KR20040032094A - 에리트로포이에틴 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및폴리펩티드 - Google Patents

에리트로포이에틴 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된, 신규한 SNP를 포함하는 신규한 폴리뉴클레오티드, 및 천연 야생형 EPO 단백질로부터 유래된, 본 발명의 하나 이상의 SNP에 의해 유발된 하나 이상의 변이를 포함하는 신규한 폴리펩티드뿐만 아니라 그들의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

에리트로포이에틴 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 {New Polynucleotides and Polypeptides of the Erythropoietin Gene}
관련 출원
본원의 부분들은 "Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene erythropoietine (EPO) ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques"라는 발명의 명칭으로 2001년 4월 4일에 출원된 프랑스 특허 출원 0104603호; "Erythropoietin Related Molecules and Single Nucleotide Polymorphisms"라는 발명의 명칭으로 2001년 12월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제60/343163호; "Modified Erythropoietin Related Molecules and Single Nucleotide Polymorphisms"라는 발명의 명칭으로 2002년 1월 4일에 출원된 미국 특허 출원 제60/345,440호; 및 "New Polynucleotides and Polypeptides of the EPO Gene"이라는 발명의 명칭으로 2002년 2월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제60/358,598호를 우선권으로 주장한다.
발명의 배경
이후 EPO로서 언급되는 에리트로포이에틴 유전자는 문헌 [Jacobs K. et al. (1985) "Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin"; Nature 313 (6005), 806-810]에 기재되어 있다.
상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 기탁번호 X02158로 진뱅크 데이터베이스에서 입수가능하다.
에리트로포이에틴 단백질은 적혈구생성의 선조 세포의 증식, 분화 및 성숙에 작용하는 것으로 공지되어 있다. 이는 그들의 적혈구로의 분화 및 성숙을 결정한다.
EPO는 또한 특정한 적백혈병 세포에 대해 자가분비 인자로서 작용하고 내피 세포에 대한 미토겐 및 화학유인물질인 것으로 공지되어 있다.
EPO는 활성화되고 분화된 B-세포를 자극하고 B-세포 면역글로불린 생성 및 증식을 증진시키는 것으로 공지되어 있다.
EPO 합성은 피드백 루프에서 신장 및 골수를 연결하는 복합체 제어 회로에 좌우된다. 합성은 정맥 산소 분압에 따라 좌우되고 저산소 상태하에 증가된다.
EPO 생산은 또한 다양한 기타 체액 인자, 예를 들어, 테스토스테론, 갑상선 호르몬, 성장 호르몬 및 카테콜라민에 의해 영향을 받는다. 대조적으로, 다수의시토킨, 예를 들어, IL-1, IL-6 및 TNF-알파는 EPO 합성을 감소시킨다.
세포에 있어서, EPO의 그의 수용체에 대한 결합은 다음을 유도한다:
- 막 인지질의 방출,
- 디아실 글리세롤의 합성,
- 세포내 칼슘 수준의 증가,
- 세포내 pH의 증가 및
- 세포내 포스포리파제 A2, 및 fos 및 myc 온코젠을 유도하는 포스포리파제 C의 증가.
과량의 EPO는 적혈구생성을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 이는 혈액 점도 및 심박출량의 증가를 수반하고, 또한 심부전증 및 폐 고혈압을 유도할 수 있다. 혈소판의 상당한 감소가 또한 관찰된다.
혈전증은 과량의 EPO의 또 다른 부작용이다.
폐 및 뇌 색전증, 즉 응혈 또는 혈액에 의해 수송되는 외래 화합물에 의한 혈관의 폐쇄는 또한 EPO 소모에 관련된 심각한 부작용을 야기한다.
그러나, 합성된 EPO의 양이 중증 신부전증의 경우에서와 같이 매우 낮은 경우에, 빈혈이 종종 관찰된다. 이와 같이, EPO는 종종 0.3 이하의 헤마토크리토로 중증 신부전증을 앓는 환자에게, 특히 투석 환자에게 투여된다.
EPO로의 치료에서의 가장 중요한 합병증은 과다긴장, 요소, 칼슘 및 인산염 수준의 증가, 혈액 점도의 증가, 혈전형성 선조 세포 및 순환 혈소판의 증대이다.
EPO는 또한 적혈구생성을 활성화시켜, 자가 공여 혈액을 수집하는데 사용된다.
더우기, EPO 사용이 또한, 예를 들어, 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 성장억제 약물 치료에 의해 유도된 비-신장형 빈혈에 대해 제안되어 있다.
어느 정도로 EPO는 거대핵세포형성의 자극 인자이다. EPO의 활성은 IL-4에 의해 상승작용된다.
EPO는 신경보호 능력을 갖는 것으로 간주되는데, 이는 EPO가 허혈에 의해 유도되는 세포 사멸에 대해 뉴런을 아마도 유리 라디칼 생성의 생성 및 산화성 스트레스 효과의 감소에 의해 보호하는 것으로 입증되었기 때문이다.
EPO 유전자는 다양한 인간 장애 및/또는 질환, 예를 들어, 다양한 암, 암종, 흑색종, 골수종, 종양, 백혈병, 간암, 경부암, 두부암 및 신장암과 같은 다양한 암; 심혈관 질환, 예를 들어, 뇌 손상; 비만과 같이 면역계와 관련없는 질환과 같은 대사 질환; 감염 질환, 특히 B형 및 C형 간염 및 AIDS와 같은 바이러스 감염; 폐렴; 궤양성 결장염; 중추 신경계 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병, 정신분열병 및 우울증; 조직 또는 기관 이식 거부반응; 상처 치유; 빈혈; 알레르기; 천식; 다발성 경화증; 골다공증; 건선; 류마티스 관절염; 크론병; 자가면역계 질환 및 장애; 생식기 또는 성병성 사마귀; 위장 장애; 및 화학요법 처치와 연관된 장애에 관여하는 것으로 공지되어 있다.
본 발명자들은 천연 야생형 EPO 단백질과는 상이한 작용성을 보유할 수 있는 EPO 유전자에 대한 신규한 폴리펩티드 및 신규한 폴리뉴클레오티드 유사체를 발견하였다.
이들 신규한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 이전에 언급된 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는데 특히 사용될 수 있고 그들에 관련된 단점들 전부 또는 일부를 피할 수 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 하나 또는 수개의 SNP (Single Nucleotide Polymorphism; 단일 뉴클레오티드 다형성)를 포함하는 점에 있어서, 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열과는 상이한 신규한 폴리뉴클레오티드를 첫 번째 목적으로 한다.
인간 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열 1은 3389개의 뉴클레오티드로 구성되고 뉴클레오티드 615번 (개시 코돈) 내지 뉴클레오티드 2763번(종결 코돈)의 2149개 뉴클레오티드의 코딩 서열을 포함한다.
EPO 유전자는 뉴클레오티드 서열 1 상의 위치가 다음과 같은 5개의 엑손으로 구성되어 있다:
엑손 1: 뉴클레오티드 397번 내지 뉴클레오티드 627번 (615번 위치에서 개시 코돈을 포함).
엑손 2: 뉴클레오티드 1194번 내지 뉴클레오티드 1339번.
엑손 3: 뉴클레오티드 1596번 내지 뉴클레오티드 1682번.
엑손 4: 뉴클레오티드 2294번 내지 뉴클레오티드 2473번.
엑손 5: 뉴클레오티드 2608번 내지 뉴클레오티드 3327번 (2763번 위치에서 종결 코돈 포함).
본 발명자들은 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 12종의 SNP를 동정하였다.
이들 12종 SNP는 다음과 같다: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a.
본 발명의 의미에 있어서, 상기 정의된 SNP의 위치지정에 상응하는 번호매김은 뉴클레오티드 서열 1의 번호매김과 관련된 것으로 이해된다.
문자 a, t, c 및 g는 각각 질소 염기 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌에 해당한다.
첫 번째 문자는 야생형 뉴클레오티드에 해당하는 반면, 마지막 문자는 변이형 뉴클레오티드에 해당한다.
이와 같이, 예를 들어, SNP g1644a는 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열 1의 1644번 위치에서의 뉴클레오티드 g (구아닌)의 뉴클레오티드 a (아데닌)으로의 변이에 해당한다. SNP 465-468 (결실)은 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열 1의 465 내지 486번 위치의 22개 뉴클레오티드가 결실된 변이에 해당한다.
이들 SNP는, 참고문헌으로 본원에 인용된, "Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applications"라는 발명의 명칭으로 2000년 12월 6일에 출원된 출원인의 특허 출원 FR 제00 22894호에 기재된 결정 방법을 이용하여 본 출원인에 의해 동정되었다.
상기 특허 출원에 기재된 방법은 무작위 개체군으로부터 하나 이상의 개체에있어서 하나 (또는 수 개)의 이전에 존재하던 SNP(s)의 동정을 가능하게 한다.
본 발명의 범위내에서, 예를 들어, 코딩 서열을 포함하는 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열의 단편을 무작위로 선택된 개체군에서 상이한 개체들로부터 단리하였다.
이들 단편의 서열분석은 DHPLC ("Denaturing-High Performance Liquid Chromatography (변성 고성능 액체 크로마토그래피)")에 의한 분석 후에 헤테로듀플렉스 프로필 (이는 참조 야생형 EPO 유전자 서열의 것과는 상이한 프로필이다)을 갖는 특정한 상기 샘플들에 대해 이어서 수행하였다.
상기 방법으로 서열분석된 단편을 이어서 참조 야생형 EPO 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열과 비교하고 본 발명에 따른 SNP를 동정하였다.
이와 같이, SNP는 천연적이며 그들 각각은 세계 인구 중 특정한 개체들에 존재한다.
참조 야생형 EPO 유전자는 아미노산 서열 2에 해당하는 193개 아미노산의 미성숙 단백질을 코딩하며, 이는 처음 27개의 아미노산을 포함하는 시그널 펩티드의 절단에 의해 166개 아미노산의 성숙 단백질로 전환될 것이다.
천연 야생형 EPO 단백질의 구조는 A, B, C 및 D로 불리는 4종의 헬릭스를 포함한다. EPO 수용체와 착체화된 EPO 수용체의 결정 구조는 단지 3종의 헬릭스 A, C 및 D만이 그의 수용체와의 EPO 결합에 관여하는 것을 지시한다 [Syed et al. (1998)]. 시토킨 수용체를 통한 시그널링의 효능은 수용체 배향에 따라 결정적으로 좌우된다 [Nature 395: 511-516]. 또한, EPO의 활성 부위를 연구하는 부위 지시된 돌연변이유발은 헬릭스 B에 위치된 아미노산에서의 변화가 EPO 활성에 대해 제한된 효과를 갖는 것을 입증한다[ Eliott et al. (1997). Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin. Blood. 89: 493-502; Wen et al. (1994). Erythropoietin structure-function relationships. Identification of functionally important domains. J. Biol. Chem. 269: 22839-22846].
본 발명의 각 코딩 SNP, 즉: g1644a, g2357a 및 c2621g는 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열의 수준으로 변형을 유발한다.
아미노산 서열에 있어서 이들 변형은 다음과 같다:
SNP g1644a는 아미노산 서열 2에 해당하는 EPO 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 70번 위치 및 성숙 단백질의 43번 위치에서 아미노산 아스파르트산 (D)의 아스파라긴 (N)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해 코딩되는 변이를 D43N 또는 D70N으로 부를 것이다.
코딩 SNP g2357a는 아미노산 서열 2에 해당하는 EPO 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 104번 위치 및 성숙 단백질의 77번 위치에서 아미노산 글리신 (G)의 세린 (S)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해 코딩되는 변이를 G77S 또는 G104S로 부를 것이다.
코딩 SNP c2621g는 아미노산 서열 2에 해당하는 EPO 유전자의 미성숙 단백질에 있어서 147번 위치 및 성숙 단백질의 120번 위치에서 아미노산 세린 (S)의 시스테인 (C)으로의 변이를 유발한다. 본 발명의 기재에 있어서, 성숙 단백질 또는 미성숙 단백질을 각각 언급하는지에 따라서 상기 SNP에 의해 코딩되는 변이를 S120C 또는 S147C로 부를 것이다.
코딩 SNP: g1664a, g2357a 및 c2621g는 야생형 참조 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 공간적 입체형태의 변형을 유발한다.
이들 변형은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법에 따라서, 예를 들어, 신규한 모델링 기술 (예를 들어, SEQFOLD/MSI), 상동화 (예를 들어, MODELER/MSI), 역장의 최소화 (예를 들어, DISCOVER, DELPHI/MSI) 및/또는 분자 역학 (예를 들어, CFF/MSI)을 이용하는 컴퓨터 분자 모델링에 의해 관찰할 수 있다.
상기 모델의 예는 이후 실험부에 기재되어 있다.
1/ 컴퓨터 분자 모델링은 변이형 성숙 단백질 상의 변이 D43N이 EPO 단백질의 헬릭스 A와 헬릭스 B 사이에 위치하는 루프의 구조 변형, 및 P129 내지 I133C 아미노산의 영역에서 EPO 단백질의 헬릭스 C와 D에 연결되는 긴 루프의 구조에서의 변이를 포함하는 것으로 제시한다. 이들 잔기는 변이형 아미노산 N43의 전방에 위치한다. 이러한 변이는 EPO 수용체에의 결합에 관여하는 짧은 헬릭스 F48-R53 근처에 위치하기 때문에, 이는 EPO 단백질과 그의 수용체와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. D43 잔기는 전체 EPO 오르토로그에서 고도로 보존된다. 이는 EPO 오르토로그에서 또한 보존되는, 양으로 하전된 잔기 (K45, R131)를 갖는 염 가교를형성할 수 있다.
