharmakologische Mittel gerichteten oder zufälligen chemischen Modifikationen wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifikation usw. ausgesetzt werden, um strukturelle Analoga dieser Mittel herzustellen.
Eine Vielzahl von anderen Reagenzien kann ebenso in der Mischung enthalten sein. Diese beinhalten Reagenzien wie Salze, Puffer, neutrale Proteine (z. B. Albumin), Detergenzien usw., welche verwendet werden können, um ein optimales Protein-Protein- und/oder Protein-Nucleinsäure-Binden zu vereinfachen. Solch ein Reagens kann ebenso nichtspezifische oder Hintergrundinteraktionen der Reaktionsbestandteile reduzieren. Andere Reagenzien, die die Effizienz des Assays verbessern, so wie Proteasen, Inhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel und Ähnliches, können ebenso verwendet werden.
Die Mischung aus den vorangegangenen Assaymaterialien wird unter Bedingungen inkubiert, bei denen das I-ASP-Polypeptid spezifisch an das zelluläre Bindeziel oder an einen Teil davon oder an ein Analogon davon bindet, es sei denn, das pharmakologische Kandidatenmittel ist vorhanden. Die Reihenfolge der Hinzufügung der Bestandteile, die Inkubationstemperatur, die Zeit der Inkubation und andere Parameter des Assays können leicht bestimmt werden. Solche Experimente beinhalten lediglich die Optimierung der Assayparameter, aber nicht die fundamentale Zusammensetzung des Assays. Die Inkubationtemperaturen liegen typischerweise zwischen 4 °C und 40 °C. Die Inkubationszeiten werden vorzugsweise minimiert, um ein schnelles, High-Throughput-Screening zu ermöglichen, und liegen typischerweise zwischen 0,1 und 10 Stunden.
Nach der Inkubation wird die Gegenwart oder Abwesenheit von spezifischem Binden zwischen dem I-ASP-Polypeptid und einem oder mehreren Bindezielen durch irgendein bequemes Verfahren detektiert, welches für den Verwender erhältlich ist. Für zellfreie Bindeassays wird häufig ein Trennungsschritt verwendet, um gebundene von nichtgebundenen Bestandteilen zu trennen. Der Trennungsschritt kann auf eine Vielzahl von Arten ausgeführt werden. Bequemerweise wird wenigstens eines der Bestandteile auf einem Festsubstrat immobilisiert, von welchem die nichtgebundenen Bestandteile leicht abgetrennt werden können. Das Feststoffsubstrat kann aus einer breiten Vielzahl von Materialien und ebenso in einer breiten Vielzahl von Formen, z. B. Mikrotiterplatte, Mikrobead, Dipstick, Harzpartikel usw. hergestellt werden. Das Substrat wird vorzugsweise so ausgewählt, dass ein maximales Signal zu Rauschen-Verhältnis erzielt wird, in erster Linie, um ein Hintergrundbinden zu minimieren, aber ebenso, um die Trennung zu erleichtern und die Kosten zu vermindern.
Die Trennung kann ebenso beispielsweise durch Entfernen eines Beads oder eines Messstabs aus einem Reservoir, durch Entleeren oder Verdünnen eines Reservoirs wie eines Well in einer Mikrotiterplatte, durch Spülen eines Beads, Partikels, einer chromatographischen Säule oder eines Filters mit einer Waschlösung oder einem Lösungsmittel, erzielt werden. Der Trennschritt beinhaltet bevorzugt mehrfaches Spülen oder Waschen. Wenn das Festsubstrat beispielsweise eine Mikrotiterplatte ist, können die Wells mehrere Male mit einer Waschlösung gewaschen werden, welche typischerweise die Bestandteile der Inkubationsmischung enthielt, die nicht am spezifischen Binden teilnehmen, so wie Salze, Puffer, Detergenzien, nichtspezifisches Protein usw. Wenn das Festsubstrat ein magnetisches Bead ist, können die Beads ein oder mehrere Male mit einer Waschlösung gewaschen werden und unter Verwendung eines Magneten isoliert werden.
Die Detektion kann auf irgendeine Art und Weise für zellbasierende Assays, so wie Two- oder Three-Hybrid-Screens, bewirkt werden. Das Transkript, das in einem Reportergentranskriptionsassay aus der Interaktion des I-ASP-Polypeptids mit einem Zielmolekül resultiert, codiert typischerweise für ein direkt oder indirekt detektierbares Produkt, z. B. β-Galactosidaseaktivität, Luciferaseaktivität und Ähnliches. Für zellfreie Bindeassays umfasst ein Bestandteil normalerweise einen detektierbaren Marker oder ist an ihn gekoppelt. Eine breite Vielzahl von Markern kann verwendet werden, so wie diejenigen, die eine direkte Detektionsmöglichkeit zur Verfügung stellen (z. B. Radioaktivität, Lumineszenz, optische oder Elektronendichte usw.) oder eine indirekte Detektionsmöglichkeit (z. B. Epitoptags wie das FLAG-Epitop, Enzymtags wie Meerrettichperoxidase usw.). Der Marker kann an den I-ASP-Bindepartner gebunden oder in die Struktur des Bindepartners mit einbezogen sein.
Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um den Marker zu detektieren, abhängig von der Natur des Markers und den anderen Assaybestandteilen. Beispielsweise kann der Marker detektiert werden, während er an ein Festsubstrat gebunden ist oder anschließend an die Trennung von dem Festsubstrat. Marker können direkt durch eine optische oder eine Elektronendichte, durch radioaktive Emissionen, nichtradiative Energietransfers usw. detektiert werden oder indirekt mit Antikörperkonjugaten, Streptavidin-Biotin-Konjugaten usw. detektiert werden. Verfahren zum Detektieren der Marker sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Erfindung umfasst spezifische an I-ASP bindende Mittel, Verfahren zum Identifizieren und Herstellen solcher Mittel und deren Verwendung bei der Diagnose, in der Therapie und bei der Entwicklung von Pharmazeutika. Beispielsweise sind pharmakologische Mittel, die spezifisch an I-ASP binden, in einer breiten Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen nützlich, insbesondere wo eine Erkrankung oder Erkrankungsprognose mit einer nicht angemessenen Verwendung eines biochemischen Wegs verbunden ist, der I-ASP, z. B. Apoptose usw., verwendet. Neue Mittel, die spezifisch an I-ASP binden, beinhalten Antikörper, die spezifisch an I-ASP binden, und andere natürliche intrazellulär bindende Mittel, die mit Assays identifiziert werden, so wie Two-Hybrid-Screens, und nicht-natürliche intrazelluläre bindende Mittel, die durch Screens von chemischen Bibliotheken und Ähnlichem identifiziert werden.
