CN114645082A - 一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及含有单核苷酸多态性(SNP)位点的核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，通过同时、不对称扩增来源于生物个体的含有SNP位点的核酸分子，本申请提供了一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。
Description
技术领域
本申请涉及含有单核苷酸多态性(SNP)位点的核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，通过同时、不对称扩增来源于生物个体的含有SNP位点的核酸分子，本申请提供了一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。
背景技术
随着各方面对司法诉讼活动的科学性、准确性及客观性要求的不断提高，以及物证鉴定领域的不断发展，对案件中检材个体来源的要求也随之提高。通常，对遗传物质DNA进行检验，通过检验其序列的多态性及长度的多态性，就可以实现个体的识别及亲权的鉴定。由于检测结果的准确性及可靠性较佳，DNA分析目前已经成为物证鉴定领域的重要技术手段。
目前，法医DNA鉴定主要采用PCR-STR分型技术对未知个体来源的检材进行基于STR(short tandem repeat，短串联重复序列)位点的分型。但是，由于各STR位点长度不一，往往需要扩增达400bp的产物，并且，在实际案件中常会遇到各种因素导致检材降解严重，而PCR-STR分型技术对这些检材进行检测时，常出现“优势扩增”或“无效扩增”，导致片段较大的STR基因座无法有效分型，从而导致错误的分型结果。此外，基于STR的分型技术一直依赖各式PCR后处理技术，而目前主要是基于PCR产物的毛细管电泳，但这种开盖的分析方法有引起实验室污染的风险，并且操作复杂、耗时较长，同时受到特殊仪器的限制。因此，PCR-STR分型技术并不能满足目前法医DNA鉴定的发展需要。
SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)是目前为止人类基因组中分布最广泛、存在数量最多的DNA遗传多态性，占所有已知多态性的90％以上，平均500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，比STR高出几个数量级。由于SNP主要为二等位基因多态性，其突变率低，比STR更加稳定可靠，且检测SNP所需要扩增的PCR产物更短，更适合于法医DNA鉴定中降解的检材。然而，SNP分型技术尚未在法医鉴定中广泛应用，主要原因包括：1)SNP识别率比STR低，需要检测多个高度多态性的SNP才能满足个体识别的需要；2)SNP在不同国家和民族发生率差异较大，同一组SNP对不同人群的个体识别能力有差异；3)缺乏简便、快速、易于自动化的SNP检测技术平台。
综上，如何建立一种简便、快速、易于自动化的SNP检测体系，且可对痕量、降解检材的DNA同时进行个体识别和亲权鉴定，为法医DNA分析提供有力的技术支撑，成为亟待解决的问题。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。基因组中具有单核苷酸多态性的位点即称为“SNP位点”。在本文中，SNP位点通过其参考号(例如rs ID)命名。可以利用rs ID在公共数据库中查询SNP位点及其型别，例如，通过NCBI的dbSNP数据库，ChinaMAP数据库，JSNP数据库等。
如本文中所使用的，术语“亲权鉴定”或“亲缘鉴定”二者表示相同的含义，可以互换使用。其是指，利用生物的遗传标记的监测与分析，判定父代与子代之间的关系。在人类的亲权鉴定中，分为常规亲权鉴定(例如，父母子的鉴定)、隔代亲权鉴定(例如，祖父母和孙子/女的鉴定)和疑难的亲权鉴定(例如，表兄妹，父母皆疑的同胞的鉴定)。
如本文中所使用的，术语“个体识别率(Power of discrimination,DP)”是指在群体中随机抽取的两个个体，二者的遗传标记不相同的概率。
如本文中所使用的，术语“三联体”是指父、母和子三方，“三联体非父排除率”是指通过检测遗传标记，能够将不是孩子亲生父亲/母亲的个体排除的概率。
如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。
如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。
如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。
如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。
如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。
在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(Tm)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的Tm就越高。因此，通过检测双链体的Tm，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“Tm”具有相同的含义，并且可互换使用。
本申请的发明人通过深入的研究，开发了一种高效不对称扩增多种靶核酸的方法。在此基础上，结合熔解曲线分析，本申请开发了一种能够简便、快速识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
因此，在一个方面，本申请提供了一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法:
(a)针对每一个待分析的个体，提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点，并且，
提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和
(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应分别扩增各个样品中的靶核酸，从而获得分别与各个个体对应的扩增产物；
(c)对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
(d)根据步骤(b)的熔解曲线分析结果，对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系。
在本申请的方法中，正向引物和反向引物分别包含特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列和反向核苷酸序列，由此，在PCR反应过程中，靶特异性引物对(正向引物和反向引物)将退火至靶核酸，并启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)。进一步，由于正向引物和第一通用引物均包含第一通用序列，因此，与正向引物互补的核酸链A也能够与第一通用引物互补。类似地，与反向引物互补的核酸链B也能够与第二通用引物互补。
因此，随着PCR反应的进行，第一通用引物和第二通用引物将分别退火至初始扩增产物的核酸链A和核酸链B，并进一步启动PCR扩增。在该过程中，由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增初始扩增产物的核酸链A和核酸链B。与此同时，第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，虽然第二通用引物也可能退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链，其具有与正向引物互补的序列)，但是其与核酸链A在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与第一正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。
因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现了对含有一种或多种SNP位点的靶核酸的不对称扩增。因此，在本申请方法的步骤(a)和(b)中，实现了不对称扩增样品中的一种或多种靶核酸。
另外，由于正向引物和反向引物均含有第一通用序列，因此，在PCR反应过程中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸在退火阶段容易自身退火，形成稳定的锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中，引物二聚体的非特异性扩增能够被有效抑制。
在某些实施方案中，所述生物个体选自动物个体，例如哺乳动物个体，例如人类个体。
在某些实施方案中，所述SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098，rs7104420，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)。
在某些实施方案中，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420。
在某些实施方案中，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本申请的方法中，检测探针不受其长度的限制。在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。
在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。
在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。
此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。
然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。
因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。
在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL FluorRed 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。
在某些实施方案中，所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。
在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。
在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。
在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(2)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。
在某些实施方案中，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个SNP位点的型别。
在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204，207，210，213和216。
在某些实施方案中，其中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，进而对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将其与参照数据库进行比较，从而对生物个体进行识别；或者，
在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将两个或更多个生物个体的SNP位点型别进行比较，从而确定所述两个或更多个生物个体亲缘关系。
在某些实施方案中，所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸。
在某些实施方案中，所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个SNP位点。
在某些实施方案中，所述样品包含来源于所述个体的基因组核酸或其片段，例如基因组DNA或其片段。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对。
易于理解，对于不同的靶核酸，可以使用不同的正向引物和反向引物。然而，当不同的靶核酸之间存在序列相似性时，不同的靶特异性引物对可能具有相同的正向引物或反向引物。
为了便于进行多重不对称扩增且有效抑制引物二聚体的非特异性扩增，在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；在某些优选的实施方案中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高至少1倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少12倍，至少15倍，至少18倍，至少20倍，至少25倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍或更多倍。在某些优选的实施方案中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。
