CN111100908A - 一种检测核苷酸片段缺失的方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测核苷酸片段缺失的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了一种检测核苷酸片段缺失的方法,所述方法能够同时检测多种核苷酸片段缺失在样品中的存在或水平。此外,本申请还提供了一种探针组和包含一种或多种所述探针组的试剂盒,所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。此外,本申请还提供了一种试剂盒,其能够在一轮反应中同时检测多种核苷酸片段缺失在样品中的存在或水平。
Description
技术领域
本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地,本申请提供了一种检测核苷酸片段缺失(特别是大片段缺失)的方法,所述方法能够同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在核酸分子中的存在。此外,本申请还提供了一种探针组,和包含一种或多种所述探针组的试剂盒,所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。此外,本申请还提供了一种试剂盒,其能够在一轮反应中同时检测一种或多种(例如1、2、5、10、15、19、20、25、30、35、40或更多种)核苷酸片段缺失在核酸分子中的存在。
背景技术
基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异(Copy number variation,CNV)。随着CNV微阵列芯片技术以及二代测序技术的发展及应用,已发现拷贝数变异(CNV)广泛地存在于人类染色体基因组中。CNV主要由基因组重组导致,一般指长度为几kb-几Mb的基因组大片段的拷贝数增加或者减少,主要表现为亚显微水平的重复,缺失和插入。目前CNV的检测方法主要有:多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术、微阵列比较基因杂交(array-CGH)、单核苷酸多态性(SNP)分型芯片、高通量测序技术、实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)和荧光原位杂交(FISH)技术等。其中array-CGH、SNP分型芯片、高通量测序技术等主要用于全基因组范围内未知CNV的检测。这些在全基因组范围内检测CNV的技术先进、准确而高效,但相对比较昂贵,因此,在检测某些特定基因或者特定区域的CNV时,它们并不是最佳选择。RT-qPCR方法虽然经典,但是效率太低,不能在一个反应体系中同时对多个片段进行检测。荧光原位杂交技术目前被广泛应用于染色体畸变的检测,但因操作流程较复杂且成本高,很小用于单个特定基因拷贝数变异的检测。MLPA于2002年由Schouten等首次报道,是目前应用最为广泛的基因拷贝数检测技术。该方法能够针对特定基因或特定区域进行拷贝数检测,且可在同一反应管中对50个不同基因片段的拷贝数进行检测,然而该方法需要多个操作步骤,且需要进行毛细管电泳分析,操作麻烦,耗时长,且对基因组DNA的质量和浓度的要求均比较高。专利CN107058541A公开了一种基于CNVplex高通量连接探针扩增法(HLPA)的用于检测苯丙酮尿症相关基因拷贝数变异的试剂盒,其检测原理及检测流程与MLPA技术相似,能够同时检测多个基因片段的拷贝数变异。然而,该方法与MLPA技术存在一样的缺陷。
综上所述,虽然已报道了多种检测基因拷贝数变异的方法,但是它们各自都具有一定的局限性。因此,仍然需要开发一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠、经济高效的检测基因拷贝数变异(特别是检测基因片段缺失)的方法。
在本申请中,发明人开发了一种新的实时PCR测定方法,其能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来对样品中的每一个靶序列进行区分和鉴定。在此基础上,本申请的发明人开发了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的高通量核酸检测方法和试剂盒,其可用于检测一种或多种核苷酸片段缺失。
发明内容
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“核苷酸片段缺失”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指,目标核酸分子(例如基因组核酸分子)中多个连续碱基(通常至少100bp,例如至少200bp,至少300bp,至少400bp,至少500bp,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp,至少2000bp,至少3000bp,至少4000bp,至少5000bp,至少6000bp,至少7000bp,至少8000bp,至少9000bp,至少104bp,至少105bp,至少106bp,乃至更多碱基)的缺失。在本申请的某些优选实施方案中,核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失。在某些优选实施方案中,核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失。在某些优选实施方案中,核苷酸片段缺失是指至少1000个连续碱基的缺失。本领域已知,核苷酸片段缺失导致核酸分子的断裂和重新连接,这将在该重新连接的位点(即断点(breakpoint))处产生新的碱基序列。因此,在本文中,当用于描述核苷酸片段缺失时,术语“断点(breakpoint)”是指,与野生型核酸分子相比,缺失型核酸分子中出现核苷酸片段缺失的位置。这意味着在断点的一侧,缺失型核酸分子与野生型核酸分子的序列相同,在断点的另一侧,与野生型核酸分子的序列相比,缺失型核酸分子缺失了一段核苷酸片段。
如本文中所使用的,术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”是指待检测的目标核酸序列。特别地,在本申请中,表述“缺失型靶核酸序列”是指,含有待检测的核苷酸片段缺失的目标核酸序列;与之对应的,表述“野生型靶核酸序列”是指,不含有该待检测的核苷酸片段缺失的目标核酸序列。在本申请中,术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”具有相同的含义,并且可互换使用。
如本文中所使用的,术语“媒介子探针”是指,从5'至3'方向含有媒介子序列(mediator sequence)和靶向序列(targeting sequence;即,靶特异性序列)的单链核酸分子。在本申请中,媒介子序列不含与靶核酸序列互补的序列,靶特异性序列包含与靶核酸序列互补的序列。因此,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,媒介子探针通过靶特异性序列与靶核酸序列杂交或退火(即,形成双链结构),并且媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交,而处于游离状态(即,保持单链结构)。
如本文中所使用的,术语“靶向序列”和“靶特异性序列”是指,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,能够与靶核酸序列选择性/特异性杂交或退火的序列,其包含与靶核酸序列互补的序列。在本申请中,术语“靶向序列”和“靶特异性序列”具有相同的含义,并且可互换使用。易于理解的是,靶向序列或靶特异性序列对于靶核酸序列是特异性的。换言之,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,靶向序列或靶特异性序列仅与特定的靶核酸序列杂交或退火,而不与其他的核酸序列杂交或退火。
如本文中所使用的,术语“媒介子序列”是指,媒介子探针中不与靶核酸序列互补的一段寡核苷酸序列,其位于靶特异性序列的上游(5'端)。在本申请中,针对每一种靶核酸序列,设计或提供一条独特的媒介子探针,其具有独特的媒介子序列(换言之,所使用的所有媒介子探针中的媒介子序列彼此不同);由此,每一种靶核酸序列与一条独特的媒介子探针(独特的媒介子序列)相对应。因此,通过检测所述独特的媒介子序列,可以检测与之相对应的靶核酸序列。
如本文中所使用的,术语“上游寡核苷酸序列”是指,包含与靶核酸序列互补的序列的一段寡核苷酸序列,其在允许核酸杂交(或退火)或扩增的条件下,能够与靶核酸序列杂交(或退火),并且,当与靶核酸序列杂交时,其位于媒介子探针的上游。相应地,术语“下游寡核苷酸序列”是指,包含与靶核酸序列互补的序列的一段寡核苷酸序列,其在允许核酸杂交(或退火)或扩增的条件下,能够与靶核酸序列杂交(或退火),并且,当与靶核酸序列杂交时,其位于媒介子探针的下游。
如本文中所使用的,术语“互补”意指,两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键,并由此形成双链体。在本申请中,术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的,术语“完全互补”意指,一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对,而不存在错配或缺口。如本文中所使用的,术语“实质上互补”意指,一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对,其允许存在错配或缺口(例如,一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火,并形成双链体。例如,在本申请中,上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列各自包含与靶核酸序列互补(例如实质上互补或完全互补)的序列。因此,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列将选择性地/特异性地与靶核酸序列杂交或退火。相应地,术语“不互补”意指,两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火,无法形成双链体。例如,在本申请中,媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列。因此,在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下,媒介子序列不与靶核酸序列杂交或退火,无法形成双链体,而是处于游离状态(即,保持单链结构)。
如本文中所使用的,术语“杂交”和“退火”意指,互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中,“杂交”和“退火”具有相同的含义,并且可互换使用。通常,完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件,特别是温度。
如本文中所使用的,“允许核酸杂交的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义,并且可通过常规的方法来确定。例如,具有互补序列的两条核酸分子可在合适的杂交条件下发生杂交。此类杂交条件可涉及下列因素:温度,杂交缓冲液的pH值、成分和离子强度等,并且可根据互补的两条核酸分子的长度和GC含量来确定。例如,当互补的两条核酸分子的长度相对较短和/或GC含量相对较低时,可采用低严紧的杂交条件。当互补的两条核酸分子的长度相对较长和/或GC含量相对较高时,可采用高严紧的杂交条件。此类杂交条件是本领域技术人员熟知的,并且可参见例如Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001);和M.L.M.Anderson,Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag New YorkInc.N.Y.(1999)。在本申请中,“杂交”和“退火”具有相同的含义,并且可互换使用。相应地,表述“允许核酸杂交的条件”和“允许核酸退火的条件”也具有相同的含义,并且可互换使用。
如本文中所使用的,表述“允许核酸扩增的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指,允许核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)以一条核酸链为模板合成另一条核酸链,并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的,并且可涉及下列因素:温度,杂交缓冲液的pH值、成分、浓度和离子强度等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。在本发明的方法中,“允许核酸扩增的条件”优选地为核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的工作条件。
如本文中所使用的,表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指,允许核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)以一条核酸链为模板延伸另一条核酸链(例如引物或探针),并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的,并且可涉及下列因素:温度,杂交缓冲液的pH值、成分、浓度和离子强度等等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如Joseph Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001))。在本发明的方法中,“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”优选地为核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的工作条件。在本申请中,表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”和“允许核酸延伸的条件”具有相同的含义,并且可互换使用。
如本文中所使用的,表述“允许切割媒介子探针的条件”是指,允许具有5'核酸酶活性的酶切割杂交至靶核酸序列上的媒介子探针,并释放出含有媒介子序列或其部分的核酸片段的条件。在本发明的方法中,允许切割媒介子探针的条件优选地为具有5'核酸酶活性的酶的工作条件。例如,当使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时,允许切割媒介子探针的条件可以为所述核酸聚合酶的工作条件。
各种酶的工作条件可由本领域技术人员通过常规方法确定,并且通常可涉及下列因素:温度,缓冲液的pH值,成分,浓度,离子强度等。备选地,可使用酶的制造商所推荐的条件。
如本文中所使用的,术语“核酸变性”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指,双链核酸分子解离为单链的过程。表述“允许核酸变性的条件”是指,使得双链核酸分子解离为单链的条件。此类条件可由本领域技术人员常规地确定(参见例如JosephSambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。例如,可通过加热,碱处理,尿素处理,酶促方法(例如使用解旋酶的方法)等常规技术来使核酸变性。在本申请中,优选地,在加热的条件下使核酸变性。例如,可通过加热至80-105℃,从而使核酸变性。
如本文中所使用的,术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系,并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如,表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指,当以5'至3'方向排列时,与后者相比,前者位于更靠前的位置(即,更接近5'端的位置)。如本文中所使用的,术语“下游”具有与“上游”相反的含义。
如本文中所使用的,术语“荧光探针”是指携带荧光基团、且能够产生荧光信号的一段寡核苷酸。在本申请中,荧光探针被用作检测探针。
如本文中所使用的,术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指,通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法,其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中,术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义,并且可互换使用。
在本申请的某些优选实施方案中,可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之,在环境温度下,检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下,检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离,淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号),此时,能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高,双链体的两条链开始解离(即,检测探针逐渐从其互补序列上解离),并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下,解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近,由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此,随着温度的升高,所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时,所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下,所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此,基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此,对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测,就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程,形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步,对所获得的曲线进行求导分析,可获得以信号强度变化速率为纵坐标,温度为横坐标的曲线(即,该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰,其所对应的温度即为所述双链体的熔点(Tm值)。通常而言,检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如,错配的碱基越少,配对的碱基越多),那么双链体的Tm值就越高。因此,通过检测双链体的Tm值,可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中,术语“熔解峰”、“熔点”和“Tm值”具有相同的含义,并且可互换使用。
在本申请中,发明人开发了一种新的实时PCR测定方法,其能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来对样品中的多种靶序列进行区分和鉴定。在此基础上,本申请的发明人开发了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的、能够同时检测一种或多种核苷酸片段缺失的方法和试剂盒。例如,本发明的方法和试剂盒能够同时检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种核苷酸片段缺失。
检测方法
因此,在一个方面,本发明提供了一种检测核苷酸片段缺失在样品中的核酸分子中的存在的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
(1)针对该核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;并且,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所述媒介子探针对以及野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列接触,其中,
(i)所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的下游,且野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述野生型靶核酸序列是不包含核苷酸片段缺失的核酸分子;
(ii)所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述缺失型靶核酸序列是包含核苷酸片段缺失的核酸分子;并且,
(iii)所述野生型媒介子序列与所述缺失型媒介子序列不同;并且,
(2)在允许切割媒介子探针及核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触;
(3)在允许核酸杂交的条件下,将步骤(2)的产物与检测探针接触,所述检测探针从3'至5'方向包含捕获序列以及模板序列(templating sequence),其中,所述捕获序列能够与野生型媒介子序列或其部分以及缺失型媒介子序列或其部分互补;并且,
所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触;
