CN117230222A - 检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法，其中，检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物包括组合物1和组合物2中的至少一个；组合物1为引物对1和探针1、引物对2和探针2以及引物对3和探针3中的任意一套；组合物2为引物对4和探针4、引物对5和探针5以及引物对6和探针6中的任意一套。本发明对结核分枝杆菌喹诺酮耐药检测具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法。
背景技术
近年来，耐药结核病，特别是耐多药(multidrug-resistant，MDR)和广泛耐多药(extensively drug-resistant，XDR)结核病的出现和传播，使结核病成为严重危及全球的公共卫生问题之一。耐药结核病患者的及时发现对结核病的治疗及控制有着重大意义，预防和治疗耐多药肺结核成为结核病防治的关键。喹诺酮类药物作为抗肺结核的二线药物，在耐多药肺结核患者和(或)不能耐受一线抗结核药物的肺结核患者治疗中起非常重要作用。该类抗菌药物具有抗菌谱广、口服吸收好、价格低廉等优点，被广泛应用于各种感染性疾病治疗。由于喹诺酮药物滥用，结核分枝杆菌对该药物敏感性呈逐年下降趋势，影响结核病患者的疗效，在2021版《中国结核病防治工作技术指南》的诊断要求中也提到结核病实验室应对所有病原学阳性的患者要进行耐药筛查，如果具备分子生物学核酸耐药检测技术，则优先采用分子生物学耐药检测。
现在，喹诺酮类耐药的水平越来越高，可以达到50％甚至更高，因此，提供一种灵敏度较高，特异性更强的检测检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的检测试剂对解决上述问题至关重要。
发明内容
本发明提供一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法，以能够更灵敏、更准确地对待测样本做出结核分枝杆菌喹诺酮耐药的检测判断。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明第一方面提供一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，包括组合物1和组合物2中的至少一个；
所述组合物1为引物对1和探针1、引物对2和探针2以及引物对3和探针3中的任意一套；
所述组合物2为引物对4和探针4、引物对5和探针5以及引物对6和探针6中的任意一套；
所述引物对1为gyrA-F1和gyrA-R1，所述引物对2为gyrA-F2和gyrA-R2，所述引物对3为gyrA-F3和gyrA-R3，所述探针1为gyrA-P1，所述探针2为gyrA-P2，所述探针3为gyrA-P3；
所述引物对4为gyrB-F1和gyrB-R1，所述引物对5为gyrB-F2和gyrB-R2，所述引物对6为gyrB-F3和gyrB-R3，所述探针4为gyrB-P1，所述探针5为gyrB-P2，所述探针6为gyrB-P3；
所述gyrB-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述gyrB-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述gyrB-P1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述gyrB-F2的序列如SEQ ID NO.4所示，所述gyrB-R2的序列如SEQ ID NO.5所示，所述gyrB-P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述gyrB-F3的序列如SEQ ID NO.7所示，所述gyrB-R3的序列如SEQ ID NO.8所示，所述gyrB-P3的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述gyrA-F1的序列如SEQ ID NO.10所示，所述gyrA-R1的序列如SEQ ID NO.11所示，所述gyrA-P1的序列如SEQ ID NO.12所示，所述gyrA-F2的序列如SEQ ID NO.13所示，所述gyrA-R2的序列如SEQ ID NO.14所示，所述gyrA-P2的序列如SEQ ID NO.15所示，所述gyrA-F3的序列如SEQ ID NO.16所示，所述gyrA-R3的序列如SEQ ID NO.17所示，所述gyrA-P3的序列如SEQ ID NO.18所示。
所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，优选地，所述组合物1的探针和所述组合物2的探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，优选地，所述组合物1的探针和所述组合物2的探针的所述荧光基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3和JOE中的任一种。
本发明第二方面提供一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，包括如权利要求1-3中任一项所述的组合物。