在本申请的方法中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度可以相同或者不同。在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物。如上文所详细论述的，在本发明的方法中，通过核酸链A和B与第一和第二通用引物的匹配性差异来实现不对称扩增。因此，第一通用引物相比于第二通用引物的相对浓度是可以变化的。在某些优选的实施方案中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的。在某些优选的实施方案中，所述第一通用引物的工作浓度高于第二通用引物。在某些优选的实施方案中，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物。如上文所详细论述的，本发明的方法的步骤(a)和(b)可用于实现含有一种或多种SNP位点的靶核酸的不对称扩增。在某些情况下，更高的扩增不对称性可能是有利的。因此，在某些优选的实施方案中，还可以调整第一通用引物和第二通用引物的比例，使得第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物，以进一步增强扩增的不对称性，更好地富集单链产物。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的。在某些优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的。在某些优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是不同的。在某些优选的实施方案中，所述正向引物的工作浓度低于所述反向引物的工作浓度。在某些优选的实施方案中，所述正向引物的工作浓度高于所述反向引物的工作浓度。
在某些实施方案中，所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。
在某些实施方案中，所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分。
在本申请的实施方案中，所述第一通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。在某些实施方案中，所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
在某些实施方案中，所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
在某些实施方案中，所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
在某些实施方案中，所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
在某些实施方案中，所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补。
在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:218所示。
在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:217所示。
在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；70和71；73和74；76和77；79和80；82和83；85和86；88和89；91和92；94和95；97和98；100和101；103和104；106和107；109和110；112和113；115和116；118和119；121和122；124和125；127和128；130和131；133和134；136和137；139和140；142和143；145和146；148和149；151和152；154和155；157和158；160和161；163和164；166和167；169和170；172和173；175和176；178和179；181和182；184和185；187和188；190和191；193和194；196和197；199和200；202和203；205和206；208和209；211和212；214和215。
在某些实施方案中，样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)，或者其任何组合。在某些优选的实施方案中，样品包含或是DNA(例如基因组DNA或cDNA)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是RNA(例如mRNA)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是核酸的混合物(例如DNA的混合物，RNA的混合物，或者DNA和RNA的混合物)。
在某些实施方案中，待扩增的靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合。
在某些实施方案中，待扩增的靶核酸是单链的或双链的。
在某些实施方案中，所述靶核酸获自原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如Herpes病毒，HIV，流感病毒，EB病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)或类病毒。
在某些实施方案中，所述靶核酸获自人类。
在某些实施方案中待扩增的靶核酸(例如，人基因组DNA)的浓度为至少0.05ng/μL，例如至少0.06ng/μL，至少0.07ng/μL，或至少0.08ng/μL。
在某些实施方案中，其中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：
(I)提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如上文所定义；
(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(II)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(VI)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(II)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，其中，所述方法的步骤(a)-(c)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：
(I)提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供一个靶特异性引物对和一个检测探针；其中，所述第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针如上文所定义；
(II)将所述样品与所述第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针，以及核酸聚合酶混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；
(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次；和
(VII)对前一步骤的产物进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性。
在某些实施方案中，在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
在某些实施方案中，在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交。
在某些实施方案中，在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
在某些实施方案中，在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(4)的产物，从而允许核酸延伸。
在某些实施方案中，在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。
在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(4)和(V)。
在某些实施方案中，重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。
在某些实施方案中，在步骤(VII)中，可对步骤(VI)的产物进行逐渐的升温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(VI)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(VI)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
在某些实施方案中，在步骤(VII)中，可对步骤(VI)的产物进行逐渐的降温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(VI)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(VI)的产物从75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)逐渐降温至45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。降温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，降温的速率可以为：每步骤降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
随后，可对获得的曲线进行求导，从而获得步骤(VI)的产物的熔解曲线。根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，可确定对应于该熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在。
在另一方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括能够不对称扩增含有SNP位点的靶核酸的引物组。
在某些实施方案中，所述引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述SNP位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行测序的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。
在某些实施方案中，所述SNP位点选自人染色体的rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420的任意组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)。
在某些实施方案中，所述SNP位点包括人染色体的rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420。
易于理解，本申请试剂盒中的第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针用于实施如上所述的识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法。因此，上文中对于第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。
在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204，207，210，213，和216。
在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:218所示。
在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:217所示。
在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；70和71；73和74；76和77；79和80；82和83；85和86；88和89；91和92；94和95；97和98；100和101；103和104；106和107；109和110；112和113；115和116；118和119；121和122；124和125；127和128；130和131；133和134；136和137；139和140；142和143；145和146；148和149；151和152；154和155；157和158；160和161；163和164；166和167；169和170；172和173；175和176；178和179；181和182；184和185；187和188；190和191；193和194；196和197；199和200；202和203；205和206；208和209；211和212；214和215。
在某些实施方案中，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如上文所定义；
(2)所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；
在某些实施方案中，所述试剂盒用于生物的个体识别或亲缘鉴定。
易于理解，本申请的试剂盒用于实施如上所述的识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法。因此，上文中对于方法所描述的各项优选特征和示例性特征同样也可以适用于本申请的试剂盒及其组分，并且没有超出本发明的构思和本申请的范围。
