ES2269430T3 - Gen supresor. - Google Patents
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Abstract
Un ensayo para diagnosticar cáncer caracterizado por la regulación al alza de un polipéptido en una muestra de tejido aislada, polipéptido que es un inhibidor de la actividad apoptótica de p53, en el que dicho polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: i) una molécula de ADN que consiste en una secuencia como se representa en la figura 2; ii) una molécula de ADN que hibrida en condiciones restrictivas de hibridación con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y iii) una molécula de ADN que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) en el que dicho ensayo comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de tejido aislada para ser probada b) proporcionar condiciones adecuadas para la detección del polipéptido por un agente y detectar la presencia del polipéptido por el agente; y c) comparar la regulación al alza del polipéptido con controles normales emparejados.
Description
Gen supresor.
La presente invención se refiere a miembros de
una familia de genes, que codifican polipeptidasas capaces de
inhibir la actividad proapoptótica de p53.
Los genes supresores de tumores codifican
proteínas que funcionan para inhibir el crecimiento o la división
celular y son por lo tanto importantes respecto a mantener la
proliferación, crecimiento y diferenciación de células normales. Las
mutaciones en los genes supresores de tumores dan como resultado una
progresión anormal del ciclo celular por la que los puntos de
control del ciclo celular normales que detienen el ciclo cuando por
ejemplo el ADN esta dañado son ignorados y las células dañadas se
dividen de forma incontrolada. Los productos de los genes
supresores de tumores funcionan en todas las partes de la célula
(por ejemplo, superficie celular, citoplasma, núcleo) para prevenir
el paso de células dañadas a través del ciclo celular (es decir, G1,
S, G2, M y citocinesis).
Se han aislado y secuenciado diversos genes
supresores de tumores. Estos incluyen, sólo como ejemplo, el gen del
retinoblastoma (Rb), en el que mutaciones están asociadas a cánceres
tales como cáncer de hueso (osteocarcoma), de vejiga, de células
pequeñas de pulmón y de mama, así como retinoblastoma y el gen del
tumor de Wils-1, mutaciones que están asociadas a
nefroblastoma y neurofibromatosis.
La familia de genes supresores de tumores, MAD
(madres contra dpp (gen decapentapélgico)) y MADR (genes
relacionados con MAD) se han identificado en diversas especies.
Estos genes codifican proteínas implicadas en rutas de transducción
de señal requeridas para la señalización del receptor
serina/treonina. El MADR1 es esencial para la señalización de la
ruta dpp. El MADR2 es otro MADR y mutaciones en este gen se
han relacionado con cáncer colorrectal (6% de los cánceres
colorrectales). La secuencia del gen MADR2, también conocido como
Smad2, se describe en el documento WO 98/07849.
Podría decirse que el gen supresor de tumores
que ha sido objeto de la investigación más intensa es el p53. El p53
codifica una proteína que funciona como un factor de transcripción y
es un regulador clave del ciclo de división celular. Fue descubierto
en 1978 (Lane y Crawford, 1979) como una proteína que se demostró
que se unía con afinidad al antígeno mayor T de SV40. El gen p53
codifica un polipéptido de 393 aminoácidos con un peso molecular de
53 kDa.
Los genes regulados por la actividad de
transcripción de p53 contienen una secuencia de reconocimiento de
p53 en sus regiones 5'. Estos genes son activados cuando los niveles
celulares de p53 son elevados debido a, por ejemplo, daño del ADN.
Ejemplos de genes que responden a p53 incluyen mdm2 (Momand y col.,
1992), Bax (Miyashita y Reed, 1995) y PIG-3 (Polyak
y col., 1997). Bax y PIG-3 están implicados en una
de las funciones más importantes de p53, la inducción de la
apoptosis. La apoptosis, o muerte celular programada es un proceso
natural que elimina las células dañadas. Es de importancia respecto
a muchos procesos celulares, incluyendo la eliminación de células
precancerosas, el desarrollo de células/tejidos y la
homeostasis.
Como se ha mencionado anteriormente, uno de las
funciones de supresión de tumores más importantes de p53 es la
capacidad de inducir la apoptosis. La capacidad para regular al alza
la expresión de algunos de los genes proapoptóticos tales como Bax
proporcionó alguna prueba de cómo p53 induce la apoptosis. Sin
embargo, comparando la expresión de Bax en ratones transgénicos
p53(-/-) y p53(+/+) y el tipo salvaje, es evidente que la expresión
de Bax sólo estaba regulada por p53 en un número limitado de tejidos
en respuesta a daño del ADN. Por lo tanto, sigue estando poco claro
por qué la expresión de p53 sólo podría inducir la expresión de Bax
de una forma específica del tipo celular. Recientemente se demostró
que una mutación en p53 puede cambiar la especificidad promotora.
Se demostró que dos de los genes mutantes de p53 derivados de
tumores eran defectuosos en la transactivación del promotor de Bax
pero competentes para transactivar otros promotores de genes diana
de p53 tales como mdm2 y p21wafl. Estas observaciones
sugirieron
que para ser capaz de transactivar genes como Bax, es muy importante para el tumor la función de supresión de p53.
que para ser capaz de transactivar genes como Bax, es muy importante para el tumor la función de supresión de p53.
Es sabido que p53 induce la apoptosis a través
de rutas transcripcionales dependientes e independientes. Además, la
apoptosis inducida por p53 puede ser bloqueada por el oncogén
bcl-2. No obstante, bcl-2 no inhibe
la función de transactivación de p53. Hasta ahora se sabe muy poco
sobre los mecanismos moleculares de cómo bcl-2
inhibe la apoptosis inducida por p53.
La 53BP2 es una proteína de unión a p53
inicialmente descubierta por Iwabuchi y col. (1994). Se aisló 53BP2
en una detección sistemática de levadura doble híbrida y se
descubrió que consistía en 528 aminoácidos a partir del extremo
C-terminal de la proteína. Contiene una secuencia
rica en prolina, cuatro repeticiones anquirina y un dominio SH3.
Seguidamente se identificó como una proteína que interactuaba con
Bcl-2 (Naumovski y Cleary, 1996). Una versión más
larga de esta proteína se aisló y se denominó bBP2/53BP2. Basándose
en los datos de traducción in vitro, los autores (Naumovski y
Cleary, 1996) predijeron que la proteína bBP2/53BP2 consistía en
1005 aminoácidos.
En un intento de entender cómo la función
apoptótica de p53 puede ser regulada in vivo, se generaron
anticuerpos para 53BP2 y se demostró que en la mayoría de las
células sometidas a prueba, el nivel de expresión de 53BP2 es bajo.
También se observó que la bBP2/53BP2 endógena inesperadamente
codifica una proteína mayor que los 1005 aminoácidos predichos por
Naumovski y Cleary. Esta proteína se denomina ASP-2
o ASP-2/53BP.
Se ha demostrado que la mitad
C-terminal de la bBP2/53BP2 no tiene un efecto
significativo sobre la actividad de p53. Sin embargo, la
ASP-2/53BP estimulaba la función de transactivación
de p53. De forma más interesante, la ASP-2/53BP
puede incrementar específicamente la función de transactivación de
p53 en los promotores derivados de genes proapoptóticos tales como
Bax y PIG-3.
Usando la secuencia de ADNc de
ASP-2, se realizó una investigación BLAST y se
identificó un clon denominado KIAA0771 con homología significativa
con la secuencia de ácido nucleico que codifica bBp2/53BP2, lo que
sugiere que la secuencia recientemente identificada es un miembro de
una familia de genes que codifican proteínas estimulantes de la
apoptosis (ASP). Este miembro de la familia es referido como
ASP-1.
Se ha nombrado la nueva secuencia de ácido
nucleico ASP-1 (proteína estimulante de la apoptosis
1), que codifica un polipéptido que tiene homología de secuencia con
bBP2/53BP2.
Se ha identificado un regulador de
ASP-2 que inhibe el efecto estimulador de p53 de
ASP-2. Se ha denominado a este regulador
I-ASP. I-ASP fue descrito en la
técnica como RAI (inhibidor asociado a Rel1A) por Yang JP y col.,
JBC 274:15662 y documento WO 0032628.como un inhibidor de
NF-KB. Se ha descubierto que en tumores que expresan
ASP-1 y ASP-2, la expresión de
I-ASP está regulada al alza comparada con los
controles normales emparejados. Esto sugiere que la actividad de
supresión de tumores de p53 puede estar regulada positiva y
negativamente por ASP y I-ASP in vivo.
De aquí en adelante, la expresión "polipéptido
de la invención" se referirá a I-ASP.
El alcance la invención está definido
exclusivamente por las reivindicaciones, la descripción tiene
propósito ilustrativo.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
un anticuerpo, o parte unión del mismo, que se una al menos a una
parte del polipéptido de la invención.
En una realización preferida de la invención,
dicha parte de unión está seleccionada del grupo constituido por:
fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd; comprendiendo los
anticuerpos regiones CDR3.
En una realización preferida de la invención,
dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización adicional más de la
invención, dicho anticuerpo está humanizado.
De forma alternativa, dicho anticuerpo es un
anticuerpo quimérico producido por procedimientos recombinantes para
contener la región variable de dicho anticuerpo con una región
invariante o constante de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos
recombinantes en los que todas las regiones V de un anticuerpo de
ratón o rata están combinadas con regiones C de anticuerpos humanos.
Los anticuerpos humanizados son anticuerpos híbridos recombinante
que fusionan las regiones determinantes de complementariedad a
partir de una región V de un anticuerpo de roedor con las regiones
marco a partir de las regiones V del anticuerpo humano. Las regiones
C del anticuerpo humano también se usan. Las regiones determinantes
de complementariedad (CDR) son las regiones en el interior del
dominio N-terminal tanto de la cadena pesada como de
la ligera del anticuerpo al que se restringe la mayoría de la
variación de la región V. Estas regiones forman bucles en la
superficie de la molécula de anticuerpo. Estos bucles proporcionan
la superficie de unión entre el anticuerpo y el antígeno.
La producción de anticuerpos es bien conocida en
la técnica. Están disponibles varios libros de texto de laboratorio
para el experto. Por ejemplo, Antibodies, Lane y Harlow, Cold Spring
Harbour Laboratories.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un procedimiento para determinar la expresión de ARNm
y/o el polipéptido según la invención.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un procedimiento para la detección sistemática de
agentes capaces de modular la actividad del polipéptido según la
invención, que comprende:
i) proporcionar una célula o línea celular que
expresa el polipéptido según la invención;
ii) exponer a la célula a al menos un agente
para el que se realiza la prueba; y
iii) monitorizar el efecto del agente o agentes
sobre la actividad del polipéptido.
Según otro aspecto adicional de la invención, se
proporciona un procedimiento para hacer un barrido para buscar
agentes capaces de modular la actividad del polipéptido según la
invención, que comprende:
i) proporcionar al menos el polipéptido según la
invención;
ii) exponer al polipéptido a al menos un agente
para el que se realiza la prueba; y
iii) monitorizar la unión de dicho agente o
agentes por dicho polipéptido.
En una realización preferida adicional de la
invención, dicho agente es un antagonista que inhibe la actividad
del polipéptido según la invención. Preferiblemente, dicho agente es
un polipéptido.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una molécula de acido nucleico no codificante en el que
dicha molécula comprende la secuencia no codificante de la secuencia
codificante representada en la figura 2 o parte de la misma.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula
no codificante según la invención.
En una realización preferida de la invención,
dicho ácido nucleico no codificante está combinado con al menos un
agente quimioterapéutico. Preferiblemente, dicho agente es una
agente anticancerígeno seleccionado del grupo constituido por:
cisplatino; carboplatino; ciclosfosfamida; melfalán; carmuslina;
metotrexato; 5-fluorouracilo; citarabina;
mercaptopurina; daunorrubicina; doxorrubicina; epirrubicina;
vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol;
L-asparaginasa; G-CSF; una enedina
tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil;
ARA-C; vindesina; bleomicina y etopósido. Otros
agentes que pueden combinarse con los anteriores incluyen agentes
que actúan sobre la neovasculatura o los inmunomoduladores
tumorales. Preferiblemente, el agente que actúa sobre la
neovasculatura tumoral se selecciona del grupo constituido por
combrestatina A4, angiostatina y endostatina. Preferiblemente, el
inmunomodulador se selecciona del grupo constituido por
\alpha-interferón,
\gamma-interferón y factor de necrosis tumoral
\alpha (TNF\alpha).
En una realización preferida de la invención,
dicho agente es cisplatino.
La invención implica por lo tanto la detección
de polipéptidos I-ASP, genes que codifican
I-ASP, modificaciones y variaciones funcionales de
los anteriores, fragmentos útiles de los anteriores, así como la
terapéutica relacionada con ellos. La expresión de este gen afecta a
la apoptosis uniéndose a p53 y polipéptidos relacionados.