이와 같이, 변이형 단백질은 야생형 EPO 유전자에 의해 코딩되는 천연 야생형 EPO 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 또한 43번 위치에서의 아스파라긴 아미노산의 존재가 천연 야생형 EPO 단백질의 구조 및 기능의 상당한 변형을 포함하는 것으로 예시한다.
2/ 컴퓨터 분자 모델링은 성숙 변이형 단백질 상의 변이 G77S는 헬릭스 D 상의 183번 위치에서의 페닐알라닌 잔기로의 입체 장애에 의해 및 친수성 아미노산 (77번 위치에서의 세린) 및 헬릭스 A와 헬릭스 B 사이의 루프 상의 소수성 아미노산 (35번 위치에서의 로이신) 사이의 바람직하지 못한 상호작용에 의해 유발되는 헬릭스 B의 C-말단의 전체 언폴딩을 포함한다. G77 잔기는 야생형 단백질 구조에 매립되어 있다.
이와 같이, 변이형 단백질은 야생형 EPO 유전자에 의해 코딩되는 천연 야생형 EPO 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 또한 특히 EPO의 그의 수용체에 대한 친화성을 변경함으로써 77번 위치에서의 아스파라긴 아미노산의 존재가 천연 야생형 EPO 단백질의 구조 및 기능의 상당한 변형을 포함하는 것으로 예시한다.
3/ 컴퓨터 분자 모델링은 성숙 변이형 분자 상의 변이 S120C가 헬릭스 C와 헬릭스 D 사이, 특히 116번 위치에서의 리신 및 125번 위치에서의 알라닌 사이의 루프 상에 위치하는 구조 변형을 포함한다. 아생형 EPO 단백질 구조내의 S120과K116 잔기 사이의 수소 결합은 변이형 단백질 구조에서 파괴된다.
이와 같이, 변이형 단백질은 야생형 EPO 유전자에 의해 코딩되는 천연 야생형 EPO 단백질과는 상이한 삼차원 입체형태를 보유한다.
컴퓨터 분자 모델링은 또한 120번 위치에서의 아스파라긴 아미노산의 존재가 천연 야생형 EPO 단백질의 구조 및 기능의 상당한 변형을 포함하는 것으로 예시한다.
본 발명에 따른 기타 SNP, 즉: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g2228a, c2502t, g2634a는 아미노산 서열 2의 수준으로 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 변형을 포함하지 않는다.
SNP: c1288t, t1607c, g2634a는 잠재성이며, SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1347t, g2228a, c2502t는 비-코딩된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 유전자형 결정은 이들 폴리뉴클레오티드의 대립형질 빈도를 결정하기 위한 방식으로 수행될 수 있다. 유전자형 결정의 2가지 예는 SNP: g1644a 및 c2621g에 대해 이후 실험부에 기재된다.
본 발명의 폴리펩티드의 작용성 측정은 하기 문헌에 기재된 프로토콜에 따라 그들의 생물학적 활성의 시험에 의해 또한 수행될 수 있다:
- Bittorf et al.; "Rapid activation of the MAP kinase pathway in hematopoietic cells by erythropoietin, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3"; Cell Signal; 1994; Mar; 6 (3): 305-11.
- Chretien et al.; "Erythropoietin-induced erythroid differentiation ofthe human erythroleukemia cell line TF-1 correlates with impaired STAT5 activation"; EMBO J.; 1996 Aug 15; 15 (16): 4174-81.
- Porteu et al.; "Functional regions of the mouse thrombopoietin receptor cytoplasmic domain: evidence for a critical region which is involved in differentiation and can be complemented by erythropoietin"; Mol. Cell. Biol.; 1996 May; 16 (5): 2473-82.
- Pallard et al.; "Thrombopoietin activates a STAT5-like factor in hematopoietic cells"; EMBO J.; 1995 Jun 15; 14 (12): 2847-56.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도뿐만 아니라, 특히 특정한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 및 치료를 위한, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드로부터 출발하여 수득되고/되거나 동정된 치료학적 분자의 용도를 목적으로 한다.
이러한 분자는 특히 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 예방하거나 치료하고, 뇌 손상을 예방하는데 특히 유용하다.
이러한 분자는 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키는데 보다 특히 유용하다.
본 발명은 에리트로포이에틴 유전자 (EPO)의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된, 신규한 SNP를 포함하는 신규한 폴리뉴클레오티드, 및 천연 에리트로포이에틴 단백질로부터 유래된, 상기 SNP에 의해 유발된 변이를 포함하는 신규한 폴리펩티드뿐만 아니라 그들의 치료 용도에 관한 것이다.
도 1A는 SNP D70N 및 천연 야생형 에리트로포이에틴을 포함하는 본 발명에따르는 코딩된 단백질의 모델링을 제시한다. 도 1B는 변이형 및 야생형 단백질의 우측부의 모델링을 제시한다.
도 1A 및 1B에 있어서, 흑색 리본은 천연 야생형 에리트로포이에틴 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 변이된 에리트로포이에틴 (D70N)의 구조를 제시한다.
도 2A는 SNP G104S 및 천연 야생형 에리트로포이에틴을 포함하는 본 발명에 따르는 코딩된 단백질의 모델링을 제시한다. 도 2B는 변이형 및 야생형 단백질의 내부의 모델링을 제시한다.
도 2A 및 2B에서, 흑색 리본은 천연 야생형 에리트로포이에틴 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 변이된 에리트로포이에틴 (G104S)의 구조를 제시한다.
도 3A는 SNP S147C 및 천연 야생형 에리트로포이에틴을 포함하는 본 발명에 따르는 코딩된 단백질의 모델링을 제시한다. 도 3B는 변이형 및 야생형 단백질의 상부 좌측부의 모델링을 제시한다.
도 3A 및 3B에서, 흑색 리본은 천연 야생형 에리트로포이에틴 단백질의 구조를 나타내고, 백색 리본은 변이된 에리트로포이에틴 (S147C)의 구조를 제시한다.
도 4는 인간 에리트로포이에틴 수용체로 안정하게 형질감염된 32D 마우스 세포주로부터의 세포의 증식에 대한 G104S 변이된 에리트로포이에틴 및 야생형 에리트로포이에틴 (단백질 추출물에 함유)의 효과를 제시한다. 도 4A 및 4B는 2가지 독립적인 실험으로부터의 결과를 각각 제시한다.
도 5는 인간 에리트로포이에틴 수용체로 안정하게 형질감염된 32D 마우스 세포주로부터의 세포의 증식에 대한 정제된 G104S 변이된 에리트로포이에틴 및 정제된 야생형 에리트로포이에틴의 효과를 제시한다. 도 5A 및 5B는 2가지 독립적인 실험으로부터의 결과를 각각 제시한다.
도 6은 G104S 변이된 에리트로포이에틴 (백색 삼각형) 또는 야생형 에리트로포이에틴 (흑색 사각형)에 의한 자극 후의 적혈구 콜로니 형성을 제시한다.
도 7은 인간 EPO 수용체의 외부에의 G104S 변이된 에리트로포이에틴 (원형) 및 야생형 에리트로포이에틴 (별모양)의 결합 능력을 제시한다. 에리트로포이에틴의 2가지 농도로 수득된 데이터가 제시되어 있다: 백색의 경우 7.5 nM 및 흑색의 경우 15 nM.
정의
"참조 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열"은 기탁번호 X01258로 진뱅크에서 입수가능하고 문헌 [Jacobs K. et al.; "Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin"; Nature 313 (6005), 806-810 (1985)]에 기재되어 있는 인간 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열 1로서 해석된다.
"천연 야생형 EPO 단백질"은 참조 야생형 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 성숙 단백질로서 해석된다. 천연 야생형 미성숙 단백질 EPO는 펩티드 서열 2에 해당한다.
"폴리뉴클레오티드"는 변형 또는 비-변형 DNA 또는 RNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로서 해석된다.
용어 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어, 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 하나 또는 여러 개의 일본쇄 영역(들) 및 하나 또는 여러 개의 이본쇄 영역(들)의 혼합물로 구성된 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 및 하나 또는 여러 개의 일본쇄 영역(들) 및 하나 또는 여러 개의 이본쇄 영역(들)의 혼합물로 구성된 RNA가 포함된다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 또는 수 개의 삼본쇄 영역(들)을 포함하는 RNA 및/또는 DNA를 포함할 수 있다. 안정성을 이유로 또는 다른 이유로 골격을 변형시키는 방식으로 하나 또는 여러 개의 변형된 염기를 함유하는 DNA 및 RNA는 또한 폴리뉴클레오티드로 해석된다. 예를 들어, 이노신과 같은 비정상적인 염기도 변형된 염기로 해석된다.
"폴리펩티드"는 펩티드, 올리고펩티드, 올리고머 또는, 예를 들어, 등입체성 펩티드의 경우에서와 같이, 정상 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 단백질로 해석된다.
폴리펩티드는 유전자 코드로 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 당업자에게 익히 공지되어 있는, 해독 후 성숙 공정과 같은 천연 공정들에 의해 또는 화학적 공정들에 의해 변형된 아미노산으로 구성될 수 있다. 이들 변형은 문헌에 충분히 상세하게 기재되어 있다. 이들 변형은 폴리펩티드의 어느 곳에서나: 펩티드 골격에서, 아미노산 쇄에서 또는 카르복시- 또는 아미노-말단에서도 나타날 수 있다.
폴리펩티드는 우비퀴틴화에 따라서 측쇄화될 수 있거나, 측쇄화되거나 측쇄화되지 않으면서 고리화될 수 있다. 상기 유형의 변형은 당업자에게 익히 공지되어 있는 천연 또는 합성의 해독 후 공정의 결과일 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드 변형으로는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 고정, 헴의 공유 고정, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유 고정, 공유 또는 비공유 가교결합, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 페길화를 비롯한 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 공정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 세넬로일화, 술페이트화, 아르기닐화 또는 우비퀴틴화와 같은 아미노산 첨가가 포함되는 것으로 해석된다. 이들 변형은 문헌 [PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ndEd., T. E. Creighton, New York, 1993], 문헌 [POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983], 문헌 [Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646] 및 문헌 [Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62]에 충분히 상세하게 기재되어 있다.
"하이퍼글리코실화 폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체"는 아미노산 서열이 하나 이상의 추가의 글리코실화 부위를 보유하도록 하는 방식으로 변형된 폴리펩티드 또는 동일한 아미노산 서열을 가지지만 글리코실화 수준이 증가된 폴리펩티드로서 해석된다.
"단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 인간 신체로부터 단리되거나 이와는 달리 기술적 방법에 의해 생산된 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서 각각 해석된다.
"상동성"은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 상동성의 척도로서 해석된다. 상동성은 당업자에게 이미 공지된 용어이고 문헌에 충분히 기재되어 있다. 문헌 [COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998]; 문헌 [BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌 [COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994]; 및 문헌 [SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987]을 참조한다.
두 서열 사이의 상동성 및 유사성을 측정하기 위해 통상적으로 이용되는 방법들은 문헌에 충분히 기재되어 있다. 문헌 [GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994] 및 문헌 [Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073]을 참조한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열 1과 95% 이상의 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열과 비교하여 100개의 뉴클레오티드에 대해 많아야 5점의 변이를 함유하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 변이점은 하나 (또는 수 개)의 뉴클레오티드(들) 중 하나 (또는 수 개의) 치환(들), 첨가(들) 및/또는 결실(들)일 수 있다.
동일한 방법으로, 예를 들어, 아미노산 서열 2와 95% 이상의 상동성을 보유하는 폴리펩티드는, 상기 서열과 비교하여 100개의 아미노산에 대해 많아야 5점의 변이를 함유하는 폴리펩티드이다.
상기 변이점은 하나 (또는 수 개)의 아미노산(들) 중 하나 (또는 수 개의) 치환(들), 첨가(들) 및/또는 결실(들)일 수 있다.
뉴클레오티드 서열 1 또는 아미노산 서열 2의 각각과 전체적으로 동일하지는 않은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 상기 서열이 본 발명의 SNP 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되고, 상기 서열들의 변형체로서 간주된다.
통상적으로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 SNP 중 하나 이상을 포함하는 뉴클레오티드 서열 1과 동일하거나 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 보유한다.
유사하게는, 통상적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명의 코딩 SNP 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열 2와 동일하거나 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 보유한다.
변형체는, 본 발명에 따르면, 예를 들어, 위치-지시된 돌연변이유발 또는 직접 합성에 의해 수득될 수 있다.
"SNP"는 뉴클레오티드 서열에 있어서 염기의 임의의 천연 변이로 이해된다. 뉴클레오티드 서열 상에서 SNP는 코딩되거나 잠재성이거나 비-코딩될 수 있다.
코딩 SNP는 본 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 있어서 아미노산의 변형을 포함하는 당해 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 포함된 다형성이다. 상기 경우에 있어서, 용어 SNP는, 연장에 의한, 아미노산 서열에 있어서의 변이에도 적용된다.
잠재성 SNP는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 있어서 아미노산의 변형을 포함하지 않는 당해 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 포함된 다형성이다.
비-코딩 SNP는 뉴클레오티드 서열의 비-코딩 서열에 포함된 다형성이다. 이러한 다형성은 인트론, 스플라이싱 영역, 전사 프로모터 또는 인핸서 부위 서열에서 현저하게 발견될 수 있다.
"작용성 SNP"는 작용성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 포함되는, 상기 정의된 바와 같은 SNP로 해석된다.
