DE60213221T2

DE60213221T2 - Neuartige polynukleotide und polypeptide des ifnalpha-21 gens

Info

Publication number: DE60213221T2
Application number: DE2002613221
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Escary
Original assignee: GenOdyssee SA
Current assignee: GenOdyssee SA
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2022-03-30
Also published as: CA2442775A1; DE60213221D1; ES2268023T3; KR20030093292A; FR2822845A1; ZA200307578B; PT1379695E; FR2822845B1; CY1105650T1; CN1531600A; JP2005503121A; US20040132139A1; AU2002257777B2; ATE333520T1; US20080299081A1; WO2002079249A3; EP1379695A2; EP1379695B1; US7402305B2; WO2002079249A2

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN:
Die vorliegende Erfindung beansprucht eine Priorität der französischen Patentanmeldung 0104404, welche am 30. März 2001 eingereicht wurde, mit dem Titel „Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la séquence nucléique du gène IFNα-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codés par ces polynucleotides et leurs utilisations thérapeutiques".
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polynukleotide, die von der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens abstammen und neue SNPs umfassen, und neue Polypeptide, die von dem natürlichen IFNα-21-Protein des Wildtyps abstammen und Mutationen umfassen, welche durch diese SNPs verursacht werden, sowie ihre therapeutischen Verwendungen.
Verwandter Stand der Technik
Das Gen des Interferons α-21, nachfolgend als IFNα-21 bezeichnet, wird in folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

– Goeddel, D. V., Leung, D. W.: "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs", Nature 290 (5801): 20–26, 1981
– Olopade O. I., Bohlander S. K.: „Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia", Genomics 14 (2): 437–443, 1992

Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist unter der Zugangsnummer AC009445 in der HTG-Abteilung der Datenbank GenBank zugänglich.
Die Sequenz der Messenger-RNA von IFNα-21 ist in der Datenbank von NCBI unter dem Zugangscode NM_002175 erwähnt.
IFNα-21 ist ein Gen, das eine strukturelle und funktionelle Homologie besitzt, welche nahe an jener des humanen Interferons-α (IFNα), insbesondere des IFNα-2, liegt.
Die IFNα sind für ihre zellulären antiproliferativen Wirkungen und ihre Beteiligungen an antiviralen und antiparasitären Reaktionen bekannt.
Die IFNα sind ebenso dafür bekannt, die Expression einiger anderer Cytokine auf der Stufe der hämatopoietischen Stammzellen zu hemmen, und ebenso die zelluläre Proliferation bestimmter Tumore zu hemmen.
Die IFNα sind ebenso dafür bekannt, die Expression der Rezeptoren für EGF in Nierenkarzinomen herabzusetzen, die Expression bestimmter mitochondrialer Gene zu hemmen, die Proliferation von Fibroblasten, Monocyten und B-Lymphocyten, insbesondere in vitro, zu hemmen, und die Synthese von Antikörpern durch B-Lymphocyten zu blockieren.
Die IFNα sind ebenso dafür bekannt, die Expression tumor-spezifischer Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen zu induzieren, und ebenso diejenigen Gene, welche unter der Kontrolle der Promotorregionen vom ISRE-Typ (Element, das auf eine Anregung durch Interferon reagiert; Interferon-Stimulated Response Element) stehen, zu induzieren, indem sie auf spezifische Transkriptionsfaktoren dieser ISRE wirken.
Es ist bekannt, dass die IFNα an verschiedenen Störungen und/oder menschlichen Krankheiten beteiligt sind, wie zum Beispiel verschiedenen Arten von Krebs, wie zum Beispiel Karzinomen, Melanomen, Lymphomen, Leukämien und Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, Nierenkrebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, wie zum Beispiel jene, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel Hepatitis B und C und AIDS, Lungenentzündungen, eiternde Dickdarmentzündung, Krankheiten des zentralen Nervensystems, wie zum Beispiel Alzheimer'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression, Abstoßung von verpflanztem Gewebe und Organen, Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten, Allergien, Asthma, multiple Sklerose, Osteoporose, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Crohn'sche Krankheit, Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Störungen des Magen-Darm-Trakts oder auch Störungen, die mit einer Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen.
Die IFNα werden insbesondere für die Behandlung von bestimmten Leukämien, metastasierenden Nierenkarzinomen, sowie Tumoren verwendet, die als Folge einer Immunschwäche auftreten, wie zum Beispiel dem Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS. Die IFNα sind ebenso wirksam gegenüber anderen Arten von Tumoren und gegenüber bestimmten viralen Infektionen. Die IFNα werden von der FDA (Food and Drug Administration) zur Behandlung von Genitalwarzen oder Geschlechtskrankheiten anerkannt.
Insbesondere wurde IFNα-21 durch in situ Hybridisierung im Gehirn von Patienten lokalisiert, die an Parkinson'scher Krankheit oder Alzheimer'scher Krankheit leiden.
Im Vergleich zu anderen Zellen exprimieren Mikroglia-Zellen IFNα-21 in großen Mengen.
Bei Patienten, die an Alzheimer'scher Krankheit leiden, wurde das Vorliegen von IFNα-21 in den Neuronen des Parietal-Lappens gezeigt, so dass der Schluss nahegelegt wird, dass IFNα-21 an diesem pathologischen Zustand beteiligt sein kann (siehe zum Beispiel Kawaguchi N., Yamada T., Yoshiyama Y., No To Shinkei 49 (1): 69–73, January 1997).
Jedoch weisen die IFNα, und insbesondere IFNα-21, zahlreiche Nebenwirkungen auf, wenn sie in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie zum Beispiel Reaktionen einer akuten Überempfindlichkeit (Urticaria, Bronchokonstriktion, anaphylaktischer Schock, etc.), Herzarrythmien, niederer Blutdruck, epileptische Anfälle, Probleme mit der Schilddrüsenfunktion, fieberähnliche Syndrome (Fieber, Schweißausbrüche, Myalgien), und dergleichen.
Manche Dokumente, wie zum Beispiel WO 84/00776, US 4,801,685 , WO 01/25438 beschreiben Polynukleotid- oder Polypeptid-Sequenzen von unterschiedlichen Interferonmolekülen, welche durch Kloniertechniken von Screening-Verfahren isoliert wurden, wie zum Beispiel solchen, die beschrieben sind in: Hussain M., et al., „Identification of Interferon α-7, α-14 and α-21 variants in the genome of a large human population", Journal of Interferon and Cytokine Research, 16: 853–859 (1996), oder Sylvänen, A.C. et al.: „Identification of individuals by analysis of biallelic DNA markers using PCR and solid-phase minisequencing", American Journal of Human Genetics 52: 56–59 (1993). Die in diesen Dokumenten beschriebenen Moleküle enthalten einzelne Nukleotid- oder Polypeptid-Polymorphismen, welche manchmal zu Variationen der biologischen Aktivität führen können, wie zum Beispiel jener, die für das IFNα-2 Molekül in Weber, H. et al.: „Single amino acid changes render human IFNα-2 biologically active on mouse cells", 6: 591–598 (1987) offenbart ist.
Weitere Polymorphismen konnten in der natürlichen Diversität des humanen Gens identifiziert werden, um neue biologische Eigenschaften zu erhalten.
Darüber hinaus können Patienten, die mit IFNα behandelt werden, Antikörper zur Neutralisation dieser Moleküle entwickeln, so dass ihre Wirksamkeit herabgesetzt wird.
Die Erfinder haben neue Polypeptid- und neue Polynukleotid-Analoga des IFNα-21-Gens gefunden, die imstande sind, eine unterschiedliche Funktionalität gegenüber dem natürlichen IFNα-21-Protein des Wildtyps aufzuweisen.
Diese neuen Polypeptide und Polynukleotide können in besonderem Maße verwendet werden, um die vorstehend erwähnten Störungen oder Krankheiten zu behandeln oder diesen vorzubeugen, und um alle oder einen Teil der Nachteile zu vermeiden, welche mit diesen einhergehen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine erste Aufgabe der Erfindung, neue Polynukleotide bereitzustellen, welche sich von der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps dadurch unterscheiden, dass sie einen oder mehrere SNPs (Polymorphismus, der die Veränderung eines einzelnen Nukleotids betrifft; Single Nucleotide Polymorphism) umfassen.
Die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 des humanen IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps ist aus 2001 Nukleotiden zusammengesetzt und umfasst eine codierende Sequenz von 570 Nukleotiden, vom Nukleotid 670 (Start-Codon) bis zum Nukleotid 1239 (Stopp-Codon).
Der Anmelder hat 8 SNPs in der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps identifiziert. Diese 8 SNPs sind die folgenden: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, und t1277c.
Es soll im Sinne der vorliegenden Erfindung so verstanden werden, dass die Zählung, welche der Position der vorstehend definierten SNPs entspricht, relativ zur Zählung der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 ist.
Die Buchstaben a, t, c und g entsprechen jeweils den stickstoffhaltigen Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin.
Der erste Buchstabe entspricht dem Wildtyp-Nukleotid, während der letzte Buchstabe dem mutierten Nukleotid entspricht.
Somit entspricht zum Beispiel der SNP c794g einer Mutation des Nukleotids Cytosin (c) an der Position 794 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps zu dem Nukleotid Guanin (g).
Diese SNPs wurden durch den Anmelder unter Verwendung eines Bestimmungsverfahrens identifiziert, das in der Patentanmeldung FR 00 22894 des Anmelders mit dem Titel „Verfahren zur Bestimmung von einem oder mehreren funktionellen Polymorphismus (Polymorphismen) in der Nukleotidsequenz eines prä-selektierten, funktionellen Kandidaten-Gens und dessen (deren) Anwendungen" („Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and ist applications") beschrieben ist, und am 6. Dezember 2000 eingereicht wurde, welche Patentanmeldung hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Das in dieser Patentanmeldung beschriebene Verfahren gestattet die Identifizierung von einem (oder mehreren) vorher vorhandenen SNP(s) in mindestens einem Individuum aus einer zufälligen Population von Individuen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Fragment der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens, welches zum Beispiel die codierende Sequenz umfasst, aus unterschiedlichen Individuen in einer Population von Individuen, die in einer zufälligen Weise ausgewählt wurden, isoliert.
Die Sequenzierung dieser Fragmente wurde anschließend in bestimmten Fällen dieser Proben mit einem Heteroduplex-Profil (das ist ein Profil, welches sich von jenem der IFNα-21-Gensequenz des als Referenz dienenden Wildtyps unterscheidet) nach einer Analyse durch DHPLC (denaturierende Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Denaturing High Performance Liquid Chromatography) durchgeführt.
Das auf diese Weise sequenzierte Fragment wurde anschließend mit der Nukleotidsequenz des Fragments des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps verglichen, und die SNPs wurden in Übereinstimmung mit der Erfindung identifiziert.
Somit sind die SNPs natürlich und jeder von ihnen ist in bestimmten Individuen der Weltbevölkerung vorhanden.
Das IFNα-21-Gen des als Referenz dienenden Wildtyps codiert für ein unreifes Protein von 189 Aminosäuren, welches Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und das in ein reifes Protein von 166 Aminosäuren überführt wird, indem das Signalpeptid abgespalten wird, welches die ersten 23 Aminosäuren umfasst.
Jeder der codierenden SNPs der Erfindung, nämlich: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, und a1204g, verursacht Modifikationen auf der Stufe der Aminosäuresequenz des Proteins, welches durch die Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens codiert wird.
Diese Modifikationen sind die folgenden:
Der SNP c973a verursacht eine Mutation der Aminosäure Glutamin (Q) zu Lysin (K) bei der Position 102 des unreifen Proteins des IFNα-21-Gens, welches der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und bei der Position 79 des reifen Proteins. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird man den durch diese Mutation codierten SNP als Q79K oder Q102K bezeichnen, je nachdem, ob sich die Mutation auf das reife Protein oder auf das unreife Protein bezieht.
Der SNP g1011c verursacht eine Mutation der Aminosäure Glutamin (Q) zu Histidin (H) bei der Position 114 des unreifen Proteins des IFNα-21-Gens, welches der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und bei der Position 91 des reifen Proteins. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird man den durch diese Mutation codierten SNP als Q91H oder Q114H bezeichnen, je nachdem, ob sich die Mutation auf das reife Protein oder auf das unreife Protein bezieht.
Der SNP t1049a verursacht eine Mutation der Aminosäure Valin (V) zu Asparaginsäure (D) bei der Position 127 des unreifen Proteins des IFNα-21-Gens, welches der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und bei der Position 104 des reifen Proteins. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird man den durch diese Mutation codierten SNP als V104D oder V127D bezeichnen, je nachdem, ob sich die Mutation auf das reife Protein oder auf das unreife Protein bezieht.
Der SNP t1155a verursacht eine Mutation der Aminosäure Cystein (C) zu einem Stopp-Codon (Stopp) bei der Position 162 des unreifen Proteins des IFNα-21-Gens, welches der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und bei der Position 139 des reifen Proteins. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird man den durch diese Mutation codierten SNP als C139stop oder C162stop bezeichnen, je nachdem, ob sich die Mutation auf das reife Protein oder auf das unreife Protein bezieht.
Der SNP a1204g verursacht eine Mutation der Aminosäure Lysin (K) zu Glutaminsäure (E) bei der Position 179 des unreifen Proteins des IFNα-21-Gens, welches der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht, und bei der Position 156 des reifen Proteins. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird man den durch diese Mutation codierten SNP als K156E oder K179E bezeichnen, je nachdem, ob sich die Mutation auf das reife Protein oder auf das unreife Protein bezieht.
Die SNPs c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g verursachen Modifikationen der räumlichen Konformation der erfindungsgemäßen Polypeptide, im Vergleich mit dem Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps codiert wird.
Diese Modifikationen können durch Molecular Modelling am Computer beobachtet werden, entsprechend den Verfahren, die einem Fachmann gut bekannt sind, indem zum Beispiel von den folgenden Modellierungs-Werkzeugen Gebrauch gemacht wird: de novo (zum Beispiel SEQFOLD/MSI), Homologie (zum Beispiel MODELER/MSI), Minimierung des Kraftfelds (zum Beispiel DISCOVER, DELPHI/MSI) und/oder Molekulardynamik (zum Beispiel CFF/MSI).
Beispiele solcher Modelle sind nachfolgend in dem experimentellen Abschnitt gegeben.
Das Molecular Modeling am Computer zeigt, dass die Mutation Q79K bei dem reifen mutierten Protein die Verschiebung des N-terminalen Endes der Helix C in dem IFNα-21-Protein des Wildtyps beinhaltet, aufgrund der Störungen der Wasserstoffbrücken-Bindungen, wie in den 1A und 1B gezeigt.
Tatsächlich verschwinden die Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen dem Sauerstoffatom der Seitenkette des Restes Q79, der sauren Gruppe des Restes E83 und der Helix C des IFNα-21-Proteins des Wildtyps in dem IFNα-21-Protein mit der Mutation Q79K.
Somit besitzt das Protein mit der Mutation Q79K eine dreidimensionale Konformation, die von der des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps verschieden ist und eine erhebliche Veränderung ihrer Struktur und Funktion beinhaltet.
Das Molecular Modeling am Computer zeigt, dass die Mutation Q91H bei dem reifen mutierten Protein eine Verschiebung der Helix C an der mutierten Position beinhaltet, wie in den 2A und 2B gezeigt. Einige Wasserstoffbrücken-Bindungen und Salzbrücken treten auf, insbesondere zwischen den Seitenketten der Aminosäuren H91 und D76, welche die Helix starrer machen.
Somit besitzt das Protein mit der Mutation Q91H eine dreidimensionale Konformation, die sich von der des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps unterscheidet und eine erhebliche Veränderung ihrer Struktur und Funktion beinhaltet.
Das Molecular Modeling am Computer zeigt, dass die Mutation V104D bei dem reifen mutierten Protein Modifikationen in der Struktur in der Schlaufe zwischen den Helices C und D an der mutierten Position beinhaltet, wie in den 3A und 3B gezeigt. In der mutierten Struktur treten einige Wasserstoffbrücken-Bindungen auf (zwischen Q102 und G105 einerseits, und zwischen Q52, E107 und T109 andererseits), welche die Schlaufe zwischen den Helices C und D starrer machen. Darüber hinaus wird eine leichte Verschiebung des N-Endes der Helix B ebenso beobachtet.
Diese räumlichen Modifikationen beeinflussen die Reste, welche an der Bindung des IFNα-21 an seinen Rezeptor beteiligt sind.
Somit besitzt das Protein mit der Mutation V104D eine dreidimensionale Konformation, die sich von der des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps unterscheidet und eine erhebliche Veränderung ihrer Struktur und Funktion beinhaltet.
Das Molecular Modeling am Computer zeigt, dass die Mutation C139stop bei dem reifen mutierten Protein einen vorzeitigen Abbruch der Proteintranslation verursacht, welcher zu einem Verschwinden eines Polypeptid-Fragments führt, das normalerweise an der Helix E des IFNα-21-Proteins des Wildtyps beteiligt ist, wie in 4 gezeigt ist.
Die Helix E ist für die Bindung des IFNα-21 an seinen Rezeptor wesentlich. Das Fehlen der Helix E verursacht eine inkorrekte Faltung des mutierten Proteins und führt zu einer Modifikation in der dreidimensionalen Konformation des Proteins, bei welcher der hydrophobe Kern des Proteins mit dem hydrophilen äußeren Medium in Kontakt steht. Somit muss das mutierte Protein seine dreidimensionale Konformation ändern, damit sein hydrophober Kern mit hydrophilen Resten bedeckt ist, um einen Kontakt mit dem hydrophilen äußeren Medium zu vermeiden.
Somit besitzt das Protein mit der Mutation C139stop eine dreidimensionale Konformation, die sich von der des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps unterscheidet und eine erhebliche Veränderung ihrer Struktur und Funktion beinhaltet.
Das Molecular Modeling am Computer zeigt, dass die Mutation K156E bei dem reifen mutierten Protein eine Entfaltung des C-terminalen Endes der Helix E und eine Modifi kation der Gestalt der Schlaufe am C-Terminus beinhaltet, wie in den 5A und 5B gezeigt.
Diese Mutation erhöht das Netzwerk der Wasserstoffbrücken-Bindungen und erzeugt eine Salzbrücke zwischen den Resten E156 und R161. Diese Modifikationen machen die Struktur des IFNα-21-Proteins in diesem Bereich starrer. Dieser Bereich in dem Protein ist dafür bekannt, dass er an dessen antiviraler Aktivität beteiligt ist. Somit ist es möglich, vorherzusagen, dass die antivirale Aktivität des IFNα-21-Proteins mit der Mutation K156E erheblich gestört ist, und dass die Glutaminsäure an Position 156 eine Modifikation in der Struktur und der Funktion des reifen IFNα-21 verursacht.
Andere erfindungsgemäße SNPs, nämlich: t1265c und t1277c sind nicht an der Modifikation des Proteins auf der Stufe der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 beteiligt, das durch die Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens codiert wird. Die SNPs t1265c und t1277c sind nicht codierend.
Die Bestimmung des Genotyps der erfindungsgemäßen Polynukleotide kann in einer solchen Weise durchgeführt werden, mit der die Allel-Frequenz dieser Polynukleotide in einer Population bestimmt wird. Beispiele zur Bestimmung des Genotyps sind nachfolgend im experimentellen Teil gegeben.
Die Bestimmung der Funktionalität der Polypeptide der Erfindung kann ebenso durch einen Test ihrer biologischen Aktivität durchgeführt werden.
In dieser Hinsicht ist es möglich, zum Beispiel die antiproliferative Wirkung der erfindungsgemäßen Polypeptide auf eine Daudi-Zelllinie im Vergleich mit derjenigen des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps zu messen (Pielher et al., „New structural and functional aspects of the type I Interferon Receptor interaction revealed by comprehensible mutational analysis of the binding interface", J. Biol. Chem. 275 (51): 40425–40433, December 22, 2000).
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, die Verwendung von erfindungsgemäßen Polynukleotiden und Polypeptiden, sowie von therapeutischen Molekülen bereitzustellen, die ausgehend von diesen Polynukleotiden und Polypeptiden erhalten und/oder identifiziert wurden, in besonderem Maße für die Vorbeugung und die Behandlung bestimmter humaner Störungen und/oder Krankheiten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A und 1B stellen ein Modell des erfindungsgemäßen codierten Proteins dar, welches das Protein mit dem SNP c973a (Q79K) und das natürliche IFNα-21-Protein des Wildtyps umfasst. Die 1B stellt eine Nahaufnahme des Modells des unteren Teils von jedem der in 1A dargestellten Proteine dar.
In den 1A und 1B stellt das schwarze Band die Struktur des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps dar, und das weiße Band stellt die Struktur des IFNα-21-Proteins mit der Mutation Q79K dar.
Die 2A und 2B stellen ein Modell des erfindungsgemäßen codierten Proteins dar, welches das Protein mit dem SNP g1011c (Q91H) und das natürliche IFNα-21-Protein des Wildtyps umfasst. Die 2B stellt eine Nahaufnahme des Modells des linken Teils von jedem der in 2A dargestellten Proteine dar.
In den 2A und 2B stellt das schwarze Band die Struktur des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps dar, und das weiße Band stellt die Struktur des IFNα-21-Proteins mit der Mutation Q91H dar.
Die 3A und 3B stellen ein Modell des erfindungsgemäßen codierten Proteins dar, welches das Protein mit dem SNP t1049a (V104D) und das natürliche IFNα-21-Protein des Wildtyps umfasst. Die 3B stellt eine Nahaufnahme des Modells des oberen Teils von jedem der in 3A dargestellten Proteine dar.
In den 3A und 3B stellt das schwarze Band die Struktur des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps dar, und das weiße Band stellt die Struktur des IFNα-21-Proteins mit der Mutation V104D dar.
4 stellt ein Modell des erfindungsgemäßen codierten Proteins dar, welches das Protein mit dem SNP t1155a (C139stop) (4B) und das natürliche IFNα-21-Protein des Wildtyps (4A) umfasst. 4C stellt die Überlagerung der zwei Proteine der 4A und 4B dar.
In der 4 stellt das schwarze Band die Struktur des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps dar, und das weiße Band stellt die Struktur des IFNα-21-Proteins mit der Mutation C139stop dar.
Die 5A und 5B stellen ein Modell des erfindungsgemäßen codierten Proteins dar, welches das Protein mit dem SNP a1204g (K156E) und das natürliche IFNα-21-Protein des Wildtyps umfasst. Die 5B stellt eine Nahaufnahme des Modells des oberen Teils vom jedem der in 5A dargestellten Proteine dar.
In 5 stellt das schwarze Band die Struktur des natürlichen IFNα-21-Proteins des Wildtyps dar, und das weiße Band stellt die Struktur des IFNα-21-Proteins mit der Mutation K156E dar.
6 stellt die Überlebensrate der Mäuse dar, welche zuvor mit dem VSV-Virus infiziert und mit dem IFNα-21-Protein mit den Mutationen A42G, Q114H/V127D oder K179E behandelt wurden, im Vergleich zu solchen, die mit dem IFNα-2 des Wildtyps behandelt wurden, oder solchen, die nicht behandelt wurden.
In dieser Figur entsprechen die Abszissen dem Zeitraum des Überlebens (Tage) und die Ordinaten entsprechen der relativen Überlebensrate der mit VSV infizierten Mäuse. Die schwarzen Dreiecke, die Kreuze bzw. die schwarzen Diamanten stellen die Daten für die mit VSV infizierten Mäuse dar, welche mit dem IFNα-21-Protein mit der Mutation A42G, mit dem IFNα-21-Protein mit der Mutation Q114H/V127D bzw. mit dem IFNα-21-Protein mit der Mutation K179E behandelt wurden. Die schwarzen Quadrate stellen die Daten für die mit VSV infizierten Mäuse dar, welche mit dem IFNα-2 des Wildtyps behandelt wurden, und die offenen Dreiecke stellen die Daten für die mit VSV infizierten Mäuse dar, welche nicht behandelt wurden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Unter dem Begriff „Nukleotidsequenz des Gens des als Referenz dienenden Wildtyps" wird die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 des humanen IFNα-21-Gens verstanden.
Diese Sequenz ist in der GenBank unter der Zugangsnummer AC009445 zugänglich und die Sequenz der IFNα-21 Messenger-RNA ist in der Datenbank des NCBI unter dem Zugangscode NM_002175 erwähnt. Darüber hinaus wird das humane IFNα-21-Gen beschrieben in: Goeddel D. V., Leung D. W., „The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs", Nature 290 (5801): 20–26, 1981 und Olopade O. I., Bohlander S. K., "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia", Genomics 14 (2): 437–443, 1992.
Unter dem Begriff "natürliches IFNα-21-Protein des Wildtyps" wird das reife Protein verstanden, welches durch die Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens des als Referenz dienenden Wildtyps codiert wird. Das natürliche unreife Protein IFNα-21 des Wildtyps entspricht der in der SEQ ID Nr. 2 gezeigten Peptidsequenz.
Unter dem Begriff „Polynukleotid" wird ein Polyribonukleotid oder ein Polydesoxyribonukleotid verstanden, welche eine modifizierte oder nicht modifizierte DNA oder eine RNA darstellen können.
Der Ausdruck „Polynukleotid" umfasst zum Beispiel eine einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, eine DNA, die aus einer Mischung von einem einzelsträngigen Bereich oder mehreren einzelsträngigen Bereichen und von einem doppelsträngigen Bereich oder mehreren doppelsträngigen Bereichen zusammengesetzt ist, eine einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, und eine RNA, die aus einer Mischung von einem einzelsträngigen Bereich oder mehreren einzelsträngigen Bereichen und von einem doppelsträngigen Bereich oder mehreren doppelsträngigen Bereichen zusammengesetzt ist. Der Ausdruck „Polynukleotid" kann ebenso eine RNA und/oder eine DNA umfassen, einschließlich einer oder mehrerer dreifachsträngiger Bereiche. Unter dem Begriff „Polynukleotid" werden ebenso DNAs und RNAs verstanden, die eine oder mehrere Basen enthalten, die in einer solchen Weise modifiziert sind, dass sie ein Skelett aufweisen, welches für Zwecke der Stabilität oder für andere Zwecke modifiziert ist. Unter dem Begriff „modifizierte Base" werden zum Beispiel unübliche Basen, wie zum Beispiel Inosin, verstanden.
Unter dem Begriff „Polypeptid" wird ein Peptid, ein Oligopeptid, ein Oligomer oder ein Protein verstanden, das mindestens zwei Aminosäuren umfasst, welche miteinander über eine normale oder eine modifizierte Peptidbindung verbunden sind, wie zum Beispiel in den Fällen isosterischer Peptide.
Ein Polypeptid kann aus Aminosäuren zusammengesetzt sein, die von den 20 Aminosäuren verschieden sind, welche durch den genetischen Code definiert werden. Ein Polypeptid kann ebenso aus Aminosäuren zusammengesetzt sein, welche durch natürliche Vorgänge modifiziert wurden, wie zum Beispiel durch posttranslationale Reifungsprozesse oder durch chemische Prozesse, welche einem Fachmann gut bekannt sind. Solche Modifikationen werden in der Literatur im Detail erläutert. Diese Modifikationen können an beliebiger Stelle im Polypeptid auftreten: im Peptidskelett, in der Aminosäurekette oder auch an den carboxy- oder amino-terminalen Enden.
Ein Polypeptid kann in Folge einer Ubiquitinierung verzweigt sein, oder es kann cyclisch mit oder ohne Verzweigung vorliegen. Diese Art der Modifikation kann das Ergebnis von natürlichen oder synthetischen posttranslationalen Prozessen sein, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Zum Beispiel werden unter dem Begriff „Polypeptid-Modifikationen" verstanden: eine Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, eine kovalente Fixierung des Flavins, eine kovalente Fixierung des Häms, eine kovalente Fixierung eines Nukleotids oder eines Nukleotid-Derivats, eine kovalente Fixierung eines Lipids oder eines Lipid-Derivats, eine kovalente Fixierung von Phosphatidyl-Inosit, eine kovalente oder nicht kovalente Vernetzung, eine Cyclisierung, die Bildung einer Disulfid-Brücke, eine Demethylierung, Cysteinbildung, Pyroglutamat-Bildung, Formylierung, γ-Carboxylierung, Glycosylierung, die Bildung eines GPI-Ankers, eine Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozesse, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, die Addition einer Aminosäure, wie zum Beispiel die Arginylierung oder Ubiquitinierung. Solche Modifikationen werden in Einzelheiten in der Literatur beschrieben: „Protein-Structure and Molecular Properties", 2. Ed., T. E. Creighton, New York, 1993; "Post-translational Covalent Modification of Proteins", B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for Protein Modifications and Non-Protein Cofactors", Meth. Enzymol. 182: 626–646, 1990; und Rattan et al., "Protein synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48–62, 1992.
Unter den Begriffen "isoliertes Polynukleotid" oder "isoliertes Polypeptid" werden ein Polynukleotid bzw. ein Polypeptid verstanden, wie zum Beispiel ein vorstehend definiertes, welches aus dem menschlichen Körper isoliert wurde oder anderweitig durch ein technisches Verfahren hergestellt wurde.
Unter dem Begriff „Identität" wird die Messung der Sequenzidentität des Nukleotids oder Polypeptids verstanden.
Der Ausdruck „Identität" ist ein Begriff, der dem Fachmann gut bekannt ist, und der in der Literatur gut beschrieben ist: siehe "Computational Molecular Biology", Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; „Biocomputing Informatics and Genome Project", Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993; „Computer Analysis of Sequence Data", Part 1, Griffin, A. M. und Griffin H. G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; und „Sequence Analysis in Molecular Biology", Heinje G., Academic Press, 1987.
Die gewöhnlich verwendeten Verfahren, um die Identität und die Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, sind ebenso gut in der Literatur beschrieben: siehe „Guide to Huge Computer", Martin J. Bishop, Ed., Academic Press, San Diego, 1994; und Carillo H. und Lipton D., Siam J. Applied Math. 48: 1073, 1988.
Ein Polynukleotid, welches zum Beispiel eine Identität von mindestens 95 % mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, ist ein Polynukleotid, das höchstens 5 Mutationspunkte pro 100 Nukleotide enthält, verglichen mit dieser Sequenz.
Diese Mutationspunkte können eine einfache Substitution (oder mehrfache Substitutionen), eine Insertion (Insertionen) und/oder eine Deletion (Deletionen) von einem Nukleotid (oder mehreren Nukleotiden) darstellen.
In derselben Weise ist ein Polypeptid, das zum Beispiel eine Identität von mindestens 95 % mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, ein Polypeptid, das höchstens 5 Mutationspunkte pro 100 Aminosäuren aufweist, verglichen mit dieser Sequenz.
Diese Mutationspunkte können eine einfache Substitution (oder mehrfache Substitutionen), eine Insertion (Insertionen) und/oder eine Deletion (Deletionen) von einer Aminosäure (oder mehreren Aminosäuren) darstellen.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide, welche nicht völlig mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 bzw. der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 identisch sind, wobei diese Sequenzen so zu verstehen sind, dass sie mindestens einen der SNPs der Erfindung enthalten, werden als Varianten dieser Sequenzen betrachtet.
Üblicherweise besitzt ein erfindungsgemäßes Polynukleotid die gleiche oder praktisch die gleiche biologische Aktivität wie die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, welche mindestens einen der SNPs der Erfindung umfasst.
In ähnlicher Weise besitzt üblicherweise ein erfindungsgemäßes Polypeptid die gleiche oder praktisch die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, welche mindestens einen der codierenden SNPs der Erfindung umfasst.
Eine erfindungsgemäße Variante kann dadurch erhalten werden, dass zum Beispiel eine ortsspezifische Mutagenese durchgeführt wird, oder durch direkte Synthese.
Unter dem Begriff „SNP" wird eine beliebige natürliche Veränderung einer Base in einer Nukleotidsequenz verstanden. Ein SNP in einer Nukleotidsequenz kann codierend, still oder nicht codierend sein.
Ein codierender SNP ist ein Polymorphismus, der in der codierenden Sequenz einer Nukleotidsequenz enthalten ist, welche eine Modifikation einer Aminosäure in der Sequenz der Aminosäuren beinhaltet, welche durch diese Nukleotidsequenz codiert wird. In diesem Fall wird der Ausdruck „SNP" ebenso in erweitertem Sinne auf eine Mutation in einer Aminosäuresequenz angewendet.
Ein stiller SNP ist ein Polymorphismus, der in der codierenden Sequenz einer Nukleotidsequenz enthalten ist, welche keine Modifikation einer Aminosäure in der Aminosäure sequenz beinhaltet, die durch diese Nukleotidsequenz codiert wird.
Ein nicht codierender SNP ist ein Polymorphismus, der in der nicht codierenden Sequenz der Nukleotidsequenz enthalten ist. Dieser Polymorphismus kann in besonderem Maße in einem Intron, einer Spleißzone, einem Transkriptions-Promotor oder einer Nukleotidsequenz, welche zu einer Steigerung der Ablesefrequenz einer bestimmten Nukelotidsequenz führt (site enhancer sequence), gefunden werden.
Unter dem Ausdruck „funktioneller SNP" wird ein SNP verstanden, wie zum Beispiel ein vorstehend definierter, der in einer Nukleotidsequenz oder einer Aminosäuresequenz mit einer Funktionalität enthalten ist.
Unter dem Begriff „Funktionalität" wird die biologische Aktivität eines Polypeptids oder eines Polynukleotids verstanden.
Die Funktionalität eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polynukleotids kann in einer Erhaltung, einer Steigerung, einer Verminderung oder einer Unterdrückung der biologischen Aktivität des Polypeptids bestehen, welches durch die Nukleotidsequenz des Gens des als Referenz dienenden Wildtyps oder durch diese letztere Nukleotidsequenz codiert wird.
Die Funktionalität eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polynukleotids kann ebenso in einer Veränderung in der Natur der biologischen Aktivität des Polypeptids bestehen, welches durch die Nukleotidsequenz des Gens des als Referenz dienenden Wildtyps oder durch diese letztere Nukleotidsequenz codiert wird.
Die biologische Aktivität kann in besonderem Maße mit der Affinität oder mit dem Fehlen der Affinität des erfindungsgemäßen Polypeptids gegenüber einem Rezeptor verbunden sein.
Polynukleotid
Es ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes Polynukleotid bereitzustellen, welches umfasst:

a) eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80 % Identität, bevorzugt mit mindestens 90 % Identität, stärker bevorzugt mit mindestens 95 % Identität und noch stärker bevorzugt mit mindestens 99 % Identität mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder mit ihrer codierenden Sequenz (vom Nukleotid 670 bis zum Nukleotid 1239), wobei die Nukleotidsequenz so zu verstehen ist, dass sie mindestens einen der folgenden codierenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a oder a1204g umfasst, oder
b) eine Nukleotidsequenz, welche zu der Nukleotidsequenz von Punkt a) komplementär ist.