所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，优选地，还包括：MgCl2、dNTP和Taq酶中的至少一种。
所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，优选地，当所述组合物仅包括所述组合物1和所述组合物2中任意一个时，所述组合物1的引物对浓度为600nM或所述组合物2的引物对浓度为600nM，所述组合物1的探针浓度或所述组合物2的探针浓度为100nM，所述Mg2+浓度为3mM，所述dNTP浓度为250μM，所述Taq酶浓度为2U。
所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，优选地，当所述组合物包括所述组合物1和所述组合物2时，所述组合物1的引物对浓度为600nM，所述组合物2的引物对浓度为600nM，所述组合物1的探针浓度为100nM，所述组合物2的探针浓度为100nM，所述Mg2+浓度为3mM，所述dNTP浓度为250μM，所述Taq酶浓度为2U。
本发明第三方面提供一种以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，所述方法包括以下步骤：
提取待测样本的DNA；
使用如上所述的组合物或如上所述的试剂盒对所述提取的待测样本的DNA进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测；
分析获得检测结果。
所述的以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，优选地，所述进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测时使用的待测样本的DNA体积为10μL，所述MgCl2、dNTP、和Taq酶的总体积为25μL，所述组合物1和/或所述组合物2的体积为15μL。
所述的以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，优选地，所述进行荧光定量PCR检测时的扩增条件为：
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
本发明对结核分枝杆菌喹诺酮耐药检测具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。
附图说明
图1-1为使用gyrA的第1套引物探针时Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-2为使用gyrA的第1套引物探针时dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-3为使用gyrA的第1套引物探针时引物对1不同浓度下对应的熔解曲线图；
图1-4为使用gyrA的第1套引物探针时探针1不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-1为使用gyrB的第2套引物探针时Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-2为使用gyrB的第2套引物探针时dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-3为使用gyrB的第2套引物探针时引物对5不同浓度下对应的熔解曲线图；
图2-4为使用gyrB的第2套引物探针时探针5不同浓度下对应的熔解曲线图；
图3-1为gyrA的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系示意图；
图3-2为gyrB的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
针对gyrA目的基因序列和gyrB目的基因序列分别设计了3套引物探针。
其中，gyrA目的基因序列如SEQ ID NO.19所示；
gyrB目的基因序列如SEQ ID NO.20所示。
本实施例的目的在于提供检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，组合物包括组合物1和组合物2中的至少一个，其中，组合物1可以选自gyrA的3套引物探针中的任意一套，组合物2可以选自gyrB的3套引物探针中的任意一套。
gyrA的第1套引物探针包括引物对1(gyrA-F1和gyrA-R1)和探针1(gyrA-P1)，第2套物探针包括引物对2(gyrA-F2和gyrA-R2)和探针2(gyrA-P2)，第3套引物探针包括引物对3(gyrA-F3和gyrA-R3)和探针3(gyrA-P3)；gyrB的第1套引物探针包括引物对4(gyrB-F1和gyrB-R1)和探针4(gyrB-P1)，第2套引物探针包括引物对5(gyrB-F2和gyrB-R2)和探针5(gyrB-P2)，第3套引物探针包括引物对6(gyrB-F3和gyrB-R3)和探针6(gyrB-P3)。其具体序列如表1所示。
表1 gyrA和gyrB的引物探针序列信息
gyrA的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系如图3-1所示；gyrB的3套引物探针相对靶标DNA序列的位置关系如图3-2所示。