Im Allgemeinen wird die Spezifität des Bindens an I-ASP durch ein bindendes Mittel durch Gleichgewichtskonstanten für die Bindung beschrieben. Ziele, die in der Lage sind, selektiv an das I-ASP-Polypeptid zu binden, haben vorzugsweise eine Bindungs-Gleichgewichtskonstante von wenigstens etwa 10⁷ M^–1, mehr bevorzugt von wenigstens etwa 10⁸ M^–1 und am meisten bevorzugt von wenigstens etwa 10⁹ M^–1. Die breite Vielzahl von zellbasierenden und zellfreien Assays kann verwendet werden, um das I-ASP-spezifische Binden zu zeigen. Zellbasierende Assays beinhalten One-, Two- und Three-Hybrid-Screens, Assays, bei welchen die I-ASP-vermittelte Transkription inhibiert oder erhöht ist, usw. Zellfreie Assays beinhalten I-ASP-proteinbindende Assays, Immunoassays usw. Andere Assays, die nützlich sind, um Mittel zu screenen, welche an I-ASP-Polypeptide binden, beinhalten Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) und elektrophoretische Mobilitätsshiftanalyse (EMSA).
Verschiedene Techniken können zum Einführen von Nucleinsäuren der Erfindung in Zellen verwendet werden, abhängig davon, ob die Nucleinsäuren in vitro oder in vivo in einen Wirt eingeführt werden. Solche Techniken beinhalten die Transfektion von Nucleinsäure-CaPO₄-Präzipitaten, die Transfektion von Nucleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion mit einem Retrovirus, der die Nucleinsäure von Interesse enthält, eine liposomvermittelte Transfektion und Ähnliches. Für gewisse Verwendungen ist es bevorzugt, die Nucleinsäure auf bestimmte Zellen zu richten. In solchen Fällen wird ein Vehikel für die Übertragung einer Nucleinsäure der Erfindung in eine Zelle verwendet (z. B. ein Retrovirus oder ein anderer Virus; ein Liposom), an das ein Targetingmolekül angehaftet sein kann. Beispielsweise kann ein Molekül wie ein Antikörper, der spezifisch für ein Oberflächenmembranprotein der Targetzelle ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Targetzelle an das Nucleinsäureübertragungsvehikel gebunden sein oder in es inkorporiert sein. Beispielsweise können Proteine, welche an ein Oberflächenmembranprotein binden, das mit Endozytose in Verbindung steht, in die Liposomformulierung für das Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme inkorporiert sein, wenn Liposomen verwendet werden, um die Nucleinsäuren der Erfindung zu übertragen. Solche Proteine beinhalten Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die eine Internalisierung beim Cyclieren unterlaufen, Proteine, die eine intrazelluläre Lokalisierung anstreben und die intrazelluläre Halbwertszeit erhöhen, und Ähnliches. Polymere Übertragungssysteme wurden ebenso erfolgreich verwendet, um Nucleinsäuren in Zellen zu übertragen, und sie sind Fachleuten bekannt. Solche Systeme erlauben sogar die orale Übertragung von Nucleinsäuren.
Bei der Verabreichung werden die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Präparationen verabreicht. Solche Präparationen können routinegemäß pharmazeutisch akzeptable Salzkonzentrationen, Puffermittel, Konservierungsstoffe, kompatible Träger, supplementäre immunverstärkende Mittel, so wie Hilfsstoffe und Zytokine, und optional andere therapeutische Mittel, so wie chemotherapeutische Mittel, enthalten.
Die Therapeutika der Erfindung können auf irgendeinem konventionellen Weg verabreicht werden, einschließlich durch Injektion oder durch graduelle Infusion mit der Zeit. Die Verabreichung kann beispielsweise oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, intrakavitär, subkutan oder transdermal ausgeführt werden. Wenn Antikörper therapeutisch verwendet werden, ist ein bevorzugter Verabreichungsweg durch ein pulmonäres Aerosol. Techniken zum Herstellen von Aerosolübertragungssystemen, die Antikörper enthalten, sind im Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen sollten solche Systeme Bestandteile verwenden, welche die biologischen Eigenschaften der Antikörper, so wie die Bindekapazität der Paratope, nicht signifikant verschlechtern (siehe beispielsweise Sciarra und Cutie, "Aerosols", in Reminton's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, 1990, S. 1694-1712; auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird). Fachleute können leicht die verschiedenen Parameter und Bedingungen bestimmen, die für die Herstellung von Antikörperaerosolen notwendig sind, ohne hierbei auf unangemessenes Herumexperimentieren angewiesen zu sein. Wenn Antisense-Präparationen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist eine langsame intravenöse Verabreichung bevorzugt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine "wirksame Menge" ist die Menge einer Zusammensetzung, die allein oder gemeinsam mit weiteren Dosen die gewünschte Antwort produziert. Im Fall der Behandlung einer bestimmten Erkrankung wie Krebs ist die gewünschte Antwort das Inhibieren der Progression der Erkrankung. Dies kann nur das temporäre Verlangsamen der Progression der Erkrankung beinhalten, auch wenn es mehr bevorzugt das Anhalten der Progression der Erkrankung auf eine permanente Art und Weise beinhaltet. Dies kann durch Routineverfahren überprüft werden oder kann gemäß den diagnostischen Verfahren der Erfindung, die hierin diskutiert werden, aufgezeichnet werden.
Solche Mengen werden natürlich von dem bestimmten Zustand, der behandelt wird, der Schwere des Zustands, den individuellen Patientenparametern einschließlich des Alters, des physischen Zustands, der Größe, des Gewichts, der Dauer der Behandlung, der Natur der Paralleltherapie (wenn eine solche vorliegt), des spezifischen Verabreichungswegs und ähnlicher Fraktoren abhängen, die sich innerhalb des Wissens und der Expertise des Praktikers auf dem Bereich des Gesundheitswesens bewegen. Diese Faktoren sind Fachleuten gut bekannt und können ermittelt werden, ohne dass unangemessenes Herumexperimentieren erforderlich ist. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass eine maximale Dosis der individuellen Bestandteile oder von Kombinationen daraus verwendet wird, die gemäß einem vernünftigen medizinischen Urteil die höchste sichere Dosis ist. Es wird von Fachleuten verstanden werden, dass ein Patient aufgrund von medizinischen Gründen, psychologischen Gründen oder aus irgendeinem anderen Grund auf einer niedrigeren Dosis oder auf einer tolerierbaren Dosis bestehen kann.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in den vorangehenden Verfahren verwendet werden, sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge Antikörper zum Produzieren der gewünschten Antwort in einer Gewichts- oder Volumeneinheit, die für die Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Die Antwort kann beispielsweise durch Bestimmen der Signaltransduktion, die durch die Zusammensetzung verstärkt oder inhibiert wird, über ein Reportersystem, wie hierin beschrieben, durch Messen der Downstream-Effekte wie der Genexpression oder durch Messen der physiologischen Effekte der Zusammensetzung wie der Regression eines Tumors, des Absinkens der Erkrankungssymptome, der Modulation der Apoptose usw. gemessen werden. Auf ähnliche Weise können die Auswirkungen von Antisense-I-ASP-Molekülen leicht durch Messen der Expression der individuellen Gene in Zellen bestimmt werden, an welche die Antisense-Zusammensetzung übertragen wird. Andere Assays werden Fachleuten bekannt sein und können verwendet werden, um das Niveau der Antwort zu messen.