Es ist im Sinne der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass die Zählung der Position der SNPs in der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein isoliertes Polynukleotid, das folgendes umfasst:

a) eine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihre codierende Sequenz, wobei sie so zu verstehen ist, dass jede dieser Sequenzen mindestens einen der folgenden codierenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a oder a1204g umfasst, oder
b) eine Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotidsequenz von Punkt a) komplementär ist.

Vorzugsweise besteht das Polynukleotid der Erfindung aus der Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder aus ihrer codierenden Sequenz, wobei sie so zu verstehen ist, dass jede dieser Sequenzen mindestens einen der folgenden codierenden SNPs umfasst: c973a, g1011c, t1049a, t1155a oder a1204g.
Erfindungsgemäß umfasst das vorstehend definierte Polynukleotid einen einzelnen codierenden SNP, der aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g besteht.
Ein Polynukleotid, wie zum Beispiel das vorstehend definierte, kann ebenso mindestens einen der folgenden nicht codierenden SNPs umfassen: t1265c und t1277c.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes Polynukleotid bereitzustellen, welches umfasst oder besteht aus:

a) einer Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder aus ihrer codierenden Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz so zu verstehen ist, dass sie mindestens einen der folgenden nicht codierenden SNPs: t1265c oder t1277c umfasst, oder
b) einer Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotidsequenz von Punkt a) komplementär ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein isoliertes Polynukleotid, das besteht aus einem Teil von:

a) einer Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrer codierenden Sequenz, wobei jede dieser Sequenzen so zu verstehen ist, dass sie mindestens einen der folgenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c oder t1277c umfasst, oder
b) einer Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotidsequenz von Punkt a) komplementär ist,

Vorzugsweise ist das isolierte Polynukleotid wie vorstehend definiert aus 10 bis 40 Nukleotiden zusammengesetzt.
Es ist ebenso Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes Polynukleotid bereitzustellen, das für ein Polypeptid codiert, welches Polypeptid umfasst:

a) die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) die Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind,

Es ist im Sinne der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass die Zählung, welche der Position der SNPs Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E entspricht, relativ zur Zählung der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 ist.
Entsprechend einer bevorzugten Aufgabe der Erfindung umfasst das vorstehend definierte Polypeptid einen einzelnen codierenden SNP, wie zum Beispiel den vorstehend definierten.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Polynukleotid aus einem DNA- oder RNA-Molekül zusammengesetzt.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann durch standardmäßige Verfahren zur DNA- oder RNA-Synthese erhalten werden.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann ebenso durch ortspezifische Mutagenese erhalten werden, die von der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens ausgeht, indem das Nukleotid des Wildtyps durch das mutierte Nukleotid für jeden SNP auf der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 modifiziert wird.
Zum Beispiel kann ein Polynukleotid, welches den SNP c794g umfasst, durch ortspezifische Mutagenese erhalten werden, die von der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens ausgeht, indem das Nukleotid Cytosin (c) durch das Nukleotid Guanin (g) an der Position 794 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 modifiziert wird.
Die Verfahren zur ortspezifischen Mutagenese, die auf diese Weise verwirklicht werden können, sind dem Fachmann gut bekannt. Die Veröffentlichung von T. A. Kunkel 1985 in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 kann in besonderer Weise erwähnt werden.
Ein isoliertes Polynukleotid kann ebenso zum Beispiel Nukleotidsequenzen umfassen, die für Prä-, Pro-, oder Prä-Pro-Protein-Aminosäuresequenzen oder Marker-Aminosäuresequenzen, wie zum Beispiel ein Hexahistidin-Peptid, codieren.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann ebenso mit Nukleotidsequenzen in Zusammenhang stehen, die für andere Proteine oder Proteinfragmente codieren, um Fusionsproteine oder andere Produkte zur Reinigung zu erhalten.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann ebenso Nukleotidsequenzen umfassen, wie zum Beispiel nicht codierende Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende, wie zum Beispiel transkribierte oder nicht transkribierte Sequenzen, translatierte oder nicht translatierte Sequenzen, spleißende Signalsequenzen, polyadenylierte Sequenzen, Ribosom-Binde sequenzen oder auch Sequenzen, welche mRNA stabilisieren.
Eine Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotid- oder Polynukleotid-Sequenz komplementär ist, wird als eine Sequenz definiert, die mit dieser Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Unter dem Ausdruck „stringente Hybridisierungs-Bedingungen" werden im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, chemische Bedingungen verstanden, die eine Hybridisierung ermöglichen, wenn die Nukleotidsequenzen eine Identität von mindestens 80 %, bevorzugt von größer oder gleich 90 %, noch stärker bevorzugt von größer oder gleich 95 % und am meisten bevorzugt von größer oder gleich 97 % aufweisen.
Die stringenten Bedingungen können entsprechend den Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, und zum Beispiel dargestellt werden durch: Inkubation der Polynukleotide bei 42 °C in einer Lösung, die 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg DNA aus denaturiertem Lachssperma umfasst, gefolgt von einem Waschschritt der Filter bei 0,1 × SSC bei 65 °C.
Wenn die stringenten Hybridisierungsbedingungen eine Hybridisierung der Nukleotidsequenzen mit einer Identität von 100 % umfassen, wird die Nukleotidsequenz so betrachtet, als sei sie streng komplementär zu der unter Punkt a) beschriebenen Nukleotidsequenz, und liegt im Rahmen der Erfindung.
Es ist innerhalb der Lehre der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass die zu einer Nukleotidsequenz komplementäre Nukleotidsequenz mindestens einen erfindungsgemäßen Antisens-SNP umfasst.
Wenn somit zum Beispiel die Nukleotidsequenz den SNP c794g umfasst, umfasst ihre komplementäre Nukleotidsequenz das Nukleotid Cytosin (c) an der äquivalenten Stelle von Position 794.
Identifikation, Hybridisierung und/oder Amplifikation des Polynukleotids, welches einen SNP umfasst
Es ist ebenso Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung folgender Gegenstände bereitzustellen:

a) ein Polynukleotid mit 80 bis 100 % Identität (bevorzugt mit mindestens 90 % Identität, stärker bevorzugt mit 95 % Identität und besonders bevorzugt mit 100 % Identität) mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder einer Sequenz des Polynukleotids, das aus 10 bis 40 Nukleotiden zusammengesetzt ist, und/oder
b) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, welches mindestens einen SNP umfasst,

Bestimmung des Genotyps und Bestimmung der Frequenz eines SNPs
Es ist ebenso Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung folgender Gegenstände bereitzustellen:

Gemäß der Erfindung kann die Bestimmung des Genotyps mit einem Individuum oder einer Population von Individuen ausgeführt werden.
Innerhalb der technischen Lehre dieser Erfindung wird die Bestimmung des Genotyps als ein Verfahren zur Bestimmung eines Genotyps eines Individuums oder einer Population von Individuen definiert. Der Genotyp besteht aus den Allelen, die an einem oder mehreren spezifischen Loci vorhanden sind.
Unter dem Begriff „Population von Individuen" wird eine Gruppe von Individuen verstanden, die in zufälliger Weise oder in nicht zufälliger Weise ausgewählt werden. Diese Individuen können Menschen, Tiere, Mikroorganismen oder Pflanzen sein.
Üblicherweise umfasst die Gruppe der Individuen mindestens 10 Personen, vorzugsweise 100 bis 300 Personen.
Die Individuen können entsprechend ihrer ethnischen Zugehörigkeit oder entsprechend ihrem Phänotyp ausgewählt werden; in besonderem Maße werden jene ausgewählt, die von den folgenden Störungen und/oder Krankheiten betroffen sind: Karzinome, Melanome, Lymphome, Leukämien und Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, Nierenkrebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, wie zum Beispiel solche, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel Hepatitis B und C und AIDS, Lungenentzündungen, eiternde Dickdarmentzündung, Krankheiten des zentralen Nervensystems, wie zum Beispiel Alzheimer'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression, die Abstoßung von verpflanztem Gewebe und von Organen, Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten, Allergien, Asthma, multiple Sklerose, Osteoporose, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Crohn'sche Krankheit, Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Störungen des Magen-Darm-Trakts oder auch Störungen, die mit einer Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen.
Ein erfindungsgemäßer funktioneller SNP wird vorzugsweise als Genotyp in einer Population von Individuen bestimmt.
Es existieren viele verschiedene Verfahren, welche eingeführt werden können, um die SNPs bezüglich des Genotyps zu bestimmen (siehe insbesondere Kwok, Pharmacogenomics 2000, Vol. 1, pp. 95–100, „High Throughput Genotyping Assay Approa ches"). Diese Verfahren beruhen auf einem der vier folgenden Prinzipien: der Hybridisierung mit allel-spezifischen Oligonukleotiden, der Verlängerung von Oligonukleotiden mittels Didesoxynukleotiden, gegebenenfalls in Gegenwart von Desoxynukleotiden, der Ligation von allel-spezifischen Oligonukleotiden oder der Spaltung von allel-spezifischen Oligonukleotiden. Jedes einzelne dieser Verfahren kann zu einem Nachweissystem gekoppelt werden, wie zum Beispiel der Messung der direkten oder polarisierten Fluoreszenz, oder der Massenspektrometrie.
Die Bestimmung des Genotyps kann insbesondere durch Minisequenzierung mit „heißen" ddNTPs (zwei unterschiedliche ddNTPs, welche mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind) und „kalten" ddNTPs (zwei verschiedene ddNTPs ohne eine Markierung), in Verbindung mit einem Scanner für polarisierte Fluoreszenz durchgeführt werden. Das Minisequenzierungsprotokoll durch Auswerten der polarisierten Fluoreszenz (Verfahren mittels Fluoreszenz-Polarisation, bei dem ein mit Farbstoff markiertes Didesoxynukleotid in das Templat eingebaut wird; Technology of Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation; FP-TDI) ist dem Fachmann gut bekannt.
Es kann mit einem Produkt durchgeführt werden, das nach der Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von einer DNA eines jeden Individuums erhalten wurde. Dieses PCR-Produkt wird so ausgewählt, dass es den Polynukleotid-Genbereich abdeckt, der den untersuchten SNP enthält. Nach dem letzten Schritt im PCR-Gerät (Thermocycler) wird die Platte auf einem Scanner für polarisierte Fluoreszenz angeordnet, um die markierten Basen mittels einer Anregung, die für das jeweilige Fluorophor spezifisch ist, und mittels Emissionsfiltern auszulesen. Die Intensitätswerte der markierten Basen werden auf einen Graphen aufgezeichnet.
Für die PCR-Amplifikation können im Falle eines SNP der Erfindung die Sens- bzw. Antisens-Primer entsprechend der Position der SNPs der Erfindung leicht durch einen Fachmann ausgewählt werden.
Zum Beispiel können die Sens- und Antisens-Nukleotidsequenzen der Primer für die PCR-Amplifikation jeweils sein:
SEQ ID Nr. 3: Sens Primer: GGT TCA AGG TTA CCC ATC TC
SEQ ID Nr. 4: Antisens-Primer: TTT GAA ATG GCA GAA GTC AT
Die Nukleotidsequenzen ermöglichen eine Amplifikation eines Fragments mit einer Länge von 696 Nukleotiden, vom Nukleotid 620 bis zum Nukleotid 1315 in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1.
Eine statistische Analyse der Frequenz eines jeden Allels (Allel-Frequenz), welches Allel durch das Gen codiert wird, das den SNP in der Population von Individuen umfasst, wird dann erreicht, und welche Frequenz die Bestimmung der Bedeutung ihres Einflusses und ihrer Verteilung in den unterschiedlichen Untergruppen, und falls notwendig, in besonderem Maße in den verschiedenen ethnischen Gruppen, ermöglicht, welche diese Population von Individuen ausmachen.
Die genotypischen Daten werden analysiert, um die Verteilung der Frequenzen von unterschiedlichen Allelen abzuschätzen, die in den untersuchten Populationen beobachtet werden. Die Berechnungen der Allel-Frequenzen können mit Hilfe einer Software durchgeführt werden, wie zum Beispiel SAS-suite^® (SAS) oder SPLUS^® (MathSoft). Der Vergleich der Allel-Verteilungen eines SNP der Erfindung über verschiedene ethnische Gruppen der Population von Individuen kann mittels der Software ARLEQUIN^® und SAS-suite^® durchgeführt werden.
SNPs der Erfindung als genetische Marker
Während SNPs, die funktionelle Sequenzen von Genen (zum Beispiel Promotor, Spleißstellen, codierender Abschnitt) modifizieren, wahrscheinlich in einer unmittelbaren Beziehung zur Anfälligkeit oder Resistenz für bestimmte Krankheiten stehen, können alle SNPs (funktionell oder nicht) wertvolle Marker für die Identifikation von einem oder mehreren Genen bereitstellen, die an diesen Krankheiten beteiligt sind, und sie können infolgedessen in einer mittelbaren Beziehung zu diesen Krankheitszuständen stehen (siehe Cargill et al., Nature Genetics 22: 231–238, 1999; Riley et al., Pharmacogenomics 1: 39–47, 2000; Roberts L., Science 287: 1898–1899, 2000).
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ebenso eine Datenbank, welche mindestens einen der folgenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c oder t1277c in einem Polynukleotid des IFNα-21-Gens umfasst.
Es ist durchaus so zu verstehen, dass die SNPs in Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 gezählt werden.
Diese Datenbank kann zur Bestimmung der statistisch erheblichen Zusammenhänge analysiert werden, die zwischen folgenden Punkten bestehen:

(i) mindestens einem der folgenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c oder t1277c in einem Polynukleotid des IFNα-21-Gens, und
(ii) einer Krankheit oder einer Resistenz gegenüber einer Krankheit.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von mindestens einem der folgenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c oder t1277c in einem Polynukleotid des IFNα-21-Gens, um diagnostische bzw. prognostische Kits für eine Krankheit oder eine Resistenz gegenüber einer Krankheit zu entwickeln.
Ein SNP der Erfindung, wie vorstehend definiert, kann in unmittelbarem oder mittelbarem Zusammenhang mit einer Krankheit oder einer Resistenz für eine Krankheit stehen.
In bevorzugter Weise können diese Krankheiten jene sein, welche wie vorstehend erwähnt definiert wurden.
Expressionsvektor und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls einen rekombinanten Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfasst.
Zahlreiche Expressionssysteme können verwendet werden, einschließlich der Chromosomen, der Episomen und derivatisierter Viren. In besonderer Weise können die verwendeten rekombinaten Vektoren abgeleitet werden von: bakteriellen Plasmiden, Transposons, Hefe-Episomen, Insertions-Elementen, Elementen von Hefe-Chromosomen, Viren, wie zum Beispiel Baculovirus, Papillomaviren, wie zum Beispiel SV40, Vaccinia-Viren, Adenoviren, Fox-Pox-Viren, Pseudowut-Viren (pseudorabies viruses) und Retroviren.
Diese rekombinaten Vektoren können ebenso Cosmid- oder Phagemid-Derivate sein. Die Nukleotidsequenz kann in den rekombinanten Expressionsvektor durch Verfahren insertiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel jene, die beschrieben sind in: „Molecular Cloning, A Laboratry Manual", Sambrook et al., 4. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
Der rekombinante Vektor kann Nukleotidsequenzen umfassen, welche die Regulation der Expression des Polynukleotids kontrollieren, sowie Nukleotidsequenzen, welche die Expression und die Transkription eines Polynukleotids der Erfindung und die Translation eines Polypeptids der Erfindung ermöglichen, wobei diese Sequenzen entsprechend den Wirtszellen ausgewählt werden, die eingesetzt werden.
Somit kann zum Beispiel ein geeignetes Sekretionssignal in den rekombinanten Vektor eingebaut werden, so dass das Polypeptid, welches durch das Polynukleotid der Erfindung codiert wird, in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum, auf die Membran oder in die extrazelluläre Umgebung geleitet wird.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Wirtszelle bereitzustellen, welche einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor umfasst.
Die Einführung des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle kann entsprechend den Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel durch jene, die beschrieben sind in: „Basic Methods in Molecular Biology", Davis et al., 2. Ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995; und „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", siehe oberhalb; wie zum Beispiel durch eine Transfektion mittels Calciumphosphat, eine Transfektion mittels DEAE-Dextran, Transfektion, Mikroinjektion, Transfektion durch kationische Lipide, Elektroporation, Transduktion oder Infektion.
Die Wirtszellen können zum Beispiel Bakterienzellen sein, wie zum Beispiel Zellen der Streptokokken, Staphylokokken, Escherichia coli oder Bacillus subtilis, Zellen von Pilzen, wie zum Beispiel Hefezellen und Zellen von Aspergillus, Streptomyces, Insektenzellen, wie zum Beispiel von Drosophila S2 und von Spodoptera Sf9, tierische Zellen, wie zum Beispiel CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 Zellen und humane Zellen des zu behandelnden Probanden, oder auch Pflanzenzellen.
Die Wirtszellen können zum Beispiel verwendet werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu exprimieren, oder sie können als ein wirksames Produkt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie nachfolgend beschrieben wird.
Polypeptid
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes Polypeptid bereitzustellen, das eine Aminosäuresequenz umfasst mit mindestens 80 % Identität, bevorzugt mit mindestens 90 % Identität, stärker bevorzugt mit mindestens 95 % Identität und noch stärker bevorzugt mit mindestens 99 % Identität mit:

a) der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 enthalten sind,

Das Polypeptid der Erfindung kann ebenso umfassen:

a) die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) die Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren enthält, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 enthalten sind,