当本申请的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物仅包括组合物1时，gyrA的3套引物探针中，探针1、探针2、探针3的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3、JOE中的任意一个，且探针1、探针2、探针3的荧光基团可以相同或不同；当本申请的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物仅包括组合物2时，gyrB的3套引物探针中，探针4、探针5、探针6的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3、JOE中的任意一个，且探针4、探针5、探针6的荧光基团可以相同或不同；当本申请的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物包括组合物1和组合物2时，组合物1已选定探针的荧光基团和组合物2已选定探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
优选地，组合物1的探针1(gyrA-P1)、探针2(gyrA-P2)、探针3(gyrA-3)的荧光基团均选定FAM，组合物2的探针4(gyrB-P1)、探针5(gyrB-P2)、探针6(gyrB-P3)的荧光基团均选定VIC。
引物探针可行性验证实验：
1)分别取约500μLgyrA的阳性待测样本和gyrB的阳性待测样本，若为痰液样本则分别加入500μL 1M NaOH至待测样本完全液化，10000rpm室温离心5-10min弃上清，若为其他样本则直接10000rpm室温离心5-10min弃上清。
2)使用天根生化科技(北京)有限公司的通用型磁珠DNA提取试剂盒(DP307)，按核酸提取试剂盒说明书操作提取步骤1)中的处理后的待测样本，形成DNA模板。
3)在两个实验反应管中分别加入等量的步骤2)的gyrA的阳性待测样本DNA模板、gyrB的阳性待测样本DNA模板，并分别按照表2制备反应体系。
4)在对照反应管中加入同实验反应管等量的已知野生型样本(也就是已知的阴性样本)，并按照表2制备反应体系。
5)将两个实验反应管及对照反应管同时进行上机检测，进行PCR扩增及熔曲实验。检测仪器可以使用鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司出产的分子诊断一体机或其他实时荧光定量PCR仪，检测操作过程按照仪器说明书进行。
表2可行性实验反应体系
6)检测结束后通过比较待测样本与野生型样本之间熔解曲线的Tm值的差异判断待测样本是否发生突变，也就是待测样本是否为阳性样本。具体的，当gyrA的阳性待测样本的FAM通道熔解曲线熔点低于野生型样本FAM通道熔解曲线熔点在2℃及以上时(△Tm1≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对喹诺酮耐药；当gyrB的阳性待测样本的VIC通道熔解曲线熔点低于野生型样本VIC通道熔解曲线熔点在2℃及以上时(△Tm2≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对喹诺酮耐药。
如表3-1所示为实验反应管中gyrA的3套引物探针的检测结果，如表3-2所示为对照反应管中gyrA的3套引物探针的检测结果，结果显示，gyrA的3套引物探针均可以实现对阳性样本的检出，gyrA的3套引物探针具有良好的可行性；如表4-1所示为实验反应管中gyrB的3套引物探针的检测结果，如表4-2所示为对照反应管中gyrB的3套引物探针的检测结果，结果显示，gyrB的3套引物探针均可以实现对阳性样本的检出，gyrB的3套引物探针具有良好的可行性。
其中△Tm1为阳性待测样本的FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为阳性待测样本的VIC通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表3-1实验反应管中gyrA的3套引物探针的检测结果
表3-2对照反应管中gyrA的3套引物探针的检测结果
| 第一套引物探针 | △Tm1＝1.16 △Tm2＝0.28 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.62 △Tm2＝0.36 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.74 △Tm2＝0.30 |
表4-1实验反应管中gyrB的3套引物探针的检测结果
| 第一套引物探针 | △Tm1＝0.25 △Tm2＝3.85 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.33 △Tm2＝3.45 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.46 △Tm2＝3.39 |
表4-2对照反应管中gyrB的3套引物探针的检测结果
| 第一套引物探针 | △Tm1＝0.25 △Tm2＝1.05 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.33 △Tm2＝0.52 |
| 第二套引物探针 | △Tm1＝0.46 △Tm2＝0.84 |
