CN112342275A - 一种检测目的核酸是否含有突变的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种检测样品中目的核酸是否含有突变的方法，具体来说，涉及一种通过特异的引物组和探针组进行数字PCR，以测定样品中目的核酸是否含有突变的方法和试剂盒。

Description

一种检测目的核酸是否含有突变的方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及一种检测样品中目的核酸是否含有突变的方法。具体来说，本申请涉及一种通过特异的引物组和探针组进行数字PCR，以测定样品中目的核酸是否含有突变的方法和试剂盒。

背景技术

突变是指生物体、病毒或染色体DNA基因组核苷酸序列的改变，包括碱基替换、DNA插入、DNA缺失、DNA重复引起的序列改变。其中单个碱基置换(A、T、C、G)可以引起氨基酸的改变，也可能由于位于内含子或由于密码子的简并性，而不改变氨基酸。突变在自然界各物种中普遍存在，细菌在复制繁殖过程中会发生随机突变，某些突变会导致细菌对药物产生抗性，这些突变称为耐药突变。在基因诊断中，检测细菌的耐药突变，尤其在异质性耐药(同时存在敏感菌与耐药菌)样本中检测出低比例的耐药突变，对鉴定耐药患者，指导个体化用药具有重要的意义。

许多检测基因组DNA低含量突变的方法是利用聚合酶链式反应(PCR)来扩增突变型和野生型靶核酸，扩增产物可以用多种方法进行分析，包括测序，限制性酶切、质谱或者等位基因特异探针杂交等多种方法。目前检测单个核苷酸位点突变的分子生物学方法有以下几种：

1.Sanger测序：根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列。作为分子检测方法的“金标准”，在大量野生背景下只能检测出10-20％的突变型。并且对于模板浓度较低的样本，扩增后可能仍然无法进行检测。

2.膜杂交方法：利用固定在膜条带上特异性野生型探针和突变型探针与PCR产物杂交显色。只能检测出10％以上的突变型。杂交技术操作较为繁琐，需要PCR后处理，容易产生污染，通常需要人工判读，主观性较强，对实验人员和环境要求较高。

3.深度测序技术：能够鉴定出1％异质性突变，但是由于噪音背景的干扰，其准确性与测序深度有关，而且依赖于生物信息学的分析软件。加之NGS需要昂贵的仪器设备，目前还无法在临床单位广泛使用。

4.多色荧光探针熔解曲线分析(MMCA)：通过不对称扩增获得单链扩增产物，与体系中双标记、自焠灭的探针结合形成特定熔点的双链产物。经熔解曲线分析即可获得产物序列信息。如果与探针结合的靶序列中存在突变，会导致升温过程中探针与单链产物解链行为改变；并且，探针与不同突变类型模板的结合程度不同，会产生熔点不同的熔解曲线，据此可检测突变的发生。目前该方法对于异质性样本的检出需要5％以上的突变序列，且难以对突变比例进行准确的定量。

以上方法均无法进行定量检测，并在异质性检出上有很大差异，在灵敏度和简便性上还无法达到满意的要求。这些方法以相同的扩增效率扩增野生型和突变型模板，加上方法本身的分辨率低，灵敏度不足以检测低频率突变。但是以上基于核酸的诊断方法，实现低丰度的核酸检测还存在一定的困难，并且以上方法均无法给出未知样本中具体的异质性比例。

数字PCR(Digital PCR,dPCR)技术是继第一代、第二代PCR技术之后，迅速发展起来的第三代PCR技术。将含有核酸分子的反应体系分割成千上万个纳升级的微滴或微孔，其中每个微滴或微孔，可能不含待检核酸靶分子，也可能含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测或芯片阅读仪扫描芯片进行检测，有荧光信号的微滴判读为1(阳性)，没有荧光信号的微滴判读为0(阴性)，根据泊松分布原理以及阴性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR能够确定待测目标分子的绝对数目，具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量等优点。因此，数字PCR技术在近年来得到了迅速的发展，广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析、复杂样本基因表达检测、病原微生物检测、产前诊断、转基因食品以及环境质检等领域。

目前大部分的商业化数字PCR平台只能够提供有限的检测通道(双通道或者三通道)，检测一个突变位点需要建立一个PCR反应，包含一条野生型探针和一条突变型探针，对热点突变区域的检测，数字PCR需要建立多管PCR反应。数字PCR检测成本高于普通的Real-time PCR，这限制了它在多位点突变检测中的应用。

因此，若将数字PCR平台应用于突变检测，就需要一种新的数字PCR检测方案，利用有限的反应通道，尽可能多的识别不同突变。

发明内容

本申请的发明人通过大量实验，开发了一种检测样品中目的核酸是否含有突变的方法，该方法利用数字PCR，能够在单个反应中检测多种突变，并且，能够通过荧光信号的强度来区分突变类型。在此基础上还开发了用于实施所述方法的试剂盒。

因此，在一个方面，本申请提供了一种检测样品中目的核酸是否含有突变的方法，所述方法包括：

(I)提供包含目的核酸的样品；

(II)使用引物组和探针组对所述包含目的核酸的样品进行数字PCR，其中，

(a)所述引物组至少包含一条引物(例如一对引物或更多的引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(b)所述探针组包含至少两条检测探针(例如第一探针和第二探针)；其中，

(i)每一条探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一条探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；

(ii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针都能够与野生型目的核酸和突变型目的核酸杂交或退火，并且，所述探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m1)和所述探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m2)存在差异(例如，第一探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点和第一探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点不同)；优选地，T_m1和T_m2相差至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)；

(iii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针能够分别杂交或退火至野生型目的核酸的不同区域(例如，第一探针能够杂交或退火至野生型目的核酸的区域A；第二探针能够杂交或退火至野生型目的区域B)；

例如，不同探针所杂交或退火的区域(例如，区域A和区域B)相距至少5bp，至少10bp，至少50bp，至少100bp，至少500bp，至少1000bp，至少5000bp，至少10000bp，或更大；

