KR20030093292A - ＩＦＮα-21 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및폴리펩티드 - Google Patents

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젠오디세
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Abstract

본 발명은 신규한 SNP를 포함하는 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 신규한 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 하나 이상의 SNP에 의해 유발된 하나 이상의 변이를 함유하는 천연 야생형 IFNα-21 단백질로부터 유래된 신규한 폴리펩티드뿐만 아니라 그들의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

ＩＦＮα-21 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 {New Polynucleotides and Polypeptides of the IFNα-21 Gene}
발명의 분야
본 발명은 신규한 SNP를 함유하는 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 신규한 폴리뉴클레오티드, 및 상기 SNP에 의해 유발된 변이를 함유하는 천연 야생형 IFNα-21 단백질로부터 유래된 신규한 폴리펩티드뿐만 아니라 그들의 치료 용도에 관한 것이다.
관련 분야
이후 IFNα-21로서 언급되는, 인터페론 알파 21 유전자는 하기 간행물에 기재되어 있다:
- Goeddel, D. V., Leung, D. W.; "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs"; Nature 290 (5801), 20-26 (1981).
- Olopade OI., Bohlander SK.; "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics 14 (2), 437-443 (1992).
상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 기탁번호 AC009445로 진뱅크 데이터베이스의 HTG 부분에서 입수할 수 있다.
IFNα-21의 메신저 RNA의 서열은 접속 코드 NM_002175로 NCBI의 데이터베이스에 기재되어 있다.
IFNα-21은 인간 인터페론 알파 (IFNα), 특히 IFNα-2와 밀접한 구조적 및 기능적 상동성을 갖는 유전자이다.
IFNα는 항바이러스성 및 항기생성 반응에 있어서 그들의 세포성 항증식 효과 및 그들의 관련성에 관하여 공지되어 있다.
IFNα는 또한 조혈 간세포의 수준에서 여러 다른 사이토키닌의 발현을 억제할 뿐만 아니라, 임의 종양의 세포성 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다.
IFNα는 또한 신장 암종에 있어서 EGF에 대한 수용체의 발현을 감소시키고, 임의 사립체 유전자의 발현을 억제하고, 섬유모세포, 단핵구 및 B 림프구의 증식을 특히 생체외에서 억제하고, B 림프구에 의한 항체들의 합성을 차단하는 것으로 공지되어 있다.
IFNα는 또한 종양 세포의 표면상에서 종양 특이적 항원의 발현을 유도하고,또한 ISRE (Interferon-Stimulated Response Element; 인터페론-자극 반응 요소)의 특정 전사 인자상에 작용함으로써 ISRE 타입의 프로모터 영역의 조절하에 위치하는 유전자를 유도하는 것으로 알려져 있다.
IFNα는, 예를 들어, 암종, 흑색종, 림프종, 백혈병 및 간, 경부, 두부 및 신장의 암과 같은 상이한 암, 심혈관 질환, 예를 들어, 비만과 같이 면역계와 관련없는 질환과 같은 대사 질환, B형 및 C형 간염 및 AIDS와 같은 감염성 질환, 폐렴, 궤양성 결장염, 중추 신경계 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병, 정신분열병 및 우울증, 조직 또는 기관 이식 거부반응, 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 알레르기, 천식, 다발성 경화증, 골다공증, 건선, 류마티스 관절염, 크론병, 자가면역계 질환 및 장애, 위장 장애 또는 화학요법 처치와 연관된 질환과 같은 상이한 장애 및/또는 인간 질환에 관여하는 것으로 공지되어 있다.
IFNα는 백혈병, 전이된 신장 암종뿐만 아니라 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종과 같은 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양의 치료에 특히 사용된다. IFNα는 또한 기타 형태의 종양 및 어떠한 바이러스성 감염에 대해서도 효과적이다. IFNα는 또한 생식기 사마귀 또는 성병의 치료를 위해 FDA (Food and Drug Administration; 식품의약국)로부터 승인을 받았다.
보다 구체적으로, IFNα-21은 파킨슨병 또는 알쯔하이머병을 앓고 있는 환자들의 뇌에서 동일계내 혼성화에 의해 위치시켰다.
다른 세포들과 비교하여, 미세아교세포는 IFNα-21을 대량으로 발현한다.
알쯔하이머병을 앓고 있는 환자에 있어서, IFNα-21의 존재는 두정엽의 신경세포에서 나타나고, 이는 IFNα-21이 상기 병리학에 관여될 수 있다는 것을 제안한다 [참조예: Kawaguchi N, Yamada T, Yoshiyama Y. No To Shinekei. 1997 Jan.; 49(1):69-73].
그러나, IFNα, 및 특히 IFNα-21은, 제약 조성물에 사용되는 경우, 급성 과민 반응 (두드러기, 기관지수축, 초과민반응 쇼크 등), 심장 부정맥, 저혈압, 간질경련, 갑상샘 기능 관련 문제, 인플루엔자-유사 증후군 (열, 발한, 근육통) 등과 같이, 많은 부작용을 나타낸다.
더욱이, IFNα로 치료받은 환자들은 상기 분자를 중화시키는 항체들을 발생시키고, 그러므로써 그들의 효과를 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 천연 야생형 IFNα-21 단백질과는 상이한 작용성을 보유할 수 있는 IFNα-21 유전자에 대한 신규한 폴리펩티드 및 신규한 폴리뉴클레오티드 유사체를 발견하였다.
이들 신규한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 이전에 언급된 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는데 명백하게 사용될 수 있고 그들에 관련된 단점들 전부 또는 일부를 피할 수 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 첫 번째 목적으로서, 하나 또는 수개의 SNP (Single Nucleotide Polymorphism; 단일 뉴클레오티드 다형성)를 함유하는 점에 있어서, 참조 야생형 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열과는 상이한 신규한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
인간 참조 야생형 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열 1은 2001개의 뉴클레오티드로 구성되고 670번 뉴클레오티드 (개시 코돈)부터 1239번 뉴클레오티드 (종결 코돈)까지의 570개의 뉴클레오티드의 코딩 서열을 함유한다.
본 출원인은 참조 야생형 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 8개의 SNP를 동정하였다. 상기 8개의 SNP는 다음과 같다: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c.
본 발명에 있어서, 상기 정의된 SNP의 위치에 상응하는 번호매김은 뉴클레오티드 서열 1의 번호매김과 관련된 것으로 이해되어진다.
문자 a, t, c 및 g는 각각 질소 염기 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌에 해당한다.
첫 번째 문자는 야생형 뉴클레오티드에 해당하는 반면, 마지막 문자는 변이된 뉴클레오티드에 해당한다.
이와 같이, 예를 들어, SNP c794g는 참조 야생형 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열 1의 794번 위치에서 뉴클레오티드 시토신 (c)을 뉴클레오티드 구아닌 (g)으로의 변이에 해당한다.
상기 SNP는, 참고문헌으로써 본 명세서에서 인용된, "Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applications"로 표제되고 2000년 12월 6일자로 출원된 출원인의 특허 출원 FR 제00 22894호에 기재된 결정 방법을 이용하여 본 출원인에 의해서 확인되었다.
상기 특허 출원에 기재된 방법은 무작위 개체군으로부터 하나 이상의 개체에 있어서 하나 (또는 수 개)의 이전에 존재하던 SNP(s)의 동정을 가능하게 한다.
본 발명의 범위내에서, 예를 들어, 코딩 서열을 함유하는 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열의 단편을 무작위로 선택된 개체군에서 상이한 개체들로부터 단리하였다.
상기 단편들의 서열분석은 DHPLC ("Denaturing-High Performance Liquid Chromatography (변성 고성능 액체 크로마토그래피)")에 의한 분석 후에 헤테로듀플렉스 프로필 (이는 참조 야생형 IFNα-21 유전자 서열의 것과는 상이한 프로필이다)을 갖는 임의 상기 샘플들에 대해서 이어서 수행되었다.
상기 방법으로 서열분석된 단편을 이어서 참조 야생형 IFNα-21 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열과 비교하고 본 발명에 따른 SNP를 동정하였다.
이와 같이, SNP는 천연적이며 그들 각각은 세계 인구 중 임의 개체들에 존재한다.
참조 야생형 IFNα-21 유전자는 아미노산 서열 2에 해당하는 189개 아미노산의 미성숙 단백질을 코딩하며, 이는 처음 23개의 아미노산을 포함하는 시그널 펩티드의 절단에 의해서 166개 아미노산의 성숙 단백질로 전환될 것이다.
본 발명의 각 코딩 SNP, 즉: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g는 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열의 수준으로 변형을 유발한다.
아미노산 서열에 있어서 상기 변형들은 하기와 같다:
SNP c794g는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 42번 위치 및 성숙 단백질의 19번 위치에서 아미노산 알라닌 (A)의 글리신 (G)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 A19G 또는 A42G로 부를 것이다.
SNP c973a는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 102번 위치 및 성숙 단백질의 79번 위치에서 아미노산 글루타민 (Q)의 리신 (K)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 Q79K 또는 Q102K로 부를 것이다.
SNP g1011c는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 114번 위치 및 성숙 단백질의 91번 위치에서 아미노산 글루타민 (Q)의 히스티딘 (H)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 Q91H 또는 Q114H로 부를 것이다.
SNP t1049a는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 127번 위치 및 성숙 단백질의 104번 위치에서 아미노산 발린 (V)의 아스파르트산 (D)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 V104D 또는 V127D로 부를 것이다.
SNP t1155a는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 162번 위치 및 성숙 단백질의 139번 위치에서 아미노산 시스테인 (C)의 종결코돈 (stop)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 C139stop 또는 C162stop로 부를 것이다.
SNP a1204g는 아미노산 서열 2에 해당하는 IFNα-21 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 179번 위치 및 성숙 단백질의 156번 위치에서 아미노산 리신 (K)의 글루탐산 (E)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해서 코딩되는 변이를 K156E 또는 K179E로 부를 것이다.
SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g는 야생형 참조 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 공간적 구조의 변형을 유발한다.
상기 변형들은 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법에 따라서, 예를 들어, 신규한 모델링 기술 (예를 들어, SEQFOLD/MSI), 상동성 (예를 들어, MODELER/MSI), 역장의 최소화 (예를 들어, DISCOVER, DELPHI/MSI) 및/또는 분자 역학 (예를 들어, CFF/MSI)을 이용하는 컴퓨터 분자 모델링에 의해서 관찰될 수 있다.
상기 모델들의 예는 이후 실험부에 기재되어 있다.
컴퓨터 분자 모델링은 성숙한 변이 단백질상의 변이 Q79K가 도 1A 및 1B에 나타낸 바와 같이 수소 결합 방해로 인해 야생형 IFNα-21 단백질에 있어서 헬릭스C N-말단의 치환을 포함한다는 것을 보여준다.
사실상, 야생형 IFNα-21 단백질의 Q79 잔기의 측쇄, E83 잔기의 산성기 및 헬릭스 C의 산소원자 사이의 수소 결합은 Q79K 변이된 IFNα-21 단백질에 있어서 사라진다.
이와 같이, Q79K 변이된 단백질은 그의 구조 및 기능에 있어서 상당한 변화를 가지며 천연 야생형 IFNα-21 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 성숙한 변이 단백질상의 변이 Q91H가 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 변이 위치에서 헬릭스 C의 치환을 포함한다는 것을 보여준다. 여러 개의 수소 결합 및 염 가교가 특히 H91과 D76 아미노산 측쇄 사이에서 나타나고, 이는 헬릭스를 보다 견고하게 만든다.
이와 같이, Q91H 변이 단백질은 그의 구조 및 기능에 있어서 상당한 변화를 가지며 천연 야생형 IFNα-21 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 성숙한 변이 단백질상의 변이 V104D가 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이 변이 위치에서 헬릭스 C 및 D 사이의 고리 구조에 변형을 포함한다는 것을 보여준다. 변이된 구조에서 여러 개의 수소 결합 (한편으로는 Q102와 G105 사이, 및 다른 한편으로는 E107과 T109 사이)이 나타나고 이는 헬릭스 C 및 D 사이의 고리를 더욱 견고하게 만든다. 게다가, 헬릭스 B N-말단의 경미한 치환이 또한 관찰된다.
상기 공간적 변형들은 그의 수용체에 결합하는 IFNα-21에 포함된 잔기들에 영향을 준다.
이와 같이, V104D 변이 단백질은 그의 구조 및 기능에 있어서 상당한 변화를 가지며 천연 야생형 IFNα-21 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 성숙한 변이 단백질상의 변이 C139stop가 도 4에 나타낸 바와 같이 야생형 IFNα-21 단백질에서 헬릭스 E에 정상적으로 포함된 폴리펩티드 단편의 소실로 인해 단백질 해독에 있어서 미성숙 정지를 유발한다는 것을 보여준다.
헬릭스 E는 그의 수용체에 결합하는 IFNα-21에게 중요하다. 헬릭스 E의 부재는 변이 단백질의 잘못된 폴딩을 유발시켜 단백질의 소수성 중심이 친수성 외부 매질과 접촉하게 되는 단백질의 삼차원 입체형태에 있어서의 변형을 나타낸다. 그러므로, 변이 단백질은 그의 소수성 중심이 친수성 외부 매질과 접촉되는 것을 피하기 위해 친수성 잔기들로 둘러싸이도록 그의 삼차원 입체형태를 변형시켜야 한다.