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定所述野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列是否存在于所述样品中,并确定所述核苷酸片段缺失是否存在于所述样品的核酸分子中。
在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;在此类实施方案中,所述核苷酸片段缺失亦可称为大片段缺失。在某些优选实施方案中,核苷酸片段缺失是指至少1000个连续碱基的缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型媒介子探针将与野生型靶核酸序列的同一条链杂交。在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述缺失型媒介子探针将与缺失型靶核酸序列的同一条链杂交。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp。在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于断点的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于断点的下游。
在本发明方法的步骤(1)中,由于所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,并且所述野生型靶向序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,因此,当存在野生型靶核酸序列时,所述野生型上游寡核苷酸序列、所述野生型下游寡核苷酸序列和所述野生型媒介子探针都与所述野生型靶核酸序列杂交,并且,所述野生型媒介子探针位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中。类似地,由于所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,并且所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,因此,当存在缺失型靶核酸序列时,所述缺失型上游寡核苷酸序列、所述缺失型下游寡核苷酸序列和所述缺失型媒介子探针都与所述缺失型靶核酸序列杂交;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间。
在本发明方法的步骤(2)中,当存在野生型靶核酸序列时,所述野生型上游寡核苷酸序列、所述野生型下游寡核苷酸序列和所述野生型媒介子探针都与所述野生型靶核酸序列杂交。进一步,由于所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列互补的序列,因此,野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列处于游离状态,而不与野生型靶核酸序列杂交。在这种情况下,野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物,以扩增野生型靶核酸序列。类似地,当存在缺失型靶核酸序列时,所述缺失型上游寡核苷酸序列、所述缺失型下游寡核苷酸序列和所述缺失型媒介子探针都与所述缺失型靶核酸序列杂交。进一步,由于所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列互补的序列,因此,缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列处于游离状态,而不与缺失型靶核酸序列杂交。在这种情况下,缺失型上游寡核苷酸序列和缺失型下游寡核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物,以扩增缺失型靶核酸序列。
因此,在某些优选的实施方案中,所述缺失型上游寡核苷酸序列为特异于该缺失型靶核酸序列的上游引物,所述缺失型下游寡核苷酸序列为特异于该缺失型靶核酸序列的下游引物;所述野生型上游寡核苷酸序列为特异于该野生型靶核酸序列的上游引物,所述野生型下游寡核苷酸序列为特异于该野生型靶核酸序列的下游引物。
在具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶的作用下,野生型媒介子序列或其部分会因野生型上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与野生型靶核酸序列杂交的野生型媒介子探针上切割下来,形成野生型媒介子片段。与此同时,缺失型上游或下游寡核苷酸序列即便与野生型靶核酸序列杂交,由于所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型上游寡核苷酸序列过远或者所述缺失型上游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型下游寡核苷酸序列过远,导致缺失型上下游寡核苷酸序列不能有效扩增野生型序列,此外,由于所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,相应地,缺失型靶向序列也能够与野生型靶核酸序列的相同位置互补,然而由于该理论互补位置不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间,从而确保该缺失型靶向序列不会与野生型上游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列的扩增产物杂交,从而保证野生型靶核酸序列不会形成缺失型媒介子片段。类似地,当存在缺失型靶核酸序列时,缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列和缺失型媒介子探针都与缺失型靶核酸序列杂交,并且缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列处于游离状态,而不与缺失型靶核酸序列杂交。在这种情况下,在具有5'核酸酶活性的酶的作用下,缺失型媒介子序列或其部分会因缺失型上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与缺失型靶核酸序列杂交的缺失型媒介子探针上切割下来,形成缺失型媒介子片段。与此同时,由于缺失型靶核酸序列不包含所述野生型靶向序列所能够杂交的片段,野生型媒介子探针不会与缺失型靶核酸序列杂交,从而保证缺失型靶核酸序列不会形成野生型媒介子片段。
在本发明方法的步骤(3)中,当存在野生型媒介子片段时,由于野生型媒介子片段包含野生型媒介子序列或其部分,且检测探针包含与野生型媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列,因此,所述野生型媒介子片段与所述检测探针杂交。类似地,当存在缺失型媒介子片段时,由于缺失型媒介子片段包含缺失型媒介子序列或其部分,且检测探针包含与缺失型媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列,因此,所述缺失型媒介子片段与所述检测探针杂交。
在本发明方法的步骤(4)中,当存在野生型媒介子片段时,由于所述野生型媒介子片段与所述检测探针杂交,并且所述检测探针包含额外的序列(例如,模板序列),因此,核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸野生型媒介子片段,形成第一双链体。类似地,当存在缺失型媒介子片段时,由于所述缺失型媒介子片段与所述检测探针杂交,并且所述检测探针包含额外的序列(例如,模板序列),因此,核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸缺失型媒介子片段,形成第二双链体。
在本发明方法的步骤(5)中,当存在第一双链体时,可检测到与第一双链体对应的熔解峰。因此,可通过与第一双链体对应的熔解峰的存在或不存在,确定野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如,当检测到或未检测到与第一双链体对应的熔解峰时,确定野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。类似地,可通过与第二双链体对应的熔解峰的存在或不存在,确定缺失型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如,当检测到或未检测到与第二双链体对应的熔解峰时,确定缺失型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。
特别地,在本发明的方法中,由于所使用的野生型媒介子序列与缺失型媒介子序列不同,因此,所形成的野生型媒介子片段与缺失型媒介子片段具有不同的序列,并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此,包含野生型媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体在结构(序列)上也不同于包含缺失型媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体。相应地,第一双链体将具有与第二双链体不同的熔点(Tm值)。因此,在熔解曲线分析中,第一双链体显示出与第二双链体不同的熔解峰。由此,通过检测第一双链体或第二双链体的熔解峰,可判断野生型靶核酸序列或缺失型靶核酸序列在样品中的存在。
另外,由于野生型媒介子序列、缺失型媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的,因此,可以预先计算第一双链体与第二双链体各自的熔点(Tm值)。由此,通过在熔解曲线分析中检测具有第一双链体或第二双链体的熔点(Tm值)的熔解峰,可判断野生型靶核酸序列或缺失型靶核酸序列在样品中的存在。
基于与上述相同的原理,通过设计更多的媒介子探针,本发明的方法可用于同时检测更多的核苷酸片段缺失。因此,在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,除了针对第一核苷酸片段缺失的上述第一野生型上游寡核苷酸序列、第一野生型下游寡核苷酸序列、第一野生型媒介子探针、第一缺失型上游寡核苷酸序列、第一缺失型下游寡核苷酸序列和第一缺失型媒介子探针之外,还在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与针对第二核苷酸片段缺失的第二缺失型上游寡核苷酸序列、第二缺失型下游寡核苷酸序列和第二缺失型媒介子探针接触,其中,
所述第二缺失型上游寡核苷酸序列包含与第二缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述第二缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含第二缺失型媒介子序列和第二缺失型靶向序列,其中,所述第二缺失型媒介子序列包含不与任一靶核酸序列(例如第一野生型/缺失型靶核酸序列以及第二野生型/缺失型靶核酸序列)互补的序列,并且,所述第二缺失型靶向序列包含与第二缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与第二缺失型靶核酸序列杂交时,第二缺失型上游寡核苷酸序列位于第二缺失型靶向序列的上游,所述第二缺失型下游寡核苷酸序列位于第二缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述第二缺失型靶向序列不位于所述第二野生型上游寡核苷酸序列与所述第二野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述第二缺失型靶核酸序列是包含第二核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所述第二缺失型媒介子序列与所述第一野生型和缺失型媒介子序列彼此均不同;
并且,在步骤(3)中,所使用的检测探针还包含与第二缺失型媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列,所述第三捕获序列位于所述模板序列的下游。
在此类实施方案中,在步骤(1)中,当存在第二缺失型靶核酸序列(第三靶核酸序列)时,所述第二缺失型上游寡核苷酸序列、第二缺失型下游寡核苷酸序列和所述第二缺失型媒介子探针与所述第二缺失型靶核酸序列杂交。进一步,在步骤(2)中,第二缺失型媒介子序列或其部分因第二缺失型上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第二缺失型靶核酸序列杂交的第二缺失型媒介子探针上切割下来,形成第二缺失型媒介子片段。进一步,在步骤(3)和(4)中,当存在所述第二缺失型媒介子片段时,所述第二缺失型媒介子片段与所述检测探针杂交,并且,所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸第二缺失型媒介子片段,形成第三双链体。更进一步,在步骤(5)中,当检测到或未检测到与第三双链体对应的熔解峰时,由于在上述体系中即便存在第二野生型靶核酸序列其也无法有效扩增,进而也不会产生第二缺失型媒介子片段,因此,可通过第三双链体对应的熔解峰确定第二缺失型靶核酸序列(第三靶核酸序列)存在于或不存在于所述样品中。
类似地,在本发明的方法中,由于所使用的第一野生型媒介子序列、第一缺失型媒介子序列和第二缺失型媒介子序列不同,因此,所形成的第一媒介子片段(第一野生型媒介子片段)、第二媒介子片段(第一缺失型媒介子片段)和第三媒介子片段(第二缺失型媒介子片段)具有不同的序列,并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此,包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地,所述第一、第二和第三双链体具有彼此不同的熔点(Tm值)。因此,在熔解曲线分析中,所述第一、第二和第三双链体显示出彼此可区分的三个熔解峰。由此,通过检测第一、第二和第三双链体的熔解峰,可判断第一靶核酸序列(第一野生型靶核酸序列)、第二靶核酸序列(第一缺失型靶核酸序列)和第三靶核酸序列(第二缺失型靶核酸序列)在样品中的存在。
另外,由于第一、第二、和第三媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的,因此,可以预先计算第一、第二和第三双链体各自的熔点(Tm值)。由此,通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二或第三双链体的熔点(Tm值)的熔解峰,可判断第一、第二或第三靶核酸序列在样品中的存在。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,除了针对第一核苷酸片段缺失的上述第一野生型上游寡核苷酸序列、第一野生型下游寡核苷酸序列、第一野生型媒介子探针、第一缺失型上游寡核苷酸序列、第一缺失型下游寡核苷酸序列和第一缺失型媒介子探针、以及针对第二核苷酸片段缺失的第二缺失型上游寡核苷酸序列、第二缺失型下游寡核苷酸序列和第二缺失型媒介子探针之外,还在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与针对第二核苷酸片段缺失的第二野生型上游寡核苷酸序列、第二野生型下游寡核苷酸序列和第二野生型媒介子探针接触,其中,
所述第二野生型上游寡核苷酸序列包含与第二野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述第二野生型媒介子探针从5'至3'方向包含第二野生型媒介子序列和第二野生型靶向序列,其中,所述第二野生型媒介子序列包含不与任一靶核酸序列(例如第一野生型/缺失型靶核酸序列以及第二野生型/缺失型靶核酸序列)互补的序列,并且,所述第二野生型靶向序列包含与第二野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与第二野生型靶核酸序列杂交时,第二野生型上游寡核苷酸序列位于第二野生型靶向序列的上游,所述第二野生型下游寡核苷酸序列位于第二野生型靶向序列的下游,且所述野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述第二野生型靶核酸序列是不包含第二核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所述第二野生型媒介子序列与所述第一野生型、第一缺失型以及第二缺失型媒介子序列彼此均不同;
并且,在步骤(3)中,所使用的检测探针还包含与第二野生型媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列,所述第四捕获序列位于所述模板序列的下游。
在此类实施方案中,在步骤(1)中,当存在第二野生型靶核酸序列(第四靶核酸序列)时,所述第二野生型上游寡核苷酸序列、第二野生型下游寡核苷酸序列和所述第二野生型媒介子探针与所述第二野生型靶核酸序列杂交。进一步,在步骤(2)中,第二野生型媒介子序列或其部分因第二野生型上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第二野生型靶核酸序列杂交的第二野生型媒介子探针上切割下来,形成第二野生型媒介子片段(第四媒介子片段)。进一步,在步骤(3)和(4)中,当存在所述第二野生型媒介子片段时,所述第二野生型媒介子片段与所述检测探针杂交,并且,所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸第二野生型媒介子片段,形成第四双链体。更进一步,在步骤(5)中,当检测到或未检测到与第四双链体对应的熔解峰时,由于第二缺失型靶核酸序列缺失不能够与所述第二野生型媒介子序列杂交的片段,进而也不会产生第二野生型媒介子片段,因此,可通过第四双链体对应的熔解峰确定第二野生型靶核酸序列(第四靶核酸序列)存在于或不存在于所述样品中。
类似地,在本发明的方法中,由于所使用的第一野生型媒介子序列、第一缺失型媒介子序列、第二缺失型媒介子序列、第二野生型媒介子序列不同,因此,所形成的第一媒介子片段(第一野生型媒介子片段)、第二媒介子片段(第一缺失型媒介子片段)、第三媒介子片段(第二缺失型媒介子片段)和第四媒介子片段(第二野生型媒介子片段)具有不同的序列,并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此,包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体、包含第四媒介子片段的延伸产物和检测探针的第四双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地,所述第一、第二、第三和第四双链体具有彼此不同的熔点(Tm值)。因此,在熔解曲线分析中,所述第一、第二、第三和第四双链体显示出彼此可区分的四个熔解峰。由此,通过检测第一、第二、第三和第四双链体的熔解峰,可判断第一靶核酸序列(第一野生型靶核酸序列)、第二靶核酸序列(第一缺失型靶核酸序列)、第三靶核酸序列(第二缺失型靶核酸序列)和第四靶核酸序列(第二野生型靶核酸序列)在样品中的存在。
另外,由于第一、第二、第三和第四媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的,因此,可以预先计算第一、第二、第三和第四双链体各自的熔点(Tm值)。由此,通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二、第三或第四双链体的熔点(Tm值)的熔解峰,可判断第一、第二、第三或第四靶核酸序列在样品中的存在。
因此,在某些实施方案中,本发明提供了一种检测n种核苷酸片段缺失在样品中的存在的方法,其中,n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数),并且,所述方法包括以下步骤:
(1)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述缺失型靶核酸序列是包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的下游,且野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所有缺失型媒介子探针、野生型媒介子探针所包含的媒介子序列彼此均不同;
并且,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列接触;
(2)在允许切割媒介子探针及核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触;
(3)在允许核酸杂交的条件下,将步骤(2)的产物与检测探针接触,所述检测探针从3'至5'方向包含,与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触;
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定每一种缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是否存在于所述样品中,并确定所述核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中。
在此类实施方案的步骤(1)中,当存在某一种缺失型靶核酸序列和/或其野生型靶核酸序列时,与所述野生型靶核酸序列对应的野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列以及野生型媒介子探针都与该野生型靶核酸序列杂交,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游;类似地,与所述缺失型靶核酸序列对应的缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列以及缺失型媒介子探针都与该缺失型靶核酸序列杂交,且所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间。
