CN103352087A - 一种3个运动能力相关基因的pcr-ldr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用LDR法同时检测3个运动机能相关基因的联合检测试剂盒，该试剂盒可在3个小时内同时检测三个运动机能相关基因中的3个热点突变，该试剂盒包括PCR扩增试剂和LDR反应试剂；所述PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增ACTN3、EPO、CKMM三个基因中3个热点突变的引物混合物；所述LDR反应试剂试剂包括：PCR产物、10×连接缓冲液、LDR探针、Taq DN A连接酶等。一共包括3对PCR引物和3组检测探针。本试剂盒能完成一次性获得3个关键与运动能力显著相关基因的基因型，实现了对运动能力的高通量筛查。

Description

一种3个运动能力相关基因的PCR-LDR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种3个运动能力相关基因的PCR-LDR检测试剂盒。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。与个体运动能力的相关多个基因位点已经被发现，遗传工程应用于运动选材的前景广阔而紧迫目前较为成熟的运动人材基因筛选的相关位点包括：

1.ACTN3基因

ACTN3是一个与爆发力相关的基因，该基因位于人体第11号染色体上，它的R等位基因所编码产生的α-辅肌动蛋白-3只存在于骨骼肌的快肌纤维中，正常情况下其16号外显子的第1747位核苷酸的碱基为c，能指导编码ACTN3蛋白；当该位点发生了c到T的突变，基因链产生了终止密码子，取代了氨基酸残基第577位的精氨酸，使快肌纤维无法合成ACTN3蛋白，从而导致α-辅肌动蛋白-3的缺失。已经有大量研究证明，577R位点的CC基因型则由于拥有两个ACTN3基因使得爆发力相关的运动能力明显优于CT和TT型。

2.CKMM基因

肌酸激酶(CK)是Cr+MgATP+H——PCr+MgADP反应的关键酶。CK与磷酸肌酸组成肌酸一磷酸肌酸穿梭系统，在细胞内的作用：一是，在高能量需求时作为“暂时的能量缓冲系统”保持ATP/ADP的比率；二是，作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。肌型肌酸激酶是一种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。肌肉中CKMM主要集中在M线附近，其主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动提供能量，CKMM也存在肌质网Ca ATP酶附近，可能影响Ca的再聚集，从而影响肌肉的工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多态性与耐力以及耐力训练效果有关。

CKMM基因多态性的三种基因型分别为：AA型、GG型和杂合子AG型。研究结果显示：与耐力训练前相比，训练后相通亚极限强度运动时，AA、AG型的人运动能力提高显著，但GG型训练后各种指标改变不明显。因此GG型基因为耐力训练中最不敏感，携带A等位基因的AA型、AG型人对耐力训练的敏感性显著高于和GG型。

最新研究表明在高强度运动后出现的肌痛、肌酸激酶增高等横纹肌溶解症状，与ACE与CKMM基因有密切的关系。运动后与D等位基因(ACE基因)和G等位基因(CKMM基因)的个体更易出现肌酸激酶高反应。而同时具有DD基因型(ACE基因)和GG基因型(CKMM基因)的人，会出现运动后肌酸激酶异常升高，D+G基因型有相加作用。

3.促红细胞生成素(EPO)基因

EPO基因是促进红细胞生成增多的关键调节基因，通过促进红细胞生成增多来提高机体携氧和运氧能力，可以通过促进红细胞生成增多来提高携氧和运氧能力，可以促使机体更快的产生能量，EPO还能促进红细胞释放进入血液，减轻低氧对机体的损伤即能增强个体对低氧环境的适应性，是可以让运动员跑的更久的基因，在越野、长跑等耐力项目中拥有更多的EPO能给机体提供更多的能量。研究发现不同种族人群中EPO基因SNP/T3541G多态性分布存在差异性，优秀基因型T/G能增强个体对低氧的适应性和耐受性。因此EPO基因序列多态性可能与不同个体间对低氧适应性具有差异性。针对位于人类EPO基因全序列第3541bp处，在EPO基因3’端增强子上，一个T/G单核苷酸多态性，即SNP/T3541G的研究表明，在EPO基因T3541G位点的三种基因型：TT型、TG型、GG型中，携带T等位基因的人群低氧适应能力较GG型更强。

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligasedetection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquidchromotography，DHPLC)、定量PCR，其中利用DNA分析仪直接测序是金标准，但是上述方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。

本试剂盒采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction-ligase detectionreaction，PCR-LDR)结合毛细管电泳技术来检测3个运动能力相关基因，LDR的原理是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别，若高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着单个核苷酸的错配，即会阻止杂交探针的连接。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，相对测序法一次出一个序列，PCR-LDR连接酶反应整合了多个位点使用测序仪完成既保证了准确率又节约了时间，大大节约了人力物力和时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测3个运动能力相关基因的PCR-LDR检测试剂盒

为了实现上述目的，该试剂盒包括PCR扩增和LDR反应试剂；包括3对PCR引物和3组检测探针。

本发明以ACTN3、CKMM和EPO等3个基因的基因型为检测对象，通过对上述运动基因的扩增和毛细管电泳，与基因分型标准物的对比，3小时内即可筛选出含有上述位点突变的个体。本试剂盒首次采用复合LDR连接酶检测反应，同时对ACTN3、CKMM和EPO3个基因进行PCR-LDR扩增，而后经毛细管电泳后分析片段大小，即可实现对3个基因位点的同时检测。该方法灵敏度高，判读清晰准确；相对传统测序技术，本试剂盒能完成一次性获得3个关键耳聋基因突变诊断结果的高通量筛查，具有经济、高效和高准确率等优势。