그러므로, C139stop 변이 단백질은 그의 구조 및 기능에 있어서 상당한 변화를 가지며 천연 야생형 IFNα-21 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 모델링은 성숙한 변이 단백질상의 변이 K156E가 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이 헬릭스 E C-말단의 펼쳐짐 및 C-말단 고리 모양의 변형을 포함한다는 것을 보여준다.
상기 변이는 수소 결합 조직망을 증가시키고 E156 및 R161 잔기 사이에 염 가교를 생성시킨다. 상기 변형은 당 영역에서 IFNα-21 단백질 구조를 보다 견고하게 만든다. 본 단백질에서 상기 영역은 그의 항바이러스 활성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, K156E 변이된 IFNα-21 단백질의 항바이러스 활성이 극적으로 방해되고 156번 위치의 글루탐산이 성숙 IFNα-21의 구조 및 기능에 있어서 변형을 유발한다는 것을 예측하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 다른 SNP, 즉: t1265c, t1277c는 아미노산 서열 2의 단계에서 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 변형에 관여하지 않는다. SNP: t1265c, t1277c는 코딩되지 않는다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 유전자형 결정은 개체군에 있어서 상기 뉴클레오티드의 대립형질 빈도를 결정하기 위한 방식으로 수행될 수 있다. 유전자형 결정의 예는 이후 실험부에 기재된다.
본 발명의 폴리펩티드의 작용성 측정은 그들의 생물학적 활성의 시험에 의해서 동등하게 수행될 수 있다.
이에 관련하여, 천연 야생형 IFNα-21 단백질과 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 다우디 세포주에 대한 항-증식성 효과를 측정하는 것이 가능하다 [Pielher et al. J. Biol. Chem.; Vol. 275, Issue 51, 40425-40433, December 22, 2000; "New structural and Functional Aspects of the type I Interferon-Receptor interaction revealed by comprehensible mutational analysis of the binding interface"].
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도뿐만 아니라, 명백하게 임의의 인간 장애 및/또는 질환의 예방 및 치료를 위한, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드로부터 출발하여 수득되고/되거나 동정된 치료학적분자의 용도를 목적으로 한다.
관련 출원:
본 발명은 << Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la sequence nucleique du gene IFNalpha21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques>>로 표제된 2001년 3월 30일자로 출원된 프랑스 특허 출원 제0104404호에 대한 우선권을 주장한다.
도 1A 및 1B는 SNP c973a (Q79K)를 함유하는 본 발명에 따라 코딩된 단백질 및 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 모델을 나타낸다. 도 1B는 도 1A에 나타낸 각 단백질의 내부 부분의 모델을 확대한 것을 나타낸다.
도 1A 및 1B에서, 흑색 리본은 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 Q79K 변이된 IFNα-21 단백질의 구조를 나타낸다.
도 2A 및 2B는 SNP g1011c (Q91H)를 함유하는 본 발명에 따라 코딩된 단백질 및 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 모델을 나타낸다. 도 2B는 도 2A에 나타낸 각 단백질의 왼쪽 부분의 모델을 확대한 것을 나타낸다.
도 2A 및 2B에서, 흑색 리본은 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 Q91H 변이된 IFNα-21 단백질의 구조를 나타낸다.
도 3A 및 3B는 SNP t1049a (V104D)를 함유하는 본 발명에 따라 코딩된 단백질 및 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 모델을 나타낸다. 도 3B는 도 3A에 나타낸 각 단백질의 상부 부분의 모델을 확대한 것을 나타낸다.
도 3A 및 3B에서, 흑색 리본은 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 V104D 변이된 IFNα-21 단백질의 구조를 나타낸다.
도 4는 SNP t1155a (C139stop) (도 4B)를 함유하는 본 발명에 따라 코딩된 단백질 및 천연 야생형 IFNα-21 단백질 (도 4A)의 모델을 나타낸다. 도 4C는 도 4A 및 도 4B의 두 단백질의 겹침을 나타낸다. 도 4에 있어서, 흑색 리본은 천연야생형 IFNα-21 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 C139stop 변이된 IFNα-21 단백질의 구조를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 SNP a1204g (K156E)를 함유하는 본 발명에 따라 코딩된 단백질 및 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 모델을 나타낸다.
도 5B는 도 5A에 나타낸 각 단백질의 윗부분의 모델을 확대한 것을 나타낸다. 도 5에 있어서, 흑색 리본은 천연 야생형 IFNα-21 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 K156E 변이된 IFNα-21 단백질의 구조를 나타낸다.
도 6은 VSV 바이러스로 미리 감염시키고 A42G, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21 단백질로 처치된 마우스의 생존율을 야생형 IFNα-2로 처치된 것 또는 처치되지 않은 것과 비교하여 나타낸다.
상기 도면에서, 세로축은 생존시간(일)에 해당하고 가로축은 VSV 감염된 마우스의 상대적인 생존율에 해당한다. 흑색 세모, 십자, 흑색 다이아몬드는 A42G 변이된 IFNα-21, Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 및 K179E 변이된 IFNα-21로 각각 처치된 VSV 감염된 마우스에 대한 데이터를 각각 나타낸다. 흑색 네모는 야생형 IFNα-21로 처치된 VSV 감염된 마우스에 대한 데이터를 나타내고, 빈 세모는 처치되지 않은 VSV 감염된 마우스에 대한 데이터를 나타낸다.
정의
"참조 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열"은 인간 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열 1로서 해석된다.
상기 서열은 기탁번호 AC009445로 진뱅크에 접속가능하고 IFNα-21 메신저 RNA의 서열은 접속 코드 NM_002175로 NCBI의 데이터베이스에 기재되어 있다. 게다가, 인간 IFNα-21 유전자는 문헌 [Goeddel, D.V., Leung, D.W. "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs"; Nature 290 (5801), 20-26 (1981)] 및 문헌 [Olopade OI., Bohlander SK. "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics 14(2), 437-443 (1992)]에 기재되어 있다.
"천연 야생형 IFNα-21 단백질"은 참조 야생형 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 성숙 단백질로서 해석된다. 천연 야생형 미성숙 단백질 IFNα-21은 서열 2에 나타낸 펩티드 서열에 해당한다.
"폴리뉴클레오티드"는 변형 또는 비-변형된 DNA 또는 RNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로서 해석된다.
용어 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어, 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 하나 또는 여러 개의 일본쇄 영역(들) 및 하나 또는 여러 개의 이본쇄 영역(들)의 혼합물로 구성된 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 및 하나 또는 여러 개의 일본쇄 영역(들) 및 하나 또는 여러 개의 이본쇄 영역(들)의 혼합물로 구성된 RNA가 포함된다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 또는 수 개의 삼본쇄 영역(들)을 포함하는 RNA 및/또는 DNA를 포함할 수 있다. 안정성을 이유로 또는 다른 이유로 골격을 변형시키는 방식으로 하나 또는 여러 개의 변형된 염기를 함유하는 DNA 및 RNA를 폴리뉴클레오티드로 동등하게 해석한다. 예를 들어, 이노신과 같은 비정상적인 염기도 변형된 염기로 해석된다.
"폴리펩티드"는 펩티드, 올리고펩티드, 올리고머 또는, 예를 들어, 등입체성 펩티드의 경우에서와 같이, 정상 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 단백질로 해석된다.
폴리펩티드는 유전자 코드로 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는, 당업자에게 잘 알려져 있는, 해독 후 성숙 공정과 같은 천연 공정들에 의해서 또는 화학적 공정들에 의해서 변형된 아미노산으로 동등하게 구성될 수 있다. 상기 변형들은 문헌에 전부 상세하게 기술되어 있다. 상기 변형들은 폴리펩티드의 어느 곳에서나: 펩티드 골격에서, 아미노산 쇄에서 또는 카르복시- 또는 아미노-말단에서 조차도 나타날 수 있다.
폴리펩티드는 우비퀴틴화에 따라서 측쇄화될 수 있고 또는 측쇄화되거나 또는 측쇄화되지 않고 고리화될 수 있다. 상기 타입의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 천연 또는 합성의 해독 후 공정들의 결과일 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드 변형들로는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 고정, 헴의 공유 고정, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유 고정, 공유 또는 비공유의 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 공정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 세넬로일화, 황화, 아르기닐화 또는 우비퀴틴화와 같은아미노산 첨가가 포함되는 것을 해석된다. 상기 변형들은 문헌 [PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ndEd., T. E. Creighton, New York, 1993], 문헌 [POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983], 문헌 [Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646] 및 문헌 [Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62]에 전부 상세하게 기술되어 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 인간 신체로부터 단리되거나 또는 이와는 달리 기술적 방법에 의해 생산된 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서 각각 해석된다.
"상동성"은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 상동성의 척도로서 해석된다.
상동성은 당업자에게 이미 공지된 용어이고 문헌에 잘 기재되어 있다. 문헌 [COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998]; 문헌 [BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌 [COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994]; 및 문헌 [SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje,G., Academic Press, 1987]을 참조한다.
두 서열 사이의 상동성 및 유사성을 측정하기 위해 통상적으로 이용되는 방법들은 문헌에 잘 기재되어 있다. 문헌 [GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994] 및 문헌 [Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073]을 참조한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열 1과 95% 이상의 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열과 비교하여 100개의 뉴클레오티드에 대해 많아야 5군데의 변이를 함유하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 변이점은 하나 (또는 수 개)의 뉴클레오티드(들) 중 하나 (또는 수 개의) 치환(들), 첨가(들) 및/또는 결실(들)일 수 있다.
동일한 방법으로, 예를 들어, 아미노산 서열 2와 95% 이상의 상동성을 보유하는 폴리펩티드는, 상기 서열과 비교하여 100개의 아미노산에 대해 많아야 5군데의 변이를 함유하는 폴리펩티드이다.
상기 변이점은 하나 (또는 수 개)의 아미노산(들) 중 하나 (또는 수 개의) 치환(들), 첨가(들) 및/또는 결실(들)일 수 있다.
뉴클레오티드 서열 1 또는 아미노산 서열 2 각각과 전체적으로 동일하지는 않은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 상기 서열이 본 발명의 SNP 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되어지고, 상기 서열들의 변형체로서 간주된다.
통상적으로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 SNP 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오티드 서열 1과 동일 또는 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 보유한다.
유사한 방식으로, 통상적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명의 코딩 SNP 중 하나 이상을 함유하는 아미노산 서열 2와 동일 또는 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 보유한다.
변형체는, 본 발명에 따르면, 예를 들어, 위치-지정된 돌연변이 또는 직접적인 합성에 의해서 수득될 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 있어서 염기의 임의 자연적인 변화를 "SNP"로 이해한다. 뉴클레오티드 서열상에서, SNP는 코딩되거나 잠재성이거나 또는 비-코딩될 수 있다.
코딩 SNP는 본 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 있어서 아미노산의 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 포함된 다형성이다. 상기 경우에 있어서, 용어 SNP는, 연장에 의한, 아미노산 서열에 있어서의 변이에도 적용된다.
잠재성 SNP는 본 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 있어서 아미노산의 변형을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 포함된 다형성이다.
비-코딩 SNP는 뉴클레오티드 서열의 비-코딩 서열에 포함된 다형성이다. 상기 다형성은 인트론, 스플라이싱 영역, 전사 프로모터 또는 사이트 인헨서 서열에서 현저하게 발견될 수 있다.
"작용성 SNP"는 작용성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 포함되는, 상기 정의된 바와 같은 SNP로 해석된다.
"작용성"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 활성으로 이해된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 작용성은 야생형 참조 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 생물학적 활성의 보존, 증가, 감소 또는 억제를 구성할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 작용성은 참조 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 생물학적 활성의 특성에 있어서의 변화를 동등하게 구성할 수 있다.
생물학적 활성은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 수용체의 친화성 또는 친화성의 부재와 현저하게 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 하기로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 첫 번째 목적으로 한다:
a) 다음의 코딩 SNP, 즉 c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 서열 1 또는 그의 코딩 서열 (670번 뉴클레오티드 내지 1239번 뉴클레오티드)와 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성 및 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 보유하는 뉴클레오티드 서열, 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
본 발명의 측면에서, 번호매김은 뉴클레오티드 서열 1에 있어서 SNP의 위치에 해당하는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 하기를 함유하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다:
a) 하기 코딩 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 1 또는 그의 코딩 서열로 구성되고, 상기 서열 각각은 하기 코딩 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따라서, 상기 정의된 폴리뉴클레오티드는 c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a 및 a1204g로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 코딩 SNP을 함유한다.
상기 정의된 바와 같이 폴리뉴클레오티드는 또한 하기 비-코딩 SNP: t1265c, t1277c 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 동등하게 하기를 함유하거나 또는 하기로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 그의 목적으로 한다:
a) 하기 비-코딩 SNP: t1265c, t1277c를 하나 이상 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
본 발명은 또한 하기의 일부로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다:
a) 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열,
상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된다.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 단리된 폴리뉴클레오티드는 10 내지 40개의 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명은 또한 a) 아미노산 서열 2, 또는 b) 아미노산의 서열 2에 있어서 24번 및 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 그의 목적으로 하며,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 하기 코딩 SNP: A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면에서, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E의 위치에 해당하는 번호매김은 아미노산 서열 2의 번호매김에 관련된 것으로 이해된다.
본 발명의 바람직한 목적에 따르면, 상기 정의된 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이 단일 코딩 SNP를 함유한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자로 구성된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 표준 DNA 또는 RNA 합성 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1상의 각 SNP에 대해서 변이된 뉴클레오티드에 의해 야생형 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 출발하는 위치-지정 돌연변이에 의해서 똑같이 수득될 수 있다.