Como se usa en este documento respecto a ácidos
nucleicos, el término "aislado" significa: (i) amplificado
in vivo, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR); (ii) producido de forma recombinante por clonación; (iii)
purificado, como por escisión y separación en gel; o (iv)
sintetizado por, por ejemplo, síntesis química. Un ácido
nuclei-
co aislado es aquel que es fácilmente manipulable por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.
co aislado es aquel que es fácilmente manipulable por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.
Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos
contenida en un vector en la que los sitios de restricción 5' y 3'
son conocidos o para la que se han descrito secuencias cebadoras
para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es considerada
aislada, pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su
estado nativo en su anfitrión natural no lo es. Un ácido nucleico
puede ser sustancialmente purificado, pero no necesita serlo. Por
ejemplo, un ácido nucleico que es aislado en un vector de clonación
o de expresión no es puro en el sentido de que puede comprender sólo
un pequeño porcentaje del material en la célula en la que reside.
Tal ácido nucleico es aislado, sin embrago, como se usa el término
en este documento, porque es fácilmente manipulable por técnicas
convencionales conocidas para aquellos exper6tos habituales en la
técnica. Un ácido nucleico aislado como se usa en este documento no
es un cromosoma que aparece de forma natural.
Como se usa en este documento respecto a
polipéptidos, "aislado" significa separado de su ambiente
nativo y presente en cantidad suficiente para permitir su
identificación o uso. Aislado cuando se refiere a una proteína o
polipéptido significa, por ejemplo: (i) producido de forma selectiva
por expresión o clonación o (ii) purificado como por cromatografía o
electroforesis. Las proteínas o polipéptidos aislados pueden ser
sustancialmente puros, aunque no necesitan serlo. El término
"sustancialmente puro" significa que las proteínas o los
polipéptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las
que se pueden encontrar en la naturaleza o en sistemas in
vivo en un grado práctico y apropiado para el uso que se
pretende. Los polipéptidos sustancialmente puros pueden producirse
por técnicas bien conocidas en la técnica. Ya que una proteína
aislada se puede mezclar con un portador farmacéuticamente aceptable
en una preparación farmacéutica, la proteína puede comprender sólo
un pequeño porcentaje en peso de la preparación. La proteína está
aislada no obstante ya que ha sido separada de las sustancias con
las que puede estar asociada en sistemas vivos, es decir, aislada de
otras proteínas.
Un aspecto de la invención son aquellas
secuencias de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos
I-ASP y que hibridan con una molécula de ácido
nucleico como se proporciona en este documento en condiciones
restrictivas. El término "condiciones restrictivas" como se usa
en este documento se refiere a parámetros con los que la técnica es
familiar. Se pueden encontrar parámetros de hibridación de ácidos
nucleicos en referencias que recopilan tales procedimientos, por
ejemplo Molecular cloning: A laboratory Manual, J. Sambrook,
y col., ed. Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in
Molecular Biology, F.M. Ausubel, y col., ed., John Willey &
Sons, Inc., Nueva York. Más específicamente, condiciones
restrictivas, como se usa en este documento, se refiere a por
ejemplo, hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5 x SCC,
Ficoll 2%, polivinilpirrolidona 0,02%, albúmina de suero bovino
0,02%, NaH_{2}PO_{4} 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es
cloruro de sodio 0,15M/citrato de sodio 0,015M, pH 7; SDS es dodecil
sulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético. Después
de la hibridación, la membrana sobre la cual se transfiere el ADN se
lava a 2 x SSC a temperatura ambiente y luego a
0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta
68ºC.
Hay otras condiciones, reactivos, etc que se
pueden usar que dan como resultado un grado de restricción similar.
Al experto le serán familiares tales condiciones, y por lo tanto no
se dan en este documento. Se entenderá, sin embargo, que el experto
será capaz de manipular las condiciones de una manera que permita la
identificación clara de homólogos y alelos de ácidos nucleicos de
I-ASP. Al experto le es también familiar con la
metodología para detectar selectivamente células y bibliotecas para
la expresión de tales moléculas, que son después aisladas de forma
rutinaria, seguido por aislamiento de la molécula de ácido nucleico
pertinente y su secuenciación.
En general, los homólogos y los alelos
típicamente compartirán al menos el 90% de identidad de nucleótidos,
y/o al menos el 95% de identidad de aminoácidos. La homología puede
calcularse usando diversas herramientas de software disponibles
públicamente desarrolladas por NCBI (Bethesda, Maryland) que se
pueden obtener a través de Internet
(ftp:/nc-bi.nlm.nih.gov/pub/).
Herramientas ejemplares incluyen el sistema
BLAST disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov,
preferiblemente usando los ajustes dados por defecto. Los
alineamientos de Pairwise y ClustalW (ajuste de matriz BLOSUM30) así
como el análisis hidropático de Kyle-Doolitle se
pueden obtener usando el software de análisis de secuencia MacVector
(Oxford Molecular Group). Los complementos de Watson y Crick de los
ácidos nucleicos anteriores también están abarcados en la
invención.
Al detectar selectivamente ácidos nucleicos que
codifican proteínas I-ASP con homología de secuencia
con los ácidos nucleicos descritos en este documento, se puede
realizar una transferencia de Southern usando las condiciones
anteriores, junto con una sonda detectable (por ejemplo,
radioactiva, quimioluminiscente). Después de lavar la membrana a la
cual se transfiere finalmente el DN, se puede detectar la señal de
la sonda, tal como situando la membrana frente a una película de
rayos X o placas de obtención de imágenes por fosforescencia para
detectar la señal radioactiva, o procesando la membrana para
detectar la señal quimioluminiscente.
La invención también incluye ácidos nucleicos
degenerados que incluyen codones alternativos a aquellos presentes
en los materiales nativos. Por ejemplo, los restos de serina están
codificados por los codones TCA, AGT, TCC, TCG, TCT, y AGC. Cada uno
de los seis codones es equivalente para los propósitos de codificar
un resto de serina. Por lo tanto, resultará evidente para un experto
habitual en la materia que cualquiera de los tripletes de
nucleótidos que codifican serina se puede emplear para dirigir el
aparato de síntesis de proteínas, in vitro o in vivo,
para incorporar un resto de serina en un polipéptido en elongación.
De forma similar, las secuencias de tripletes de nucleótidos que
codifican otros restos de aminoácidos incluyen, pero no se limitan
a: CCA, CCC, CCG y CCT (codones prolina); CGA, CGC, CGG, AGA y AGG
(codones arginina); ACA, ACC, ACG y ACT (codones treonina); AAC y
AAT (codones asparagina); y ATA, ATC y ATT (codones isoleucina).
Otros restos de aminoácidos pueden estar codificados de forma
similar por múltiples secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, la
invención abarca ácidos nucleicos degenerados que difieren de los
ácidos nucleicos aislados biológicamente en su secuencia de codones
debido a la degeneración del código genético.
La invención también proporciona moléculas de
ácido nucleico o polipéptidos modificados que incluyen adiciones,
sustituciones y deleciones de uno o más nucleótidos o aminoácidos.
Como se usa en este documento, "uno o más" significa 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más hasta un número que no
cambia sustancialmente la función de la molécula para aquellas
moléculas en las que se desea que la función sea sustancialmente
similar a la del ácido nucleico o polipéptido original. Un cambio
sustancial de función sería, por ejemplo, una proteína
dominantemente negativa, o una proteína que ha perdido una o más de
sus funciones.
En realizaciones preferidas, estas moléculas de
ácidos nucleicos modificadas y/o los polipéptidos que codifican
mantienen al menos una actividad o función de la molécula de ácido
nucleico y/o polipéptidos no modificados, tal como unión a p53,
antigenicidad, actividad de transcripción, etc. En ciertas
realizaciones, las moléculas de ácido nucleico modificadas codifican
polipéptidos modificados, preferiblemente polipéptidos que tienen
sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describen en
otras partes de este documento. Las moléculas de ácido nucleico
modificadas están estructuralmente relacionadas con las moléculas de
ácido nucleico no modificadas y en realizaciones preferidas, están
estructuralmente relacionados de forma suficiente con las moléculas
de ácido nucleico no modificadas de tal forma que las moléculas de
ácido nucleico modificadas y no modificadas hibridan en condiciones
altamente restrictivas conocidas por el experto en la materia.
Por ejemplo, se pueden preparar moléculas de
ácido nucleico modificadas que codifican polipéptidos que tienen
cambios únicos de aminoácidos. Cada una de estas moléculas de ácidos
nucleicos pueden tener una, dos o tres sustituciones de nucleótidos
que exclusivas de cambios de nucleótidos correspondientes a la
degeneración del código genético como se describe en este documento.
De forma similar, se pueden preparar moléculas de ácido nucleico
modificadas que codifican polipéptidos que tienen dos cambios de
aminoácidos, las cuales tienen, por ejemplo, 2-6
cambios de nucleótidos. El experto en la materia se imaginará
fácilmente numerosas moléculas de ácido nucleico modificadas como
estas, incluyendo por ejemplo sustituciones de nucleótidos en
codones que codifican aminoácidos 2 y 3, 2 y 4, 2 y 5, 2 y 6, y así
sucesivamente. En el ejemplo anterior, cada combinación de dos
aminoácidos está incluida en el juego de moléculas de ácido nucleico
modificadas, así como todas las sustituciones de nucleótidos que
codifican para las sustituciones de aminoácidos. También se pueden
preparar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican
polipéptidos que tienen sustituciones adicionales (es decir, 3 o
más), adiciones o deleciones (por ejemplo, por la introducción de un
codón de detención o un sitio o sitios de empalme, y están abarcados
por esta invención como se será fácilmente imaginado por un experto
en la materia. Cualquiera de los ácidos nucleicos o polipéptidos
anteriores se puede someter a prueba por experimentación rutinaria
respecto a la retención de la relación estructural o actividad para
los ácidos nucleicos y/o polipéptidos descritos en este
documento.
La invención también proporciona fragmentos de
I-ASP aislados o complementos de los mismos de
longitud suficiente para representar una secuencia única dentro del
genoma humano, e identificar un ácido nucleico que codifica
polipéptidos I-ASP. Estos fragmentos se pueden
considerar únicos en el sentido de que un fragmento único es aquel
que es una "firma" para el ácido nucleico mayor. Un fragmento
único, por ejemplo, es lo suficientemente largo como para asegurar
que su secuencia precisa no se encuentra en moléculas fuera de los
ácidos nucleicos I-ASP definidos anteriormente, es
decir, que identifica específicamente las secuencias
I-ASP. Un fragmento único incluye una secuencia de
nucleótidos contiguos que no es idéntica a ninguna de las secuencias
presentes en las bases de datos disponibles públicamente (por
ejemplo, Gen Bank) hasta la fecha de presentación de esta solicitud,
aunque ciertos fragmentos pueden contener como una porción del
fragmento algunas secuencias previamente conocidas depositadas en el
GenBank. De forma similar, los complementos de secuencias
públicamente conocidas y fragmentos de las secuencias públicamente
conocidas y complementos de los mismos pueden ser una porción, pero
no la totalidad de los fragmentos únicos de I-ASP.
Por lo tanto, un fragmento único excluye, por definición, secuencias
constituidas solamente por EST y/o secuencias de genes depositadas
en bases de datos disponibles públicamente hasta la fecha más
temprana de presentación de las secuencias contenidas en esta
solicitud. Por lo tanto, un fragmento único debe contener una
secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia exacta de aquellas
que se encuentran en el GenBank o fragmentos de las mismas. La
diferencia puede ser una adición, deleción o sustitución respecto a
la secuencia del GenBank o puede ser una secuencia completamente
distinta de la secuencia del GenBank.
Se pueden usar fragmentos de moléculas de ácido
nucleico I-ASP, incluyendo fragmentos únicos, como
sondas en ensayos de transferencia de hibridación (por ejemplo,
técnica de Southern, técnica de Northern) para identificar tales
ácidos nucleicos, en ensayos de protección de la nucleasa para medir
la transcripción, o se pueden usar en ensayos de amplificación tales
como aquellos que emplean PCR. Como es sabido para los expertos en
la materia, se prefieren sondas grandes tal como de 200, 250, 300 o
más nucleótidos para ciertos usos tales como técnicas de Southern y
de Northern, mientras que fragmentos más pequeños se preferirán para
usos tales como PCR. También se pueden usar fragmentos para
producir proteínas de fusión para generar anticuerpos o determinar
la unión de fragmentos de polipéptidos, o para generar componentes
de inmunoensayo. De forma similar, se pueden emplear fragmentos para
producir fragmentos no fusionados de los polipéptidos
I-ASP tales como fragmentos
N-terminales o C-terminales, o los
diversos dominios proteicos descritos en este documento, útiles por
ejemplo en la preparación de anticuerpos, en inmunoensayos y como
parejas de unión comparativas de los polipéptidos
I-ASP y/u otros polipéptidos que se unen a p53 o
polipéptidos rel, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas. Se
pueden usar fragmentos adicionalmente como moléculas no
codificantes, como se describe en este documento, para inhibir la
expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos I-ASP,
particularmente para propósitos terapéuticos como se describe en
mayor detalle en este documento.