Die Antikörperdosis, die einem Subjekt verabreicht wird, kann in Übereinstimmung mit unterschiedlichen Parametern gewählt werden, insbesondere in Übereinstimmung mit dem Verabreichungsweg, der verwendet wird, und dem Zustand des Subjekts. Andere Faktoren beinhalten die gewünschte Behandlungsdauer. In dem Fall, dass eine Antwort in einem Subjekt bei initial angewendeten Dosierungen nicht ausreichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen durch einen unterschiedlichen, stärker lokalisierten Übertragungsweg) in einem Ausmaß, das die Patiententoleranz erlaubt, verwendet werden.
Im Allgemeinen werden Antikörperdosen in Dosen zwischen 1 ng und 1 mg und bevorzugt zwischen 10 ng und 100 μg gemäß irgendeinem Standardverfahren des Standes der Technik formuliert und verabreicht. Andere Protokolle für die Verabreichung von Antikörperzusammensetzungen werden Fachleuten bekannt sein, bei welchen die Dosismenge, der Zeitplan der Injektionen, die Orte der Injektionen, der Verabreichungsweg (z. B. intratumoral) und Ähnliches von den Vorangehenden abweichen. Die Verabreichung von Antikörperzusammensetzungen an Säugetiere außer Menschen, z. B. zu Testzwecken oder zu veterinärtherapeutischen Zwecken, wird im Wesentlichen unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben ausgeführt. Ein Subjekt, wie hierin verwendet, ist ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, und beinhaltet einen nichthumanen Primaten, Kühe, Pferde, Schweine, Schafe, Ziegen, Hunde, Katzen oder Nagetiere.
Wenn sie verabreicht werden, werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Mengen und in pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen angewendet. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet ein nichttoxisches Material, das nicht mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe interferiert. Solche Präparationen können routinegemäß Salze, Puffermittel, Konservierungsstoffe, kompatible Träger und optional andere therapeutische Mittel enthalten. Wenn sie in der Medizin verwendet werden, sollten die Salze pharmazeutisch akzeptabel sein, aber nicht pharmazeutisch akzeptable Salze können bequemerweise verwendet werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze daraus herzustellen, und sind nicht vom Umfang der Erfindung ausgeschlossen. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch akzeptablen Salze beinhalten diejenigen, die aus den folgenden Säuren hergestellt werden, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Malonsäure, Succinsäure und Ähnliches. Auch können pharmazeutisch akzeptable Salze als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze hergestellt werden, so wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze.
Antikörperzusammensetzungen können, wenn gewünscht, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert werden. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabler Träger", wie hierin verwendet, bedeutet ein oder mehrere kompabible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Verkapselungssubstanzen, welche für die Verabreichung an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff "Träger" bezeichnet einen organischen oder anorganischen Inhaltsstoff, natürlich oder synthetisch, mit welchem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um die Anwendung zu vereinfachen. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind ebenso in der Lage, mit den Molekülen der vorliegenden Erfindung und miteinander auf eine Art und Weise vermischt zu werden, so dass es keine Interaktion gibt, welche die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit substantiell beeinträchtigen könnte.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können geeignete Puffermittel enthalten, einschließlich Essigsäure in einer Salzform, Zitronensäure in einer Salzform, Borsäure in einer Salzform und Phosphorsäure in einer Salzform.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenso optional geeignete Konservierungsstoffe enthalten, so wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Parabene und Thimerosal.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können bevorzugt in einer Dosierungsformeinheit präsentiert werden und können durch irgendein Verfahren hergestellt werden, das im Stand der Technik in der Pharmazie bekannt ist. Alle Verfahren beinhalten den Schritt des In-Verbindung-Bringens des aktiven Mittels mit einem Träger, welcher einen oder mehrere akzessorische Inhaltsstoffe enthält. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch uniformes und intimes In-Kontakt-Bringen der aktiven Verbindung mit einem flüssigen Träger, einem fein zerteilten Feststoffträger oder beidem hergestellt und dann, wenn erforderlich, durch Formen des Produkts.
Zusammensetzungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten wie Kapseln, Tabletten, Pastillen präsentiert werden, wobei jede eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält. Andere Zusammensetzungen beinhalten Suspensionen in wässrigen Flüssigkeiten oder nichtwässrigen Flüssigkeiten wie einem Sirup, einem Elixir oder einer Emulsion.
Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen bequemerweise eine sterile wässrige oder nichtwässrige Präparation von Antikörpern, welche bevorzugt isotonisch zu dem Blut des Empfängers ist. Diese Präparation kann gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von geeigneten Dispersions- oder Benetzungsmitteln und Suspensionsmitteln formuliert sein. Die sterile injizierbare Präparation kann ebenso eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral akzeptablen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den akzepablen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, eine Ringer Lösung und eine isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile fixierte Öle konventionell als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes milde fixierte Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Zusätzlich können Fettsäuren wie Oleinsäure bei der Herstellung der injizierbaren Substanzen verwendet werden. Trägerformulierungen, die geeignet für die orale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre usw. Verabreichung sind, können in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA gefunden werden.