进一步,在此类实施方案的步骤(2)中,当存在某一种缺失型靶核酸序列和/或其野生型靶核酸序列时,与该野生型靶核酸序列对应的野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列以及野生型媒介子探针都与该野生型靶核酸序列杂交,但是所述野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列处于游离状态,而不与该野生型靶核酸序列杂交;相应地,与该缺失型靶核酸序列对应的缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列以及缺失型媒介子探针都与该缺失型靶核酸序列杂交,但是所述缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列处于游离状态,而不与该缺失型靶核酸序列杂交。在这种情况下,在具有5'核酸酶活性的酶的作用下,所述野生型和/或缺失型媒介子探针中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来,形成与野生型靶核酸序列对应的媒介子片段和/或与缺失型靶核酸序列对应的媒介子片段。特别地,缺失型上游或下游寡核苷酸序列即便与野生型靶核酸序列杂交,由于所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型上游寡核苷酸序列过远或者由于所述缺失型上游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型下游寡核苷酸序列过远,导致缺失型上下游寡核苷酸序列不能有效扩增野生型序列,此外,由于所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,相应地,缺失型靶向序列也能够与野生型靶核酸序列的相同位置互补,然而由于该理论互补位置不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间,从而确保该缺失型靶向序列不会与野生型上游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列的扩增产物杂交,从而保证野生型靶核酸序列不会形成缺失型媒介子片段;与此同时,由于缺失型靶核酸序列不包含所述野生型靶向序列所能够杂交的片段,野生型媒介子探针不会与缺失型靶核酸序列杂交,从而保证缺失型靶核酸序列不会形成野生型媒介子片段。
进一步,在此类实施方案的步骤(3)和(4)中,当存在与某一种缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列对应的媒介子片段时,所述媒介子片段与所述检测探针杂交,并且,所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸所述媒介子片段,形成与所述缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列对应的双链体。更进一步,在此类实施方案的步骤(5)中,当检测到或未检测到与某一种缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时,确定所述缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中,并进而确定与所述核苷酸片段缺失存在于或不存在于所述样品中。
特别地,在此类实施方案中,由于所使用的所有媒介子探针(包括每一种缺失型媒介子探针及相应的野生型媒介子探针)所包含的媒介子序列彼此不同,因此,所形成的每一种媒介子片段具有不同的序列,并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此,由媒介子片段的延伸产物和检测探针构成的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列)。相应地,每一种双链体具有彼此不同的熔点(Tm值)。因此,在熔解曲线分析中,每一种双链体显示出彼此不同的熔解峰。由此,通过检测某一种双链体的熔解峰,可判断与该双链体对应的某一种缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列在样品中的存在。
另外,由于每一种媒介子序列(每一种缺失型媒介子探针及相应的野生型媒介子探针)以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的,因此,可以预先计算每一种双链体各自的熔点(Tm值)。由此,通过在熔解曲线分析中检测具有某一种双链体的熔点(Tm值)的熔解峰,可判断与该双链体对应的靶核酸序列(某一种缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)在样品中的存在。
以上针对本发明方法的基本原理进行了简要概述,现参照本发明方法的各个步骤,对本发明方法进行详细的阐释和举例说明。
关于步骤(1)和(2)
在本发明的方法中,样品中的缺失型靶核酸序列(例如第一或第二缺失型靶核酸序列;如果存在的话)首先与对应的缺失型上游寡核苷酸序列(例如第一或第二缺失型上游寡核苷酸序列)、缺失型下游寡核苷酸序列(例如第一或第二缺失型下游寡核苷酸序列)和对应的缺失型媒介子探针(例如第一或第二缺失型媒介子探针)杂交。
在本发明的方法中,样品可以是任何待检测的样品。例如,在某些优选的实施方案中,样品包含或是DNA(例如基因组DNA或cDNA)。在某些优选的实施方案中,样品包含或者是RNA(例如mRNA)。在某些优选的实施方案中,样品包含或者是核酸的混合物(例如DNA的混合物,RNA的混合物,或者DNA和RNA的混合物)。在某些优选的实施方案中,待检测的样品为获自受试者的样品,例如血液,唾液,组织,或毛发。在某些优选的实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如灵长类动物,例如人。
在本发明的方法中,待检测的靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)不受限于其序列组成或长度。例如,所述靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)可以是DNA(例如基因组DNA或cDNA)或RNA分子(例如mRNA)。此外,待检测的靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)可以是单链的或双链的。
当待检测的样品或靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)为mRNA时,优选地,在进行本发明的方法之前,进行逆转录反应,以获得与所述mRNA互补的cDNA。关于逆转录反应的详细描述可参见例如,Joseph Sam-brook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001)。
待检测的样品或靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)可获自任何来源。在本发明的方法中,待检测的样品是含有或怀疑含有核苷酸片段缺失的样品。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;在此类实施方案中,所述核苷酸片段缺失又称为大片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失导致疾病,例如苯丙氨酸羟化酶缺乏症(PAH缺乏症)。待检测的样品或靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列)还可以是任何形式的核酸序列,例如基因组序列,人工分离或片段化的序列,合成的序列等。
在本发明的某些实施方案中,媒介子探针(例如缺失型媒介子探针或野生型媒介子探针)可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸),经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中,媒介子探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中,媒介子探针包含经修饰的核苷酸,例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中,媒介子探针包含非天然的核苷酸,例如脱氧次黄嘌呤,肌苷,1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯,5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本发明的方法中,媒介子探针(例如缺失型媒介子探针或野生型媒介子探针)不受其长度的限制。例如,媒介子探针的长度可以为15-1000nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt,900-1000nt。例如,媒介子探针的长度可以为15-150nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt,140-150nt。媒介子探针中的靶向序列(例如缺失型媒介子探针中的缺失型靶向序列或野生型媒介子探针中的野生型靶向序列)可以是任何长度,只要其能够与相应的靶核酸序列特异性杂交。例如,缺失型媒介子探针中的缺失型靶向序列或野生型媒介子探针中的野生型靶向序列的长度可以为10-500nt,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-150nt,150-200nt,200-250nt,250-300nt,300-350nt,350-400nt,400-450nt,450-500nt。例如,缺失型媒介子探针中的缺失型靶向序列或野生型媒介子探针中的野生型靶向序列的长度可以为10-140nt,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt。媒介子探针中的媒介子序列(例如,缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列或野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列)可以是任何长度,只要其能够与相应的检测探针特异性杂交并进行延伸。例如,缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列或野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列的长度可以为5-140nt,例如5-10nt,8-50nt,8-15nt,15-20nt,10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt。在某些优选的实施方案中,缺失型媒介子探针中的缺失型靶向序列或野生型媒介子探针中的野生型靶向序列的长度为10-100nt(例如,10-90nt,10-80nt,10-50nt,10-40nt,10-30nt,10-20nt),并且,缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列或野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列的长度为5-100nt(例如,10-90nt,10-80nt,10-50nt,10-40nt,10-30nt,10-20nt)。
在某些优选的实施方案中,媒介子探针(例如缺失型媒介子探针或野生型媒介子探针)具有3'-OH末端。在某些优选的实施方案中,媒介子探针的3'-末端是封闭的,以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如媒介子探针)的3'-末端。例如,可通过对媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰,以封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中,可通过在媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如,生物素或烷基),从而封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中,可通过将媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除,或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸,从而封闭媒介子探针的3'-末端。
在本发明的某些实施方案中,上游寡核苷酸序列(例如缺失型上游寡核苷酸序列或野生型上游寡核苷酸序列)可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸),经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中,上游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中,上游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸,例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中,上游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸,例如脱氧次黄嘌呤,肌苷,1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯,5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本发明的方法中,上游寡核苷酸序列(例如缺失型上游寡核苷酸序列或野生型上游寡核苷酸序列)不受其长度的限制,只要其能够与相应的靶核酸序列特异性杂交。例如,上游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt,140-150nt。
在本发明的方法中,允许核酸杂交的条件可由本领域技术人员常规地确定。例如,可根据待检测的靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列)、所使用的上游寡核苷酸序列(例如缺失型上游寡核苷酸序列或野生型上游寡核苷酸序列)、下游寡核苷酸序列(例如缺失型下游寡核苷酸序列或野生型下游寡核苷酸序列)、媒介子探针中的靶向序列(例如缺失型媒介子探针中的缺失型靶向序列或野生型媒介子探针中的野生型靶向序列)确定合适的杂交条件。在本发明的某些实施方案中,所述允许核酸杂交的条件是这样的严紧条件,其使得上游寡核苷酸序列(例如缺失型上游寡核苷酸序列)以及媒介子探针中的靶向序列(例如缺失型靶向序列)通过碱基互补配对与对应的靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列)杂交,并且,媒介子探针中的媒介子序列(例如缺失型媒介子序列)不与任一靶核酸序列(例如缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列)杂交。在某些优选的实施方案中,在高严紧条件下,将样品与各种上游寡核苷酸序列(例如缺失型和/或野生型上游寡核苷酸序列)和各种媒介子探针(例如缺失型媒介子探针和/或野生型媒介子探针)接触。
在本发明的方法中,在将样品与所述各种上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和各种媒介子探针接触后,需要诱导媒介子探针的切割,以释放含有媒介子序列或其部分的片段(即,媒介子片段)。在一般情况下,可使用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶,利用与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸序列或其延伸产物,诱导与靶核酸序列杂交的媒介子探针的切割。特别地,在步骤(1)中,当媒介子探针与靶核酸序列接触时,其所包含的靶向序列与靶核酸序列杂交并形成双链结构,而媒介子序列不与靶核酸序列杂交,保持单链结构。因此,可利用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶来切割这种包含双链结构和单链结构的寡核苷酸,并释放具有单链结构的片段。
易于理解,在本发明的方法中,在允许核酸杂交的条件下,上游寡核苷酸序列和媒介子探针将与靶核酸序列的同一条链杂交,且上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游,从而可诱导媒介子探针的切割。在本发明的某些实施方案中,可通过两种方式来诱导媒介子探针的切割:(A)不依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式;和(B)依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式。特别地,在上游寡核苷酸序列和媒介子探针与靶核酸序列杂交后,如果上游寡核苷酸序列和媒介子探针足够接近,使得具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶能够诱导对媒介子探针的切割,那么所述核酸聚合酶将结合至上游寡核苷酸序列,并切割媒介子探针,而无需进行延伸反应(即,方式A)。相反地,在与靶核酸序列杂交后,如果上游寡核苷酸序列远离媒介子探针,那么所述核酸聚合酶以靶核酸序列为模板,催化上游寡核苷酸序列的延伸,随后其5'核酸酶活性切割媒介子探针(即,方式B)。
因此,在某些优选的实施方案中,在与靶核酸序列(例如,缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列)杂交后,上游寡核苷酸序列(例如,缺失型上游寡核苷酸序列或野生型上游寡核苷酸序列)位于媒介子探针(例如,缺失型媒介子探针或野生型媒介子探针)的上游邻近。在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶切割媒介子探针,而无需进行延伸反应。因此,在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针,其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的,术语“邻近”意欲表示,两条核酸序列彼此相邻,形成缺口。在某些优选的实施方案中,邻近的两条核酸序列(例如,上游寡核苷酸序列和媒介子探针)相距不超过30nt,例如不超过20nt,例如不超过15nt,例如不超过10nt,例如不超过5nt,例如4nt,3nt,2nt,1nt。
在某些优选的实施方案中,在与靶核酸序列杂交后,上游寡核苷酸序列与媒介子探针的靶向序列具有部分重叠的序列。在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶切割媒介子探针,而无需进行延伸反应。因此,在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针,其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。在某些优选的实施方案中,所述部分重叠的序列的长度为1-10nt,例如1-5nt,或1-3nt。
在某些优选的实施方案中,在与靶核酸序列杂交后,上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游远端。在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列被该核酸聚合酶延伸,随后所产生的延伸产物诱导该核酸聚合酶的5'核酸酶活性切割媒介子探针。因此,在此类实施方案中,上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游引物,其用于起始延伸反应,并以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的,术语“远端”意欲表示,两条核酸序列彼此远离,例如相距至少30nt,至少50nt,至少80nt,至少100nt或更长。
因此,在某些优选的实施方案中,所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。所述引物适合于以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。所述探针适合于以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。
利用上游寡核苷酸来诱导切割下游寡核苷酸(下游探针)的各种方法是本领域技术人员已知的,并且可用于本发明。关于此类方法的详细描述可参见例如,美国专利5,210,015,5,487,972,5,691,142,5,994,069和7,381,532,以及美国申请US 2008/0241838。
在某些实施方案中,媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列与靶向序列的连接处(即,与靶核酸杂交的序列和不与靶核酸杂交的序列的连接处)。在此类实施方案中,酶对媒介子探针的切割将释放出包含完整媒介子序列的片段。在某些实施方案中,媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列的3'-末端区域内(即,位于媒介子序列的3'-末端的上游,且例如距离媒介子序列的3'-末端数个核苷酸,例如1-3个核苷酸)。在此类实施方案中,酶对媒介子探针的切割将释放出包含媒介子序列的一部分(5’-末端部分)的片段。因此,在本发明的某些实施方案中,媒介子片段包含完整的媒介子序列,或者媒介子序列的一部分(5'-末端部分),例如包含媒介子序列的5'-末端的至少5nt,至少8nt,至少10nt,至少20nt,至少30nt,至少40nt,至少50nt,例如5-50nt,5-10nt,10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt。