(III)根据数字PCR的检测结果判断样品中是否存在突变，并且任选地，判断突变的类型。

在本申请的方法中，在进行数字PCR时，在含有目的核酸的微滴中，在退火温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其靶向区域互补，并在扩增期间被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)所降解，释放报告基团(例如荧光基团)。不受理论限制，发明人提出，当检测探针与目的核酸完全匹配时，二者的结合最稳定；由此，在退火温度下，最大量的检测探针与目的核酸匹配且随后被降解并释放报告基团(例如荧光基团)；因此，在数字PCR结束后，产生最多的游离报告基团(例如游离荧光基团)；相应地，积累的终点信号(例如终点荧光)最强。反之，当检测探针与目的核酸不完全匹配时，二者结合的稳定性下降；由此，在退火温度下，降低量的检测探针与目的核酸匹配且随后被降解并释放报告基团(例如荧光基团)；因此，在数字PCR结束后，产生降低量的游离报告基团(例如游离荧光基团)；相应地，积累的终点信号(例如终点荧光)降低。因此，利用终点信号(例如终点荧光)的强度的差异，可以判断样品中是否存在突变，并且任选地，判断突变的类型。

在某些实施方案中，可以将检测探针设计成与野生型目的核酸完全互补。在此情况下，在数字PCR结束后，含有野生型目的核酸的液滴将呈现最强终点信号(例如终点荧光)；而含有突变类型目的核酸的液滴的终点信号(例如终点荧光)强度将会下降。根据终点信号(例如终点荧光)强度的下降幅度，可以确定待测样品中是否含有突变，以及任选地，确定含有几种类型的突变。在某些实施方案中，可以将检测探针设计成与突变类型目的核酸完全互补。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，使用引物组对所述包含目的核酸的样品进行对称PCR扩增。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，使用引物组对所述包含目的核酸的样品进行不对称PCR扩增。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶具有5’至3’外切酶活性。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermusflavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcuslitoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcushorikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifexaeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，所述探针与不同突变类型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)不同。在某些实施方案中，所述探针与不同突变型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)的差异为至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)。

在某些实施方案中，探针与突变型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)低于探针与野生型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)；例如，所述两种双链体的熔点(T_m)的差异为至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)。

在某些实施方案中，探针与野生型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)低于探针与突变型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)；例如，所述两种双链体的熔点(T_m)的差异为至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)。在某些实施方案中，所述探针组包含两条、三条或者更多条探针，并且根据每一条探针所携带的报告基团(例如荧光基因)的终点信号强度(例如终点荧光强度)判断样品中是否存在突变，并且任选地，判断突变的类型。

在某些实施方案中，所述方法还包括，确定特定突变类型在目的核酸中的频率。在某些实施方案中，通过下述方法计算特定突变类型在目的核酸中的频率：突变频率＝含有该突变类型目的核酸的拷贝数量/总拷贝数量。

野生型或突变类型目的核酸的拷贝数量可根据泊松分布原理，由数字PCR平台检测并通过软件直接输出，其相关原理及计算方法可参见例如，Milbury CA,Zhong Q,Lin J,et al.Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.Biomol Detect Quantif.2014；1(1):8-22.Published 2014Aug 20.doi:10.1016/j.bdq.2014.08.001。

在某些实施方案中，所述探针组中至少一条探针与野生型目的核酸和突变型目的核酸所形成的各种双链体之间的熔点高于退火温度。在某些实施方案中，所述探针组中的每一条探针与野生型目的核酸和突变型目的核酸所形成的各种双链体之间的熔点高于退火温度。在某些实施方案中，所述退火温度低于65℃。在某些实施方案中，所述退火温度为55℃-65℃。

在某些实施方案中，所述探针组的每一条探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本申请的方法中，检测探针不受其长度的限制。在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述探针为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

在某些实施方案中，所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述探针是线性的，或者具有发夹结构。

在某些实施方案中，所述探针组中的每一条探针分别与野生型目的核酸的序列完全互补。

在某些实施方案中，所述探针组中的每一条探针分别与突变型目的核酸的序列完全互补。

在某些实施方案中，所述探针组中的部分探针与野生型目的核酸的序列完全互补。在某些实施方案中，所述探针组中的其余探针与突变型目的核酸的序列完全互补。

在某些实施方案中，所述引物组包含一对或多对上游引物和下游引物。

在某些实施方案中，所述一对或多对上游引物和下游引物能够特异性扩增所述目的核酸或其片段。

在某些实施方案中，所述探针能够与上游引物和下游引物特异性扩增的目的核酸或其片段所产生的扩增产物杂交或退火。

在某些实施方案中，所述上游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列。

在某些实施方案中，所述下游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列。

在某些实施方案中，上游引物可以包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，上游引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，上游引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，上游引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，上游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，下游引物可以选自或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，下游引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，下游引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，下游引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，下游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

易于理解，对于不同的靶核酸，可以使用不同的上游引物和下游引物。然而，当不同的靶核酸之间存在序列相似性时，不同的引物组可能具有相同的上游引物或下游引物。

在某些实施方案中，样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)，或者其任何组合。

在某些实施方案中，待扩增的靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合。

在某些实施方案中，待扩增的靶核酸是单链的或双链的。

在某些实施方案中，所述样品或靶核酸获自原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如Herpes病毒，HIV，流感病毒，EB病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)或类病毒。

在本申请的另一方面，提供了一种检测样品中目的核酸是否含有突变的试剂盒，所述试剂盒包括：引物组和探针组，其中，

(a)所述引物组至少包含一条引物(例如一对引物或更多引物)，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述引物组能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(b)所述探针组包含至少两条探针(例如第一探针和第二探针)；其中，

(i)每一条探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一条探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；