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden die Antikörper bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation von Apoptose verwendet. Das Medikament kann in einer Ampulle angeordnet werden und kann ein Bestandteil eines Kits sein, das zur Behandlung eines Subjekts verwendet werden soll. In gewissen Ausführungsformen können andere Medikamente, welche dieselben Antworten modulieren oder welche die Antikörperzusammensetzungen begünstigend beeinflussen, in demselben Kit beinhaltet sein, so wie chemotherapeutische Mittel. Die Kits können Anweisungen oder anderes gedrucktes Material enthalten, wie die Antikörperzusammensetzungen oder irgendwelche anderen Bestandteile des Kits zu verabreichen sind.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren und Tabellen beschrieben werden;
1. Saos2-Zellen wurden entweder mit Vektor, p53 (5 μg), I-ASP (10 μg) oder p53+ I-ASP transfiziert und dann 16 h lang inkubiert. Die Zellen wurden in NP40-Lysepuffer lysiert, und 1000 μg Lysat waren Gegenstand einer Immunopräzipitierung, die mit polyklonalen Antikörpern gegen I-ASP, die an Protein G-Beads gebunden waren, ausgeführt wurde. Die Gegenwart von p53 wurde durch Western Blot der Immunokomplexe unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-p53-Antikörper CM1 detektiert, 1A. Saos2-Zellen wurden mit entweder ASP-1 (8 μg) oder ASP-2 (4 μg), I-ASP (5 μg) und p53 (50 ng) transfiziert. 40 μl der entsprechenden Lysate wurden auf einem 10%igen Gel laufen gelassen, ASP-1 wurde mit V5-Antikörper detektiert, ASP-2 mit DX.5410, I-ASP mit Maus-anti-I-ASP-Antikörper, p53 mit DO1 und PCNA mit anti-PCNA-Antikörper, 1D; 1B zeigt die Induktion von p53-induzierter Apoptose durch ASP-1 und ASP-2 und die Inhibierung von p53-induzierter Apoptose durch I-ASP; 1C zeigt die Aktivierung von dem für p53 empfänglichen Promotor, Bax durch ASP-1 und ASP-2 und die Inhibierung der Transaktivierung durch I-ASP;
2 zeigt die DNA-Sequenz von I-ASP;
3 zeigt die Proteinsequenz von I-ASP;
4 zeigt, dass die apoptotische Funktion von p53 durch die Mitglieder der ASP-Familie in vivo stark reguliert wird. Die Zelllinien U2OS und MCF-7, die den Wildtyp von p53 exprimieren, wurden mit Plasmiden transfiziert, die Proteine wie angezeigt gemeinsam mit einem Zelloberflächenmarker CD20 (A-E) exprimieren. Die transfizierten Zellen wurden aussortiert und mit FACS analysiert. Die Balkendiagramme stellen den Prozentsatz der transfizierten Zellen mit dem Sub-G1-DNA-Gehalt dar, der charakteristisch für Apoptose ist. Die Plasmide, die Antisense-RNA von ASP-1, ASP-2 und I-ASP exprimieren, sind mit α-ASP-1, α-ASP-2 bzw. α-I-ASP bezeichnet. Das virale Onkoprotein E6 von humanem HPV16 ist als E6 bezeichnet. In 4B und 4D wurden die Zellen mit den Plasmiden wie angezeigt transfiziert. Anschließend wurden die transfizierten U2OS- und MCF-7-Zellen mit Medium inkubiert, welches Cisplatin in Konzentrationen von 5 bzw. 3 μg/ml enthielt. 30 Stunden später wurden die Zellen geerntet und wie oben analysiert. Für F und G wurden sowohl die U2OS- als auch die MCF-7-Zellen mit Plasmiden transfiziert, welche die Proteine wie angezeigt exprimieren. Die Co-Expression von ASP oder p53 und von endogenem Bax oder mdm2 wurden nach der Zellfixierung durch Doppelimmunofluoreszenzmarkieren visualisiert, wie in 4G angegeben. Für 4F wurden 200 U2OS- oder MCF-7-Zellen, die entweder mit Vektor allein oder ASPP-Plasmiden transfiziert wurden hinsichtlich der Überexpression von endogenem Bax-Protein untersucht. Die Balkendiagramme repräsentieren den Durchschnittswert von wenigstens drei unabhängigen Experimenten;
5A illustriert ein Modell, das die Interaktion von Mitgliedern der ASP-Familie mit p65, IkB und p53 darstellt; 5C und 5D sind graphische Darstellungen der Fähigkeit von IkB, die Transaktivierungsfunktion von p53 auf Bax- und mdm2-Promotoren in der Gegenwart und Abwesenheit von ASP-2 zu beeinflussen;
6A ist eine graphische Darstellung der Fähigkeit von Wildtyp p65 und der Deletionsmutante Δp65, ein NFkB-Reporterplasmid zu transaktivieren; 6B ist eine graphische Darstellung der Induktion der Apoptose in Zellen, die p53, ASP-2, p65 und Δp65 exprimieren und coexprimieren.
7A illustriert den verstärkenden Effekt von I-ASP auf die transformierende Funktion von E7; 7B illustriert den verstärkenden Effekt von I-ASP auf die Zellresistenz gegenüber Cisplatin; und
Tabelle 1 stellt eine Zusammenfassung der mRNA-Expression von ASP-1, ASP-2 und I-ASP in 40 Paaren von entsprechenden normalen und Tumor-RNA-Proben dar, die von Brusttumoren des Grades I und II abgeleitet sind, die den p53 Wildtyp exprimieren.
Beispiel 1
Eine kürzlich isolierte Sequenz, reL-assoziierter Inhibitor (RAI), wurde als ein p65 rel A-Bindeprotein identifiziert, welches 315 Aminosäuren enthält. RAI hat die α-helikale Domäne von ASP-1 oder ASP-2 nicht, aber es enthält die prolinreiche Region, die Ankryin-Repeats und die SH3-Domäne. Die Reste von ASP-2, die mit p53 in Kontakt treten, sind ebenso in RAI konserviert. Um die Aktivität von RAI zu untersuchen, welche wir I-ASP genannt haben, haben wir die codierende Sequenz in einen Säugetierexpressionsvektor pcDNA3 cloniert. Wir haben ebenso ein Peptid (RLQPALPPEAQSVPELEE) synthetisiert, das in I-ASP gefunden wird, welches keine Sequenzähnlichkeit zu ASP-1 und ASP-2 aufweist. Ein Mausantikörper, der für dieses einzigartige I-ASP-Peptid spezifisch ist, bindet weder an ASP-1 noch an ASP-2 (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung dieses Maus-anti-I-ASP-spezifischen Antikörpers, um das transfizierte I-ASP-in Saos2-Zellen zu immunopräzipitieren, waren wir in der Lage zu demonstrieren, dass I-ASP ebenso mit p53 interagieren kann (1A). Wie die ASP-2-Mutante, 53BP2/ASP-2 (600-1128), induzierte die Expression von I-ASP allein keine Apoptose. Wenn I-ASP mit p53 co-exprimiert wurde, hatte es eine geringe inhibitorische Wirkung auf die apoptotische Funktion von p53. Die am meisten signifikante Wirkung von I-ASP auf die apoptotische Funktion von p53 wurde beobachtet, wenn ASP-1 oder ASP-2 co-exprimiert wurden. In Übereinstimmung mit unserer Vorhersage inhibierte die Co-Expression von I-ASP die verstärkte apoptotische Funktion von p53, die durch ASP-1 und ASP-2 bewirkt wird (1B). Auf ähnliche Art und Weise war die Co-Expression von I-ASP gemeinsam mit ASP-1 oder ASP-2 in der Lage, vollständig die Fähigkeit von sowohl ASP-1 als auch von ASP-2 zu unterdrücken, die Transaktivierungsfunktion von p53 auf den Bax-Promotor zu stimulieren (1C). Die Co-Expression von I-ASP hatte die Expressionsniveaus von entweder p53 oder ASP (1D) nicht signifikant verändert. Diese Resultate zeigten, dass in vivo die pro-apoptotische Funktion von ASP-1 und ASP-2 durch den natürlichen Inhibitor I-ASP reguliert sein kann. Somit könnte das Gleichgewicht zwischen den Expressionsniveaus von ASP-1, ASP-2 und I-ASP das Zellschicksal bestimmen, d. h. ob eine Zelle lebt oder stirbt.