在本申请的又一方面，提供了如前所定义的引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于识别生物个体，或用于对生物个体进行亲缘鉴定。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的检测探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。
发明的有益效果
本发明与目前司法检验中个体识别或亲缘鉴定的同类技术相比具有以下优势：(1)本发明的方法能够检测高度降解的检材；(2)本发明方法采用多重不对称扩增技术，其特异性强，有抑制引物二聚体的作用，使得检测体系的灵敏度高，可以检测微量DNA；(3)本发明全程采用闭管体系，无PCR产物污染风险，检测自动化程度高。
综合上述优势，采用本发明方法，能够高精度且有效的识别生物个体和对生物个体进行亲缘鉴定。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1示意性地描述了本发明方法通过SNP分型识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。
图1A示意性地描述了该实施方案中所涉及的引物组和自淬灭荧光检测探针，其中，引物组包括：第一通用引物和第二通用引物，以及，包含正向引物和反向引物的靶特异性引物对；其中，
第一通用引物包含第一通用序列(Tag1)；
第二通用引物包含第二通用序列(Tag2)，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸(例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸)；
正向引物包含第一通用序列和特异于含有SNP位点的靶核酸的正向核苷酸序列，且正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；
反向引物包含第二通用序列和特异于含有SNP位点的靶核酸的反向核苷酸序列，且反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，
正向引物和反向引物能够特异性扩增相应的含有SNP位点的靶核酸；并且，
第二通用序列不能与正向引物的互补序列完全互补。
图1B示意性地描述了使用图1A的引物组进行扩增时，引物二聚体的非特异性扩增被抑制的原理，其中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸自身在退火阶段将形成锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。
图1C示意性地描述了使用图1A的引物组和检测探针对含有SNP位点的多个靶核酸同时检测的原理。在该实施方案中，针对每个含有SNP位点的靶核酸分别设计一对正向引物和反向引物以及一条自淬灭荧光检测探针，具体检测流程如下：
首先，由浓度低的靶特异性引物对启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物/第一通用引物和反向引物/第二通用引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)；随后，由浓度高的第一通用引物和第二通用引物对所述初始扩增产物进行后续的PCR扩增。
由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增核酸链A和核酸链B。
第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，其与核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。
因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量目标单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现不对称扩增。此外，为进一步增强扩增的不对称性，还可以调整第一通用引物和第二通用引物的比例，使得第一通用引物的浓度低于第二通用引物，以更好地富集目标单链产物。在同一反应体系内同时使用多对正向引物和反向引物对，就可以同时不对称扩增多个含有SNP位点的靶核酸，产生大量的含有SNP位点的靶核酸单链。
PCR扩增完之后，预先加入的多条自淬灭荧光检测探针与对应的含有SNP位点的靶核酸单链分别结合，形成检测探针与靶核酸单链的双链杂交体，因所形成双链杂交体稳定性的不同，经熔解曲线分析后，即能获得不同的熔解峰，再根据熔点(Tm)的高低及探针所标记的荧光基团类型即可判定各靶核酸单链中SNP的基因型。
图2显示了实施例1中使用本发明系统中反应体系1-3对不同基因组DNA样本扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线(样本1)、灰色实线(样本2)、黑色虚线(样本3)、灰色虚线(样本4)、灰色点线(无模板对照)分别代表使用本发明检测体系扩增样本1-4及无模板对照后进行熔解曲线分析的结果。
图3显示了实施例1中使用本发明体系中反应体系4-6对不同基因组DNA样本扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线(样本1)、灰色实线(样本2)、黑色虚线(样本3)、灰色虚线(样本4)、灰色点线(无模板对照)分别代表使用本发明检测体系扩增样本1-4及无模板对照后进行熔解曲线分析的结果。
图4显示了实施例2中使用本发明体系中反应体系1-3对不同浓度基因组DNA样本扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线、灰色实线、黑色虚线、灰色虚线、灰色点线分别代表人基因组DNA浓度为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL及无模板对照的样本PCR扩增后进行熔解曲线分析的结果。
图5显示了实施例2中使用本发明体系中反应体系4-6对不同浓度基因组DNA样本扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线、灰色实线、黑色虚线、灰色虚线、灰色点线分别代表人基因组DNA浓度为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL及无模板对照的样本PCR扩增后进行熔解曲线分析的结果。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。
实施例1
本实施例中，以4份不同人基因组DNA样本分型为例，考察本发明系统对不同SNP位点的检测及区分能力。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)。
简言之，本实施例中使用6个25μL的PCR反应体系来进行PCR扩增和熔解曲线分析，所述每个PCR反应体系包括：1×PCR buffer(TaKaRa，北京)，7.0mM MgCl2，0.3mM dNTPs，3.0U Taq DNA聚合酶(TaKaRa，北京)，通用引物Tag1和Tag2，以及待检测SNP相应的靶特异性引物对和探针(各体系引物和探针的序列及用量如表1所示)，5μL人类基因组DNA或阴性对照(水)。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；10个循环的(95℃变性15s，65℃-56℃退火15s(每个循环下降1℃)，76℃延伸20s)；50个循环的(95℃变性15s，55℃退火15s，76℃延伸20s)。在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，程序为：95℃变性1min；37℃保温3min；随后，按0.04℃/s的升温速率从40℃递增至85℃，采集FAM、HEX、ROX、CY5和Quasar 705通道的荧光信号。实验结果如图2-3所示。
图2-3显示了实施例1中使用本发明检测系统对4份样本的72个SNP位点分型结果。其中，各样本分别以黑色实线(样本1)、灰色实线(样本2)、黑色虚线(样本3)、灰色虚线(样本4)、灰色点线(无模板对照)表示。将图2-3的熔解曲线分析结果进一步概述于表2中。
本实施例对各样本的各SNP位点的分型结果与桑格测序结果完全一致，以上结果表明，本发明的检测系统对72个SNP位点的各基因型均具有良好区分能力。
表1.实施例1中所使用的引物和探针的序列与用量
表2. 72个SNP位点的分型结果
实施例2
在本实施例中，将1份已知浓度和72个SNP基因型(rs6424243:A/G；rs12990278:T/T；rs2122080:G/G；rs98506667:G/G；rs774763:C/G；rs10779650:A/A；rs4971514:G/G；rs711725:T/T；rs2053911:A/G；rs9613776:G/A；rs7160304:T/T；rs1024676:T/C；rs1560193:C/C；rs10004744:G/G；rs6792367:T/A；rs11856699:A/A；rs1561393:G/C；rs10820181:T/C；rs6504977:A/G；rs8027171:G/G；rs1110116:A/G；rs9621748:C/C；rs32853:T/C；rs4847034:A/G；rs2826949:T/T；rs8103778:C/C；rs1396009:G/A；rs1523537:T/C；rs1528460:T/T；rs7937238:T/C；rs2111980:A/G；rs7278737:T/G；rs591173:T/C；rs1358856:A/A；rs2730648:G/A；rs859400:G/G；rs876724:T/C；rs2270529:T/T；rs1463729:A/A；rs6857303:G/G；rs214955:A/G；rs7041158:C/T；rs6474513:A/A；rs964681:T/T；rs2237427:G/G；rs590162:G/G；rs560681:A/G；rs2342747:G/G；rs4796362:A/G；rs9307465:C/C；rs4288409:C/C；rs1027895:G/A；rs10098647:C/T；rs116187:G/G；rs7704770:A/G；rs2272998:G/C；rs901398:T/C；rs727811:A/A；rs3802268:A/G；rs1001389:C/C；rs4237677:A/A；rs1355366:T/T；rs3900:G；rs1019029:T/C；rs938283:T/T；rs464663:T/C；rs10776839:T/G；rs12997453:G/G；rs4606077:C/T；rs914165:A/G；rs722098:G/A；rs7104420:G/A)的人类基因组DNA(男性)样本进行梯度稀释(稀释后浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL)，考察本发明系统的分析灵敏度。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)。本实施例中使用6个PCR反应体系，PCR扩增程序和熔解曲线分析程序均同实施例1。
图4-5显示了实施例2中使用本发明系统扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线、灰色实线、黑色虚线、灰色虚线、灰色点线分别代表基因组DNA浓度为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL及无模板对照的进行扩增后进行熔解曲线分析的结果。图4-5的结果表明，人类基因组DNA的浓度即使低至0.05ng/μL(灰色虚线)，本发明系统仍然可以稳定、准确地检测出所有72个SNP位点的基因型。
实施例3
本实施例中，利用本发明检测系统检测205份唾液，提取DNA样品(采用Lab-Aid820核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)以及配套试剂自动提取)，并计算实际各位点在所收集区域(福建厦门)范围内的各SNP基因座的基因型频率、等位基因频率、观察杂合度Ho、个体识别率DP、多态信息含量PIC、三联体非父排除率PEtrio，以及72个SNPs基因座累积个体识别率CDP和累积三联体非父排除率CPEtrio。本实施例中使用6个PCR反应体系、PCR扩增程序和熔解曲线分析程序均同实施例1。
用于评价本体系的标准公式如下：
(1)多态信息含量(Polymorphism Information Content，PIC)
其中，n为某一SNP位点等位基因的个数，Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因的频率。
(2)观察杂合度(Observed Heterozygosity，Ho)：
其中，n为某一SNP位点等位基因的个数，Pi为第i个等位基因的频率。
(3)个体识别率(Power of Discrimination，DP)
其中，n为某一SNP位点基因型的个数，Pi为第i个基因型的频率。
累积个体识别率(Cumulative Discrimination Power，CDP)
其中，m为体系SNP位点的总个数，DPj为第j个SNP位点的个体识别率。
(4)非父排除率(Probability of Exclusion，PE)
其中，n为某一SNP位点等位基因的个数，Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因的频率。
累积非父排除率(Cumulative Excludingprobability of Paternity，CPE)
其中，m为体系SNP位点的总个数，PEj为第j个SNP位点的非父排除率。
