CN117070645A - 检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法。其中组合物包括组合物1和组合物2中的至少一个；组合物1包括第一对引物和第一探针，第一对引物包括引物对1、引物对2、引物对3中的任意一个，第一探针包括探针1‑3中的任意一个；组合物2包括第二对引物和第二探针，第二对引物包括引物对4、引物对5、引物对6中的任意一个，第二探针包括探针4‑6中的任意一个。本发明对结核分枝杆菌氨基糖苷耐药检测具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法。
背景技术
在Robert Koch于1882年发现结核分枝杆菌(MTB)近1.5个世纪后，结核病(TB)仍然是一种全球威胁和致命的人类病原体，结核病在免疫功能正常和免疫功能低下个体中的高患病率历来使结核病成为全球十大死因95％的病例和死亡发生在发展中国家。世界上约有四分之一的人口患有结核病感染，结核病仍然是一个全球威胁，多重和广泛耐药结核病的增加带来了更多的挑战。
氨基糖苷类抗生素是治疗MDR-TB的核心二线药物，主要包括阿米卡星、卡那霉素以及它的衍生物丁胺卡那霉素，氨基糖苷类抗生素通过干扰蛋白质的翻译而导致细菌死亡。在蛋白质翻译过程中，多肽链每增加一个氨基酸均需要进位、转肽和移位，氨基糖苷类抗生素通过与核糖体的16SrRNA的核糖小体结合，能有效阻碍氨基酸的进位，从而抑制蛋白质的生物合成。已有研究证明，氨基糖苷类药物耐药与核糖体的16SrRNA编码基因rrs突变显著相关，且多导致高水平耐药。氨基糖苷类药物耐药与eis基因启动子点突变也明显相关,eis基因启动子突变显著提高了eis基因的转录及相应的eis蛋白表达水平，而eis蛋白可以使氨基糖苷类药物乙酰化，药物分子结构发生改变，从而失去抗菌活性。
在临床上，医生需要准确地获取耐药检测结果，才能及时对氨基糖苷耐药患者采用正确的用药方案和疗程进行治疗。
因此，提供一种灵敏度较高，特异性更强的检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的检测试剂对解决上述问题至关重要。
发明内容
本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物、试剂盒及方法，以能够更灵敏、更准确地对待测样本做出氨基糖苷耐药的检测判断。
第一方面，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物，所述组合物包括组合物1和组合物2中的至少一个；
所述组合物1包括第一对引物和第一探针，所述第一对引物包括引物对1、引物对2、引物对3中的任意一个，所述第一探针包括探针1、探针2、探针3中的任意一个；
所述组合物2包括第二对引物和第二探针，所述第二对引物包括引物对4、引物对5、引物对6中的任意一个，所述第二探针包括探针4、探针5、探针6中的任意一个；
所述引物对1为rrs-F1和rrs-R1，所述引物对2为rrs-F2和rrs-R2，所述引物对3为rrs-F3和rrs-R3，所述引物对4为eis-F1和eis-R1，所述引物对5为eis-F2和eis-R2，所述引物对6为eis-F3和eis-R3，所述探针1为rrs-P1，所述探针2为rrs-P2，所述探针3为rrs-P3，所述探针4为eis-P1，所述探针5为eis-P2，所述探针6为eis-P3；
所述rrs-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述rrs-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述rrs-F2的序列如SEQ ID NO.3所示，所述rrs-R2的序列如SEQ ID NO.4所示，所述rrs-F3的序列如SEQ ID NO.5所示，所述rrs-R3的序列如SEQ ID NO.6所示，所述eis-F1的序列如SEQ ID NO.7所示，所述eis-R1的序列如SEQ ID NO.8所示，所述eis-F2的序列如SEQ IDNO.9所示，所述eis-R2的序列如SEQ ID NO.10所示，所述eis-F3的序列如SEQ ID NO.11所示，所述eis-R3的序列如SEQ ID NO.12所示；
所述rrs-P1的序列如SEQ ID NO.13所示，所述rrs-P2的序列如SEQ ID NO.14所示，所述rrs-P3的序列如SEQ ID NO.15所示，所述eis-P1的序列如SEQ ID NO.16所示，所述eis-P2的序列如SEQ ID NO.17所示，所述eis-P3的序列如SEQ ID NO.18所示。
其中，所述第一探针和所述第二探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
所述第一探针和所述第二探针的所述荧光基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3和JOE。
使用本发明的组合物，在对待测样本进行氨基糖苷耐药检测时，方法简单，结果准确，且易于推广，同时本发明所设计的引物和探针灵敏度高，对于rrs和eis检测的检测下限均低至200CFU/ml，并且不会受到其他常见种属相近的或引起症状相似的临床阳性样本的干扰，特异性好。
第二方面，本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，包括如上所述的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括：MgCl2、dNTP、Taq酶中的至少一种。
在一个具体的实施方案中，当所述组合物仅包括所述组合物1和所述组合物2中一者时，所述第一对引物浓度或所述第二对引物浓度为400～1200nM，所述第一探针或所述第二探针浓度为40～300nM，所述Mg2+浓度为1～5mM，所述dNTP浓度为200～500μM，所述Taq酶浓度为2U。
在一个具体的实施方案中，当所述组合物包括所述组合物1和所述组合物2时，所述第一对引物和所述第二对引物的总浓度为400～1200nM，所述第一探针和所述第二探针总浓度为40～300nM，所述Mg离子浓度为1～5mM，所述dNTP浓度为200～500μM，所述Taq酶浓度为2U。
第三方面，本发明提供了一种以非诊断为目的的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样本的DNA；