(ii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针都能够与野生型目的核酸和突变型目的核酸杂交或退火，并且，所述探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m1)和所述探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m2)存在差异(例如，第一探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点和第一探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点不同)；优选地，T_m1和T_m2相差至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)；

(iii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针能够分别杂交或退火至野生型目的核酸的不同区域(例如，第一探针能够杂交或退火至野生型目的核酸的区域A；第二探针能够杂交或退火至野生型目的区域B)。

在某些实施方案中，不同探针所杂交或退火的区域(例如，区域A和区域B)相距至少5bp，至少10bp，至少50bp，至少100bp，至少500bp，至少1000bp，至少5000bp，至少10000bp，或更大。

易于理解，本申请试剂盒中的引物组和探针组用于实施如上所述的检测样品中目的核酸是否含有突变的方法。因此，上文中对于引物组和探针组所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于进行数字PCR。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行数字PCR的试剂，数字PCR芯片，微孔板中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述核酸聚合酶具有5’至3’外切酶活性。

在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermusflavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcuslitoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcushorikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifexaeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，所述引物组包含一对或多对上游引物和下游引物。

在某些实施方案中，所述一对或多对上游引物和下游引物能够特异性扩增所述目的核酸或其片段。

在某些实施方案中，所述探针能够与上游引物和下游引物特异性扩增的目的核酸或其片段所产生的扩增产物杂交或退火。

在某些实施方案中，所述上游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列。

在某些实施方案中，所述下游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列。

在某些实施方案中，上游引物可以包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，上游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，下游引物可以选自或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，下游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述数字PCR选自微滴式数字PCR和芯片式数字PCR。

易于理解，本申请的试剂盒用于实施如上所述的检测样品中目的核酸是否含有突变的方法。因此，上文中对于方法所描述的各项优选特征和示例性特征同样也可以适用于本申请的试剂盒及其组分，并且没有超出本发明的构思和本申请的范围。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“荧光强度”、“荧光振幅”与“荧光大小”同等含义。术语“终点荧光强度”是指数字PCR反应扩增结束后，数据阅读采集的微滴中荧光的大小。由于DNA聚合酶同时具有5’→3’外切酶活性，可将检测探针上的报告基团(荧光基团)从探针上切下，在每一轮扩增中积累荧光基团。

如本文中所使用的，术语“野生型核酸”或“野生型序列”是指在群体中最频繁观察到的基因或基因序列，并因此被定义为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“突变型核酸”或“突变型序列”指当与野生型基因、序列相比时，显示出序列或功能特异性的改变的基因、序列。突变具有多种形式，例如，添加突变、缺失突变、移码突变、错义突变、点突变、读框移位突变、转换突变和颠换突变等，本发明所检测的突变不限于任何类型的突变。

数字PCR将含有核酸分子的反应体系分割成千上万个纳升级的微滴或微孔，其中每个微滴或微孔都作为一个独立的PCR反应器进行扩增。在扩增结束后，通过计数阴性和阳性微滴的数量，结合泊松分布原理，即可计算数字PCR反应之前反应体系中核酸分子的拷贝数。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明具备以下优势：

(1)本发明的方法能够通过荧光信号的强度来区分突变类型，由此能够在单个数字PCR反应中实现对多种突变的检测；

(2)本发明的方法可对核酸样本进行绝对定量，准确给出异质性样本中突变频率的百分比；

(3)本发明的方法在大量野生背景下，对低丰度核酸的检测有显著优势，适用于低异质性样本的检测；

(4)本发明的方法可通过两条或两条以上探针的荧光信号的强度，来确定核酸分子上发生了哪种类型的突变。

本申请的方法提高了数字PCR应用于突变检测的效率，降低了反应成本和时间成本。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1示例性的显示了本发明系统的原理。针对突变区域较为分散的靶核酸，设计A探针、B探针两条探针，以分别对第一区域和第二区域进行检测，其中，A探针和B探针各自携带不同的报告基团(例如第一和第二荧光基团)，并且分别与第一区域的野生型序列和第二区域的野生型序列完全互补。

当待检测的靶核酸为野生型(即，第一区域和第二区域均不含有突变)时，A探针和B探针分别在第一区域和第二区域与靶核酸完全匹配。在此情况下，A探针和第一区域结合形成的双链体以及B探针与第二区域结合形成的双链体均最稳定，具有最高的熔点。相应地，在数字PCR期间，数量最多的A探针和B探针结合至靶核酸上，并且被核酸聚合酶降解。在数字PCR结束后，所检测到的第一和第二荧光基团的积累的终点荧光强度最大(图1A)。

当待检测的靶核酸在第一区域存在突变、而在第二区域不存在突变时，A探针和第一区域结合形成的双链体较不稳定，具有相对降低的熔点；相应地，在数字PCR期间，数量较少的A探针结合至靶核酸上，并且被核酸聚合酶降解。在数字PCR结束后，所检测到的第一荧光基团的积累的终点荧光强度下降。相比之下，B探针仍然能够与靶核酸完全匹配，并且如上所分析的，在数字PCR结束后，所检测到的第二荧光基团的积累的终点荧光强度最大。因此，当数字PCR所检测到的第一荧光基团的积累的终点荧光强度下降、而第二荧光基团的积累的终点荧光强度保持最大(图1B)时，即可判断，待检测的靶核酸在第一区域含有突变，而在第二区域不含突变。

相应地，当数字PCR所检测到的第二荧光基团的积累的终点荧光强度下降、而第一荧光基团的积累的终点荧光强度保持最大(图1C)时，即可判断，待检测的靶核酸在第二区域含有突变，而在第一区域不含突变。当数字PCR所检测到的第一和第二荧光基团的积累的终点荧光强度均下降(图1D)时，即可判断，待检测的靶核酸在第一区域和第二区域都含有突变。