附图说明

本发明分型完整清晰，结果如图1-7所示：

图1：26号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：CC纯合、A/G杂合、T/G杂合，与测序结果一致。提示该个体具有较好的爆发力、较好的训练敏感性和较强的低氧适应能力。

图2：81号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：C/T、G/G、T/T，与测序结果一致。提示该个体具有较好的爆发力和较强的低氧适应能力。

图3：90号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：T/T、A/A、G/G，与测序结果一致。提示该个体具有较好的训练敏感性。

图4：56号样本血斑来源DNA直接测序结果，其中ACTN3基因型为，C/T，提示该个体具有较好的爆发力。

图5：56号样本血斑来源DNA直接测序后结果，其中CKMM基因型为：A/G(利用反向序列设计测序引物)，提示该个体具有较好的训练敏感性。

图6：56号样本血斑来源DNA测序分型后结果，EPO基因型为：T/G，提示该个体具有较强的低氧适应能力。

图7：56号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：C/T、A/G、T/G，与测序结果一致。提示该个体具有较好的爆发力、较好的训练敏感性和较强的低氧适应能力。

图8：试剂盒的组成结构图。

具体实施方式

1.基因组DNA准备

待检样品选用磁珠或Chelex-100法提取基因组DNA，提取的样品基因组DNA定量在约1ng/ul-10ng/ul。

2.PCR反应：

按如下过程实验：

体系：25 ul

每次实验都要求同时做阴性对照和阳性对照

PCR循环参数：

备注：因各地PCR仪器性能不同，循环参数中的退火温度可提高或降低1℃。

3、连接酶反应体系：

反应条件：

94℃   2min

94℃   30S；60℃  2min，30Cycles

20℃   pause

4电泳检测

取1ul连接产物与0.5ul Marker ROX-300和10ul去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟冰浴，电泳检测。

实验所需模板和引物如下：

其中用于ACTN3基因引物序列如下：

ACTN3_M：5’P-GTAGAGCTCGGGTTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCACCTACTCATACC

ACTN3_C：TTTTTTTTTTCCAAATGACCGTCCCTACTCT

ACTN3_T：TTTTTTTTTTTTTCCCCCTATATCACCATCCGCCTAA

用于CKMM基因引物序列如下：

CKMM_M：5'P-TGGGACTTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCACCCTGCTACC

CKMM_A：TTTTTTTTTTTTTTCACTAGATTACTTACCTAAGATCACCAACA

CKMM_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCCTCCATTATCTCTCAGGCC

用于EPO基因引物序列如下：

EPO_M：5'P-TTCATATTGAAGCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTAAGCGCTCTTATG

EPO_T：TTTTTTTTTTTTTTCTGCATGAGGTCTGGACGGTAG

EPO_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCCATCAGCCGTACAGGGCG

实施例2

与测序法比较有如下优势：结果更易读，引物特异性更高，更灵敏

图4：第56号样本血斑来源DNA直接测序结果，其中ACTN3基因型为，C/T，提示该个体具有较好的爆发力。

图5：第56号样本血斑来源DNA测序后结果，其中CKMM基因型为：A/G(利用反向序列设计测序引物)，提示该个体具有较好的训练敏感性。

图6：第56号样本血斑来源DNA直接测序结果，EPO基因型为：T/G，提示该个体具有较强的低氧适应能力。

图7：第56号样本血斑来源DNA使用本试剂盒进行测序分型后结果，其中ACTN3、CKMM、EPO三个基因的分型结果依次为：C/T、A/G、T/G，与测序结果一致。提示该个体具有较好的爆发力、较好的训练敏感性和较强的低氧适应能力。

Claims (1)

1.一种同时检测3个运动基因的PCR-LDR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包装盒体(1)，PCR扩增和LDR反应试剂； 

所述PCR扩增试剂分别为PCR扩增Reaction Mix(2)和(3)；所述LDR反应试剂为LDR反应Probe Mix(4)和(5)； 

所述3个运动能力相关基因为ACTN3C＞T，CKMM A＞G，EPO T＞G； 

实验所需模板和引物如下： 

其中用于ACTN3基因引物序列如下： 

ACTN3_M：5’P-GTAGAGCTCGGGTTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCACCTACTCATACC 

ACTN3_C：TTTTTTTTTTCCAAATGACCGTCCCTACTCT 

ACTN3_T：TTTTTTTTTTTTTCCCCCTATATCACCATCCGCCTAA 

用于CKMM基因引物序列如下： 

CKMM_M：5’P-TGGGACTTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCACCCTGCTACC 

CKMM_A：TTTTTTTTTTTTTTCACTAGATTACTTACCTAAGATCACCAACA 

CKMM_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCCTCCATTATCTCTCAGGCC 

用于EPO基因引物序列如下： 

EPO_M：5’P-TTCATATTGAAGCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTAAGCGCTCTTATG 

EPO_T：TTTTTTTTTTTTTTCTGCATGAGGTCTGGACGGTAG 

EPO_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCCATCAGCCGTACAGGGCG。 

Images