Beispiel 2
Im Gegensatz zu ASP-1 und ASP-2 war das Expressionsniveau von I-ASP im Allgemeinen in den normalen und humanen Brusttumorgewebeproben, die getestet wurden, niedrig. Jedoch wurde eine Überexpression von I-ASP in acht der Tumorgewebe verglichen mit deren normalen Kontrollpartnern detektiert (Tabelle 1). Das auffälligste Phänomen war die Korrelation zwischen der normalen Expression von ASP-1 und ASP-2 mit der Überexpression von I-ASP. Sieben der I-ASP-überexprimierenden Tumore wiesen keine Herunterregulierung der ASP-1- und ASP-2-Expression auf (Tabelle 1). Dieses Resultat stützt das Argument der biologischen Wichtigkeit von I-ASP als natürlicher Inhibitor von ASP-1 und ASP-2 in vivo.
Beispiel 3
Um die Rollen zu studieren, welche die Familienmitglieder von endogenem ASP beim Regulieren der Apoptose spielen, die durch endogenes p53 induziert wird, haben wir ASP-1 und ASP-2 in die Zelllinien U2OS und MCF7 eingeführt, welche den p53 Wildtyp exprimieren. ASP-1 und ASP-2 induzierten Apoptose, wenn sie in diesen Zellen exprimiert wurden (4A). Das virale Onkoprotein E6, welches von humanem Papillomavirus abgeleitet ist und welches spezifisch p53 anstreben und zum Abbau an es binden kann, inhibierte die Apoptose, die durch ASP-1 oder ASP-2 induziert wurde, was demonstriert, dass ASP-1 und ASP-2 eine p53-abhängige Apoptose induzieren können.
Wir haben ebenso die dominant negative Funktion von 53BP2 und I-ASP beim Inhibieren von Apoptose studiert, die durch endogenes p53 als Antwort auf einen DNA-Schaden induziert wird. Vor der Aussetzung gegenüber Cisplatin wurden U2OS- und MCF7-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die für HPV16, E6, I-ASP oder 53BP2 codierten. Der Prozentsatz der transfizierten Zellen, die an Apoptose als Antwort auf die Behandlung mit Cisplatin starben, wurde durch FACS-Analyse bestimmt (4B). Die Behandlung mit Cisplatin induzierte, dass über 20 % der transfizierten Zellen an Apoptose starben. Die Expression von E6 reduzierte die Prozentzahl der apoptotischen Zellen auf unter 15 %, was suggeriert, dass Cisplatin eine p53-abhängige Apoptose in U2OS-Zellen induziert. In Übereinstimmung hiermit war die Expression von I-ASP oder 53BP2 in der Lage, die Cisplatin-induzierte Apoptose in einem ähnlichen Ausmaß zu inhibieren wie E6. Diese Resultate suggerieren, dass die apoptotische Funktion von endogenem p53 durch die Expression von Mitgliedern der ASP-Familie reguliert werden kann.
Um weiter zu demonstrieren, dass die Mitglieder ASP-Familie signifikante Rollen beim Regulieren der apoptotischen Funktion von p53 spielen, haben wir eine Antisense-Herangehensweise gewählt. Wir klonierten Fragmente von den 5'-Enden von ASP-1-, ASP-2- und I-ASP-dDNAs in einen Säugetierexpressionsvektor in einer Antisense-Orientierung und testeten die Fähigkeit der Antisense-RNA, spezifisch die Proteinsynthese der ASP-Familienmitglieder in vitro zu inhibieren (Daten nicht gezeigt). Die Expression von Antisense-ASP-1 inhibierte nur die Apoptose, die durch ASP-1 induziert wurde, aber nicht die, die durch ASP-2 induziert wurde. Auf ähnliche Art und Weise inhibierte die Expression von Antisense-ASP-2 nur die Apoptose, die durch ASP-2 induziert wurde, nicht aber die, die durch ASP-1 induziert wurde. Die spezifische Wirkung von Antisense-ASP-1 und -ASP-2 wurde weiter durch die Beobachtung besättigt, dass die Co-Expression von Antisense-ASP-1 oder -ASP-2 die durch Bax vermittelte Apoptose unter den gleichen Bedingungen nicht beeinflusste (4C). Daher erlaubte dies uns, die Rolle von endogenem ASP-1 und ASP-2 beim Regulieren der apoptotischen Funktion von endogenem p53 als Antwort auf einen DNA-Schaden zu untersuchen. U2OS- und MCF-7-Zellen wurde mit verschiedenen Expressionsplasmiden vor der Behandlung mit Cisplatin transfiziert. Eine FACS-Analyse zeigte, dass etwa 20-30 % der transfizierten Kontrollzellen eine Apoptose unterlaufen. Die Expression von E6 reduzierte den Prozentsatz der apoptotischen Zellen auf die Hälfte, was anzeigte, dass Cisplatin Apoptose sowohl durch p53-abhängige als auch durch p53-unabhängige Wege in diesen Zellen induzieren kann. Die Expression von Antisense-RNA von ASP-1 oder ASP-2 inhibierte die Cisplatin-induzierte Apoptose in demselben Ausmaß wie E6 (4D), ähnlich wie die Effekte, die mit 53BP2 und I-ASP gesehen werden. Dies suggeriert, dass endogenes ASP-1 und ASP-2 wichtige Rollen beim Regulieren der apoptotischen Funktion von p53 als Antwort auf einen DNA-Schaden spielen.
Wir vermuten, dass die stimulatorische Wirkung von endogenem ASP-1 und ASP-2 auf die p53-induzierte Apoptose als Antwort auf Cisplatin aufgrund der hohen I-ASP- Niveaus, die in diesen Zellen detektiert werden (Daten nicht gezeigt), welche verhindern könnten, dass ASP-1 und ASP-2 die apoptotische Funktion von p53 verstärken, unterschätzt werden kann. Um die anti-apoptotische Rolle von I-ASP zu studieren, wurden sowohl U2OS als auch MCF-7-Zellen mit Antisense-I-ASP transfiziert. Antisense-I-ASP induzierte p53-abhängige Apoptose, die durch die Co-Expression von E6 abrogiert wurde. Die Entfernung der antiapoptotischen Funktion von I-ASP durch Antisense-I-ASP verstärkte die apoptotische Funktion von ASP-1 und ASP-2 (4E). Anders als ASP-1 und ASP-2 inhibierte die Expression von Antisense-I-ASP die Cisplatin-induzierte Apoptose nicht. Ein kleiner Anstieg an apoptotischen Zellen wurde konsistent detektiert (4D). Diese Resultate demonstrierten, dass ASP-1 und ASP-2 spezifisch die apoptotische Funktion von p53 in vivo stimulieren. Endogenes I-ASP funktioniert als Inhibitor von ASP und kann die durch endogenes p53 induzierte Apoptose blockieren.
Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle waren von den cDNAs von ASP-1, ASP-2 und I-ASP abgeleitet und wurden durch PCR auf die entsprechenden Plasmidklone unter Verwendung von Primern amplifiziert, die die folgenden Nucleotidbereiche (relativ zur initialen ATG) überspannten: –74 bis 923; –253 bis 839 und –37 bis 536 für ASP-1, ASP-2 bzw. I-ASP. Die amplifizierten Segmente wurden mit dem QIAquick-PCR-Aufreinigungskit (QIAGEN) aufgereinigt und in den pcDNA3.1/V5-His TOPO-Vektor (Invitrogen) entsprechend den Anweisungen des Herstellers ligiert. Die Plasmide, welche Antisense-DNA von ASP-1, ASP-2 und I-ASP enthielten, wurden mittels dem QUIAGEN-Plasmidaufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
Beispiel 4
Es wurde gut dokumentiert, dass p53 und p65RelA von NF-kappaB sehr wichtige Rollen beim Regulieren von Apoptose als Antwort auf Stress spielen. Jedoch ist sehr wenig darüber bekannt, wie diese zwei apoptotischen Wege in vivo gemeinsam funktionieren können. Versuche wurden gemacht, um zu verstehen, ob es einen Kommunikationsweg zwischen p64 und NF-kappaB gibt. Der erste Hinweis kam von der kürzlichen Beobachtung, dass p53 die DNA-bindende Aktivität von p65 Rel A induzieren kann. Besonders wichtig ist, dass Ikb, der Inhibitor von p65 Rel A, die apoptotische Funktion von p53 inhibieren kann. Jedoch war nicht klar, wie p53 die DNA-bindende Aktivität von p65 induzieren kann und wie Ikb die apoptotische Funktion von p53 inhibieren kann.
Interessanterweise wurde kürzlich herausgefunden, das sowohl ASP-2 als auch I-ASP mit p65 rel A interagieren können, einem Bestandteil von NF-kappaB, in einem Yeast-Hybrid-Assay. I-ASP kann ebenso die Transaktivierungsfunktion von p65 inhibieren, wenn auch weniger effektiv als Ikb. Der Bereich, der erforderlich ist, damit ASP-2 und I-ASP mit rel A p65 interagieren können, ist sehr ähnlich wie der, der für p53 erforderlich ist. Daher ist es möglich, dass es etwas Wettbewerb zwischen p53 und p65 rel A geben könnte, um mit ASP-2 und I-ASP zu interagieren. Da die ASP-Familienmitglieder gewöhnlich der Bindepartner von p53 und auch der Bindepartner von p65 sind, haben wir spekuliert, dass die Mitglieder der ASP-Familie die apoptotischen Funktionen von p53 und NF-kappaB verbinden könnten. Im Rahmen dieser Arbeitshypothese (5A) kann p53 die DNA-bindende Aktivität von p65 durch Interagieren mit dem nuklearen I-ASP induzieren und es p65 erlauben, an DNA zu binden. Zusätzlich könnte Ikb p53-induzierte Apoptose durch Binden an p65 und Freisetzen von I-ASP inhibieren. Die erhöhte nukleare Konzentration von I-ASP könnte dann mit p53 interagieren und verhindern, dass ASP-2 oder ASP-1 die Transaktivierungsfunktion von p53 stimuliert. Wenn diese Hypothese korrekt ist, würde man erwarten, dass die Expression von Ikb einen ausgeprägten Effekt auf die p53-induzierte Apoptose in der Gegenwart von ASP-1 oder ASP-2 hat.
Die Ergebnisse, die in 5B gezeigt sind, sind mit dieser Denkweise konsistent. In dem Ikb-exprimierenden Zellen sterben 7,2 % der Zellen an Apoptose, verglichen mit 4,6 % der Zellen, die mit dem Vektor allein transfiziert sind. Die Wirkung von Ikb auf die p53-induzierte Apoptose war ebenso minimal, da der Prozentsatz der apoptotischen Zellen, die in p53+Ikb-exprimierenden Zellen detektiert wurden, 12 % bzw. 11 % betrug. Dies könnte an dem sehr niedrigen Spiegel der ASP-1- und ASP-2-Expression in Saos-2-Zellen liegen. In Übereinstimmung mit den vorher gezeigten Resultaten produzierte die Co-Expression von ASP-2 eine signifikante Verstärkung der p53-induzierten Apoptose. Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen in p53+ASP-2-transfizierten Zellen betrug 30 %. Interessanteweise zeigte die Co-Expression von Ikb unter diesen Bedingungen den deutlichsten Effekt. Die Co-Expression von Ikb war in der Lage, die Menge der apoptischen Zellen, die durch p53 und ASP-2 induziert wurden, von 30 % auf 16 % zu reduzieren. Dieses Resultat suggerierte, dass Ikb die p53-induzierte Apoptose dadurch inhibieren könnte, dass es verhindert, dass ASP-2 die p53-Funktion stimuliert. Ähnliche Resultate wurden ebenso erhalten, wenn Ikb mit p53 und ASP-1 coexprimiert wurde.
Wir haben gezeigt, dass ASP-2 die apoptotische Funktion von p53 durch spezifisches Stimulieren der Transaktivierungsfunktion von p53 auf die Promotoren der proapoptotischen Gene wie Bax verstärken kann. Dann haben wir ebenso die Wirkung von Ikb auf die Transaktivierungsfunktion von p53 auf die Bax- und mdm2-Promotoren in der Gegenwart oder Abwesenheit von ASP-2 untersucht (siehe 5C und D. Wie vorher gezeigt, stimulierte die Co-Expression von ASP-2 und p53 die Transaktivierungsfunktion von p53 um das etwa 8-Fache. Unter denselben Bedingungen zeigte die Expression von Ikb keine detektierbare Inhibierung der Bax-Promotorreporteraktivität, was suggeriert, dass Ikb die transkriptionale Aktivität des Bax-Promotors nichtspezifisch in Saos-2-Zellen nicht inhibiert. Die Co-Expression von 50 ng Ikb mit p53 zeigte nur eine sehr geringe Inhibierung der Transaktivierungsfunktion von p53. Jedoch, wenn Ikb, ASP-2 und p53 coexprimiert wurden, war Ikb in der Lage, die ASP-2-vermittelte Stimulierung der p53-Transaktivierungsfunktion dramatisch zu inhibieren (5D).