具体统计结果如表3所示，大多数SNP位点的杂合度介于0.3～0.7，具有较高的杂合度，所选择的72个SNP位点实际的累积个体识别率为1-3.9×10-29，实际的累积非父排除率为0.999999204，满足中华人民共和国司法部司法鉴定管理局发布的司法鉴定技术规范中的亲权鉴定技术规范中应用于司法鉴定的分型体系的累积非父排除率需大于0.9999的要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法和试剂盒
<130> IDC200305
<160> 218
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 1
tcgcaagcac tcacgtagag ccacatctcc tccagca 37
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtcgcaagca ctcacgtaga gacaaaggga tgggttcctc 40
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 3
cgcagctaca aatgtacact gcg 23
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 4
tcgcaagcac tcacgtagag taggtgtgaa cgagcctg 38
<210> 5
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 5
gtcgcaagca ctcacgtaga gacctgttag agctcccac 39
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 6
cggtccccag ccctgtagcc acgaccg 27
<210> 7
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 7
tcgcaagcac tcacgtagag tagtctcagt ggactttggt 40
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 8
gtcgcaagca ctcacgtaga gacaaacatc aaacaattca gca 43
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<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 9
acctgagaat gtggttactt gcaggt 26
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 10
tcgcaagcac tcacgtagag tccccaccca gaagaaac 38
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 11
gtcgcaagca ctcacgtaga gagggaggag aaggactgat g 41
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 12
cctcagctgt cctccccact tccgtcactg agg 33
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 13
tcgcaagcac tcacgtagag ccccagtaat ggcagatca 39
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 14
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgccttcc agatatgcat tc 42
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 15
acagcaagtc aattcactgt 20
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 16
tcgcaagcac tcacgtagag ctccagaatc aagctgtgt 39
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 17
gtcgcaagca ctcacgtaga gatcatgtag gagtgcattg t 41
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 18
ccagtaagac agctgtacac tggt 24
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 19
tcgcaagcac tcacgtagag cgtatcattc ggttatcaag 40
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 20
gtcgcaagca ctcacgtaga gacccatctg agcaaagaac t 41
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 21
aatcggccgg atttccctcc aggtaccgat 30
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 22
tcgcaagcac tcacgtagag taatttctct atgctcatag gttct 45
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 23
gtcgcaagca ctcacgtaga gattcaaacc tcctattcca cag 43
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 24
acagcacatg taacatatgg agtgct 26
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<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 25
gtcgcaagca ctcacgtaga gagcacaggc aattgagaag a 41
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 26
tcgcaagcac tcacgtagag ctcctttaaa agggtcggt 39
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 27
acagcccatt tgtttctcct gtcttgaggc tg 32
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 28
gtcgcaagca ctcacgtaga gaccaaactc ctggatcata aaaca 45
<210> 29
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 29
tcgcaagcac tcacgtagag ggaatcaggg ataatctcta tca 43
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 30
tccagggtgc ttacactg 18
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 31
tcgcaagcac tcacgtagag tctaccgtct aacctgcaag 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 32
gtcgcaagca ctcacgtaga gaatctacgc ctgagggaca 40
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 33
tgctgcctga gtgatgataa gtgtcagca 29
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 34
gtcgcaagca ctcacgtaga gaggataacc aggcactaag ga 42
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 35
tcgcaagcac tcacgtagag ctagcaggtt catacacac 39
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 36
cagagaacat agcggctctg 20
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 37
gtcgcaagca ctcacgtaga gaccaaacac acctgaacaa gt 42
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 38
tcgcaagcac tcacgtagag tgcatcaaga aagaaaccta tgac 44
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 39
tcaacaaact tggcagtgag catg 24
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<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 40
gtcgcaagca ctcacgtaga gaagaactgc ttgacaaaag ctg 43
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 41
tcgcaagcac tcacgtagag gcaagaaggg agaagagtaa g 41
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 42
cgggctgcct gcttccctcg acgaacaccc g 31
<210> 43
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 43
tcgcaagcac tcacgtagag caactttaga gaacatctat atgacag 47
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 44
gtcgcaagca ctcacgtaga gattgagtgc tataatcagg agac 44
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 45
ctgctgccaa gattatgtgc ag 22
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 46
gtcgcaagca ctcacgtaga gactgctaac atgtaacttc ctca 44
<210> 47
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 47
tcgcaagcac tcacgtagag cctgctctca cagacct 37
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 48
acaaggaaag gatgtgcagg aggcgagatg gc 32
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 49
tcgcaagcac tcacgtagag gagttgatgt tatggatagt gtatg 45
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 50
gtcgcaagca ctcacgtaga gacaggtgaa attttccagt tagt 44
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 51
cgagaattta gacgcttact cg 22
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 52
gtcgcaagca ctcacgtaga gagtcttaca tttgacaagg agga 44
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 53
tcgcaagcac tcacgtagag cactgactgc tacagattaa ct 42
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 54
aggcatgaag aggtccaaat gccc 24
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 55
gtcgcaagca ctcacgtaga gagctgagag cttcctggt 39
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 56
tcgcaagcac tcacgtagag cgactagaag cagcatgt 38
<210> 57
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 57
tgccttgctc gaccttccct ccacccccat cccaacgg 38
<210> 58