2)使用上述本发明的组合物或试剂盒对步骤1)获得的待测样本的DNA进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测；
3)分析获得检测结果。
进一步地，所述进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测时使用的待测样本的DNA体积为10μL，所述组合物1或所述组合物2的体积为15μL或者所述组合物1和所述组合物2的总体积为15μL，所述MgCl2、dNTP、和Taq酶的总体积为25μL。
在一个具体的实施方案中，所述进行荧光定量PCR检测时的扩增条件为：
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
本发明的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物是针对rrs区域或eis区域设计的特异引物对和探针，在对结核分枝杆菌氨基糖苷耐药基因rrs或eis进行检测时，灵敏度较高，特异性更强，且同时包含了针对rrs区域和eis区域设计的特异引物对和探针形成的组合物在对结核分枝杆菌氨基糖苷耐药基因rrs和eis进行同时检测也没有交叉反应。
本发明结核分支杆菌氨基糖苷耐药基因eis和rrs基因检测试剂，将结核分枝杆菌基因组提取后，一步法测试，可以缩短临床检测结核分枝杆菌耐药的时间。
使用本发明的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物或试剂盒对结核分枝杆菌氨基糖苷进行耐药检测时具有操作简单、可重复性好，特异性高的特点，检测准确性和灵敏度也得到了很大的提高。
附图说明
图1-1为使用rrs的第1套引物探针时Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-2为使用rrs的第1套引物探针时dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-3为使用rrs的第1套引物探针时引物对1不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-4为使用rrs的第1套引物探针时探针1不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-1为使用eis的第2套引物探针时Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-2为使用eis的第2套引物探针时dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-3为使用eis的第2套引物探针时引物对5不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-4为使用eis的第2套引物探针时探针5不同浓度下对应的熔解曲线图；
图3-1为rrs的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系示意图；
图3-2为eis的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
根据如SEQ ID NO.19所示的rrs目的基因序列和如SEQ ID NO.20所示的eis目的基因序列分别设计引物探针，最终针对rrs目的基因序列和eis目的基因序列分别设计了3套引物探针。
本实施例的目的在于提供用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物，组合物包括组合物1和组合物2中的至少一个，其中，组合物1可以选自rrs的3套引物探针中的任意一套，组合物2可以选自eis的3套引物探针中的任意一套。
rrs的第1套引物探针包括引物对1(rrs-F1和rrs-R1)和探针1(rrs-P1)，第2套物探针包括引物对2(rrs-F2和rrs-R2)和探针2(rrs-P2)，第3套引物探针包括引物对3(rrs-F3和rrs-R3)和探针3(rrs-P3)；eis的第1套引物探针包括引物对4(eis-F1和eis-R1)和探针4(eis-P1)，第2套引物探针包括引物对5(eis-F2和eis-R2)和探针5(eis-P2)，第3套引物探针包括引物对6(eis-F3和eis-R3)和探针6(eis-P3)。其具体序列如表1所示。
表1 rrs和eis的引物探针序列信息
| 名称 | 序列 |
| rrs-F1(SEQ ID NO.1) | TTGTCTCATGTTGCCAGCACGTA |
| rrs-R1(SEQ ID NO.2) | TTGTACCGGCCATTGTAGCAT |
| rrs-P1(SEQ ID NO.13) | 5`6-FAM CCCCGGCAGTCTCTCACGAGT3`BHQ1 |
| rrs-F2(SEQ ID NO.3) | TTGGGTTAAGTCCCGCAACGA |
| rrs-R2(SEQ ID NO.4) | ATCCCCACCTTCCTCCGAG |
| rrs-P2(SEQ ID NO.14) | 5`6-FAMACGAGTCCCCACCATTACGTGCT3`BHQ1 |
| rrs-F3(SEQ ID NO.5) | CCTTATGTCCAGGGCTTCACAC |
| rrs-R3(SEQ ID NO.6) | ACTGAGACCGGCTTTTAAGGA |
| rrs-P3(SEQ ID NO.15) | 5`6-FAM CCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCA3`BHQ1 |
| eis-F1(SEQ ID NO.7) | ATCGGCCCTGAATCAGCGAC |
| eis-R1(SEQ ID NO.8) | ACCACTTCACCAGGCACCG |
| eis-P1(SEQ ID NO.16) | 5`VIC ACAGCGCCATCCCGACCACCT3`BHQ1 |
| eis-F2(SEQ ID NO.9) | GTGTAGCCCGACCGAGGAC |
| eis-R2(SEQ ID NO.10) | CACCATCGCGGACCACCAC |