예를 들어, SNP c794g를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1상의 794번 위치에서 뉴클레오티드 시토신 (c)을 뉴클레오티드 구아닌 (g)으로 변형시킴으로써 IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 출발하는 위치-지정 돌연변이에 의해서 수득될 수 있다.
상기 방법으로 수행될 수 있는 위치-지정 돌연변이의 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 문헌 [TA Kunkel in 1985 in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:488]이 명백하게 언급될 수 있다.
단리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 프리-, 프로- 또는 프리-프로-단백질 아미노산 서열 또는, 헥사-히스티딘 펩티드와 같이, 마커 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 다른 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열와 연관되어 융합 단백질 또는 다른 정제 생산물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, 전사된 또는 비-전사된 서열, 해독된 또는 비-해독된 서열, 스플라이싱 시그널 서열, 폴리아데닐화 서열, 리보좀 결합 서열 또는 심지어 mRNA를 안정화시키는 서열과 같이, 5' 및/또는 3' 비-코딩 서열과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은, 엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 것으로 정의된다.
"엄격한 혼성화 조건"은 뉴클레오티드 서열이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 보유하는 경우 혼성화를 가능하게 하는 화학적 조건으로서 일반적이지만 필수적이지는 않게 이해된다.
엄격한 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법들에 따라서 및, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5×SSC (150 mM의 NaCl, 15 mM의 시트르산삼나트륨), 50 mM의 인산나트륨 (pH=7.6), 5×덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 ㎍ 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에, 42℃에서, 폴리뉴클레오티드를 항온배양한 다음 65℃에서 0.1×SSC로 필터를 세척함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 영역내에서, 엄격한 혼성화 조건이 100%와 같은 상동성을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 가능하게 하는 경우, 뉴클레오티드 서열은 a)에 기재된 바와 같이 뉴클레오티드 서열과 엄격하게 상보적인 것으로 간주된다.
뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 따른 항-센스 SNP를 하나 이상 함유하는 것으로 본 발명의 취지내에서 이해되어진다.
그러므로, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열이 SNP c794g를 함유한다면, 그의상보적인 뉴클레오티드 서열은 794번 위치와 동등한 위치에서 시토신 (c) 뉴클레오티드를 함유한다.
SNP를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 동정, 혼성화 및/또는 증폭
본 발명은 뉴클레오티드 서열 1 또는 필요하다면 그의 (670번 뉴클레오티드 내지 1239번 뉴클레오티드의) 코딩 서열과 80 내지 100%의 상동성 (바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성 및 특히 100%의 상동성)을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 동정, 혼성화 및/또는 증폭시키기 위한 하기 전부 또는 일부의 용도를 그의 목적으로 한다:
a) 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100%의 상동성 (바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성 및 특히 100%의 상동성)을 보유하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는
b) 하나 이상의 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드,
상기 서열 각각은 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되어진다.
유전자형 결정 및 SNP의 빈도 결정
본 발명은 뉴클레오티드 서열 1 또는 필요하다면 그의 (670번 뉴클레오티드 내지 1239번 뉴클레오티드의) 코딩 서열과 80 내지 100%의 상동성 (바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성 및 특히 100%의 상동성)을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부의 유전자형 결정을 위한 하기 전부 또는 일부의 용도를 그의 목적으로 한다:
a) 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100%의 상동성 (바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성 및 특히 100%의 상동성)을 보유하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는
b) 하나 이상의 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드,
상기 서열 각각은 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되어진다.
본 발명에 따르면, 유전자형 결정은 개체별로 또는 개체군에 대해 수행될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, 유전자형 결정은 개체 또는 개체군의 유전자형의 결정 방법으로서 정의된다. 유전자형은 하나 이상의 특정 위치에 존재하는 대립형질 인자로 구성된다.
"개체군"은 무작위 또는 비-무작위 방식으로 선택된 개체들의 군으로서 해석된다. 상기 개체들은 인간, 동물, 미생물 또는 식물일 수 있다.
통상적으로, 개체군은 10명 이상의 사람, 바람직하게는 100 내지 300명의 사람을 포함한다.
상기 개체들은 그들의 민족성에 따라서 또는 그들의 표현형에 따라서 선택될 수 있고, 명백하게는 하기 장애 및/또는 질환을 앓고 있는 개체들이다: 암종, 흑색종, 림프종, 백혈병 및 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 심혈관 질환, 예를 들어, 비만과 같이 면역계와 관련없는 질환과 같은 대사 질환, B형 및 C형 간염 및 AIDS와 같은 감염성 질환, 특히 바이러스성 감염, 폐렴, 궤양성 결장염, 중추 신경계 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병, 정신분열병 및 우울증, 조직 또는 기관 이식 거부반응, 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 알레르기, 천식, 다발성 경화증, 골다공증, 건선, 류마티스 관절염, 크론병, 자가면역계 질환 및 장애, 위장 장애 또는 화학요법 처치와 연관된 질환.
본 발명에 따른 작용성 SNP는 바람직하게 개체군에서 유전자형이 결정된다.
SNP를 유전자형 결정하기 위해서 수행될 수 있는 다수의 기술들이 존재한다 [참조: Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"]. 상기 기술들은 하기 4개의 원칙들 중 하나에 기초하고 있다: 대립형질인자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 선택적으로 디데옥시뉴클레오티드에 의한 올리고뉴클레오티드 신장, 대립형질인자 특이적 올리고뉴클레오티드의 결찰 또는 대립형질인자 특이적 올리고뉴클레오티드의 절단. 상기 방법들 중 각각은 직접 또는 편광된 형광성의 측정 또는 질량 분광법과 같은 검출 시스템과 연결될 수 있다.
유전자형 결정은 편광된 형광 스캐너와 연결된, 핫 ddNTP (상이한 형광체로 표지된 2개의 상이한 ddNTP) 및 콜드 ddNTP (표지되지 않은 2개의 상이한 ddNTP)로 미니서열분석에 의해서 명백하게 수행될 수 있다. 편광된 형광성을 판독하는 미니서열분석 프로토콜 (FP-TDI Technology or Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation)은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
이는 각 개체의 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭 후 수득된 생산물에 대해서 수행될 수 있다. 상기 PCR 생산물은 연구된 SNP를 함유하는 폴리뉴클레오티드 유전인자 영역을 포함하기 위해 선택된다. PCR 써모사이클러에서 최종 단계 후, 플레이트를 이어서 형광체 특이적 여기 및 방출 필터를 사용하여 표지된 염기들을 판독하기 위한 편광된 형광성 스캐너상에 위치시킨다. 표지된 염기의 강도 수치는 그래프상에 기록된다.
PCR 증폭을 위해서, 본 발명의 SNP의 경우에, 센스 및 안티센스 프라이머는 각각 본 발명의 SNP의 위치에 따라서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
예를 들어, PCR 증폭 프라이머를 위한 센스 및 안티센스 뉴클레오티드 서열은 각각 하기일 수 있다:
서열 3: 센스 프라이머: GGTTCAAGGTTACCCATCTC
서열 4: 안티센스 프라이머: TTTGAAATGGCAGAAGTCAT
상기 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 1에 있어서, 620번 뉴클레오티드부터 1315번 뉴클레오티드까지의 696개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단편의 증폭을 가능하게 한다.
개체군에서 SNP를 함유하는 유전자에 의해 코딩되는 각 대립형질의 빈도 (대립형질 빈도)의 통계적 분석이 이어서 수행되고, 이는 상이한 하부군들 및 명백하게, 필요하다면, 상기 개체군을 구성하는 다양한 인종군에 있어서 그들의 영향 및 그들의 분포의 중요성의 결정을 가능하게 한다.
유전자형 결정 데이터는 연구된 개체군에서 관찰된 상이한 대립형질의 분포 빈도를 측정하기 위해서 분석된다. 대립형질 빈도의 계산은 SAS-suite (등록상표) (SAS) 또는 SPLUS (등록상표)(MathSoft)와 같은 소프트웨어의 도움으로 수행될 수있다. 개체군의 상이한 인종군을 교차하는 본 발명의 SNP의 대립형질 분포의 비교는 소프트웨어 ARLEQUIN (등록상표) 및 SAS-suite (등록상표)에 의해서 수행될 수 있다.
유전자 마커로서 본 발명의 SNP
유전자 (예컨대, 프로모터, 스플라이싱 부위, 코딩 영역)의 기능적 서열을 변형시키는 SNP는 질환 감수성 또는 내성에 직접적으로 관련되기 쉬운 반면, 모든 SNP (기능적이든 아니든)는 상기 질환 상태에 관련된 하나 또는 수 개의 유전자의 동정을 위한 중요한 마커를 제공할 수 있고, 결과적으로 상기 질환 상태에 간접적으로 관련될 수 있다 [참조: Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22: 231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1: 39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899].
그러므로, 본 발명은 또한 IFNα-21 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상을 함유하는 데이터뱅크에 관한 것이다.
상기 SNP는 뉴클레오티드 서열 1에 따라서 번호매김된 것으로 해석된다.
상기 데이터뱅크는 하기 (i)과 (ii) 사이의 상대적인 관계를 통계적으로 결정하기 위해 분석될 수 있다:
(i) IFNα-21 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상, 및
(ii) 질환 또는 당해 질환에 대한 내성.
본 발명은 또한 질환 또는 당해 질환에 대한 내성에 대한 진단/예측 키트를 개발하기 위한, IFNα-21 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나 이상의 용도에 관한 것이다.
상기 정의된 바와 같이 본 발명의 SNP는 질환 또는 당해 질환에 대한 내성에 직접 또는 간접적으로 연관될 수 있다.
바람직하게는, 상기 질환들은 위에서 언급된 바와 같이 정의된 것들일 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 백터를 그의 목적으로 한다.
염색체에 국한하지 않고 에피솜 및 유도된 바이러스를 포함한, 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 특히, 사용된 재조합 벡터는 박테리아성 플라스미드, 트랜스포손, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종 바이러스, 백신 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.
상기 재조합 벡터들은 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrooket al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]에 기재된 바와 같이, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 의해서 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 발현의 조절을 제어하는 뉴클레오티드 서열뿐 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 및 전사 및 본 발명의 폴리펩티드의 해독을 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열은 사용된 숙주 세포에 따라서 선택될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 적합한 분비 시그널이 재조합 벡터에 통합될 수 있으므로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 세포질 망상의 내강으로, 원형질막 주위 공간으로, 세포막상에 또는 세포외 환경으로 지시될 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 목적으로 한다.
숙주 세포에 재조합 벡터의 도입은 인산칼슘에 의한 형질감염, DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사법에 의한 형질감염, 양이온성 지질에 의한 형질감염, 전기천공법, 형질도입 또는 감염과 같이, 문헌 [BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Daviset al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995] 및 문헌 [MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 상동]에 기재된 바와 같은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 따라서 수행될 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들어, 스트렙토코커스 (streptococci), 스타필로코커스 (staphylococci), 대장균 (E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)과 같은 박테리아 세포, 효모 세포 및 아스페르길루스 (Aspergillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces)의 세포와 같은 진균류의 세포, 초파리 S2 및 스포도프테라 Sf9의 세포와 같은 곤충 세포, CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 세포 및 치료할 대상체의 인간 세포와 같은 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들어, 이후 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해서 또는 제약 조성물에서의 활성 생산물로서 사용될 수 있다.
폴리펩티드
본 발명은 또한 하기와 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성 및 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 함유하는 단리된 폴리펩티드를 목적으로 한다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 24번 위치와 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 하기 코딩 SNP: A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 하기를 함유할 수 있다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 24번 위치와 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 하기 코딩 SNP: A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
본 발명의 폴리펩티드는 보다 특히 하기로 구성될 수 있다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 24번 위치와 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 하기 코딩 SNP: A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 코딩 SNP를 함유한다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고 상기 폴리펩티드를 상기 배양 배지로부터 단리하는, 상기-기재된 폴리펩티드의 제조 방법을 그의 목적으로 한다.
폴리펩티드는 염, 특히 황산암모늄, 에탄올, 아세톤 또는 삼염화아세트산과 같은 카오트로픽 제제에 의한 침전법, 산 추출법; 이온교환 크로마토그래피; 포스포셀룰로스 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피; 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 배제 크로마토그래피와 같은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 따라서, 숙주 세포의 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
"배양 배지"는 본 발명의 폴리펩티드가 단리 또는 정제되는 배지로서 이해되어진다. 상기 배지는 세포외 배지 및/또는 세포성 용해질로 구성될 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들은, 상기 폴리펩티드의 입체형태가 단리 또는 정제중에 변경되면, 나중에 상기 폴리펩티드에 활성 구조를 되돌려줄 수 있게 한다.
항체
본 발명은 또한 면역특이적 항체를 수득하는 방법을 그의 목적으로 한다.
"항체"는, Fab 또는 면역글로불린 발현 라이브러리 산물을 포함한, 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단순 쇄, 인간화된 항체뿐만 아니라 Fab 단편들로서 이해된다.
면역특이적 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역화시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 면역특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드, 그의 단편들 중 하나, 유사체, 그의 변형체 중 하나 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포가 또한 면역특이적 항체들을 생성하는데 사용될 수 있다.
용어 "면역특이적"은 항체가 선행 기술에서 공지된 다른 폴리펩티드보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해 더 우수한 친화성을 보유한다는 것을 의미한다.