在本发明方法的步骤(2)中,具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物,对靶核酸序列进行扩增。并且,在靶核酸的扩增过程中,该核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性,诱导对杂交至靶核酸序列的媒介子探针的切割,从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。可使用各种具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶来实施本发明的方法。在某些优选的实施方案中,所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶为具有5'外切核酸酶活性的核酸聚合酶。在某些优选的实施方案中,所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的DNA核酸聚合酶(例如,热稳定的DNA聚合酶)。在本申请中,特别优选地,所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如模板依赖性DNA聚合酶)。
在某些优选的实施方案中,具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶,其可获自各种细菌物种,例如,Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermusantranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermusrubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotogamaritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。特别优选地,所述具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶为Taq聚合酶。
在本发明的方法中,上游寡核苷酸序列(例如缺失型上游寡核苷酸序列或野生型上游寡核苷酸序列)和下游寡核苷酸序列(例如缺失型下游寡核苷酸序列或野生型下游寡核苷酸序列)可分别用作上游引物和下游引物,用于扩增靶核酸序列。因此,易于理解的是,上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列分别靶向两条互补链中的不同链。因此,当靶核酸序列为双链分子时,上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序分别与靶核酸序列的不同链(正义链和反义链)互补;而当靶核酸序列为单链分子时,上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序分别与靶核酸序列及其互补序列互补,从而可用于实现对靶核酸序列的扩增。然而,在本申请中,为了简便起见,在描述上游寡核苷酸序列/下游寡核苷酸序列与靶核酸序列的关系时,均统称为“与靶核酸序列互补”,而不再详细区分靶核酸序列的正义链和反义链,也不再详细区分靶核酸序列及其互补序列。然而,本领域技术人员能够正确理解,上游寡核苷酸序列/下游寡核苷酸序列与靶核酸序列的互补关系和位置关系。
在本发明的某些实施方案中,下游寡核苷酸序列(例如缺失型下游寡核苷酸序列或野生型下游寡核苷酸序列)可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸),经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中,下游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中,下游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸,例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中,下游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸,例如脱氧次黄嘌呤,肌苷,1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯,5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本发明的方法中,下游寡核苷酸序列(例如缺失型下游寡核苷酸序列或野生型下游寡核苷酸序列)不受其长度的限制,只要其能够与相应的靶核酸序列特异性杂交。例如,下游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt,140-150nt。
在某些优选的实施方案中,以对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中,对于某一靶核酸序列,使用等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些优选的实施方案中,以不对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中,对于某一靶核酸序列,使用不等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些实施方案中,上游寡核苷酸序列相对于下游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍,至少2倍,至少5倍,至少8倍,至少10倍,例如过量1-10倍)。在某些实施方案中,下游寡核苷酸序列相对于上游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍,至少2倍,至少5倍,至少8倍,至少10倍,例如过量1-10倍)。
在某些优选的实施方案中,以三步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中,每一轮的核酸扩增需要经过三个步骤:在第一温度下进行核酸变性,在第二温度下进行核酸退火,以及在第三温度下进行核酸延伸。在某些优选的实施方案中,以两步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中,每一轮的核酸扩增需要经过两个步骤:在第一温度下进行核酸变性,以及在第二温度下进行核酸退火和延伸。适合于进行核酸变性、核酸退火和核酸延伸的温度可由本领域技术人员通过常规方法容易地确定(参见例如,Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。
在本发明的方法中,所使用的媒介子探针与靶核酸序列通常是一一对应的。换言之,针对每一种待检测的靶核酸序列,提供了一种独特的媒介子探针(例如,针对野生型靶核酸序列,提供一种野生型媒介子探针,针对缺失型靶核酸序列,提供一种缺失型媒介子探针)。然而,易于理解的是,上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列与靶核酸序列之间并不需要是一一对应的。因此,在本发明的方法中,针对缺失型靶核酸序列和相应的野生型靶核酸序列可以使用相同的上游寡核苷酸序列,在此情况下,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;针对缺失型靶核酸序列和相应的野生型靶核酸序列也可以使用相同的下游寡核苷酸序列,在此情况下,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中。
此外,当在步骤(2)中使用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时,还可采用HANDS策略来提高核酸扩增的效率(参见例如Nucleic Acids Research,1997,25(16):3235-3241)。例如,在某些优选的实施方案中,可在所有的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列的5'端引入一段相同的寡核苷酸序列,随后利用与所述相同的寡核苷酸序列互补的通用引物(优选地,其用量通常远远大于上游和下游寡核苷酸序列的用量)来进行扩增。
因此,在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,所提供的所有上游寡核苷酸序列(例如,第一野生型和缺失型上游寡核苷酸序列以及第二野生型和缺失型上游寡核苷酸序列)和下游寡核苷酸序列(例如,第一野生型和缺失型下游寡核苷酸序列以及第二野生型和缺失型下游寡核苷酸序列)在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列,并且,还提供一种通用引物,所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列;然后,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针、下游寡核苷酸序列和通用引物接触。在某些优选的实施方案中,所述相同的寡核苷酸序列的长度为8-50nt,例如8-15nt,15-20nt,20-30nt,30-40nt,或40-50nt。相应地,所述通用引物的长度可以为8-50nt,例如8-15nt,15-20nt,20-30nt,30-40nt,或40-50nt。随后,在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,在允许核酸扩增的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。在此类实施方案中,核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物,对靶核酸序列进行初步扩增,获得初步扩增的产物;随后,利用通用引物对初步扩增的产物进行再次扩增。并且,在整个扩增过程中,核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性,切割杂交至靶核酸序列或初步扩增的产物的媒介子探针,从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。
在本发明的某些实施方案中,通用引物可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸),经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中,通用引物包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中,通用引物包含经修饰的核苷酸,例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中,通用引物包含非天然的核苷酸,例如脱氧次黄嘌呤,肌苷,1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯,5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本发明的方法中,通用引物不受其长度的限制,只要其能够与上游和下游寡核苷酸序列中包含的所述相同的寡核苷酸序列特异性杂交。例如,通用引物的长度可以为8-50nt,例如8-15nt,15-20nt,20-30nt,30-40nt,或40-50nt。
关于步骤(3)和(4)
在步骤(2)中,具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶对杂交至靶核酸序列(例如,缺失型靶核酸序列或其野生型靶核酸序列)的媒介子探针(例如,缺失型媒介子探针或野生型媒介子探针)进行切割,释放出含有该媒介子序列或其部分的媒介子片段,其随后在步骤(3)中与检测探针发生杂交。在本申请中,检测探针从3'至5'方向包含,与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列。由此,在步骤(4)中,在核酸聚合酶的作用下,检测探针用作模板,用于延伸与其杂交的媒介子片段;而媒介子片段用作引物,用于起始延伸反应;并且在延伸反应结束后,媒介子片段的延伸产物与检测探针杂交在一起,形成核酸双链体。
在本发明的方法中,检测探针包含与多个媒介子序列或其部分互补的多个捕获序列(例如,与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列,与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列,与第三媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列,和/或与第四媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列)。易于理解的是,各个捕获序列可以以任何顺序排列。例如,第一捕获序列可以位于第二捕获序列的上游(5'端)或下游(3'端)。例如,检测探针可以从3'至5'方向依次包含,第一捕获序列和第二捕获序列;或者,第二捕获序列和第一捕获序列。类似地,检测探针可以以任何排列顺序包含其他捕获序列(例如,第一、第二、第三、第四捕获序列)。
此外,各个捕获序列可以以任何方式排列。例如各个捕获序列可以以相邻的方式或以间隔有连接序列的方式排列。例如,第一捕获序列可以和第二捕获序列相邻排列;或者,二者之间可间隔有连接序列(在本文中也简称为“接头”);或者,二者之间可存在重叠。类似地,检测探针可以以任何排列方式包含其他捕获序列(例如,第一、第二、第三、第四捕获序列)。
在某些情况下,以重叠的方式排列各个捕获序列是特别有利的。在此类实施方案中,可对多个媒介子序列进行设计,以使不同的媒介子序列包含重叠序列。例如,可以设计第一媒介子序列和第二媒介子序列,使得第一媒介子序列的3'末端部分具有与第二媒介子序列的5'末端部分相同的序列。相应地,在检测探针中,与第一媒介子序列互补的第一捕获序列的5'末端部分具有与第二媒介子序列互补的第二捕获序列的3'末端部分相同的序列。由此,检测探针可以以3'至5'方向包含第一捕获序列和第二捕获序列,并且二者可以以重叠的方式进行排列。在此情况下,重叠的序列即为第一和第二捕获序列共有的相同序列或其部分。通过以重叠的方式排列捕获序列,可使得检测探针在预定的长度内包含更多个捕获序列,从而可以与更多个媒介子片段杂交。换言之,通过以重叠的方式排列捕获序列,单个检测探针可以与更多个媒介子探针组合使用。
如上文所描述的,在本发明的方法中,单个检测探针与至少2个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)媒介子探针组合使用。因此,在某些优选的实施方案中,单个检测探针的用量相对于单个媒介子探针是过量的(例如,过量至少1倍,至少2倍,至少5倍,至少10倍,至少20倍)。此类实施方案在某些情况下是有利的,因为整个反应体系包含足够的检测探针与释放的媒介子片段杂交,介导媒介子片段延伸,并形成双链体。
如上文所描述的,媒介子片段可含有完整的媒介子序列或其部分。当媒介子片段包含有完整的媒介子序列时,所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列互补的序列。当媒介子片段包含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)时,所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列的部分(5'-末端部分)互补的序列,或者,与完整的媒介子序列互补的序列。在某些优选的实施方案中,所述检测探针包含与所述媒介子序列互补的序列。此类检测探针在某些情况下是特别有利的,因为其既能够与含有完整的媒介子序列的媒介子片段杂交,也能够与含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)的媒介子片段杂交。然而,应当理解的是,所述检测探针也可包含仅与媒介子片段的一部分(例如3'-末端部分)互补的序列,只要检测探针能够与媒介子片段稳定地杂交,并起始延伸反应。
此外,除了捕获序列和模板序列之外,检测探针还可在3'端(即,在捕获序列的下游)包含额外的序列。所述额外的序列通常包含不与媒介子片段互补的序列,不参与和媒介子片段的杂交。
根据本发明,检测探针中的模板序列可以包含任何序列,并且,其位于各个捕获序列的上游(5'端),从而可用作模板用于延伸媒介子片段。在某些优选的实施方案中,所述模板序列包含与媒介子探针(媒介子序列和靶向序列)不互补的序列。此类模板序列在某些情况下是特别有利的,因为其可以提高媒介子片段与检测探针的杂交特异性,避免媒介子片段杂交至不期望的位置,从而避免产生不期望的双链体。
在本发明的某些实施方案中,检测探针可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸),经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸),或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中,检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中,检测探针包含经修饰的核苷酸,例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中,检测探针包含非天然的核苷酸,例如脱氧次黄嘌呤,肌苷,1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯,5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本发明的方法中,检测探针不受其长度的限制。例如,检测探针的长度可以为15-1000nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt,900-1000nt。检测探针中的捕获序列可以是任何长度,只要其能够与媒介子片段特异性杂交。例如,检测探针中的捕获序列的长度可以为10-500nt,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-150nt,150-200nt,200-250nt,250-300nt,300-350nt,350-400nt,400-450nt,450-500nt。检测探针中的模板序列可以是任何长度,只要其能够用作延伸媒介子片段的模板。例如,检测探针中的模板序列的长度可以为1-900nt,例如1-5nt,5-10nt,10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt。在某些优选的实施方案中,检测探针中的捕获序列的长度为10-200nt(例如,10-190nt,10-180nt,10-150nt,10-140nt,10-130nt,10-120nt,10-100nt,10-90nt,10-80nt,10-50nt,10-40nt,10-30nt,10-20nt),并且,模板序列的长度为5-200nt(例如,10-190nt,10-180nt,10-150nt,10-140nt,10-130nt,10-120nt,10-100nt,10-90nt,10-80nt,10-50nt,10-40nt,10-30nt,10-20nt)。
在某些优选的实施方案中,检测探针具有3'-OH末端。在某些优选的实施方案中,检测探针的3'-末端是封闭的,以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如检测探针)的3'-末端。例如,可通过对检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰,以封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中,可通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如,生物素或烷基),从而封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中,可通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除,或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸,从而封闭检测探针的3'-末端。
在本发明的方法中,媒介子片段与检测探针杂交,并由此起始核酸聚合酶的延伸反应。虽然未被切割的媒介子探针也能够通过媒介子序列与检测探针杂交,但是媒介子探针还包含靶向序列,其位于媒介子序列下游并且不与检测探针杂交(即,处于游离状态),从而核酸聚合酶不能延伸与检测探针杂交的媒介子探针。
如上文所描述的,检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
在某些优选的实施方案中,所述检测探针为自淬灭探针。在此类实施方案中,当检测探针未与其他序列杂交时,淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如,淬灭基团位于报告基团的邻近),从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下,所述检测探针不发出信号。进一步,当所述检测探针与其互补序列杂交时,淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如,淬灭基团位于远离报告基团的位置),从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下,所述检测探针发出信号。
此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如,可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团,或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此,当所述检测探针单独存在时,所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用,使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收,从而使得所述检测探针不发出信号;而当所述检测探针与其互补序列杂交时,所述报告基团与所述淬灭基团相互分离,使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收,从而使得所述检测探针发出信号。
