CN103525906A - 速度或爆发力相关基因-actn3多态性速测试剂盒及检测方法 - Google Patents

速度或爆发力相关基因-actn3多态性速测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶、引物混合物和超纯水；所述基因分型用试剂琼脂糖、TAE缓冲液、DAN分子量标准、DAN无毒染料和DAN上样缓冲液。本发明还公开一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法。本发明的有益效果如下：可以为运动员选材提供快速参考；准确性高，方法简单易操作，检测成本低，便于应用推广。

Description

速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物基因检测技术领域，具体为一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒及检测方法。
背景技术：
近年来，随着分子生物学技术与理论的飞速发展，限制性片段长度多态和单核苷酸多态作为遗传标记技术得到广泛的应用，从而使在基因水平上寻找决定人类运动能力的基因成为可能，并且能更加科学而准确地评估个体的运动状态及运动潜力，也使基因选材成为未来运动员科学遴选的主要研究内容。
研究表明，ACTN3基因与肌肉爆发力相关，是指导合成α-辅肌动蛋白-3的基因,可分为RR型、RX型和XX三种类型。该基因位于人体第11号染色体,正常情况下，其16号外显子的第1747位核苷酸的碱基为C,指导编码ACTN3蛋白；当该位点C碱基突变为T碱基,第577位的精氨酸链密码子变为终止密码子时,将导致α-辅肌动蛋白-3的缺失，影响肌肉拉伸速度，降低爆发力，世界上约有18%的人存在此多态。
国内外研究结果表明，ACTN3基因位点可能是决定运动员爆发力素质的主效基因，CC纯合型爆发力素质优于CT、TT型，该基因可以作为爆发力相关项目运动员的基因选材指标。
目前常用的基因检测方法有：连接酶检测反应、限制性片段长度多态性分析、直接测序、定量PCR等。但这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、重复性差、准确性不高等问题。
发明内容：
本发明的目的是针对以上所述ACTN3基因现有检测方法存在的不足，提供一种准确性高、操作简易且检测成本低的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒。
本发明另一目的是提供一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法。
为了实现本发明目的，本发明是采取的技术方案是：速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其包括引物混合物，所述引物混合物为：
SEQ NO.1：5’-GCCCCAAATTCTGCCACCCACAAC-3’；
SEQ NO.2：5’-GCTGGGAAATGGCTTTAGGGGAGAT-3’；
SEQ NO.3：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAC-3’；
SEQ NO.4：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAT-3’。
且摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=0.8-1.2:0.32-0.48:1。
其中浓度为10uM的所述内参上游引物（SEQ NO.1）用量为0.1-0.3μl,浓度为10uM的多态性引物（SEQ NO.2，SEQ NO.3）用量为0.04-0.12μl、浓度为10uM的下游引物（SEQ NO.4）（10uM）用量为0.1-0.3μl。
所述速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶和超纯水；
所述速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒还包括扩增后的基因分型用试剂，所述扩增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、TAE缓冲液、DAN分子量标准（DAN Marker）、DAN无毒染料和DAN上样缓冲液。
优选的，所述扩增试剂包括10倍PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.1-0.125μl。
优选的，扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure BDA00003633585700021
Figure BDA00003633585700031
其中，所述PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl，所述内参上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。
优选的，扩增试剂由以下体积的组分组成：
其中，所述PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl，所述内参上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。
所述内参上游引物为SEQ NO.1，多态性引物为SEQ NO.2和SEQ NO.3，下游引物为SEQ NO.4。
一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法,其步骤包括：
（1）、检材基因组的DAN提取；
（2）、扩增和扩增产物的检测分析；
其中，PCR扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure BDA00003633585700041
其中，所述PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl，所述内参上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。
PCR扩增程序如下：
Figure BDA00003633585700042
（3）、做琼脂糖凝胶电泳分析。
所述扩增采用AS-PCR（等位基因特异性PCR）来进行，然后采用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行多态性分型检测。
其中，所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DAN；所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑或血液。
其中，用于ACTN3-C1747T基因多态性分型扩增的引物SEQ NO.1为内参上游引物；SEQ NO.2和SEQ NO.3的3′端第二位碱基分别错配为A碱基，为多态检测上游引物；SEQ NO.4为内参和多态检测共用下游引物。
通过AS-PCR及琼脂糖凝胶电泳特异性检测速度/爆发力相关基因ACTN3-C1747T多态性；用于ACTN3-C1747T多态性基因检测的引物为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：以ACTN3基因的C1747T多态位点为检测对象，通过半巢式AS-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，根据DNA电泳条带即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为运动员选材提供参考；采用AS-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术实现ACTN3基因的C1747T多态位点的检测，准确性高，方法简单易操作，检测成本低，便于应用推广。
附图说明
图1是本发明速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒对8,18,26号样本ACTN3-C1747T基因多态性分型电泳图；
图2是本发明速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒对ACTN3-C1747T基因多态性分型电泳图中8,18,26号样本对应的测序图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细的描述说明。