Como reconocerán aquellos expertos en la
materia, el tamaño del fragmento único dependerá de su conservación
en el código genético. Por lo tanto, algunas regiones de las
moléculas de ácido nucleico y sus complementos requerirán segmentos
más largos para ser únicas mientras que otras requerirán tan solo
segmentos más cortos, típicamente ente 12 y 32 nucleótidos (por
ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32
bases de longitud). Esta descripción tiene intención de abarcar
todos y cada uno de los fragmentos de cada secuencia, empezando por
el primer nucleótido, el segundo nucleótido, y así sucesivamente
hasta 8 nucleótidos antes del final, y terminando en cualquier
lugar desde el nucleótido número 8, 9, 10 y así sucesivamente para
cada secuencia, hasta el último nucleótido de todos (siempre que la
secuencia sea única como se ha descrito anteriormente). Muchos
segmentos de los ácidos nucleicos I-ASP, o
complementos de los mismos que tienen una longitud de 25 nucleótidos
o más serán únicos. Aquellos expertos en la materia versados en
procedimientos para determinar tales secuencias, típicamente sobre
la base de la capacidad del fragmento único para distinguir
selectivamente la secuencia de interés de ácidos nucleicos no
I-ASP. Una comparación de la secuencia del fragmento
con aquellas de bases de datos conocidas es típicamente todo lo que
resulta necesario, aunque se pueden realizar hibridación
confirmatoria in vitro y análisis de secuenciación.
Un fragmento puede ser un fragmento funcional.
Un fragmento funcional de la molécula de ácido nucleico de la
invención es un fragmento que mantiene algunas propiedad funcional
de la molécula de ácido nucleico mayor, tal como codificar para un
polipéptido funcional, unirse a proteínas (por ejemplo, a p53),
regular la transcripción de ácidos nucleicos unidos de forma
operativa, codificar para epítopos reconocidos inmunológicamente y
similares. Un experto habitual en la materia puede determinar
fácilmente usando los ensayos descritos en este documento y aquellos
bien conocidos en la técnica para determinar si un fragmento es un
fragmento funcional de una molécula de ácido nucleico usando nada
más que experimentación rutinaria.
Como se ha mencionado anteriormente, la
invención abarca oligonucleótidos no codificantes que se unen
selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido I-ASP, para modular la unión de p53, la
actividad transcripcional o la apoptosis, por ejemplo. Esto es
deseable en prácticamente cualquier dolencia médica en la que es
deseable una modulación de la actividad de p53, tal como cáncer y
dolencias que implican apoptosis aberrante.
Como se usa en este documento, "nucleótido no
codificante" o "no codificante" describe un oligoncleótido
que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido u
oligodesoxirribonucleótido modificado que hibrida en condiciones
fisiológicas con ADN que comprende un gen particular, o con un
transcripto de ARNm de ese gen y, por ello inhibe la transcripción
de ese gen y/o la traducción de ese ARNm,. Las moléculas no
codificantes se diseñan de tal manera que interfieran con la
transcripción o la traducción de un gen diana mediante hibridación
con el gen o transcripto diana. Aquellos expertos en la materia
reconocerán que la longitud exacta del oligonucleótido no
codificante y su grado de complementariedad con su diana dependerá
de la diana específica seleccionada, incluyendo la secuencia de la
diana las bases particulares que comprende dicha secuencia. Se
prefiere que el oligonucleótido no codificante se construya y se
ordene de tal manera que se una selectivamente con la diana en
condiciones fisiológicas, es decir, para hibridar sustancialmente
más con la secuencia diana que con cualquier otra secuencia en la
célula diana en condiciones fisiológicas. Basándose en las
secuencias de ácido nucleico I-ASP proporcionadas en
este documento, o en secuencias alélicas u homólogas genómicas y/o
de ADNc, un experto en la materia puede fácilmente elegir y
sintetizar cualquiera de varias moléculas no codificantes apropiadas
para usarlas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, se
puede preparar un "camino génico" que comprende una serie de
oligonucleótidos de 15-30 nucleótidos que engloba la
longitud de un ácido nucleico I-ASP, seguido de una
prueba respecto a la inhibición de la expresión de
I-ASP correspondiente. Opcionalmente, se pueden
dejar huecos de 5-10 nucleótidos entre los
oligonucleótidos para reducir el número de oligonucleótidos
sintetizados y sometidos a prueba.
Con el fin de ser suficientemente selectivos y
potentes para la inhibición, tales oligonucleótidos no codificantes
deberían comprender al menos 10, y más preferiblemente al menos 15
bases consecutivas que sean complementarias con la diana, aunque en
ciertos casos, se han usado oligonucleótidos modificados de tan solo
7 bases de longitud con éxito como oligonucleótidos no codificantes
8Wagner y col., Nature Biotechnol.
14:840-844, 1996). Con la mayor preferencia, los
oligonucleótidos no codificantes comprenden una secuencia
complementaria de 20-30 bases. Aunque se pueden
elegir oligonucleótidos que sean no codificantes para cualquier
región del gen o transcriptos de ARNm, en las realizaciones
preferidas, los oligonucleótidos no codificantes corresponden a
sitios N-terminales o sitios en dirección 5' tales
como sitios de iniciación de la traducción, iniciación de la
transcripción o promotores. Además, se pueden dirigir hacia regiones
no traducidas 3'. Se ha usado dirigirse a sitios de empalme de ARNm
en la técnica, pero puede ser menos preferido si se da empalme
alternativo de ARNm. Además, el no codificante se dirige
preferiblemente a sitios en los que no se espera estructura
secundaria de ARNm (véase, por ejemplo, Sainio y col., Cell Mol.
Neurobiol. 14(5): 439-454, 1994) y en los
que no se espera que se unan proteínas. Finalmente, aunque las
secuencias de ADNc I-ASP se describen en este
documento, un experto habitual en la materia puede derivar
fácilmente el ADN genómico correspondiente a estos ADNc. Por lo
tanto, la presente invención también proporciona oligonucleótidos no
codificantes que son complementarios al ADNc genómico
I-ASP. De forma similar, están permitidos sin
excesiva experimentación no codificantes para ADNc genómicos u
homólogos y ADN genómicos.
En un juego de realizaciones, los
oligonucleótidos de la invención pueden estar compuestos por
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos naturales o cualquier
combinación de los mismos. Es decir, el extremo 5' de un nucleótido
nativo y el 3' de otro nucleótido nativo pueden estar unidos
covalentemente, como en los sistemas naturales, por medio de un
enlace fosfodiéster internucleósido. Estos oligonucleótidos pueden
ser preparados por procedimientos reconocidos en la técnica que
pueden llevarse a cabo de forma manual o por un sintetizador
automático. También se pueden producir de forma recombinante por
vectores.
En realizaciones preferidas, los
oligonucleótidos no codificantes de la invención también pueden
incluir oligonucleótidos "modificados". Es decir, los
oligonucleótidos pueden estar modificados de varias formas que no
evitan que hibriden con su diana, pero que potencian su estabilidad
o dirección o que potencian de otra manera su eficacia
terapéutica.
El término oligonucleótidos "modificados"
como se usa en este documento describe un oligonucleótidos en el que
(1) al menor dos de sus nucleótidos están unidos covalentemente por
medio de un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace
distinto de un enlace fosfodiéster entre el extremo 5' de un
nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido) y/o (2) un grupo
químico normalmente no asociado con ácidos nucleicos se ha adjuntado
covalentemente al oligonucleótido. Son enlaces internucleósidos
sintéticos preferidos fosforotioatos, fosforoditioatos, ésteres
fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforoamidatos, carbamatos,
carbonatos, triésteres fosfato, acetamidatos, ésteres
carboximetílicos y péptidos.
El término "oligonucleótido modificado"
abarca también oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificados
covalentemente. Por ejemplo, oligonucleótidos modificados incluyen
oligonucleótidos que tienen azúcares en el esqueleto que están
adjuntados de forma covalente a grupos orgánicos de bajo peso
molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y
distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Por lo tanto, los
oligonucleótidos modificadas pueden incluir un grupo ribosa
2'-O-alquilado. Además, los
oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como
arabinosa en lugar de ribosa. La presente invención por lo tanto,
contempla preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas no
codificantes modificadas que son complementarias e hibridables en
condiciones fisio-
lógicas con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos I-ASP, junto con portadores farmacéuticamente aceptables.
lógicas con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos I-ASP, junto con portadores farmacéuticamente aceptables.
Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser
administrados como parte de una composición farmacéutica. Tal
composición farmacéutica puede incluir los oligonucleótidos no
codificantes en combinación con cualquier portador convencional
fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable que son conocidos en la
técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una
cantidad terapéuticamente eficaz de de los oligonucleótidos no
codificantes en una unidad de peso o volumen adecuada para la
administración a un paciente. Las características del portador
dependerán de la vía de administración. Los portadores fisiológica y
farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales,
tampones, estabilizantes, solubilizantess y otros materiales que son
bien conocidos en la técnica.
Como se usa en este documento, un "vector"
puede ser cualquiera de varios ácidos en el que se puede insertar
una secuencia por restricción y ligamiento para el transporte entre
diferentes ambientes genéticos o para expresión en una célula
anfitriona. Los vectores incluyen, pero no se limitan a plásmidos,
fagémidos, y genomas de virus. Un vector de clonación es aquel que
es capaz de replicarse en una célula anfitriona, y que típicamente
está caracterizado además por uno o más sitios de restricción de
endonucleasa por los que se puede cortar el vector de una manera
determinada y en el que se puede ligar una determinada secuencia de
ADN de tal forma que el nuevo vector recombinante mantiene su
capacidad para replicarse en la célula anfitriona. En el caso de
plásmidos, la replicación de la secuencia deseada se puede producir
muchas veces según el plásmido aumenta en número de copias en el
interior de la bacteria anfitriona o sólo una única vez por
anfitrión antes de que el anfitrión se reproduzca por mitosis. En el
caso de un fago, la replicación se puede producir de forma activa
durante una fase lítica o de forma pasiva durante una fase
lisogénica. Un vector de expresión es aquel en el que se puede
insertar una secuencia deseada de ADN por restricción y ligamiento
de tal forma que se junta operativamente a secuencias reguladoras y
puede ser expresado como transcripto de ARN. Los vectores pueden
contener adicionalmente una o más secuencias marcadoras adecuadas
para su uso en la identificación de células que han sido o no
transformadas o transfectadas con el vector. Los marcadores
incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o
disminuyen la resistencia o sensibilidad a antibióticos u otros
compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son
detectables por ensayos convencionales conocidos en la materia (por
ejemplo, \beta-galactosidasa, luciferasa o
fosfatasa alcalina), y genes que afectan visiblemente el fenotipo
de las células, anfitriones, colonias o placas transformados o
transfectados (por ejemplo, diversas proteínas fluorescentes tales
como proteína verde fluorescente, GFP). Los vectores preferidos son
aquellos capaces de replicación autónoma y expresión de los
productos estructurales de los genes presentes en los segmentos de
ADN a los que están unidos de forma operativa.
Como se usa en este documento, se dice que una
secuencia de codificación y secuencias reguladoras se juntan de
forma operativa cuando están unidas covalentemente de tal forma que
ponga la expresión o transcripción de la secuencia de codificación
bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Si se
desea que las secuencias codificadoras se traduzcan en una proteína
funcional, se dice que dos secuencias ADN están juntas de forma
operativa si la inducción de un promotor en las secuencias
reguladoras 5' dan como resultado la transcripción de la secuencia
codificadora y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias
de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de
desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la
región promotora de dirigir la transcripción de las secuencias
codificadoras, o (3) interfiere con la capacidad del transcripto de
ARN correspondiente de ser traducido en una proteína. Por lo tanto,
una región promotora se juntaría de forma operativa con una
secuencia codificadora si la región promotora fuese capaz de
efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de tal forma que
el transcripto resultante pueda ser traducido en la proteína o
polipéptido deseados.