Das Polypeptid der Erfindung kann insbesondere bestehen aus:

a) der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren enthält, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 enthalten sind,

Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßes Polypeptid einen einzelnen codierenden SNP, der aus der Gruppe ausgewählt wird, welche besteht aus: Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Polypeptids bereitzustellen, bei dem eine vorstehend definierte Wirtszelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, und das Polypeptid aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Das Polypeptid kann ausgehend von dem Kulturmedium der Wirtszellen gereinigt werden, entsprechend den Verfahren, welche einem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel der Präzipitation mit Hilfe von chaotropen Mitteln, wie zum Beispiel Salzen, insbesondere Ammoniumsulfat, Ethanol, Aceton oder Trichloressigsäure, Säureextraktion; Ionenaustausch-Chromatographie; Phosphatcellulose-Chromatographie; Chromatographie der hydrophoben Wechselwirkung; Affinitäts-Chromatographie; Chromatographie mit Hydroxylapatit oder Größenausschluss-Chromatographie.
Unter dem Begriff „Kulturmedium" wird ein Medium verstanden, aus dem das Polypeptid der Erfindung isoliert oder gereinigt wird. Dieses Medium kann aus dem extrazellulären Medium und/oder dem zellulären Lysat zusammengesetzt sein. Diejenigen Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, ermöglichen es ebenso, dass dem Polypeptid eine aktive Konformation zurückgegeben wird, falls die Konformation des Polypeptids während der Isolation oder der Reinigung verändert wurde.
Antikörper
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung eines immunspezifischen Antikörpers bereitzustellen.
Unter dem Begriff „Antikörper" werden monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, chimäre Antikörper, Antikörper mit einer einzelnen Kette, humanisierte Antikörper, sowie Fab-Fragmente, einschließlich Fab, oder Produkte einer Bibliothek zur Expression von Immunglobulinen verstanden.
Ein immunspezifischer Antikörper kann durch Immunisierung eines Tiers mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid erhalten werden.
Die Erfindung betrifft ebenso einen immunspezifischen Antikörper für ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wie zum Beispiel dem vorstehend definierten.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, eines seiner Fragmente, ein Analoges, eines seiner Varianten oder eine Zelle, welche dieses Polypeptid exprimiert, können ebenso verwendet werden, um immunspezifische Antikörper herzustellen.
Der Ausdruck „immunspezifisch" bedeutet, dass der Antikörper eine höhere Affinität für das Polypeptid der Erfindung als für andere Peptide, die im Stand der Technik bekannt sind, besitzt.
Die immunspezifischen Antikörper können durch Verabreichung eines Polypeptids der Erfindung, eines seiner Fragmente, eines Analogen oder eines epitopen Fragments oder einer Zelle, welche dieses Polynukleotid exprimiert, an ein Tier, vorzugsweise nicht an einem Menschen, entsprechend den Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können typische Verfahren zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, welche von Zelllinien ausgehen, wie zum Beispiel der Hybridom-Technologie (Köhler et al., Nature 256: 495–497, 1975), der Trioma-Technologie, der Hybridom-Technologie mit humanen B-Zellen (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983) und der Hybridom-Technologie mittels EBV (Cole et al., „The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer", in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, R. A. Reisfeld und S. Sell, Eds., Alan R. Liss, Inc., N.Y., 1985, pp. 77–96).
Die Verfahren zur Herstellung von Antikörpern mit einer einzelnen Kette, wie sie zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,946,778 beschrieben sind, können ebenso verwendet werden.
Transgene Tiere, wie zum Beispiel Mäuse, können ebenso verwendet werden, um humanisierte Antikörper herzustellen.
Mittel, welche mit dem Polypeptid der Erfindung wechselwirken
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifikation eines Mittels bereitzustellen, welches ein erfindungsgemäßes Polypeptid aktiviert oder hemmt, wobei das Verfahren umfasst:

a) die Herstellung eines rekombinanten Vektors, welcher ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfasst, das mindestens einen codierenden SNP enthält,
b) die Herstellung von Wirtszellen, welche einen rekombinanten Vektor von Punkt a) umfassen,
c) das In-Kontakt-Bringen der Wirtszellen von Punkt b) mit einem zu testenden Mittel und
d) die Bestimmung der aktivierenden oder hemmenden Wirkung, welche durch das zu testende Mittel erzeugt wird.

Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ebenso für ein Verfahren zum Screening von Verbindungen verwendet werden, welche mit diesem wechselwirken.
Diese Verbindungen können aktivierende (Agonisten) oder hemmende (Antagonisten) Mittel einer intrinsischen Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids sein. Diese Verbindungen können ebenso Liganden oder Substrate eines Polypeptids der Erfindung sein. Siehe Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Kapitel 5, 1991.
Um ein solches Verfahren aufzubauen, ist es im Allgemeinen zunächst wünschenswert, geeignete Wirtszellen herzustellen, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren. Solche Zellen können zum Beispiel Zellen von Säugetieren, Hefen, Insekten, wie zum Beispiel Drosophila, oder von Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, sein.
Diese Zellen oder Membranextrakte dieser Zellen werden anschließend den zu testenden Verbindungen ausgesetzt.
Die Bindungsfähigkeit der zu testenden Verbindungen gegenüber dem Polypeptid der Erfindung kann anschließend beobachtet werden, sowie die Hemmung oder die Akti vierung der funktionellen Reaktion.
Der Schritt d) des vorstehenden Verfahrens kann unter Verwendung eines zu testenden Mittels verwirklicht werden, welches unmittelbar oder mittelbar markiert ist. Er kann ebenso einen konkurrierenden Test umfassen, indem ein markiertes oder nicht markiertes Mittel und ein markiertes Mittel als konkurrierendes Molekül verwendet werden.
Die Bestimmung gemäß Schritt d) des vorstehenden Verfahrens kann ebenso erfolgen, falls ein zu testendes Mittel ein Aktivierungs- oder Hemmungs-Signal in Bezug auf diejenigen Zellen erzeugt, welche das Polypeptid der Erfindung exprimieren, indem Mittel zum Nachweis verwendet werden, die in geeigneter Weise entsprechend dem nachzuweisenden Signal ausgewählt werden.
Solche aktivierenden oder hemmenden Mittel können Polynukleotide sein, und in bestimmten Fällen können sie zum Beispiel Oligonukleotide oder Polypeptide sein, wie zum Beispiel Proteine oder Antikörper.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifikation eines Mittels bereitzustellen, welches durch das erfindungsgemäße Polypeptid aktiviert oder gehemmt wird, wobei das Verfahren umfasst:

a) die Herstellung eines rekombinanten Vektors, der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfasst, welches mindestens einen codierenden SNP enthält,
b) die Herstellung von Wirtszellen, welche einen rekombinanten Vektor von Punkt a) umfassen,
c) das Aussetzen der Wirtszellen von Punkt b) dem zu testenden Mittel, und
d) die Bestimmung der aktivierenden oder hemmenden Wirkung, welche durch das Polypeptid auf das zu testende Mittel ausgeübt wird.

Ein Mittel, welches durch das Polypeptid der Erfindung aktiviert oder gehemmt wird, ist ein Mittel, das in Form einer Aktivierung bzw. Hemmung in Gegenwart dieses Polypeptids reagiert. Die Mittel, welche unmittelbar oder mittelbar durch das Polypeptid der Erfindung aktiviert oder gehemmt werden, können aus Polypeptiden bestehen, wie zum Beispiel membranäre oder nukleäre Rezeptoren, Kinasen, und stärker bevorzugt Tyrosinkinasen, Transkriptionsfaktoren oder Polynukleotide.
Nachweis von Krankheiten
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse der biologischen Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Polynukleotids und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem Probanden bereitzustellen, welches Verfahren mindestens einen der folgenden Schritte umfasst:

a) Bestimmen des Vorliegens oder des Fehlens eines erfindungsgemäßen Polynukleotids im Genom eines Probanden;
b) Bestimmen des Ausmaßes der Expression eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einem Probanden;
c) Bestimmen des Vorliegens oder des Fehlens eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem Probanden;
d) Bestimmen der Konzentration eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem Probanden; und/oder
e) Bestimmen der Funktionalität eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem Probanden.

Diese biologischen Eigenschaften können in einem Probanden oder in einer Probe von dem Probanden analysiert werden.
Diese biologischen Eigenschaften können es ermöglichen, eine genetische Diagnose in vitro zu erstellen, und zu bestimmen, ob ein Proband betroffen ist oder ein Risiko besteht, betroffen zu sein, oder im Gegensatz dazu, ob eine teilweise Resistenz für die Entwicklung einer Krankheit, einer Unpässlichkeit oder einer Störung vorliegt, die mit dem Vorliegen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids in Zusammenhang stehen.
Diese Krankheiten können Störungen und/oder humane Krankheiten sein, wie zum Beispiel verschiedene Arten von Krebs und Tumoren, Infektionskrankheiten, Geschlechtskrankheiten, Immun- und/oder Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems und Störungen, die mit einer Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen.
Diese Arten von Krebs und Tumoren umfassen Karzinome, welche metastasierende Nierenkarzinome umfassen, Melanome, Lymphome, welche follikuläre Lymphome (Brill-Symmers-Syndrom) und das kutane T-Zell-Lymphom umfassen, Leukämien, welche Haarzell-Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie und chronische myeloide Leukämie umfassen, Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, sowie Nierenkrebs, multiple Myelome, karzinoide Tumoren und Tumoren, die infolge einer Immunschwäche auftreten und das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS umfassen.
Diese Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionen, welche chronische Hepatitis B und C sowie HIV/AIDS, infektiöse Lungenentzündungen und Geschlechtskrankheiten, wie zum Beispiel Genitalwarzen, umfassen.
Diese Immun- und Autoimmun-Krankheiten können die Abstoßung von verpflanztem Gewebe oder Organen, Allergien, Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Crohn'sche Krankheit und eine eiternde Dickdarmentzündung umfassen.
Diese Stoffwechselkrankheiten können solche Krankheiten, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, umfassen.
Diese Krankheiten des zentralen Nervensystems können die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression umfassen.
Diese Krankheiten und Störungen können ebenso die Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten sowie Osteoporose umfassen.
Dieses Verfahren gestattet ebenso eine genetische Diagnose einer Krankheit oder der Resistenz gegenüber einer Krankheit, die mit dem Vorliegen eines mutierten Allels, das durch einen erfindungsgemäßen SNP codiert wird, in einem Probanden verbunden ist.
Vorzugsweise wird in Schritt a) das Vorliegen oder das Fehlen eines Polynukleotids nachgewiesen, welches mindestens einen codierenden SNP, wie zum Beispiel den vorstehend definierten, enthält.
Der Nachweis des Polynukleotids kann ausgehend von biologischen Proben aus dem zu untersuchenden Probanden durchgeführt werden, wie zum Beispiel mit Zellen, Blut, Urin, Speichel oder ausgehend von einer Biopsie oder einer Autopsie des zu untersuchenden Probanden. Die genemische DNA kann für den Nachweis unmittelbar oder zum Beispiel nach einer PCR-Amplifikation verwendet werden. Es können ebenso RNA oder cDNA in einer ähnlichen Weise verwendet werden.
Es ist dann möglich, die Nukleotidsequenz eines erfindungsgemäßen Polynukleotids mit der Nukleotidsequenz, die im Genom des Probanden nachgewiesen wurde, zu vergleichen.
Der Vergleich der Nukleotidsequenzen kann durch Sequenzierung, durch DNA-Hybridisierungsverfahren, durch Unterschiede in der Beweglichkeit der DNA-Fragmente auf einem Elektrophorese-Gel mit oder ohne denaturierende Mittel oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur durchgeführt werden (siehe Myers et al., Science 230: 1242, 1985). Solche Modifikationen in der Struktur der Nukleotidsequenz an einem genauen Punkt können ebenso durch Tests ermittelt werden, welche den Schutz vor Nuklease-Abbau zum Gegenstand haben, wie zum Beispiel RNase oder die S1-Nuklease, oder ebenso durch Mittel zur chemischen Spaltung (siehe Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397–4401, 1985). Oligonukleotid-Sonden, welche ein Polynukleotidfragment der Erfindung umfassen, können ebenso verwendet werden, um das Screening durchzuführen.
Es können viele Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, dazu verwendet werden, um die Expression eines Polynukleotids der Erfindung zu bestimmen und die genetische Variabilität dieses Polynukleotids zu identifizieren (siehe Chee et al., Science 274: 610–613, 1996).
In Schritt b) kann das Ausmaß der Expression des Polynukleotids durch quantitative Bestimmung der Konzentration der RNA, welche von diesem Polynukleotid codiert wird, (und welches für ein Polypeptid codiert), entsprechend den Verfahren gemessen werden, die einem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel durch PCR, RT-PCR, RNase-Protektion, Northern-Blot und andere Hybridisierungsverfahren.
In Schritt c) und d) kann das Vorliegen oder das Fehlen, sowie die Konzentration eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem Probanden oder einer Probe aus einem Probanden mittels gut bekannter Verfahren durchgeführt werden, wie zum Beispiel durch einen Radioimmunoassay, konkurrierende Bindungstests, Western-Blot und ELISA-Tests.
Im Anschluss an Schritt d) kann die bestimmte Konzentration des erfindungsgemäßen Polypeptids mit der Konzentration des natürlichen Proteins des Wildtyps, die üblicherweise in einem Probanden gefunden wird, verglichen werden.
Ein Fachmann kann den Schwellenwert, oberhalb bzw. unterhalb dessen eine Anfälligkeit, oder im Gegensatz dazu eine Resistenz gegenüber einer Krankheit, einer Unpässlichkeit oder einer zuvor hervorgerufenen Störung auftreten, mit der Hilfe von Veröffentlichungen im Stand der Technik oder durch herkömmliche Tests oder Assays identifizieren, wie zum Beispiel jene, die zuvor erwähnt wurden.
In Schritt e) kann die Bestimmung der Funktionalität eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt werden, wie zum Beispiel durch solche in vitro Tests, die zuvor erwähnt wurden, oder durch die Verwendung von Wirtszellen, welche dieses Polypeptid exprimieren.
Therapeutische Verbindungen und Behandlung von Krankheiten
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine therapeutische Verbindung bereitzustellen, welche auf dem Wege eines wirksamen Mittels ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält.
Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids für die Herstellung einer therapeutischen Verbindung, die für die Vorbeugung oder die Behandlung von unterschiedlichen humanen Störungen und/oder Krankheiten vorgesehen ist. Diese Krankheiten können Störungen und/oder humane Krankheiten sein, wie zum Beispiel verschiedene Arten von Krebs und Tumoren, Infektionskrankheiten, Geschlechtskrankheiten, Immun- und/oder Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems, sowie Krankheiten, die mit der Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen.
Diese Arten von Krebs und Tumoren umfassen Karzinome, welche metastasierende Nierenkarzinome umfassen, Melanome, Lymphome, welche follikuläre Lymphome (Brill-Symmers-Syndrom) und das kutane T-Zell-Lymphom umfassen, Leukämien, welche Haarzell-Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie und chronische myeloide Leukämie umfassen, Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, sowie Nierenkrebs, multiple Myelome, karzinoide Tumoren und Tumoren, die infolge einer Immunschwäche auftreten und das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS umfassen.
Diese Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionen, welche chronische Hepatitis B und C sowie NIV/AIDS, infektiöse Lungenentzündungen und Geschlechtskrankheiten, wie zum Beispiel Genitalwarzen, umfassen.
Diese Immun- und Autoimmun-Krankheiten können die Abstoßung von verpflanztem Gewebe oder Organen, Allergien, Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Crohn'sche Krankheit und eine eiternde Dickdarmentzündung umfassen.
Diese Stoffwechselkrankheiten können solche Krankheiten, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, umfassen.
Diese Krankheiten des zentralen Nervensystems können die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression umfassen.
Diese Krankheiten und Störungen können ebenso die Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten sowie Osteoporose umfassen.
In bevorzugter Weise kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid ebenso für die Herstellung einer therapeutischen Verbindung verwendet werden, die für die Vorbeugung oder die Behandlung von verschiedenen humanen Störungen und/oder Krankheiten vorgesehen ist, wie zum Beispiel für bestimmte virale Infektionen, wie zum Beispiel chronische Hepatitis B und C, Leukämien, wie zum Beispiel Haarzell-Leukämie und chronische myeloide Leukämie, multiple Myelome, follikuläre Lymphone (Brill-Symmers-Syndrom), karzinoide Tumore, maligne Melanome, metastasierende Nierenkarzi nome, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit, sowie Tumore, die infolge einer Immunschwäche auftreten, wie zum Beispiel das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS, sowie Genitalwarzen oder Geschlechtskrankheiten.
Bestimmte Verbindungen, welche es ermöglichen, das erfindungsgemäße Polypeptid zu erhalten, sowie jene Verbindungen, welche durch oder von diesem Polypeptid erhalten oder identifiziert wurden, können in ähnlicher Weise für die therapeutische Behandlung des menschlichen Körpers verwendet werden, das heißt als eine therapeutische Verbindung.
Dies ist der Grund dafür, weshalb es ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Medikament bereitzustellen, das auf dem Weg eines wirksamen Mittels ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthält, welches mindestens einen zuvor definierten codierenden SNP, einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, eine vorstehend definierte Wirtszelle und/oder einen vorstehend definierten Antikörper enthält.
Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids, welches mindestens einen vorstehend definierten codierenden SNP, einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, eine vorstehend definierte Wirtszelle und/oder einen vorstehend definierten Antikörper für die Herstellung eines Medikaments enthält, das für die Vorbeugung oder die Behandlung verschiedener menschlicher Störungen und/oder Krankheiten vorgesehen ist. Diese Krankheiten können Störungen und/oder humane Krankheiten sein, wie zum Beispiel verschiedene Arten von Krebs und Tumoren, Infektionskrankheiten, Geschlechtskrankheiten, Immun- und/oder Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems und Störungen, die mit der Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen.
Diese Arten von Krebs und Tumoren umfassen Karzinome, welche metastasierende Nierenkarzinome umfassen, Melanome, Lymphome, welche follikuläre Lymphome (Brill-Symmers-Syndrom) und das kutane T-Zell-Lymphom umfassen, Leukämien, welche Haarzell-Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie und chronische myeloide Leukämie umfassen, Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, sowie Nierenkrebs, multiple Myelome, karzinoide Tumoren und Tumoren, die infolge einer Immunschwä che auftreten und das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS umfassen.
Diese Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionen, welche chronische Hepatitis B und C sowie HIV/AIDS, infektiöse Lungenentzündungen und Geschlechtskrankheiten, wie zum Beispiel Genitalwarzen, umfassen.
Diese Immun- und Autoimmun-Krankheiten können die Abstoßung von verpflanztem Gewebe oder Organen, Allergien, Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Crohn'sche Krankheit und eine eiternde Dickdarmentzündung umfassen.
Diese Stoffwechselkrankheiten können solche Krankheiten, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, umfassen.
Diese Krankheiten des zentralen Nervensystems können die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression umfassen.
Diese Krankheiten und Störungen können ebenso die Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten sowie Osteoporose umfassen.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids, das mindestens einen vorstehend definierten SNP, einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, eine vorstehend definierte Wirtszelle und/oder einen vorstehend definierten Antikörper für die Herstellung eines Medikaments enthält, das für die Vorbeugung oder die Behandlung verschiedener humaner Störungen und/oder Krankheiten vorgesehen ist, wie zum Beispiel für bestimmte virale Infektionen, wie zum Beispiel chronische Hepatitis B und C, Leukämien, wie zum Beispiel Haarzell-Leukämie und chronische myeloide Leukämie, multiple Myelome, follikuläre Lymphone (Brill-Symmers-Syndrom), karzinoide Tumore, maligne Melanome, metastasierende Nierenkarzinome, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit, sowie Tumore, die infolge einer Immunschwäche auftreten, wie zum Beispiel das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS, sowie Genitalwarzen oder Geschlechtskrankheiten.
Die Dosierung eines Polypeptids und der anderen Verbindungen der Erfindung, die als ein wirksames Mittel nützlich sind, hängt von der Wahl der Verbindung, der therapeu tischen Indikation, der Art der Verabreichung, des Wesens der Formulierung, des Wesens des Probanden und der Beurteilung durch den behandelnden Arzt ab.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid als ein wirksames Mittel verwendet wird, wird es im Allgemeinen in Dosierungen verabreicht, die im Bereich zwischen 1 und 100 μg/kg Körpergewicht des Probanden liegen.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, welche mindestens eine vorstehend erwähnte Verbindung als ein wirksames Mittel enthält, wie zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Polypeptid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, das mindestens einen vorstehend definierten SNP enthält, einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, eine vorstehend definierte Wirtszelle und/oder einen vorstehend definierten Antikörper sowie einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält.
In diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen liegt das wirksame Mittel in vorteilhafter Weise in einer physiologisch wirksamen Dosis vor.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können zum Beispiel Feststoffe oder Flüssigkeiten sein, und sie können in pharmazeutischen Arzneimittelformen vorliegen, die derzeit in der Humanmedizin verwendet werden, wie zum Beispiel einfache oder beschichtete Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Karamelbonbons, Zäpfchen und vorzugsweise injizierbare Zubereitungen sowie Pulver für injizierbare Arzneimittelformen. Diese pharmazeutischen Formen können entsprechend den üblichen Verfahren hergestellt werden.
Das wirksame Mittel kann (die wirksamen Mittel können) in Hilfsmittel eingebracht werden, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie zum Beispiel Talkum, arabisches Gummi, Laktose, Stärke, Dextrose, Glycerin, Ethanol, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wässrige und nicht wässrige Vehikel, fettartige Substanzen von tierischem oder pflanzlichem Ursprung, paraffinartige Derivate, Glycole, verschiedene Feuchthaltemittel, Dispersionsmittel oder Emulgatoren und Konservierungsmittel.
Das erfindungsgemäße wirksame Mittel (die erfindungsgemäßen wirksamen Mittel) kann (können) allein oder in Kombination mit anderen Verbindungen verwendet werden, wie zum Beispiel therapeutischen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen Cytokinen, wie zum Beispiel Interleukinen oder Interferonen.
Die unterschiedlichen Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden entsprechend der Art der Verabreichung eingestellt.
Die pharmazeutischen Formulierungen können durch unterschiedliche Wege der Verabreichung, welche dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, eine diagnostische Zusammensetzung bereitzustellen, welche mindestens eine vorstehend erwähnte Verbindung als ein wirksames Mittel enthält, wie zum Beispiel ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das gesamte oder einen Teil des erfindungsgemäßen Polynukleotids, einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, eine vorstehend definierte Wirtszelle und/oder einen vorstehend definierten Antikörper, sowie einen geeigneten pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff.
Diese diagnostische Zusammensetzung kann zum Beispiel einen geeigneten Hilfsstoff enthalten, wie zum Beispiel jene, die im Allgemeinen in der diagnostischen Zusammensetzung verwendet werden, wie zum Beispiel Puffer und Konservierungsmittel.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, die Verwendung von folgenden Stoffen bereitzustellen:

a) eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids, und/oder
b) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, und/oder
c) eine Wirtszelle aus dem vorstehend definierten, zu behandelnden Probanden,

Somit sind verschiedene Verfahren möglich, einen Probanden zu behandeln, der einen Anstieg bezüglich der Expression oder der Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids benötigt.
Es ist möglich, einem Probanden eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff zu verabreichen.
Es ist ebenso möglich, die endogene Produktion eines Polypeptids der Erfindung durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids an den Probanden zu erhöhen. Zum Beispiel kann dieses Polynukleotid in einem retroviralen Expressionsvektor insertiert sein. Ein solcher Vektor kann ausgehend von Zellen isoliert werden, die mit einem retroviralen Plasmidvektor infiziert wurden, der RNA enthält, welche für das Polypeptid der Erfindung codiert, in solch einer Weise, dass die transduzierten Zellen infektiöse virale Partikel produzieren, welche das betreffende Gen enthalten (siehe "Gene therapy and other Molecular Genetic based Therpeutic Approaches", Kapitel 20, in Human Molecular Genetics, Strachan und Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd., 1996).
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Polynukleotid bevorzugt verwendet, das mindestens einen codierenden SNP, wie zum Beispiel den vorstehend definierten, enthält.
Es ist ebenso möglich, Wirtszellen an den Probanden zu verabreichen, welche ihm gehören, wobei diese Wirtszellen zuvor dem Probanden entnommen und modifiziert wurden, so dass sie das Polypeptid der Erfindung, wie vorstehend definiert, exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von:

a) einer therapeutisch wirksamen Menge eines vorstehend definierten immunspezifischen Antikörpers, und/oder
b) eines Polynukleotids, welches die Hemmung der Expression eines erfindungsgemäßen Polynukleotids gestattet,

Somit ist es möglich, einem Probanden eine therapeutisch wirksame Menge eines hemmenden Mittels und/oder eines Antikörpers, wie zum Beispiel des vorstehend definierten, zu verabreichen, möglicherweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff.
Es ist ebenso möglich, die endogene Produktion eines Polypeptids der Erfindung durch Verabreichung eines komplementären erfindungsgemäßen Polynukleotids an den Probanden herabzusetzen, welches die Hemmung der Expression eines Polynukleotids der Erfindung ermöglicht.
Vorzugsweise kann ein komplementäres Polynukleotid, das mindestens einen codierenden SNP enthält, wie zum Beispiel den vorstehend definierten, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines IFNα-21-Proteins für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder zur Behandlung eines Patienten mit einer Störung oder einer Krankheit, die durch eine Variante von IFNα-21 verursacht wurde, welche mit dem Vorliegen einer Nukleotidsequenz mit mindestens 95 % Identität (vorzugsweise von 97 % Identität, stärker bevorzugt von 99 % Identität und insbesondere von 100 % Identität) mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 im Genom dieses Patienten verbunden ist, mit der Maßgabe, dass diese Nukleotidsequenz mindestens einen der folgenden SNPs: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c oder t1277c umfasst.
Vorzugsweise wird dieses Medikament für die Vorbeugung oder die Behandlung von einer der Krankheiten verwendet, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus verschiedenen Arten von Krebs und Tumoren, Infektionskrankheiten, Geschlechtskrankheiten, Immun- und/oder Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems und Störungen, die mit der Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen, besteht.
Diese Arten von Krebs und Tumoren umfassen Karzinome, welche metastasierende Nierenkarzinome umfassen, Melanome, Lymphome, welche follikuläre Lymphome (Brill- Symmers-Syndrom) und das kutane T-Zell-Lymphom umfassen, Leukämien, welche Haarzell-Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie und chronische myeloide Leukämie umfassen, Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, sowie Nierenkrebs, multiple Myelome, karzinoide Tumoren und Tumoren, die infolge einer Immunschwäche auftreten und das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS umfassen.
Diese Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionen, welche chronische Hepatitis B und C sowie HIV/AIDS, infektiöse Lungenentzündungen und Geschlechtskrankheiten, wie zum Beispiel Genitalwarzen, umfassen.
Diese Immun- und Autoimmun-Krankheiten können die Abstoßung von verpflanztem Gewebe oder Organen, Allergien, Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Crohn'sche Krankheit und eine eiternde Dickdarmentzündung umfassen.
Diese Stoffwechselkrankheiten können solche Krankheiten, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, umfassen.
Diese Krankheiten des zentralen Nervensystems können die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression umfassen.
Diese Krankheiten und Störungen können ebenso die Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten sowie Osteoporose umfassen.
Mimetische Verbindungen eines IFNα-21-Polypeptids, welches die SNPs der Erfindung umfasst
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine neue Verbindung mit einer biologischen Aktivität, die im Wesentlichen ähnlich ist zu jener des Polypeptids von:

a) der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind;

Diese biologische Aktivität kann zum Beispiel durch Messung der Reifung dentritischer Zellen, der Freisetzung von Cytokinen durch CD4+ und CD8+ T-Lymphocyten, der Freisetzung von Cytokinen durch Monocyten, der antiviralen Aktivität in vitro oder in vivo, der zellulären antiproliferativen Wirkung auf die Daudi-Burkitt-Zelllinie, oder der zellulären antiproliferativen Wirkung auf die TF-1-Zelllinie bewertet werden, wie im experimentellen Teil beschrieben.
Wie im experimentellen Teil erwähnt, unterscheidet sich das IFNα-21 mit der Mutation K179E von dem IFNα-2 des Wildtyps in folgender Weise:

– das IFNα-21 mit der Mutation K179E besitzt eine höhere Fähigkeit, die Reifung dendritischer Zellen zu stimulieren;
– das IFNα-21 mit der Mutation K179E besitzt eine höhere Fähigkeit, die Freisetzung von IFN-γ durch CD4+ oder CD8+ T-Lymphocyten zu stimulieren;
– das IFNα-21 mit der Mutation K179E besitzt eine antivirale Aktivität in der Zellkultur, welche mit VSV infiziert wurde, die geringer als jene des IFNα-2 des Wildtyps ist.

Wie im experimentellen Teil erwähnt, besitzt das IFNα-21 mit der Mutation K179E eine zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine Daudi-Burkitt-Zelllinie, die etwas geringer als jene des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps ist.
Wie ebenso im experimentellen Teil erwähnt, besitzt das IFNα-21 mit der Mutation K179E eine zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine TF-1-Zelllinie, welche ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps ist, sowie eine antivirale Aktivität im EMCV-Mausmodell, welche ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps ist.
Eine neue Verbindung der Erfindung, wie zum Beispiel die vorstehend definierte, kann eine biologische Aktivität besitzen, die im Wesentlichen zu jener des IFNα-21 mit der Mutation K179E ähnlich ist.
Diese Verbindung kann ebenso eine biologische Aktivität aufweisen, die sogar geringer oder höher ist, entsprechend der Art der betrachteten biologischen Aktivität, als jene des IFNα-21 mit der Mutation K179E.
Diese Verbindung kann eine biochemische Verbindung sein, wie zum Beispiel ein Polypeptid oder zum Beispiel ein Peptid, oder eine organische chemische Verbindung, wie zum Beispiel ein synthetisches Peptid-Mimetikum.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung, welches den SNP K179E enthält, für die Identifizierung einer Verbindung, wie zum Beispiel der vorstehend definierten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung der Erfindung, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Bestimmen der biologischen Aktivität der zu testenden Verbindung, wie zum Beispiel der Reifung dendritischer Zellen, der Freisetzung eines Cytokins durch CD4+ oder CD8+ T-Lymphozyten, der Freisetzung von Cytokinen durch Monocyten, der antiviralen Aktivität in vitro oder in vivo, oder der zellulären antiproliferativen Wirkung auf die Daudi-Burkitt-Zelllinie;
b) Vergleichen
i) der in Schritt a) bestimmten Aktivität der zu testenden Verbindung mit
ii) der Aktivität des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind; mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP K179E enthalten; und
c) Bestimmen auf der Grundlage des in Schritt b) durchgeführten Vergleichs, ob die zu testende Verbindung eine im Wesentlichen ähnliche, oder geringere oder höhere Aktivität aufweist, im Vergleich mit jener des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind; mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP K179E umfassen.

Vorzugsweise kann die zu testende Verbindung zuvor aus kombinatorischen Bibliotheken synthetischer Peptide und durch Screening mit hohem Durchsatz identifiziert werden, oder sie kann durch computer-unterstütztes Arzneimittel-Design konzipiert werden, so dass sie dieselbe dreidimensionale Struktur wie jene des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz aufweist, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind, mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP K179E umfassen.
Die vorliegend Erfindung betrifft ebenso eine neue Verbindung mit einer biologischen Aktivität, die im Wesentlichen ähnlich zu jener des Polypeptids ist von:

a) einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder
b) einer Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind;

Diese biologische Aktivität kann zum Beispiel durch Messung der Fähigkeit bewertet werden, die Reifung dendritischer Zellen, die Freisetzung von Cytokin durch CD4+ oder CD8+ T-Lymphocyten, die Freisetzung von Cytokin durch Monocyten, die antivirale Aktivität in vitro oder in vivo, die zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine Daudi-Burkitt-Zelllinie, oder die zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine TF-1-Zelllinie zu stimulieren, wie im experimentellen Teil beschrieben.
Wie im experimentellen Teil erwähnt, unterscheidet sich das IFNα-21, welches sowohl die SNPs Q114H als auch V127D enthält (eine solche Doppelmutation wird nachfolgend als „Q114H/V127D" bezeichnet), von dem IFNα-2 des Wildtyps in der folgenden Weise:

– das IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D besitzt eine höhere Fähigkeit, die Freisetzung von IFN-γ durch CD4+ oder CD8+ T-Lymphocyten zu stimulieren;
– das IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D besitzt eine geringere antivirale Aktivität in der mit VSV infizierten Zellkultur.