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 58
tcgcaagcac tcacgtagag caagtgcagg tggagaca 38
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 59
gtcgcaagca ctcacgtaga gagtcgtggc taaaggatag aac 43
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 60
atcggataga aaacatggag accgat 26
<210> 61
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 61
gtcgcaagca ctcacgtaga gacacctcct tccagttaca c 41
<210> 62
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 62
tcgcaagcac tcacgtagag tcccacacag ggaacac 37
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 63
aagacgcaga cggagcaaag caagaagagg cgtc 34
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 64
gtcgcaagca ctcacgtaga gaggccagat caggcatact 40
<210> 65
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 65
tcgcaagcac tcacgtagag cagggagaaa tcagaggca 39
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 66
tctaggacag gatccataat c 21
<210> 67
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 67
tcgcaagcac tcacgtagag tgttatgttg atcaagtgtt agcca 45
<210> 68
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 68
gtcgcaagca ctcacgtaga gattccattt agggtcccca g 41
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 69
tcagcttccc ttctgagaaa tcaccaaact gg 32
<210> 70
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 70
tcgcaagcac tcacgtagag tggtaatttg aattcctttg ggt 43
<210> 71
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 71
gtcgcaagca ctcacgtaga gaggtgcagc tatggcaga 39
<210> 72
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 72
tccgttttat ttttagtttg tttagaaacg g 31
<210> 73
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 73
tcgcaagcac tcacgtagag cacctaaact ttgactggag ac 42
<210> 74
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 74
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaaatacgt gggtagtcac ttga 44
<210> 75
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 75
cagatggagt ggtcaaattt agtcctaagt aaccatct 38
<210> 76
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 76
tcgcaagcac tcacgtagag ttggtccctg gctctgt 37
<210> 77
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 77
gtcgcaagca ctcacgtaga gacagagctg agcttggga 39
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 78
tcgggacccc ggcaccacca ccaagccatc ccg 33
<210> 79
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 79
tcgcaagcac tcacgtagag tcctctgtag agtgatactg ttc 43
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 80
gtcgcaagca ctcacgtaga gataggatac tgcttgattt tggt 44
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 81
tcgcagaaga aaaacatact tgcg 24
<210> 82
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 82
tcgcaagcac tcacgtagag taagcccttt catattttat gcct 44
<210> 83
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 83
gtcgcaagca ctcacgtaga gattcataat acaacctgtc tttgga 46
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 84
ccaagatctt gtagggacgc tatcgctggc 30
<210> 85
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 85
gtcgcaagca ctcacgtaga gacttcctcc tggagatcaa tattt 45
<210> 86
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 86
tcgcaagcac tcacgtagag tgattatgtt gggatggggt 40
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 87
tgccagtctt aaatatgtta aggca 25
<210> 88
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 88
gtcgcaagca ctcacgtaga gatcagtctg atttaggtgt gtc 43
<210> 89
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 89
tcgcaagcac tcacgtagag ttaggagatg ttgtcatggc a 41
<210> 90
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 90
tcccagcagt tcggttgact ttggga 26
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 91
gtcgcaagca ctcacgtaga gacggtcaaa gcatcttggc 40
<210> 92
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 92
tcgcaagcac tcacgtagag tacaaactga tcctatgcag c 41
<210> 93
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 93
cgcggaggca ccaggctgga gctcgaagga tccgc 35
<210> 94
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 94
tcgcaagcac tcacgtagag ctttggtgta catgtgtttg ga 42
<210> 95
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 95
gtcgcaagca ctcacgtaga gagagagaag gaaatcaact ctg 43
<210> 96
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 96
ccgaaacact tcctctctgt cttcgg 26
<210> 97
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 97
tcgcaagcac tcacgtagag caaacacatc tcagtgctga c 41
<210> 98
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 98
gtcgcaagca ctcacgtaga gacatagtgt ttccatgtga atgta 45
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 99
acgctgtcct aagcacggga acagatacag cg 32
<210> 100
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 100
gtcgcaagca ctcacgtaga gagcaaatag agttatttca tcatggta 48
<210> 101
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 101
tcgcaagcac tcacgtagag gtatttaatt ttgctggcag tgt 43
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 102
tctgtgtaca tagctgtttg tacat 25
<210> 103
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 103
tcgcaagcac tcacgtagag tcttacctcc agagcctgt 39
<210> 104
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 104
gtcgcaagca ctcacgtaga gataccagaa ctattgaagg catc 44
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 105
tcccttgcta aggaacatga ggataaggga 30
<210> 106
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 106
gtcgcaagca ctcacgtaga gagccaactg ctgccaag 38
<210> 107
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 107
tcgcaagcac tcacgtagag ttgttcactc tccctctctg 40
<210> 108
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 108
tgagtcctga gaccacgctg cgagctcccg gactc 35
<210> 109
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 109
gtcgcaagca ctcacgtaga gacaggggaa tcatcatgca g 41
<210> 110
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 110
tcgcaagcac tcacgtagag gagcaggcag ttagcag 37
<210> 111
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 111
ccagtgtgaa aaaaatgtac ttatactgg 29
<210> 112
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 112
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaagttgct cacacattca c 41
<210> 113
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 113
tcgcaagcac tcacgtagag caaggttggg gggatagtt 39