La naturaleza precisa de las secuencias
reguladoras que se necesitan para la expresión de genes puede variar
entre especies o tipos celulares, pero deben incluir en general,
como necesarias, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas
implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción,
respectivamente, tales como la caja TATA, la secuencia de tapadera,
la secuencia CAAT y similares. En particular, tales secuencias 5' no
transcritas reguladoras incluirán una región promotora que incluye
una secuencia promotora para el control transcripcional del gen
junto de forma operativa. Las secuencias reguladoras pueden incluir
también secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en
dirección 5' como se desee. Los vectores de la invención pueden
incluir opcionalmente secuencias líderes 5' o señal. La elección y
diseño de un vector se realizará según la capacidad y discreción de
un experto habitual.
Vectores de expresión que contienen todos los
elementos necesarios para la expresión están disponibles
comercialmente y son conocidos para aquellos expertos en la materia.
Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A
laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989. Las células generalmente se manipulan por la
introducción en el interior de las células de ADN (ARN) heterólogo
que codifica un polipéptido I-ASP o un fragmento o
variante del mismo. El ADN (ARN) heterólogo se sitúa bajo el control
operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión
del ADN heterólogo en la célula anfitriona.
Son sistemas preferidos para la expresión de
ARNm en células de mamífero aquellos tales como pcDNA3.1 y pRc/CMV
(disponibles de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen un marcador
que se puede seleccionar tal como un gen que confiere resistencia
G418 (que facilita la selección de líneas celulares transfectadas de
forma estable) y las secuencias
potenciadoras-promotoras del citomegalovirus humano
(CMV). Adicionalmente, es adecuado para la expresión en líneas
celulares de primates o caninas el vector pCEP4 (Invitrogen), que
contienen un origen de replicación del virus de Epstein Barr (EBV),
facilitando el mantenimiento de plásmido como un elemento
extracromosómico de copia múltiple. Otro vector de expresión es el
plásmido pEF-BOS que contiene el promotor del factor
de elongación de polipéptido 1\alpha, que estimula eficazmente la
transcripción in vitro. El plásmido está descrito por
Mishizuma y Nagata (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990) y su uso
en experimentos de transcripción está descrito por, por ejemplo,
Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716,
1996). Otro vector de expresión también preferido es un adenovirus,
descrito por Stratford-Perricaudet, que es
defectuoso en proteínas E1 y E3 (J. Clin.
Invest./90:626-630, 1992). El uso de adenovirus
como un Adeno. P1A recombinante se describe por Warnier y col., en
inyección intradérmica en ratones ara inmunización contra P1A
(Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996).
El aislamiento de las moléculas de ácido
nucleico I-ASP también hace posible para el experto
diagnosticar un trastorno caracterizado por la expresión (o relativa
falta de la misma) de estas moléculas. Estos procedimientos implican
determinar la expresión de los ácidos nucleicos
I-ASP y/o los polipéptidos derivados de los mismos.
En la primera situación, tales determinaciones se pueden llevar a
cabo por medio de cualquier ensayo de determinación de ácidos
nucleicos convencional incluyendo la reacción en cadena de la
polimerasa como se ha ejemplificado en los ejemplos a continuación,
o ensayando con sondas de hibridación marcadas.
La invención también implica agentes tales como
polipéptidos que se unen a polipéptidos I-ASP y a
complejos de polipéptidos I-ASP y parejas de unión
tales como p53. Tales agentes de unión se pueden usar, por ejemplo,
en ensayos de detección sistemática para detectar la presencia o
ausencia de polipéptidos y complejos de polipéptidos
I-ASP y sus parejas de unión y en protocolos de
purificación para aislar polipéptidos I-ASP y
complejos de polipéptidos I-ASP y sus parejas de
unión. Tales agentes también se pueden usar para inhibir la
actividad nativa de los polipéptidos I-ASP o sus
parejas de unión, por ejemplo, uniéndose a dichos polipéptidos o a
sus parejas de unión o a ambos.
La invención, por lo tanto abarca agentes de
unión a péptidos que, por ejemplo, pueden ser anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de unirse
selectivamente a polipéptidos I-ASP. Los anticuerpos
incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales preparados según la
metodología convencional.
De forma significativa, como es conocido en la
técnica, sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el
paratopo, está implicada en la unión de el anticuerpo a su epítopo
(véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental
Foundatios of Modern Immunology Wiley & Sons Inc., Nueva
York; Roitt I., (1991) Essential Immunology, 7ª ed.,
Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc,
por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento, pero no
están implicadas en la unión a antígeno. Un anticuerpo del que se ha
escindido enzimáticamente la región pFc', o que se ha producido sin
la región pFc', designado como fragmento F(ab')_{2}
mantiene los dos sitios de unión de un anticuerpo intacto. De forma
similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la
región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, designado como
fragmento Fab, mantiene uno de los sitios de unión a antígeno de una
molécula de anticuerpo intacta. Procediendo adicionalmente, los
fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida
covalentemente y una porción de la cadena pesada denominada Fd. Los
fragmentos Fd son el mayor determinante de la especificidad del
anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez
cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del
anticuerpo) y los fragmentos Fd mantienen la capacidad de unión a
epítopo cuando están aislados. Dentro de la porción de unión a
antígeno de un anticuerpo, como es bien conocido en la técnica, hay
regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que
interactúan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones
marco (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo
(véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento
de cadena pesada Fd como en la cadena ligera de inmunoglobulinas
IgG, hay cuatro regiones marco (FR1 hasta Fr4) separadas
respectivamente por las tres regiones determinantes de
complementariedad (CDR1 hasta CDR3). Las regiones CDR, y en
particular CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada son
en gran medida responsables de la especificidad del anticuerpo.
Actualmente está bien establecido en la técnica que las regiones
distintas de CDR de un anticuerpo de mamífero se pueden reemplazar
con regiones similares de anticuerpos conespecíficos o
heteroespecíficos mientras se mantiene la especificidad epitópica
del anticuerpo original.
Esto se manifiesta más claramente en el
desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados", en los que se
juntan covalentemente CDR no humanas a regiones FR y/o Fc/pFc' para
producir un anticuerpo funcional. Véase, por ejemplo, las patentes
de EE.UU. 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.762 y
5.859.205.
Por lo tanto, por ejemplo, la publicación
internacional PCT número WO 92/04381 muestra la producción y uso de
anticuerpos RSV murinos humanizados en los que al menos una porción
de las regiones FR murinas han sido reemplazadas por regiones FR de
origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo fragmentos de
anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígeno, son
referidos a menudo como anticuerpos "quiméricos".
También se pueden preparar anticuerpos
monoclonales enteramente humanos por ejemplo por inmunización de
animales no humanos transgénicos para genes de inmunoglobulinas
humanos. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.814.318,
5.877.397, 6.091.001, 6.114.598.
Por lo tanto, como resultará evidente para un
experto habitual en la técnica, la presente invención también
proporciona para fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fb,
anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1
y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por
secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos con
fragmentos F(ab')_{2} quiméricos en los que las regiones
FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas
por secuencias homólogas humanas o no humanas,; anticuerpos con
fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o
CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias
homólogas humanas o no humanas, y anticuerpos con fragmentos Fd
quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 han sido
reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas. La
presente invención también incluye los llamados anticuerpos de
cadena única.
Por lo tanto, la invención implica polipéptidos
de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a
polipéptidos I-ASP, y complejos tanto de
polipéptidos I-ASP como de sus parejas de unión.
Estos polipéptidos pueden ser derivados también de fuentes distintas
a la tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, tales agentes de unión
a polipéptidos pueden ser proporcionados por bibliotecas de péptidos
degenerados que pueden prepararse fácilmente en disolución, de forma
inmovilizada o como bibliotecas de exposición de fagos. También se
pueden sintetizar bibliotecas combinatorias de péptidos que
contienen uno o más aminoácidos: las bibliotecas pueden sintetizarse
adicionalmente de peptoides y restos sintéticos no peptídicos.
La exposición de fagos puede ser particularmente
eficaz para identificar péptidos de unión útiles según la invención.
Brevemente, se prepara una biblioteca de fagos (usando, por ejemplo,
m13, fd o fago lamda), exponiendo insertos de 4 a aproximadamente 80
restos de aminoácidos usando procedimientos convencionales. Los
insertos pueden representar, por ejemplo, un conjunto completamente
degenerado o predispuesto. Se pueden seleccionar entonces los
insertos portadores de fagos que se unen al polipéptido
I-ASP. Este proceso puede repetirse a lo largo de
varios ciclos de reselección de fagos que se unen al polipéptido.
Las series repetidas conducen a un enriquecimiento en secuencias
particulares portadoras de fagos. Se puede realizar un análisis
secuencial de ADN para identificar las secuencias de los
polipéptidos expresados. Puede determinarse la porción lineal mínima
de la secuencia que se une con el polipéptido I-ASP.
Se puede repetir el procedimiento usando una biblioteca predispuesta
que contenga insertos que contengan parte o toda la porción lineal
mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en dirección
5' ó 3' de la misma. También se pueden usar procedimientos de
detección sistemática de levadura doble híbrida para identificar los
polipéptidos que se unen al el o los polipéptidos
I-ASP. Por lo tanto, los polipéptidos
I-ASP de la invención, o fragmentos de los mismos,
se pueden usar para la detección sistemática de bibliotecas de
péptidos, incluyendo bibliotecas de exposición de fagos, para
identificar y seleccionar parejas de unión a los polipéptidos
I-ASP de la invención. Tales moléculas se pueden
usar, como se ha descrito, para ensayos de detección sistemática,
para protocolos de purificación, para interferir directamente con el
funcionamiento de I-ASP y para otros propósitos que
resultarán evidentes para los expertos habituales en la
materia.
La invención proporciona además procedimientos
eficaces para la identificación de agentes farmacológicos o
compuestos guía para agentes activos al nivel de una función celular
modulable por I-ASP. En particular, tales funciones
incluyen unión a p53 y apoptosis. Generalmente, los procedimientos
de detección sistemática implican ensayar respecto a compuestos que
interfieren con la actividad de I-ASP como unión a
p53, etc, aunque también se puede ensayar respecto a compuestos que
potencian la actividad de I-ASP usando los
procedimientos de detección sistemática. Tales procedimientos son
adaptables a la detección sistemática automática de alta tasa de
transferencia de compuestos. Las indicaciones terapéuticas diana de
agentes farmacológicos detectados por los procedimientos de
detección sistemática están limitadas sólo en el sentido de que la
función celular diana esté sujeta a modulación por alteración de la
formación de un complejo que comprende un polipéptido
I-ASP o un fragmento del mismo y una o más dianas
intracelulares de unión de I-ASP, tales como p53.
Las indicaciones diana incluyen la apoptosis.
Se proporcionan una amplia variedad de ensayos
para agentes farmacológicos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína marcadas in vitro, ensayos
de desplazamiento de la movilidad electroforética, inmunoensayos,
ensayos basados en células tales como detecciones sistemáticas
dobles o triples híbridas, ensayos de expresión, etc. Por ejemplo,
las detecciones sistemáticas híbridas se usan para examinar
fácilmente el efecto de ácidos nucleicos transfectados sobre la
unión intracelular de polipéptidos I-ASP o
fragmentos de los mismos a dianas intracelulares específicas. Los
ácidos nucleicos transfectados pueden codificar, por ejemplo,
bibliotecas de péptidos combinatorias o moléculas no codificantes.
En la técnica son conocidos reactivos convenientes para tales
ensayos, por ejemplo proteínas de fusión GAL4. Un ensayo ejemplar
basado en células implica transfectar a una célula con un ácido
nucleico que codifica un polipéptido I-ASP fusionado
con un dominio de unión a ADN GAL4 y un ácido nucleico que codifica
un dominio p53 que interactúa con I-ASP fusionado
con un dominio de activación de la transcripción tal como VP16. La
célula también contiene un gen informador unido de forma operativa a
una región reguladora de la expresión génica, tal como uno o más
sitios de unión a GAL4. La activación de la transcripción del gen
informador aparece cuando los polipéptidos de fusión ASP y p53 se
unen de tal forma que el dominio de unión a GAL4 y el dominio de
activación transcripcional VP16 se aproximan para permitir la
transcripción del gen informador. Los agentes que modulan una
función celular mediada por polipéptido I-ASP son
entonces detectados mediante un cambio en la expresión del gen
informador. En la técnica se conocen procedimientos para determinar
cambios en la expresión de genes informadores.