면역특이적 항체들은, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 따라, 본 발명의 폴리펩티드, 그의 단편들, 유사체 또는 에피토프 단편 중 하나 또는 포유류, 바람직하게는 인간이 아닌 포유류에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포의 투여에 의해서 수득될 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해서, 세포주로부터 출발하는, 하이브리도마방법 [Kohleret al., Nature (1975) 256: 495-497], 트리오마 방법, 인간 B 세포 하이브리도마 방법 [Kozboret al., Immunology Today (1983) 4:72] 및 EBV 하이브리도마 방법 [Coleet al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series) (eds. R.A.Reisfeld and S.Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 185, pp. 77-96]과 같은, 항체 생성을 위한 대표적인 방법들이 사용될 수 있다.
예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 바와 같은 일본쇄 항체 생성의 방법도 사용될 수 있다.
예를 들어, 마우스와 같은 트랜스제닉 동물도 인간화된 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 상호작용하는 제제
본 발명은 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 활성화하는 또는 억제하는 제제의 동정 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터의 제조,
b) a)에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포의 제조,
c) b)에 따른 숙주 세포와 시험될 제제의 접촉, 및
d) 시험된 제제에 의해 생성된 활성 또는 억제 효과의 측정.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 그와 상호작용하는 화합물을 선별하는 방법에 이용될 수 있다.
상기 화합물들은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 고유 활성의 활성화 제제 (작용제) 또는 억제 제제 (길항제)일 수 있다. 상기 화합물은 본 발명의 폴리펩티드의 리간드 또는 기질일 수 있다. 문헌 [Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991)]을 참조한다.
일반적으로, 상기 방법을 수행하기 위해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 적합한 숙주 세포를 제조하는 것이 우선 바람직하다. 그러한 세포들은, 예를 들어, 포유류, 효모, 초파리와 같은 곤충 또는 대장균과 같은 박테리아의 세포일 수 있다.
상기 세포들 또는 상기 세포들의 막 추출물을 이어서 시험되는 화합물의 존재하에 위치시킨다.
시험되는 화합물과 본 발명의 폴리펩티드와의 결합능뿐만 아니라 작용 반응의 억제 또는 활성화를 이어서 관찰할 수 있다.
상기 방법 중 단계 d)는 직접 또는 간접적으로 표지된 시험될 제제를 이용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 표지 또는 비-표지된 제제 및 표지된 경쟁 제제의 사용에 의한 경쟁 시험을 포함할 수 있다.
검출될 시그널에 따라 적절하게 선택된 검출 수단들을 이용함으로써 시험되는 제제가 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포상에서 활성 또는 억제 시그널을 생성하는지를 또한 결정할 수 있다.
이와 같은 활성 또는 억제 제제들은 폴리뉴클레오티드, 및 어떠한 경우에는,올리고뉴클레오티드 또는, 예를 들어, 단백질 또는 항체와 같은 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 의해 활성화 또는 억제되는 제제의 동정 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 제조,
b) a)에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포의 제조,
c) b)에 따른 숙주 세포를 시험되는 제제의 존재하에 위치시키고,
d) 시험되는 제제에 대한 폴리펩티드에 의해 생성되는 활성화 또는 억제 효과의 측정.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 활성화 또는 억제되는 제제는 상기 폴리펩티드의 존재하에서 활성화 또는 억제에 의해 각각 반응하는 제제이다. 본 발명의 폴리펩티드에 의해 직접 또는 간접적으로 활성화 또는 억제되는 제제들은, 예를 들어, 세포막 또는 핵 수용체와 같은 폴리펩티드, 키나제 및 보다 바람직하게는 티로신 키나제, 전사 인자 또는 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
질환의 검출
본 발명은 하나 이상의 하기 단계를 포함하는, 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생물학적 특성을 분석하는 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 대상체의 게놈내에 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를측정;
b) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정;
c) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정;
d) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 농도를 측정; 및/또는
e) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 작용성을 측정.
상기 생물학적 특성은 대상체에게서 또는 대상체로부터의 샘플에서 분석될 수 있다.
상기 생물학적 특성은 유전학적 진단을 수행하고, 대상체가 질환을 앓고 있는지 또는 앓을 위험성이 있는지, 또는 반대로, 질환의 발생에 대해 부분적인 내성, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재와 연관된 가벼운 병 또는 질환이 존재하는지를 측정하는 것을 가능하게 할 수 있다.
상기 질환들은 장애 및/또는 인간 질환, 예를 들어, 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애일 수 있다.
상기 암 및 종양으로는 전이된 신장 암종을 포함한 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 포함하는 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 포함하는 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양이 포함된다.
상기 감염성 질환으로는 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병이 포함된다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환으로는 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함될 수 있다.
상기 대사 질환으로는 비만과 같은 상기 비-면역계 질환이 포함될 수 있다.
상기 중추 신경계 질환으로는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증이 포함될 수 있다.
상기 질환 및 장애로는 또한 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 및 골다공증이 포함될 수 있다.
상기 방법은 또한, 대상체에 있어서, 본 발명에 따른 SNP에 의해 코딩되는 변이 대립형질의 존재와 연관된 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 유전자적 진단을 가능하게 한다.
바람직하게는, 단계 a)에 있어서, 상기 정의된 바와 같은 코딩 SNP를 하나 이상 함유하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재가 검출될 것이다.
폴리뉴클레오티드의 검출은 세포, 혈액, 소변, 타액과 같은 연구되어지는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 또는 연구되어지는 대상체의 생검 또는 부검으로부터 수행될 수 있다. 게놈 DNA는 직접 또는, 예를 들어, PCR 증폭 후에 검출을 위해 사용될 수 있다. RNA 또는 cDNA는 한편 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
이어서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 대상체의게놈에서 검출된 뉴클레오티드 서열을 비교하는 것이 가능하다.
뉴클레오티드 서열의 비교는 서열분석에 의해서, DNA 혼성화 방법에 의해서, 변성제 유무에 따른 전기영동상에서의 DNA 단편들의 이동성 차이에 의해서 또는 용융 온도 차이에 의해서 수행될 수 있다. 문헌 [Myerset al., Science (1985) 230: 1242]을 참조한다. 정확하게는 뉴클레오티드 서열의 구조에 있어서 상기 변형은 RNase 및 S1 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제 보호 시험에 의해서 또는 화학적 절단 제제에 의해서 밝혀질 수 있다. 문헌 [Cottonet al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401]을 참조한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브가 또한 스크리닝을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 많은 방법들이 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 측정하기 위해서 및 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자적 변이성을 확인하기 위해서 사용될 수 있다 [참조: Cheeet al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613].
단계 b)에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은, 예를 들어, PCR, RT-PCR, RNase 방어, 노던 블롯 및 기타 혼성화 방법들과 같은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 따라서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 RNA (및 폴리펩티드의 코딩) 수준을 정량함으로써 측정될 수 있다.
단계 c) 및 d)에 있어서, 대상체 또는 대상체로부터의 샘플에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재 또는 부재뿐만 아니라 농도는, 예를 들어, 방사선면역측정법, 경쟁적 결합 시험, 웨스턴 블롯 및 ELISA 시험과 같은 잘 알려진 방법들에 의해서 수행될 수 있다.
단계 d)에 이어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 측정된 농도를 대상체에서 통상 발견되는 천연 야생형 단백질 농도와 비교할 수 있다.
당업자는, 이전에 언급된 것과 같이, 선행 기술 문헌의 도움으로 또는 통상적인 시험 또는 분석에 의해서, 질환에 대한 민감도 또는 반대로 내성을 나타내는 역가, 상기 유발된 가벼운 병 또는 질환을 확인할 수 있다.
단계 e)에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 작용성의 측정은, 예를 들어, 위에서 언급된 것과 같은 생체외 시험에 의해서 또는 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포의 사용에 의해서와 같이, 당업자에게 잘 알려진 방법들에 의해서 수행될 수 있다.
치료 화합물 및 질환의 치료법
본 발명은 또한 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 치료 화합물을 그의 목적으로 한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 치료 화합물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 상기 질환들은 장애 및/또는 인간 질환, 예를 들어, 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애일 수 있다.
상기 암 및 종양으로는 전이된 신장 암종을 포함한 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 포함하는 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 포함하는 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양이 포함된다.
상기 감염성 질환으로는 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병이 포함된다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환으로는 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함될 수 있다.
상기 대사 질환으로는 비만과 같은 상기 비-면역계 질환이 포함될 수 있다.
상기 중추 신경계 질환으로는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증이 포함될 수 있다.
상기 질환 및 장애로는 또한 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 및 골다공증이 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한, 만성 B형 및 C형 간염과 같은 바이러스성 감염, 모상 세포 백혈병 및 만성 골수 백혈병과 같은 백혈병, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 카르시노이드 종양, 악성 흑색종, 전이된 신장 암종, 알쯔하이머병, 파킨슨병뿐만 아니라 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종과 같은 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양, 및 생식기 사마귀 또는 성병과 같은 다양한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 치료 화합물의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 수득하게 할 수 있는 임의 화합물뿐만 아니라 상기 폴리펩티드에 의해서 또는 그로부터 수득되거나 동정되는 화합물도 마찬가지로, 예컨대, 치료 화합물로서, 인간 신체의 치료학적 처치를 위해 사용될 수 있다.
이는 본 발명이 또한 활성제로서 상기 정의된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체를 함유하는 약제를 그의 목적으로 하는 이유이다.
본 발명은 또한 다양한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조를 위한 상기 정의된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체의 용도에 관한 것이다. 상기 질환들은 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애와 같은 장애 및/또는 인간 질환일 수 있다.
상기 암 및 종양으로는 전이된 신장 암종을 포함한 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 포함하는 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 포함하는 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양이 포함된다.
상기 감염성 질환으로는 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병이 포함된다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환으로는 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함된다.
상기 대사 질환으로는 비만과 같은 상기 비-면역계 질환이 포함될 수 있다.
상기 중추 신경계 질환으로는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증이 포함될 수 있다.
상기 질환 및 장애로는 또한 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 및 골다공증이 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 만성 B형 및 C형 간염과 같은 바이러스성 감염, 모상 세포 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 카르시노이드 종양, 악성 흑색종, 전이된 신장 암종, 알쯔하이머병, 파킨슨병뿐만 아니라 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종과 같은 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양, 및 생식기 사마귀 또는 성병과 같은 다양한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조를 위한, 하나 이상의 상기 정의된 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체의 용도에 관한 것이다.
활성제로서 유용한, 본 발명의 폴리펩티드 및 다른 화합물의 투여량은 화합물의 선택, 치료적 조치, 투여 방식, 제제의 특성, 대상체의 특성 및 의사의 판단에 의존한다.
활성제로서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 일반적으로 1 내지 100 ㎍/대상체의 ㎏의 범위인 투여량으로 투여된다.
본 발명은 또한 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드, 하나 이상의 상기 정의된 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체와 같은 하나 이상의 위에서 언급된 화합물뿐만 아니라 제약상 허용가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물을 목적으로 한다.
상기 제약 조성물에 있어서, 활성제는 유리하게는 생리학적으로 유효한 투여량으로 존재한다.
상기 제약 조성물은, 예를 들어, 고형 또는 액상일 수 있고, 예를 들어, 단순 또는 피복된 정제, 젤캡, 과립, 카라멜, 좌약 및 바람직하게는 주사가능한 제제 및 주사용 분말과 같이 인간 의학에서 최근에 사용되는 제약 형태들로 존재할 수 있다. 상기 제약 형태들은 통상적인 방법들에 따라서 제조될 수 있다.
활성제(들)는 탈크, 아라비아 고무, 락토스, 전분, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 스테아르산마그네슘, 코코아 버터, 수성 또는 비-수성 비히클, 동물성 또는 식물성 지방산 물질, 파라핀 유도체, 글리콜, 각종 습윤제, 분산제 또는 유화제, 방부제와 같은 제약 조성물에 통상적으로 사용되는 부형제와 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 활성제(들)는 단독으로 이용되거나 또는, 예를 들어, 인터루킨 또는 인터페론과 같은 기타 시토킨과 같은 치료 화합물처럼 기타 화합물들과 배합하여 이용될 수 있다.
제약 조성물의 상이한 제형들은 투여 방식에 따라서 적용된다.
제약 조성물은 당업자에게 알려진 상이한 경로의 투여법에 의해서 투여될 수 있다.
본 발명은 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포 및/또는 상기 정의된 항체와 같은 하나 이상의 위에서 언급된 화합물뿐만 아니라 적합한 제약상 허용가능한 부형제를 함유하는 진단 조성물을 목적으로 한다.
상기 진단 조성물은, 예를 들어, 완충제 및 방부제와 같이 진단 조성물에 일반적으로 사용되는 것과 같은 적합한 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명은 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 목적으로 하는 치료 화합물을 제조하기 위한 하기의 용도를 목적으로 한다:
a) 본 발명에 따른 폴리펩티드의 치료 유효량, 및/또는
b) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 및/또는
c) 상기 정의된, 치료받을 대상체로부터의 숙주 세포.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 활성에 있어서의 증가를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해서는, 몇가지 방법들이 가능하다.
치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 제약상 허용가능한 부형제와 함께 대상체에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 본 발명의 폴리펩티드의 내인성 생성을 증가시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스성 발현 벡터내에 삽입될 수 있다. 이러한 벡터는, 형질도입된 세포가 목적 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 플라스미드 벡터에 의해 감염되어진 세포로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)]을 참조한다.
본 발명에 따르면, 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하게 사용될 것이다.
대상체에게 그에게 속하는 숙주 세포를 투여하는 것이 역시 가능한데, 상기 숙주 세포는 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 발현하도록 사전에 획득되고 변형되어진다.