Wir haben gezeigt, dass ASP-1 und ASP-2 spezifisch die Transaktivierungsfunktion von p53 auf den Bax-Promotor, aber nicht auf den mdm2-Promotor stimulieren kann. Daher, wenn Ikb tatsächlich die Transaktivierungsfunktion von p53 über ASP-2 spezifisch inhibieren würde, wäre es nicht in der Lage, eine signifikante Inhibierung der Promotoraktivität von mdm2 zu zeigen. Unter denselben Bedingungen haben wir ebenso die Fähigkeit von Ikb getestet, die Transaktivierungsfunktion von p53 auf die mdm2-Promotoraktivität zu inhibieren. Wie in 5D gezeigt, hatte die Co-Expression von ASP-2 einen sehr geringen Einfluss auf die Transaktivierungsfunktion von p53 auf den mdm2-Promotor. Am wichtigsten ist, dass Ikb kaum die Transaktivierungsfunktion von p53 auf den mdm2-Promotor inhibierte, sogar in der Gegenwart von ASP-2. Die hier gezeigten Resultate suggerieren zum ersten Mal, dass Ikb die apoptotische Funktion von p53 dadurch inhibiert, dass Ikb verhindert, dass ASP-1 oder ASP-2 die Transaktivierungsfunktion von p53 stimulieren.
Um die Rolle der ASP-Familie im Zusammenhang mit dem p53- und dem NFkb-Weg weiter zu untersuchen, haben wir auch die Wirkung der ASP-2- und p65 rel A-Interaktion auf die apoptotische Funktion von p53 studiert. Basierend auf der Arbeitshypothese aus 5A könnte die p65/ASP-Wechselwirkung den nuklearen Eintritt des ASP-Proteins vereinfachen und somit die p53/ASP-Interaktion und die Freisetzung von nuklearem I-ASP erlauben, um an das nukleare p65 zu binden. Die Reste 176-406 von p65 binden an ASP-2 und I-ASP.
Als Transkriptionsfaktor kann p65 viele Targetgene transaktivieren. Da die p53-induzierte Apoptose p65 erfordert und ebenso mit einer erhöhten DNA-bindenden Aktivität von NFkB korreliert, wird suggeriert, dass die DNA-bindende Aktivität von p65 essentiell sein könnte, um mit p53 zu kooperieren, so dass Apoptose induziert wird. Die Fähigkeit, sowohl an p53 als auch an p65 zu binden, verleiht der ASP-Proteinfamilie eine zentrale Rolle. Eine Möglichkeit ist, dass das ASP-Binden an p65 der Mediator für die p53-induzierte DNA-bindende Aktivität von p65 sein könnte. Jedoch war die Co-Expression von p64 nicht in der Lage, die transkriptionale Aktivität von p65 auf seinen Reporter zu induzieren. Die Co-Expression von p53 und ASP-2 war ebenso nicht in der Lage, irgendeinen signifikanten Effekt auf die Transaktivierungsfunktion von p65 zu zeigen. Dieses Resultat suggeriert, dass ASP nicht der Messenger ist, der die Signale von p53 auf p65 überträgt. Trotzdem könnte ASP p65 in die Lage versetzen, mit p53 zu kooperieren, um Apoptose zu induzieren. Wir haben getestet, ob die Wirkung von ASP die DNA-bindende Aktivität von p65 NFkB benötigte. Einhundert Aminosäuren von p65 wurden von dem N-Terminus entfernt, welcher den DNA-bindenen Bereich von p65 enthält. Das Δp65-Konstrukt, das so generiert wurde, war transkriptional inaktiv, wenn es mit dem NFkB-Reporterplasmid getestet wurde. Wenn die ASP-p65-Wechselwirkung der Mediator der p53- und NFkB-Wege ist, würde Δp65 eine ähnliche Wirkung auf die apoptotische Funktion von p53 haben wie das Gesamtlängen-p65. Andererseits wäre Δp65 inaktiv, da es nicht in der Lage ist, irgendeines seiner Targetgene zu transaktivieren (6A). Das Resultat, das in 6B gezeigt ist, zeigte, dass nicht nur p65 und Δp65 die apoptotische Funktion von p53 in der Gegenwart von ASP-2 stimulierten, sondern dass Δp65 sogar noch aktiver als p65 beim Verstärken der apoptotischen Funktion von p53 war. Dies mag an der Tatsache liegen, dass Δp65 nuklearer ist als p65. Die Daten, die mit Δp65 erhalten wurden, stärken die Hypothese, dass p65 die apoptotische Funktion von p53 beeinflussen kann, unabhängig von der DNA-bindenden Aktivität von p65. Daher könnte die Wechselwirkung von ASP-2-p65 der wirkende Mechanismus sein.
Beispiel 6
Bis jetzt haben wir gezeigt, dass I-ASP die p53-induzierte Apoptose in verschiedenen Zelllinien inhibieren kann und dass dessen Expressionsniveau in Brustkarzinomazellen in vivo hochreguliert ist. All diese Daten suggerieren, das I-ASP ein Onkogen sein könnte. Da die Tumorsuppressionsfunktion von p53 am besten mit seiner Fähigkeit verbunden ist, Apoptose zu induzieren, ist es wahrscheinlich; dass die Inhibierung von p53-induzierter Apoptose die Tumorsuppressionsfunktion von p53 entfernen kann. Um die onkogene Funktion von I-ASP zu testen, wurden Rattenembryofibroblasten mit Plasmiden transfiziert, die I-ASP und das Onkoprotein E7 exprimieren. Die Expression von I-ASP verstärkte die transformierende Funktion von E7 signifikant (7A). Dies demonstriert, dass I-ASP tatsächlich ein Onkogen ist.
Da die meisten der Chemotherapiemedikamente DNA-zerstörende Mittel sind und Apoptose über p53-abhängige Wege induzieren, haben wir geschlossen, dass die Fähigkeit von I-ASP, p53-induzierte Apoptose zu inhibieren, Zellen resistenter gegen die zytotoxische Wirkung von Chemotherapiemedikamenten wie Cisplatin machen könnte. MCF-7-Zellen (eine humane Brustkrebszelllinie) wurden mit einem I-ASP-exprimierenden Plasmid transfiziert. Die zelluläre Resistenz gegenüber der zytotoxischen Wirkung von Cisplatin wurde verglichen zwischen I-ASP-exprimierenden und nichtexprimierenden I-ASP-MCF-7-Zellen. Die Ergebnisse aus 7B zeigen, dass die Expression von I-ASP die zelluläre Resistenz um das etwa 2,5-Fache erhöhen kann. Solch ein Anstieg der zellulären Resistenz gegenüber Cisplatin ist biologisch sehr signifikant bezüglich der Krebsbehandlung. Daher erklären die hohen Expressionsniveaus von I-ASP nicht nur, warum Wildtyp p53 in einigen der humanen Tumorzellen nicht funktional ist. Sie können ebenso die Tumorantwort auf die Behandlungen vorhersagen. Schließlich könnte die Verwendung von I-ASP-überexprimierenden Zellen die Identifizierung von wirksameren Chemotherapiemedikamenten in der Zukunft erlauben.