然而,应当理解的是,报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部,只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如,可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游),而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游),并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,或更长的距离)。由此,当所述检测探针单独存在时,由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成,所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用,使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收,从而使得所述检测探针不发出信号;并且,当所述检测探针与其互补序列杂交时,所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离,使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收,从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团相距不超过80nt,不超过70nt,不超过60nt,不超过50nt,不超过40nt,不超过30nt,或不超过20nt。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团相距至少5nt,至少10nt,至少15nt,或至少20nt。
因此,可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团,只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而,在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置,并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离,使得在检测探针与其互补序列杂交之前,淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置,并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离,使得在检测探针与其互补序列杂交之前,淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中,报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端,并且另一种位于3'末端。
在本发明的方法中,所述报告基团和淬灭基团可以是本领域已知的任何合适的基团或分子,其具体实例包括但不限于Cy2TM(506),YO-PROTM-l(509),YOYOTM-l(509),Calcein(517),FITC(518),FluorXTM(519),AlexaTM(520),Rhodamine 110(520),Oregon GreenTM500(522),Oregon GreenTM488(524),RiboGreenTM(525),Rhodamine GreenTM(527),Rhodamine123(529),Magnesium GreenTM(531),Calcium GreenTM(533),TO-PROTM-l(533),TOTOl(533),JOE(548),BODIPY530/550(550),Dil(565),BODIPY TMR(568),BODIPY558/568(568),BODIPY564/570(570),Cy3TM(570),AlexaTM546(570),TRITC(572),MagnesiumOrangeTM(575),Phycoerythrin R&B(575),Rhodamine Phalloidin(575),CalciumOrangeTM(576),PyroninY(580),Rhodamine B(580),TAMRA(582),Rhodamine RedTM(590),Cy3.5TM(596),ROX(608),Calcium CrimsonTM(615),AlexaTM594(615),Texas Red(615),Nile Red(628),YO-PROTM-3(631),YOYOTM-3(631),R-phycocyanin(642),C-Phycocyanin(648),TO-PROTM-3(660),T0T03(660),DiD DilC(5)(665),Cy5TM(670),Thiadicarbocyanine(671),Cy5.5(694),HEX(556),TET(536),Biosearch Blue(447),CALFluor Gold 540(544),CAL Fluor Orange 560(559),CAL Fluor Red 590(591),CALFluor Red 610(610),CAL Fluor Red 635(637),FAM(520),Fluorescein(520),Fluorescein-C3(520),Pulsar 650(566),Quasar 570(667),Quasar 670(705),和Quasar705(610)。括号中的数字表示最大发射波长,单位为nm。
此外,报告基团和淬灭基团的各种合适配对是本领域已知的,参见例如Pesce etal.,editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971);White etal.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970);Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971);Griffiths,Color AND Constitution of OiganicMolecules(Academic Press,New York,1976);Bishop,editor,Indicators(PeigamonPress,Oxford,1972);Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes,Eugene,1992);Pringsheim,Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949);Haugland,R.P.,Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals,6th Edition(Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996);美国专利3,996,345和4,351,760。
在某些优选的实施方案中,所述报告基团为荧光基团。在此类实施方案中,报告基团发出的信号即为荧光,并且,淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如,能够吸收所述荧光的另一荧光分子,或者能够淬灭所述荧光的淬灭剂)。在某些优选的实施方案中,所述荧光基团包括但不限于各种荧光分子,例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CALGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。在某些优选的实施方案中,所述淬灭基团包括但不限于各种淬灭剂,例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。
在本发明的方法中,还可以对检测探针进行修饰,例如使其具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性,例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性。例如,可在检测探针的主链中引入抵抗核酸酶活性的修饰,例如硫代磷酸酯键,烷基磷酸三酯键,芳基磷酸三酯键,烷基膦酸酯键,芳基膦酸酯键,氢化磷酸酯键,烷基氨基磷酸酯键,芳基氨基磷酸酯键,2'-O-氨基丙基修饰,2'-O-烷基修饰,2'-O-烯丙基修饰,2'-O-丁基修饰,和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。
在本发明的方法中,检测探针可以是线性的,或者可具有发夹结构。在某些优选的实施方案中,所述检测探针是线性的。在某些优选的实施方案中,所述检测探针具有发夹结构。发夹结构可以是天然的,也可以是人工引入的。此外,可使用本领域中的常规方法来构建具有发夹结构的检测探针。例如,可通过在检测探针的2个末端(5'端和3'端)添加互补的2段寡核苷酸序列,从而使得检测探针可形成发夹结构。在此类实施方案中,互补的2段寡核苷酸序列构成发夹结构的臂(茎)。发夹结构的臂可具有任何期望的长度,例如臂的长度可以是2-15nt,例如3-7nt,4-9nt,5-10nt,6-12nt。
此外,在本发明的方法中,步骤(3)中的“杂交”、“核酸杂交”以及“允许核酸杂交的条件”可如上文所定义。
使用步骤(3)的产物和核酸聚合酶来进行步骤(4)。在步骤(4)中,在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,核酸聚合酶将以检测探针为模板,对杂交至检测探针的媒介子片段进行延伸,并由此形成双链体。
如上文所详细描述的,每一种媒介子探针各自包含独特的媒介子序列,并且在具有5'核酸酶活性的酶的作用下,释放出包含独特的媒介子序列或其部分的媒介子片段。随后,每一种媒介子片段杂交至检测探针的不同位置(即,与对应的媒介子序列或其部分互补的捕获序列),被核酸聚合酶延伸,并与检测探针一起形成双链体。由此,针对每一种媒介子探针,当存在其对应的靶序列时,在步骤(4)中将产生一种独特的双链体,其包含检测探针(作为一条链)和对应于该媒介子探针的媒介子片段的延伸产物(作为另一条链)。因此,步骤(4)中所产生的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列),因而具有彼此不同的Tm值,并在熔解曲线分析中显示出彼此不同的熔解峰。
在某些优选的实施方案中,步骤(4)中所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如,DNA聚合酶,特别是热稳定的DNA聚合酶)。在某些优选的实施方案中,所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶,其可获自各种细菌物种,例如,Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcusliteralis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermusruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermusthermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。特别优选地,所述模板依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
在某些优选的实施方案中,步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。在某些优选的实施方案中,步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶是不同的。
例如,在某些实施方案中,在步骤(2)中,使用具有5'核酸酶活性的第一核酸聚合酶来催化上游寡核苷酸序列的延伸以及媒介子探针的切割,随后在步骤(4)中使用第二核酸聚合酶来催化媒介子片段的延伸。然而,特别优选地,在步骤(2)和(4)中使用相同的酶。例如,可使用具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如,DNA聚合酶,特别是热稳定的DNA聚合酶),在步骤(2)中催化上游寡核苷酸序列的延伸和媒介子探针的切割,并且在步骤(4)中催化媒介子片段的延伸。
在本发明的方法中,可根据需要,重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中,重复进行步骤(1)-(2)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤。易于理解,步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段,用于后续的步骤(即,步骤(3)-(5))。因此,在某些优选的实施方案中,通过下列方案来进行本发明的方法:重复步骤(1)-(2)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤;随后进行步骤(3)-(5)。
在某些优选的实施方案中,重复进行步骤(1)-(4)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤。易于理解,步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体,用于后续的步骤(即,步骤(5))。因此,在某些优选的实施方案中,通过下列方案来进行本发明的方法:重复步骤(1)-(4)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤;随后进行步骤(5)。
在某些优选的实施方案中,本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行:
(a)提供一种检测探针,并且针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;并且,任选地,提供一种通用引物;其中,所述检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义;
(b)将待检测的样品与所提供的检测探针、媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列,以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如,DNA聚合酶,特别是热稳定的DNA聚合酶)混合;并且任选地,添加通用引物;
(c)在允许核酸变性的条件下,温育前一步骤的产物;
(d)在允许核酸退火或杂交的条件下,温育前一步骤的产物;
(e)在允许核酸延伸的条件下,温育前一步骤的产物;和
(f)任选地,重复步骤(c)-(e)一次或多次。
在此类实施方案中,在步骤(c)中,样品中的所有核酸分子将解离为单链状态;随后,在步骤(d)中,互补的核酸分子(例如,上游寡核苷酸序列与靶核酸序列或下游寡核苷酸序列的延伸产物,下游寡核苷酸序列与靶核酸序列或上游寡核苷酸序列的延伸产物,媒介子探针与靶核酸序列或其扩增产物,媒介子探针或因媒介子探针的切割而产生的媒介子片段与检测探针,通用引物与上游/下游寡核苷酸序列或上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物)将退火或杂交在一起,形成双链体;随后,在步骤(e)中,具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶将延伸杂交至靶核酸序列的上游/下游寡核苷酸序列,切割杂交至靶核酸序列的媒介子探针的游离5'末端,延伸杂交至检测探针的媒介子片段,延伸杂交至上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物的通用引物。由此,通过步骤(c)-(e)的循环,可实现靶核酸序列的扩增,媒介子探针的切割,以及含有检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体的形成,从而完成本发明方法的步骤(1)-(4)。
易于理解的是,在步骤(e)中,由于杂交至野生型靶核酸序列的缺失型下游寡核苷酸序列(下游引物)与缺失型/野生型上游寡核苷酸序列(上游引物)相距过远(例如,相距至少500bp),或者,由于杂交至野生型靶核酸序列的缺失型上游寡核苷酸序列(上游引物)与缺失型/野生型下游寡核苷酸序列(下游引物)相距过远(例如,相距至少500bp),从而导致缺失型上下游引物无法有效扩增野生型靶核酸序列;此外,核酸聚合酶不会延伸杂交至检测探针的媒介子探针,因为位于媒介子探针3'端的靶特异性序列不能与检测探针杂交,处于游离状态。此外,优选地,媒介子探针的3'端是封闭的,从而可避免媒介子探针的不期望的延伸,例如避免杂交至靶核酸序列或检测探针的媒介子探针的延伸。
步骤(c)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中,在步骤(c)中,在80-105℃(例如,80-85℃,85-90℃,90-95℃,91℃,92℃,93℃,94℃,95℃,96℃,97℃,98℃,99℃,100℃,101℃,102℃,103℃,104℃,或105℃)的温度下温育步骤(b)的产物,从而使核酸变性。在某些优选的实施方案中,在步骤(c)中,温育步骤(b)的产物10s-5min,例如10-20s,20-40s,40-60s,1-2min,或2-5min。
步骤(d)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中,在步骤(d)中,在35-70℃(例如,35-40℃,40-45℃,45-50℃,50-55℃,55-60℃,60-65℃,或65-70℃)的温度下温育步骤(c)的产物,从而允许核酸退火或杂交。在某些优选的实施方案中,在步骤(d)中,温育步骤(c)的产物10s-5min,例如10-20s,20-40s,40-60s,1-2min,或2-5min。
步骤(e)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中,在步骤(e)中,在35-85℃(例如,35-40℃,40-45℃,45-50℃,50-55℃,55-60℃,60-65℃,65-70℃,70-75℃,75-80℃,80-85℃)的温度下温育步骤(d)的产物,从而允许核酸延伸。在某些优选的实施方案中,在步骤(e)中,温育步骤(d)的产物10s-30min,例如10-20s,20-40s,40-60s,1-2min,2-5min,5-10min,10-20min或20-30min。
在某些实施方案中,可在不同的温度下进行步骤(d)和(e),即在不同的温度下进行核酸的退火和延伸。在某些实施方案中,可在相同的温度下进行步骤(d)和(e),即在相同的温度下进行核酸的退火和延伸。在此情况下,可将步骤(d)和(e)合并为一个步骤。
在本发明的方法中,可重复步骤(c)-(e)至少一次,例如至少2次,至少5次,至少10次,至少20次,至少30次,至少40次,或至少50次。在某些情况下,步骤(c)-(e)的多次重复是有利的,因为其能够扩增靶核酸序列,提高检测的灵敏度。然而,易于理解的是,当重复步骤(c)-(e)一次或次时,每一个循环的步骤(c)-(e)所使用的条件不必是相同的。例如,可使用一种条件来进行前5个循环的步骤(c)-(e),随后使用另一种条件来进行剩余循环的步骤(c)-(e)。
步骤(5)
在根据本发明方法的步骤(5)中,对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定所述每一种靶核酸序列是否存在于所述样品中。
如上文所论述的,可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中,可对步骤(4)的产物进行逐渐的升温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号,从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如,可将步骤(4)的产物从45℃或更低的温度(例如,不超过45℃,不超过40℃,不超过35℃,不超过30℃,不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如,至少75℃,至少80℃,至少85℃,至少90℃,至少95℃),并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号,从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如,升温的速率可以为:每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃,例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃),并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s,1-2s,2-3s,3-4s,4-5s,5-10s,10-15s);或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃,例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
在某些实施方案中,可对步骤(4)的产物进行逐渐的降温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号,从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如,可将步骤(4)的产物从75℃或更高的温度(例如,至少75℃,至少80℃,至少85℃,至少90℃,至少95℃)逐渐降温至45℃或更低的温度(例如,不超过45℃,不超过40℃,不超过35℃,不超过30℃,不超过25℃),并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号,从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。降温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如,降温的速率可以为:每步骤降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃,例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃),并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s,1-2s,2-3s,3-4s,4-5s,5-10s,10-15s);或者每秒降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃,例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