본 발명은 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 목적으로 하는 치료 화합물을 제조하기 위한 하기의 용도에 관한 것이다:
a) 치료 유효량의 상기 정의된 면역특이적 항체, 및/또는
b) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시키는 폴리뉴클레오티드.
그러므로, 상기 정의된 바와 같이 치료 유효량의 억제제 및/또는 항체를, 가능하게는 제약상 허용가능한 부형제와 배합하여 대상체에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시킬 수 있는 본 발명에 따른 상보적인 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 본 발명의 폴리펩티드의 내인성 생성을 감소시키는 것이 또한 가능하다.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 상보적인 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열 1과 95% 이상의 상동성 (바람직하게는, 97% 상동성, 보다 바람직하게는 99% 상동성 및 특히 100% 상동성)을 보유하는 뉴클레오티드 서열이 환자의 게놈에 존재하는 것과 연관된 IFNα-21 변형체에 의해 유발된 장애 또는 질환을 앓는 환자를 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 IFNα-21 단백질의 용도에 관한 것으로, 단, 상기 뉴클레오티드 서열은 하기 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g, t1265c, t1277c 중 하나를 함유한다.유정
바람직하게는, 상기 약제는 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환들 중 하나의 예방 또는 치료를 위해 사용된다.
상기 암 및 종양으로는 전이된 신장 암종을 포함한 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 포함하는 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 포함하는 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양이 포함된다.
상기 감염성 질환으로는 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병이 포함된다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환으로는 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함된다.
상기 대사 질환으로는 비만과 같은 상기 비-면역계 질환이 포함될 수 있다.
상기 중추 신경계 질환으로는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증이 포함될 수 있다.
상기 질환 및 장애로는 또한 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 및 골다공증이 포함될 수 있다.
본 발명의 SNP를 함유하는 IFNα-21 폴리펩티드의 모방 화합물
본 발명은 또한 하기의 폴리펩티드의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 신규한 화합물에 관한 것이다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열;
단, a) 및 b)의 상기 아미노산 서열은 SNP K179E를 함유한다.
상기 생물학적 활성은, 실험부에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 수지상 세포 성숙을 자극하는 능력, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성, TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
실험부에서 언급된 바와 같이, K179E 변이된 IFNα-21은 하기 사항에 있어서 야생형 IFNα-2와는 상이하다:
▶ K179E 변이된 IFNα-21은 수지상 세포 성숙을 자극하는 더 큰 능력을 보유한다;
▶ K179E 변이된 IFNα-21은 CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 IFN-감마 분비를 자극하는 더 큰 능력을 보유한다;
▶ K179E 변이된 IFNα-21은 야생형 IFNα-2보다는 더 낮은 VSV로 감염된 세포 배양액에서의 항바이러스 활성을 보유한다.
실험부에서 언급된 바와 같이, K179E 변이된 IFNα-21은 천연 야생형 IFNα-21보다 약간 더 낮은 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 보유한다.
실험부에서 언급된 바와 같이, K179E 변이된 IFNα-21은 야생형 IFNα-2와 유사한 TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성 및 야생형 IFNα-2와 유사한 EMCV 마우스 모델에서의 항바이러스 활성을 보유한다.
상기 정의된 바와 같이, 본 발명의 신규한 화합물은 K179E 변이된 IFNα-21의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은 또한, 고려되는 생물학적 활성의 종류에 따라서, K179E 변이된 IFNα-21의 생물학적 활성보다 더욱 더 낮거나 또는 더 높은 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 생화학적 화합물, 또는 예를 들어, 합성 펩티드-모방체와 같은 유기 화학적 화합물일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 화합물의 동정을 위한 K179E SNP를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 화합물의 동정 방법에 관한 것이다:
a) 예를 들어, 수지상 세포 성숙, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성과 같은, 시험되는 화합물의 생물학적 활성을 측정하고;
b) i) 시험되는 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성과,
ii) 아미노산 서열 2의 폴리펩티드, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 활성을 비교하고; 단, 상기 아미노산 서열은 K179E SNP를 함유하며;
c) 시험되는 화합물이 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 실질적으로 유사하거나, 더 낮거나 또는 더 높은 활성을 보유하는지를 단계 b)에서 수행된 비교를 기초로 하여 결정하며; 단, 상기 아미노산 서열은 K179E SNP를 함유한다.
바람직하게는, 시험되는 화합물은 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 미리 동정되거나, 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계될 수 있으며; 단, 상기 아미노산 서열은 K179E SNP를 함유한다.
본 발명은 또한 하기 폴리펩티드의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 신규한 화합물에 관한 것이다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열;
단, 상기 a) 및 b)의 아미노산 서열은 SNP: Q114H 및 V127D를 함유한다.
상기 생물학적 활성은 실험부에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 수지상 세포 성숙을 자극하는 능력, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성, TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
실험부에서 언급된 바와 같이, SNP: Q114H 및 V127D 모두 (상기 이중 변이를 이후 "Q114H/V127D"로 언급할 것이다)를 함유하는 IFNα-21은 하기 사항에 있어서야생형 IFNα-2와는 다르다:
▶ Q114H/V127D 변이된 IFNα-21은 CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 IFN-감마 분비를 자극하는 더 큰 능력을 보유한다;
▶ Q114H/V127D 변이된 IFNα-21은 VSV로 감염된 세포 배양액에서의 더 낮은 항바이러스 활성을 보유한다.
실험부에서 언급된 바와 같이, Q114H/V127D 변이된 IFNα-21은 천연 야생형 IFNα-21보다 더 낮은 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 보유한다.
실험부에서 언급된 바와 같이, Q114H/V127D 변이된 IFNα-21은 야생형 IFNα-2와 유사한 EMCV 마우스 모델에서의 항바이러스 활성, 야생형 IFNα-2와 유사한 단핵구에 의한 IL-10, IL-12 및 TNF-α분비를 자극하는 능력, 및 야생형 IFNα-2와 유사한 TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 보유한다.
상기 정의된 바와 같이, 본 발명의 신규한 화합물은 Q114H/V127D 변이된 IFNα-21의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은 또한, 고려되는 생물학적 활성의 종류에 따라서, Q114H/V127D 변이된 IFNα-21의 생물학적 활성보다 더욱 더 낮거나 또는 더 높은 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 생화학적 화합물, 또는 예를 들어, 합성 펩티드-모방체와 같은 유기 화학적 화합물일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 화합물의 동정을 위한 Q114H/V127D SNP를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 화합물의 동정 방법에 관한 것이다:
a) 예를 들어, 수지상 세포 성숙, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성과 같은 생물학적 활성을 측정하고;
b) i) 시험되는 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성과,
ii) 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 활성을 비교하고; 단, 상기 아미노산 서열은 Q114H/V127D SNP를 함유하며;
c) 시험되는 화합물이 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 실질적으로 유사하거나, 더 낮거나 또는 더 높은 활성을 보유하는지를 단계 b)에서 수행된 비교를 기초로 하여 결정하며; 단, 상기 아미노산 서열은 Q114H/V127D SNP를 함유한다.
바람직하게는, 시험되는 화합물은 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 미리 동정되거나, 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계될 수 있으며; 단, 상기 아미노산 서열은 Q114H/V127D SNP를 함유한다.
화합물을 동정하고 설계하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 방법들을 인용하고 있는 간행물들은, 예를 들어, 하기와 같을 수 있다:
- Silverman R.B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action". Academic Press, 1st edition (January 15, 1992).
- Anderson S and Chiplin J. (2002). "Structural genomics; shaping the future of drug design" Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). "The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
- Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1): 5-14.
- Kauvar L.M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6):709.
본 발명의 화합물은 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환들 중 하나의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
상기 암 및 종양으로는 전이된 신장 암종을 포함한 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 포함하는 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 간, 경부, 두부 및 신장의 암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 포함하는 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양이 포함된다.
상기 감염성 질환으로는 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병이 포함된다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환으로는 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함된다.
상기 대사 질환으로는 비만과 같은 상기 비-면역계 질환이 포함될 수 있다.
상기 중추 신경계 질환으로는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증이 포함될 수 있다.
상기 질환 및 장애로는 또한 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈, 및 골다공증이 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물은 만성 B형 및 C형 간염과 같은 바이러스성 감염, 모상 세포 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 카르시노이드 종양, 악성 흑색종, 전이된 신장 암종, 알쯔하이머병, 파킨슨병뿐만 아니라 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종과 같은 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양, 및 생식기 사마귀 또는 성병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환들 중 하나의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
실험부
실시예 1: SNP c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g를 함유하는 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 및 야생형 참조 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 모델링
첫 번째 단계로, IFNα-21의 삼차원 구조를 PDB 데이터베이스 (코드 1ITF)에서 그의 구조가 이용가능한 IFNα-2의 삼차원 구조로부터 소프트웨어 Modeler (MSI, San Diego, CA)를 이용하여 구축하였다.
성숙 폴리펩티드는 단편을 이어서 변이 A19G, Q79K, Q91H, V104D, C139stop, 및 K156E를 재생시키는 방식으로 변형시켰다.
무수한 분자 최소화 단계들을 프로그램 AMBER 및 DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.)를 이용하여 상기 변이된 단편에 대해서 수행하였다.
2회의 분자 역학 계산 실행을 이어서 동일한 프로그램 및 동일한 역장을 가지고 수행하였다.
각 경우에 있어서, 50,000회 단계들은 300 °K에서 계산되었고, 300 평형 단계들에 의해 종결되었다.
상기 모델링의 결과를 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타내었다.
실시예 2: 개체군에서의 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g의 유전자형 결정
SNP의 유전자형 결정은 편광된 형광성을 판독하여 생산물을 검출하는 미니서열분석의 원리를 기초로 한다. 상기 방법은 형광 미니서열분석으로 구성된다 (FP-TDI Technology or Fluorescence Polarization Template direct Dye-terminatorIncorporation).
미니서열분석은 각 개체군의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭된 생산물상에서 수행된다. 상기 PCR 생산물은 유전자형이 결정될 SNP를 함유하는 유전자 영역을 포함하는 방식으로 선택된다. 사용되지 않은 PCR 프라이머 및 통합되지 않은 dNTP를 제거한 후, 미니서열분석을 수행한다.
미니서열분석은 폴리머라제 효소 및 형광표지된 디데옥시뉴클레오티드를 사용하여, SNP 자리의 바로 상류에 위치하는, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시키는 것으로 구성된다. 상기 연장 공정으로부터 생성된 생산물은 편광된 형광성을 판독함으로써 직접 분석된다.
상기 모든 단계들뿐만 아니라 판독은 동일한 PCR 플레이트에서 수행된다.
이와 같이, 유전자형 결정은 5 단계를 필요로 한다:
1) PCR에 의한 증폭
2) 효소 분해에 의한 PCR 생산물의 정제
3) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장
4) 판독
5) 판독의 해석
유전자형 결정 단계 1 및 2는 SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 각각에 대해서 동일한 조건에서 수행된다. 단계 3, 4 및 5는 상기 다형성의 각각에 특이적이다.
1) IFNα-21 유전자의 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭은 인종적으로 다양한기원의 사람들 268명으로부터 유래한 게놈 DNA로부터 수행된다.
상기 게놈 DNA는 미국의 코리엘 인스티튜트 (Coriell Institute)에 의해서 제공된다.
상기 268명은 하기와 같이 분포한다:
계통군 특정 인종군 총계 %
아프리카 아메리카인 아메리카 원주민 카리브인 유럽 코카소이드 멕시코인 북동 아시아인 비유럽 코카소이드 남동 아시아인 남아메리카인 아프리카 아메리카인남아메리카 안데스남서아메리카 인디안카리브인북아메리카 카프카스인이베리아인이탈리아인멕시코인중국인일본인그리스인인도-파키스탄인중동태평양 섬주민남아시아인남아메리카인 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 5050105151010791010991010101020892037710171010 100.018.766.733.35.6100.03.779.810.110.136.9100.03.750.050.07.521.624.354.113.841.258.86.3100.03.7
총계 268 100
각 개체들 중 각각으로부터 유래된 게놈 DNA로 샘플을 구성한다.
모든 SNP에 대해서, PCR 증폭은 하기 프라이머로부터 출발하여 수행된다:
서열 5: 센스 프라이머: GGTTCAAGGTTACCCATCTC
서열 5: 안티센스 프라이머: TTTGAAATGGCAGAAGTCAT
상기 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 1에서 620번 뉴클레오티드 내지 1315번 뉴클레오티드인, 696개 길이의 뉴클레오티드의 단편의 증폭을 가능하게 한다.
각 SNP에 대해서, PCR 생산물은 미니서열분석을 위한 주형으로서 제공될 것이다.
PCR 반응의 총 반응 용적은 샘플당 5 ㎕이다.
상기 반응 용적은 하기 표에 나타낸 시약들로 이루어진다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
라이프 테크놀로지 (Life Technology) Taq으로 전달 완충액 (X) 10 0.5 1
라이프 테크놀로지 Taq으로 전달 MgSO4(mM) 50 0.2 2
AP 바이오테크 (AP Biotech) 27-2035-03 dNTP (mM) 10 0.1 0.2
요청에 따라 센스 프라이머 (μM) 10 0.1 0.2
요청에 따라 안티센스 프라이머 (μM) 10 0.1 0.2
라이프 테크놀로지 11304-029 Taq 백금 5 U/㎕ 0.02 0.1 U/반응
H2O Qsp 5 ㎕ 1.98
DNA (샘플) 2.5 ng/㎕ 2 5 ng/반응
총 용적 5 ㎕
상기 시약들을 ABGene 사에 의해 공급된 384웰을 갖는 블랙 PCR 플레이트 (ref: TF-0384-k)에 분배한다. 플레이트를 밀봉하여, 원심분리한 다음, 384-웰 플레이트용 써모사이클러내에 위치시켜 하기 항온배양을 수행한다: PCR 사이클: 94℃에서 1분, 이어서 3 단계 (94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 68℃에서 1분)로 이루어진 사이클 36회.