实施例2
本实施例的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒。
一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，包括实施例1中的组合物和MgCl2、dNTP、Taq酶中的至少一种。
此外，试剂盒中还包括阳性质控品、阴性对照1野生结核分枝杆菌复合群菌株，阴性对照2TE。
使用本申请的试剂盒对待测样本进行结核分枝杆菌喹诺酮耐药检测时，如实施例1所记载的检测结果，本申请的试剂盒具有良好的可行性。
实施例3
本实施例的目的在于对实施例2的试剂盒内各组分浓度的优化，优化实验均在Taq酶浓度为2U下进行，并按照表5所示扩增程序对待测样本进行上机实验，具体优化实验如下：
表5扩增程序
如表3和表4所示，因实施例1中gyrA的3套引物探针和gyrB的3套引物探针对待测样本的检出结果相差不大，因此任选gyrA的一套引物探针和gyrB的一套引物探针组成试剂盒进行优化实验。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括gyrA第1套引物探针和gyrB的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的Mg2+浓度进行梯度调节，形成Mg2+浓度分别为1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，5mM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-1和图2-1，图1-1为FAM通道的Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-1为VIC通道的Mg2+不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-1可以看到在Mg2+浓度为3mM时，熔解曲线的峰最高，从图2-1可以看到在Mg2+浓度为3mM时，熔解曲线的峰最高，也就是说Mg2+最优反应浓度为3mM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括gyrA第1套引物探针和gyrB的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的dNTP浓度进行梯度调节，形成dNTP浓度分别为200μM，250μM，300μM，350μM，400μM，500μM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-2和图2-2，图1-2为FAM通道的dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-2为VIC通道的dNTP不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-2可以看到在dNTP浓度为200μM时，熔解曲线的峰最高，从图2-2可以看到在dNTP浓度为300μM时，熔解曲线的峰最高，因此最终选定dNTP最优反应浓度为250μM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括gyrA第1套引物探针和gyrB的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的引物对1和引物对5浓度进行梯度调节，其中，引物对1和引物对5各自浓度一致，形成引物对1和引物对5浓度分别为400nM，600nM，800nM，1000nM，1200nM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-3和图2-3，图1-3为FAM通道的引物对1不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-3为VIC通道的引物对5不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-3可以看到在引物对1浓度为600nM时，熔解曲线的峰最高，从图2-3可以看到在引物对5浓度为600nM时，熔解曲线的峰最高，也就是说引物对1和引物对5最优反应浓度均为600nM。
使用实施例2中的一种试剂盒进行优化实验，本实验中选用的试剂盒为包括gyrA第1套引物探针和gyrB的第2套引物探针的试剂盒，对该试剂盒的探针1和探针5浓度进行梯度调节，其中，探针1和探针5各自浓度一致，形成探针1和探针5浓度分别为40nM，60nM，100nM，200nM，300nM的多个试剂盒并分别对同样的1000CFU/mL的待测样本进行检测，检测结果见图1-4和图2-4，图1-4为FAM通道的探针1和探针5不同浓度下对应的熔解曲线图，图2-4为VIC通道的探针1和探针5不同浓度下对应的熔解曲线图，从图1-4可以看到在探针1浓度为100nM时，熔解曲线的峰最高，从图2-4可以看到在探针5浓度为100nM时，熔解曲线的峰最高，也就是说探针1和探针5最优反应浓度均为100nM。
综上，确定试剂盒内各组分最优浓度为：引物对1浓度为600nM,引物对5浓度为600nM，探针浓度(例如探针1-6任意一个，或探针1-3的任意一个与探针4-6的任意一个组合)为100nM、Mg2+浓度为3mM、dNTP浓度为250μM、Taq酶浓度为2U。其中MgCl2、dNTP、Taq酶的混合液也称为反应酶混合液。