Referenzen

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Tabelle 1. mRNA-Expression von ASPP in Wildtyp p53 exprimierenden humanen Brustkrebsproben (Grad I und II)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Test zur Diagnose von Krebs, gekennzeichnet durch Hochregulation eines Polypeptids in einer isolierten Gewebeprobe, wobei das Polypeptid ein Inhibitor der apoptotischen Aktivität von p53 ist und wobei das Polypeptid von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem DNA-Molekül, das aus einer wie in 2 dargestellten Sequenz besteht; ii) einem DNA-Molekül, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die Nukleinsäuresequenz in 2 hybridisiert und das für einen Inhibitor der apoptotischen Aktivität von p53 codiert; und iii) einem DNA-Molekül, das aufgrund des genetischen Codes gegenüber den in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert ist; wobei der Test die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer zu testenden, isolierten Gewebeprobe; b) Bereitstellen von Bedingungen, die zum Nachweis des Polypeptids mit einem Mittel geeignet sind, und Nachweisen des Vorhandenseins des Polypeptids mit dem Mittel; und c) Vergleichen der Hochregulation des Polypeptids mit parallelisierten, normalen Kontrollen.
Test nach Anspruch 1, wobei die Gewebeprobe Brustgewebe ist.
Test nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel ein Antikörper ist.
Test nach Anspruch 3, wobei der Test ein Immunoassay ist.
Test zur Diagnose von Krebs, gekennzeichnet durch Hochregulation eines Nukleinsäuremoleküls in einer isolierten Brustgewebeprobe, wobei die Nukleinsäure für einen Inhibitor der apoptotischen Aktivität von p53 codiert und wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer wie in 2 dargestellten Sequenz besteht; ii) einem Nukleinsäuremolekül, das an die Nukleinsäuresequenz in 2 hybridisiert und das für einen Inhibitor der apoptotischen Aktivität von p53 codiert; und iii) einem Nukleinsäuremolekül, das aufgrund des genetischen Codes gegen-über den in (i) und (ii) definierten Sequenzen degeneriert ist; wobei der Test die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer zu testenden Probe; b) Bereitstellen von Bedingungen, die zum Nachweis des Nukleinsäuremoleküls mit einem Mittel geeignet sind, und Nachweisen des Vorhandenseins des Nukleinsäuremoleküls mit dem Mittel; und c) Vergleichen der Hochregulation der Nukleinsäure mit parallelisierten, normalen Kontrollen.
Test nach Anspruch 5, wobei das Mittel ein Nukleinsäuremolekül ist, das an die Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann.
Test nach Anspruch 6, wobei die Nukleinsäure wenigstens ein Oligonukleotid ist.
Test nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Test ein Test mittels Polymerasekettenreaktion ist.
Verwendung eines Antikörpers, der an ein Polypeptid, wie es durch die Aminosäuresequenz in 3 dargestellt ist, binden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs durch die Induktion von Apoptose.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 9, wobei der Krebs Brustkrebs ist.
Verwendung eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine Antisense-Sequenz zu einer Sense-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer wie in 2 dargestellten Sequenz besteht; ii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die an die Nukleinsäuresequenz in 2 hybridisiert; iii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die aufgrund des genetischen Codes gegenüber den in (i) und (ii) definierten Nukleinsäuresequenzen degeneriert ist; zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs durch die Induktion von Apoptose.
Screening-Verfahren zur Identifizierung von pharmakologischen Mitteln, welche die Bindung eines Polypeptids mit p53 stören, umfassend: i) Bereitstellen eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem DNA-Molekül, das aus einer Sequenz besteht, wie sie durch die Nukleinsäuresequenz in 2 dargestellt ist; b) einem DNA-Molekül, das an die Nukleinsäuresequenz in 2 hybridisiert und das für einen Inhibitor der apoptotischen Aktivität von p53 codiert; und c) einem DNA-Molekül, das aufgrund des genetischen Codes gegenüber den in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert ist; ii) Bereitstellen wenigstens eines zu prüfenden Mittels; iii) Bereitstellen einer eine Kombination aus (i) und (ii) bildenden Zubereitung; iv) Nachweisen oder Messen der Aktivität des Mittels bezüglich seines störenden Einflusses auf die Bindung des Polypeptids an p53; und gegebenenfalls v) Untersuchen der Wirkung des Mittels auf die Apoptose eines ausgewählten Zelltyps.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid von der in 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz codiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Polypeptid von einer Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zelle eine Krebszelle ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12-15, wobei das Polypeptid überexprimiert wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14-16, wobei die Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül transformiertitransfiziert ist, das für dieses Polypeptid codiert.
Pharmazeutisches Kombinationspräparat, umfassend wenigstens ein Antisense-Nukleinsäuremolekül zu der Sense-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer wie in 2 dargestellten Sequenz besteht; ii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die an die Sequenz in 2 hybridisiert; und iii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die aufgrund des genetischen Codes gegenüber den in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert ist; und ein chemotherapeutisches Mittel.
Präparat nach Anspruch 18, wobei das chemotherapeutische Mittel ein Antikrebsmittel ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cisplatin; Carboplatin; Cyclosphosphamid; Melphalan; Carmustin; Methotrexat; 5-Fluoruracil; Cytarabin; Mercaptopurin; Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; Vinblastin; Vincristin; Dactinomycin; Mitomycin C; Taxol; L-Asparaginase; G-CSF; einem Endiin wie Calicheamicin oder Esperamicin; Chlorambucil; ARA-C; Vindesin; Bleomycin; oder Etoposid.
Präparat nach Anspruch 19, wobei das Mittel Cisplatin ist.
Pharmazeutisches Kombintaionspräparat, umfassend einen Antikörper, der ein Polypeptid binden kann, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer wie in 2 dargestellten Sequenz besteht; ii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die an eine Nukleinsäuresequenz in 2 hybridisiert; und iii) einem Nukleinsäuremolekül, das aus einer Sequenz besteht, die aufgrund des genetischen Codes gegenüber den in (i) und (ii) definierten Sequenzen degeneriert ist; und ein chemotherapeutisches Mittel.
Präparat nach Anspruch 21, wobei das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cisplatin; Carboplatin; Cyclosphosphamid; Melphalan; Carmustin; Methotrexat; 5-Fluoruracil; Cytarabin; Mercaptopurin; Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; Vinblastin; Vincristin; Dactinomycin; Mitomycin C; Taxol; L-Asparaginase; G-CSF; einem Endiin wie Calicheamicin oder Esperamicin; Chlorambucil; ARA-C; Vindesin; Bleomycin; oder Etoposid.
Präparat nach Anspruch 22, wobei das chemotherapeutische Mittel Cisplatin ist.