随后,可对获得的曲线进行求导,从而获得步骤(4)的产物的熔解曲线。根据熔解曲线中的熔解峰(熔点),可确定对应于该熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在。随后,通过媒介子片段中的缺失型媒介子序列与缺失型靶核酸序列的对应关系以及野生型媒介子序列与野生型靶核酸序列的对应关系,可确定缺失型靶核酸序列或相应的野生型靶核酸序列的存在,并进而可确定与所述核苷酸片段缺失的存在。
例如,当熔解曲线分析的结果显示,存在或不存在对应于包含检测探针和第一缺失型媒介子片段延伸产物的第一双链体的熔解峰时,可确定第一缺失型靶核酸序列(第一核苷酸片段缺失)存在于或不存在于所述样品中。类似地,当熔解曲线分析的结果显示,存在或不存在对应于包含检测探针和第一野生型媒介子片段延伸产物的第二双链体的熔解峰时,可确定第一野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示,存在或不存在对应于包含检测探针和第二缺失型媒介子片段延伸产物的第三双链体的熔解峰时,可确定第二缺失型靶核酸序列/第二核苷酸片段缺失存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示,存在或不存在对应于包含检测探针和第二野生型媒介子片段延伸产物的第四双链体的熔解峰时,可确定第二野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。由此,本发明的方法通过使用一种检测探针和至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)媒介子探针,即可实现对至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)靶核酸序列/核苷酸片段缺失的同时检测(多重检测)。
不拘于理论限制,熔解曲线分析的分辨率或精度可达到0.5℃或更高。换言之,熔解曲线分析能够区分熔点相差仅0.5℃或更低(例如0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃)的两个熔解峰。因此,在本发明方法的某些实施方案中,任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为至少0.5℃(例如,通过设计第一媒介子序列、第二媒介子序列以及检测探针的序列),从而所述任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)可通过熔解曲线分析来区分和辨别。然而,出于便于区分和辨别的目的,两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)的更大的熔点差异在某些情况下是优选的。因此,在本发明方法的某些实施方案中,两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为任何期望的值(例如至少0.5℃,至少1℃,至少2℃,至少3℃,至少4℃,至少5℃,至少8℃,至少10℃,至少15℃,或至少20℃),只要所述熔点差异能够通过熔解曲线分析来区分和辨别即可。
一种或多种检测探针的同时使用
在上文描述的方法中,使用了一种检测探针即实现了对多种核苷酸片段缺失的多重检测。然而,易于理解的是,本发明的方法并不限于所使用的检测探针的数目。本发明的方法可以使用一种或多种检测探针(例如,至少1种,至少2种,至少3种,至少4种,至少5种,至少6种,至少7种,或更多种检测探针)。并且,基于与上述相同的原理,针对每一种检测探针可设计至少1对或更多对(例如,1对,2对,3对,4对,5对,6对,7对,8对,9对,10对,或更多对)的媒介子探针对,由此,本发明的方法能够用于同时检测多种核苷酸片段缺失的存在,并且本发明方法能够同时检测的核苷酸片段缺失的最大数目远远超过了所使用的检测探针的数目,等于针对每一种检测探针设计的媒介子探针的数目之和(即,所使用的全部媒介子探针的数目)。此外,易于理解的是,针对每一种核苷酸片段缺失,可以设计一对或多对媒介子探针对。因此,本发明方法能够同时检测的核苷酸片段缺失的实际数目可以等于或小于所使用的全部媒介子探针的数目,而仍然大于所使用的检测探针的数目。
因此,在某些实施方案中,本发明提供了一种检测n种核苷酸片段缺失在样品中的存在的方法,其中,n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数),并且,所述方法包括以下步骤:
(1)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含缺失型媒介子探针和野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述缺失型靶核酸序列是包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的下游,且野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所有缺失型媒介子探针、野生型媒介子探针所包含的媒介子序列彼此均不同;
并且,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列接触;
(2)在允许切割媒介子探针及核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触;
(3)提供m种检测探针,并且在允许核酸杂交的条件下,将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触,其中,
m为小于2n且大于0的整数,并且,
每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含,与一种或多种缺失型媒介子序列或其部分或一种或多种野生型媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述m种检测探针包含多种(例如至少2n种)捕获序列,其分别与步骤(1)中提供的每一种缺失型媒介子序列或其部分或一种或多种野生型媒介子探针的媒介子序列或其部分互补;并且,
每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;并且,
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触;
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定每一种缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是否存在于所述样品中,并确定所述核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中。
在此类实施方案的步骤(1)中,当存在某一种缺失型靶核酸序列和/或其野生型靶核酸序列时,与所述缺失型靶核酸序列对应的缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列以及缺失型媒介子探针都与该缺失型靶核酸序列杂交,且所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;类似地,与所述野生型靶核酸序列对应的野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列以及野生型媒介子探针都与该野生型靶核酸序列杂交,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游。
进一步,在此类实施方案的步骤(2)中,当存在某一种缺失型靶核酸序列和/或其野生型靶核酸序列时,与该缺失型靶核酸序列对应的缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列以及缺失型媒介子探针都与该缺失型靶核酸序列杂交,但是所述缺失型媒介子探针中的缺失型媒介子序列处于游离状态,而不与任一靶核酸序列(缺失型及野生型)杂交;相应地,与该野生型靶核酸序列对应的野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列以及野生型媒介子探针都与该野生型靶核酸序列杂交,但是所述野生型媒介子探针中的野生型媒介子序列处于游离状态,而不与任一靶核酸序列(缺失型及野生型)杂交。在这种情况下,在具有5’核酸酶活性的酶的作用下,所述野生型和/或缺失型媒介子探针中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来,形成与野生型靶核酸序列对应的媒介子片段和/或与缺失型靶核酸序列对应的媒介子片段。特别地,缺失型上游或下游寡核苷酸序列即便与野生型靶核酸序列杂交,由于所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型上游寡核苷酸序列过远或者由于所述缺失型上游寡核苷酸序列距离所述野生型或缺失型下游寡核苷酸序列过远,导致缺失型上下游寡核苷酸序列不能有效扩增野生型序列,此外,由于所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,相应地,缺失型靶向序列也能够与野生型靶核酸序列的相同位置互补,然而由于该理论互补位置不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间,从而确保该缺失型靶向序列不会与野生型上游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列的扩增产物杂交,从而保证野生型靶核酸序列不会形成缺失型媒介子片段;与此同时,由于缺失型靶核酸序列不包含所述野生型靶向序列所能够杂交的片段,野生型媒介子探针不会与缺失型靶核酸序列杂交,从而保证缺失型靶核酸序列不会形成野生型媒介子片段。
进一步,在此类实施方案的步骤(3)和(4)中,当存在与某一种缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列对应的媒介子片段时,所述媒介子片段与所述检测探针杂交,并且,所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板,延伸所述媒介子片段,形成与所述缺失型靶核酸序列或其野生型靶核酸序列对应的双链体。
易于理解,在本发明的方法中,m种检测探针包含多种捕获序列,所述多种捕获序列的集合涵盖了步骤(1)提供的所有媒介子探针中的媒介子序列或其部分的互补序列,由此,所述m种检测探针或所述多种捕获序列能够“捕获”从任何媒介子探针上切割下来的媒介子片段。即,从媒介子探针上切割下来的任何媒介子片段能够与至少一种检测探针或至少一种捕获序列杂交。
更进一步,在此类实施方案的步骤(5)中,当检测到或未检测到与某一种靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时,确定所述缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中,并进而确定与所述核苷酸片段缺失存在于或不存在于所述样品中。
在某些实施方案中,在步骤(1)中,针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供n对媒介子探针对;随后,在步骤(3)中,所述m种检测探针包含2n种捕获序列,其分别与步骤(1)中提供的n对媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列或其部分互补;由此,步骤(2)中产生的任一种媒介子片段都能够与至少一种检测探针(其包含与该媒介子片段中的媒介子序列或其部分互补的捕获序列)杂交,并形成双链体,用于后续的延伸和检测。在某些示例性实施方案中,所述m种检测探针包含2n种捕获序列,其分别与n种媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列或其部分互补。在某些示例性实施方案中,所述m种检测探针包含2n种捕获序列,其分别与n种缺失型媒介子探针的媒介子序列或部分以及相应的n种野生型媒介子探针的媒介子序列或部分互补。
在某些优选的实施方案中,所述m种检测探针彼此之间不包含相同的捕获序列。在此情况下,针对每一种媒介子探针,有且仅有一种检测探针(其包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交,并且在延伸反应后,仅产生一种双链体。随后,通过在步骤(5)中检测该双链体的存在,可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。
在某些优选的实施方案中,所述m种检测探针彼此之间可以包含相同的捕获序列。在此情况下,针对每一种媒介子探针,可能存在一种或多种的检测探针(其都包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交,并且在延伸反应后,产生一种或多种的双链体。随后,通过在步骤(5)中检测所述一种或多种的双链体的存在,可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。
在此类实施方案的步骤(5)中,可通过双链体的熔点和/或检测探针中的报告基团来对双链体进行区分和辨别。在某些优选的实施方案中,所述m种检测探针包含相同的报告基团。在此情况下,可对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析,并根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在,进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。在某些优选的实施方案中,所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同。在此情况下,当对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时,可分别实时监测每一种报告基团的信号,由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线。随后,可根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在,进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。
在某些示例性实施方案中,可使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针(也即,m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数)。在某些示例性实施方案中,可使用1-10种检测探针(也即,m为1-10的整数;例如,m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。进一步优选地,所使用的检测探针各自标记有相同或不同的报告基团。
例如,在某些示例性实施方案中,本发明的方法可使用第一和第二检测探针,其分别标记有第一报告基团和第二报告基团。由此,在步骤(5)中,分别实时监测第一报告基团和第二报告基团的信号随温度的变化,从而获得第一熔解曲线和第二熔解曲线。随后,根据第一(或第二)熔解曲线中的熔解峰,可判断包含第一(或第二)检测探针的双链体的存在,并进而确定对应于与第一(或第二)检测探针杂交的媒介子片段的靶核酸序列的存在。
在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、或至少10种检测探针;以及,至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少8对、至少10对、至少15对、至少20对、至少25对、或至少30对媒介子探针对。由此,本发明的方法可实现对多种核苷酸片段缺失的同时检测(多重检测),其中可检测的核苷酸片段缺失的最大数目等于所使用的媒介子探针对的数目。
例如,在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用1种检测探针和1-3对(例如1,2或3对)媒介子探针对,实现了对1-3种(例如1,2或3种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用2种检测探针和2-6对(例如2,3,4,5,或6对)媒介子探针对,实现了对2-6种(例如2,3,4,5或6种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用3种检测探针和2-9对(例如2,3,4,5,6,7,8或9对)媒介子探针对,实现了对2-9种(例如2,3,4,5,6,7,8或9种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用4种检测探针和3-12对(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11或12对)媒介子探针对,实现了对3-12种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11或12种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用5种检测探针和3-15对(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15种)媒介子探针对,实现了对3-15种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用6种检测探针和4-18对(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17或18对)媒介子探针对,实现了对4-18种(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17或18种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用7种检测探针和4-21对(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或21对)媒介子探针对,实现了对4-21种(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或21种)核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用7种检测探针和20种媒介子探针,实现了对10种核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。
在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的媒介子探针对包括:
(1)如SEQ ID NO:12所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:13所示的缺失型媒介子探针;
(2)如SEQ ID NO:17所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:18所示的缺失型媒介子探针;
(3)如SEQ ID NO:22所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:23所示的缺失型媒介子探针;
(4)如SEQ ID NO:27所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:28所示的缺失型媒介子探针;
(5)如SEQ ID NO:32所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:33所示的缺失型媒介子探针;
(6)如SEQ ID NO:37所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:38所示的缺失型媒介子探针;
(7)如SEQ ID NO:42所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:43所示的缺失型媒介子探针;
(8)如SEQ ID NO:47所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:48所示的缺失型媒介子探针;
(9)如SEQ ID NO:53所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:54所示的缺失型媒介子探针;
(10)如SEQ ID NO:58所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:59所示的缺失型媒介子探针;或
(11)(1)-(10)的任意组合。
在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的检测探针包含:如SEQ ID NO:2所示的检测探针,如SEQ ID NO:3所示的检测探针,如SEQ ID NO:4所示的检测探针,如SEQ IDNO:5所示的检测探针,如SEQ ID NO:6所示的检测探针,如SEQ ID NO:7所示的检测探针,如SEQ ID NO:8所示的检测探针,或其任何组合。