速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶、引物混合物和超纯水；所述扩增后的基因分型用试剂：试剂琼脂糖、TAE缓冲液、DAN分子量标准、DAN无毒染料和DAN上样缓冲液。所述DNA上样缓冲液(DNA loadingbuffer，6X)，是一种经过适当改良的常规的六倍浓缩的DNA上样缓冲液，以溴酚蓝为指示剂，稀释至1X后比重仍然较大，上样时极易下沉，且颜色清晰可见，此DNA上样缓冲液在市场上可以购买到。
所述扩增试剂包括扩增试剂包括10倍PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl 500Mm;MgCl215mM），各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.1-0.125μl。优选的，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.120μl。其中，dNTP混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四中核苷酸组成。
所述引物混合物为
SEQ NO.1：5’-GCCCCAAATTCTGCCACCCACAAC-3’；
SEQ NO.2：5’-GCTGGGAAATGGCTTTAGGGGAGAT-3’；
SEQ NO.3：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAC-3’；
SEQ NO.4：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAT-3’。
且摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=0.8:0.32:1。
或者，摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1.2:0.48:1。
优选的，摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1：0.4：1，此比例扩增效果最好。
其中浓度为10uM的所述内参上游引物（SEQ NO.1）用量为0.1μl,浓度为10uM的多态性引物（SEQ NO.2，SEQ NO.3）用量为0.04μl、浓度为10uM的下游引物（SEQ NO.4）（10uM）用量为0.1μl。
或者浓度为10uM的所述内参上游引物（SEQ NO.1）用量为0.3μl,浓度为10uM的多态性引物（SEQ NO.2，SEQ NO.3）用量为0.12μl、浓度为10uM的下游引物（SEQ NO.4）（10uM）用量为0.3μl。
优选的，其中浓度为10uM的所述内参上游引物（SEQ NO.1）用量为0.2μl,浓度为10uM的多态性引物（SEQ NO.2，SEQ NO.3）用量为0.08μl、浓度为10uM的下游引物（SEQ NO.4）（10uM）用量为0.2μl。
实施例1
扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure BDA00003633585700061
实施例2
扩增试剂由以下体积的组分组成：
实施例3
扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure BDA00003633585700073
所述内参上游引物为SEQ NO.1，多态性引物为SEQ NO.2和SEQ NO.3，下游引物为SEQ NO.4。
一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法,其步骤包括：
（1）、检材基因组的DAN提取；
（2）、扩增和扩增产物的检测分析；
其中，PCR扩增试剂优选由以下体积的组分组成：
Figure BDA00003633585700081
所述内参上游引物为SEQ NO.1，多态性引物为SEQ NO.2和SEQ NO.3，下游引物为SEQ NO.4。
另外，PCR扩增试剂也可以选用上述实施例组成，其效果也可以满足检测要求。
PCR扩增程序如下：
Figure BDA00003633585700082
（3）、做琼脂糖凝胶电泳分析。
可以将扩增产物在ABI3130基因遗传分析仪上的检测分析，以验证本发明上述检测结果。
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物，将10ul上样混合物与1ul扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡，95℃变性5min，做电泳，用ABI3130基因遗传分析仪检测分析验证分析结果。
所述扩增采用AS-PCR（等位基因特异性PCR）来进行，采用琼脂糖凝胶电泳进行多态性分型检测。
其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DAN；所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑或血液。
通过AS-PCR及琼脂糖凝胶电泳特异性检测速度/爆发力相关基因ACTN3-C1747T多态性；用于ACTN3-C1747T多态性基因检测的引物为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
实施例4
本发明的试剂盒检测30个不同个体的DNA样本。
1、待测样本30份，下文列举的是不同个体的基因型个体3分的结果。相关样本都已经使用“DAN提取—PCR扩增—测序”的技术方法对ACTN3-C1747T基因进行过测序检测。其中，3号、18号、26号样本的分型结果依次为：C/T、T/T、C/C。
2、检材的基因组DAN提取：Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml,振荡离心，弃上清，重复步骤两次，弃上清，将5%Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取200ul加入离心管中，振荡数秒，于56℃水浴保温30min后，振荡数秒，95℃沸水浴10min,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清为提取的DAN。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1PCR扩增体系：
3.1PCR扩增体系：
Figure BDA00003633585700091
Figure BDA00003633585700101
3.2PCR扩增程序：
Figure BDA00003633585700102
所述扩增采用AS-PCR（等位基因特异性PCR）来进行，采用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行多态性分型检测。
4、扩增产物在ABI3130基因遗传分析仪上的检测分析验证
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物（0.2ul分子量内标×进样书+9.8ul去离子甲酰胺×进样数）。将10ul上样混合物与1ul扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，并尽快电泳，用ABI3130基因遗传分析仪检测分析。
5、结论
本发明分型完整清晰，结果如图1所示：其中，用M.DL1000DNA分子量标准；1,3,5泳道为SNP“C”的多态引物PCR扩增产物；2,4,6泳道为SNP“T”的多态引物PCR扩增产物；1,2泳道基因分型为CC型；2,3泳道基因分型为CT型；5,6泳道基因分型为TT型。
如图2所示，图1：3号样本ACTN3-C1747T基因多态性分型电泳图中，C泳道700bp位置下方出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值831bp吻合，T泳道无目的条带出现，检为CC纯合，与测序结果一致，表明该个体具有较好的速度/爆发力优势。
图1：18号样本ACTN3-C1747T基因多态性分型电泳图中，C泳道与T泳道700bp位置下方均出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值831bp吻合，，检为C/T杂合，测序图表现为C/T套峰，用“Y”表示，与测序结果一致。
图1：26号样本ACTN3-C1747T基因多态性分型电泳图中，T泳道700bp位置下方出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值831bp吻合，C泳道无目的条带出现，检为TT纯合，与测序结果一致。
以上实施例中所用的Taq热启动聚合酶及其他试剂和耗材均为市售产品。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