"작용성"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 활성으로 이해된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 작용성은 야생형 참조 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 생물학적 활성의 보존, 증가, 감소 또는 억제를 구성할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 작용성은 또한 참조 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 생물학적 활성의 특성에 있어서의 변화를 구성할 수 있다.
생물학적 활성은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 수용체의 친화성 또는 친화성의 부재와 현저하게 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은
a) 다음의 코딩 SNP: g1644a, g2357a, c2621g 중 하나 이상을 포함하는 것으로 이해되는, 서열 1 또는 그의 코딩 서열 (뉴클레오티드 615번 내지 뉴클레오티드 2763번)와 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성 및 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 보유하는 뉴클레오티드 서열, 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 첫 번째 목적으로 한다.
본 발명은 또한
a) 다음의 코딩 SNP: g1644a, g2357a, c2621g 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 1 또는 그의 코딩 서열로 구성되고, 상기 서열 각각은 다음의 코딩 SNP: g1644a, g2357a, c2621g 중 하나 이상을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따라서, 이전에 정의된 폴리뉴클레오티드는 g1644a, g2357a 및c2621g로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일 코딩 SNP를 포함한다.
상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 또한 다음의 비-코딩 및 잠재성 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g2228a, c2502t, g2634a 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한
a) 다음의 비-코딩 또는 잠재성 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g2228a, c2502t, g2634a 중 하나 이상을 포함하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 경우에 따라 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 그의 목적으로 한다.
다음의 잠재성 SNP: c1288t, t1607c, g2634a는 뉴클레오티드 서열 1의 코딩 서열에 위치하는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한
a) 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 경우에 따라 그의 코딩 서열 또는
b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 일부로 구성되며,
10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산의 서열 2에 있어서 28번 및 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 그의 목적으로 하며,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 다음의 코딩 SNP: D70N, G104S, S147C 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해된다.
본 발명의 취지내에서, D70N, G104S, S147C SNP의 위치에 해당하는 번호매김은 아미노산 서열 2의 번호매김에 관련된 것으로 이해된다.
본 발명의 바람직한 목적에 따르면, 이전에 정의된 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이 단일 코딩 SNP를 함유한다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 또한 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 그의 목적으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자로 구성된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 표준 DNA 또는 RNA 합성 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1 상의 각 SNP에 대해 변이형 뉴클레오티드에 의해 야생형 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 출발하는 위치-지시된 돌연변이유발에 의해 또한 수득될 수 있다.
예를 들어, SNP g2357a를 포함하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1 상의 2357번 위치에서 뉴클레오티드 g를 변형시킴으로써 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 출발하는 위치-지시된 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
상기 방법으로 수행될 수 있는 위치-지시된 돌연변이유발은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 문헌 [TA Kunkel in 1985 in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:488]이 특히 언급될 수 있다.
단리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 프리-, 프로- 또는 프리-프로-단백질 아미노산 서열, 또는 헥사-히스티딘 펩티드와 같이, 마커 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 다른 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 결합되어 융합 단백질 또는 다른 정제 산물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, 전사되거나 비-전사된 서열, 해독되거나 비-해독된 서열, 스플라이싱 시그널 서열, 폴리아데닐화 서열, 리보좀 결합 서열 또는 심지어 mRNA를 안정화시키는 서열과 같이, 5' 및/또는 3' 비-코딩 서열과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 것으로 정의된다.
"엄격한 혼성화 조건"은 일반적으로 뉴클레오티드 서열이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 보유하는 경우에 혼성화를 가능하게 하는 화학적 조건으로서 이해되지만 반드시 그러한 것은 아니다.
엄격한 조건은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라서 및, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5×SSC (150 mM의 NaCl, 15 mM의 시트르산삼나트륨), 50 mM의 인산나트륨 (pH=7.6), 5×덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 ㎍ 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에, 42℃에서, 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션한 다음, 65℃에서 0.1×SSC로 필터를 세척함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 취지내에서, 엄격한 혼성화 조건이 100%와 같은 상동성을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 가능하게 하는 경우, 뉴클레오티드 서열은 a)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 엄격하게 상보적인 것으로 간주된다.
뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 따른 항-센스 SNP를 하나 이상 함유하는 것으로 본 발명의 의미내에서 이해된다.
이와 같이, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열이 SNP g1644a를 포함하는 경우, 그의 상보적인 뉴클레오티드 서열은 1644번 위치와 동등한 위치에서 t 뉴클레오티드를 포함한다.
SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 동정, 혼성화 및/또는 증폭
본 발명은 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t,t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상을 함유하는 것으로 이해되는, 뉴클레오티드 서열 1 또는 경우에 따라 그의 (뉴클레오티드 615번 내지 뉴클레오티드 2763번) 코딩 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 동정, 혼성화 및/또는 증폭시키기 위한 상기 정의된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부의 용도를 그의 목적으로 한다.
유전자형 결정 및 SNP의 빈도 결정
본 발명은 EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열과 90 내지 100% 상동성을 보유하고 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 유전자형 결정을 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부의 용도를 그의 목적으로 한다.
본 발명에 따르면, 유전자형 결정은 개체별로 또는 개체군에 대해 수행될 수 있다.
본 발명의 의미내에서, 유전자형 결정은 개체 또는 개체군의 유전자형의 결정 방법으로서 정의된다. 유전자형은 하나 이상의 특정 위치에 존재하는 대립형질 인자로 구성된다.
"개체군"은 무작위 또는 비-무작위 방식으로 선택된 결정된 개체들의 군으로서 해석된다. 상기 개체들은 인간, 동물, 미생물 또는 식물일 수 있다.
통상적으로, 개체군은 10명 이상의 사람, 바람직하게는 100 내지 300명의 사람을 포함한다.
개체는 그들의 민족성에 따라서 또는 그들의 표현형에 따라서 선택될 수 있고, 특히 다음의 장애 및/또는 질환을 앓고 있는 개체들이다: 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 연관된 장애.
상기 암 및 종양은 암종, 예를 들어, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키기 위한 치료 화합물의 제조에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 작용성 SNP는 바람직하게 개체군에서 유전자형이 결정된다.
SNP를 유전자형 결정하기 위해 수행될 수 있는 다수의 기술들이 존재한다 [참조: Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"]. 이들 기술은 다음의 4가지 원칙들 중 하나에 기초하고 있다: 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 선택적으로 디데옥시뉴클레오티드에 의한 올리고뉴클레오티드 신장, 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드의 연결 또는 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드의 절단. 상기 방법들 중 각각은 직접 또는 편광된 형광의 측정 또는 질량 분광계와 같은 검출 시스템과 연결할 수 있다.
유전자형 결정은 특히 편광된 형광 스캐너와 연결된, 핫 ddNTP (상이한 형광체로 표지된 2개의 상이한 ddNTP) 및 콜드 ddNTP (표지되지 않은 2개의 상이한 ddNTP)로 미니서열분석에 의해 수행할 수 있다. 편광된 형광을 판독하는 미니서열분석 프로토콜 (FP-TDI Technology 또는 Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation)은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
이는 각 개체의 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭 후 수득된 산물 상에서 수행할 수 있다. 상기 PCR 산물은 연구된 SNP를 함유하는 폴리뉴클레오티드 유전자 영역을 포함하기 위해 선택한다. PCR 써모사이클러에서 최종 단계 후, 플레이트를 형광체 특이적 여기 및 방출 필터를 사용하여 표지된 염기들을 판독하기 위한 편광된 형광 스캐너 상에 위치시킨다. 표지된 염기의 강도 수치는 그래프 상에 기록한다.
PCR 증폭을 위해, 본 발명의 SNP의 경우에, 센스 및 안티센스 프라이머는 각각 본 발명의 SNP의 위치에 따라서 당업자에 의해 용이하게 선택할 수 있다.
예를 들어, 서열이 SNP: g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및/또는 g2634a를 포함하는 단편의 PCR 증폭을 위한 센스 및 안티센스 뉴클레오티드 서열은 각각 다음과 같을 수 있다:
서열 3: 센스 프라이머 (A): TTGCATACCTTCTGTTTGCT
서열 4: 안티센스 프라이머 (B): CACAAGCAATGTTGGTGAG
이들 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 1에 있어서, 뉴클레오티드 2192번 내지 뉴클레오티드 2817번의 626개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단편의 증폭을 가능하게 한다.
개체군에서 SNP를 포함하는 유전자에 의해 코딩되는 각 대립형질의 빈도 (대립형질 빈도)의 통계적 분석을 이어서 수행하고, 이는 상이한 아집단 및 특히, 경우에 따라, 상기 개체군을 구성하는 다양한 인종 집단에 있어서 그들의 영향 및 그들의 분포의 중요성의 결정을 가능하게 한다.
유전자형 결정 데이터는 연구된 개체군에서 관찰된 상이한 대립형질의 분포 빈도를 측정하기 위해 분석된다. 대립형질 빈도의 계산은 SAS-suite (등록상표)(SAS) 또는 SPLUS (등록상표)(MathSoft)와 같은 소프트웨어의 도움으로 수행될 수 있다. 개체군의 상이한 인종 집단을 교차하는 본 발명의 SNP의 대립형질 분포의 비교는 소프트웨어 ARLEQUIN (등록상표) 및 SAS-suite (등록상표)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 한 개체에 있어서 EPO 뉴클레오티드 서열에서 한 변이의 연구를 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
유전자 마커로서의 본 발명의 SNP
유전자의 기능적 서열 (예를 들어, 프로모터, 스플라이싱 부위, 코딩 영역)을 변형시키는 SNP는 질환 감수성 또는 내성에 직접적으로 관련되기 쉬운 반면, 모든 SNP (기능적이든 아니든)는 상기 질환 상태에 관련된 하나 또는 수 개의 유전자의 동정을 위한 중요한 마커를 제공할 수 있고, 결과적으로 상기 질환 상태에 간접적으로 관련될 수 있다 [참조: Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22: 231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1: 39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899].
이와 같이, 본 발명은 또한 EPO 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상을 포함하는 데이터뱅크에 관한 것이다.
상기 SNP는 뉴클레오티드 서열 1에 따라서 번호매김된 것으로 해석된다.
이러한 데이터뱅크는 하기 (i)과 (ii) 사이의 통계학적 상관 관계를 결정하기 위해 분석할 수 있다:
(i) EPO 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상, 및
(ii) 질환 또는 당해 질환에 대한 내성.
본 발명은 또한 질환 또는 당해 질환에 대한 내성에 대한 진단/예후 키트를 개발하기 위한, EPO 유전자의 폴리뉴클레오티드에 있어서 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나 이상의 용도에 관한 것이다.
상기 정의된 바와 같은 본 발명의 SNP는 질환 또는 당해 질환에 대한 내성에 직접 또는 간접적으로 연관될 수 있다.
바람직하게는, 상기 질환은 위에서 언급된 바와 같이 정의된 것들일 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 백터를 그의 목적으로 한다.
예를 들어, 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은, 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 특히, 사용된 재조합 벡터는 세균성 플라스미드, 트랜스포손, 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종 바이러스, 백신 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.
이들 재조합 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrooket al., 2ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]에 기재된 바와 같이, 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 의해 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 발현의 조절을 제어하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 및 전사 및 본 발명의 폴리펩티드의 해독을 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이들 서열은 사용된 숙주 세포에 따라서 선택된다.
따라서, 예를 들어, 적합한 분비 시그널이 재조합 벡터에 통합될 수 있으므로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 세포질 망상의 내강으로, 원형질막 주위 공간으로, 세포막 상에 또는 세포외 환경으로 지시될 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 목적으로 한다.
숙주 세포에 재조합 벡터의 도입은 인산칼슘에 의한 형질감염, DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염, 양이온성 지질에 의한 형질감염, 전기천공법, 형질도입 또는 감염과 같이, 문헌 [BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY, Daviset al., 1986] 및 문헌 [MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 상동]에 기재된 바와 같은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 수행될 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들어, 스트렙토코커스 (streptococci), 스타필로코커스 (staphylococci), 이. 콜라이 (E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 세균 세포, 효모 세포 및 아스페르길루스 (Aspergillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces)의 세포와 같은 진균류의 세포, 드로소필리아 (Drosophilia) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9의 세포와 같은 곤충 세포, CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 세포 및 치료할 대상체의 인간 세포와 같은 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들어, 이후 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위해 또는 제약 조성물에서의 활성 산물로서 사용될 수 있다.
폴리펩티드
본 발명은 또한 하기 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성 및 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 함유하는 단리된 폴리펩티드를 목적으로 한다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 28번 위치와 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 다음의 코딩 SNP: D70N, G104S, S147C 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 하기 서열을 함유할 수 있다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 28번 위치와 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 다음의 코딩 SNP: D70N, G104S, S147C 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
본 발명의 폴리펩티드는 보다 특히 다음으로 구성될 수 있다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 28번 위치와 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 함유하는 아미노산 서열,
a) 및 b)의 아미노산 서열 각각은 다음의 코딩 SNP: D70N, G104S, S147C 중 하나 이상을 함유하는 것으로 해석된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일 코딩 SNP를 함유한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 28번 내지 아미노산 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유한다.
본 발명은 또한 치료 특성을 향상시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 페길화 유사체에 관한 것이다.