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 114
cgcttcccaa caaatgaaga cccaaagcg 29
<210> 115
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 115
gtcgcaagca ctcacgtaga gacgcctgta cctgcaact 39
<210> 116
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 116
tcgcaagcac tcacgtagag caaccatttg agaatatggg cac 43
<210> 117
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 117
ctggctgcac gtggctatga gtgtatgctg ccag 34
<210> 118
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 118
tcgcaagcac tcacgtagag ctcactatgc tgcagacatt t 41
<210> 119
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 119
gtcgcaagca ctcacgtaga gatacagacg tgcctttaag ttc 43
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 120
agaaagaagt aactcactgg t 21
<210> 121
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 121
gtcgcaagca ctcacgtaga gaatcgcttt ttcctgccat ta 42
<210> 122
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 122
tcgcaagcac tcacgtagag cctgaaggcc tttcgaaatc 40
<210> 123
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 123
tcttgcaaac aaagactgaa aaggtgacgc aa 32
<210> 124
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 124
tcgcaagcac tcacgtagag tggtgagagg ttgatggtaa 40
<210> 125
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 125
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgagaata acattgcctc tcct 44
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 126
tcgttcaatt tcctttccaa cg 22
<210> 127
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 127
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgggtcag tccaagccat 40
<210> 128
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 128
tcgcaagcac tcacgtagag tccatccttc ctacccttc 39
<210> 129
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 129
tggacagtcc atgaacgagc tctgtcc 27
<210> 130
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 130
tcgcaagcac tcacgtagag taaacgggga gctctgtc 38
<210> 131
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 131
gtcgcaagca ctcacgtaga gagtaaacta agctttcttc caaaaaac 48
<210> 132
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 132
ctgtggaacg tcgacacggg catttggggc cacag 35
<210> 133
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 133
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaggcagca tgggagaaac 40
<210> 134
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 134
tcgcaagcac tcacgtagag caagcaggaa aactggttca tt 42
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 135
actgcacttg agttttaagc agt 23
<210> 136
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 136
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgcacccg atagtatttt atacca 46
<210> 137
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 137
tcgcaagcac tcacgtagag tacgcattgt taagtgggga 40
<210> 138
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 138
tggagagctc tgtttttgtt atccgtcagt tctcc 35
<210> 139
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 139
tcgcaagcac tcacgtagag tcagtgaaaa tcaccccaac 40
<210> 140
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 140
gtcgcaagca ctcacgtaga gacaggatgc aaactcttgg a 41
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 141
tgaccatctc tgtttactca ggtca 25
<210> 142
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 142
gtcgcaagca ctcacgtaga gaccccttgt tttcaaaaag ttgtca 46
<210> 143
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 143
tcgcaagcac tcacgtagag tatagaacat aatggacaca ggga 44
<210> 144
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 144
gcgctcattc tttgttgtcc cctccacggt caagagcgc 39
<210> 145
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 145
tcgcaagcac tcacgtagag ctatgacccc aggcaac 37
<210> 146
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 146
gtcgcaagca ctcacgtaga gagtcacaac aaagataaat ctcaaaataa t 51
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 147
cttcctcaaa ttttatataa gttgag 26
<210> 148
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 148
tcgcaagcac tcacgtagag ctttcaataa cctgtcacac ac 42
<210> 149
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 149
gtcgcaagca ctcacgtaga gactagctcc tttagcccaa tg 42
<210> 150
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 150
tcaccactgt tctgtcatac ttaccttatg gtga 34
<210> 151
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 151
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgggtttt tgccttggag taa 43
<210> 152
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 152
tcgcaagcac tcacgtagag caggagctga acctcaca 38
<210> 153
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 153
tacggccctg caagtgtgtg gagctgagcc gt 32
<210> 154
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 154
gtcgcaagca ctcacgtaga gatctggagg tgaagagagg caag 44
<210> 155
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 155
tcgcaagcac tcacgtagag cacacagaac aggaccca 38
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 156
aacagattgc tttgatattt ctgt 24
<210> 157
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 157
gtcgcaagca ctcacgtaga gacccaacac ctgaccca 38
<210> 158
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 158
tcgcaagcac tcacgtagag gctactgtca ttttgttgca c 41
<210> 159
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 159
ttgcatgcac acacacattt tctgagtgca tg 32
<210> 160
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 160
gtcgcaagca ctcacgtaga gagcttggat gctgaagtat gt 42
<210> 161
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 161
tcgcaagcac tcacgtagag tctgcattct agggccac 38
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 162
ggcaccaatt caaagtgt 18
<210> 163
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 163
tcgcaagcac tcacgtagag cccatctacc caagca 36
<210> 164
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 164
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaagaatga accagaaggg ga 42
<210> 165
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 165
ctgacaatgt gggactaact ttctgtcag 29
<210> 166
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 166
tcgcaagcac tcacgtagag ttcacttcag ctgcggt 37
<210> 167
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 167
gtcgcaagca ctcacgtaga gattgacacg gcgctaca 38