2) PCR 증폭된 생산물을 이어서 2개의 효소: 새우 알칼린 포스파타제 (SAP) 및 엑소뉴클레아제 I (Exo I)를 이용하여 정제한다. 상기 효소들 중 첫 번째 것은 PCR 증폭 중에 통합되지 않은 dNTP를 탈인산화시키는 반면, 두 번째 것은 일본쇄 DNA 잔기, 특히 PCR 중에 사용되지 않은 프라이머를 제거한다.
상기 분해는, PCR 플레이트의 각 웰에, 샘플당 5 ㎕의 반응 혼합물의 첨가에 의해 수행된다. 상기 반응 혼합물은 하기 시약들로 구성된다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
AP 바이오테크 E70092X SAP 1 U/㎕ 0.5 0.5/반응
AP 바이오테크 070073Z Exo I 10 U/㎕ 0.1 1/반응
AP 바이오테크 SAP 공급 SAP 완충액 (X) 10 0.5 1
H2O Qsp 5 ㎕ 3.9
PCR 생산물 5 ㎕
총 용적 10 ㎕
일단 충전되면, 플레이트를 밀봉하고, 원심분리한 다음, 384웰 플레이트용 써모사이클러 (Tetrad of MJ Research)내에 위치시키고 하기 항온배양을 수행한다: SAP-EXO 분해: 37℃에서 45분, 80℃에서 15분.
신장 또는 미니서열분석 단계는 이어서 제조된 샘플당 5 ㎕의 반응 혼합물을 첨가함으로써 분해된 PCR의 생산물에 대해 수행된다.
미니서열분석 3) 및 판독 단계 4) 및 판독의 해석 5)은 각 SNP: c794g,c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g에 특이적이다.
상기 모든 단계들은 이후 상기 다형성의 각각에 대해 사용되는 특정 조건들을 상세하게 기재한다.
3) 미니서열분석
유전자형 결정을 위해 필요한 2개의 미니서열분석용 프라이머의 서열은 본 발명에 따른 SNP 위치의 상류에 위치하는 뉴클레오티드의 서열에 상응시키는 방식으로 결정되었다. SNP를 함유하는 PCR 생산물은 이본쇄 DNA 생산물이고, 유전자형 결정은 그러므로 센스 쇄 또는 안티센스 쇄 중 하나에 대해서 수행될 수 있다. 선택된 프라이머는 라이프 테크놀로지사에 의해 제조된다.
하기 표는, 각 SNP에 대해서, 시험되는 미니서열분석용 프라이머의 서열 및 유전자형 결정을 위해 유지되는 최적 조건을 나타낸다:
SNP 시험되는 프라이머 유전자형 결정을 위한 최적 조건
c794g 서열 7: 센스: gagggccttgatactcctgg서열 8: 안티센스: gagagattcttcccatttgt 안티센스 프라이머 + ddGTP-R110 + ddCTP-Tamra
c973a 서열 9: 센스: actcatctgctacttgggaa서열 10: 안티센스: aaatttttctaggaggctct 안티센스 프라이머 + dGTP-R110 + ddTTP-Tamra
g1011c 서열 11: 센스: ttttccactgaacttaacca서열 12: 안티센스: gcttccaggtcattcagctg 안티센스 프라이머 + ddGTP-R110 + ddCTP-Tamra
t1049a 서열 13: 센스: agcctgcgtgatacaggagg서열 14: 안티센스: ggggagtctcttccacccca 안티센스 프라이머 + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra
t1155a 서열 15: 센스: gagaagaaatacagcccttg서열 16: 안티센스: gctctgacaacctcccaggc 안티센스 프라이머 + ddATP-R110 +ddTTP-Tamra
a1204g 서열 17: 센스: tgagatccttctctttatca서열 18: 안티센스: taatctttcttgaaaaattt 안티센스 프라이머 + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra
SNP의 미니서열분석은 우선 16개의 샘플에 대해 동정되었고, 이어서 268 개체로 구성된 개체군 및 10개의 대조군에 대해 유전자형 결정을 하였다.
연장 또는 미니서열분석 단계는 이어서 하기 표에 나타낸 바와 같이 수행된다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
자체 제조 신장 완충액1(X) 5 1 1
라이프테크놀로지 요청에 따라 미니서열분석용 프라이머 (μM)A 또는 B 10 0.5 2
AP바이오테크 27-2051(61,71,81)-01 ddNTP2(μM)2는 표지되지 않음 각 2.5 0.25 각 0.125
NEN Nel 472/5및 Nel 492/5 ddNTP2(μM)2는 Tamra 및 R110으로 표지 각 2.5 0.25 각 0.125
AP바이오테크 E79000Z 써모-시쿼나제 3.2 U/㎕ 0.125 0.4 U/반응
H2O Qsp 5 ㎕ 3.125
분해된 PCR 생산물 10
총 용적 15
15X 신장 완충액은 250 mM 트리스-HCl pH 9, 250 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM MgCl2및 40% 글리세롤로 구성된다.2ddNTP에 대해서, 4 가지 염기의 혼합물은 연구되는 다형성에 따라서 수행된다. 작용성 SNP를 이루는 목적의 2 염기만 (야생형 뉴클레오티드/변이된 뉴클레오티드)이 Tamra 또는 R110으로 표지된다.예를 들어:- 비표지된 2.5 μM의 ddCTP,- 비표지된 2.5 μM의 ddATP,- 2.5 μM의 ddTTP (비표지된 1.875 μM의 ddTTP 및 Tamra 표지된 0.625 μM의 ddTTP),- 2.5 μM의 ddGTP (비표지된 1.875 μM의 ddGTP 및 R110 표지된 0.625 μM의 ddGTP).
일단 충전되면, 플레이트를 밀봉하고, 원심분리한 다음, 384-웰 플레이트용 써모사이클러 (Tetrad of MJ Research)내에 위치시키고 하기 항온배양을 수행한다: 신장 사이클: 93℃에서 1분, 이어서 2 단계 (93℃에서 10초, 55℃에서 30초)로 구성된 사이클 35회.
써모사이클러내에서 최종 단계 후, 플레이트를 직접 Analyst (등록상표) HT 타입의 편광된 형광성 판독기 (LJL Biosystems Inc.)상에 위치시킨다. 플레이트를 두 가지 방법의 이용에 의한 Criterion Host (등록상표) 소프트웨어를 이용하여 판독한다. 첫 번째는 상기 형광체에 특이적인 방사 및 여기 필터를 이용하여 (여기 550-10 nm, 방사 580-10 nm) Tamra 표지된 염기를 판독할 수 있고, 두 번째는 상기 형광체에 특이적인 여기 및 방사 필터를 이용하여 (여기 490-10 nm, 방사 520-10 nm) R110 표지된 염기를 판독할 수 있다. 상기 두 경우에 있어서, 2색성 이중 거울 (R11/Tamra)이 사용되고 다른 판독 매개변수는 하기와 같다:
Z-높이: 1.5 mm
감쇠자: 아웃
융합 시간: 100,000 μsec.
원데이터 단위: 카운트/초
전환 편광: 웰 당
플레이트 고정 시간: 0 msec
PMT 장치: Smart Read (+), 민감도 2
동적 편광기: 방사
정적 편광기: S
이와 같이, Tamra 필터에 대한 mP (milliPolarization) 및 R110 필터에 대한 mP의 계산치를 포함하는 파일 결과가 수득된다. 상기 mP 값은 하기 식에 따라서평행면 () 및 수직면 ()상에서 수득된 강도 수치로부터 출발하여 계산된다:
상기 계산에서,값은 인자 g에 의해 측량된다. 이는 미리 실험적으로 결정되어야만 하는 기계 변수이다.
4) 및 5) 판독의 해석 및 유전자형의 판독
mP 값은 Microsoft Inc. Excel 소프트웨어, 및/또는 Allele Caller (등록상표) 소프트웨어 (LJL Biosystems Inc. 개발)를 이용한 그래프상에 기록된다.
가로축상에 Tamra 표지된 염기의 mP 값을 나타내고, 세로축상에는 R110 표지된 염기의 mP 값을 나타낸다. 강한 mP 값은 상기 형광체로 표지된 염기가 통합되었다는 것을 나타내고, 반대로, 약한 mP 값은 상기 염기의 통합이 존재하지 않는 것을 의미한다.
상이한 유전자형을 가진 동종의 뉴클레오티드 서열의 군이 3개까지 수득될 수 있다.
Allele Caller (등록상표) 소프트웨어의 사용은, 일단 상이한 군들의 동정이 수행되면, 각 개체에 대해 정의된 유전자형을 표의 형태로 직접 추출할 수 있다.
SNP: c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g에 대한 미니서열분석의 결과
유전자형 결정 공정의 완료 후, 연구되는 SNP에 대한 개체군 중 개체들의 유전자형의 결정은 상기 기재된 그래프를 이용하여 수행되었다.
SNP c794g에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 CC, 또는 이형접합체 CG, 또는 동형접합체 GG 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 GG는 개체군에서 검출되지 않는다.
SNP c973a에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 CC, 또는 이형접합체 CA, 또는 동형접합체 AA 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 AA는 개체군에서 검출되지 않는다.
SNP g1011c에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 GG, 또는 이형접합체 GC, 또는 동형접합체 CC 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 CC는 개체군에서 검출되지 않는다.
SNP t1049a에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 TT, 또는 이형접합체 TA, 또는 동형접합체 AA 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 AA는 개체군에서 검출되지 않는다.
SNP t1155a에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 TT, 또는 이형접합체 TA, 또는 동형접합체 AA 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 AA는 개체군에서 검출되지 않는다.
SNP a1204g에 대해서, 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 AA, 또는 이형접합체 AG, 또는 동형접합체 GG 중 하나이다. 실제로, 하기 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 GG는 개체군에서 검출되지 않는다.
개체군에서 결정된 유전자형의 분포 결과 및 연구되는 6개의 SNP에 대한 상이한 대립형질 빈도의 계산을 하기 표들에 나타내었다:
상기 표에서,
- N은 개체수를 나타내고,
- %는 특정 아개체군에서의 개체의 백분율을 나타내고,
- 대립형질 빈도는 특정 아개체군에서 변이된 대립형질의 백분율을 나타내고,
- 95% CI는 95% 신뢰도의 최소와 최대 간격을 나타낸다.
SNP c973a에 대해서, 예를 들어, 안티센스에서의 대립인자 g 판독은 센스에서 대립인자 c 판독에 해당하며, 이는 미성숙 IFNα-21 단백질 서열의 102번 위치에서 글루타민 (Q)의 존재와 관련된다는 것과, 그러므로 안티센스에서 대립인자 t 판독은 센스에서 대립인자 a 판독에 해당하여 상응하는 단백질의 서열에서 상기 위치에 리신 (K)에 해당한다는 것을 상술할 필요가 있다.
계통군에 의한 상기 결과들을 조사함으로써, 및 SNP에 의해서, 다음이 관찰된다:
- SNP c794g에 대해서, 6개의 이형접합 개체 CG는 아프리카 아메리카인 및 남동 아시아인의 아개체군으로부터 유래한다.
- SNP c973a에 대해서, 4개의 이형접합 개체 CA는 유럽 및 비유럽 코카소이드의 아개체군으로부터 유래한다.
- SNP g1011c에 대해서, 하나의 이형접합 개체 GC는 유럽 코카소이드의 아개체군으로부터 유래한다.
- SNP t1049a에 대해서, 유일한 이형접합 개체 TA는 아프리카 아메리카인의 아개체군으로부터 유래한다.
- SNP t1155a에 대해서, 8개의 이형접합 개체 TA는 아프리카 아메리카인 및 유럽 코카소이드의 아개체군으로부터 유래한다.
- SNP a1204g에 대해서, 15개의 이형접합 개체 AG는 아메리카 원주민, 유럽 및 비유럽 코카소이드, 멕시코인, 북동 아시아인 및 남아메리카인의 아개체군으로부터 유래한다.
실시예 3: 효모에서 천연 야생형 IFNα-21 및 A42G, Q102K, Q114H/V127D, K179E 변이된 IFNα-21의 발현
a) 진핵생물 발현 벡터 pPicZα-topo에서 천연 야생형 IFNα-21 및 변이된 IFNα-21의 클로닝
천연 야생형 IFNα-21 및 A42G, Q102K, Q114H/V127D, K179E 변이된 IFNα-21의 성숙 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상응하는 SNP(s)에 대해 이형접합체인 개체로부터의 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 PCR에 의해 증폭된다.
상기 증폭을 가능하게 하는 PCR 프라이머는 하기와 같다:
서열 19: 센스 프라이머: TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
서열 20: 안티센스 프라이머: TCATTCCTTCCTCCTTAATCTTTCTTG
PCR 생산물을 메탄올에 의해 유도가능한 하이브리드 프로모터 AOX1의 제어하에서 진핵생물 발현 벡터 pPicZα-TOPO에 삽입시킨다 (TOPOTM-cloning; Invitrogen Corp.).