| eis-P2(SEQ ID NO.17) | 5`VIC TCATCGGCCCTGAATCAGCGACC3`BHQ1 |
| eis-F3(SEQ ID NO.11) | ATGGCGCTGTACATGGATCTG |
| eis-R3(SEQ ID NO.12) | TCTCAGTTTCGTCGCGGTG |
| eis-P3(SEQ ID NO.18) | 5`VIC AGTTTCGTCGCGGTGGCGCCGAC3`BHQ1 |
rrs的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系如图3-1所示；eis的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系如图3-2所示。
当本申请的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物仅包括组合物1时，rrs的3套引物探针中，探针1、探针2、探针3的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3、JOE中的任意一个，且探针1、探针2、探针3的荧光基团可以相同或不同；当本申请的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物仅包括组合物2时，eis的3套引物探针中，探针4、探针5、探针6的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3、JOE中的任意一个，且探针4、探针5、探针6的荧光基团可以相同或不同；当本申请的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物包括组合物1和组合物2时，组合物1已选定探针的荧光基团和组合物2已选定探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
优选地，组合物1的探针1(rrs-P1)、探针2(rrs-P2)、探针3(rrs-3)的荧光基团均选定FAM，组合物2的探针4(eis-P1)、探针5(eis-P2)、探针6(eis-P3)的荧光基团均选定VIC。
引物探针可行性验证实验：
1)分别取约500μLrrs的阳性待测样本和eis的阳性待测样本，若为痰液样本则分别加入500μL 1M NaOH至待测样本完全液化，10000rpm室温离心5-10min弃上清，若为其他样本则直接10000rpm室温离心5-10min弃上清。
2)使用天根生化科技(北京)有限公司的通用型磁珠DNA提取试剂盒(DP307)，按核酸提取试剂盒说明书操作提取步骤1)中的处理后的待测样本，形成DNA模板。
3)在两个实验反应管中分别加入等量的步骤2)的rrs的阳性待测样本DNA模板、eis的阳性待测样本DNA模板，并分别按照表2制备反应体系。
4)在对照反应管中加入同实验反应管等量的已知野生型样本(也就是已知的阴性样本)，并按照表2制备反应体系。
5)将两个实验反应管及对照反应管同时进行上机检测，进行PCR扩增及熔曲实验。检测仪器可以使用鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司出产的分子诊断一体机或其他实时荧光定量PCR仪，检测操作过程按照仪器说明书进行。
表2可行性实验反应体系
6)检测结束后通过比较待测样本与野生型样本之间熔解曲线的Tm值的差异判断待测样本是否发生突变，也就是待测样本是否为阳性样本。具体的，当rrs的阳性待测样本的FAM通道熔解曲线熔点低于野生型样本FAM通道熔解曲线熔点在2℃及以上时(△Tm1≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对氨基糖苷类耐药；当eis的阳性待测样本的VIC通道熔解曲线熔点低于野生型样本VIC通道熔解曲线熔点在2℃及以上时(△Tm2≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对氨基糖苷类耐药。
如表3所示为rrs的3套引物探针的检测结果，结果显示，rrs的3套引物探针均可以实现对阳性样本的检出，rrs的3套引物探针具有良好的可行性；如表4所示为eis的3套引物探针的检测结果，结果显示，eis的3套引物探针均可以实现对阳性样本的检出，eis的3套引物探针具有良好的可行性。
其中△Tm1为阳性待测样本的FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为阳性待测样本的VIC通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表3 rrs的3套引物探针的检测结果
| 第一套引物探针 | △Tm1＝6.71△Tm2＝0.26 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝6.52△Tm2＝0.42 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝5.98△Tm2＝0.27 |
表4 eis的3套引物探针的检测结果
| 第一套引物探针 | △Tm1＝0.15△Tm2＝5.85 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.53△Tm2＝6.41 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.46△Tm2＝6.33 |
实施例2
本实施例的目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒。
一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，包括实施例1中的组合物和MgCl2、dNTP、Taq酶中的至少一种。
此外，试剂盒中还包括阳性质控品、阴性对照1野生结核分枝杆菌复合群菌株，阴性对照2TE。
使用本申请的试剂盒对待测样本进行氨基糖苷耐药检测时，如实施例1所记载的检测结果，本申请的试剂盒具有良好的可行性。
实施例3
本实施例的目的在于对实施例2的试剂盒内各组分浓度的优化，优化实验均在Taq酶浓度为2U下进行，并按照表5所示扩增程序对待测样本进行上机实验，具体优化实验如下：
表5扩增程序