在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的野生型上游寡核苷酸序列包括:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的野生型下游寡核苷酸序列包括:分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的缺失型上游寡核苷酸序列包括:分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的缺失型下游寡核苷酸序列包括:以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列,或其任何组合。
在某些示例性实施方案中,本发明方法所使用的检测探针包含:分别如SEQ IDNO:2-8所示的7种检测探针,所使用的媒介子探针包含:分别如SEQ ID NO:12、17、22、27、32、37、42、47、53、58所示的10种野生型媒介子探针和分别如SEQ ID NO:13、18、23、28、33、38、43、48、54、59所示的10种缺失型媒介子探针。优选地,本发明方法所使用的上游和下游寡核苷酸序列包含:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列。更优选地,所述方法还使用通用引物(例如,如SEQ ID NO:1所示的通用引物)。此类实施方案例如可用于检测选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del的PAH基因大片段缺失。
还易于理解的是,针对使用一种检测探针的方法而详细描述的各种技术特征同样可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。例如,上文针对待检测的样品、靶核酸序列、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、检测探针、允许核酸杂交的条件、允许切割媒介子探针的条件、具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶、允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件、核酸聚合酶、熔解曲线分析、步骤的重复等所作的各种详细描述均可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。因此,在某些优选的实施方案中,本发明的使用两种或更多种检测探针的方法可涉及如上文所详细描述的任一项或多项技术特征,或所述技术特征的任何组合。
例如,如上文所描述的,可根据需要,重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中,重复进行步骤(1)-(2)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤。易于理解,步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段,用于后续的步骤(即,步骤(3)-(5))。因此,在某些优选的实施方案中,通过下列方案来进行本发明的方法:重复步骤(1)-(2)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤;随后进行步骤(3)-(5)。
在某些优选的实施方案中,重复进行步骤(1)-(4)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤。易于理解,步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体,用于后续的步骤(即,步骤(5))。因此,在某些优选的实施方案中,通过下列方案来进行本发明的方法:重复步骤(1)-(4)一次或多次,并且在每一次重复之前,进行一次核酸变性的步骤;随后进行步骤(5)。
在某些优选的实施方案中,本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行:
(a)提供m种检测探针,并且针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;并且,任选地,提供一种通用引物;其中,所述检测探针、媒介子探针对、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义;
(b)将待检测的样品与所提供的检测探针、媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列、以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如,DNA聚合酶,特别是热稳定的DNA聚合酶)混合;并且任选地,添加通用引物;
(c)在允许核酸变性的条件下,温育前一步骤的产物;
(d)在允许核酸退火或杂交的条件下,温育前一步骤的产物;
(e)在允许核酸延伸的条件下,温育前一步骤的产物;和
(f)任选地,重复步骤(c)-(e)一次或多次。
关于步骤(a)-(f),其已详细描述于上文中。
任选的步骤(6)以及定量/半定量检测
本发明的方法既可用于核苷酸片段缺失类型的定性检测,又可用于核苷酸片段缺失含量的定量或半定量检测。易于理解,当某种核苷酸片段缺失在样品中的含量越高时,其缺失型靶核酸序列的含量就越高,相应地,步骤(1)中,与所述缺失型靶核酸序列杂交的缺失型媒介子探针就越多;进而,步骤(2)中发生切割的缺失型媒介子探针也越多,释放的缺失型媒介子片段也越多;进而,步骤(3)和(4)中,与检测探针杂交的缺失型媒介子片段也越多,因延伸反应而产生的双链体也越多;进而,在步骤(5)中,能够进行溶解曲线分析的双链体也越多,所产生的信号也越强,所获得的熔解峰的高度也越高。因此,通过熔解峰的相对高度,可判断样品中的相应缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列的含量/水平(定量或半定量检测)。因此,本发明的方法不仅可用于检测两种或更多种核苷酸片段缺失在样品中的存在,而且可用于检测所述两种或更多种核苷酸片段缺失在样品中的水平。
因此,在某些优选的实施方案中,本发明的方法还包括下述步骤:
(6)根据熔解曲线分析的结果(特别是熔解曲线中的熔解峰的峰高),确定与各个熔解峰对应的缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列的水平。
探针组和试剂盒
在另一个方面,本发明提供了一种探针组(probe set),其包含一种检测探针,以及至少一对媒介子探针对,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针,其中,
所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;所述缺失型靶核酸序列是包含核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;和
所述检测探针从3'至5'方向包含,与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
在某些优选的实施方案中,所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列彼此均不同。
在某些优选的实施方案中,所述探针组还包含针对每一种缺失型靶核酸序列的缺失型上游寡核苷酸序列和缺失型下游寡核苷酸序列、以及针对每一种野生型靶核酸序列的野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
在某些优选的实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于断点的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于断点的下游。
在某些优选的实施方案中,所述探针组包含至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少12对、至少15对、或至少20对媒介子探针对。
易于理解的是,此类探针组可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此,上文针对媒介子探针对(缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针)、缺失型/野生型上游寡核苷酸序列、缺失型/野生型下游寡核苷酸序列和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于探针组中的媒介子探针对、缺失型/野生型上游寡核苷酸序列、缺失型/野生型下游寡核苷酸序列和检测探针。因此,在某些优选的实施方案中,所述探针组包含如上文所定义的媒介子探针对。在某些优选的实施方案中,所述探针组包含如上文所定义的缺失型/野生型上游寡核苷酸序列。在某些优选的实施方案中,所述探针组包含如上文所定义的缺失型/野生型下游寡核苷酸序列。在某些优选的实施方案中,所述探针组包含如上文所定义的检测探针。
在某些优选的实施方案中,所有媒介子探针对各自靶向(特异于)不同的核苷酸片段缺失。在本文中,表述“媒介子探针对靶向(特异于)某一核苷酸片段缺失”是指,所述媒介子探针对中的缺失型媒介子探针可用于实施本发明方法来检测含有该核苷酸片段缺失的缺失型靶核酸序列,并且所述媒介子探针对中的野生型媒介子探针可用于实施本发明方法来检测不含有该核苷酸片段缺失的野生型靶核酸序列,并且该媒介子探针对不能用于检测含有其他核苷酸片段缺失的序列或其野生型。在某些优选的实施方案中,所有媒介子探针对中的每个媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同;并且,所有媒介子探针对中的每个媒介子探针所包含的靶向序列彼此不同。
在某些优选的实施方案中,所述探针组包含1对、2对、3对、4对、5对、6对、7对、8对、9对、10对或更多对媒介子探针对。优选地,所述媒介子探针对特异于1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种核苷酸片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;在此类实施方案中,所述核苷酸片段缺失亦可称为大片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del等,或其任何组合。关于PAH基因突变的详细描述可进一步参见国际PAH基因突变数据库(http://www.pahdb.mcgil1.ca)。
在某些优选的实施方案中,所述探针组包含1种检测探针,以及1-3对(例如,1,2或3对)的媒介子探针对。由此,所述探针组可用于同时检测1-3种(例如1,2或3种)核苷酸片段缺失。
在某些优选的实施方案中,所述探针组还包含,如上文所定义的通用引物。例如,在某些优选的实施方案中,所述的上游寡核苷酸序列(缺失型/野生型)和下游寡核苷酸序列(缺失型/野生型)的5'端含有一段相同的寡核苷酸序列;由此,所述探针组可进一步包含通用引物(例如SEQ ID NO:1所示的通用引物),其具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列。
在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的一种或多种媒介子探针对:
(1)如SEQ ID NO:12所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:13所示的缺失型媒介子探针;
(2)如SEQ ID NO:17所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:18所示的缺失型媒介子探针;
(3)如SEQ ID NO:22所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:23所示的缺失型媒介子探针;
(4)如SEQ ID NO:27所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:28所示的缺失型媒介子探针;
(5)如SEQ ID NO:32所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:33所示的缺失型媒介子探针;
(6)如SEQ ID NO:37所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:38所示的缺失型媒介子探针;
(7)如SEQ ID NO:42所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:43所示的缺失型媒介子探针;
(8)如SEQ ID NO:47所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:48所示的缺失型媒介子探针;
(9)如SEQ ID NO:53所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:54所示的缺失型媒介子探针;和
(10)如SEQ ID NO:58所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:59所示的缺失型媒介子探针。
在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的检测探针:如SEQ ID NO:2所示的检测探针,如SEQ ID NO:3所示的检测探针,如SEQ ID NO:4所示的检测探针,如SEQID NO:5所示的检测探针,如SEQ ID NO:6所示的检测探针,如SEQ ID NO:7所示的检测探针,如SEQ ID NO:8所示的检测探针,或其任何组合。
在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的野生型上游寡核苷酸序列:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的野生型下游寡核苷酸序列:分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的缺失型上游寡核苷酸序列:分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,或其任何组合。在某些示例性实施方案中,所述探针组包含选自下列的缺失型下游寡核苷酸序列:以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列,或其任何组合。
在另一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包含一种或多种如上文所定义的探针组。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有媒介子探针对各自靶向不同的靶核酸序列。在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同。在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶向序列彼此不同。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有检测探针包含相同的报告基团。在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。在某些优选的实施方案中,所述试剂盒中的所有检测探针所包含的报告基团彼此不同。
在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含:分别如SEQ ID NO:2-8所示的7种检测探针,以及,分别如SEQ ID NO:12、17、22、27、32、37、42、47、53、58所示的10种野生型媒介子探针和分别如SEQ ID NO:13、18、23、28、33、38、43、48、54、59所示的10种缺失型媒介子探针;优选地,所述试剂盒还包含:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列;任选地,所述试剂盒还包含:如SEQ ID NO:1所示的通用引物。此类试剂盒例如可用于检测选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del的PAH基因大片段缺失。
本申请还提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含m种检测探针和n对媒介子探针对,其中,n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数),m为小于2n且大于0的整数,并且,每一对媒介子探针对各自独立地包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;所述缺失型靶核酸序列是包含核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;和
每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含,与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templatingsequence);并且,所述m种检测探针包含多种(例如至少2n种)捕获序列,其分别与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补;并且,
每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
在某些优选实施方案中,所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列彼此均不同。
在某些优选实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del等,或其任何组合。关于PAH基因突变的详细描述可进一步参见国际PAH基因突变数据库(http://www.pahdb.mcgil1.ca)。
在本发明的示例性实施方案中,m种检测探针包含多种捕获序列,所述多种捕获序列的集合涵盖了步骤(1)提供的所有缺失型和野生型媒介子探针中的媒介子序列或其部分的互补序列,由此,所述m种检测探针或所述多种捕获序列能够“捕获”从任何缺失型或野生型媒介子探针上切割下来的媒介子片段。即,从缺失型或野生型媒介子探针上切割下来的任何媒介子片段能够与至少一种检测探针或至少一种捕获序列杂交。
在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还包含针对每一种缺失型靶核酸序列的缺失型上游寡核苷酸序列和缺失型下游寡核苷酸序列、以及针对每一种野生型靶核酸序列的野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
在某些优选的实施方案中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同。在此类实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
在某些优选的实施方案中,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于断点的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于断点的下游。
在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种检测探针(也即,m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10的整数)。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含1-10种检测探针(也即,m为1-10的整数;例如,m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。进一步优选地,所述检测探针各自标记有相同或不同的报告基团。
在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、或至少10种检测探针;以及,至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少8对、至少10对、至少15对、至少20对、至少25对、或至少30对媒介子探针对。由此,所述试剂盒可用于对多种核苷酸片段缺失进行同时检测,其中可检测的核苷酸片段缺失的最大数目等于所使用的媒介子探针对的数目。
例如,在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含1种检测探针和1-3对(例如1,2或3对)媒介子探针对,可用于对1-3种(例如1,2或3种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含2种检测探针和2-6对(例如2,3,4,5,或6对)媒介子探针对,可用于对2-6种(例如2,3,4,5或6种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含3种检测探针和2-9对(例如2,3,4,5,6,7,8或9对)媒介子探针对,可用于对2-9种(例如2,3,4,5,6,7,8或9种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含4种检测探针和3-12对(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11或12对)媒介子探针对,可用于对3-12种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11或12种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含5种检测探针和3-15对(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15种)媒介子探针对,可用于对3-15种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含6种检测探针和4-18对(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17或18对)媒介子探针对,可用于对4-18种(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17或18种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含7种检测探针和4-21对(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或21对)媒介子探针对,可用于对4-21种(例如4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或21种)核苷酸片段缺失及其野生型进行同时检测。在某些示例性实施方案中,本发明的方法使用7种检测探针和10对媒介子探针对,实现了对10种核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测。