Wie nachstehend im experimentellen Teil erwähnt, besitzt das IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D eine zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine Daudi-Burkitt-Zelllinie, die geringer als jene des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps ist.
Wie ebenso im experimentellen Teil erwähnt, besitzt das IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D eine antivirale Aktivität im EMCV-Mausmodell, welche ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps ist, eine Fähigkeit, die Freisetzung von IL-10, IL-12 und TNF-α durch Monocyten zu stimulieren, welche ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps ist, und eine zelluläre antiproliferative Wirkung auf eine TF-1-Zelllinie, welche ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps ist.
Eine neue Verbindung der Erfindung, wie zum Beispiel die vorstehend definierte, kann eine biologische Aktivität besitzen, die im Wesentlichen ähnlich zu jener des IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D ist.
Diese Verbindung kann ebenso eine biologische Aktivität aufweisen, welche auch geringer oder höher ist, je nach Art der betrachteten biologischen Aktivität, als jene des IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D.
Diese Verbindung kann eine biochemische Verbindung, wie zum Beispiel ein Polypeptid oder Peptid, oder eine organische chemische Verbindung sein, wie zum Beispiel ein synthetisches Peptid-Mimetikum.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung, das den SNP Q114H/V127D enthält, für die Identifizierung einer Verbindung, wie zum Beispiel der vorstehend definierten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung der Erfindung, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Bestimmen der biologischen Aktivität der zu testenden Verbindung, wie zum Beispiel der Reifung dendritischer Zellen, der Freisetzung eines Cytokins durch CD4+ oder CD8+ T-Lymphocyten, der Freisetzung von Cytokinen durch Monocyten, der antiviralen Aktivität in vitro oder in vivo, oder der zellulären antiproliferativen Wirkung auf die Daudi-Burkitt-Zelllinie;
b) Vergleichen
i) der in Schritt a) bestimmten Aktivität der zu testenden Verbindung mit
ii) der Aktivität des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind; mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP Q114H/V127D enthalten; und
c) Bestimmen auf der Grundlage des in Schritt b) durchgeführten Vergleichs, ob die zu testende Verbindung eine im Wesentlichen ähnliche, oder geringere oder höhere Aktivität aufweist, im Vergleich mit jener des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind; mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP Q114H/V127D umfassen.

Vorzugsweise kann die zu testende Verbindung zuvor aus kombinatorischen Bibliotheken synthetischer Peptide und durch Screening mit hohem Durchsatz identifiziert werden, oder sie kann durch computer-unterstütztes Arzneimittel-Design konzipiert werden, so dass sie dieselbe dreidimensionale Struktur wie jene des Polypeptids der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, oder der Aminosäuresequenz aufweist, welche die Aminosäuren umfasst, die zwischen den Positionen 24 und 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 enthalten sind, mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenzen den SNP Q114H/V127D umfassen.
Die Verfahren zur Identifikation und zur Konzeption von Verbindungen sind dem Fachmann gut bekannt.
Veröffentlichungen, welche auf diese Verfahren Bezug nehmen, können zum Beispiel sein:

– Silveymann R. B., "Organic chemistry of drug design and drug action", Academic Press, 1. Ed., 15. Jan. 1992
– Anderson S. und Chiplin J., "Structural genomics; shaping the future of drug design", Drug Discov. Today 7(2): 105–107, 2002
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– Kauvar L. M., "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" Nature Biotechnology 14(6): 709, June 1996

Die Verbindungen der Erfindung können für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Vorbeugung oder zur Behandlung einer der Krankheiten vorgesehen ist, welche aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus verschiedenen Arten von Krebs und Tumoren, Infektionskrankheiten, Geschlechtskrankheiten, Immun- und/oder Autoimmun-Krankheiten und -Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems und Störungen, die mit der Behandlung durch Chemotherapie in Zusammenhang stehen, besteht.
Diese Arten von Krebs und Tumoren umfassen Karzinome, welche metastasierende Nierenkarzinome umfassen, Melanome, Lymphome, welche follikuläre Lymphome (Brill-Symmers-Syndrom) und das kutane T-Zell-Lymphom umfassen, Leukämien, welche Haarzell-Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie und chronische myeloide Leukämie umfassen, Leberkrebs, Krebs im Hals- und Kopf-Bereich, sowie Nierenkrebs, multiple Myelome, karzinoide Tumoren und Tumoren, die infolge einer Immunschwäche auftreten und das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS umfassen.
Diese Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionen, welche chronische Hepatitis B und C sowie HIV/AIDS, infektiöse Lungenentzündungen und Geschlechtskrankheiten, wie zum Beispiel Genitalwarzen, umfassen.
Diese Immun- und Autoimmun-Krankheiten können die Abstoßung von verpflanztem Gewebe oder Organen, Allergien, Asthma, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Crohn'sche Krankheit und eine eiternde Dickdarmentzündung umfassen.
Diese Stoffwechselkrankheiten können solche Krankheiten, die nicht mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, umfassen.
Diese Krankheiten des zentralen Nervensystems können die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, Schizophrenie und Depression umfassen.
Diese Krankheiten und Störungen können ebenso die Wundheilung, Anämie bei dialysierten Patienten sowie Osteoporose umfassen.
Die Verbindungen der Erfindung können für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Vorbeugung oder die Behandlung einer der Krankheiten vorgesehen ist, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus bestimmten viralen Infektionen, wie zum Beispiel chronische Hepatitis B und C, Leukämien, wie zum Beispiel Haarzell-Leukämie und chronische myeloide Leukämie, multiple Myelome, follikuläre Lymphone (Brill-Symmers-Syndrom), karzinoide Tumore, maligne Melanome, metastasierende Nierenkarzinome, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit, sowie Tumore, die infolge einer Immunschwäche auftreten, wie zum Beispiel das Kaposi-Sarkom im Falle von AIDS, sowie Genitalwarzen oder Geschlechtskrankheiten, besteht.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1: Modellieren eines Proteins, welches durch ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz codiert wird, welche die SNPs c973a, g1011c, t1049a, t1155a oder a1204g enthält, und eines Proteins, das durch die Nukleotidsequenz des Gens des als Referenz dienenden Wildtyps codiert wird
In einem ersten Schritt wurde die dreidimensionale Struktur von IFNα-21 ausgehend von jener des IFNα-2 konstruiert, dessen Struktur in der PDB-Datenbank (Code 1ITF) und durch die Verwendung der Software Modeler (MSI, San Diego, CA) erhältlich ist.
Das reife Polypeptid-Fragment wurde anschließend in einer solchen Weise modifiziert, um die Mutationen A19G, Q79K, Q91H, V104D, C139stop und K156E zu reproduzieren.
Eintausend molekulare Minimierungsschritte wurden mit diesem mutierten Fragment durchgeführt, indem die Programme AMBER und DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.) verwendet wurden.
Zwei molekulardynamische Berechnungen wurden anschließend mit demselben Programm und denselben Kraftfeldern durchgeführt.
In jedem Fall wurden 50.000 Schritte bei 300 °K berechnet, die durch 300 Gleichgewichtsschritte beendet wurden.
Das Ergebnis dieser Modellierung ist in den 1, 2, 3, 4 und 5 zu sehen.
Beispiel 2: Bestimmung des Genotyps der SNPs c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g in einer Population von Individuen
Die Bestimmung des Genotyps der SNPs beruht auf dem Prinzip der Minisequenzierung, wobei das Produkt durch Ablesen der polarisierten Fluoreszenz nachgewiesen wird. Dieses Verfahren besteht aus einer fluoreszierenden Minisequenzierung (Verfahren mittels Fluoreszenz-Polarisation, bei dem ein mit Farbstoff markiertes Didesoxynukleotid in das Templat eingebaut wird; Technology of Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation; FP-TDI).
Die Minisequenzierung wird mit einem durch PCR amplifizierten Produkt durchgeführt, die aus der genomischen DNA eines jeden Individuums der Population gewonnen wird. Dieses PCR-Produkt wird in einer solchen Weise ausgewählt, dass es den genetischen Bereich abdeckt, welcher denjenigen SNP enthält, dessen Genotyp zu bestimmen ist. Nach der Beseitigung der PCR-Primer, die nicht verwendet wurden, und der dNTPs, die nicht eingebaut wurden, wird die Minisequenzierung durchgeführt.
Die Minisequenzierung besteht aus der Verlängerung eines Oligonukleotid-Primers, der genau stromaufwärts von der Stelle des SNPs angeordnet ist, indem ein Polymerase-Enzym und fluoreszenz-markierte Didesoxynukleotide verwendet werden. Das Produkt, welches sich aus diesem Verlängerungsprozess ergibt, wird unmittelbar durch Ablesen der polarisierten Fluoreszenz analysiert.
Alle diese Schritte, auch das Ablesen, werden in derselben PCR-Platte durchgeführt.
Somit erfordert die Bestimmung des Genotyps 5 Schritte:

1) Amplifikation durch PCR
2) Reinigung des PCR-Produkts durch enzymatischen Verdau
3) Verlängerung der Oligonukleotidprimer
4) Ablesen
5) Interpretation der abgelesenen Werte

Die Schritte 1 und 2 bei der Bestimmung des Genotyps werden für jeden der SNPs c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g unter denselben Bedingungen durchgeführt. Die Schritte 3, 4 und 5 sind spezifisch für jeweils einen dieser Polymorphismen.

1) Die Amplifikation der Nukleotidsequenz des IFNα-21-Gens durch PCR wird ausgehend von der genomischen DNA durchgeführt, die aus jeweils 268 Individuen von ethnisch verschiedenem Ursprung stammt.

Diese genomischen DNAs wurden durch das Coriell Institut in den Vereinigten Staaten bereitgestellt.
Diese 268 Individuen verteilen sich wie folgt:
Die genomische DNA, die aus jeweils einem dieser Individuen stammt, stellt eine Probe dar.
Für alle SNPs wird die PCR-Amplifikation ausgehend von den folgenden Primern durchgeführt:
SEQ ID Nr. 5: Sens-Primer: GGT TCA AGG TTA CCC ATC TC
SEQ ID Nr. 6: Antisens-Primer: TTT GAA ATG GCA GAA GTC AT
Diese Nukleotidsequenzen erlauben die Amplifikation eines Fragments mit einer Länge von 696 Nukleotiden, vom Nukleotid 620 bis zum Nukleotid 1315 in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1.
Für jeden SNP wird das PCR-Produkt als Templat für die Minisequenzierung dienen.
Das gesamte Reaktionsvolumen der PCR-Reaktion beträgt 5 μl pro Probe.
Dieses Reaktionsvolumen ist aus den Reagenzien zusammengesetzt, welche in der folgenden Tabelle gezeigt sind:
Diese Reagenzien werden auf eine schwarze PCR-Platte mit 384 Vertiefungen von ABGene (Ref.: TF-0384-k) verteilt. Die Platte wird abgedichtet, zentrifugiert, und anschließend in ein PCR-Gerät (Thermocycler) für Platten mit 384 Vertiefungen (Tetrad of MJ Research) eingesetzt und der folgenden Inkubation unterzogen: PCR Zyklen: 1 Min. bei 94 °C, gefolgt von 36 Zyklen, die aus 3 Schritten zusammengesetzt sind (15 Sek. bei 94 °C, 30 Sek. bei 56 °C, 1 Min. bei 68 °C).

2) Das durch PCR amplifizierte Produkt wird anschließend mittels zweier Enzyme gereinigt: Alkalische Phosphatase aus Garnelen (Shrimp alkalische Phosphatase, SAP) und Exonuklease I (Exo I). Das erste dieser Enzyme ermöglicht die Dephosphorylierung der dNTPs, welche während der PCR-Amplifikation nicht eingebaut wurden, während das zweite die einzelsträngigen DNA-Reste beseitigt, insbesondere die Primer, welche während der PCR-Reaktion nicht verwendet wurden.

Dieser Verdau wird durch die Zugabe von einer Reaktionsmischung von 5 μl per Probe in jede Vertiefung der PCR-Platte bewerkstelligt. Diese Reaktionsmischung ist aus den folgenden Reagenzien zusammengesetzt:
Sobald die Platte befüllt ist, wird sie abgedichtet, zentrifugiert und in ein PCR-Gerät (Thermocycler) für eine Platte mit 384 Vertiefungen (Tetrad of MJ Research) eingesetzt, und der folgenden Inkubation unterzogen: Verdau SAP-EXO: 45 Min. bei 37 °C, 15 Min. bei 80 °C.
Der Verlängerungs- oder Minisequenzierung-Schritt wird anschließend mit dem Produkt der PCR-Reaktion durchgeführt, welches durch Zugabe einer Reaktionsmischung von 5 μl je vorbereiteter Probe verdaut wird.
Die Schritte der Minisequenzierung 3) und des Ablesens 4) sowie der Interpretation der abgelesenen Werte 5) sind für jeden SNP c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g spezifisch.
Alle diese Schritte werden nachfolgend beschrieben, wobei die spezifischen Bedingungen, die für jeden dieser Polymorphismen verwendet wurden, genauer beschrieben werden.

3) Minisequenzierung Die Sequenzen der zwei Minisequenzierungs-Primer, die für die Bestimmung des Genotyps notwendig sind, wurden in einer Weise bestimmt, um der Sequenz der Nukleotide zu entsprechen, die stromaufwärts von der Stelle des erfindungsgemäßen SNPs lokalisiert ist. Das PCR-Produkt, welches den SNP enthält, ist ein doppelsträngiges DNA-Produkt, so dass die Bestimmung des Genotyps daher entweder mit dem Sens-Strang oder mit dem Antisens-Strang erfolgen kann. Die ausgewählten Primer wurden von Life Technologies hergestellt.

Die folgende Tabelle weist die Sequenz der Minisequenzierungs-Primer, die getestet wurden, und die optimale Bedingung, die für die Bestimmung des Genotyps eingehalten wurde, für jeden SNP aus:
Die Minisequenzierung der SNPs wurde zunächst für 16 Proben bestätigt, und anschließend wurde der Genotyp über einen Satz einer Population von Individuen bestimmt, die aus 268 Individuen und 10 Kontrollpersonen zusammengesetzt war.
Der Verlängerungs- oder Minisequenzierungs-Schritt wird anschließend durchgeführt, wie er in der folgenden Tabelle gezeigt ist:

¹ 5 × Verlängerungspuffer ist zusammengesetzt aus: 250 mM Tris-HCl, pH 9; 250 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 40 % Glycerin.
² Für die ddNTPs wird eine Mischung der 4 Basen gemäß dem untersuchten Polymorphismus durchgeführt. Nur 2 der betreffenden Basen (Wildtyp-Nukleotid/mutiertes Nukleotid), welche den funktionellen SNP ausmachen, sind markiert, entweder mit Tamra oder mit R110.

Zum Beispiel ist die Mischung der ddNTPs für SNP c973a zusammengesetzt aus:

– 2,5 μM nicht markiertes ddCTP,
– 2,5 μM nicht markiertes ddATP,
– 2,5 μM ddTTP (1,875 μM nicht markiertes ddTTP und 0,625 μM mit Tamra markiertes ddTTP)
– 2,5 μM ddGTP (1,875 μM nicht markiertes ddGTP und 0,625 μM mit R110 markiertes ddGTP).

Sobald die Platte befüllt ist, wird sie abgedichtet, zentrifugiert und anschließend in ein PCR-Gerät (Thermocycler) für Platten mit 384 Vertiefungen (Tetrad of MJ Research) eingesetzt und der folgenden Inkubation unterzogen: Verlängerungszyklen: 1 Min. bei 93 °C, gefolgt von 35 Zyklen, die aus 2 Schritten zusammengesetzt sind (10 Sek. bei 93 °C, 30 Sek. bei 55 °C).
Nach dem letzten Schritt im PCR-Gerät (Thermocycler) wird die Platte unmittelbar in ein Lesegerät für polarisierte Fluoreszenz vom Typ Analyst^®HT von LJL Biosystems Inc. eingesetzt. Die Platte wird unter Verwendung der Criterion Host^® Software unter Verwendung zweier Verfahren gelesen. Das erste ermöglicht das Ablesen der mit Tamra markierten Base, indem Emissions- und Anregungs-Filter verwendet werden, die für dieses Fluorophor (Anregung 550–10 nm, Emission 580–10 nm) spezifisch sind, und das zweite ermöglicht das Ablesen der mit R110 markierten Base, indem Anregungs- und Emissions-Filter verwendet werden, die für dieses Fluorophor (Anregung 490–10 nm, Emission 520–10 nm) spezifisch sind. In den beiden Fällen wird ein dichromatischer Spiegel (R110/Tamra) verwendet, und die anderen Ableseparameter sind:
Z-Höhe: 1,5 mm
Attenuator: aus
Integrationszeit: 100.000 μSek.
Einheiten der Rohdaten: Zahl/Sek.
Umschalten der Polarisation: für jeden Napf
Absetzzeit der Platte (plate settling time): 0 mSek.
PMT Setup: Smart Read (+), Empfindlichkeit 2
Dynamischer Polarisator: Emission
Statischer Polarisator: S
Ein Ergebnis eines Datensatzes wird somit erhalten, der die berechneten Werte von mP (Millipolarisation) für den Tamra-Filter und jene für das R110-Filter enthält. Diese mP-Werte werden berechnet, ausgehend von den Werten der Intensität, die auf der parallelen Ebene (P) und auf der senkrechten Ebene (S) entsprechend der folgenden Formel erhalten wurden: mP = 1000(P – (g·S))/(P + (g·S)).
In dieser Berechnung wird der Wert S mit dem Faktor g gewichtet. Es ist ein Geräteparameter, der zuvor experimentell bestimmt werden muss.