如表3和表4所示，因实施例1中rrs的3套引物探针和eis的3套引物探针对待测样本的检出结果相差不大，因此任选rrs的一套引物探针和eis的一套引物探针组成试剂盒进行优化实验。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括rrs第1套引物探针和eis的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的Mg2+浓度进行梯度调节，形成Mg2+浓度分别为1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，5mM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-1和图2-1，图1-1为FAM通道的Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-1为VIC通道的Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-1和图2-1可以看到在Mg2+浓度为3mM时，熔解曲线的峰最高，也就是说Mg2+最优反应浓度为3mM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括rrs第1套引物探针和eis的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的dNTP浓度进行梯度调节，形成dNTP浓度分别为200μM，250μM，300μM，350μM，400μM，500μM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-2和图2-2，图1-2为FAM通道的dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-2为VIC通道的dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-2和图2-2可以看到在dNTP浓度为300μM时，熔解曲线的峰最高，也就是说dNTP最优反应浓度为300μM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括rrs第1套引物探针和eis的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的引物对1和引物对5浓度进行梯度调节，其中，引物对1和引物对5各自浓度一致，形成引物对1和引物对5总浓度分别为400nM，600nM，800nM，1000nM，1200nM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-3和图2-3，图1-3为FAM通道的引物对1和引物对5不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-3为VIC通道的引物对1和引物对5不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-3和图2-3可以看到在引物对1和引物对5总浓度为800nM时，熔解曲线的峰最高，也就是说引物对1和引物对5最优反应浓度为800nM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括rrs第1套引物探针和eis的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的探针1和探针5浓度进行梯度调节，其中，探针1和探针5各自浓度一致，形成探针1和探针5总浓度分别为40nM，60nM，100nM，200nM，300nM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-4和图2-4，图1-4为FAM通道的探针1和探针5不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-4为VIC通道的探针1和探针5不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-4和图2-4可以看到在探针1和探针5总浓度为200nM时，熔解曲线的峰最高，也就是说探针1最优反应浓度为200nM。
综上，确定试剂盒内各组分最优浓度为：引物对(例如引物对1-6任意一个，或引物1-3的任意一个与引物对4-6的任意一个组合)800nM、探针(例如探针1-6任意一个，或探针1-3的任意一个与探针4-6的任意一个组合)200nM、Mg2+3mM、dNTP300μM、Taq酶2U。其中MgCl2、dNTP、Taq酶的混合液也称为反应酶混合液。
实施例4
本实施例的目的在于阐述采用实施例1的试剂或实施例2的试剂盒检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法。
一种以非诊断为目的的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法，具体如下：
(1)样本前处理：对于粘稠的待测样本，如痰液等，取约500μL样本，加入500μL 1MNaOH至待测样本完全液化，10000rpm室温离心5-10min弃上清，若为其他待测样本则直接10000rpm室温离心5-10min弃上清。
(2)核酸提取：使用天根生化科技(北京)有限公司的通用型磁珠DNA提取试剂盒(DP307)，按核酸提取试剂盒说明书操作提取步骤(1)中的处理后的待测样本，形成DNA模板。
(3)加样：在准备好的PCR反应管中按照表6加入相关试剂，包括步骤(2)的10μLDNA模板、实施例1中的15μL任意一种组合物(也称为引物探针混合液)、以及按照实施例3确定的各组分浓度加入25μL反应酶混合液(MgCl2、dNTP、Taq酶的混合液称为反应酶混合液)，盖紧PCR反应管管盖，瞬时低速离心。
(4)PCR扩增检测:将步骤(3)的PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行扩增熔曲检测，生成待测样本的熔解曲线。检测结束后通过比较待测样本与野生型样本之间熔解曲线的Tm值的差异判断待测样本是否发生突变，也就是待测样本是否为阳性样本。具体的，当待测样本的FAM通道和VIC通道的熔解曲线熔点均低于野生型样本熔点在预设范围(0≤△Tm＜2℃)时判定待测样本未发生突变，待测样本为阴性样本，待测样本对氨基糖苷类药物敏感：当待测样本的FAM通道、VIC通道任一通道中待测样本的熔点低于野生型样本熔点2℃及以上时(△Tm≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对氨基糖苷类耐药。