Claims (10)

1.速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其包括引物混合物，其特征在于，所述引物混合物为：
SEQ NO.1：5’-GCCCCAAATTCTGCCACCCACAAC-3’；
SEQ NO.2：5’-GCTGGGAAATGGCTTTAGGGGAGAT-3’；
SEQ NO.3：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAC-3’；
SEQ NO.4：5’-CAAGGCAACACTGCCCGAGGCTGAAT-3’；
且摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=0.8-1.2:0.32-0.48:1。
2.根据权利要求1所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，浓度为10uM的所述内参上游引物用量为0.1-0.3μl,浓度为10uM的多态性引物用量为0.04-0.12μl、浓度为10uM的下游引物用量为0.1-0.3μl。
3.根据权利要求1所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶和超纯水。
4.根据权利要求1所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，还包括扩增后的基因分型用试剂，所述扩增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、TAE缓冲液、DAN分子量标准、DAN无毒染料和DAN上样缓冲液。
5.根据权利要求1所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括10倍PCR缓冲液：其中，Tris-HCl pH8.3 100mM;KCl 500Mm;MgCl215mM，各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶用量为0.1-0.125μl。
6.根据权利要求1所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure FDA00003633585600021
其中，所述PCR缓冲液中：Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM，所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶为5U/μl，所述内参上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。
7.根据权利要求6所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性速测试剂盒，其特征在于，扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure FDA00003633585600022
8.一种速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法,其特征在于，其步骤包括，
（1）、检材基因组的DAN提取；
（2）、扩增和扩增产物的检测分析；
其中，PCR扩增试剂由以下体积的组分组成：
Figure FDA00003633585600031
PCR扩增程序如下：
Figure FDA00003633585600032
（3）、做琼脂糖凝胶电泳分析。
9.根据权利要求8所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法,其特征在于，由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物，将10ul上样混合物与1ul扩增产物或等位基因分析标准物混合，95℃变性5min，做电泳。
10.根据权利要求8所述的速度或爆发力相关基因-ACTN3多态性检测方法,其特征在于，其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DAN；所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑或血液。
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