실제로, 다당류 성분이 물리적 안정화, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약동학 및 특이적 생물학적 활성의 효능을 포함한 치료학적 당단백질의 효능에 관련된 특성에 상당히 영향을 미치는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다 [참조예: Dube et al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988); Delorme et al. Biochemistry 31, 9871-9876 (1992)]. 인간 야생형 뇨 유래된 EPO 및 재조합 야생형 인간 EPO는 함께 당단백질의 전체 분자량의 약 40%를 구성하는 3개의 N-결합된 다당류 쇄 및 1개의 O-결합된 다당류 쇄를 함유하므로, 단백질 상의 탄수화물 쇄의 수를 증가시키는 것이 여전히 가능하다. 다음을 포함한, 단백질 상의 탄수화물 쇄의 수를 증가시키기 위한 기법은 당업자에게 익히 공지되어 있다:
- 아미노산 잔기 치환 또는 부가를 발생시키는 부위-지시된 돌연변이유발을 이용하는 글리코실화에 대해 이용가능한 신규한 부위의 도입 [참조예: 공개 공보 제20020037841호로 공개된 EP0640619 및 미국 특허 제09/853731호].
- WO9954342 출원에 의해 제안된, 관심 단백질을 코딩하는 핵산 및 당단백질-개질 글리코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 보유하는 숙주 세포를 이용함으로써 단백질의 글리코실화 조작.
본 발명은 또한 상기 정의된 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고 상기 폴리펩티드를 상기 배양 배지로부터 단리하는, 상기된 폴리펩티드의 제조 방법을 그의 목적으로 한다.
폴리펩티드는 염, 특히 황산암모늄, 에탄올, 아세톤 또는 트리클로로아세트산과 같은 카오트로픽 제제에 의한 침전법; 산 추출법; 이온 교환 크로마토그래피; 포스포셀룰로스 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피; 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 배제 크로마토그래피와 같은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라서, 숙주 세포의 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
"배양 배지"는 본 발명의 폴리펩티드가 단리 또는 정제되는 배지로서 이해된다. 상기 배지는 세포외 배지 및/또는 세포성 용해질로 구성될 수 있다. 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들은, 상기 폴리펩티드의 입체형태가 단리 또는 정제동안 변경될 경우, 상기 폴리펩티드에 활성 입체형태를 복귀시키도록 한다.
항체
본 발명은 또한 면역특이적 항체를 수득하는 방법을 그의 목적으로 한다.
"항체"는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단순 쇄, 인간화된 항체뿐만 아니라 Fab 단편, 예를 들어, Fab 또는 면역글로불린 발현 라이브러리 산물로서 이해된다.
면역특이적 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역화시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 바와 같은, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 면역특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 그의 단편들 중 하나, 유사체, 그의 변형체 중 하나 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 세포가 또한 면역특이적 항체들을 생성하는데 사용될 수 있다.
용어 "면역특이적"은 항체가 선행 기술에서 공지된 다른 폴리펩티드보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해 더 우수한 친화성을 보유한다는 것을 의미한다.
면역특이적 항체들은, 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법에 따라, 본 발명의 폴리펩티드, 그의 단편들, 유사체 또는 에피토프 단편 중 하나 또는 포유류, 바람직하게는 인간이 아닌 포유류에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 세포의 투여에 의해 수득될 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 세포주로부터 출발하는, 하이브리도마 방법 [Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497], 트리오마 방법, 인간 B 세포 하이브리도마 방법 [Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72] 및 EBV 하이브리도마 방법 [Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985]과 같은, 항체 생성을 위한 전형적인 방법들이 사용될 수 있다.
예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 바와 같은 일본쇄 항체 생성의 방법도 사용될 수 있다.
예를 들어, 마우스와 같은 트랜스제닉 동물도 인간화된 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 상호작용하는 제제
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 활성화 또는 억제하는 제제의 동정 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터의 제조,
b) a)에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포의 제조,
c) b)에 따른 숙주 세포와 시험되는 제제의 접촉, 및
d) 시험된 제제에 의해 생성된 활성화 또는 억제 효과의 측정.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 그와 상호작용하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 이용될 수 있다.
이들 화합물은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 고유 활성의 활성화 제제 (작용제) 또는 억제 제제 (길항제)일 수 있다. 이들 화합물은 본 발명의 폴리펩티드의 리간드 또는 기질일 수 있다. 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991)]을 참조한다.
일반적으로, 상기 방법을 수행하기 위해, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현시키는 적합한 숙주 세포를 제조하는 것이 우선 바람직하다. 그러한 세포들은, 예를 들어, 포유류, 효모, 드로소필리아와 같은 곤충 또는 이. 콜라이와 같은 세균 세포일 수 있다.
이들 세포 또는 이들 세포의 막 추출물을 이어서 시험되는 화합물의 존재하에 위치시킨다.
시험되는 화합물과 본 발명의 폴리펩티드와의 결합능뿐만 아니라 작용성 반응의 억제 또는 활성화를 이어서 관찰할 수 있다.
상기 방법 중 단계 d)는 직접 또는 간접적으로 표지된 시험되는 제제를 이용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 표지 또는 비-표지된 제제 및 표지된 경쟁 제제의 사용에 의한 경쟁 시험을 포함할 수 있다.
검출할 시그널에 따라 적절하게 선택된 검출 수단들을 이용함으로써 시험되는 제제가 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 세포 상에서 활성화 또는 억제 시그널을 생성하는지를 또한 결정할 수 있다.
이와 같은 활성화 또는 억제 제제들은 폴리뉴클레오티드, 및 어떠한 경우에는, 올리고뉴클레오티드 또는, 예를 들어, 단백질 또는 항체와 같은 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 의해 활성화 또는 억제되는 제제의 동정 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 제조,
b) a)에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포의 제조,
c) b)에 따른 숙주 세포를 시험되는 제제의 존재하에 위치시킴,
d) 시험되는 제제에 대한 폴리펩티드에 의해 생성되는 활성화 또는 억제 효과의 측정.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 활성화 또는 억제되는 제제는 상기 폴리펩티드의 존재하에서 활성화 또는 억제에 의해 각각 반응하는 제제이다. 본 발명의 폴리펩티드에 의해 직접 또는 간접적으로 활성화 또는 억제되는 제제들은, 예를 들어, 세포막 또는 핵 수용체와 같은 폴리펩티드, 키나제 및 보다 바람직하게는 티로신 키나제, 전사 인자 또는 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
질환의 검출
본 발명은 하나 이상의 하기 단계를 포함하는, 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생물학적 특성을 분석하는 방법을 그의 목적으로 한다:
a) 대상체의 게놈내에 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정;
b) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정;
c) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정;
d) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 농도를 측정; 및/또는
e) 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 작용성을 측정.
이들 생물학적 특성은 대상체에서 또는 대상체로부터의 샘플에서 분석될 수 있다.
이들 생물학적 특성은 유전학적 진단을 수행하고, 대상체가 질환을 앓고 있는지 또는 앓을 위험성이 있는지, 또는 반대로, 질환의 발생에 대해 부분적인 내성, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재와 연관된 가벼운 병 또는 질환이 존재하는지를 측정하는 것을 가능하게 할 수 있다. 이들 질환은 장애 및/또는 인간 질환, 예를 들어, 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애일 수 있다.
상기 암 및 종양은 암종, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한, 대상체에 있어서, 본 발명에 따른 SNP에 의해 코딩되는 변이체 대립형질의 존재와 연관된 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 유전자적 진단을 가능하게 한다.
바람직하게는, 단계 a)에 있어서, 상기 정의된 바와 같은 코딩 SNP를 하나 이상 함유하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재가 검출될 것이다.
폴리뉴클레오티드의 검출은 세포, 혈액, 뇨, 타액과 같은 연구되어지는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터, 또는 연구되어지는 대상체의 생검 또는 부검으로부터 수행될 수 있다. 게놈 DNA는 직접 또는, 예를 들어, PCR 증폭 후에 검출을 위해 사용될 수 있다. RNA 또는 cDNA는 또한 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
이어서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 대상체의 게놈에서 검출된 뉴클레오티드 서열을 비교하는 것이 가능하다.
뉴클레오티드 서열의 비교는 서열분석에 의해, DNA 혼성화 방법에 의해, 변성제 유무에 따른 전기영동 상에서의 DNA 단편들의 이동성 차이에 의해 또는 용융 온도 차이에 의해 수행될 수 있다. 문헌 [Myerset al., Science (1985) 230: 1242]을 참조한다. 정확하게는 뉴클레오티드 서열의 구조에 있어서 상기 변형은 또한 RNase 및 S1 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제 보호 시험에 의해 또는 화학적 절단 제제에 의해 밝혀질 수 있다. 문헌 [Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401]을 참조한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브가 또한 스크리닝을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 익히 공지되어 있는 다수의 방법들이 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 측정하기 위해 및 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자적 변이성을 확인하기 위해 사용될 수 있다 [참조: Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613].
단계 b)에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은, 예를 들어, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블롯 및 기타 혼성화 방법과 같은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 RNA (및 폴리펩티드의 코딩) 수준을 정량함으로써 측정될 수 있다.
단계 c) 및 d)에 있어서, 대상체 또는 대상체로부터의 샘플에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재 또는 부재뿐만 아니라 농도는, 예를 들어, 방사선면역검정법, 경쟁적 결합 시험, 웨스턴 블롯 및 ELISA 시험과 같은 익히 공지되어 있는 방법에 의해 수행될 수 있다.
단계 d)에 이어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 측정된 농도를 대상체에게서 통상적으로 발견되는 천연 야생형 EPO 단백질 농도와 비교할 수 있다.
당업자는, 이전에 언급된 것과 같이, 선행 기술 문헌의 도움으로 또는 통상적인 시험 또는 분석에 의해, 질환에 대한 민감도 또는 반대로 내성을 나타내는 역가, 상기 유발된 가벼운 병 또는 질환을 확인할 수 있다.
단계 e)에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 작용성의 측정은, 예를 들어, 위에서 언급된 것과 같은 생체외 시험에 의해 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포의 사용에 의해서와 같이, 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 의해 수행될 수 있다.
치료 화합물 및 질환의 치료법
본 발명은 또한 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체를 함유하는 치료 화합물을 그의 목적으로 한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 장애 및/또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 치료 화합물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체의 용도에 관한 것이다. 이들 질환은 장애 및/또는 인간 질환, 예를 들어, 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애일 수 있다.
상기 암 및 종양은 암종, 예를 들어, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키기 위한 치료 화합물의 제조에 바람직하게 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체를 또한 하기 목적용 치료 화합물의 제조에 사용할 수 있다:
- 빈혈, 특히 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈의 예방 또는 치료, 및/또는
- 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산 증가, 및/또는
- 뇌 손상의 예방.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 수득하게 할 수 있는 특정한 화합물뿐만 아니라 상기 폴리펩티드에 의해 또는 그로부터 수득되거나 동정되는 화합물도 마찬가지로, 즉 치료 화합물로서, 인간 신체의 치료학적 처치를 위해 사용될 수 있다.
이는 본 발명이 또한 활성제로서 상기 정의된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체를 함유하는 약제를 그의 목적으로 하는 이유이다.
본 발명은 또한 다양한 인간 장애 및/또는 질환, 예를 들어, 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조를 위한 상기 정의된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체의 용도에 관한 것이다.
상기 암 및 종양은 암종, 예를 들어, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키기 위한 치료 화합물의 제조에 바람직하게 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 하기 목적용 치료 화합물의 제조를 위한, 하나 이상의 상기 정의된 SNP를 함유하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체의 용도에 관한 것이다:
- 빈혈, 특히 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈의 예방 또는 치료, 및/또는
- 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산 증가, 및/또는
- 뇌 손상의 예방.
활성제로서 유용한, 본 발명의 폴리펩티드 및 다른 화합물의 투여량은 화합물의 선택, 치료적 조치, 투여 방식, 제제의 특성, 대상체의 특성 및 의사의 판단에 의존한다.
활성제로서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 일반적으로 1 내지 300 단위/대상체 ㎏의 범위인 투여량으로 투여된다.
본 발명은 또한 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체, 상기 정의된 SNP 중 하나 이상을 함유하는 본 발명에 따른 뉴클레오티드, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포, 및/또는 상기 정의된 항체와 같은 하나 이상의 위에서 언급된 화합물뿐만 아니라 제약상 허용가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물을 목적으로 한다.
이들 제약 조성물에 있어서, 활성제는 유리하게는 생리학적으로 유효한 투여량으로 존재한다.
이들 제약 조성물은, 예를 들어, 고형 또는 액상일 수 있고, 예를 들어, 단순 또는 피복된 정제, 젤캡, 과립제, 카라멜, 좌제 및 바람직하게는 주사가능한 제제 및 주사용 분말과 같이 인간 의학에서 최근에 사용되는 제약 형태로 존재할 수 있다. 이들 제약 형태는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
활성제(들)는 탈크, 아라비아 고무, 락토스, 전분, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 스테아르산마그네슘, 코코아 버터, 수성 또는 비-수성 비히클, 동물성 또는 식물성 지방산 물질, 파라핀 유도체, 글리콜, 각종 습윤제, 분산제 또는 유화제, 방부제와 같은 제약 조성물에 통상적으로 사용되는 부형제와 혼입될 수 있다.
본 발명에 따른 활성제(들)는 단독으로 사용되거나, 예를 들어, 인터루킨 또는 인터페론과 같은 기타 시토킨과 같은 치료 화합물처럼 기타 화합물들과 배합하여 이용될 수 있다.
제약 조성물의 상이한 제형은 투여 방식에 따라서 적용된다.
제약 조성물은 당업자에게 공지되어 있는 상이한 경로의 투여법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 활성제로서 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부, 상기 정의된 재조합 벡터, 상기 정의된 숙주 세포 및/또는 상기 정의된 항체와 같은 하나 이상의 위에서 언급된 화합물뿐만 아니라 적합한 제약상 허용가능한 부형제를 함유하는 진단 조성물을 목적으로 한다.