应理解的是，当试剂盒为包括gyrA的任意一套引物探针和gyrB的任意一套引物探针时，试剂盒内各组分最优浓度为：gyrA的引物对浓度为600nM,gyrB的引物对浓度为600nM，gyrA的探针浓度为100nM，gyrB的探针浓度为100nM、Mg2+浓度为3mM、dNTP浓度为250μM、Taq酶浓度为2U。其中MgCl2、dNTP、Taq酶的混合液也称为反应酶混合液。
实施例4
本实施例的目的在于阐述采用实施例1的试剂或实施例2的试剂盒检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法。
一种以非诊断为目的的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，具体如下：
(1)样本前处理：对于粘稠的待测样本，如痰液等，取约500μL样本，加入500μL 1MNaOH至待测样本完全液化，10000rpm室温离心5-10min弃上清，若为其他待测样本则直接10000rpm室温离心5-10min弃上清。
(2)核酸提取：使用天根生化科技(北京)有限公司的通用型磁珠DNA提取试剂盒(DP307)，按核酸提取试剂盒说明书操作提取步骤(1)中的处理后的待测样本，形成DNA模板。
(3)加样：在准备好的PCR反应管中按照表6加入相关试剂，包括步骤(2)的10μLDNA模板、实施例1中的15μL任意一种组合物(也称为引物探针混合液)、以及按照实施例3确定的各组分浓度加入25μL反应酶混合液(MgCl2、dNTP、Taq酶的混合液称为反应酶混合液)，盖紧PCR反应管管盖，瞬时低速离心。
(4)PCR扩增检测:将步骤(3)的PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行扩增熔曲检测，生成待测样本的熔解曲线。检测结束后通过比较待测样本与野生型样本之间熔解曲线的Tm值的差异判断待测样本是否发生突变，也就是待测样本是否为阳性样本。具体的，当待测样本的FAM通道和VIC通道的熔解曲线熔点均低于野生型样本熔点在预设范围(0≤△Tm＜2℃)时判定待测样本未发生突变，待测样本为阴性样本，待测样本对喹诺酮耐药敏感：当待测样本的FAM通道、VIC通道任一通道中待测样本的熔点低于野生型样本熔点2℃及以上时(△Tm≥2℃)判定待测样本发生突变，待测样本为阳性样本，待测样本对喹诺酮耐药。
其中，野生型样本是指已知的阴性样本，在每次进行待测样本的结核分枝杆菌喹诺酮耐药检测实验时，除了按照实施例4的上述实验方法对待测样本在一台荧光定量PCR仪上进行检测处理，同时还需对野生型样本在同一台荧光定量PCR仪上进行同样的检测处理，以便在步骤(4)进行检测结果判定分析时有更为准确的对照组，对照组是指野生型样本的熔解曲线。
表6反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 反应酶混合液 | 25μL |
| 引物探针混合液 | 15μL |
| DNA模板 | 10μL |
实施例5
本实施例的目的在于研究实施例1的组合物或实施例2的试剂盒的最低检出浓度和灵敏度。
操作步骤如下：
S1：按实施例4中的方法步骤(1)制备gyrA阳性待测样本的DNA模板。
S2：对步骤S1中的gyrA阳性待测样本的DNA模板进行浓度调制，制备成4组不同浓度的DNA模板，浓度依次为1000CFU/mL、300CFU/mL、200CFU/mL、150CFU/mL。
S3：以步骤S2中已制备好的不同浓度的阳性样本为待测样本，使用质检合格的实施例2的任意一种试剂盒(本实验中使用的试剂盒为由gyrA的第1套引物探针和gyrB的第2套引物探针所组成的试剂盒)对待测样本进行上机检测，每个浓度的待测样本均检测10次。其中待测样本的反应体系按表6制备，上机检测的扩增程序按表5执行，扩增完成后进行熔曲生成熔解曲线，统计分析结果见表7，其中△Tm1为gyrA阳性待测样本FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本的FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为gyrB阳性待测样本VIC通道的熔解曲线的熔点值与野生型样本VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表7 gyrA和gyrB最低检出限测试实验检出结果△Tm值统计信息
由表7可以看出，在阳性样本浓度为200CFU/mL时，阳性检出率为100％，在浓度为150CFU/mL时，阳性检出率为60％。因此确定本申请的组合物或试剂盒的最低检出限为200CFU/mL。
实施例6
本实施例的目的在于验证实施例1的组合物或实施例2的试剂盒的特异性。
按照实施例4的方法依次对gyrA阳性参考品、gyrB阳性参考品、B1正常人阴性样本、B2～B4为种属相近的或引起症状相似的临床阳性样本(堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、肺炎链球菌阳性样本)，使用质检合格的实施例2的试剂盒在同一荧光定量PCR仪上检测，通过分析检测结果的阴阳性，考查试剂盒的特异性。实验结果如表8所示，其中△Tm1为各样本的FAM通道熔解曲线的熔点值与野生型样本FAM通道熔解曲线的熔点值差值，△Tm2为各样本的VIC通道熔解曲线的熔点值与野生型样本VIC通道熔解曲线的熔点值差值。