进一步，还可根据第一和第二荧光基团的积累的终点荧光强度的下降幅度来判断待检测的靶核酸在第一区域和第二区域含有的突变类型。易于理解，当第一区域(或第二区域)与A探针(或B探针)的互补性越低(即，不匹配程度越高)，二者结合形成的双链体就越不稳定，其熔点就越低。相应地，在数字PCR期间，数量越少的A探针(或B探针)能够结合至靶核酸上，并且被核酸聚合酶降解。在数字PCR结束后，所检测到的第一(或第二)荧光基团的积累的终点荧光强度就越低。因此，根据第一(或第二)荧光基团的积累的终点荧光强度值，可以判断待检测的靶核酸在第一区域和第二区域含有的突变类型(图1B和图1C)。

图2显示了实施例1中使用引物F1和R1以及探针P1和P2对野生型质粒(WT)和突变类型质粒(M1-M6)进行数字PCR的检测结果。

图3显示了对使用实施例2中描述的方法和体系检测出的突变频率与预期的突变频率进行线性回归的结果。

图4显示了使用实施例3中描述的方法和体系对含有不同模板的核酸样本进行数字PCR检测并计算突变频率的结果。

图5显示了使用实施例4中描述的方法和体系对9种不同样品进行数字PCR的检测结果。

图6显示了使用实施例5中描述的方法和体系检测X基因的探针设计原理。

图7显示了实施例5中使用引物F2和R2以及探针PA和PB对野生型质粒(WT)和突变类型质粒(H1-H5)进行数字PCR的检测结果。

图8显示了使用实施例6中描述的方法和体系对含有不同模板浓度的核酸样本进行数字PCR检测并计算突变频率的结果。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1

本实施例的实验材料为已知具有多个突变位点的M基因，该基因总长为2517bp，其序列如SEQ ID NO:1所示，并且其中第88、90、91和94个密码子是最常发生突变的密码子。其中，第94个密码子的突变频率最高，包括5种突变类型，约占突变总数的60％，其余3个密码子的突变类型分别约占突变总数的24％，11％和3％。通过分子克隆的方法将该基因的野生型核苷酸序列(SEQ ID NO:2)和不同突变型的核苷酸序列分别构建至克隆载体Pmd-18T中(购自TAKARA)，得到了野生型质粒和6种突变型质粒(M1、M2、M3、M4、M5、M6；其各自包含的突变如表1所示)。构建完成后，通过测序进行验证。因为用于数字PCR分析的质粒需要线性化处理，因此对质粒进行线性化处理并回收线性化的质粒，并将各个质粒分别调整至2*10³copies/μL备用。

表1. 6种突变类型

突变命名	突变位置	突变类型
			M1	密码子90	GCG→GTG
M2	密码子91	TCG→CCG
			M3	密码子94	GAC→AAC
M4	密码子94	GAC→GCC
			M5	密码子94	GAC→TAC
M6	密码子94	GAC→GGC

根据该基因的核苷酸序列和6种突变类型，分别设计了上、下游引物(F1和R1)及两条探针(P1和P2)，其中，引物F1和R1能够扩增含有M1-M6的突变位点的核苷酸区段；探针P1能够与包含M1和M2的突变位点的核苷酸区域退火或杂交，探针P2能够与包含M3、M4、M5和M6的突变位点的核苷酸区域退火或杂交。引物F1和R1以及探针P1和P2的具体序列如表2所示，并且，探针P1携带HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团，探针P2携带FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团。

表2.引物及探针的序列

序列名称	寡核苷酸序列	碱基数	SEQ ID NO:
				F1	GCAGCCACGCCAAGTCGGC	19	4
R1	CCCGCTGGTGGACGGCCA	18	5
				P1	ATCTACGACACCTGGTGCGC	20	6
P2	ATCTACGACAGCCTGGTG	18	7

将配置好的反应体系(具体如表3所示)加入DG8cartridge(Bio-Rad，美国)中，每个样品同时还加入70uL的微滴发生油，放入支架中。将支架平稳的放置于微滴发生仪(Bio-Rad，美国)中生成微滴，一般用时2分钟。将生成的微滴用排枪转移至96孔板中，将96孔板放入PX1封膜仪(Bio-Rad，美国)对其进行封膜，180℃，10s。封好之后在可朗基A300PCR仪(朗基，中国杭州)上进行扩增。升温速率2.5℃/s(具体扩增程序如表4所示)。在本实验中，所使用的DNA模板分别为上述得到的线性化野生型质粒和6种突变型质粒(M1、M2、M3、M4、M5、M6。

表3.反应体系

组分名称	终浓度
		2×ddPCR superMix for Probes(No dUTP)	1×
F1	900nM
		R1	900nM
P1	250nM
		P2	250nM
DNA模板	5uL
		无菌超纯水	补足反应体积
总体积	20uL

表4.PCR扩增程序

在PCR仪上运行结束后，将96孔板放入plate holder中组装好，平稳放入QX100微滴阅读仪(Bio-Rad，美国)中，并使用Quantasoft软件，进行数据的读取，获得各个微滴的FAM和HEX的累积终点荧光强度，并获得待测核酸分子的拷贝数。根据阴性对照的本底信号强度，设置一个阈值，当微滴的荧光强度高于该阈值时，将该微滴的信号判定为阳性信号。然后，根据各个微滴的累积终点荧光强度绘制散点图，以HEX的终点荧光强度为横坐标，以FAM的终点荧光强度为纵坐标。实验结果如图2所示。

如图2所示，当以野生型质粒为模板进行数字PCR时，探针P1和P2与模板和扩增产物完全互补，由此所形成的双链体最稳定，具有最高的熔点。因此，在数字PCR期间，数量最多的探针P1和P2结合至模板和扩增产物上，并且被核酸聚合酶降解。在数字PCR结束后，所检测到的FAM和HEX的积累的终点荧光强度最高。