4) und 5) Interpretation der abgelesenen Daten und Bestimmung der Genotypen Die mP-Werte werden zu einem Graphen aufgetragen, unter Verwendung der Software Microsoft Excel, und/oder der Software Allele Caller^®, welche von LJL Biosystems Inc. entwickelt wurde.

Auf der Abszisse ist der mP-Wert der mit Tamra markierten Base angegeben, auf der Ordinate ist der mP-Wert der mit R110 markierten Base angegeben. Ein hoher mP-Wert weist darauf hin, dass die mit diesem Fluorophor markierte Base eingebaut wird, und umgekehrt lässt ein geringer mP-Wert erkennen, dass der Einbau dieser Base nicht erfolgt ist.
Bis zu drei homogene Gruppen von Nukleotidsequenzen mit unterschiedlichen Genotypen können erhalten werden.
Die Verwendung der Software Allele Caller^® ermöglicht es, den für jedes Individuum in der Tabelle definierten Genotyp unmittelbar zu extrahieren, sobald die Identifikation der unterschiedlichen Gruppen durchgeführt wurde.
Ergebnisse der Minisequenzierung für die SNPs c973a g1011c t1049a t1155a und a1204g
Nach der Vervollständigung des Verfahrens zur Bestimmung des Genotyps wurde die Bestimmung der Genotypen der Individuen der Population von Individuen für die hier untersuchten SNPs unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Graphen durchgeführt.
Für den SNP c973a ist der Genotyp in der Theorie entweder ein homozygotes CC oder ein heterozygotes CA, oder ein homozygotes AA in den untersuchten Individuen. In Wirklichkeit und wie nachfolgend gezeigt ist, wird der homozygote Genotyp AA in der Population von Individuen nicht nachgewiesen.
Für den SNP g1011c ist der Genotyp in der Theorie entweder ein homozygotes GG oder ein heterozygotes GC, oder ein homozygotes CC in den untersuchten Individuen. In Wirklichkeit und wie nachfolgend gezeigt ist, wird der homozygote Genotyp CC in der Population von Individuen nicht nachgewiesen.
Für den SNP t1049a ist der Genotyp in der Theorie entweder ein homozygotes TT oder ein heterozygotes TA, oder ein homozygotes AA in den untersuchten Individuen. In Wirklichkeit und wie nachfolgend gezeigt ist, wird der homozygote Genotyp AA in der Population von Individuen nicht nachgewiesen.
Für den SNP t1155a ist der Genotyp in der Theorie entweder ein homozygotes TT oder ein heterozygotes TA, oder ein homozygotes AA in den untersuchten Individuen. In Wirklichkeit und wie nachfolgend gezeigt ist, wird der homozygote Genotyp AA in der Population von Individuen nicht nachgewiesen.
Für den SNP 1204g ist der Genotyp in der Theorie entweder ein homozygotes AA oder ein heterozygotes AG, oder ein homozygotes GG in den untersuchten Individuen. In Wirklichkeit und wie nachfolgend gezeigt ist, wird der homozygote Genotyp GG in der Population von Individuen nicht nachgewiesen.
Die Ergebnisse der Verteilung der bestimmten Genotypen in der Population von Individuen und die Berechnung der Frequenzen der unterschiedlichen Allele für die 5 untersuchten SNPs werden in den folgenden Tabellen vorgestellt:
In der vorstehenden Tabelle

– stellt N die Anzahl der Individuen dar,
– stellt % den Prozentsatz der Individuen der spezifischen Subpopulation dar,
– stellt die Allel-Frequenz den Prozentsatz des mutierten Allels in der spezifischen Subpopulation dar,
– stellt der 95 % IC-Wert das minimale und maximale Vertrauensintervall (confidence interval; Cl) bei 95 % dar.

Es ist notwendig, zu spezifizieren, dass zum Beispiel im Falle des SNP c973a, das Allel g, gelesen in Antisens-Richtung, dem Allel c, gelesen in Sens-Richtung entspricht, und dass es mit dem Vorliegen eines Glutamins (Q) an Position 102 der unreifen IFNα-21-Proteinsequenz in Beziehung steht, und dass daher das Allel t, gelesen in Antisens-Richtung, dem Allel a, gelesen in Sens-Richtung, entspricht, welches einem Lysin (K) an dieser Position in der Sequenz des entsprechenden Proteins entspricht.
Durch die Überprüfung dieser Ergebnisse anhand der phylogenetischen Population und durch den SNP wird beobachtet, dass:

– im Falle des SNP c973a die 4 heterozygoten Individuen bezüglich CA aus den europäischen und nicht europäischen kaukasoiden Subpopulationen stammen;
– im Falle des SNP g1011c das einzige heterozygote Individuum bezüglich GC aus der europäisch kaukasoiden Subpopulation stammt,
– im Falle des SNP t1049a das einzige heterozygote Individuum bezüglich TA aus der afrikanisch amerikanischen Subpopulation stammt,
– im Falle des SNP t1155a die 8 heterozygoten Individuen bezüglich TA aus der afrikanisch amerikanischen und europäisch kaukasoiden Subpopulation stammen,
– im Falle des SNP a1204g die 15 heterozygoten Individuen bezüglich AG aus der amerikanisch indianischen, europäischen und nicht europäischen kaukasoiden, mexikanischen, nordostasiatischen und südamerikanischen Subpopulation stammen.

Beispiel 3: Expression des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps und des IFNα-21 mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D oder K179E in Hefe
a) Klonierung des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps und des mutierten IFNα-21 in dem eukaryotischen Expressionsvektor pPicZa-Topo
Die Nukleotidsequenzen, welche für den reifen Teil des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps und des IFNα-21 mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D oder K179E codieren, werden durch PCR amplifiziert, wobei ein Templat mit genomischer DNA aus einem Individuum verwendet wird, das heterozygot bezüglich der SNPs ist.
Die PCR-Primer, welche eine solche Amplifikation ermöglichen, sind:
SEQ ID Nr. 19: Sens-Primer: TGT GAT CTG CCT CAG ACC CAC
SEQ ID Nr. 20: Antisens-Primer: TCA TTC CTT CCT CCT TAA TCT TTC TTG
Die PCR-Produkte werden in den eukaryotischen Expressionsvektor pPicZa-Topo unter der Kontrolle des Hybridpromotors AOX1 insertiert, der durch Methanol induzierbar ist (TOPO^TM-Cloning, Invitrogen Corp.).
Dieser Vektor ermöglicht die heterologe Expression eukaryotischer Proteine in der Hefe Pichia pastoris
Nach der Überprüfung der Nukleotidsequenz in dem Bereich des Vektors, der für die rekombinanten Proteine codiert, wird der Vektor durch das Restriktionsenzym Pme1 linearisiert, und der Hefestamm P. pastoris (Invitrogen) wird mit diesen rekombinanten Expressionsvektoren transformiert.
b) Heterologe Expression in P. pastoris und Reinigung des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps und des IFNα-21-Proteins mit Mutationen
Zwei gesättigte Vorkulturen von 50 ml BMGY-Medium (2 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 1,34 % YNB, 1 % Glycerin, 100 mM Kaliumphosphat, 0,4 mg/l Biotin, pH 6,0), welche Kulturen einen Klon enthielten, der für das IFNα-21-Protein des Wildtyps codiert, oder der für das IFNα-21-Protein mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D oder K179E codiert, wurden für 24 bis 48 Stunden bei 30 °C unter Rühren bei 200 Umdrehungen/Minute (UpM) durchgeführt.
Wenn die Kultur eine gesättigte Zelldichte (entsprechend einer optischen Dichte von 12, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm) erreicht, wird sie dazu verwendet, 250 ml BMMY-Medium (2 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 1,34 % YNB, 0,5 % Methanol, 100 mM Kaliumphosphat, 0,4 mg/l Biotin, pH 6,0) bei 5 OD/ml zu beimpfen.
Die Expression des Proteins wird anschließend durch Methanol mit einer Endkonzentration von 1 % für 24 Stunden bei 30 °C induziert, wobei das Kulturgefäß mit 180 UpM gerührt wird.
Aufgrund des Vorliegens einer Signalpeptid-Sequenz des „α-Faktors", stromaufwärts von der codierenden Sequenz, werden die Proteine durch die Hefen in das Kulturmedium sezerniert. Der α-Faktor wird in natürlicher Weise während des Prozessierens abgespalten.
Die Suspension wird zentrifugiert und das Protein wird durch HPLC ausgehend von dem erhaltenen Überstand gereinigt.
In einem Schritt vor dem Start ermöglicht eine Ultrafiltration (Labscale, Ausschluss-Molekulargewicht 5.000 Da, Millipore), gefolgt von einer Dialyse eine Konzentrierung des Hefeüberstandes auf die zehnfache Konzentration in einem Puffer von 50 mM Tris-HCl, pH 9,0; 25 mM NaCl.
Der erste chromatographische Schritt ermöglicht eine Protein-Rückgewinnung durch Affinität auf einer blauen Sepharose-Säule (Sepharose Blue; Amersham Pharmacia). Das Vorliegen des Proteins in den gesammelten Fraktionen wird bestätigt, einerseits durch Elektrophorese vom SDS-PAGE-Typ und andererseits durch immunchemischen Nachweis mittels eines spezifischen Antikörpers, der gegen das IFNα-21-Protein gerichtet ist. Auf dieser Stufe beträgt die Reinheit des betreffenden Proteins mehr als 75 %.
In einem zweiten Reinigungsschritt ermöglicht eine Gelfiltration einen Pufferaustausch der gesammelten Fraktionen, welche den IFNα-21-Proteinen entsprechen, gegen 50 mM Tris-HCl, pH 9,0; 25 mM NaCl.
Der letzte Schritt der Reinigung besteht aus einer Trennung der Proteine auf einer Anionenaustausch-Chromatographiesäule.
Die Fraktionen, welche das rekombinante Protein enthalten, werden auf eine Anionenaustausch-Säule (Resource Q, 6,0 ml, Pharmacia) aufgegeben, die zuvor mit einem Puffer von 50 mM Tris-HCl, pH 9,0; 25 mM NaCl äquilibriert wurde. Die Elution der Proteine wird durch die Migration eines Gradienten zwischen 0,025 und 1 M NaCl in dem Puffer von 50 mM Tris-HCl, pH 9 durchgeführt.
Die Reinheit des betreffenden Proteins wird aus dem SDS-PAGE-Gel abgeschätzt, und die Proteinkonzentrationen werden durch Densitometrie (Quantity One, Biorad) und einem BCA-Assay (Bicinchoninsäure (= 2,2'-Bischinolin-4,4'-dicarbonsäure) und Kupfersulfat, Sigma) gemessen.
Das gereinigte IFNα-21-Protein des Wildtyps und das gereinigte IFNα-21-Protein mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D oder K179E, welche entsprechend diesem Protokoll erhalten wurden, und welche gegebenenfalls in größerem Maßstab hergestellt werden, um größere Mengen des Proteins zu erhalten, werden für die nachfolgend beschriebenen funktionellen Tests verwendet.
Beispiel 4: Bewertung der immunmodulierenden Wirkung des natürlichen IFNα-21 des Wildtyps und des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E
IFNs vom Typ I (IFN-α und IFN-β) sind imstande, bestimmte Funktionen des Immunsystems zu modulieren. Es wurde gezeigt, dass sie die Reifung dendritischer Zellen (DC) erhöhen: ein Anstieg der Expression der MHC-Moleküle der Klasse I (HLA-ABC) und der Klasse II (HLA-DR), ein Anstieg der Expression der Moleküle, die an der Costimulation der T-Lymphocyten, der CD80-, der CD86- und der CD83-Moleküle beteiligt sind, sowie ein Anstieg der stimulierenden Funktion der T-Lymphocyten.
a) Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E auf die Reifung dendritischer Zellen
Die immunmodulierende Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E wurde zuerst bezüglich der Reifung dendritischer Zellen erforscht und mit jener des IFNα-2 des Wildtyps verglichen, das als ein Vertreter eines im Handel erhältlichen Intron A Produkts ausgewählt wurde.
Um dies auszuführen, wurden dendritische Zellen zunächst aus Monocyten aus peripherem Blut eines Erwachsenen erzeugt, welche Monocyten in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 Cytokinen kultiviert wurden. Nach der Reinigung unter Verwendung eines Reinigungskits mit CD14+ Zellen wurden diese dendritischen Zellen der Gegenwart von 100 ng/ml IFNα-2 des Wildtyps oder des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E ausgesetzt, und ihr Phänotyp wurde durch FACS-Analyse bestimmt, welche den Zweck hatte, nach der Expression der MHC-Moleküle der Klasse I und der Klasse II sowie nach den Markern CD40, CD80, CD86, CD83 und CD1a zu suchen. Der Reifungszustand dieser dendritischen Zellen wurde ebenso mit jenem Zustand verglichen, der ohne eine Behandlung mit IFNα erhalten wurde, um eine Kontrolle mit nicht stimulierten dendritischen Zellen bereitzustellen.
Der Mittelwert der Messungen der Fluoreszenzintensität für jeden Marker und für die drei experimentellen Bedingungen, dargestellt als willkürliche Einheiten, ist in der folgenden Tabelle dargestellt:
Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, dass das IFNα-21-Protein mit der Mutation K179E eine hohe Fähigkeit besitzt, die Reifung dendritischer Zellen zu stimulieren, wobei diese stimulierende Wirkung höher ist als jene des IFNα-2 des Wildtyps.
b) Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E auf die Freisetzung eines Cytokins durch T-Lymphocyten
Die immunmodulierende Wirkung von IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E wurde ebenso untersucht, indem die Freisetzung von Cytokin durch T-Lymphocyten gemessen wurde, welche der Gegenwart des entsprechenden mutierten IFNα-21-Proteins mit oder ohne ein starkes Antigen (SEB) ausgesetzt wurden, um eine Immunreaktion gegenüber einer Aggression nachzuahmen. Dieser Test wurde ebenso in Gegenwart des IFNα-2 des Wildtyps durchgeführt, welches als eine Kontrolle verwendet wurde, und als ein Vertreter eines im Handel erhältlichen Intron A Produkts ausgewählt wurde.
Um dies durchzuführen, wurden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) aus gesunden Spendern isoliert und für 16 Stunden in einem geeigneten Medium stimuliert, das anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper oder ein SEB enthielt. Zu jeder Kultur wurden 4 μg/ml IFNα-2 des Wildtyps oder IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E gegeben. Nach der Stimulation wurden die T-Lymphocyten extrazellulär mit anti-CD3-, anti-CD4- und anti-CD69-Antikörpern oder anti-CD3-, anti-CD8- und anti-CD69-Antikörpern, und intrazellulär mit spezifischen Antikörpern markiert, die gegen die Cytokine vom Typ Th1 (IFN-γ) oder die Cytokine vom Typ Th2 (IL-10) gerichtet sind. Fluoreszierende Zellen wurden unter Verwendung von FACS-Calibur und der Software CellQuest analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mutierten IFNα-21-Proteine und das IFNα-2 des Wildtyps die Freisetzung von IL-10 und IFN-γ nicht stimulieren, und somit die T-Lymphocyten in Abwesenheit von SEB nicht aktivieren. Im Gegensatz dazu stimulieren die mutierten IFNα-21-Proteine und das IFNα-2 des Wildtyps die Freisetzung von Cytokinen (IL-10 und IFN-γ) durch SEB-aktivierte T-Lymphocyten, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Diese Tabelle stellt die Freisetzung von Cytokinen durch T-Lymphocyten in Gegenwart von SEB vor, ausgedrückt als Prozentsatz der CD4+ CD69+ Zellen bzw. der CD8+ CD69+ Zellen für die CD4+ T-Lymphocyten bzw. CD8+ T-Lymphocyten, sowie den Prozentsatz der CD69+ Zellen in Bezug auf die gesamten Zellen.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D und das IFNα-21 mit der Mutation K179E die Freisetzung von Cytokinen (IFN-γ und IL-10) durch CD4+ und CD8+ T-Lymphocyten, welche zuvor durch das SEB-Antigen aktiviert wurden, stark stimulieren. In diesem Test ist die Erzeugung von Interferon-γ durch T-Lymphocyten in Gegenwart von IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D oder IFNα-21 mit der Mutation K179E höher als in Gegenwart des IFNα-2 des Wildtyps.
c) Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E auf die Freisetzung eines Cytokins durch Monocyten
Schließlich wurde die immunmodulierende Wirkung von IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E durch Messung der Freisetzung des Cytokins durch Monocyten in Abwesenheit oder in Gegenwart eines bakteriellen toxischen Mittels (LPS) untersucht. Dieser Test wurde auch in Gegenwart von IFNα-2 des Wildtyps durchgeführt, welches als Kontrolle verwendet wurde und als ein Vertreter eines im Handel erhältlichen Intron A Produktes ausgewählt wurde.
Um dies durchzuführen, wurden mononukleäre Zellen aus humanem peripheren Blut (PBMC) aus gesunden Spendern isoliert, und ihr Phänotyp wurde analysiert, um die relative Menge von CD64+ CD4dim Zellen zu bestimmen (CD64 und CD4dim sind Marker für Blutmonocyten). Nach einer Kultur über Nacht wurden diese PBMC ausschließlich in dem Kulturmedium (nicht stimulierte Zellen) oder in Gegenwart von LPS (stimulierte Zellen) inkubiert. Zu jeder Kultur wurden 4 μg/ml IFNα-2 des Wildtyps oder mutierte IFNα-21 gegeben. Nach der Kultur wurden die Zellen extrazellulär mit anti-CD64- und anti-CD4dim-Antikörpern markiert, und intrazellulär mit spezifischen Antikörpern markiert, die gegen Cytokine vom Typ Th1 (TNF-α), IL-12 und IL-10 gerichtet sind.
Fluoreszierende Zellen wurden unter Verwendung von FACS-Calibur und der Software CellQuest analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mutierten IFNα-21-Proteine und das IFNα-2 des Wildtyps die Freisetzung von Cytokinen (IL-10, IL-12 und TNF-α) in Abwesenheit von LPS nicht stimulieren. Im Gegensatz dazu stimulieren die IFNα-21-Proteine mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E in Gegenwart von LPS die Freisetzung von Cytokinen (IL-10, IL-12, and TNF-α) durch Monocyten, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt ist. Diese Tabelle stellt die Freisetzung von Cytokinen durch Monocyten in Gegenwart von LPS dar, ausgedrückt als Prozentsatz der CD64+ CD4dim Zellen, sowie den Prozentsatz der CD4dim CD64+ Zellen in Bezug auf die gesamten Zellen.
Beispiel 5: Bewertung der antiproliferativen Wirkung in vitro von IFNα-21 mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D und K179E
a) auf die Proliferation humaner Lymphoblasten einer Daudi-Burkitt-Zelllinie
Diese Tests wurden mit den IFNα-21-Proteinen mit den Mutationen Q102K, Q114H/V127D und K179E sowie mit dem IFNα-21-Protein des Wildtyps durchgeführt. Die Zellen (eine humane Zelllinie des Daudi-Burkitt-Lymphoms, nachfolgend „Daudi-Zellen" genannt), welche zuvor in einem RPMI 1640 Medium (das mit 10 % fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin ergänzt wurde) kultiviert wurden, wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen bei einer Zelldichte von 4 × 10⁴ Zellen/Vertiefung überimpft.
In jede Vertiefung wurden Daudi-Zellen mit steigenden Konzentrationen entweder der mutierten IFNα-21-Proteine oder des Wildtyps in Kontakt gebracht. Für jedes IFNα-21-Protein, das untersucht werden soll, wurden Endkonzentrationen von 0,003 pM bis 600 nM getestet.
Die Daudi-Zellen wurden anschließend für 66 Stunden bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubiert, und anschließend wurde das Uptiblue-Reagenz (Uptima) zu den Kulturen gegeben. Die Geschwindigkeit der Zellproliferation wird durch Messung der Fluoreszenz, welche bei 590 nm (Anregung 560 nm) nach einem weiteren Zeitraum der Inkubation von 4 Stunden emittiert wurde, quantitativ bestimmt.
Die antiproliferative Wirkung der mutierten IFNα-21 oder des IFNα-21 des Wildtyps beruht auf den Messungen der IC₅₀-Werte, welche denjenigen Konzentrationen des IFNα-21 entsprechen, bei denen das Zellwachstum zu 50 % gehemmt ist.
Für jede experimentelle Bedingung wurden mindestens drei Experimente dreimal durchgeführt, welche die Bestimmung eines durchschnittlichen IC₅₀-Werts für jedes IFNα-21-Protein gestatten. Das Verhältnis, welches dem IC₅₀-Wert des mutierten Proteins, dividiert durch den IC₅₀-Wert des Wildtyp-Proteins entspricht, ermöglicht den Vergleich. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst (in Klammern ist die Standardabweichung angegeben):
Dieser Test zeigt, dass die zelluläre antiproliferative Wirkung der IFNα-21-Proteine mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E auf die Daudi-Zellen geringer ist als jene des IFNα-21 des Wildtyps. Insbesondere ist die zelluläre antiproliferative Wirkung auf Daudi-Zellen in Gegenwart von IFNα-21 mit der Mutation Q114H/V127D annähernd 10- bis 16-mal geringer im Vergleich mit jener des IFNα-21 des Wildtyps.
b) auf die Erythroleukämie-Zelllinie TF-1
Die Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E wurde ebenso in Bezug auf die Erythroleukämie-Zelllinie TF-1 bewertet. Dieser Test wird ebenso in Gegenwart des IFNα-2 des Wildtyps durchgeführt, das als Kontrolle verwendet wird und als ein Vertreter eines im Handel erhältlichen Intron A Produkts ausgewählt wird.
Um dies durchzuführen, wurden die TF-1-Zellen mit steigenden Konzentrationen von mutiertem IFNα-21-Protein oder des IFNα-2 des Wildtyps (0,001 bis 1000 ng/ml) in Kontakt gebracht, und die Zellproliferation wurde gemessen.
Die Ergebnisse werden als IC₃₀-Wert ausgedrückt, welcher derjenigen Konzentration an IFNα entspricht, bei der die Proliferation der Zellen zu 30 % gehemmt wird, und sie sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Diese Daten weisen darauf hin, dass die drei mutierten IFNα-21-Proteine eine schwache antiproliferative Wirkung auf TF-1-Zellen aufweisen, und diese Wirkung ist ähnlich zu jener des IFNα-2 des Wildtyps, so dass der Schluss nahegelegt wird, dass die hämatologische Toxizität der IFNα-21-Proteine mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E nicht größer ist als jene des IFNα-2 des Wildtyps.
Beispiel 6: Bewertung der antiviralen Aktivität des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E
Die IFNs spielen eine wichtige Rolle in der antiviralen Abwehr. Die antivirale Wirkung der IFNs ist zum Teil auf IFNs zurückzuführen, die durch enzymatische Systeme induziert werden, wie zum Beispiel:

