CN109468368A - 检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途 - Google Patents
检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途，所述试剂盒至少包括：rrs基因检测引物，所述rrs基因检测引物至少有3种，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。采用本发明所述的试剂盒能够达到对结核分枝杆菌rrs基因的特异性扩增，有利于耐卡那霉素的结核分枝杆菌的快速鉴别，用以指导临床用药。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途。
背景技术
结核病(TB)是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。
结核病是威胁人类3大感染性疾病之一，是仅次于艾滋病的第2大致死性感染性疾病。据世界卫生组织发表的《2014全球结核病报告》中显示，2013年全球有900万人感染结核病，150万人因结核病而死亡，其中包括36万艾滋病毒感染者。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。导致结核病爆发流行的主要原因包括人口流动的加速、人类免疫缺陷病毒感染的流行、无规律化疗和治疗药物的中断及质量不佳导致耐药菌株的出现。我国是22个结核病高负担国家之一，虽然制定了一系列有关于TB防治的政策法规，但伴随着耐药结核分枝杆菌(MTB)的不断传播，TB的流行趋势不容乐观。
MTB耐药突变株的自然变异率很低，但随着耐药菌株的传播，原发性耐药会逐渐增多，在许多TB控制较好的地区原发耐药TB患者占全部耐药患者的多数。耐药结核的出现给TB的控制和治疗带来了很大困难，患者必须使用二线甚至三线药物治疗。
我国卫生部2008年调查结果显示，我国TB患者中总耐药率为38％，其中耐多要率为8.32％，对至少2种药物产生耐药(MDR)的结核病患者，必须要有结核菌药敏试验结果才能确诊。世界卫生组织(WHO)推荐一线和二线抗结核药物可以混合用于治疗MDR-TB。卡那霉书做为治疗结核病的一种二线药物，引起其耐药的主要因素是基因rrs的突变，MarionBlaschitz和Suzuki Y分别在文章中指出MTB耐卡那霉素主要是基因rrs(第1401和1402位碱基)突变所致；吴雪琼在其文章中指出MTB耐卡那霉素是由于rrs突变所致，突变率为32.6％～67.4％。
现阶段主要的几种耐药检测方法：(1)PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)：该方法的优点是简便、快速、价廉，并具有较高的特异性，但只能用于分析已知序列特定位点的基因突变，应用范围较局限。(2)基因芯片：其原理是采用固相原位合成或显微打印技术，将寡核苷酸固化于支持物表面上，与带标记的样品进行杂交形成稳定的双链结构，通过检测目的单链上的荧光信号，对生物样品进行快速、灵敏、高效地检测，但操作技术有要求，相对成本也较高，对未知的突变不能检测。(3)测序法：该方法能够确定突变的部位与性质，是检测基因突变的决定性方法，自动化DNA测序仪的应用使测序效率大大提高。该方法具有准确度高，特异性和重复性好等特点，可对基因型进行直观的判断，是分析基因突变的金标准，，但是突变率低于15％的检测不出、实验流程较复杂。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测rrs基因第1401和1402位碱基的基因型，准确度高，特异性好。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒，所述试剂盒包括rrs基因检测引物，所述rrs基因检测引物至少有3种，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。
本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行rrs基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象rrs基因第1401和1402位碱基的基因型。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。
MTB rrs基因在NCBI中的登录号为NC_000962.3(1471846..1473382)。
基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。
优选地，所述试剂盒中包含两种独立包装的引物对，其中一个包装含有的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，另外一个包装含有的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3所示。
PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。
优选地，所述试剂盒中还含有阳性对照，所述阳性对照为含有rrs基因第1401和1402位碱基突变的结核分枝杆菌DNA样本。
本发明的第二方面提供了一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)将样品基因组DNA加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得样品反应管，所述PCR反应体系中含有gyrA基因检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
(3)第一轮PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应，获得第一轮PCR反应产物；
(4)取第一轮PCR反应产物作为第二轮PCR的模板，加入到PCR反应管中，同时加入引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；
(5)第二轮PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应，获得第二轮PCR反应产物；
(6)PCR反应结束后，分析结果。
优选地，所述步骤(3)中的反应条件设置为(a)95.0℃5 min；(b)95℃30s；58℃30s；72℃40s；步骤(b)循环35次；(c)72°10min。
优选地，所述步骤(5)中的反应条件与步骤(3)相同。
本发明的另一方面公开了上述试剂盒在制备rrs基因检测产品中的用途。
进一步地，所述检测产品用于检测和筛选耐卡那霉素药物的结核分枝杆菌
如上所述，本发明的检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途，具有以下有益效果：
采用本发明的检测试剂盒和方法，能够达到对结核分枝杆菌的rrs基因的特异性扩增，有利于耐卡那霉素药物的结核分枝杆菌的快速鉴别，用以指导临床用药。
附图说明
图1为步骤二(1)中未加入rrs-R1特异性引物后扩增条带电泳对比图；M(marker)自上而下由1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp 7条带组成，1～5号仅使用一轮PCR引物扩增的条带。
图2为步骤二(2)中1～5号样品扩增带电泳对比图；M(marker)自上而下由1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp 7条带组成。
图3是图2中1号条带PCR产物的测序结果图。
图4是图2中2号条带PCR产物的测序结果图。
图5是图2中3号条带PCR产物的测序结果图。
图6是图2中4号条带PCR产物的测序结果图。
图7是图2中5号条带PCR产物的测序结果图。
图8是图2中5号PCR产物的测序结果，图中“NN”从左往右为1401和1402位碱基的基因型(图8中显示的片段为含有对比序列的片段)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1试剂盒的制备