상기 진단 조성물은, 예를 들어, 완충제 및 방부제와 같이 진단 조성물에 통상적으로 사용되는 것과 같은 적합한 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 목적으로 하는 치료 화합물을 제조하기 위한 하기의 용도를 목적으로 한다:
a) 본 발명에 따른 폴리펩티드의 치료 유효량, 및/또는
b) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 및/또는
c) 상기 정의된, 치료할 대상체로부터의 숙주 세포.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 활성에 있어서의 증가를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해서는, 몇가지 방법들이 가능하다.
치료 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드, 아미노산 서열 2의 아미노산 28번 내지 193번을 포함하고 SNP G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체, 및/또는 상기 정의된 활성화제 및/또는 활성화된 제제의 치료 유효량을 가능하게는 하나 이상의 위에서 언급된 화합물뿐만 아니라 제약상 허용가능한 부형제와 함께 대상체에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 본 발명의 폴리펩티드의 내인성 생성을 증가시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스성 발현 벡터내에 삽입될 수 있다. 이러한 벡터는, 형질도입된 세포가 목적 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 플라스미드 벡터에 의해 감염된 세포로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)]을 참조한다.
본 발명에 따르면, 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하게 사용될 것이다.
대상체에게 그에게 속하는 숙주 세포 (자가 세포)를 투여하는 것이 역시 가능한데, 이들 숙주 세포는 상기된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키도록 사전에 취하고 변형시킨다.
본 발명은 또한 대상체에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 목적으로 하는 치료 화합물을 제조하기 위한 하기의 용도에 관한 것이다:
a) 치료 유효량의 상기 정의된 면역특이적 항체, 및/또는
b) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는
c) 상기 정의된 바와 같은 치료할 대상체로부터의 숙주 세포.
이와 같이, 상기 정의된 바와 같은 치료 유효량의 억제제 및/또는 항체를, 가능하게는 제약상 허용가능한 부형제와 배합하여 대상체에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있는 본 발명에 따른 상보적인 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 본 발명의 폴리펩티드의 내인성 생성을 감소시키는 것이 또한 가능하다.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 상보적인 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 서열 1과 95% 이상의 상동성 (바람직하게는, 97% 상동성, 보다 바람직하게는 99% 상동성 및 특히 100% 상동성)을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 환자의 게놈내에서의 존재와 연관된 EPO 변이체에 의해 유발된 장애 또는 질환을 앓는 환자를 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 EPO 단백질의 용도에 관한 것으로, 단, 상기 뉴클레오티드 서열은 다음의 SNP: 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g, g2634a 중 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상기 치료 화합물은 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환들 중 하나의 예방 또는 치료를 위해 사용된다.
상기 암 및 종양은 암종, 예를 들어, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키기 위한 치료 화합물의 제조에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 SNP G104S를 포함하는 EPO 폴리펩티드의 모방 화합물
본 발명은 또한 하기의 폴리펩티드의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 신규한 화합물에 관한 것이다:
a) 아미노산 서열 2 또는
b) 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열;
단, a) 및 b)의 상기 아미노산 서열은 G104S SNP를 포함한다.
이들 생물학적 활성은, 예를 들어, EPO 수용체를 과발현시키는 마우스, 32D 세포주로부터의 세포 상에서의 세포 증식 활성, 적혈구 콜로니 형성 또는 EPO 수용체에의 결합 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다.
실험부에서 언급된 바와 같이, G104S 변이된 EPO는 EPO 수용체를 과발현시키는 마우스 32D 세포주의 세포 증식을 야생형 EPO보다 2 내지 5배 더 증가시킨다.
실험부에서 언급된 바와 같이, G104S 변이된 EPO는 천연 야생형 EPO보다 높은 적혈구 콜로니 형성 자극 능력을 보유한다.
실험부에서 언급된 바와 같이, EPO 수용체에 대한 G104S 변이된 EPO의 결합 능력은 천연 야생형 EPO를 사용하여 측정한 것보다 높다.
상기 정의된 바와 같이, 본 발명의 신규한 화합물은 G104S 변이된 EPO의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한, 즉 천연 야생형 EPO의 것보다 높은 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은 또한 G104S 변이된 EPO보다 훨씬 더 높은 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 EPO 수용체에 작용하는 EPO와 관련된 하나 이상의 기능 및 G104S SNP를 포함하는 아미노산 서열 2의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 활성을 보유할 수 있다.
상기 화합물은 또한 G104S SNP를 포함하는 아미노산 서열 2의 폴리펩티드에 의해 유도되는 EPO 수용체에 대한 효과와 실질적으로 유사한 상기 EPO 수용체에서의 변화에 영향을 미침으로써 유도되는 활성을 기초로 하여 EPO 수용체에 대한 EPO 작용과 관련된 하나 이상의 기능을 보유할 수 있다.
상기 화합물은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 생화학적 화합물, 또는 예를 들어, 합성 펩티드-모방체와 같은 유기 화학적 화합물일 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 EPO보다 2 내지 5배 더 높은, EPO 수용체를 과발현시키는 마우스 32D 세포주로부터의 세포에 대한 세포 증식 활성을 보유하는 신규한 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 야생형 EPO보다 더 높은 적혈구 콜로니 형성 자극 능력을 보유하는 신규한 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 야생형 EPO보다 더 높은 EPO 수용체에의 결합 능력을 보유하는 신규한 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 화합물의 동정을 위한, G104S SNP를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 화합물의 동정 방법에 관한 것이다:
a) 예를 들어, 인간 EPO-수용체를 과발현시키는 32D 세포주의 세포 증식, 적혈구 콜로니 형성 및/또는 EPO 수용체에의 결합 능력에 대한 자극 효과와 같은 생물학적 활성을 측정하는 단계;
b) i) 시험되는 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성과,
ii) 아미노산 서열 2의 폴리펩티드, 또는 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하며, G104S SNP를 포함하는 아미노산 서열의 활성을 비교하는 단계; 및
c) 시험되는 화합물이 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하며, G104S SNP를 포함하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 실질적으로 유사하거나, 더 낮거나 또는 더높은 활성을 보유하는지를 단계 b)에서 수행된 비교 결과를 기초로 하여 결정하는 단계.
바람직하게는, 시험되는 화합물은 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 미리 동정되거나, 아미노산 서열 2, 또는 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조 및/또는 화학적 효과를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계될 수 있으며; 단, 상기 아미노산 서열은 G104S SNP를 함유한다.
화합물을 동정하고 설계하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
상기 방법들을 인용하고 있는 간행물들은, 예를 들어, 다음과 같을 수 있다:
- Silverman R.B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action". Academic Press, 1st edition (January 15, 1992).
- Anderson S and Chiplin J. (2002). "Structural genomics; shaping the future of drug design" Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). "The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
- Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1): 5-14.
- Kauvar L.M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6):709.
본 발명의 화합물은 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 질환 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환들 중 하나의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
상기 암 및 종양은 암종, 예를 들어, 전이성 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 있어서 카포시 육종을 비롯한 면역결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함한다.
상기 감염성 질환은 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀와 같은 성병을 포함한다.
상기 면역계 및 자가면역계 질환은 조직 또는 기관 이식 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있다.
상기 심혈관 질환은 뇌 손상 및 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함할 수 있다.
상기 대사 질환은 비만과 같은 상기 비-면역계 질환을 포함할 수 있다.
상기 중추 신경계 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함할 수 있다.
상기 질환 및 장애는 또한 상처 치유 및 골다공증을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특히 다른 개체로부터의 혈액의 사용을 피하기 위해 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에서 자가 혈액의 생산을 증가시키기 위한 치료 화합물의 제조에 바람직하게 사용할 수 있다.
실험부
실시예 1: SNP g1644a, g2357a 또는 c2621g를 함유하는 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 및 야생형 참조 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 모델링
첫 번째 단계로, 에리트로포이에틴의 삼차원 구조를 PDB 데이터베이스 (코드 1EER)에서 입수가능한 것으로부터 출발하고 소프트웨어 Modeler (MSI, San Diego, CA)를 이용하여 구축하였다. 성숙 폴리펩티드 단편을 이어서 변이 D70N, G104S 또는 S147C를 재생시키는 방식으로 변형시켰다. 무수한 분자 최소화 단계들을 프로그램 AMBER 및 DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.)를 이용하여 상기 변이된 단편에 대해 수행하였다. 2회의 분자 역학 계산 실행을 이어서 동일한 프로그램 및 동일한 역장을 이용하여 수행하였다. 각 경우에 있어서, 50,000 단계들을 300 °K에서 계산하고, 300 평형 단계들에 의해 종결하였다. 상기 모델링의 결과를 도 1, 2 및 3에 나타내었다.
실시예 2: 개체군에서의 SNP: g1644a 및 c2621g의 유전자형 결정
SNP의 유전자형 결정은 편광된 형광을 판독하여 산물을 검출하는 미니서열분석의 원리를 기초로 하였다. 상기 방법은 형광 미니서열분석 (FP-TDI Technology 또는 Fluorescence Polarization Template direct Dye-terminator Incorporation)으로 구성된다. 미니서열분석은 각 개체군의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭된 산물 상에서 수행하였다. 상기 PCR 산물은 유전자형을 결정할 SNP를 함유하는 유전자 영역을 포함하는 방식으로 선택하였다. 혼입되지 않은 PCR 프라이머 및 통합되지 않은 dNTP를 제거한 후, 미니서열분석을 수행하였다. 미니서열분석은 폴리머라제 효소 및 형광표지된 디데옥시뉴클레오티드를 사용하여, SNP 부위의 바로 상류에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시키는 것으로 구성된다. 상기 연장 공정으로부터 생성된 산물을 편광된 형광의 판독에 의해 직접 분석하였다. 상기 모든 단계들뿐만 아니라 판독은 동일한 PCR 플레이트에서 수행하였다.
이와 같이, 유전자형 결정은 5 단계를 필요로 한다:
1) PCR에 의한 증폭
2) 효소 분해에 의한 PCR 산물의 정제
3) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장
4) 판독
5) 판독의 해석
단계 1) PCR에 의한 증폭
EPO 유전자의 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭을 인종적으로 다양한 기원의 사람들 268명으로부터 유래한 게놈 DNA로부터 출발하여 수행하였다. 이들 게놈 DNA는 미국의 코리엘 인스티튜트 (Coriell Institute)에 의해 제공되었다. 상기 268명은 다음과 같이 분포한다:
계통군 특정 인종 집단 총계 %
아프리카 아메리카인 아메리카 원주민 카리브인 유럽 코카소이드 멕시코인 북동 아시아인 비유럽 코카소이드 남동 아시아인 남아메리카인 아프리카 아메리카인남아메리카 안데스남서아메리카 인디안카리브인북아메리카 카프카스인이베리아인이탈리아인멕시코인중국인일본인그리스인인도-파키스탄인중동태평양 섬주민남아시아인남아메리카인 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 소계 5050105151010791010991010101020892037710171010 100.018.766.733.35.6100.03.779.810.110.136.9100.03.750.050.07.521.624.354.113.841.258.86.3100.03.7
총계 268 100
*계통군은 문헌 [Cavalli-Sforza, P. Menozzi, and A. Piazza. 1994. "The History and Geography of Human Genes." Princeton: Princeton University Press. pp 80.]으로부터 적용시켰다.
3종의 개체들 중 각각으로부터 유래된 게놈 DNA로 샘플을 구성하였다.
PCR 증폭은 뉴클레오티드 서열 1을 기초로 하여 당업자에 의해 용이하게 설계될 수 있는 있는 프라이머로부터 수행하였다.
g1644a의 유전자형 결정의 경우에, PCR 증폭은 하기 프라이머를 사용하여 수행하였다:
서열 5: 센스 프라이머: TTCAGGGACCCTTGACTC
서열 6: 안티센스 프라이머: GATCATTCTCCCTTTCATCC
상기 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 1에서 뉴클레오티드 1557번 내지 뉴클레오티드 1764번의 208개 길이의 뉴클레오티드의 단편의 증폭을 가능하게 한다.
c2621g의 유전자형 결정의 경우에, PCR 증폭은 하기 프라이머를 사용하여 수행하였다:
서열 7: 센스 프라이머: TTGCATACCTTCTGTTTGCT
서열 8: 안티센스 프라이머: CACAAGCAATGTTGGTGAG
상기 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 1에서 뉴클레오티드 2192번 내지 뉴클레오티드 2817번의 626개 길이의 뉴클레오티드의 단편의 증폭을 가능하게 한다.
유전자형을 결정할 각 SNP의 경우에, PCR 산물은 미니서열분석용 주형으로서 제공될 것이다.
PCR 반응의 총 반응 용적은 샘플당 5 ㎕이었다. 상기 반응 용적은 하기 표에 나타낸 시약들로 구성된다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
라이프 테크놀로지 (Life Technology) Taq으로 전달 완충액 (X) 10 0.5 1
라이프 테크놀로지 Taq으로 전달 MgSO4(mM) 50 0.2 2
AP 바이오테크 (AP Biotech) 27-2035-03 dNTP (mM) 10 0.1 0.2
요청에 따라 센스 프라이머 (μM) 10 0.1 0.2
요청에 따라 안티센스 프라이머 (μM) 10 0.1 0.2
라이프 테크놀로지 11304-029 Taq 백금 5 U/㎕ 0.02 0.1 U/반응
H2O Qsp 5 ㎕ 1.98
DNA (샘플) 2.5 ng/㎕ 2 5 ng/반응
총 용적 5 ㎕
상기 시약들을 ABGene사에 의해 공급된 384웰을 갖는 블랙 PCR 플레이트 (ref: TF-0384-k)에 분배하였다. 플레이트를 밀봉하여, 원심분리한 다음, 384-웰 플레이트용 써모사이클러내에 위치시켜 하기 인큐베이션을 수행하였다: PCR 사이클: 94℃에서 1분, 이어서 3 단계 (94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 68℃에서 1분)로 이루어진 사이클 36회.