当以在第94个密码子含有突变的核酸样本(M3-M6)为模板进行数字PCR时，探针P1与模板和扩增产物完全互补，由此所形成的双链体最稳定，具有最高的熔点；但是，探针P2与模板和扩增产物不能完全互补，由此所形成的双链体的稳定性下降，熔点降低。因此，在数字PCR期间，结合至模板和扩增产物上的探针P1的数量基本上保持不变，而结合至模板和扩增产物上的探针P2的数量则显著下降。在数字PCR结束后，所检测到的HEX的积累的终点荧光强度基本上保持不变，但是FAM的积累的终点荧光强度显著降低。由此，可以将突变型质粒(M3-M6)与野生型质粒(WT)进行区分(图2)。

进一步，由于M3-M6各自包含不同的突变，其与探针P2所形成的双链体的熔点下降幅度各不相同；相应地，在数字PCR期间，结合至模板和扩增产物上的探针P2的数量的下降程度也各不相同；在数字PCR结束后，FAM的终点荧光强度的下降程度也各不相同(双链体的熔点下降越多，结合的探针P2就越少，FAM的终点荧光强度就越低)。由此，可以将突变型质粒M3-M6彼此区分开(图2)。

类似地，基于HEX的终点荧光强度，可以将在第90或91个密码子含有突变的核酸样本(M1-M2)与野生型质粒(WT)相区分，并且可以将突变型质粒M1-M2彼此区分开(图2)。

图2的实验结果表明，通过使用本发明的检测体系和方法，在仅使用2种探针的情况下，即可以在单个反应内检测和区分野生型质粒和多种(6种)突变型质粒。

实施例2

本实施例的具体实验步骤同实施例1，不同之处在于，将反应体系中的DNA模板进行了调整，所应用的模板具体为：

(1)50％组：取50ul 2×10³copies/μl的M6型突变型质粒与50ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(2)10％组：取10ul 2×10³copies/μl的M6型突变型质粒与90ul同浓度的野生型质粒震荡混匀，并用于后续1％组的制备。

(3)5％组：取5ul 2×10³copies/μl的M6型突变型质粒与95ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(4)1％组：取10ul 10％组的混合液并混入90ul 10³copies/μl的野生型质粒，震荡混匀。

(5)野生型对照组：2×10³copies/μl的野生型质粒。

将2×10³copies/μl的50％组、10％组、5％组、1％组、野生型对照组模板分别稀释至2×10²copies/μl。取稀释前的模板(5μl；高模板浓度组)或稀释后的模板(5μl；低模板浓度组)，分别按照实施例1中描述的体系进行配制，并进行数字PCR。如实施例1所述，获取每个实验组的各个微滴的FAM和HEX的累积终点荧光强度，并根据各个微滴的累积终点荧光强度绘制散点图，以HEX的终点荧光强度为横坐标，以FAM的终点荧光强度为纵坐标。进一步，如实施例1所述，区分含有野生型质粒(WT)或突变型质粒(M6)的微滴，分别计数，并通过Quantasoft软件输出拷贝数，突变频率如下计算：

突变频率＝含有突变型质粒的拷贝数目/(含有野生型质粒的拷贝数目+含有突变型质粒的拷贝数目)

对检测的突变频率和预期的突变频率进行线性回归。实验结果如图3所示。结果显示，在两种模板浓度(10⁴拷贝/反应和10³拷贝/反应)下，使用本发明体系检出的突变频率与预期的突变频率有良好线性相关关系，R²＝0.999。图3的实验结果表明，本发明的检测体系和方法具有优良的检测稳定性，能够稳定、可靠地检出极低浓度的核酸样本(10拷贝/反应)。

实施例3

本实施例的具体实验步骤同实施例2，不同之处在于，将反应体系中的DNA模板进行了调整，所应用的模板具体为：

(1)1％组：取10ul 10％组的混合液并混入90ul 10³copies/μl的野生型质粒，震荡混匀。

(2)0.5％组：取5ul 5％组的混合液并混入95ul 10³copies/μl的野生型质粒，震荡混匀。

(3)野生型对照组：2×10³copies/μl的野生型质粒。

在2×10³copies/μl的1％组、0.5％组和野生型对照组中，各取模板5μl，分别按照实施例2中所述进行数字PCR(每种模板重复8孔)，并计算突变频率。

实验结果如图4所示。结果显示，在模板为10⁴拷贝/反应的浓度下，野生型对照组与1％组、0.5％组均能够显著区分，稳定性良好。即本申请的方法能够在极低的拷贝下，准确区分含有突变的样本以及不含有突变的样本。

实施例4

在本实施例中，实验员A共采集了9例核酸样本，这些核酸样本可能混合有一种或多种核酸分子，并且这些核酸分子随机的含有实施例1的6种突变(M1-M6)和野生型中的一个或几个。实验员A将9例核酸样本混合的组分和比例记录在实验本中。

实验员B将9例核酸样本分别按照实施例1和2中描述的步骤进行检测，并计算突变频率。所述9个样本的检测结果如下所示：

样本1：野生型核酸分子。

样本2：野生型核酸分子+含有M2型突变的核酸分子+含有M6型突变的核酸分子。

样本3：含有M2型突变的核酸分子+含有M1型突变的核酸分子。

样本4：含有M1型突变的核酸分子+含有M6型突变的核酸分子。

样本5：野生型核酸分子+含有M2型突变的核酸分子。

样本6：含有M6型突变的核酸分子+含有M6型突变和M1型突变的核酸分子。

样本7：野生型核酸分子+含有M6型突变的核酸分子。

样本8：含有M6型突变的核酸分子。

样本9：含有M2型突变的核酸分子+含有M6型突变的核酸分子。

9个样本的检测结果及突变的计算频率如图5所示。将检测结果与实验员A记录的样本进行比较，结果一致。结果证实，通过使用本发明的方法和体系，能够准确地区分和鉴定出各个核酸样本含有的野生型或突变的类型，并计算各突变类型的突变频率。特别的，通过使用本发明的方法和体系，还检测并区分出了样本6的核酸分子中含有的复合突变(即一个核酸分子上同时含有两种突变)。