引物设计与合成：以rrs基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳检测用引物对，为更好显示rrs基因第1401和1402位碱基的基因型，选择以上位点附近的序列进行引物设计，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
上述引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对；也可以是含有配制好的含有引物对的PCR检测液，例如将第一轮PCR两种引物包装在一起，第二轮的两种PCR引物包装在一起。
进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等等。
进一步的所述试剂盒中还可以含有第1401和1402位碱基突变的rrs基因。
实施例2试剂盒对样本的特异性检测
一、样本抽提：痰液提取DNA方法
(1)液化：样本中加入等量的4％NaOH溶液，至痰样完全液化；
(2)离心：转移1.2～1.5mL液化的痰样1.5mL离心管中，13,000rpm离心5分钟；
(3)洗涤：加入1mL MTB洗液，混匀；
(4)离心：10,000rpm离心2分钟；
(5)加液：加入50uL MTB裂解液，充分混匀；
(6)裂解：恒温金属浴100℃加热10分钟；
(7)离心：12,000转/分钟，离心2分钟；
(8)保存：留上清液(即DNA)，待用。
二、对目标产物进行PCR扩增：
(1)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液，每管18ul分装于反应管中。将上述处理好的待测样本各取5ul分别加入反应管中，标号为1、2、3、4和5号，5号采用实施例1制备的试剂盒，1～4分别对应的加入1～4号引物(引物列表如下表2，5号引物为本发明第一轮引物，见上述表1)，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：
PCR反应体系：
| Go-Taq Colorless Master Mix | 10μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 6μL |
| 引物工作液(上游) | 1μL |
| 引物工作液(下游) | 1μL |
| 样品DNA | 5μL |
PCR引物列表：
表2
PCR程序：
对其中1～5号样品进行第一轮PCR反应，具体条件为：(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；58℃30s；72℃40s；步骤(b)循环35次；(c)72°10min。
对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，180V，20min，凝胶成像系统观察目的条带，结果如图1所示。结果表明，用本发明所述的引物获得的PCR产物为泳道中1(564bp)、2(568bp)、3(529bp)、4(523bp)和5(546bp)。表明采用上述试剂盒中rrs第一轮扩增引物效率和特异性较其他4对较好，可以获得特异性和亮度相对较好的条带。
(2)取上述步骤的PCR产物各5ul分别加入反应管中，标号为1、2、3、4、5号，其中1～4号加入的引物如下表3(5号引物见上述表1，为本发明的引物)，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，采用的DNA反应体系与(1)中相同，具体反应程序如下：
表3
PCR程序：
对其中1～5号样品进行第二轮PCR反应，具体条件为：(a)95.0℃5 min；(b)95℃30s；58℃30s；72℃40s；步骤(b)循环35次；(c)72°10min。
对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，180V，20min，凝胶成像系统观察目的条带，结果如图2所示。
结果表明，用本发明所述的引物获得PCR产物的泳道中标注为“5”的条带(542bp)，而采用其他引物获得的扩增条带1～4号依次为439bp，445bp，422bp，432bp的条带，由此可见使用本试剂盒的引物(第一轮PCR引物:rrs-F/R，第二轮PCR引物:rrs-F/R1)扩增的条带单一。
三、对步骤二(2)即两次扩增后的中的目标产物进行PCR纯化、测序
1.试剂配制：按下表配制，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。
BigDye体系：
酶纯化体系：
| 原料 | 1X | 需要体积量(ul/管) |
| CIP | 0.1ul | - |
| Exo I | 0.5ul | - |
| 去离子水 | 1.4ul | - |
2.PCR产物纯化
2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。
2.2取9ulPCR产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。
2.3将混匀样品按照如下反应条件上PCR仪，进行酶纯化扩增。
3.测序反应
3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。
3.2每反应体系5ul，BigDye混合液和5P引物固定加1ul，模板加2ul，最大量为3ul(根据PCR产物电泳结果调整)，用水补足5ul。
3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul引物加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的BigDye混合液，最后加入模板。
3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。
3.5按照如下反应条件上PCR仪，进行测序反应。
4.测序反应后乙醇纯化，上机。
4.1将扩增完的PCR产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mM EDTA，然后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。
4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。
4.3加入50ul的20℃预冷75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。
4.4 300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。
4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和Hi-DiTM各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静置15min.使测序产物完全溶解。
4.6将Hi-DiTM溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至PCR扩增仪上，95℃预变性5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。结果如图3～7所示，可见，1～4分别一一对应于图3～6，5号的扩增产物特异性较高(图7)。
数据分析：应用sequencing analysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的标准序列进行比对，确认样本rrs基因1401和1402位碱基的基因型，结果如图8所示。
结果显示：表明采用上述试剂盒中特定rrs扩增引物，可以通过PCR方法快速鉴定未知MTB的rrs基因1401和1402位碱基的的基因型。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海新培晶医学检验所有限公司