Los fragmentos de I-ASP que se
usan en estos procedimientos, cuando no son producidos por un ácido
nucleico transfectado se añaden a una mezcla de ensayo como un
polipéptido aislado. Los polipéptidos I-ASP se
producen preferiblemente de forma recombinante, aunque tales
polipéptidos pueden aislarse a partir de extractos biológicos. Los
polipéptidos I-ASP producidos de forma recombinante
incluyen proteínas quiméricas que comprenden una fusión de una
proteína I-ASP con otro polipéptido, por ejemplo, un
polipéptido capaz de proporcionar o potenciar la unión
proteína-proteína, la unión específica a secuencia
de ácido nucleico (tal como GAL4), potenciar la estabilidad del
polipéptido I-ASP en las condiciones de ensayo o
proporcionar un resto detectable, tal como proteína verde
fluorescente o un epítopo bandera.
La mezcla de ensayo se compone de una diana
natral de unión de I-ASP tal como p53 o un factor de
la misma capaz de interactuar con I-ASP. Aunque se
pueden usar dianas de unión de I-ASP naturales,
frecuentemente se prefiere usar porciones (por ejemplo péptidos o
fragmentos de ácidos nucleicos) o análogos (es decir, agentes que
mimetizan las propiedades de unión a I-ASP de la
diana de unión natural para los propósitos del ensayo) de la diana
de unión de I-ASP mientras que la porción o análogo
proporciona afinidad de unión y avidez al fragmento
I-ASP medible en el ensayo.
La mezcla de ensayo también comprende un agente
farmacológico candidato. Típicamente, se ponen en marcha en paralelo
una pluralidad de mezclas de ensayo con diferentes concentraciones
de agente ara obtener una respuesta diferente a las diversas
concentraciones. Típicamente, una de esas concentraciones sirve como
control negativo, es decir, a concentración cero del agente o a una
concentración del agente por debajo de los límites de detección del
ensayo. Los agentes candidatos engloban numerosas clases químicas,
aunque típicamente son compuestos orgánicos. Preferiblemente, los
agentes farmacológicos candidatos son compuestos orgánicos pequeños,
es decir, aquellos que tienen un peso molecular de más de 50 pero de
menos de aproximadamente 2500, preferiblemente de menos de 1000, más
preferiblemente de menos de aproximadamente 500. Los agentes
candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para
interacciones estructurales con polipéptidos y/o ácidos nucleicos, y
típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o
carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos
funcionales y más preferiblemente al menos tres de los grupos
químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender una
estructura de carbono cíclica o heterocíclica y/o estructuras
aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos
funcionales identificados anteriormente. Los agentes candidatos
también pueden ser biomoléculas tales como péptidos, sacáridos,
ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas, pirimidinas,
derivados o análogos estructurales de los anteriores o combinaciones
de los mismos y similares. Cuando el agente es un ácido nucleico,
el agente es típicamente una molécula de ADN o ARN, aunque también
se contemplan ácidos nucleicos modificados como se definen en este
documento.
Los agentes candidatos se obtienen a partir de
una amplia variedad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos
sintéticos o naturales. Por ejemplo, hay numerosos medios
disponibles para la síntesis aleatoria o dirigida de una amplia
variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la
expresión de forma aleatoria de oligonucleótidos, las bibliotecas
orgánicas combinatorias, bibliotecas de exposición de fagos de
péptidos aleatorios y similares. Alternativamente, ya están
disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos
naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y
animales. Adicionalmente, se pueden modificar fácilmente bibliotecas
naturales y producidas sintéticamente y compuestos con medios
químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Además, se puede
someter a agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas
dirigidas o aleatorias tales como acilación, alquilación,
esterificación, acidificación, etc para producir análogos
estructurales de los agentes.
También se puede incluir una variedad de otros
reactivos en la mezcla. Estos incluyen reactivos tales como sales,
tampones, proteínas neutrales (por ejemplo, albúmina), detergentes,
etc, que pueden usarse para facilitar la óptima unión
proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Un
reactivo tal puede también reducir las interacciones no específicas
o de fondo de los componentes de reacción. Otros reactivos que
mejoran la eficacia del ensayo tales como proteasa, inhibidores,
inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos y similares también
pueden usarse.
La mezcla de los materiales de ensayo anteriores
es incubada en condiciones por las que, pero por la presencia del
agente farmacológico candidato, el polipéptido I-ASP
se une específicamente con la diana celular de unión, una porción de
la misma o un análogo de la misma. El orden de adición de los
componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación y otros
parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Tal
experimentación implica únicamente la optimización de los parámetros
de ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las
temperaturas de incubación están típicamente entre 4ºC y 40ºC. Los
tiempos de incubación típicamente se minimizan para facilitar la
detección sistemática rápida, de alta tasa de transferencia, y
típicamente están entre 0,1 y 10 horas.
Después de la incubación, la presencia o
ausencia de unión específica entre el polipéptido
I-ASP y una o más dianas de unión es detectada por
cualquier procedimiento conveniente disponible para el usuario. Para
ensayos de tipo de unión celular libre, a menudo se usa una etapa de
separación para separar componentes unidos de no unidos. La etapa de
separación puede llevarse a cabo de diversas formas.
Convenientemente, al menos uno de los componentes es inmovilizado
sobre un sustrato sólido, a partir del cual se pueden separar
fácilmente los componentes no unidos. El sustrato sólido puede estar
hecho de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad
de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperla,
varilla de nivel, partícula de resina, etc. El sustrato se elige
para la máxima señal de proporciones de ruido, principalmente para
minimizar la unión de fondo, así como para facilitar la separación y
el coste.
La separación puede efectuarse por ejemplo,
retirando una perla o una varilla de nivel de un reservorio,
vaciando o diluyendo un reservorio tal como un pocillo de placa de
microtitulación, aclarando una perla, partícula, columna
cromatográfica o filtro con una disolución de lavado o disolvente.
La etapa de separación incluye preferiblemente múltiples aclarados o
lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de
microtitulación, los pocillos se pueden lavar varias veces con una
solución de lavado, que típicamente incluye aquellos componentes de
la mezcla de incubación que no participan en uniones específicas
tales como sales, tampón, detergente, proteína no específica, etc.
Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas se
pueden lavar una o más veces con una solución de lavado y aislarse
usando un imán.
La detección se puede efectuar de cualquier
forma conveniente para ensayos basados en células tales como
detecciones sistemáticas híbridas dobles o triples. El trancripto
que resulta de un ensayo de transcripción de gen informador de
polipéptido I-ASP que interactúa con una molécula
diana típicamente codifica un producto directa o indirectamente
detectable, por ejemplo, actividad
\beta-galactosidasa, actividad luciferasa, y
similares. Para ensayos de unión libres de células, uno de los
componentes normalmente comprende o está acoplado a una marca
detectable. Se puede usar una amplia gama de marcas, tales como
aquellas que proporcionan detección directa (por ejemplo,
radioactividad, luminescencia, densidad óptica o electrónica, etc) o
detección indirecta (por ejemplo, etiqueta epitópica tal como el
epítopo FLAG, etiqueta enzimática tal como peroxidasa de rábano,
etc). La marca puede estar unido a una pareja de unión de
I-ASP o incorporada en el interior de la estructura
de la pareja de unión.
Se puede usar una variedad de procedimientos
para detectar la marca, dependiendo de la naturaleza de la marca y
otros componentes de ensayo. Por ejemplo, la marca puede ser
detectada mientras esté unida al sustrato sólido o después de la
separación del sustrato sólido. Las marcas pueden detectarse
directamente mediante densidad óptica o electrónica, emisiones
radioactivas, transferencias de energía no radiantes, etc o
detectarse indirectamente con conjugados de anticuerpo, conjugados
de estreptavidina-biotina, etc. Procedimientos para
detectar las marcas son bien conocidos en la técnica.
La invención proporciona agentes de unión a
I-ASP específicos, procedimientos para identificar y
preparar tales agentes y su uso en el diagnóstico, terapia y
desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, los agentes farmacológicos
específicos de I-ASP son útiles en una variedad de
aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, especialmente cuando la
enfermedad o el pronóstico de la enfermedad está asociado con la
utilización inadecuada de una ruta que implica
I-ASP, por ejemplo, la apoptosis, etc. Nuevos
agentes de unión a I-ASP específicos incluyen
anticuerpos específicos de I-ASP y otros agentes
naturales de unión intracelular identificados con ensayos tales como
detecciones sistemáticas dobles híbridas, y agentes no naturales de
unión intracelular identificados en detecciones sistemáticas de
bibliotecas químicas y similares.
En general, la especificidad de la unión de
I-ASP al unirse con un agente de unión se muestra
por constantes de equilibrio de unión. Las dianas que son capaces de
unirse selectivamente a un polipéptido I-ASP tienen
preferiblemente constantes de equilibrio de unión de al menos
aproximadamente 10^{7}M^{-1}, más preferiblemente de al menos
aproximadamente 10^{8}M^{-1} y de la forma más preferida de al
menos 10^{9}M^{-1}. La amplia variedad de ensayos basados en
células y libres de células se puede usar para demostrar unión
específica a I-ASP. Los ensayos basados en células
incluyen detecciones sistemáticas híbridas simples, dobles y
triples, ensayos en los que la transcripción medidas por
I-ASP es inhibida o aumentada, etc. Los ensayos
libres de células incluyen ensayos de unión
I-ASP-proteína, inmunoensayos, etc.
Otros ensayos útiles para la detección sistemática de agentes que se
unen a polipéptidos I-ASP incluyen transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (FRET), y análisis de
desplazamiento por movilidad electroforética (EMSA).
Se pueden emplear diversas técnicas para
introducir ácidos nucleicos de la invención en células, dependiendo
de si los ácidos nucleicos se introducen in vitro o in
vivo en un anfitrión. Tales técnicas incluyen transfección de
precipitados de ácido nucleico-CaPO_{4},
transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección
con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés,
transfección mediada por liposomas, y similares. Para ciertos usos,
se prefiere dirigir el ácido nucleico a células particulares. En
tales casos, un vehículo usado para suministrar un ácido nucleico
de la invención en una célula (por ejemplo, un retrovirus u otro
virus, un liposoma) puede tener una molécula diana adjunta a él. Por
ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una
proteína de superficie de la membrana de la célula diana o un
ligando para un receptor sobre la célula diana puede estar unido o
incorporado en el interior del vehículo de suministro del ácido
nucleico. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas para suministrar
ácidos nucleicos de la invención, se pueden incorporar proteínas que
se unen a una proteína de superficie de la membrana asociada con
endocitosis a la formulación del liposoma para dirigir y/o
facilitar la absorción. Tales proteínas incluyen proteínas de la
cápsida o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula
particular, anticuerpos para proteínas que llevan a cabo la
internalización en el ciclo, proteínas que se dirigen a la
localización intracelular y potencian la semivida intracelular, y
similares. También se han usado con éxito sistemas poliméricos de
suministro para suministrar ácidos nucleicos a células, como es
sabido por aquellos expertos en la materia. Tales sistemas incluso
permiten suministro oral de ácidos nucleicos.
Cuando se administran, las composiciones
terapéuticas de la presente invención son administradas en
preparaciones farmacéuticamente aceptables. Tales preparaciones
pueden contener de forma rutinaria concentraciones farmacéuticamente
aceptables de sal, agentes de tamponamiento, conservantes,
portadores compatibles, agentes potenciadores inmunes suplementarios
tales como adyuvantes y citocinas y opcionalmente otros agentes
terapéuticos, tales como agentes quimioterapéuticos.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden
ser administrados por cualquier vía convencional, incluyendo
inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. La
administración puede ser por ejemplo por vía oral, intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular, intracavital, subcutánea o
transdérmica. Cuando se usan anticuerpos terapéuticamente, una vía
de administración preferida es por aerosol pulmonar. Las técnicas
para preparar sistemas de suministro en aerosol que contienen
anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la materia.
Generalmente, tales sistemas deben utilizar componentes que no
dificulten significativamente las propiedades biológicas de los
anticuerpos, tales como la capacidad de unión del paratopo (véase,
por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols", en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, pág.
1694-1712; incorporado por referencia). Aquellos
expertos en la materia pueden determinar fácilmente los diversos
parámetros y condiciones para producir aerosoles de anticuerpos sin
recurrir a experimentación innecesaria. Cuando se usen preparaciones
no codificantes de la invención, se prefiere la administración lenta
intravenosa.
Las composiciones de la invención son
administradas en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es
aquella cantidad de una composición que sola o junto con dosis
adicionales produce la respuesta deseada. En caso de tratar una
enfermedad particular, tal como cáncer, la respuesta deseada es
inhibir la progresión de la enfermedad. Esto puede implicar
únicamente ralentizar la progresión de la enfermedad temporalmente,
aunque más preferiblemente implica detener la progresión de la
enfermedad permanentemente. Esto se puede controlar por
procedimientos rutinarios, o puede controlarse según procedimientos
de diagnóstico de la invención descritos en este documento.
Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la
dolencia particular que se está tratando, la gravedad de la
dolencia, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad,
estado físico, altura y peso, la duración del tratamiento, la
naturaleza de la terapia concurrente (si hay alguna), la vía de
administración específica y factores similares en el conocimiento y
experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien
conocidos por aquellos expertos habituales en la materia y pueden
tratarse con experimentación rutinaria sin más. Se prefiere
generalmente usar una dosis máxima de los componentes individuales o
combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta
según juicio médico responsable. Será entendido por aquellos
expertos en la materia sin embargo, que un paciente pueda
exigir
una dosis menor o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o prácticamente cualquier otra razón.
una dosis menor o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o prácticamente cualquier otra razón.
Las composiciones farmacéuticas usadas en los
procedimientos anteriores son preferiblemente estériles y contienen
una cantidad eficaz de anticuerpo para producir la respuesta deseada
en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un
paciente. La respuesta puede por ejemplo medirse determinando la
transducción de señal potenciada o inhibida por la composición por
medio de un sistema informador como se describe en este documento,
midiendo los efectos consiguientes como expresión génica, o midiendo
los efectos fisiológicos de la composición, tales como regresión de
un tumor, disminución de los síntomas de la enfermedad, modulación
de la apoptosis, etc. De forma similar, los efectos de moléculas no
codificantes de I-ASP pueden ser fácilmente
determinados midiendo la expresión de los genes individuales en
células a las que se añade una composición no codificante. Otros
ensayos serán conocidos para un experto en la materia y se pueden
emplear para medir el nivel de la respuesta.
Las dosis de anticuerpo administradas a un
sujeto pueden elegirse de acuerdo con diferentes parámetros, en
particular de acuerdo con el modo de administración usado y el
estado del sujeto. Otros factores incluyen el periodo de tratamiento
deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea
insuficiente a la dosis inicial aplicada, se pueden emplear dosis
más altas (o dosis más altamente efectivas por una vía de suministro
diferente, más localizada) para extender los límites de tolerancia
de ese paciente.
En general se formulan y se administran dosis de
anticuerpos a dosis entre 1 ng y 1 mg, y preferiblemente entre 10 ng
y 100 \mug, según cualquier procedimiento convencional en la
técnica. Otros protocolos para la administración de composiciones de
anticuerpo serán conocidos por un experto habitual en la materia, en
los que la cantidad de dosis, el programa de inyecciones, sitios de
las inyecciones, modo de administración (por ejemplo, intratumoral),
y similares pueden variar respecto a los anteriores. La
administración de las composiciones de anticuerpos a mamíferos que
no sean humanos, por ejemplo para propósitos de prueba o propósitos
veterinarios terapéuticos se lleva a cabo en sustancialmente las
mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Un sujeto,
como se usa en este documento, es un mamífero, preferiblemente un
ser humano, e incluyendo un primate no humano, vaca, caballo, cerdo,
oveja, cabra, perro, gato o roedor.
Cuando se administran, las preparaciones
farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades
farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente
aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa
un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la
actividad biológica de los ingredientes activos. Tales preparaciones
pueden contener rutinariamente sales, agentes de tamponamiento,
conservantes, portadores compatibles y opcionalmente otros agentes
terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser
farmacéuticamente aceptables, pero se pueden usar convenientemente
sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales
farmacéuticamente aceptables de las mismas y no están excluidas del
alcance de la invención. Tales sales farmacológica y
farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a aquellas
preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico,
bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético,
salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares.
También se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables como
sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de
sodio, potasio o calcio.
Se pueden combinar composiciones de anticuerpos
si se desea con un portador farmacéuticamente aceptable. El término
"portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en este
documento significa una o más cargas compatibles sólidas o líquidas,
diluyentes, o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la
administración a un ser humano. El término "portador" denota un
ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que
se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los
componentes de las composiciones farmacéuticas son capaces de ser
mezclados con las moléculas de la presente invención, y unos con
otros, de tal manera que no hay ninguna interacción que podría
perjudicar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
agentes de tamponamiento adecuados, incluyendo ácido acético en una
sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido
fosfórico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como cloruro
de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.
Las composiciones farmacéuticas pueden
presentarse convenientemente en forma de unidad de dosificación y
pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien
conocidos en la técnica de farmacia. Todos los procedimientos
incluyen la etapa de asociar el agente activo con un portador que
constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las
composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el
compuesto activo con un portador líquido, un portador finamente
dividido o ambos, y entonces, si es necesario, modelar el
producto.
Se pueden presentar composiciones adecuadas para
administración oral como unidades discretas, tales como cápsulas,
comprimidos, pastillas, conteniendo cada una una cantidad
predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen
suspensiones, en líquidos acuosos o líquidos no acuosos como un
jarabe, un elixir o una emulsión.
Las composiciones adecuadas para administración
parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa o no
acuosa de anticuerpos, que es preferiblemente isotónica con la
sangre del receptor. Esta preparación puede formularse según
procedimientos conocidos que usan agentes dispersantes o humectantes
y agentes suspensores. La preparación inyectable estéril puede ser
también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente
o disolvente no tóxico parenterelmante aceptable, por ejemplo, una
disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y
disolventes adecuados que se pueden emplear están agua, disolución
de Ringer y disolución isotónica de cloruro sódico. Además, se
emplean convencionalmente aceites estériles fijados como disolvente
o medio de suspensión. Para este propósito se puede emplear
cualquier aceite fijado suave incluyendo mono o diglicéridos
sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos tales como ácido
oleico en la preparación de inyectables. Las formulaciones
portadoras adecuadas para administraciones orales, subcutáneas,
intravenosas, intramusculares, etc. Se pueden encontrar en
Remington's Pharmaceutic Science, Mack Publishing Co Easton, PA.
En otro aspecto de la invención, se usan
anticuerpos en la fabricación de un medicamento para modular la
apoptosis. El medicamento puede situarse en un vial e incorporarse
en un kit para ser usado para tratar a un sujeto. En ciertas
realizaciones, otros medicamentos que modulan las mismas respuestas
o que afectan favorablemente a las composiciones de anticuerpos
también pueden estar incluidos en el mismo kit, tales como agentes
quimioterapéuticos. Los kits pueden incluir instrucciones u otro
material impreso sobre cómo administrar las composiciones de
anticuerpos y otros componentes del kit.
Una realización de la invención se describirá
ahora, únicamente como ejemplo, y con referencia a los siguientes
ejemplos y figuras y tabla;
Figura 1. Células Saos2 fueron transfectadas con
vector, p53 (5 \mug), I-ASP (10 \mug) o
p53+I-ASP y luego incubadas durante 16 horas. Las
células se lisaron en tampón de lisis NP40 y se sometió a 1000
\mug de lisado a inmunoprecipitación realizada con anticuerpos
policlonales para I-ASP unidos a perlas de proteína
G. La presencia de p53 se detectó por inmunotransferencia de los
inmunocomplejos usando anticuerpo policlonal de conejo para p53 CM1,
Figura 1A. Células Saos2 fueron transfectadas con
ASP-1 (8 \mug) o ASP-2 (4 \mug,
I-ASP (5 \mug) y p53 (50 ng). Se pasaron en un gel
al 10% 40 \mul de los lisados correspondientes, se detectó
I-ASP con anticuerpo V5, ASP-2 con
DX.5410, I-ASP con anticuerpo de ratón anti
I-ASP, p53 con DO1 y PCNA con anticuerpo anti PCNA,
Figura 1D; la Figura 1B muestra la inducción de apoptosis inducida
por p53 por ASP-1 y ASP-2 y la
inhibición de la apoptosis inducida por p53 por
I-ASP; la Figura 1C muestra la activación del
promotor de respuesta a p53, Bax, por ASP-q y
ASP-2, y la inhibición de la transactivación por
I-ASP:
La Figura 2 representa la secuencia de ADN de
I-ASP;
La Figura 3 representa la secuencia de proteína
de I-ASP;
La Figura 4 muestra que la función apoptótica de
p53 está altamente regulada por los miembros de la familia ASP in
vivo. Las líneas celulares que expresan el tipo salvaje de p53
U2OS y MCF-7 fueron transfectadas con plásmidos que
expresan proteínas como se ha indicado junto con un marcador celular
de superficie CD20 (A-E). Las células transfectadas
se encerraron y se analizaron por FACS. Los gráficos de barras
representan el porcentaje de células transfectadas con contenido en
ADN sub-G1, característico de la apoptosis. Los
plásmidos que expresan ARN no codificante de ASP-1,
ASP-2 e I-ASP son etiquetados como
\alpha ASP-1, \alphaASP-2 y
\alphaI-ASP, respectivamente. La oncoproteína
viral E6 del HPV16 humano se indica como E6. En las figuras 4B y 4D,
las células fueron transfectadas con los plásmidos como se ha
indicado. A continuación, las células transfectadas U2OS y
MCF-7 se incubaron con un medio que contenía
cisplatino a concentraciones de 5 y 3 \mug/ml respectivamente. 30
horas más tarde, se cosecharon las células y se analizaron como
antes. Para f y G, tanto las células U2OS como
MCF-7 fueron transfectadas con plásmidos que
expresaban proteínas como se ha indicado. La coexpresión de ASP o
p53 y Bax endógena o mdm2 se visualizaron después de la fijación de
las células, por marcaje inmunofluorescente doble como se ha
indicado en la figura 4G. Para la figura 4F, 200 células U2OS o
MCF-7 transfectadas con vector solo o con plásmidos
ASPP fueron examinadas respecto a la sobreexpresión de proteína Bax
endógena. Los gráficos de barras representan el valor medio de al
menos tres experimentos independientes.
La figura 5A ilustra un modelo que describe la
interacción de los miembros de la familia ASP con p65, IkB y p53;
las figuras 5C y 5D son una representación gráfica de la capacidad
de IkB de afectar la función de transactivación de p53 sobre los
promotores Bax y mdm2 en la presencia y ausencia de
ASP-2.
La figura 6A es una representación gráfica de la
capacidad del tipo salvaje p65 y el mutante por deleción \Deltap65
para transactivar un plásmido informador NFkB; la Figura 6B es una
representación gráfica de la inducción de la apoptosis en células
que expresan y coexpresan p53, ASP-2 y
\Deltap65.
La Figura 7A ilustra el efecto potenciador de
I-ASP en la función de transformación de E7;
La Figura 7B ilustra el efecto potenciados de
I-ASP en la resistencia celular al cisplatino; y
La Tabla 1 representa un resumen de la expresión
de ARNm de ASP-1, ASP-2 e
I-ASP en 40 pares de muestras de ARN normales y
tumorales emparejadas derivadas de tumores de cáncer de mama de
grado I y grado II que expresan p53 de tipo salvaje.
Ejemplo
1
Una secuencia aislada recientemente, el
inhibidor asociado a reL (RAI) se identifico como una proteína reL A
de unión a p65 que contiene 315 aminoácidos. RAI no tiene el dominio
en \alpha hélice de ASP-1 o ASP-2
pero sí contiene la región rica en prolina, las repeticiones alanina
y el dominio SH3. Los restos de contacto con p53 de
ASP-2 también están conservados en RAI. Para
investigar la actividad de RAI que se ha llamado
I-ASP, se clonó la secuencia de codificación en un
vector de expresión de mamífero pcDNA3. También se sintetizó un
péptido (RLQPALPPEAQSV
PELEEE) que se encuentra en I-ASP que no tiene similaridad de secuencia con ASP-1 ni ASP-2. Un anticuerpo de ratón específico para este péptido I-ASP único no reaccionaba de forma cruzada ni con ASP-1 ni con ASP-2 (los datos no se muestran). Usando este anticuerpo de ratón específico para I-ASP para inmunoprecipitar el I-ASP en células Saos-2, se pudo demostrar que I-ASP también interactúa con p53 (figura 1A). Como el mutante ASP-2, 53BP2/ASP-2 (600-1128), la expresión de I-ASP no indujo apoptosis por sí misma. Cuando se coexpresaba I-ASP con p53, tenía un pequeño efecto inhibitorio en la función apoptótica de p53. El efecto más significativo de I-ASP sobre la función apoptótica de p53 se observó cuando se coexpresaban ASP-1 y ASP-2. De acuerdo con la predicción, la coexpresión de I-ASP inhibió la función apoptótica potenciada de p53 efectuada por ASP-1 y ASP-2 (figura 1B). De forma similar, la coexpresión de I-ASP junto con ASP-1 o ASP-2 fue capaz de suprimir completamente la capacidad tanto de ASP-1 como de ASP-2 para estimular la función de transactivación de p53 sobre el promotor Bax (figura 1C). La coexpresión de I-ASP no alteró significativamente los niveles de expresión ni de p53 ni de ASP (figura 1D). Estos resultados indicaron que in vivo la función proapoptótica de de ASP-1 y ASP-2 puede ser regulada por el inhibidor natural I-ASP. Por lo tanto el equilibrio entre los niveles de expresión de ASP-1, ASP-2 e I-ASP pueden determinar el destino celular, es decir, si una célula vive o muere.