实施例5

本实施例的实验材料为已知具有多个突变位点的X基因，其序列如SEQ ID NO:3所示。如图6所示，其第39、32、30、10、9和6个密码子是最常发生突变的密码子。根据该基因的核苷酸序列和5种突变类型，分别设计了上、下游引物(F2和R2)及两条探针(PA和PB)，其中，引物F2和R2能够扩增含有5种突变位点的核苷酸区段；探针PA能够与包含第39、32和30位密码子的核苷酸区域退火或杂交，探针PB能够与包含第10、9和6位密码子的核苷酸区域退火或杂交。引物F2和R2以及探针PA和PB的具体序列如表6所示，并且，探针PA携带FAM荧光基团和BHQ1，探针PB携带HEX荧光基团和BHQ1。

表5.5种突变类型

突变命名	突变位置	突变类型
			H1	密码子39	C→T
H2	密码子32	G→A
			H3	密码子30	C→T
H4	密码子10	C→T
			H5	密码子9	G→A

表6.引物和探针序列

序列名称	寡核苷酸序列	碱基数	SEQ ID NO:
				F2	GACCGCAGCCACGCCAAGTC	20	8
R2	AGCATCTCCATCGCCAACGGGGT	23	9
				PA	CTACGACAGCCTGGTGCGC	19	10
PB	CGCACGGCGACGCGTCGAT	19	11

按照实施例1描述的步骤，分别制备线性化的野生型质粒，以及突变型质粒H1-H5(表5)，并对样品分别进行数字PCR检测。

如图7所示，当以野生型质粒为模板进行数字PCR时，探针PA和PB与模板和扩增产物完全互补，由此所形成的双链体最稳定，具有最高的熔点。因此，在数字PCR期间，数量最多的探针PA和PB结合至模板和扩增产物上，并且被核酸聚合酶降解。在数字PCR结束后，所检测到的FAM和HEX的积累的终点荧光强度最高。

当以在第32个密码子含有突变的核酸样本(H2)为模板进行数字PCR时，探针PB与模板和扩增产物完全互补，由此所形成的双链体最稳定，具有最高的熔点；但是，探针PA与模板和扩增产物不能完全互补，由此所形成的双链体的稳定性下降，熔点降低。因此，在数字PCR期间，结合至模板和扩增产物上的探针PB的数量基本上保持不变，而结合至模板和扩增产物上的探针PA的数量则显著下降。在数字PCR结束后，所检测到的HEX的积累的终点荧光强度基本上保持不变，但是FAM的积累的终点荧光强度显著降低。由此，可以将突变型质粒(H2)与野生型质粒(WT)进行区分(图7)。

进一步，由于H1和H3各自包含不同的突变，其与探针PA所形成的双链体的熔点下降幅度各不相同；相应地，在数字PCR期间，结合至模板和扩增产物上的探针PA的数量的下降程度也各不相同；在数字PCR结束后，FAM的终点荧光强度的下降程度也各不相同(双链体的熔点下降越多，结合的探针PA就越少，FAM的终点荧光强度就越低)。由此，可以将突变型质粒H1和H3彼此区分开(图7)。

类似地，基于HEX的终点荧光强度，可以将在第10个密码子的两种含有不同突变的核酸样本(H4和H5)与野生型质粒(WT)相区分，并且可以将突变型质粒H4和H5彼此区分开(图7)。

图7的实验结果表明，通过使用本发明的检测体系和方法，在仅使用2种探针的情况下，即可以在单个反应内检测和区分野生型质粒和多种(至少5种)突变型质粒。

实施例6

本实施例的具体实验步骤同实施例1，不同之处在于，将反应体系中的DNA模板进行了调整，所应用的模板具体为：

1、A组(突变型质粒H3与野生型的混合)：

(1)50％组：取50ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与50ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(2)10％组：取10ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与90ul同浓度的野生型质粒震荡混匀，并用于后续1％组的制备。

(3)5％组：取5ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与95ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(4)1％组：取10ul 10％组的混合液并混入90ul 10³copies/μl的野生型质粒，震荡混匀。

(5)野生型对照组：2×10³copies/μl的野生型质粒。

2、B组(突变型质粒H4与野生型的混合)：

(1)50％组：取50ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与50ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(2)10％组：取10ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与90ul同浓度的野生型质粒震荡混匀，并用于后续1％组的制备。

(3)5％组：取5ul 2×10³copies/μl的突变型质粒与95ul同浓度的野生型质粒震荡混匀。

(4)1％组：取10ul 2×10％组的混合液并混入90ul 103copies/μl的野生型质粒，震荡混匀。

(5)野生型对照组：2×10³copies/μl的野生型质粒。

将2×10³copies/μl的50％组、10％组、5％组、1％组、野生型对照组，稀释至2×10²copies/μl。取稀释后的混合物5μl按照实施例1中描述的体系进行配制，并进行后续实验。分别取5组模板5μl，按照实施例1中描述的体系进行配制，并进行数字PCR。如实施例1所述，获取每个实验组的各个微滴的FAM和HEX的累积终点荧光强度，并根据各个微滴的累积终点荧光强度绘制散点图，以HEX的终点荧光强度为横坐标，以FAM的终点荧光强度为纵坐标。进一步，如实施例1所述，区分含有野生型质粒(WT)或突变型质粒(H3或H4)的微滴，并通过Quantasoft软件输出拷贝数。然后，如下计算突变频率：

突变频率＝含有突变型质粒的拷贝数目/(含有野生型质粒的拷贝数目+含有突变型质粒的拷贝数目)

实验结果如图8所示，在5种不同模板的浓度下考察，两种突变均能够实现1％的异质性检测灵敏度，并且，异质性样本可实现定量检测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种检测目的核酸是否含有突变的方法和试剂盒