– Die 2',5'-Oligoadenylat-Synthase, ein Enzym, welches die Adenosin-Oligomersynthese katalysiert. Diese Oligomere aktivieren die RNase I, eine Endoribonuklease, welche die virale RNA zerstört, sobald die RNase einmal aktiviert ist.
– Die Mx-Proteine (GTPasen), welche die Synthese und/oder die Reifung viraler Transkripte hemmen. Diese Aktivität wird hauptsächlich auf den Influenza-Virus ausgeübt.
– Das PKR-Protein (oder p68-Kinase), welche durch die doppelsträngige RNA aktiviert wird. Das aktivierte PKR-Protein hemmt die Proteinsynthese.

Die antivirale Aktivität der IFNs wird ebenso durch andere Mechanismen induziert, wie zum Beispiel im Falle der Retroviren die Hemmung des Eindringens viraler Partikel in die Zellen, die Replikation, die Bindung, das Austreten der Partikel und die infektiöse Potenz der viralen Teilchen.
Schließlich üben die IFNs eine mittelbare antivirale Wirkung aus, indem sie bestimmte Funktionen des Immunsystems modulieren, insbesondere indem sie die Reaktion auf eine Zellvermittlung begünstigen (einschließlich eines Anstiegs der MHC-Moleküle der Klassen I und II, eines Anstiegs der Produktion von IL-12 und IFN-γ, eines Anstiegs der CTL-Aktivitäten, und dergleichen).
Die antivirale Aktivität des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E wurde sowohl in einer Zellkultur in vitro als auch in einem Mausmodell in vivo bewertet. Beide Testverfahren wurden parallel mit IFNα-2 des Wildtyps durchgeführt, das als Kontrolle verwendet wurde und als ein Vertreter eines im Handel erhältlichen Intron A Produkts ausgewählt wurde.
a) Antivirale Aktivität in einer Zellkultur in vitro
Dieser Assay gestattet die Bewertung der antiviralen Wirkung des IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E und des IFNα-2 des Wildtyps in einer Zellkultur, wobei der vesikulare Stomatitis-Virus (VSV) verwendet wurde.
Um dies durchzuführen, werden humane epitheliale WISH-Zellen für 24 Stunden in Gegenwart absteigender Konzentrationen von IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E oder von IFNα-2 des Wildtyps kultiviert. Anschließend werden die Zellen mit dem Virus der vesikularen Stomatitis (VSV) während 24 bis 48 weiteren Stunden infiziert, und die Zelllyse wird gemessen.
Die antivirale Wirkung der unterschiedlichen getesteten IFNα wird durch Vergleich des IC₅₀-Werts bestimmt, welcher derjenigen IFN-Konzentration entspricht, bei welcher die durch VSV induzierte Zelllyse zu 50 % gehemmt wird.
Ein ähnliches Experiment wurde zweimal durchgeführt, und die durchschnittlichen gemessenen IC₅₀-Werte sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Somit weisen die IFNα-21-Proteine mit den Mutationen Q114H/V127D und K179E in einer mit VSV infizierten Zellkultur eine geringere antivirale Wirkung auf als jene des IFNα-2 des Wildtyps.
b) Antivirale Aktivität im Mausmodell in vivo
Dieser Test in vivo wird im EMCV-Mausmodell (Encephalomyocarditis-Virus) durchgeführt.
Humane IFNs zeigen eine dosisabhängige antivirale Wirkung in der Maus, welche im Allgemeinen 100- bis 1.000-fach geringer als jene ist, die durch die gleiche Menge eines Maus-IFN gezeigt wird (Meister et al., J. Gen. Virol. 67: 1633–1644, 1986).
Die intraperitoneale Injektion der Mäuse mit dem Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) gibt Anlass zu einer rasch fortschreitenden tödlichen Krankheit, die durch die Beteiligung des zentralen Nervensystems sowie durch Encephalitis (Finter N. B., Front Biol. 2: 295–360, 1973) gekennzeichnet ist. Es wurde gezeigt, dass Interferon-α sowohl aus der Maus als auch aus dem Menschen wirksam ist beim Schutz der Mäuse gegenüber einer tödlichen EMCV-Infektion (Tovey und Maury, J. IFN Cytokine Res. 19: 145–155, 1999).
Gruppen von 20, sechs Wochen alten, schweizerischen Mäusen wurden intraperitoneal (ip) mit 100 × LD₅₀ EMCV infiziert und eine Stunde später behandelt, und anschließend einmal täglich für 3 anschließende Tage mit 2 μg Zubereitungen von IFNα-21-Proteinen mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E oder mit jener des IFNα-2 des Wildtyps behandelt. Eine Kontrolle wurde mit einer Gruppe mit Tieren durchgeführt, die lediglich mit dem Hilfsstoff behandelt wurden. Den Tieren wurden die Stoffe täglich für 21 Tage verabreicht, bzw. solange sie lebten.
Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt und weisen darauf hin, dass die relative Überlebensrate der Mäuse, welche mit IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D oder K179E behandelt wurden, viel höher als die Überlebensrate der nicht behandelten Mäuse ist, jedoch ähnlich zu jener Rate bleibt, die für die Mäuse beobachtet wurde, welche mit dem IFNα-2 des Wildtyps behandelt wurden.
Alle diese Ergebnisse zeigen, dass das IFNα-21 mit den Mutationen Q114H/V127D bzw. K179E einzigartige biologische Eigenschaften besitzt. Sequenzliste

Claims

Isoliertes Polynukleotid, das folgendes umfaßt: a) eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz aufweist, mit der Maßgabe, daß solch eine Nukleotidsequenz mindestens einen SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c umfaßt; oder b) eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) komplementär ist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz gemäß a), die mindestens einen SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c umfaßt, mindestens zu 90% mit SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz identisch ist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz gemäß a), die mindestens einen SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c umfaßt, mindestens zu 95% mit SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz identisch ist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz gemäß a), die mindestens einen SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c umfaßt, mindestens zu 99% mit SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz identisch ist.
Isoliertes Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfaßt, codiert und mindestens einen Codier-SNP aus der Gruppe Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E aufweist.
Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfaßt, codiert und die beiden Codier-SNPs Q114H und V127D aufweist.
Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfaßt, codiert und den Codier-SNP K179E aufweist.
Verwendung eines isolierten Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer Sequenz dieses isolierten Polynukleotids, die sich aus 10 bis 40 Nukleotiden zusammensetzt, für die Identifikation, Hybridisierung und/oder Amplifikation eines Polynukleotids, das 80 bis 100% Identität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz aufweist, mit der Maßgabe, daß jede dieser Sequenzen mindestens einen der folgenden SNPs umfaßt: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c.
Verwendung eines isolierten Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer Sequenz dieses isolierten Polynukleotids, die sich aus 10 bis 40 Nukleotiden zusammensetzt, für das Genotyping eines Polynukleotids, das 80 bis 100 Identität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrer Codiersequenz aufweist, mit der Maßgabe, daß jede dieser Sequenzen mindestens einen der folgenden SNPs umfaßt: c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c.
Rekombinanter Vektor, der ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.
Wirtszelle, die einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 umfaßt.
Verfahren zur Abtrennung eines Polypeptids, bei dem man eine Wirtszelle nach Anspruch 11 in einem Kulturmedium kultiviert und das Polypeptid von dem Kulturmedium abtrennt.
Isoliertes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von dem isolierten Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert wird.
Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Identität mit a) der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 oder b) der Aminosäure 24 bis 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Aminosäuresequenz gemäß a) oder b) mindestens einen Codier-SNP aus der Gruppe Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E enthält.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Identität der Aminosäuresequenz mit den Sequenzen gemäß a) oder b) 90% beträgt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Identität der Aminosäuresequenz mit den Sequenzen gemäß a) oder b) 95% beträgt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Identität der Aminosäuresequenz mit den Sequenzen gemäß a) oder b) 99% beträgt.
Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuren 24 bis 189 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfaßt und mindestens einen Codier-SNP aus der Gruppe Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 18, das die beiden Codier-SNPs Q114H und V127D aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 18, das den Codier-SNP K179E aufweist.
Antikörper, der für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 20 immunspezifisch ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens unter einer oder mehreren Testverbindungen, das die Aktivität eines isolierten Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfaßt und mindestens einen Codier-SNP aus der Gruppe Q102K, Q114H, V127D, C162stop und K179E aufweist, aktiviert oder hemmt, wobei man bei diesem Verfahren a) Wirtszellen, die den rekombinanten Vektor nach Anspruch 10, der mindestens einen Codier-SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a und a1204g aufweist, umfassen, bereitstellt, b) diese Wirtszellen mit den Testverbindungen in Kontakt bringt, c) die Aktivier- oder Hemmwirkung auf die Aktivität des Polypeptids bestimmt, wodurch das aktivierende oder hemmende Agens identifiziert wird.
Verfahren zum Analysieren der biologischen Eigenschaften eines Probanden, das die Durchführung von mindestens einem der folgenden Schritte umfaßt: a) Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 im Genom eines Probanden; b) Bestimmen des Expressionsniveaus des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem Probanden; c) Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 13 bis 20 in einem Probanden; d) Bestimmen der Konzentration des Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 20 in einem Probanden; oder e) Bestimmen der Funktionsfähigkeit des Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 20 in einem Probanden.
Therapeutikum, das eine oder mehrere Verbindungen aus der folgenden Gruppe umfaßt: isoliertes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7; rekombinanter Vektor nach Anspruch 10; Wirtszelle nach Anspruch 11; isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 20; Antikörper nach Anspruch 21.
Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen aus der Gruppe: isoliertes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7; rekombinanter Vektor nach Anspruch 10; Wirtszelle nach Anspruch 11; isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 20; Antikörper nach Anspruch 21, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Prävention oder Behandlung einer Krankheit aus der Gruppe Karzinome und Tumoren, Infektionskrankheiten, Immun- und Autoimmunkrankheiten, Herz-Kreislauf-Krankheiten, Stoffwechselkrankheiten, Krankheiten des Zentralnervensystems, pathologische Zustände, die mit Chemotherapiebehandlungen einhergehen, Wundheilung, Anämie bei Dialysepatienten und/oder Osteoporose in einem Probanden.
Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Karzinome und Tumoren folgendes umfassen: metastasierende Nierenkarzinome, Melanome, Lymphome, darunter auch Brill-Symmers-Syndrom sowie Haut-T-Zellen-Lymphom, Leukämien, darunter auch Haarzellenleukämie, chronische lymphatische Leukämie und chronische myeloische Leukämie, Leber-, Hals-, Kopf- und Nierenkarzinome, multiple Myelome, Karzinoide und Tumoren, die nach Immundefizienz auftreten, darunter auch Kaposi-Sarkom bei AIDS.
Verfahren zur Bestimmung von statistisch relevanten Zusammenhängen zwischen mindestens einem SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c in dem IFNα-21-Gen und einer Krankheit bzw. Resistenz gegenüber einer Krankheit, das folgendes umfaßt: a) das Genotyping einer Gruppe von Einzelpersonen; b) Bestimmen der Verteilung der Krankheit bzw. Resistenz gegenüber der Krankheit innerhalb der Gruppe von Einzelpersonen; c) Vergleichen der Genotypwerte mit der Verteilung der Krankheit bzw. Resistenz gegenüber der Krankheit; sowie d) Analysieren dieses Vergleichs für statistisch relevante Zusammenhänge.
Verfahren zur Diagnose oder zum Erstellen einer Prognose von einer Krankheit oder einer Resistenz gegenüber einer Krankheit, das den In-vitro-Nachweis von mindestens einem SNP aus der Gruppe c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g und t1265c in dem IFNα-21-Gen umfaßt.