2) 효소 분해에 의한 PCR 산물의 정제
PCR 증폭된 산물을 이어서 2종의 효소: 새우 알카리성 포스파타제 (SAP) 및 엑소뉴클레아제 I (Exo I)을 사용하여 정제하였다. 상기 효소들 중 첫 번째 것은 PCR 증폭 동안 통합되지 않은 dNTP를 탈인산화시키는 반면, 두 번째 것은 나머지 일본쇄 DNA 잔기, 특히 PCR 동안 사용되지 않은 프라이머를 제거하였다. 상기 분해는 PCR 플레이트의 각 웰에의 샘플당 5 ㎕의 반응 혼합물의 첨가에 의해 수행하였다.
상기 반응 혼합물은 하기 시약들로 구성된다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
AP 바이오테크 E70092X SAP 1 U/㎕ 0.5 0.5/반응
AP 바이오테크 070073Z Exo I 10 U/㎕ 0.1 1/반응
AP 바이오테크 SAP 공급 SAP 완충액 (X) 10 0.5 1
H2O Qsp 5 ㎕ 3.9
PCR 산물 5 ㎕
총 용적 10 ㎕
일단 충전되면, 플레이트를 밀봉하고, 원심분리한 다음, 384웰 플레이트용 써모사이클러 (Tetrad of MJ Research)내에 위치시키고 하기 인큐베이션을 수행하였다: SAP-EXO 분해: 37℃에서 45분, 80℃에서 15분.
단계 3) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장
다음, 신장 또는 미니서열분석 단계를 하기 표에 제시된 바와 같이, 제조된 샘플당 5 ㎕의 반응 혼합물을 첨가함으로써 분해된 PCR의 산물에 대해 수행하였다:
공급자 참고 반응물 초기 농도 튜브당 용적 (㎕) 최종 농도
자체 제조 신장 완충액1(X) 5 1 1
라이프테크놀로지 요청에 따라 미니서열분석용 프라이머 (μM)A 또는 B 10 0.5 2
AP바이오테크 27-2051(61,71,81)-01 ddNTP2(μM)2는 표지되지 않음 각 2.5 0.25 각 0.125
NEN Nel 472/5및 Nel 492/5 ddNTP2(μM)2는 Tamra 및 R110으로 표지 각 2.5 0.25 각 0.125
AP바이오테크 E79000Z 써모-시쿼나제 3.2 U/㎕ 0.125 0.4 U/반응
H2O Qsp 5 ㎕ 3.125
분해된 PCR 산물 10
총 용적 15
15X 신장 완충액은 250 mM 트리스-HCl pH 9, 250 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM MgCl2및 40% 글리세롤로 구성된다.2ddNTP에 대해, 4가지 염기의 혼합물은 연구되는 다형성에 따라서 수행된다. 작용성 SNP를 구성하는 관심의 2개 염기 (야생형 뉴클레오티드/변이형 뉴클레오티드)만이 Tamra 또는 R110으로 표지된다.g1644a의 유전자형 결정의 경우에, ddNTP의 혼합물은- 비표지된 2.5 μM의 ddGTP,- 비표지된 2.5 μM의 ddATP,- 2.5 μM의 ddTTP (비표지된 1.875 μM의 ddTTP 및 Tamra 표지된 0.625 μM의 ddTTP),- 2.5 μM의 ddCTP (비표지된 1.875 μM의 ddCTP 및 R110 표지된 0.625 μM의 ddCTP)로 구성된다.c2621g의 유전자형 결정의 경우에, ddNTP의 혼합물은- 비표지된 2.5 μM의 ddATP,- 비표지된 2.5 μM의 ddTTP,- 2.5 μM의 ddGTP (비표지된 1.875 μM의 ddGTP 및 Tamra 표지된 0.625 μM의 ddGTP),- 2.5 μM의 ddCTP (비표지된 1.875 μM의 ddCTP 및 R110 표지된 0.625 μM의 ddCTP).
유전자형 결정에 필요한 2종의 미니서열분석용 프라이머의 서열을 본 발명에 따른 SNP의 부위의 상류에 위치하는 뉴클레오티드의 서열에 대해 상응하는 방식으로 결정하였다. SNP를 함유하는 PCR 산물은 이중쇄 DNA 산물이므로, 유전자형 결정은 센스 쇄 및 안티센스 쇄 상에서 수행할 수 있다. 선택된 프라이머는 라이프테크놀로지 인코포레이티드에 의해 제조된다.
SNP g1644a의 경우에, 시험된 미니서열분석용 프라이머는 다음과 같다:
서열 9: 센스 프라이머 (A): tgcagcttgaatgagaatatcactgtccca
서열 10: 안티센스 프라이머 (B): cctcttccaggcatagaaattaactttggtgt
SNP g1644a의 미니서열분석을 우선 48개 샘플에 대해 확인한 다음, 268명 개체 및 11명 음성 대조군으로 구성된 개체군의 셋트에 대해 유전자형을 결정하였다. 수가지 미니서열분석 조건을 시험하고 다음의 최적 조건을 g1644a의 유전자형 결정에 대해 유지시켰다:
안티센스 프라이머 + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra
SNP c2621g의 경우에, 시험되는 미니서열분석용 프라이머는 다음과 같다:
서열 11: 센스 프라이머 (A): ttggcagaaggaagccatct
서열 12: 안티센스 프라이머 (B): ctgaggccgcatctggaggg
SNP c2621a의 미니서열분석을 우선 48개 샘플에 대해 확인한 다음, 268명 개체 및 10명 음성 대조군으로 구성된 개체군의 셋트에 대해 유전자형을 결정하였다. 수가지 미니서열분석 조건을 시험하고 다음의 최적 조건을 g1644a의 유전자형 결정에 대해 유지시켰다:
센스 프라이머 + ddCTP-R110 + ddGTP-Tamra
일단 충전되면, 플레이트를 밀봉하고, 원심분리한 다음, 384-웰 플레이트용 써모사이클러 (Tetrad of MJ Research)내에 위치시키고 하기 인큐베이션을 수행하였다: 신장 사이클: 93℃에서 1분, 이어서 2 단계 (93℃에서 10초, 55℃에서 30초)로 구성된 사이클 35회.
써모사이클러내에서 최종 단계 후, 플레이트를 직접 Analyst (등록상표) HT형의 편광된 형광 판독기 (LJL Biosystems Inc.) 상에 위치시켰다. 플레이트를 두 가지 방법의 이용에 의한 Criterion Host (등록상표) 소프트웨어를 이용하여 판독하였다. 첫 번째는 상기 형광체에 특이적인 방출 및 여기 필터를 이용하여 (여기 550-10 nm, 방출 580-10 nm) Tamra 표지된 염기를 판독할 수 있고, 두 번째는 상기 형광체에 특이적인 여기 및 방출 필터를 이용하여 (여기 490-10 nm, 방출 520-10 nm) R110 표지된 염기를 판독할 수 있다. 상기 두 경우에 있어서, 2색성 이중 거울 (R11/Tamra)이 사용되었고 다른 판독 매개변수는 다음과 같다:
Z-높이: 1.5 mm
감쇠기: 아웃
융합 시간: 100,000 μsec.
원데이터 단위: 카운트/초
스위치 편광: 웰 당
플레이트 고정 시간: 0 msec
PMT 장치: Smart Read (+), 민감도 2
동적 편광기: 방출
정적 편광기: S
이와 같이, Tamra 필터에 대한 mP (milliPolarization) 및 R110 필터에 대한 mP의 계산치를 포함하는 파일 결과가 수득되었다. 상기 mP 값은 하기 식에 따라서평행면 () 및 수직면 () 상에서 수득된 강도 수치로부터 출발하여 계산된다:
상기 계산에서, 값은 인자 g에 의해 측량된다. 이는 미리 실험적으로 결정되어야만 하는 기계 변수이다.
단계 4) 및 5) 판독의 해석 및 유전자형의 결정
mP 값은 Microsoft Inc. Excel 소프트웨어, 및/또는 Allele Caller (등록상표) 소프트웨어 (LJL Biosystems Inc. 개발)를 이용한 그래프 상에 기록된다.
가로축 상에 Tamra 표지된 염기의 mP 값을 나타내고, 세로축상에는 R110 표지된 염기의 mP 값을 나타낸다. 강한 mP 값은 상기 형광체로 표지된 염기가 통합되었다는 것을 나타내고, 반대로, 약한 mP 값은 상기 염기의 통합이 존재하지 않는 것을 의미한다.
상이한 유전자형을 보유하는 뉴클레오티드 서열의 동종 군이 3개까지 수득될 수 있다.
Allele Caller (등록상표) 소프트웨어의 사용은, 일단 상이한 군들의 동정이 수행되면, 각 개체에 대해 정의된 유전자형을 표의 형태로 직접 추출할 수 있다.
SNP: g1644a 및 c2621g에 대한 미니서열분석의 결과
유전자형 결정 공정의 완료 후, 연구되는 SNP에 대한 개체군 중 개체들의 유전자형의 결정은 상기된 그래프를 이용하여 수행하였다.
SNP g1644a의 경우에, 이러한 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 GG, 이형접합체 GA 또는 동형접합체 AA이다. 실제로, 아래에 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 AA는 개체군에서 검출되지 않는다.
유사하게는, SNP c2621a의 경우에, 이러한 유전자형은 이론적으로 시험되는 개체에 있어서 동형접합체 CC, 이형접합체 CG 또는 동형접합체 GG이다. 실제로, 아래에 나타낸 바와 같이, 동형접합체 유전자형 AA는 개체군에서 검출되지 않는다.
개체군에서의 음성 대조군에 대해 결정된 유전자형의 분포의 결과 및 상기 2종의 작용성 SNP에 대한 상이한 대립형질 빈도의 계산치는 하기 표에 제시되어 있다:
개체 수 대조군 수 성공률
시험 유전자형 결정 시험 유전자형 결정
g1644a 268 267 11 11 99.6
c2621g 268 250 10 10 93.5
계통군 총계 g1644a (D70N)
f (95% CI) GG % GA % AA % 총계
아프리카 아메리카인 50 50 100 50
아메리카 원주민 15 15 100 15
카리브인 10 10 100 10
유럽 코카소이드 99 0.5 (0, 1.5) 97 99.0 1 1.0 98
멕시코인 10 10 100 10
비유럽 코카소이드 37 37 100 37
북동 아시아인 20 20 100 20
남아메리카인 10 10 100 10
남동 아시아인 17 17 100 17
총계 268 0.2 (0, 0.6) 266 99.6 1 0.4 267
계통군 총계 c2621g (S147C)
f (95% CI) CC % CG % GG % 총계
아프리카 아메리카인 50 50 100 50
아메리카 원주민 15 15 100 15
카리브인 10 10 100 10
유럽 코카소이드 99 0.5 (0, 1.6) 91 98.9 1 1.1 92
멕시코인 10 8 100 8
비유럽 코카소이드 37 32 100 32
북동 아시아인 20 19 100 19
남아메리카인 10 8 100 8
남동 아시아인 17 16 100 16
총계 268 0.2 (0, 0.6) 249 99.6 1 0.4 250
상기 표에서,
- N은 개체수를 나타내고,
- %는 특정 아개체군에서의 개체의 백분율을 나타내고,
- 대립형질 빈도는 특정 아개체군에서 변이된 대립형질의 백분율을 나타내고,
- 95% CI는 95% 신뢰도의 최소와 최대 간격을 나타낸다.
개체군에 의한 상기 결과를 조사함으로써, SNP g1644a의 경우에 단지 이형접합체 개체 GA만이 개체군의 아개체군 유럽 코카소이드로부터 유래한다는 것이 관찰되었다.
유사하게는, 개체군에 의한 상기 결과를 조사함으로써, SNP c2621g의 경우에 단지 이형접합체 개체 CG만이 개체군의 아개체군 유럽 코카소이드로부터 유래한다는 것이 관찰되었다.