<130> IDC200304

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2517

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> M基因

<400> 1

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

atgggcaact accacccgca cggcgacgcg tcgatctacg acagcctggt gcgcatggcc 300

cagccctggt cgctgcgcta cccgctggtg gacggccagg gcaacttcgg ctcgccaggc 360

aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgctgaggg aaatcgacga ggagacagtc gatttcatcc ctaactacga cggccgggtg 480

caagagccga cggtgctacc cagccggttc cccaacctgc tggccaacgg gtcaggcggc 540

atcgcggtcg gcatggcaac caatatcccg ccgcacaacc tgcgtgagct ggccgacgcg 600

gtgttctggg cgctggagaa tcacgacgcc gacgaagagg agaccctggc cgcggtcatg 660

gggcgggtta aaggcccgga cttcccgacc gccggactga tcgtcggatc ccagggcacc 720

gctgatgcct acaaaactgg ccgcggctcc attcgaatgc gcggagttgt tgaggtagaa 780

gaggattccc gcggtcgtac ctcgctggtg atcaccgagt tgccgtatca ggtcaaccac 840

gacaacttca tcacttcgat cgccgaacag gtccgagacg gcaagctggc cggcatttcc 900

aacattgagg accagtctag cgatcgggtc ggtttacgca tcgtcatcga gatcaagcgc 960

gatgcggtgg ccaaggtggt gatcaataac ctttacaagc acacccagct gcagaccagc 1020

tttggcgcca acatgctagc gatcgtcgac ggggtgccgc gcacgctgcg gctggaccag 1080

ctgatccgct attacgttga ccaccaactc gacgtcattg tgcggcgcac cacctaccgg 1140

ctgcgcaagg caaacgagcg agcccacatt ctgcgcggcc tggttaaagc gctcgacgcg 1200

ctggacgagg tcattgcact gatccgggcg tcggagaccg tcgatatcgc ccgggccgga 1260

ctgatcgagc tgctcgacat cgacgagatc caggcccagg caatcctgga catgcagttg 1320

cggcgcctgg ccgcactgga acgccagcgc atcatcgacg acctggccaa aatcgaggcc 1380

gagatcgccg atctggaaga catcctggca aaacccgagc ggcagcgtgg gatcgtgcgc 1440

gacgaactcg ccgaaatcgt ggacaggcac ggcgacgacc ggcgtacccg gatcatcgcg 1500

gccgacggag acgtcagcga cgaggatttg atcgcccgcg aggacgtcgt tgtcactatc 1560

accgaaacgg gatacgccaa gcgcaccaag accgatctgt atcgcagcca gaaacgcggc 1620

ggcaagggcg tgcagggtgc ggggttgaag caggacgaca tcgtcgcgca cttcttcgtg 1680

tgctccaccc acgatttgat cctgttcttc accacccagg gacgggttta tcgggccaag 1740

gcctacgact tgcccgaggc ctcccggacg gcgcgcgggc agcacgtggc caacctgtta 1800

gccttccagc ccgaggaacg catcgcccag gtcatccaga ttcgcggcta caccgacgcc 1860

ccgtacctgg tgctggccac tcgcaacggg ctggtgaaaa agtccaagct gaccgacttc 1920

gactccaatc gctcgggcgg aatcgtggcg gtcaacctgc gcgacaacga cgagctggtc 1980

ggtgcggtgc tgtgttcggc cggcgacgac ctgctgctgg tctcggccaa cgggcagtcc 2040

atcaggttct cggcgaccga cgaggcgctg cggccaatgg gtcgtgccac ctcgggtgtg 2100

cagggcatgc ggttcaatat cgacgaccgg ctgctgtcgc tgaacgtcgt gcgtgaaggc 2160

acctatctgc tggtggcgac gtcagggggc tatgcgaaac gtaccgcgat cgaggaatac 2220

ccggtacagg gccgcggcgg taaaggtgtg ctgacggtca tgtacgaccg ccggcgcggc 2280

aggttggttg gggcgttgat tgtcgacgac gacagcgagc tgtatgccgt cacttccggc 2340

ggtggcgtga tccgcaccgc ggcacgccag gttcgcaagg cgggacggca gaccaagggt 2400

gttcggttga tgaatctggg cgagggcgac acactgttgg ccatcgcgcg caacgccgaa 2460

gaaagtggcg acgataatgc cgtggacgcc aacggcgcag accagacggg caattaa 2517

<210> 2

<211> 227

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> M基因的扩增片段

<400> 2

gaccgcagcc acgccaagtc ggcccggtcg gttgccgaga ccatgggcaa ctaccacccg 60

cacggcgacg cgtcgatcta cgacagcctg gtgcgcatgg cccagccctg gtcgctgcgc 120

tacccgctgg tggacggcca gggcaacttc ggctcgccag gcaatgaccc accggcggcg 180

atgaggtaca ccgaagcccg gctgaccccg ttggcgatgg agatgct 227

<210> 3

<211> 478

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> X基因

<400> 3

cttgccggaa agacatgccc tgggggtgca ccgagaccgg cttccgacca ccgctcgccg 60

caacgtcgac tggctcatat cgagaatgct tgcggcactg ctgaaccact gctttgccgc 120

caccgcggcg aacgcgcgaa gcccggccac ggccggctag cacctcttgg cggcgatgcc 180

gataaatatg gtgtgatata tcacctttgc ctgacagcga cttcacggca cgatggaatg 240

tcgcaaccaa atgcattgtc cgctttgatg atgaggagag tcatgccact gctaaccatt 300

ggcgatcaat tccccgccta ccagctcacc gctctcatcg gcggtgacct gtccaaggtc 360

gacgccaagc agcccggcga ctacttcacc actatcacca gtgacgaaca cccaggcaag 420

tggcgggtgg tgttcttttg gccgaaagac ttcacgttcg tgtgccctac cgagatcg 478

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 4

gcagccacgc caagtcggc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 5

cccgctggtg gacggcca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 6

atctacgaca cctggtgcgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 7

atctacgaca gcctggtg 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 8

gaccgcagcc acgccaagtc 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 9

agcatctcca tcgccaacgg ggt 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 10

ctacgacagc ctggtgcgc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 11

cgcacggcga cgcgtcgat 19

Claims (10)