<210> 168
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 168
cgtcagatga agcctgctcc tctgaccaca ctgacg 36
<210> 169
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 169
gtcgcaagca ctcacgtaga gagagcagct atttaccatc cag 43
<210> 170
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 170
tcgcaagcac tcacgtagag tggaatgtac taggcaagaa ac 42
<210> 171
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 171
tcagctatca acggggctg 19
<210> 172
<211> 49
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 172
tcgcaagcac tcacgtagag tattcttaat ctatcctaca tgtgtttct 49
<210> 173
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 173
gtcgcaagca ctcacgtaga gagccttgag gatcacatga c 41
<210> 174
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 174
ccgggaactt caacgactta caatcatctg catctcccgg 40
<210> 175
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 175
tcgcaagcac tcacgtagag cttgttaagc ctgcagaaat aaaga 45
<210> 176
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 176
gtcgcaagca ctcacgtaga gactattttc taggtgcatg aacca 45
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 177
tcagagcaag atacggaaga gg 22
<210> 178
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 178
tcgcaagcac tcacgtagag tcttttgtct tatctctggc tg 42
<210> 179
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 179
gtcgcaagca ctcacgtaga gagagaagag agcaagggtc 40
<210> 180
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 180
tgggcctcta agtgttttgg tgacccaagg ccct 34
<210> 181
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 181
tcgcaagcac tcacgtagag ttgttctttc tgcatgtggt 40
<210> 182
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 182
gtcgcaagca ctcacgtaga gacagttatt gctagggttt ttgttc 46
<210> 183
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 183
tagtgaatgc ataaaataaa atcact 26
<210> 184
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 184
tcgcaagcac tcacgtagag tatttctcta aatgctcctg cac 43
<210> 185
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 185
gtcgcaagca ctcacgtaga gaccaaagtt aagtatcacc atcca 45
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 186
tggaggcctc gaggatgggg actc 24
<210> 187
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 187
tcgcaagcac tcacgtagag ctgcgcaagg aattcgctg 39
<210> 188
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 188
gtcgcaagca ctcacgtaga gaagcgctac cttacttaca taact 45
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 189
aagagatggt tgaatgctct t 21
<210> 190
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 190
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgctcagc ctactcaagc a 41
<210> 191
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 191
tcgcaagcac tcacgtagag ttggcttcat tttcaacagg a 41
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 192
tagactaggc atttagcgtt tccac 25
<210> 193
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 193
gtcgcaagca ctcacgtaga gactcaaaat tcatacattg aagtcctaac 50
<210> 194
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 194
tcgcaagcac tcacgtagag tgtgcatgtc tgtgtcct 38
<210> 195
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 195
tgacctatct ccaaatacgg tc 22
<210> 196
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 196
gtcgcaagca ctcacgtaga gaagaatctc aagaaggctt ggt 43
<210> 197
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 197
tcgcaagcac tcacgtagag gtgcaacttt taaatgctgt gt 42
<210> 198
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 198
tatgggtttc ctacttattg acggacccat 30
<210> 199
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 199
gtcgcaagca ctcacgtaga gagcgaaatc ccaaaatgcc a 41
<210> 200
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 200
tcgcaagcac tcacgtagag tgttgacccc gtcgtatc 38
<210> 201
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 201
acggggctct gatctgacgg caacctgggc tccccgt 37
<210> 202
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 202
tcgcaagcac tcacgtagag gtctgatcaa ttgtttgtca gaatg 45
<210> 203
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 203
gtcgcaagca ctcacgtaga gaccagctct gatgatgtgc aag 43
<210> 204
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 204
taggtattac atgagttttt acctac 26
<210> 205
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 205
gtcgcaagca ctcacgtaga gactgcctgt ggctttgtag 40
<210> 206
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 206
tcgcaagcac tcacgtagag tctcgaggta gcaggaaga 39
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 207
cgctttgggt aggctgtggg gagcg 25
<210> 208
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 208
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgggaccc tgtggaaaga 40
<210> 209
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 209
tcgcaagcac tcacgtagag tgtgcagacc agtcacct 38
<210> 210
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 210
tcagagctgc ctgagggtgt cgccctcttt ggtg 34
<210> 211
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 211
tcgcaagcac tcacgtagag ccgttcactt agatgccag 39
<210> 212
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 212
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaaattaaa agtgtttttg ttgggtaaag 50
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 213
ccttgataag gatttaaatt ttgg 24
<210> 214
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 214
tcgcaagcac tcacgtagag ttaatcctta ggtcgatggc a 41
<210> 215
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 215
gtcgcaagca ctcacgtaga gagcaaagct ccttcttggg t 41
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 216
tgggaaagga cagcaatacc tgagc 25
<210> 217
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Tag2
<400> 217
gtcgcaagca ctcacgtaga ga 22
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Tag1
<400> 218
tcgcaagcac tcacgtagag 20
Claims (11)
1.一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法:
(a)针对每一个待分析的个体，提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点，并且，
提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和
(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应分别扩增各个样品中的靶核酸，从而获得分别与各个个体对应的扩增产物；
(c)对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
(d)根据步骤(b)的熔解曲线分析结果，对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系。