PELEEE) que se encuentra en I-ASP que no tiene similaridad de secuencia con ASP-1 ni ASP-2. Un anticuerpo de ratón específico para este péptido I-ASP único no reaccionaba de forma cruzada ni con ASP-1 ni con ASP-2 (los datos no se muestran). Usando este anticuerpo de ratón específico para I-ASP para inmunoprecipitar el I-ASP en células Saos-2, se pudo demostrar que I-ASP también interactúa con p53 (figura 1A). Como el mutante ASP-2, 53BP2/ASP-2 (600-1128), la expresión de I-ASP no indujo apoptosis por sí misma. Cuando se coexpresaba I-ASP con p53, tenía un pequeño efecto inhibitorio en la función apoptótica de p53. El efecto más significativo de I-ASP sobre la función apoptótica de p53 se observó cuando se coexpresaban ASP-1 y ASP-2. De acuerdo con la predicción, la coexpresión de I-ASP inhibió la función apoptótica potenciada de p53 efectuada por ASP-1 y ASP-2 (figura 1B). De forma similar, la coexpresión de I-ASP junto con ASP-1 o ASP-2 fue capaz de suprimir completamente la capacidad tanto de ASP-1 como de ASP-2 para estimular la función de transactivación de p53 sobre el promotor Bax (figura 1C). La coexpresión de I-ASP no alteró significativamente los niveles de expresión ni de p53 ni de ASP (figura 1D). Estos resultados indicaron que in vivo la función proapoptótica de de ASP-1 y ASP-2 puede ser regulada por el inhibidor natural I-ASP. Por lo tanto el equilibrio entre los niveles de expresión de ASP-1, ASP-2 e I-ASP pueden determinar el destino celular, es decir, si una célula vive o muere.
Ejemplo
8
Ejemplo
2
En contraste con ASP-1 y
ASP-2, el nivel de expresión de
I-ASP era generalmente bajo en las muestras de
tejido humano normal y de tumor de mama. Sin embargo, se detectó
sobreexpresión de I-ASP en 8 de los tejidos
tumorales comparados con sus controles normales emparejados (tabla
1). El fenómeno más impactante fue la correlación entre la expresión
normal de ASP-1 y ASP-2 con la
sobreexpresión de I-ASP. 7 de los tumores que
sobreexpresaban I-ASP no tenían ninguna regulación a
la baja de la expresión de ASP-1 y
ASP-2 (tabla 1). Este resultado apoya el argumento
para la importancia biológica de I-ASP como el
inhibidor natural de ASP-1 y ASP-2
in vivo.
Ejemplo
3
Para estudiar los papeles que juegan los
miembros endógenos de la familia ASP en la regulación de la
apoptosis inducida por p53 endógena, se introdujeron
ASP-1 o ASP-2 en las líneas
celulares U2OS y mCF-7 que expresan p53 de tipo
salvaje. Cuando se expresaban en estas células,
ASP-1 y ASP-2 inducían apoptosis
(figura 4). La oncoproteína viral E6, que es derivada de virus de
papiloma humano y que puede unirse y dirigirse específicamente a p53
para su degradación, inhibía la apoptosis inducida por
ASP-1 o ASP-2, demostrando que
ASP-1 y ASP-2 pueden inducir la
apoptosis dependiente de p53.
También se estudió la función dominante negativa
de 53BP2 e I-ASP de inhibición de la apoptosis
inducida por p53 endógena en respuesta a daño del ADN. Antes de la
exposición a cisplatino, se transfectaron células U2OS y
MCF-7 con plásmidos que codifican para HPV16E6,
I-ASP o 53BP2. El porcentaje de células
transfectadas que morían por apoptosis en respuesta al tratamiento
con cisplatino se determinó mediante análisis FACS (figura 4B). El
tratamiento con cisplatino indujo a más del 20% transfectadas a
morir por apoptosis. La expresión de E6 reducía el porcentaje de
células apoptóticas a menos de del 15%, sugiriendo que el cisplatino
induce la apoptosis dependiente de p53 en células U2SO. De acuerdo
con esto, la expresión de ASP o 53BP2 fue capaz de inhibir la
apoptosis inducida por cisplatino en una extensión similar a E6.
Estos resultados sugieren que la función apoptótica de la p53
endógena puede estar regulada por la expresión de miembros de la
familia ASP.
Para demostrar adicionalmente que los miembros
endógenos de la familia ASP juegan papeles significativos en la
regulación de la función apoptótica de p53, se usó un enfoque no
codificante. Se clonaron fragmentos de los extremos 5' de ADNc de
SP-1, ASP-2 y 1-ASP
en un vector de expresión para mamíferos en una orientación no
codificante y se sometió a prueba la capacidad del ARN no
codificante para inhibir específicamente la síntesis de proteínas de
miembros de la familia ASP in vitro (los datos no se
muestran). La expresión de ASP-1 no codificante sólo
inhibía la apoptosis inducida por ASP-1, pero no por
ASP-2. De forma similar, la expresión de
ASP-2 no codificante sólo inhibía la apoptosis
inducida por ASP-2, pero no por
ASP-1. El efecto específico de ASP-1
y ASP-2 no codificantes se vio apoyado
adicionalmente por la observación que la coexpresión de
ASP-1 y ASP-2 no influía sobre la
apoptosis mediada por Bax en las mismas condiciones (figura 4C). Por
lo tanto fue posible investigar el papel de ASP-1 y
ASP-2 endógenos en la regulación de la función
apoptótica de la p53 endógena en respuesta a daño del ADN. Células
U2OS y MCF-7 fueron transfectadas con las diversos
plásmidos de expresión entes del tratamiento con cisplatino. El
análisis FACS mostró que aproximadamente 20-30% de
las células transfectadas de control experimentaban apoptosis. La
expresión de E6 reducía el porcentaje de las células apoptóticas a
la mitad, indicando que el cisplatino puede inducir apoptosis a
través tanto de vías dependientes como independientes de p53 en
estas células. La expresión de ARN no codificante de
ASP-1 o ASP-2 inhibía la apoptosis
inducida por cisplatino a la misma extensión que E6 (figura 4D),
similar a los efectos vistos con 53BP2 e I-ASP. Esto
sugiere que ASP-1 y ASP-2 endógenos
juegan papeles importantes en la regulación de la función apoptótica
de p53 en respuesta a daño del ADN.
Se sospechaba que el efecto estimulatorio de
ASP-1 y ASP-2 endógenos sobre p53
inducía apoptosis en respuesta a cisplatino puede estar
infravalorado debido a altos niveles de I-ASP
detectados en estas células (los datos no se muestran) que podían
evitar que ASP-1 y ASP-2 potenciasen
la función apoptótica de p53. Para estudiar el papel antiapoptótico
de I-ASP, fueron transfectadas tanto células U2OS
como MCF-7 con I-ASP no codificante.
I-ASP no codificante inducía apoptosis dependiente
de p53 que se suprimía por la coexpresión de E6. La eliminación de
la función antiapoptótica de I-ASP por
I-ASP no codificante también potenciaba la función
apoptótica de ASP-1 y ASP-2 (figura
4E). Al contrario que ASP-1 y ASP-2
no codificantes, la expresión de I-ASP no
codificante no inhibía la apoptosis inducida por cisplatino. Se
detectó un pequeño aumento en las células apoptóticas (figura 4D).
Estos resultados demostraron que ASP-1 y
ASP-2 estimulan específicamente la función
apoptótica de p53 in vivo. I-ASP endógeno
funciona como un inhibidor de ASP y puede bloquear la apoptosis
inducida por p53 endógena.
Las moléculas de ácidos nucleicos no
codificantes fueron derivadas de los ADNc de ASP-1,
ASP-2 e I-ASP y fueron amplificadas
por PCR sobre los clones plásmidos respectivos usando cebadores que
abarcaban las siguientes regiones de nucleótidos(relativas al
ATG inicial): 74 a 923; 253 a 839 y 37 a 536 para
ASP-1, ASP-2 e
I-ASP, respectivamente. Los segmentos amplificados
se purificaron con el kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN) y se
ligaron al vector pcDNA3.1/V5 His TOPO (Invitrogen) según las
instrucciones del fabricante. Los plásmidos que contenían ADN no
codificante de ASP-1, ASP-2 e
I-ASP se produjeron por medio del kit de
purificación de QIAGEN según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo
4
Ha sido bien documentado que p53 y p65RelA de NF
kappaB juegan papeles muy importantes en la regulación de la
apoptosis en respuesta al esfuerzo. Sin embargo, se sabe muy poco
sobre cómo estas dos rutas apoptóticas pueden funcionar juntas in
vivo. La primera evidencia surgió a partir de la reciente
observación de que p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de
p65 RelA. De forma más importante, Ikb, el inhibidor de p65 RelA,
puede inhibir la función apoptótica de p53. Sin embargo no estaba
claro como p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de p65 y
cómo Ikb puede inhibir la función apoptótica de p53.
De modo interesante, muy recientemente se
descubrió que tanto ASP-2 como I-ASP
pueden interactuar con p65 relA, un componente de
NF-kappaB, en un ensayo híbrido de levadura.
I-ASP puede inhibir también la función de
transactivación de p65, aunque menos eficazmente que lkb. La región
que ASP-2 e I-ASP requieren para
interactuar con relA es muy similar a la requerida para p53. Por lo
tanto es posible que pueda haber alguna competencia entre p53 y p65
relA para interactuar con ASP-2 e
I-ASP. Ya que los miembros de la familia ASP
resultan ser la pareja común entre p53 y p65, se especula que los
miembros de la familia ASP pueden conectar la función apoptótica de
NF-kappaB. En este modelo de trabajo (figura 5A),
p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de p65 interactuando
con el I-ASP nuclear y permitir que p65 se una a
ADN. Además, lkb podría inhibir la apoptosis inducida por p53
uniéndose a p65 y liberando I-ASP. La concentración
nuclear aumentada de I-ASP puede entonces
interactuar con p53 y evitar que ASP-2 o
ASP-1 estimulen la función de transactivación de
p53. Si esta hipótesis es correcta, se esperaría que la expresión de
lkb debiera tener un profundo efecto sobre la apoptosis inducida por
p53 en presencia de ASP-1 o
ASP-2.
Los resultados mostrados en la figura 5B son
coherentes con este concepto. En las células que expresan lkb, el
7,2% de las células murieron por apoptosis, comparado con el 4,6% de
las células transfectadas con células transfectadas en el vector
solo. El efecto de lkb sobre la apoptosis inducida por p53 fue por
lo tanto mínimo ya que el porcentaje de células apoptóticas
detectado en p53 frente a células que expresaban p53+lkb fue del 12%
y el 11%, respectivamente. Esto puede deberse al nivel muy bajo de
la expresión de ASP-1 y ASP-2 en
células Saos-2. De acuerdo con los resultados
mostrados anteriormente, la coexpresión de ASP-2
produjo una potenciación significativa de la apoptosis inducida por
p53. El porcentaje de células apoptóticas en células transfectadas
p53+ASP-2 fue del 30%.De forma interesante, en estas
condiciones, la coexpresión de lkb mostró el efecto más profundo. La
coexpresión de lkb fue capaz de reducir la cantidad de células
apoptóticas inducidas por p53 y ASP-2 desde el 30%
hasta el 16%. Este resultado sugiere que lkb podría inhibir la
apoptosis inducida por p53 evitando que ASP-2
estimulase la función de p53. Se obtuvieron resultados similares
cuando se coexpresaba lkb con p53 y ASP-1.
Se ha mostrado que ASP-2 puede
potenciar la función apoptótica de p53 estimulando específicamente
la función de transactivación de p53 sobre los promotores de genes
proapoptóticos tales como Bax. Por lo tanto se ha investigado el
efecto de lkb sobre la función de transactivación de p53 sobre los
promotores Bax y mdm2 en presencia o ausencia de
ASP-2, véanse las figuras 5C y D. Como se ha
mostrado previamente, la coexpresión de ASP-2 y p53
estimulaba la función de transactivación de p53 aproximadamente unas
8 veces. En las mismas condiciones, la expresión de lkb no mostró
ninguna inhibición detectable de la actividad informadora del
promotor Bax, lo que sugiere que Bax no inhibe la actividad
transcripcional del promotor Bax de forma no específica en células
Saos-2. La coexpresión de 50 ng de lkb con p53
mostró únicamente una inhibición muy pequeña de la función de
transactivación de p53. Sin embargo, cuando se coexpresaron lkb,
ASP-2, y p53, lkb fue capaz de inhibir la
estimulación mediada por ASP-2 de la función de
transactivación de p53 de forma dramática (figura 5D).