상기 벡터는 효모 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 진핵생물 단백질의 이종 발현을 시킬 수 있다.
재조합 단백질을 코딩하는 벡터의 영역의 뉴클레오티드 서열의 동정 후, 벡터를 Pme1 제한효소로 직선화시키고, 피키아 파스토리스 효모 균주 (Invitrogen)에 상기 재조합 발현 벡터를 형질전환시킨다.
b) 피키아 파스토리스에서의 이종 발현 및 천연 야생형 IFNα-21 및 변이된 IFNα-21 단백질의 정제
천연 야생형 IFNα-21를 코딩하는 클론 또는 A42G, Q102K, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21를 코딩하는 클론을 함유하는 50 mL의 BMGY 배지 (2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 1.34% YNB, 1% 글리세롤, 100 mM 인산칼륨, 0.4 mg/리터 비오틴 pH 6.0)의 2개의 포화된 예비-배양을 200 rpm (분당 회전수)의 진탕하에 30℃에서 24-48시간 동안 수행하였다.
상기 배양액이 포화 세포 밀도 (600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도 12에 해당)에 도달할 때, 이를 250 mL의 BMMY 배지 (2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 1.34% YNB, 0.5% 메탄올, 100 mM 인산칼륨, 0.4 mg/리터 비오틴 pH 6.0)에 5 OD/mL로 접종하는데 사용한다.
단백질의 발현은 이어서 180 rpm으로 배양 플라스크를 진탕시키면서 30℃에서 24시간 동안 최종 농도 1%의 메탄올에 의해 유도된다.
코딩 서열의 상류에 "알파 인자"의 시그널 펩티드 서열의 존재로 인하여, 단백질은 효모에 의해서 배양 배지에 분비된다. 알파 인자는 선천적으로 공정 중에 절단된다.
현탁액을 원심분리시키고 단백질을 수득된 상층액으로부터 HPLC에 의해 정제한다.
예비-개시된 단계에서, 초여과법 (Labscale, 컷오프 5000 Da, Millipore) 및 후속적인 투석은 50 mM 트리스-HCl pH 9.0, 25 mM NaCl의 완충액 중에 효모 상층액의 농도가 10배가 되도록 할 수 있다.
첫 번째 크로마토그래피 단계는 블루 세파로스 컬럼 (Amersham Pharmacia)상의 친화성에 의해 단백질 회수를 가능하게 한다. 수집된 분획들 중 단백질의 존재는, 한편으로는 SDS PAGE의 전기영동법에 의해서 다른 한편으로는 IFNα-21 단백질에 대항하여 유도된 특이적 항체에 의한 면역-검출법에 의해서 동정된다. 본 단계에서, 목적 단백질의 순도는 75% 이상이다.
두 번째 정제 단계에서, 겔 여과법은 50 mM 트리스 pH 9.0, 25 mM NaCl에 대항하여 IFNα-21 단백질에 해당하는 수집된 분획의 완충액 교환을 가능하게 한다.
정제의 마지막 단계는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼상에서 단백질의 분리로 이루어진다.
재조합 단백질을 함유하는 분획을 트리스 50 mM pH 9, NaCl 25 mM 완충액으로 미리 평형화시킨 음이온 교환 컬럼 (ResourceQ 6.0 mL, Pharmacia)상에 주사한다. 단백질의 용출은 트리스 50 mM pH 9 완충액 중 0.025 내지 1 M NaCl의 농도구배 이동에 의해서 수행된다.
목적 단백질의 순도는 SDS/PAGE 겔상에서 측정되고, 단백질 농도는 농도계 (Quantity one, Biorad) 및 BCA 분석 (비신크로닌산 및 황산구리, Sigma)에 의해서 측정되었다.
상기 프로토콜에 따라서 수득되고, 결국 더 많은 양의 단백질을 생성하기 위해서 스케일업된 정제된 천연 야생형 IFNα-21 및 A42G, Q102K, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21 단백질은 하기되는 작용성 시험에 사용된다.
실시예 4: 천연 야생형 IFNα-21 및 A42G, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 면역조절 활성의 평가
IFN 타입 I (IFN 알파 및 IFN 베타)은 면역계의 작용들을 조절할 수 있다. 그들은 수지상 세포 (DC) 성숙을 증가시키는 것으로 증명되었다; MHC 클래스 I (HLA-ABC) 및 II (HLA-DR) 분자의 발현에 있어서 증가, T-림프구, CD80, CD86 및 CD83 분자의 공동-자극에 관여하는 분자들의 발현에 있어서 증가 및 T-림프구의 자극하는 특성에 있어서의 증가.
a) 수지상 세포 성숙에 대한 A42G, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 효과
A42G, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 면역조절 활성은 수지상 세포 성숙에 대해서 처음 연구되었고 인트론 A 시제품의 대표로서 선택된 야생형 IFNα-2의 면역조절 활성과 비교하였다.
그렇게 하기 위해서, 수지상 세포는 우선 GM-CSF 및 IL-4 시토킨의 존재하에서 배양된 성인 말초혈액 단핵구로부터 생성되었다. CD14+ 세포 정제 키트를 이용한 정제 후, 상기 수지상 세포를 100 ng/mL의 야생형 IFNα-2 또는 A42G, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 존재하에 위치시키고, 그들의 표현형을 MHC 클래스 I 및 II 분자 및 CD40, CD80, CD86, CD83 및 CD1a 마커의 발현을 기대하는 것을 목적으로 하는 FACS 분석에 의해서 결정하였다. 상기 수지상 세포의 성숙 상태를 또한 비-자극된 수지상 세포로 대조군을 제공하여, IFNα처리없이 수득된 것과 비교하였다.
각 마커 및 3개의 실험 조건에 대한 형광성 강도의 측정치의 중간값을 임의의 단위로 표현하였으며, 하기 표에 나타내었다.
HLA ABC HLA DR CD40 CD80 CD86 CD83 CD1a
자극 없음 64 133 24 25 14 15 26
야생형 IFNα-2 87 281 331 76 45 15 155
A42G 변이된 IFNα-21 76 127 117 37 5 8 209
Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 68 122 163 46 8 8 191
K179E 변이된 IFNα-21 181 322 491 87 44 14 127
상기 시험의 결과들은 K179E 변이된 IFNα-21 단백질이 수지상 세포 성숙을 자극하는 높은 능력을 가지고 있다는 것을 증명하며, 상기 자극효과는 야생형 IFNα-2의 것보다 더 높다.
b) T 림프구에 의한 시토킨 분비에 대한 Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 효과
Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 면역조절 활성은 또한 공격에 대항하는 면역반응을 모방하도록 상응하는 변이된 IFNα-21 단백질의 존재 및 강한 항원 (SEB)의 유무하에 놓여진 T 림프구에 의한 시토킨 방출을 측정함으로써 조사되었다. 본 시험은 또한 대조군으로서 사용되고 인트론 A 시제품의 대표로서 선택된 야생형 IFNα-2의 존재하에서 수행되었다.
그렇게 하기 위해서, 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 건강한 공여자로부터 단리하고 항-CD3 및 항-CD28 항체 또는 SEB를 함유하는 적합한 배지에서 16시간 동안 자극하였다. 각 배양액에 4 ㎍/mL의 야생형 IFNα-2 또는 Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21을 첨가하였다. 자극 후, T 림프구를 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD69항체들 또는 항-CD3, 항-CD8 및 항-CD69 항체들로 세포외 표지를 하고, Th1-타입 시토킨 (IFN-감마) 또는 Th2-타입 시토킨 (IL-10)에 대항하여 유도된 특정 항체로 세포내 표지시킨다. 형광 세포들을 FACScalibur 및 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
수득된 결과들은 변이된 IFNα-21 단백질 및 야생형 IFNα-2가 IL-10 및 IFN-감마 분비를 자극하지 않으며, 따라서, SEB의 부재하에서 T 림프구를 활성화시키지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, 변이된 IFNα-21 단백질 및 야생형 IFNα-2은 하기 표에 나타낸 바와 같이 SEB-활성화된 T-림프구에 의한 시토킨 (IL-10 및 IFN-감마) 분비를 자극한다. 당해 표는, CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구에 대한 각각 CD4+ CD69+ 세포 또는 CD8+ CD69+ 세포의 백분율 및 전체 세포에 대한 CD69+ 세포의 백분율로 표현되는, SEB의 존재하에서 T-림프구에 의한 시토킨 분비를 나타낸다.
T-림프구 IFN 감마 IL-10 CD69+세포/총세포
CD4+ CD69+ 음성 대조군 11.9 7.5 1.26
야생형 IFNα-2 19.6 24.68 2.7
Q114H/V127D IFNα-21 38.9 14.6 4.67
K179E IFNα-21 29.5 15.1 3.84
CD8+ CD69+ 음성 대조군 8.73 0.65 4.69
야생형 IFNα-2 16.37 4.26 10.02
Q114H/V127D IFNα-21 32.24 4.91 14.98
K179E IFNα-21 28.28 3.8 13.48
상기 결과들은 Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 및 K179E 변이된 IFNα-21이 SEB 항원에 의해 미리 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비 (IFN 감마 및 IL-10)를 자극한다는 것을 명백하게 증명한다. 본 시험에서, T-림프구에의한 인터페론 감마 생성은 야생형 IFNα-2의 존재하에서 보다 Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 존재하에서 더 높다.
c) 단핵구에 의한 시토킨 분비에 대한 Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 효과
마지막으로, Q114H/V127D 또는 K179E 변이된 IFNα-21의 면역조절 활성은 박테리아성 독성 제제 (LPS)의 부재 또는 존재하에 단핵구에 의한 시토킨 분비를 측정함으로써 연구되었다. 본 시험은 또한 대조군으로서 사용되고 인트론 A 시제품의 대표로서 선택된 야생형 IFNα-2의 존재하에서 수행되었다.
그렇게 하기 위해서, 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 건강한 공여자로부터 단리하고 그의 표현형을 분석하여 CD64+ CD4dim 세포 (CD64 및 CD4dim은 혈액 단핵구를 위한 마커이다)의 상대적인 양을 결정하였다. 하룻밤 배양 후, 상기 PBMC를 (자극된 세포 부재) 배양 배지에서만 또는 LPS (자극된 세포)의 존재하에서 항온배양하였다. 각 배양액에, 4㎍/mL의 야생형 IFN-α 또는 변이된 IFNα-21을 첨가하였다. 배양 후, 세포들을 항-CD64 및 항-CD4dim으로 세포외 표지하고, Th1-타입 시토킨 (TNF-알파), IL-12 및 IL-10에 대항하여 유도된 특정 항체들로 세포내 표지하였다.
형광 세포들을 FACScalibur 및 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
수득된 결과들은 변이된 IFNα-21 단백질 및 야생형 IFNα-2가 LPS의 부재하에서 시토킨 (IL-10, IL-12 및 TNF-알파) 분비를 자극하지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, LPS의 존재하에서, Q114H/V127D 및 K179E 변이된 IFNα-21 단백지 및 야생형 IFNα-2는 하기 표에 나타낸 바와 같이 단핵구에 의한 시토킨 (IL-10, IL12 및 TNF-알파) 분비를 자극한다. 당해 표는, 전체 세포에 대한 CD64+ CD4dim 세포의 백분율 및 CD4dim CD64+ 세포의 백분율로서 표현된, LPS의 존재하에서 단핵구에 의한 시토킨 분비를 나타낸다.
IL-10 IL-12 TNF-α CD4dim CD64+세포/총세포
자극 없음 16.21 8.52 13.88 3.1
야생형 IFNα-2 49.34 34.48 50.87 2.71
Q114H/V127D IFNα-21 50.63 31.81 56.5 2.31
K179E IFNα-21 60.14 36.42 60.16 4.43
실시예 5: A42G, Q102K, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21의 생체외 항증식 활성의 평가
a) 다우디 브르킷 세포주 증식의 인간 림프모구에 대해서
본 시험은 A42G, Q102K, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21 단백질 및 야생형 IFNα-21 단백질상에서 수행된다. RPMI 1640 배지 (10% 소태아 혈청 및 2 mM의 L-글루타민이 추가 공급)에서 미리 배양된 세포 (인간 다우디 브르킷 림프종 세포주, 이후 "다우디 세포"라 부른다)를 96-웰 플레이트에 4×104개 세포/웰의 세포 밀도로 접종한다.
각 웰에서, 다우디 세포는 변이된 또는 야생형 IFNα-21 단백질 중 하나의 증가된 농도와 접촉하도록 놓여진다. 특성을 밝힐 각 IFNα-21에 대해서, 0.003 pM 내지 600 nM의 최종 농도를 시험한다.
다음, 다우디 세포를 Uptiblue 시약 (Uptima)을 배양액에 첨가한 후, 5% CO2하에서 37℃로 66시간 동안 항온배양한다. 세포 증식의 속도를 4시간 더 항온배양한 후 590 nm (여기 560 nm)에서 방출되는 형광성을 측정함으로써 정량한다.
변이된 또는 야생형 IFNα-21의 항증식 활성은 세포 성장을 50% 억제하는 IFNα-21의 농도에 해당하는 IC50의 측정에 기초한다.