2.权利要求1的方法，所述生物个体选自动物个体，例如哺乳动物个体，例如人类个体；
优选地，所述SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098，rs7104420，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)；
优选地，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420。
3.权利要求1或2的方法，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；
(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；
(3)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；
(4)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；
(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；
(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL FluorGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；
(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；
(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；
(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；
(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；
(11)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个SNP位点的型别；
(12)所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204，207，210，213和216。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，进而对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系；
优选地，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将其与参照数据库进行比较，从而对生物个体进行识别；或者，
在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将两个或更多个生物个体的SNP位点型别进行比较，从而确定所述两个或更多个生物个体亲缘关系。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸；
(2)所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个SNP位点；
(3)所述样品包含来源于所述个体的基因组核酸或其片段，例如基因组DNA或其片段；
(4)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶特异性引物对；
(5)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍；
(6)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物；
(7)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；
(8)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和
(9)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermusscotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(2)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；
(3)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；
(4)所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(5)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(6)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；
(7)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(8)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和
(9)所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；
(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；
(5)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；
(6)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(7)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(8)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(9)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(10)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；
(11)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；
(12)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；
(13)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(14)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和
(15)所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补；
优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:218所示；
优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:217所示；
优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；70和71；73和74；76和77；79和80；82和83；85和86；88和89；91和92；94和95；97和98；100和101；103和104；106和107；109和110；112和113；115和116；118和119；121和122；124和125；127和128；130和131；133和134；136和137；139和140；142和143；145和146；148和149；151和152；154和155；157和158；160和161；163和164；166和167；169和170；172和173；175和176；178和179；181和182；184和185；187和188；190和191；193和194；196和197；199和200；202和203；205和206；208和209；211和212；214和215。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)，或者其任何组合；
(2)待扩增的靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合；
(3)待扩增的靶核酸是单链的或双链的；
(4)所述靶核酸获自原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如Herpes病毒，HIV，流感病毒，EB病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)或类病毒；
优选地，所述靶核酸获自人类；
(5)待扩增的靶核酸(例如，人基因组DNA)的浓度为至少0.05ng/μL，例如至少0.06ng/μL，至少0.07ng/μL，或至少0.08ng/μL。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：
(I)提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如权利要求1所定义；
(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次；
优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；
(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；
(3)在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；
(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；
(5)在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(4)的产物，从而允许核酸延伸；
(6)在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min；
(7)在相同或不同的温度下进行步骤(4)和(V)；和
(8)重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包括能够不对称扩增含有SNP位点的靶核酸的引物组；
优选地，所述引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；
优选地，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述SNP位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行测序的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合；
优选地，所述SNP位点选自人染色体的rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420的任意组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)；
优选地，所述SNP位点包括人染色体的rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420；
优选地，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204，207，210，213，和216；
优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:218所示；
优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:217所示；
优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；70和71；73和74；76和77；79和80；82和83；85和86；88和89；91和92；94和95；97和98；100和101；103和104；106和107；109和110；112和113；115和116；118和119；121和122；124和125；127和128；130和131；133和134；136和137；139和140；142和143；145和146；148和149；151和152；154和155；157和158；160和161；163和164；166和167；169和170；172和173；175和176；178和179；181和182；184和185；187和188；190和191；193和194；196和197；199和200；202和203；205和206；208和209；211和212；214和215；
优选地，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如权利要求2所定义；
优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；
优选地，所述试剂盒用于生物的个体识别或亲缘鉴定。
11.权利要求10所定义的引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于识别生物个体，或用于对生物个体进行亲缘鉴定；
优选地，所述试剂盒还包含权利要求3所定义的检测探针；
优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-9任一项所描述的方法。
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