其中，野生型样本是指已知的阴性样本，在每次进行待测样本的氨基糖苷耐药检测实验时，除了按照实施例4的上述实验方法对待测样本在一台荧光定量PCR仪上进行检测处理，同时还需对野生型样本在同一台荧光定量PCR仪上进行同样的检测处理，以便在步骤(4)进行检测结果判定分析时有更为准确的对照组，对照组是指野生型样本的熔解曲线。
表6反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 反应酶混合液 | 25μL |
| 引物探针混合液 | 15μL |
| DNA模板 | 10μL |
实施例5
本实施例的目的在于研究实施例1的组合物或实施例2的试剂盒的最低检出浓度和灵敏度。
操作步骤如下：
S1：按实施例4中的方法步骤(1)制备rrs阳性待测样本的DNA模板。
S2：对步骤S1中的rrs阳性待测样本的DNA模板进行浓度调制，制备成4组不同浓度的DNA模板，浓度依次为1000CFU/mL、300CFU/mL、200CFU/mL、150CFU/mL。
S3：以步骤S2中已制备好的不同浓度的阳性样本为待测样本，使用质检合格的实施例2的任意一种试剂盒(本实验中使用的试剂盒为由rrs的第1套引物探针和eis的第2套引物探针所组成的试剂盒)对待测样本进行上机检测，每个浓度的待测样本均检测10次。其中待测样本的反应体系按表6制备，上机检测的扩增程序按表5执行，扩增完成后进行熔曲生成熔解曲线，统计分析结果见表7，其中△Tm1为rrs阳性待测样本FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为rrs阳性待测样本VIC通道的熔解曲线的熔点值与野生型样本VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表7 rrs和eis最低检出限测试实验检出结果△Tm值统计信息
由表7可以看出，在阳性样本浓度为200CFU/mL时，阳性检出率为100％，在浓度为150CFU/mL时，阳性检出率为70％。因此确定本申请的组合物或试剂盒的最低检出限为200CFU/mL。
实施例6
本实施例的目的在于验证实施例1的组合物或实施例2的试剂盒的特异性
按照实施例4的方法依次对rrs阳性参考品、eis阳性参考品、B1正常人阴性样本、B2～B4为种属相近的或引起症状相似的临床阳性样本(堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、肺炎链球菌阳性样本)，使用质检合格的实施例2的试剂盒在同一荧光定量PCR仪上检测，通过分析检测结果的阴阳性，考查试剂盒的特异性。实验结果如表8所示，其中△Tm1为各样本的FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为各样本的VIC通道熔解曲线的熔点值与野生型样本VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表8各样本测试实验检出结果△Tm值统计信息
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物，其特征在于，包括组合物1和组合物2中的至少一个；
所述组合物1包括第一对引物和第一探针，所述第一对引物包括引物对1、引物对2、引物对3中的任意一个，所述第一探针包括探针1、探针2、探针3中的任意一个；
所述组合物2包括第二对引物和第二探针，所述第二对引物包括引物对4、引物对5、引物对6中的任意一个，所述第二探针包括探针4、探针5、探针6中的任意一个；
所述引物对1为rrs-F1和rrs-R1，所述引物对2为rrs-F2和rrs-R2，所述引物对3为rrs-F3和rrs-R3，所述引物对4为eis-F1和eis-R1，所述引物对5为eis-F2和eis-R2，所述引物对6为eis-F3和eis-R3，所述探针1为rrs-P1，所述探针2为rrs-P2，所述探针3为rrs-P3，所述探针4为eis-P1，所述探针5为eis-P2，所述探针6为eis-P3；
所述rrs-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述rrs-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述rrs-F2的序列如SEQ ID NO.3所示，所述rrs-R2的序列如SEQ ID NO.4所示，所述rrs-F3的序列如SEQ ID NO.5所示，所述rrs-R3的序列如SEQ ID NO.6所示，所述eis-F1的序列如SEQID NO.7所示，所述eis-R1的序列如SEQ ID NO.8所示，所述eis-F2的序列如SEQ ID NO.9所示，所述eis-R2的序列如SEQ ID NO.10所示，所述eis-F3的序列如SEQ ID NO.11所示，所述eis-R3的序列如SEQ ID NO.12所示；
所述rrs-P1的序列如SEQ ID NO.13所示，所述rrs-P2的序列如SEQ ID NO.14所示，所述rrs-P3的序列如SEQ ID NO.15所示，所述eis-P1的序列如SEQ ID NO.16所示，所述eis-P2的序列如SEQ ID NO.17所示，所述eis-P3的序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
3.根据权利要求2所述的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的组合物，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针的所述荧光基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3和JOE。
4.一种用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，其特征在于，还包括：MgCl2、dNTP、Taq酶中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，其特征在于，当所述组合物仅包括所述组合物1和所述组合物2中一者时，所述第一对引物浓度或所述第二对引物浓度为400～1200nM，所述第一探针或所述第二探针浓度为40～300nM，所述Mg2+浓度为1～5mM，所述dNTP浓度为200～500μM，所述Taq酶浓度为2U。