각 실험 조건에 대해서는, 3종 이상의 실험을 3회씩 수행하였고, 각 IFNα-21에 대한 평균 IC50 값을 측정한다. 야생형 단백질의 IC50 값에 대한 변이된 단백질의 IC50 값에 해당하는 비율을 비교한다. 상기 결과들을 하기 표에 수집한다 (괄호안에는 표준 편차를 표시하였다):
야생형 IFNα-21 A42G IFNα-21 Q102K IFNα-21 Q114H/V127D IFNα-21 K179E IFNα-21
IC50 (pM) 1.02 2.55 1.05 13.92 3.73
야생형/변이형 비율 - 2.15 (0.78) 1.30 (0.24) 13.10 (3.06) 3.72 (0.83)
본 시험은 A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21 단백질의 다우디 세포에 대한 세포성 항증식 활성이 야생형 IFNα-21의 것보다 더 낮다는 것을 증명한다. 특히, 다우디 세포에 대한 세포성 항증식 활성은 야생형 IFNα-21과 비교하여 Q114H/V127D IFNα-21의 존재하에서 약 10 내지 16 배 더 낮다.
b) TF-1 적백혈병 세포주에 대해서
A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21의 효과는 또한 TF-1 적백혈병 세포주에 대해서 평가된다. 본 시험은 또한 대조군으로서 사용되고 인트론 A 시제품의 대표로서 선택된 야생형 IFNα-2의 존재하에서 수행되었다.
그렇게 하기 위해서, TF-1 세포를 증가하는 농도의 변이된 IFNα-21 또는 야생형 IFNα-2 (0.001 내지 1000 ng/mL)와 접촉하도록 위치시키고 세포 증식을 측정하였다.
결과들은 세포의 30%의 증식을 억제하는 IFNα농도에 해당하는 IC30으로 표현되고 하기 표에 수집된다:
야생형 IFNα-2 A42G IFNα-21 Q114H/V127D IFNα-21 K179E IFNα-21
IC30 (ng/mL) 0.66 2.33 1.97 1.62
상기 데이터는 3종의 변이된 IFNα-21이 TF-1 세포에 대해 약한 항증식 효과를 가지며, 상기 효과는 야생형 IFNα-21의 것과 유사하고, 이는 A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21의 혈액 독성이 야생형 IFNα-2의 것보다 우세하지 않다는 것을 제안한다.
실시예 6: A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21의 항바이러스 활성의 평가
IFN은 항바이러스 방어에 중요한 역할을 한다. IFN 항바이러스 활성은 하기와 같이, IFN 유도된 효소 시스템에 부분적으로 기인한다:
- 2'5' 올리고아데닐레이트 합성효소, 아데노신 올리고머의 합성을 촉매하는 효소. 상기 올리고머는, 일단 활성화되면 바이러스 RNA를 파괴하는 엔도리보뉴클레아제인 RNase L을 활성화시킨다.
- 바이러스 전사체의 합성 및/또는 성숙을 억제하는 Mx 단백질 (GTPase). 상기 활성은 주로 인플루엔자 바이러스상에서 나타난다.
- 이본쇄 RNA에 의해 활성화되는 PKR 단백질 (또는 p68 키나제). 활성화된 PKR은 단백질 합성을 억제한다.
IFN 항바이러스 활성은 또한, 레트로바이러스의 경우에, 세포내로의 바이러스 입자의 도입, 복제, 결합, 입자의 탈출 및 바이러스 입자의 감염력의 억제와 같은 다른 기작들에 의해서 유도된다.
마지막으로, IFN은 면역계의 작용을 조절함으로써, 특히 세포 중재에 대한 반응 (MHC 클래스 I 및 II 분자의 증가, IL-12 및 IFN-감마 생성의 증가, CTL 활성의 증가 등을 포함)에 조력함으로써 간접적인 항바이러스 활성을 발휘한다.
A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21의 항바이러스 활성은 생체외 세포 배양액에서 및 생체내 마우스 모델에서 평가되었다. 두 시험들은 대조군으로서 사용되고 인트론 A 시제품의 대표로서 선택된 야생형 IFNα-2와 나란히 수행되었다.
a) 세포 배양에서의 세포외 항바이러스 활성
본 분석은 소수포 구내염 바이러스 (VSV)를 이용한 세포 배양에서 A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21 및 야생형 IFNα-2의 항바이러스 활성의 평가을 수행한다.
그렇게 하기 위해서, WISH 인간 상피 세포를 감소하는 농도의 변이된 IFNα-21 및 야생형 IFNα-2의 존재하에서 24시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 부가적으로 24 내지 48시간 동안 소수포 구내염 바이러스 (VSV)로 감염시키고 세포 용해를 측정한다.
시험된 상이한 IFNα의 항바이러스 효과는 VSV에 의해 유도된 세포 용해를 50% 억제하는 IFN 농도에 해당하는 IC50 값을 비교함으로써 측정된다.
유사한 실험을 2회 수행하고, 측정된 IC50 값 평균을 하기 표에 나타낸다:
야생형 IFNα-2 A42G IFNα-21 Q114H/V127D IFNα-21 K179E IFNα-21
IC50 (ng/mL) 4 14 22 25
이와 같이, VSV로 감염된 세포 배양에 있어서, A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21은 야생형 IFNα-2보다 더 낮은 항바이러스 활성을 보유한다.
b) 마우스 모델에서 생체내 항바이러스 활성
본 생체내 시험은 EMCV (뇌심근염 바이러스) 마우스 모델에서 수행된다.
인간 IFN은 마우스에 있어서 동일한 양의 마우스 IFN에 의해서 나타나는 것보다는 일반적으로 100 내지 1,000배 더 적은 투여량-의존적 항바이러스 활성을 나타낸다 [Meisteret al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644].
뇌심근염 바이러스 (EMCV)로 마우스의 복막내 주사는 중추 신경계 병발 및 뇌염으로 특징되는 급속하게 진행하는 치명적 질환을 발생시킨다 [Finter NB (1973). Front Biol. 2: 295-360]. 마우스 및 인간 인터페론-알파 모두는 치사 EMCV 감염에 대항하여 마우스를 방어하는데 효과적이라는 것을 보여준다 [Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19: 145-155].
6주령 스위스 마우스 20마리의 군들을 100 ×LD50EMCV으로 복막내 (ip) 감염시키고, 1시간 이후 및 이어서 하루에 한번 3일 동안 2 ㎍의 A42G, Q114H/V127D, K179E 변이된 IFNα-21 또는 야생형 IFNα-2 제제를 처치한다. 대조군은 부형제만으로 처치한 동물로 수행된다. 상기 동물들은 21일간 생존을 위해 매일 처리된다.
결과를 도 6에 나타내고, 이는 A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21로 처치된 마우스의 상대적인 생존율은 비-처치된 마우스의 생존율보다는 훨씬 더 높지만 야생형 IFNα-2으로 처치된 마우스에 대해 관찰된 것과는 유사하게 유지된다는 것을 나타낸다.
상기 결과 모두는 A42G, Q114H/V127D, 및 K179E 변이된 IFNα-21가 독특한 생물학적 특성을 보유한다는 것을 증명한다.

Claims (46)

  1. a) c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP (Single Nucleotide Polymorphism; 단일 뉴클레오티드 다형성)를 포함하는 뉴클레오티드 서열 1; 또는
    b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열
    의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a 및 a1204g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 서열 1의 670번 내지 1239번의 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, 2개의 코딩 SNP: Q114H 및V127D를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, 코딩 SNP: K179E를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 제1항의 폴리뉴클레오티드와 적합한 혼성화 조건하에 혼성화시키는 것을 포함하는, 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 동정 또는 증폭시키는 방법.
  8. 대상체 또는 대상체의 개체군의 게놈 DNA에 있어서 관심 영역을 증폭시키는 단계 및 794번, 973번, 1011번, 1049번, 1155번, 1204번 및 1265번으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 1내의 하나 이상의 위치의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부의 유전자형 결정 방법.
  9. 제8항에 있어서, 유전자형 결정을 미니서열분석 (minisequencing)에 의해 수행하는 방법.
  10. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제10항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제11항에 따른 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 폴리펩티드를 배양 배지로부터 분리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 분리 방법.
  13. 제1항의 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  14. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드.
  15. 제13항에 있어서, 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번의 아미노산을 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 폴리펩티드.
  16. 제13항에 있어서, 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번의 아미노산을 포함하고, 2개의 코딩 SNP: Q114H 및 V127D를 함유하는 폴리펩티드.
  17. 제13항에 있어서, 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번의 아미노산을 포함하고, 코딩 SNP: K179E를 보유하는 폴리펩티드.
  18. 제13항에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역화시키고, 면역특이적 항체를 상기 동물로부터 수집하는 것을 포함하는, 면역특이적 항체를 수득하는 방법.
  19. 제18항의 방법으로부터 생성된 면역특이적 항체.
  20. a) 제10항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 시험되는 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 폴리펩티드의 활성에 대한 활성화 또는 억제 효과를 측정함으로써 상기 활성화 또는 억제하는 제제를 동정하는 단계를 포함하는,
    아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드의 활성을 활성화 또는 억제하는 제제를 하나 이상의 시험되는 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  21. a) 제10항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 시험되는 화합물들과 접촉시키는 단계;
    c) 상기 제제의 활성에 대한 강화 또는 억제 효과를 측정함으로써 상기 강화 또는 억제되는 제제를 동정하는 단계를 포함하는,
    아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 단리된 폴리펩티드에 의해 활성이 강화 또는 억제되는 제제를 시험되는 하나 이상의 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  22. a) 대상체의 게놈에 있어서 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정하는 단계;
    b) 대상체에서 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 대상체에서 제13항에 따른 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정하는 단계;
    d) 대상체에서 제13항에 따른 폴리펩티드의 농도를 측정하는 단계; 및
    e) 대상체에서 제13항에 따른 폴리펩티드의 작용성을 측정하는 단계들 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하는, 대상체의 생물학적 특성을 분석하는 방법.
  23. c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포; 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G,Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드; 및 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 치료제.
  24. 치료 유효량의 제23항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 암 및 종양, 감염성 질환, 면역계 및 자가면역계 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암 및 종양이 전이된 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 비롯한 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 대사 질환이 비만을 비롯한 비-면역계 질환을 포함하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 감염성 질환이 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀을 비롯한 성병을 포함하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 중추 신경계 질환이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함하는 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 면역계 및 자가면역계 질환이 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 방법.
  30. 치료 유효량의 제23항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 상처 치유, 투석 환자에 있어서의 빈혈 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  31. c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 보유하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 치료받을 대상체로부터 수득될 수 있는, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포; 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 포함하는 단리된 폴리펩티드;상기 폴리펩티드에 특이적인 항체 중 하나 이상의 치료 유효량, 및 제약상 허용가능한 부형제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에 있어서 제13항에 따른 폴리펩티드의 활성을 증가 또는 감소시키는 방법.
  32. c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 보유하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열; 상기 폴리뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포; 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, A42G, Q102K, Q114H, V127D, C162stop 및 K179E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 포함하는 단리된 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적인 항체 중 하나 이상의 치료 유효량, 및 제약상 허용가능한 부형제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 개체의 게놈내의 제1항의 폴리뉴클레오티드의 존재와 연관된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  33. a) 개체군의 유전자형을 결정하는 단계;
    b) 상기 개체군내의 상기 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 분포를 측정하는 단계;
    c) 유전자형 데이터를 상기 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 분포와 비교하는 단계; 및
    d) 상기 비교를 통계학적으로 상대적인 관계에 대해 분석하는 단계를 포함하는,
    IFNα-21 유전자에 있어서, c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP와 질환 또는 당해 질환에 대한 내성 사이의 상대적인 관계를 통계학적으로 결정하는 방법.
  34. IFNα-21 유전자에 있어서, c794g, c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g 및 t1265c로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출하는 것을 포함하는, 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 예후를 진단 또는 결정하는 방법.
  35. a) 수지상 세포 성숙, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성, TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 비롯한, 상기 화합물의 생물학적 활성을 측정하는 단계;
    b) 상기 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성을 Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 비교하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 수행된 비교를 기초로, 상기 화합물이 Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 비교하여 실질적으로 유사한 활성을 보유하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    Q114H/V127D 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 화합물을 시험되는 하나 이상의 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 시험되는 화합물을 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 동정하거나, 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계하며, 상기 아미노산 서열은 Q114H 및 V127D SNP를 포함하는 방법.
  37. 제35항의 방법에 의해 동정된 화합물.
  38. a) 수지상 세포 성숙, CD4+ 또는 CD8+ T-림프구에 의한 시토킨 분비, 단핵구에 의한 시토킨 분비, 생체외 또는 생체내 항바이러스 활성, 다우디 버킷 세포주에 대한 세포성 항증식 활성, TF-1 세포주에 대한 세포성 항증식 활성을 비롯한, 상기 화합물의 생물학적 활성을 측정하는 단계;
    b) 상기 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성을 K179E 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 비교하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 수행된 비교를 기초로, 상기 화합물이 K179E 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 비교하여 실질적으로 유사한 활성을 보유하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    K179E 변이된 IFNα-21 유전자 산물의 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 화합물을 하나 이상의 시험되는 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 시험되는 화합물을 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 동정하거나, 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 24번 내지 189번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계하며, 상기 아미노산 서열은 K179E SNP를 포함하는 방법.
  40. 제38항의 방법에 의해 동정된 화합물.
  41. 치료 유효량의 제37항 또는 제40항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 암 및 종양, 감염성 질환, 면역계 및 자가면역계 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 암 및 종양이 전이된 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 모상 세포 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 및 만성 골수 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 비롯한 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 감염성 질환이 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀를 비롯한 성병을 포함하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 면역계 및 자가면역계 질환이 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 중추 신경계 질환이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함하는 방법.
  46. 제41항에 있어서, 상기 대사 질환이 비만을 비롯한 비-면역계 질환을 포함하는 방법.
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