실시예 3: G104S 변이된 에리트로포이에틴의 생물학적 기능의 천연 야생형 에리트로포이에틴의 생물학적 기능과의 비교에 의한 연구
제1 단계는 변이형 및 야생형 EPO 단백질을 제조하는 것으로 구성된다.
a)제네티신-내성 유전자를 보유하는 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3.1/His-Topo내에서의 천연 야생형 에리트로포이에틴 및 변이형 에리트로포이에틴 (g2357a)의 클로닝
SwissProt에 공개된 에리트로포이에틴 단백질의 서열과 비교하여, Genestorm 클론 (H-X02158M - Invitrogen)으로부터의 폴리히스티딘 표지된 EPO cDNA는 K143E (G427AG) 변이 (아래첨자 번호는 cDNA 서열 상의 뉴클레오티드 서열에 해당한다)를 보유하였다. 이와 같이, 본 발명자들은 먼저 Exsite PCR 키트 (Stratagene) 및 다음의 프라이머를 사용하여 천연 야생형 E143 (A427AG) 서열을 재구성하였다:
서열 13: 센스 프라이머: CCAGAAGGAAGCCATCTCCCCT
서열 14: 안티센스 프라이머 (5' 말단 상에서 포스포릴화): GCTCCCAGAGCCCGAAGCAG
유사하게, G104S (G310GC => AGC) 변이된 에리트로포이에틴을 Exsite PCR 키트 (Stratagene corp.) 및 다음의 프라이머를 사용하여 수득하였다:
서열 15: 센스 프라이머: CGGAGCCAAGCCCTGTTGGTCA
서열 16: 안티센스 프라이머 (5' 말단 상에서 포스포릴화): CAGGACAGCTTCCGACAGCA
변이형이든 야생형이든 폴리히스티딘 말단부를 제거하고 완전 EPO 단백질 (즉 천연 시그널 펩티드 및 성숙 단백질)을 단리하기 위해, PCR 증폭을 다음의 프라이머를 사용하여 수행하였다:
서열 17: 센스 프라이머: ATGGGGGTGCACGAATGTCC
서열 18: 안티센스 프라이머: TCATCTGTCCCCTGTCCTGC
PCR 산물을 CMV 프로모터의 제어하에 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3.1/GS/HisTopo (TOPO™-클로닝; Invitrogen Corp.)내에 삽입하였다. 이들 벡터는 진핵생물 세포주내에서의 단백질의 구조성 발현을 가능하게 한다.
재조합 단백질을 코딩하는 벡터 영역의 뉴클레오티드 서열의 조사 후에, 각종 재조합 발현 벡터를 Superfect (QIAgen)를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에 형질감염시켰다.
b) 천연 야생형 또는 변이형 EPO를 과발현시키는 클론의 선택
다양한 EPO 작제물로 형질감염시킨지 2일 후에, CHO 세포를 제네티신 (Invitrogen) 800 ㎍/ml를 함유하는 배양 배지에 두었다. 이들 배양 조건하에 2주간 성장의 결과로서, EPO를 과발현시키는 안정한 세포가 선택되었다. 다음, 세포를 제한 희석 방법에 의해 클로닝시켰다. 야생형 또는 변이형 EPO로 형질감염된 세포로부터의 30개 콜로니를 EPO ELISA (R&D Systems)를 이용한 EPO 단백질의 발현을 위해 스크리닝시켰다. 7개 EPO-발현 클론을 선택하여 냉동시켰다. 이들 중, 가장 많은 양의 야생형 또는 변이형 EPO를 생산하는 클론을 EPO 매스 생산에 사용하였다.
c)EPO 단백질의 정제
CHO 배양물에서의 EPO 발현 후에, 배양 배지를 상청액의 회수를 위해 20분동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 다음, 상청액을 Labscale (Millipore 막 5 Kda)을 이용하여 10배 농축시키고, 완충액 (Tris 50 mM, NaCI 25 mM pH 9) 3L에 대해 투석하고, 음이온 교환 칼럼 (Pharmacia, HiprepQ) 상에서 정제하였다. 200 mM NaCl에서의 단계를 이용한 단백질 용해 후에, 단백질을 완충액 NaH2PO450 mM, NaCl 25 mM, pH 7에 대해 탈염시키고, Heparine HP (Pharmacia) 상에서 정제하였다. 다음, 단백질 용해를 150 mM NaCl에서의 단계를 이용하여 수행하였다. 마지막으로, EPO 단백질을 SDS-PAGE 겔 특성규명에 의해, 이어서 밀도계 (Biorad 밀도계 GS800)에 의해 분석하였다.
제2 단계는 EPO 수용체를 과발현시키는 32D 마우스 세포의 제조로 구성된다.
d)제오신-내성 유전자를 보유하는 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3.1/GS/HisTopo내에서의 천연 EPO 수용체의 클로닝:
V5 에피토프 및 폴리히스티딘 말단부를 보유하는 프레임내의 cDNA를 추가로 삽입하기 위해, Genestorm 클론 (H-M60459M - Invitrogen)으로부터의 천연 인간 EPO 수용체 cDNA의 완전 서열을 다음의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
서열 19: 센스 프라이머: ATGGACCACCTCGGGGCGTC
서열 20: 안티센스 프라이머: AGAGCAAGCCACATAGCTGGGGG
PCR 산물을 CMV 프로모터의 제어하에 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3.1/GS/HisTopo (TOPO™-클로닝; Invitrogen Corp.)내에 삽입하였다. 상기벡터는 진핵생물 세포주내에서의 단백질의 구조성 발현을 가능하게 한다. 당해 경우에, EPO 수용체를 폴리-히스티딘 말단부 및 V5 에피토프를 함유하는 추가의 C-말단 서열로 표지시켰다. 재조합 단백질을 코딩하는 벡터 영역의 뉴클레오티드 서열의 조사 후에, 작제물을 마우스 32D 세포주 (ATCC)내로 전기천공시켰다.
e)EPO-수용체를 과발현시키는 안정한 세포의 선택
인간 EPO-수용체를 과발현시키는 안정한 세포를 선택하기 위해, EPO-수용체를 코딩하는 작제물로 전기천공된 32D 세포주를 200 ㎍/ml 제오신 (Invitrogen)의 존재하에 5주 동안 배양한 후, 시판용 인간 EPO (R&D Systems)의 존재하에 증식시키는 그의 능력을 평가하였다.
마지막으로, 변이형 EPO 및 야생형 EPO의 생물학적 효과를 2가지 상이한 시험: EPO 수용체를 과발현시키는 마우스 32 세포의 세포 증식을 유도하는 상이한 EPO 단백질의 능력의 평가 및 변이형 EPO 및 야생형 EPO의 EPO 수용체에의 직접 결합의 측정에 의해 측정하였다.
f)EPO-수용체를 과발현시키는 마우스 32D 세포의 세포 증식을 유도하는 야생형 및 변이형 G104S EPO의 능력 평가
세포 증식을 유도하는 야생형 EPO 및 G104S 변이된 EPO의 능력을 EPO-수용체를 과발현시키는 마우스 32D 세포 (32D-EPOR 세포) 상에서 평가하였다. 이러한 시험은 먼저 이전 단계에서 생산된 상이한 EPO 단백질을 함유하는 단백질 추출물 상에서 수행한 다음, 상기한 바와 같이 수득된 정제된 EPO 단백질 상에서 수행하였다.
원리는 32D-EPOR 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 200 ㎕ 최종 배양 배지에서 2x104개 세포/웰의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 접종시키는 것이다. 32D-EPOR 세포를 야생형 또는 변이형 EPO의 계열 희석액 (단백질 추출물의 경우에 0.024 내지 140 ng/ml 및 정제된 EPO의 경우에 0.76x10-3내지 400 ng/ml)과 함께 인큐베이션시킨 후, Uptiblue (Uptima)를 배양물에 첨가하였다. 단백질 추출물의 경우에 24시간 동안 및 정제된 EPO의 경우에 4시간 동안의 인큐베이션의 추가의 기간 후에 세포 증식률을 590 nm에서 방출된 형광 (여기 560 nm)을 측정함으로써 정량화시켰다.
천연 야생형 및 변이형 EPO의 증식 활성은 세포 증식이 50%에 이르는 EPO 농도 (ng/ml)에 해당하는 EC50 값의 측정을 기초로 한다.
먼저, 상기한 바와 같은 2가지 실험을 EPO를 함유하는 단백질 추출물을 사용하여 수행하였으며, 각각의 실험은 3회 반복하였다. 3회 실험의 결과는 도 4A 및 도 4B에 각각 제시되어 있다. 도 4에 있어서, 각각의 단백질 농도의 경우에, 점은 3회 측정치의 평군에 해당하고, 표준 편자는 3회 반복 사이의 변동을 나타낸다.
상기 곡선으로부터 수득된 EC 값은 다음과 같다:
- 제1 실험의 경우: 야생형 EPO에 대해 24.22 ng/ml 및 G104S 변이된 EPO에 대해 4.68 ng/ml
- 제2 실험의 경우: 야생형 EPO에 대해 5.24 ng/ml 및 G104S 변이된 EPO에 대해 3.7 ng/ml
이와 같이, 도 4A 및 4B 및 EC50 값은 인간 EPO-수용체를 과발현시키는 32D 세포주의 세포 증식에 대한 G104S 변이된 EPO 자극 효과가 천연 야생형 EPO보다 2 내지 5배 더 높다는 것을 제시한다.
다음, 유사한 실험을 정제된 EPO 단백질을 이용하여 수행하였다. 3회씩 수행된 2가지 실험의 결과는 도 5A 및 도 5B에 각각 제시되어 있다. 도 5에 있어서, 각각의 단백질 농도에 대해, 점은 측정치의 평균에 해당하고, 표준 편차는 3회 반복 사이의 변동을 나타낸다.
상기 곡선으로부터 수득된 EC50 값은 다음과 같다:
- 제1 실험의 경우: 야생형 EPO에 대해 2.38 ng/ml 및 G104S 변이된 EPO에 대해 0.58 ng/ml
- 제2 실험의 경우: 야생형 EPO에 대해 2.57 ng/ml 및 G104S 변이된 EPO에 대해 1.12 ng/ml
이와 같이, 도 5A 및 5B 및 EC50 값은 인간 EPO-수용체를 과발현시키는 32D 세포주의 세포 증식에 대한 정제된 G104S 변이된 EPO 자극 효과가 천연 야생형 EPO보다 2 내지 5배 더 높다는 것을 제시하며, 이는 단백질 추출물을 사용하여 수득된 결과를 입증한다.
g)G104S 변이된 에리트로포이에틴에 의한 적혈구 형성의 자극
적혈구 콜로니 형성을 자극하는 G104S 변이된 에리트로포이에틴의 능력을 평가하고, 야생형 에리트로포이에틴의 것과 비교하였다.
그렇게 하기 위해, 건강한 개체로부터의 인간 골수 세포를 수집하고 피콜 구배 상에서 분리하였다. 유핵 세포 (2.5x105개 세포)를 반고형 메틸 셀룰로스에 플레이팅시켰다. 다음, 0.25 내지 10 ng/mL 범위의 변이형 또는 야생형 에리트로포이에틴을 배양 배지에 첨가하였다. 배양한지 10일 후에, 적혈구 콜로니를 카운팅하였다.
본 실험을 2회 수행하고, 평균 결과를 하기 표에 수집하고 도 6에 제시하였다.
콜로니 수
EPO (ng/mL) 야생형 EPO G104S EPO
0.25 170 230
0.5 505 685
1 540 810
2.5 620 860
5 670 855
10 715 950
이들 데이터는 G104S 변이된 에리트로포이에틴이 적혈구 콜로니 형성을 자극한다는 것을 명백하게 입증한다. 특히, G104S 변이된 에리트로포이에틴에 의한 적혈구 콜로니 형성의 자극은 야생형 에리트로포이에틴을 사용하여 측정된 것보다 30 내지 50% 더 높다.
h) EPO와 EPO 수용체 사이의 상호작용
EPO와 그의 수용체 (EPO-R) 사이의 상호작용을 표면 플라즈몬 공명 기법 (Biacore, SPR)을 이용하여 측정하였다.
G104S 변이형 EPO와 야생형 EPO의 친화성을 비교하기 위해, EPO와 EPO-R의 세포외 부분과의 결합 상호작용의 정량적 측정을 센서 칩 표면 상에 고정된 EPO-R표적 리간드를 사용하여 수행한 다음, 시험되는 EPO 단백질로 구성된 다양한 농도의 분석물을 칩 상으로 통과시켰다.
니켈을 결합시켜, 폴리-히스티딘 말단부의 금속 킬레이트화에 의한 리간드의 포획을 매개하도록 칩의 카르복시메틸화 덱스트란을 설계하였다.
이러한 이유로, 본 발명자들은 성숙한 인간 수용체의 세포외 부분 (아미노산 25-247), 및 이어서 C-말단 V5 에피토프 및 폴리-히스티딘 말단부 (KGFSFNWGGKPIPNPLLGLDSTGVDHHHHHH-C-ter)에 상응하는 EPO-수용체를 설계하였다. 상응하는 cDNA 단편을 다음의 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하는 피키아 파스토리스 벡터 pPICZalpha his-topo (Invitrogen)내로 삽입하였다:
서열 21: 센스 프라이머: GCGCCCCCGCCTAACCTC
서열 22: 안티센스 프라이머: GTCGCTAGGCGTCAGCAGCGA
천연 야생형 EPO를 코딩하거나 G104S EPO를 코딩하는 클론을 함유하는 BMGY 배지 (2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 1.34% YNB, 1% 글리세롤, 100 mM 인산칼륨, 0.4 mg/L 비오틴 pH 6.8) 50 ml의 2회 예비 배양을 200 회전수/분 (rpm)의 교반으로 30℃에서 24시간 동안 수행하였다.
배양물이 600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도 5.0에 상응하는 세포 밀도에 이를 경우, BMMY 배지 (2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 1.34% YNB, 0.5% 메탄올, 100 mM 인산칼륨, 0.4 mg/L 비오틴 pH 6.8) 200 ml를 1/5씩 접종시켰다.
다음, 단백질의 발현을 200 rpm에서의 배양 플라스크의 교반과 함께 0.5%의 농도의 메탄올에 의해 30℃에서 2 내지 5일 동안 유도하였다.