表8各样本测试实验检出结果△Tm值统计信息
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，其特征在于，包括组合物1和组合物2中的至少一个；
所述组合物1为引物对1和探针1、引物对2和探针2以及引物对3和探针3中的任意一套；
所述组合物2为引物对4和探针4、引物对5和探针5以及引物对6和探针6中的任意一套；
所述引物对1为gyrA-F1和gyrA-R1，所述引物对2为gyrA-F2和gyrA-R2，所述引物对3为gyrA-F3和gyrA-R3，所述探针1为gyrA-P1，所述探针2为gyrA-P2，所述探针3为gyrA-P3；
所述引物对4为gyrB-F1和gyrB-R1，所述引物对5为gyrB-F2和gyrB-R2，所述引物对6为gyrB-F3和gyrB-R3，所述探针4为gyrB-P1，所述探针5为gyrB-P2，所述探针6为gyrB-P3；
所述gyrB-F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述gyrB-R1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述gyrB-P1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述gyrB-F2的序列如SEQ ID NO.4所示，所述gyrB-R2的序列如SEQ ID NO.5所示，所述gyrB-P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述gyrB-F3的序列如SEQ ID NO.7所示，所述gyrB-R3的序列如SEQ ID NO.8所示，所述gyrB-P3的序列如SEQID NO.9所示；
所述gyrA-F1的序列如SEQ ID NO.10所示，所述gyrA-R1的序列如SEQ ID NO.11所示，所述gyrA-P1的序列如SEQ ID NO.12所示，所述gyrA-F2的序列如SEQ ID NO.13所示，所述gyrA-R2的序列如SEQ ID NO.14所示，所述gyrA-P2的序列如SEQ ID NO.15所示，所述gyrA-F3的序列如SEQ ID NO.16所示，所述gyrA-R3的序列如SEQ ID NO.17所示，所述gyrA-P3的序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，其特征在于，所述组合物1的探针和所述组合物2的探针的荧光基团互不相同且互不干涉。
3.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物，其特征在于，所述组合物1的探针和所述组合物2的探针的所述荧光基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5.5、TAMRA、TET、CY3和JOE中的任一种。
4.一种检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，其特征在于，还包括：MgCl2、dNTP和Taq酶中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，其特征在于，当所述组合物仅包括所述组合物1和所述组合物2中任意一个时，所述组合物1的引物对浓度为600nM或所述组合物2的引物对浓度为600nM，所述组合物1的探针浓度为100nM或所述组合物2的探针浓度为100nM，所述Mg2+浓度为3mM，所述dNTP浓度为250μM，所述Taq酶浓度为2U。
7.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的试剂盒，其特征在于，当所述组合物包括所述组合物1和所述组合物2时，所述组合物1的引物对浓度为600nM，所述组合物2的引物对浓度为600nM，所述组合物1的探针浓度为100nM，所述组合物2的探针浓度为100nM，所述Mg2+浓度为3mM，所述dNTP浓度为250μM，所述Taq酶浓度为2U。
8.一种以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取待测样本的DNA；
使用如权利要求1-3中任一项所述的组合物或权利要求4-7中任一项所述的试剂盒对所述提取的待测样本的DNA进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测；
分析获得检测结果。
9.根据权利要求8所述的以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，其特征在于，所述进行荧光定量PCR检测和/或熔曲实验检测时使用的待测样本的DNA体积为10μL，所述MgCl2、dNTP、和Taq酶的总体积为25μL，所述组合物1和/或所述组合物2的体积为15μL。
10.根据权利要求9所述的以非诊断为目的检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的方法，其特征在于，所述进行荧光定量PCR检测时的扩增条件为：
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