<120> 检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcgttccc ttgtgg 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgttttcgt ggtgct 16
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgtggtg ctccttaga 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttgccagca cgtaatggtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
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<400> 5
aacaagtccg agtgttgcct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
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<210> 7
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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<400> 10
gcacgtaatg gtggggactc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgttggtgg ccaactttgt 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tttcgtggtg ctcctta 17
Claims (9)
1.一种检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括：rrs基因检测引物，所述rrs基因检测引物至少有3种，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含两种独立包装的引物对，其中一个包装含有的引物如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，另外一个包装含有的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有无菌水、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性对照，所述阳性对照为含有rrs基因第1401和1402位碱基突变的结核分枝杆菌DNA样本。
5.如权利要求1～4任意项所述的试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)将样品基因组DNA加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得样品反应管，所述PCR反应体系中含有gyrA基因检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
(3)第一轮PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应，获得第一轮PCR反应产物；
(4)取第一轮PCR反应产物作为第二轮PCR的模板，加入装有PCR反应体系的PCR反应管中，同时加入引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；
(5)第二轮PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应，获得第二轮PCR反应产物；
(6)PCR反应结束后，分析结果。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(3)中的反应条件设置为(a)95.0℃5min；(b)95℃30s；58℃30s；72℃40s；步骤(b)循环35次；(c)72°10min。
7.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中的反应条件与步骤(3)相同。
8.如权利要求1～4任意项权利要求所述的检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒在制备rrs基因检测产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测产品用于检测和筛选耐卡那霉素药物的结核分枝杆菌。
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|---|---|---|---|
| CN201710796480.0A Pending CN109468368A (zh) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109468368A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070645A (zh) * | 2023-07-25 | 2023-11-17 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144099A (zh) * | 2006-09-11 | 2008-03-19 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒 |
| CN103045717A (zh) * | 2011-10-11 | 2013-04-17 | 上海市肺科医院 | 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法 |
| CN103224984A (zh) * | 2013-04-26 | 2013-07-31 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法 |
| CN103882114A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-06-25 | 华晶基因技术有限公司 | 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法 |
-
2017
- 2017-09-06 CN CN201710796480.0A patent/CN109468368A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144099A (zh) * | 2006-09-11 | 2008-03-19 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒 |
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| CN103224984A (zh) * | 2013-04-26 | 2013-07-31 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| MARION BLASCHITZ等: "Real-time PCR for single-nucleotide polymorphism detection in the 16S rRNA gene as an indicator for extensive drug resistance in Mycobacterium tuberculosis", 《J ANTIMICROB CHEMOTHER》 * |
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| CN117070645A (zh) * | 2023-07-25 | 2023-11-17 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法 |
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