약 10 mg/ml EPO-R을 함유하는 상청액을 한외 여과에 의해 실험실 규모 장치 (컷-오프 5000 Da) 상에서 농축시키고, 완충액을 인산나트륨 50mM, Tris (Cl) 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 이미다졸 10 mM에 대한 투석에 의해 교환하였다. 다음, 폴리-히스티딘 EPO-R을 황산니켈 (Amersham Pharmacia)로 예비 로딩된 Hi-Trap 상에서 포획하였다. 단백질을 함유하는 분획을 겔 여과 (완충액 Tris (Cl) pH 9, NaCl 50 mM)에 의해 탈염시킨 다음, 음이온 교환 크로마토그래피 상에서 약 95%로 정제하였다. 순도 및 농도를 SDS-PAGE 겔을 이용하여 평가하였다.
다음, 센서 칩 NTA를 유속 20 ㎕/분으로 황산니켈 500 μM 상으로 통과시켰다. 다음, EPO-R을 유속 10 ㎕/분으로 HBS-P 완충액 (10mM HEPES, NaCl 150 mM, 0.005% P20 EDTA 50 uM) 중에서 50 nM의 농도로 표면 상에서 포획하였다. 다음, 0.45 내지 15 nM 범위의 야생형 EPO 및 G104S 변이된 EPO의 농도를 센서 칩 상으로 통과시켰다. HBS-P, EDTA 0.35M을 사용한 재생을 각각의 농도 시험 후에 수행하였다. 자동화 방법은 위에 제시된 범위의 6가지 농도에 대해 야생형 EPO와 G104S 변이된 EPO와의 상호작용을 평가하였다.
도 7은 G104S 변이된 EPO 및 야생형 EPO의 2가지 농도 (7.5 및 15 nM)에 대한 결합 측정의 결과를 제시한다.
이들 결과는 G104S 변이된 EPO가 야생형 EPO보다 그의 수용체에 신속하게 결합하는 것을 제시하며, 이는 세포 수준에서 관찰된 효과를 입증한다 (3f 및 3g에 기재된 실시예 참조). 결과로서, 이는 EPO 수용체를 과발현시키는 마우스 32D 세포의 증식에 대한 G104S 변이된 EPO의 강력한 양성 효과가 G104S 변이된 EPO의 그의 수용체에 대한 보다 우수한 친화성과 적어도 부분적으로 관련된다는 것을 입증한다.
미성숙 EPO 단백질 서열내의 104번 위치에서 아미노산에 영향을 미치는 성숙 EPO 효능에 대한 이러한 효과는 대단히 놀랍다. 실제로, EPO 수용체와 착체화된 EPO의 결정 구조는 EPO의 (4개의 헬릭스 A, B, C 및 D 중에서) 단지 3개의 헬릭스 A, C 및 D가 EPO 수용체와의 결합에 관여한다 [Syed et al. Efficiency of signaling through cytokine receptors depends critically on receptor orientation. Nature 395: 511-516 (1998)]. 또한, EPO에서의 구조-기능 관계를 분석하는 부위-지시된 돌연변이유발은 잔기 77번의 근처에 존재하는 헬릭스 B에 위치하는 아미노산의 변화는 EPO 활성에 실질적인 영향을 미치지 않는다 [Eliott et al. Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin. Blood. 89: 493-502 (1997); Wen et al. Erythropoietin structure-function relationships. Identification of functionally important domains. J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)].
EPO의 구조/기능에 대한 이와 같은 신규한 정보를 또한 그의 인간 수용체 상에서의 EPO 활성을 모방하는 신규한 EPO-유사 실체물 (화합물 또는 펩티드)을 동정하고, 설계하고 개발하는데 사용할 수 있다.

Claims (59)

  1. a) 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP (Single Nucleotide Polymorphism; 단일 뉴클레오티드 다형성)를 포함하는 뉴클레오티드 서열 1; 또는
    b) a)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열
    의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, g1664a, g2357a 및 c2621g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 서열 1의 615번 내지 2763번의 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 제1항의 폴리뉴클레오티드와 적합한 혼성화 조건하에 혼성화시키는 것을 포함하는, 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 동정 또는 증폭시키는 방법.
  7. 대상체 또는 대상체의 개체군의 게놈 DNA에 있어서 관심 영역을 증폭시키는 단계 및 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 1내의 하나 이상의 위치의 대립형질을 결정하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열 1과 80 내지 100% 상동성을 보유하는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부의 유전자형 결정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 유전자형 결정을 미니서열분석 (minisequencing)에 의해 수행하는 방법.
  9. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제9항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제10항에 따른 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 폴리펩티드를 배양 배지로부터 분리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 분리 방법.
  12. 제1항의 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  13. 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 폴리펩티드.
  15. 제12항에 있어서, 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드.
  16. 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체.
  17. 제12항에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역화시키고, 면역특이적 항체를 상기 동물로부터 수집하는 것을 포함하는, 면역특이적 항체를 수득하는 방법.
  18. 제17항의 방법으로부터 생성된 면역특이적 항체.
  19. a) 제9항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포를 시험되는 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    c) 폴리펩티드의 활성에 대한 활성화 또는 억제 효과를 측정함으로써 활성화제 또는 억제제를 동정하는 단계를 포함하는,
    아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드의 활성을 활성화 또는 억제하는 제제를 하나 이상의 시험되는 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  20. a) 제9항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포를 시험되는 화합물들과 접촉시키는 단계;
    c) 제제의 활성에 대한 강화 또는 억제 효과를 측정함으로써 강화제 또는 억제제를 동정하는 단계를 포함하는,
    아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 함유하는 단리된 폴리펩티드에의해 활성이 강화 또는 억제되는 제제를 시험되는 하나 이상의 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  21. a) 대상체의 게놈에 있어서 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정하는 단계;
    b) 대상체에서 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 대상체에서 제1항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정하는 단계;
    d) 대상체에서 제1항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 농도를 측정하는 단계; 및
    e) 대상체에서 제1항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 작용성을 측정하는 단계들 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함하는,
    대상체의 생물학적 특성을 분석하는 방법.
  22. - 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;
    - 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터;
    - 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포;
    - 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 보유하는 단리된 폴리펩티드;
    - 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체; 및
    - 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 치료제.
  23. 치료 유효량의 제22항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암 및 종양이 전이된 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 비롯한 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 대사 질환이 비만을 비롯한 비-면역계 질환을 포함하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 감염성 질환이 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀를 비롯한 성병을 포함하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 중추 신경계 질환이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 면역계 및 자가면역계 질환이 조직 또는 기관 이식의 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 심혈관 질환이 뇌 손상, 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함하는 방법.
  30. 치료 유효량의 제22항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 상처 치유 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  31. 치료 유효량의 제22항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 특히 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에 있어서 자가 혈액의 생산을 증가시키는 방법.
  32. 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 보유하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 치료할 대상체로부터 수득할 수 있는, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포; 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 포함하는 단리된 폴리펩티드; 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체; 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체 중 하나 이상의 치료 유효량, 및 제약상 허용가능한 부형제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에 있어서 제12항에 따른 폴리펩티드의 활성을 증가 또는 감소시키는 방법.
  33. 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a,g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 보유하는 뉴클레오티드 서열 1 또는 당해 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포; 아미노산 서열 2의 전부 또는 일부를 포함하고, D70N, G104S 및 S147C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코딩 SNP를 포함하는 단리된 폴리펩티드; 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번의 아미노산을 포함하고, SNP: G104S를 보유하는 폴리펩티드의 하이퍼글리코실화 유사체; 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적인 항체 중 하나 이상의 치료 유효량, 및 제약상 허용가능한 부형제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에 있어서 대상체의 게놈내의 제1항의 폴리뉴클레오티드의 존재와 연관된 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  34. a) 개체군의 유전자형을 결정하는 단계;
    b) 상기 개체군내의 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 분포를 측정하는 단계;
    c) 유전자형 데이터를 상기 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 분포와 비교하는 단계; 및
    d) 상기 비교 결과의 통계학적 상관 관계를 분석하는 단계를 포함하는,
    EPO (에리트로포이에틴) 유전자에 있어서, 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP와 질환 또는 당해 질환에 대한 내성 사이의 통계학적 상관 관계를 결정하는 방법.
  35. EPO 유전자에 있어서, 465-486 (결실), c577t, g602c, c1288t, c1347t, t1607c, g1644a, g2228a, g2357a, c2502t, c2621g 및 g2634a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출하는 것을 포함하는, 질환 또는 당해 질환에 대한 내성의 예후를 진단 또는 결정하는 방법.
  36. a) 인간 EPO-수용체를 과발현시키는 32D 세포주의 세포 증식에 대한 자극 효과, 적혈구 콜로니 형성에 대한 자극 효과 및/또는 EPO 수용체에의 결합 능력을 비롯한, 화합물의 생물학적 활성을 측정하는 단계;
    b) 시험되는 화합물의 단계 a)에서 측정된 활성을 G104S 변이된 EPO 유전자 산물의 활성과 비교하는 단계; 및
    c) 상기 화합물이 G104S 변이된 EPO 유전자 산물의 활성과 비교하여 실질적으로 유사한 활성을 보유하는지 보다 높은 활성을 보유하는지를 단계 b)에서 수행된 비교 결과를 기초로 하여 결정하는 단계를 포함하는,
    G104S 변이된 EPO 유전자 산물의 활성과 실질적으로 유사하거나 보다 높은 생물학적 활성을 보유하는 화합물을 시험되는 하나 이상의 화합물들 중에서 동정하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 시험되는 화합물을 합성 펩티드 조합 라이브러리, 고처리율 스크리닝으로부터 동정하거나, 서열 2의 폴리펩티드, 또는 아미노산 서열 2의 28번 내지 193번 위치 사이에 포함된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 것과 동일한 삼차원 구조를 갖도록 컴퓨터에 의한 약제 디자인에 의해 설계하며, 상기 아미노산 서열은 G104S SNP를 포함하는 방법.
  38. 제36항의 방법에 의해 동정된 화합물.
  39. 치료 유효량의 제38항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 암 및 종양, 감염성 질환, 성병, 면역계 및/또는 자가면역계 질환 및 장애, 심혈관 질환, 대사 질환, 중추 신경계 질환, 위장 장애, 및 화학요법 처치와 관련된 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 암 및 종양이 전이된 신장 암종, 흑색종, 여포성 림프종 및 피부 T 세포 림프종을 비롯한 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 간암, 경부암, 두부암, 신장암, 다발성 골수종, 카르시노이드 종양 및 AIDS의 경우에 카포시 육종을 비롯한 면역 결핍으로 인해 나타나는 종양을 포함하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 대사 질환이 비만을 비롯한 비-면역계 질환을 포함하는 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 감염성 질환이 만성 B형 및 C형 간염 및 HIV/AIDS를 비롯한 바이러스성 감염, 감염성 폐렴, 및 생식기 사마귀를 비롯한 성병을 포함하는 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 중추 신경계 질환이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 우울증을 포함하는 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 면역계 및 자가면역계 질환이 조직 또는 기관 이식의 거부반응, 알레르기, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 방법.
  45. 제39항에 있어서, 상기 심혈관 질환이 뇌 손상, 신부전증에서 투석하의 환자에서의 빈혈, 및 만성 감염, 염증 과정, 방사선요법 및 화학요법으로부터 유발된 빈혈을 포함하는 방법.
  46. 치료 유효량의 제38항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에 있어서 상처 치유 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  47. 치료 유효량의 제38항의 치료제 및 제약상 허용가능한 부형제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 특히 다양한 자가 혈액 수집 프로그램에 참여한 환자에 있어서 자가 혈액의 생산을 증가시키는 방법.
  48. 야생형 인간 에리트로포이에틴의 세포 증식 작용성 특성과 적어도 동일한 세포 증식 작용성 특성을 보유하고 에리트로포이에틴 수용체에 결합할 수 있으며, 헬릭스 B의 아미노산 서열에서 하나 이상의 변형을 보유함으로써, 야생형 인간 에리트로포이에틴의 친화성보다 높은 친화성으로 에리트로포이에틴 수용체에 결합하는 헬릭스 A, B, C 및 D를 특징으로 하는 분자.
  49. 야생형 에리트로포이에틴의 헬릭스 B에 상응하는 에리트로포이에틴 유사 분자의 부분의 아미노산 서열을 변경시키는 것을 포함하는, 야생형 에리트로포이에틴의 헬릭스 B 부분에 상응하는 부분을 보유하고 에리트로포이에틴 수용체에 결합할 수 있는 에리트로포이에틴 유사 분자의 세포 증식 작용성을 향상시키는 방법.
  50. 제48항의 분자 및 제약상 허용가능한 비히클을 포함하는 치료 화합물.
  51. 치료 유효량의 제50항의 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  52. 헬릭스 A, B, C 및 D를 보유하는 인간 야생형 에리트로포이에틴 분자 또는 당해 분자를 코딩하는 유전자를 변형시켜, 헬릭스 B의 아미노산 서열을 당해 분자의 에리트로포이에틴 수용체에 대한 결합 친화성이 향상되도록 변경시키는 것을 포함하는, 헬릭스 A, B, C 및 D를 보유하는 인간 야생형 에리트로포이에틴 분자의 작용성을 향상시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 서열 2의 글리신 104번에 상응하는 아미노산을 변경시키는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 서열 2의 글리신 104번에 상응하는 아미노산을 세린으로 치환시키는 방법.
  55. 제52항의 방법에 의해 제조된 화합물.
  56. 제53항의 방법에 의해 제조된 화합물.
  57. 제54항의 방법에 의해 제조된 화합물.
  58. 서열 2의 글리신 104번에 상응하는 아미노산이 변경된, 제49항의 방법에 의해 제조된 화합물.
  59. 서열 2의 글리신 104번에 상응하는 아미노산이 세린으로 치환된, 제49항의 방법에 의해 제조된 화합물.
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