\newpage
Se ha mostrado que ASP-1 y
ASP-2 pueden estimular específicamente la función de
transactivación de p53 sobre el promotor Bax pero no el promotor
mdm2. Por ello, si lkb estaba inhibiendo realmente la función de
transactivación de p53 por medio de ASP-2
específicamente, no sería capaz de mostrar una inhibición
significativa de la actividad promotora de mdm2. En las mismas
condiciones, se probó la capacidad de lkb de inhibir la función de
transactivación de p53 sobre la actividad del promotor mdm2. Como se
muestra en la figura 5D, la coexpresión de ASP-2
tuvo muy poco efecto sobre la función de transactivación de p53
sobre el promotor mdm2. De forma más importante, lkb apenas inhibió
la función de transactivación de p53 sobre el promotor mdm2 incluso
en presencia de ASP-2. Los resultados mostrados en
este documento sugieren por primera vez que lkb puede inhibir la
función apoptótica de p53 evitando que ASP-1 o
ASP-2 estimulen la función de transactivación de
p53.
Para seguir investigando el papel de la familia
ASP en conexión con la ruta de p53 y NFkb, se estudió el efecto de
la interacción entre ASP-2 y p65 relA sobre la
función apoptótica de p53. Basándose en el modelo de trabajo de la
figura 5A, la interacción p65/ASP puede facilitar la entrada al
núcleo de proteína ASP, permitiendo por lo tanto la interacción
p53/ASP y la liberación de I-ASP nuclear para unirse
con p65 nuclear. Los restos 176-406 de p65 se unen a
AWSP-2 e I-ASP.
Como factor de transcripción, p65 puede
transactivar a muchos genes diana. Dado que la apoptosis inducida
por p53 requiere p65 y se correlaciona también con el aumento de la
actividad de unión a ADN de NFkB, se sugirió que la actividad de
unión a ADN de p65 puede ser esencial para cooperar con p53 para
inducir la apoptosis. Ser capaces de unirse tanto a p53 como a p65
sitúa a la familia de proteínas ASP en un papel central. Una
posibilidad es que ASP que se une a p65 puede ser el mediador de la
actividad de unión a ADN de p65 inducida por p53. Sin embargo, la
coexpresión de p53 no pudo inducir la actividad transcripcional de
p65 sobre su informador. La compresión de p53 y
ASP-2 tampoco pudo mostrar ningún efecto
significativo sobre la función de transactivación de p65. Este
resultado sugiere que ASP no era el mensajero que suministra las
señales desde p53 a p65. No obstante, ASP podría impedir que p65
cooperase con p53 para inducir apoptosis. Se probó si la acción de
ASP necesitaba la actividad de unión a ADN de p65 NFkB. Se
eliminaron cien aminoácidos de p65 a partir del extremo
N-terminal que contiene la región de ADN de unión a
p65. El constructo \Deltap65 así generado resultón
transcripcionalmente inactivo cuando se sometió a prueba sobre el
plásmido informador de NFkb. Si la interacción
ASP-p65 es el mediador de las rutas de p53 y NFkb,
\Deltap65 tendría un efecto similar sobre la función apoptótica de
p53 al de p65 de longitud completa. En caso contrario, \Deltap65
sería inactivo ya que no es capaz de transactivar ninguno de sus
genes diana (figura 6A). El resultado mostrado en la figura 6B
mostró que no sólo tanto p65 como \Deltap65 estimulaban la función
apoptótica de p53 en presencia de ASP-2, sino que
\Deltap65 era incluso más activo que p65 en potenciar la función
apoptótica de p53. Esto puede deberse al hecho de que \Deltap65 es
incluso más nuclear que p65. Los datos obtenidos a partir de
\Deltap65 argumentan firmemente que p65 puede influir sobre la
función apoptótica de p53 independientemente de la actividad de
unión a ADN de p65. Por lo tanto, la interacción de
ASP-2-p65 podría ser el mecanismo de
acción.
Ejemplo
5
Ejemplo
6
Hasta ahora se ha demostrado que
I-ASP puede inhibir la apoptosis inducida por p53 en
diversas líneas celulares y que su nivel de expresión está regulado
al alza en células de carcinoma de mama in vivo. Todos estos
datos sugieren que I-ASP podría ser un oncogen. Ya
que la función de supresión tumoral de p53 está más unida con su
capacidad para inducir apoptosis, es probable que la inhibición de
la apoptosis inducida por p53 pueda eliminar la función de supresión
tumoral de p53. Para probar la función oncogénica de
I-ASP, se transfectaron fibroblastos de embrión de
rata con plásmidos que expresan I-ASP y la
oncoproteína E7. La expresión de I-ASP potenciaba la
función transformadora de E7 de forma significativa (figura 7A).
Esto demostró que I-ASP es efectivamente un
oncogen.
Como la mayoría de los fármacos
quimioterapéuticos son agentes que dañan el ADN e inducen la
apoptosis por medio de rutas dependientes de p53, se razonó que la
capacidad de I-ASP de inhibir la apoptosis inducida
por p53 puede hacer a las células más resistentes al efecto
citotóxico de fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino. Se
transfectaron células MCF-7 (una línea celular de
cáncer de mama) con un plásmido que expresa I-ASP.
La resistencia celular al efecto citotóxico de cisplatino se comparó
entre las células MCF-7 que expresaban
I-ASP y las que no expresaban I-ASP.
Los resultados de la figura 7 muestran que la expresión de
I-ASP puede potenciar la resistencia celular
aproximadamente 2,5 veces. Tal incremento en la resistencia celular
a cisplatino es muy significativo biológicamente respecto al
tratamiento del cáncer. Por lo tanto, el alto nivel de expresión de
I-ASP no sólo explica por qué p53 de tipo salvaje no
es funcional en algunas de células tumorales humanas. También
predice la respuesta tumoral a tratamientos. Finalmente, el uso de
células que sobreexpresan I-ASP puede permitir la
futura identificación de fármacos quimioterapéuticos más
eficaces.
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\sa{Arg Leu Gln Pro Ala Leu Pro Pro Glu Ala Gln
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Claims (23)
1. Un ensayo para diagnosticar cáncer
caracterizado por la regulación al alza de un polipéptido en
una muestra de tejido aislada, polipéptido que es un inhibidor de
la actividad apoptótica de p53, en el que dicho polipéptido está
codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo
constituido por:
i) una molécula de ADN que consiste en una
secuencia como se representa en la figura 2;
ii) una molécula de ADN que hibrida en
condiciones restrictivas de hibridación con la secuencia de ácido
nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad
apoptótica de p53; y
iii) una molécula de ADN que está degenerada
como resultado del código genético de las secuencias de ADN
definidas en (i) y (ii)
en el que dicho ensayo comprende las etapas
de:
a) proporcionar una muestra de tejido aislada
para ser probada
b) proporcionar condiciones adecuadas para la
detección del polipéptido por un agente y detectar la presencia del
polipéptido por el agente; y
c) comparar la regulación al alza del
polipéptido con controles normales emparejados.
2. Un ensayo según la reivindicación 1, en el
que la muestra de tejido es tejido mamario.
3. Un ensayo según la reivindicación 1 ó 2 en el
que el agente es un anticuerpo.
4. Un ensayo según la reivindicación 3 en el que
el ensayo es un inmunoensayo.
5. Un ensayo para diagnosticar cáncer
caracterizado por la regulación al alza de un molécula de
ácido nucleico en una muestra de tejido mamario aislada, el ácido
nucleico que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de
p53, en el que dicha molécula se selecciona del grupo constituido
por:
i) una molécula de ácido nucleico que consiste
en una secuencia como se representa en la figura 2;
ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida
con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un
inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y
iii) una molécula de ácido nucleico que está
degenerada como resultado del código genético de las secuencias
definidas en (i) y (ii)
en el que dicho ensayo comprende las etapas
de:
a) proporcionar una muestra para ser probada
b) proporcionar condiciones adecuadas para la
detección de dicha molécula de ácido nucleico por dicho agente y
detectar la presencia de la molécula de ácido nucleido por el
agente; y
c) comparar la regulación al alza del ácido
nucleico con controles normales emparejados.
6. Un ensayo según la reivindicación 5, en el
que el agente es una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar
con dicha secuencia de ácido nucleico.
7. Un ensayo según la reivindicación 6, en el
que el ácido nucleico es al menos un oligonucleótido.
8. Un ensayo según la reivindicación 6 ó 7 en el
que el ensayo es un ensayo de reacción en cadena de la
polimerasa.
9. Uso de un anticuerpo capaz de unirse a un
polipéptido como se representa por la secuencia de aminoácidos de la
figura 3, para la fabricación de un medicamento para su uso en el
tratamiento de cáncer por inducción de apoptosis.
10. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
9, en el que el cáncer es cáncer de mama.
11. Uso de una molécula de ácido nucleico no
codificante que comprende una secuencia no codificante de una
secuencia codificante seleccionada del grupo constituido por:
i) una molécula de ácido nucleico constituida
por una secuencia como se representa en la figura 2;
ii) una molécula de ácido nucleico constituida
por una secuencia que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de
la figura 2; y
iii) una molécula de ácido nucleico que consiste
en una secuencia que está degenerada como resultado del código
genético de las secuencias de ácido nucleico definidas en (i) y
(ii), para su uso en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de cáncer por inducción de apoptosis.
12. Un procedimiento de detección sistemática
para la identificación de agentes farmacológicos que interfieren con
la unión de un polipéptido con p53 que comprende:
i) proporcionar un polipéptido codificado por
una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido
por:
- a)
- una molécula de ADN constituida por una secuencia como se representa por la secuencia de ácido nucleico de la figura 2;
- b)
- una molécula de ADN que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y
- c)
- una molécula de ADN que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii);
ii) proporcionar al menos un agente
candidato;
iii) proporcionar una preparación formando una
combinación de (i) y (ii);
iv) detectar o medir la actividad del agente
respecto a la interferencia con la unión de dicho polipéptido con
p53; y opcionalmente
v) probar el efecto del agente sobre la
apoptosis de un tipo celular seleccionado.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12,
en el que dicho polipéptido está codificado por la secuencia de
ácido nucleico representada en la figura 2.
14. Un procedimiento según la reivindicación 12
ó 13, en el que dicho polipéptido es expresado por una célula.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicha célula es una célula cancerosa.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12-15, en el que dicho polipéptido
es sobreexpresado.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16, en el que dicha célula es
transformada/transfectada con una molécula de ácido nucleico que
codifica dicho polipéptido.
18. Una preparación farmacéutica combinada que
comprende al menos una molécula de ácido nucleico no codificante de
la secuencia codificante seleccionada del grupo constituido por:
i) una molécula de ácido nucleico constituida
por la secuencia como se representa en la figura 2;
ii) una molécula de ácido nucleico constituida
por una secuencia que hibrida con la secuencia de la figura 2; y
iii) una molécula de ácido nucleico que consiste
en una secuencia que está degenerada como resultado del código
genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) y un
agente quimioterapéutico.
19. Una preparación según la reivindicación 18,
en la que dicho agente quimioterapéutico es un agente
anticancerígeno seleccionado del grupo constituido por: cisplatino;
carboplatino; ciclofosfamida; melfalán; carmuslina; metotrexato;
5-fluorouracilo; citarabina; mercaptourina;
danorrubicina; doxorrubicina; epirrubicina; vinblastina;
vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol;
L-asparaginasa; G-CSF; una enedina
tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil;
ARA-C; vindesina; bleomicina; o etopósido.
20. Una preparación según la reivindicación 19,
en la que dicho agente es cisplatino.
21. Una preparación farmacéutica combinada que
comprende un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido codificado
por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo
constituido por:
i) una molécula de ácido nucleico constituida
por la secuencia como se representa en la figura 2;
\newpage
ii) una molécula de ácido nucleico constituida
por una secuencia que hibrida con la secuencia de ácido nucleico la
figura 2; y
iii) una molécula de ácido nucleico que consiste
en una secuencia que está degenerada como resultado del código
genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) y un
agente quimioterapéutico.
22. Una preparación según la reivindicación 21,
en la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo
constituido por: cisplatino; carboplatino; ciclofosfamida; melfalán;
carmuslina; metotrexato; 5-fluorouracilo;
citarabina; mercaptourina; danorrubicina; doxorrubicina;
epirrubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C;
taxol; L-asparaginasa; G-CSF; una
enedina tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil;
ARA-C; vindesina; bleomicina; o etopósido.
23. Una preparación según la reivindicación 22,
en la que dicho agente quimioterapéutico es cisplatino.
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