7.根据权利要求5所述的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的试剂盒，其特征在于，
当所述组合物包括所述组合物1和所述组合物2时，所述第一对引物和所述第二对引物的总浓度为400～1200nM，所述第一探针和所述第二探针总浓度为40～300nM，所述Mg2+浓度为1～5mM，所述dNTP浓度为200～500μM，所述Taq酶浓度为2U。
8.一种以非诊断为目的的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取待测样本的DNA；
使用如权利要求1-3中任一项所述的组合物或权利要求4-7中任一项所述的试剂盒对所述提取的待测样本的DNA进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测；
分析获得检测结果。
9.根据权利要求8所述的以非诊断为目的的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法，其特征在于，所述进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测时使用的待测样本的DNA体积为10μL，所述MgCl2、dNTP、和Taq酶的总体积为25μL，所述组合物1和/或所述组合物2的体积为15μL。
10.根据权利要求9所述的以非诊断为目的的用于检测结核分枝杆菌氨基糖苷耐药的方法，其特征在于，所述进行荧光定量PCR检测时的扩增条件为：
。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278082A (zh) * | 2014-05-15 | 2015-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种结核分枝杆菌四种二线药物耐药基因特异片段组合及其应用 |
| CN107002148A (zh) * | 2014-10-10 | 2017-08-01 | 新泽西鲁特格斯州立大学 | 结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针 |
| CN107385049A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品 |
| CN109468368A (zh) * | 2017-09-06 | 2019-03-15 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278082A (zh) * | 2014-05-15 | 2015-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种结核分枝杆菌四种二线药物耐药基因特异片段组合及其应用 |
| CN107002148A (zh) * | 2014-10-10 | 2017-08-01 | 新泽西鲁特格斯州立大学 | 结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针 |
| CN107385049A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 首都医科大学附属北京胸科医院 | 用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品 |
| CN109468368A (zh) * | 2017-09-06 | 2019-03-15 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 检测MTB耐卡那霉素相关基因rrs突变的试剂盒及其方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| QINGYUN LIU ET AL.: "Triplex real-time PCR melting curve analysis for detecting Mycobacterium tuberculosis mutations associated with resistance to second-line drugs in a single reaction", J ANTIMICROB CHEMOTHER., vol. 68, no. 5, pages 1, XP055559862, DOI: 10.1093/jac/dks509 * |
| 张婷 等: "探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变", 中国人兽共患病学报, no. 5, pages 412 - 417 * |
| 车洋等: "结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物耐药相关基因突变特征分析", 中国人兽共患病学报, no. 2, pages 58 - 63 * |
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Country or region after: China Address after: Building 1, No. 42 Qibei Road, Changping District, Beijing Applicant after: Kunpeng Gene (Beijing) Scientific Instrument Co.,Ltd. Address before: 2202, 19th Floor, Building 9, No. 8 Ronghua Middle Road, Daxing District, Beijing Applicant before: ROCGENE TECNOLOGY Co. Country or region before: China |
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