1.一种检测样品中目的核酸是否含有突变的方法，所述方法包括：

(I)提供包含目的核酸的样品；

(II)使用引物组和探针组对所述包含目的核酸的样品进行数字PCR，其中，

(a)所述引物组至少包含一条引物(例如一对引物或更多的引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(b)所述探针组包含至少两条检测探针(例如第一探针和第二探针)；其中，

(i)每一条探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一条探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；

(ii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针都能够与野生型目的核酸和突变型目的核酸杂交或退火，并且，所述探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m1)和所述探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m2)存在差异(例如，第一探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点和第一探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点不同)；优选地，T_m1和T_m2相差至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)；

(iii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针能够分别杂交或退火至野生型目的核酸的不同区域(例如，第一探针能够杂交或退火至野生型目的核酸的区域A；第二探针能够杂交或退火至野生型目的区域B)；

优选地，不同探针所杂交或退火的区域(例如，区域A和区域B)相距至少5bp，至少10bp，至少50bp，至少100bp，至少500bp，至少1000bp，至少5000bp，至少10000bp，或更大；

(III)根据数字PCR的检测结果判断样品中是否存在突变，并且任选地，判断突变的类型。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述探针与不同突变类型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)不同；优选地，所述探针与不同突变型目的核酸所形成的双链体的熔点(T_m)的差异为至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)；

(2)所述探针组包含两条、三条或者更多条探针，并且根据每一条探针所携带的报告基团(例如荧光基因)的终点信号强度(例如终点荧光强度)判断样品中是否存在突变，并且任选地，判断突变的类型；

(3)所述方法还包括，确定特定突变类型在目的核酸中的频率；优选地，通过下述方法计算特定突变类型在目的核酸中的频率：突变频率＝含有该突变类型目的核酸的拷贝数量/总拷贝数量；

(4)所述探针组中至少一条探针与野生型目的核酸和突变型目的核酸所形成的各种双链体之间的熔点高于退火温度；优选地，所述探针组中的每一条探针与野生型目的核酸和突变型目的核酸所形成的各种双链体之间的熔点高于退火温度；优选地，所述退火温度低于65℃；优选地，所述退火温度为55℃-65℃；

(5)所述探针组的每一条探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

(6)所述探针为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(7)所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(8)所述探针是线性的，或者具有发夹结构；

(9)在所述方法的步骤(II)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶具有5’至3’外切酶活性；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermusaquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述探针组中的每一条探针分别与野生型目的核酸的序列完全互补。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述探针组中的每一条探针分别与突变型目的核酸的序列完全互补。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述探针组中的部分探针与野生型目的核酸的序列完全互补；优选地，所述探针组中的其余探针与突变型目的核酸的序列完全互补。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述引物组包含一对或多对上游引物和下游引物；

优选地，所述上游引物和下游引物具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述一对或多对上游引物和下游引物能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(2)所述探针能够与上游引物和下游引物特异性扩增的目的核酸或其片段所产生的扩增产物杂交或退火；

(3)所述上游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列；

(4)所述下游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列；

(5)上游引物可以包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(6)上游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(7)下游引物可以选自或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(8)下游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)，或者其任何组合；

(2)待扩增的靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合；

(3)待扩增的靶核酸是单链的或双链的；和

(4)所述样品或靶核酸获自原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如Herpes病毒，HIV，流感病毒，EB病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)或类病毒。

8.一种检测样品中目的核酸是否含有突变的试剂盒，所述试剂盒包括：引物组和探针组，其中，

(a)所述引物组至少包含一条引物(例如一对引物或更多引物)，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述引物组能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(b)所述探针组包含至少两条探针(例如第一探针和第二探针)；其中，

(i)每一条探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一条探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；

(ii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针都能够与野生型目的核酸和突变型目的核酸杂交或退火，并且，所述探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m1)和所述探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点(T_m2)存在差异(例如，第一探针与野生型目的核酸形成的双链体的熔点和第一探针与突变型目的核酸形成的双链体的熔点不同)；优选地，T_m1和T_m2相差至少2℃(例如，至少3℃，至少4℃或更多)；

(iii)在允许核酸杂交或退火的条件下，每一条探针能够分别杂交或退火至野生型目的核酸的不同区域(例如，第一探针能够杂交或退火至野生型目的核酸的区域A；第二探针能够杂交或退火至野生型目的区域B)；

优选地，不同探针所杂交或退火的区域(例如，区域A和区域B)相距至少5bp，至少10bp，至少50bp，至少100bp，至少500bp，至少1000bp，至少5000bp，至少10000bp，或更大；

优选地，所述试剂盒用于进行数字PCR；

优选地，所述试剂盒还包括选自核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行数字PCR的试剂，数字PCR芯片，微孔板中的一种或多种；

优选地，所述核酸聚合酶具有5’至3’外切酶活性；

优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。

9.权利要求8的试剂盒，其中，所述引物组包含一对或多对上游引物和下游引物；

优选地，所述上游引物和下游引物具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述一对或多对上游引物和下游引物能够特异性扩增所述目的核酸或其片段；

(2)所述探针能够与上游引物和下游引物特异性扩增的目的核酸或其片段所产生的扩增产物杂交或退火；

(3)所述上游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列；

(4)所述下游引物包含与所述野生型目的核酸和突变型目的核酸的序列互补的序列；

(5)上游引物可以包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(6)上游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(7)下游引物可以选自或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(8)下游引物的长度为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

10.权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8或9所述的试剂盒，其中，所述数字PCR选自微滴式数字PCR和芯片式数字PCR。

Images