易于理解的是,此类试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此,上文针对媒介子探针对(缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针)、缺失型/野生型上游寡核苷酸序列、缺失型/野生型下游寡核苷酸序列和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于试剂盒中的媒介子探针对、缺失型/野生型上游寡核苷酸序列、缺失型/野生型下游寡核苷酸序列和检测探针。
在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含:分别如SEQ ID NO:2-8所示的7种检测探针,以及,分别如SEQ ID NO:12、17、22、27、32、37、42、47、53、58所示的10种野生型媒介子探针和分别如SEQ ID NO:13、18、23、28、33、38、43、48、54、59所示的10种缺失型媒介子探针;优选地,所述试剂盒还包含:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列;任选地,所述试剂盒还包含:如SEQ ID NO:1所示的通用引物。此类试剂盒例如可用于检测选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del的PAH基因大片段缺失。
在某些优选的实施方案中,此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。
例如,在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还可包含如上文所定义的通用引物、具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶、核酸聚合酶、或其任何组合。在某些优选的实施方案中,所述试剂盒还可包含,用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合。此类试剂可由本领域技术人员常规地确定,并且包括但不限于,酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白(Single Strand DNA-Binding Protein,SSB)、或其任何组合。例如,用于进行逆转录的试剂包括但不限于,逆转录酶,逆转录酶的工作缓冲液,Oligo d(T),dNTPs,不含核酸酶的水,Rnase抑制剂,或其任何组合。
探针组的用途
本申请还涉及,如上文所定义的探针组用于制备试剂盒的用途,所述试剂盒用于检测核苷酸片段缺失在样品中的核酸分子中的存在或水平,或者用于诊断受试者是否具有所述核苷酸片段缺失和/或患有由所述核苷酸片段缺失所导致的疾病。
在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;在此类实施方案中,所述核苷酸片段缺失亦可称为大片段缺失。在某些优选的实施方案中,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失。在此类实施方案中,所述由所述核苷酸片段缺失所导致的疾病是苯丙氨酸羟化酶缺乏症。在某些优选的实施方案中,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del,或其任何组合。易于理解的是,所述探针组或试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此,上文针对核苷酸片段缺失、探针组、试剂盒、以及其所包含的各种组分(例如,媒介子探针对、检测探针、缺失型/野生型上游寡核苷酸序列、缺失型/野生型下游寡核苷酸序列、通用引物、具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶、核酸聚合酶、用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合)所详细描述的各种技术特征同样可应用于此。
本领域技术人员基于本申请所详细描述的原理,可对本发明技术方案的各种技术特征进行修饰、替换或组合,而不背离本发明的精神和范围。所有此类技术方案以及其变形都涵盖在本申请的权利要求书或其等同物的范围内。
发明的有益效果
与现有技术相比,本发明的技术方案具有以下有益效果:
(1)本发明的方法、探针组和试剂盒能够在仅使用一种标记探针(即,检测探针)的情况下,实现对多种核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测(多重检测)。
(2)本发明的方法能够实现对多种核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测(多重检测),并且能够同时检测核苷酸片段缺失及其野生型的最大数目远远超出了所使用的标记探针(即,检测探针)的数目。
因此,本发明提供了一种简单、高效、低成本的多重检测法,其能够同时检测多种核苷酸片段缺失及其野生型。本发明方法能够检测的核苷酸片段缺失及其野生型的最大数目不受限于所使用的标记探针(即,检测探针)的数目。也即,本发明方法能够基于相对有限数目的标记探针(即,检测探针)实现对显著更多数量的核苷酸片段缺失及其野生型的同时检测(多重检测),这是特别有利的。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1示意性地描述了使用1种检测探针和1种缺失型媒介子探针、1种野生型媒介子探针来检测1种核苷酸片段缺失及其野生型的示例性实施方案,以阐释本发明方法的基本原理。
在该实施方案中,如图1A所示,提供一种自淬灭检测探针(其携带荧光基团和淬灭基团),和媒介子探针,所述媒介子探针由5′端的媒介子序列和3′端的靶向序列组成,所述媒介子序列与检测探针互补,所述靶向序列与待测靶核酸序列互补。图1B为该实施方案的原理示意图,针对不含有该核苷酸片段缺失的野生型靶核酸序列,分别设计并提供提供一条上游引物(共用引物),一条下游引物(下游引物1),以及一条野生型媒介子探针,其中,所述野生型媒介子探针由5′端的野生型媒介子序列和3′端的野生型靶向序列组成,所述野生型媒介子序列能够与检测探针杂交,所述野生型靶向序列与野生型靶核酸序列杂交的区域位于缺失片段内;针对含有该核苷酸片段缺失的缺失型靶核酸序列,分别设计并提供提供一条上游引物(共用引物,位于断点上游),一条下游引物(下游引物2,位于断点下游),以及一条缺失型媒介子探针;其中,所述缺失型媒介子探针由5′端的缺失型媒介子序列和3′端的缺失型靶向序列组成,所述缺失型媒介子序列能够与检测探针杂交,所述缺失型靶向序列与缺失型靶核酸序列杂交的区域位于断点下游。在进行PCR扩增时,若只存在野生型模板,上游引物和野生型特异下游引物扩增并切下野生型媒介子探针的野生型媒介子序列,所述野生型媒介子与检测探针杂交并延伸,而缺失型下游特异引物由于离上游引物太远而无法扩增;若只存在缺失型模板,上游引物和缺失型特异下游引物进行扩增并切下缺失型媒介子探针的缺失型媒介子,所述缺失型媒介子与检测探针杂交并延伸,而野生型媒介子探针和特异下游引物位于缺失片段内,无法扩增;若野生型和缺失型两种模板同时存在,则两种媒介子探针都能被切下媒介子序列;随后,被切下的缺失型媒介子序列和野生型媒介子序列分别杂交至检测探针的不同位置,并被核酸聚合酶延伸,从而产生2种延伸产物;这2种延伸产物各自具有不同的长度,并且与检测探针一起形成了2种不同的双链体。如图1C所示,根据媒介子序列与检测探针杂交位置不同,导致延伸产物与检测探针杂交的双链体的Tm值不同,通过熔解曲线分析,可确定具有特定Tm值的双链体的存在,并进而可确定与该双链体对应的靶核酸分子的存在。一条荧光标记的检测探针与多条片段长度不一的延伸产物杂交,可形成多个Tm值,因此实现单通道内多个对象的检测。
图2显示了单种PAH基因Ex6del缺失的检测结果。
图3显示使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案,对十种PAH基因缺失的同时检测的检测结果。
图4显示使用使用表1中描述的试剂和表2中描述的检测方案,对不同浓度野生型基因组灵敏度检测结果。
本申请所涉及的序列(SEQ ID NO:1-59)的信息提供于表1中。
表1:实施例反应体系所涉试剂的序列信息(SEQ ID NO:1-59)
注:前面带有“+”的碱基为锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)修饰的碱基。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是,这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果,而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理,利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念,并且涵盖在本发明的范围内。
本申请实施例中所使用的检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸(上游引物)、下游寡核苷酸(下游引物)和通用引物的详细信息,以及它们的工作浓度(除特定实施例再给出工作浓度外)已概述于表1中。其中检测对象是10种中国人群常见的PAH基因大片段缺失类型,其HGVS命名分别是c.-4163_-406del3758(简称“Ex1del3.7kb”),c.-1932_60+3337delins56(简称“Ex1del5.3kb”),c.353-8714_441+2813del11612(简称“Ex4del”),c.442-5521_509+2161delins3(简称“Ex5del”),c.353-1069_510+4247del16271(简称“Ex4_5del”),c.510-6708_706+888delins2(简称“Ex6del”),c.169-4948_352+1467delins8(简称“Ex3del6.6kb”),c.169-655_352+3942del4765(简称“Ex3del4.7kb”)],c.456_706+138del11653(简称“Ex5_6del”),c.[353-6071_441+4081delins7;441+8099_842+518del](简称“Ex4_7del”)。在表1描述的各种检测探针和媒介子探针中,检测探针1和2标记有ROX和BHQ2,其荧光信号通过ROX通道进行检测;检测探针3和4标记有FAM和BHQ1,其荧光信号通过FAM通道进行检测;检测探针5标记有HEX和BHQ1,其荧光信号通过HEX通道进行检测;检测探针6和7标记有Cy5和BHQ2,其荧光信号通过Cy5通道进行检测。
实施例1.单种PAH基因大片段缺失的检测
本实施例中,使用表1中的检测探针2、以及针对Ex6del缺失设计的3条引物(上游引物5F和下游引物5R和5R′)和媒介子探针5P和5P′,对Ex6del缺失进行检测和基因分型。具体配制方式如下:5μL反应体系中含有1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH4)2SO4,6.7μM EDTA,0.085mg/mL牛血清白蛋白),5mM MgCl2,0.2mM dNTPs,1U Taq HS(TaKaRa,大连),0.1μM检测探针2,0.4μM各上下游引物,0.4μM各媒介子探针,5μL人类基因组DNA(浓度约为10ng/μL)。
PCR扩增程序为:95℃预变性5min;95℃变性20s,65℃-56℃(每个循环下降1℃)退火40s,76℃延伸20s,10个循环;95℃变性20s,55℃退火40s,76℃延伸20s,50个循环;35℃媒介子延伸30min;随后进行熔解曲线分析,程序为:95℃变性1min,37℃保温3min,从40℃-95℃进行熔解曲线分析,升温速率为0.4℃/s,,同时检测ROX 4个通道的荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。检测结果如图2所示。
图2的结果显示,没有Ex6del缺失的(野生型)样本只有80.5℃野生型熔解峰,EX6del纯合缺失型对应只有86.5℃缺失型熔解峰,而未加入模板的空白对照(NTC)无任何熔解峰。该结果表明,所设计的检测体系可用于准备检测PAH基因大片段缺失。
实施例2. 10种PAH基因大片段缺失的同时检测和基因分型
通过使用表1中提供的试剂(7种检测探针、10种缺失型媒介子探针、10种野生型媒介子探针、14种上游引物、17种下游引物和1种通用引物),本发明的方法在只使用7种荧光探针(检测探针)的情况下,即能够对10种核苷酸片段缺失和10种相应的野生型进行同时检测(二十重检测)。所使用的荧光检测通道以及所检测的熔解峰的熔点概述于表2中。
表2:检测方案
简言之,本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行PCR扩增和熔解曲线分析,所述PCR反应体系包括:1×buffer A(67mM Tris-HCl,16.6mM(NH4)2SO4,6.7μM EDTA,0.085mg/mL牛血清白蛋白),13mM MgCl2,1.2mM dNTPs,4U Taq HS(TaKaRa,大连),表1中描述的各种试剂(以指定的工作浓度使用),5μL人类基因组DNA(样本包括:野生型样本;分别包含Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del的10种杂合缺失样本;分别包含Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del的10种纯合缺失样本)。PCR扩增程序为:95℃预变性5min;95℃变性20s,65℃-56℃(每个循环下降1℃)退火40s,76℃延伸20s,10个循环;95℃变性20s,55℃退火40s,76℃延伸20s,50个循环;35℃媒介子延伸30min;随后进行熔解曲线分析,程序为:95℃变性1min,37℃保温3min,从40℃-95℃进行熔解曲线分析,升温速率为0.4℃/s,,同时检测ROX 4个通道的荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。检测结果如图3和图4所示。
图3的结果显示,野生型的样本(图3黑色实线)只能产生10个野生型熔解峰;10种缺失类型的PAH基因杂合缺失型样本(图3灰色实线),除了产生10个野生型熔解峰,还会产生缺失型对应的缺失型熔解峰;10种缺失类型的PAH基因纯合缺失型样本(图3黑色虚线)具有除该缺失类型外的其他9个野生型峰,同时还具有该缺失类型的缺失峰。这一结果表明,对于各种含有不同PAH基因缺失的样本,所设计的检测体系可以获得正确的结果和对应的基因型具有很强的特异性。综上,对于任一待测样本,所设计的检测体系均可根据检测结果中熔解峰的个数及熔点的高低即可判定待测样本是否含有PAH基因缺失及缺失的类型。
图4为10倍梯度稀释的不同浓度梯度(50ng/反应-50pg/反应)野生型基因组样本的检测结果,结果显示,浓度梯度的野生型模板都能检测到10个野生型熔解峰,检测结果为对应的野生型结果。因此,本发明方法和试剂盒可检测低至50pg/反应基因组DNA即15拷贝的人基因组DNA,具有很高的检测灵敏度。
上述实验结果表明,利用所设计的检测体系和试剂(特别是所设计的10条缺失型媒介子探针、10条野生型媒介子探针和7条荧光探针),可在单次的测定中实现对十种PAH基因缺失及其野生型的同时检测和基因分型。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种检测核苷酸片段缺失的方法和试剂盒
<130> IDC180225
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物
<400> 1
gcaagccctc acgtagcgaa 20
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针1
<400> 2
cgagcaaaaa gaagtgtgag aggtgtgatg agctcg 36
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针2
<400> 3
cggcggagtg ggcacggaga gcgctggaca gtgtggaccc acgtctcgca gcaggccgcc 60
g 61
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针3
<400> 4
aagcccaaaa aagagaacag tatcagtcac acggggctt 39
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针4
<400> 5
gcgcgccagc ggacgaggct gtgcaccggt cggaggtggg ggcgcgc 47
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针5
<400> 6
gctgcaaaaa actcaacgat gtggaagtca gcagc 35
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针6
<400> 7
ccggcgggga gggaccgtcg tggcaggagg agcagctcac caggccgccg g 51
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测探针7
<400> 8
atcgccataa aagatagacc agagagagtc agagcggcga t 41
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物1F(野生型)
<400> 9
gcaagccctc acgtagcgaa ctggaatgtc agccctaac 39
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物1F′(缺失型)
<400> 10
gcaagccctc acgtagcgaa gattgaattt gggccatttg t 41
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物1R(共用)
<400> 11
gcaagccctc acgtagcgaa gagacatcca attgttgaaa aaga 44
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针1P(野生型)
<400> 12
gtctatcttt tatccaggat ctagcactta ctacatgcat gtg 43
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针1P′(缺失型)
<400> 13
gactgatact gtatgcactc ccttttaata ggcaagaaac tgag 44
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物2F(野生型)
<400> 14
gcaagccctc acgtagcgaa ttcgttcttg ttgcccag 38
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物2F′(缺失型)
<400> 15
gcaagccctc acgtagcgaa cctaagccct tcatctagag ac 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物2R(共用)
<400> 16
gcaagccctc acgtagcgaa gcttgacaaa catggtgaaa tc 42
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针2P(野生型)
<400> 17
ctggtctatc ttgcctgtaa tcccagctac tcaagagg 38
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针2P′(缺失型)
<400> 18
cgtgtgactg atcttgaagt gcttactgac acgtttttta atacatgt 48
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物3F(共用)
<400> 19
gcaagccctc acgtagcgaa gagatccctt ttattcatct ggt 43
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物3R(野生型)
<400> 20
gcaagccctc acgtagcgaa cagcagtggt cagaagt 37
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物3R′(缺失型)
<400> 21
gcaagccctc acgtagcgaa gccaagcatt tagcattgt 39
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针3P(野生型)
<400> 22
cacctctcac tgttctctct gttcacatgg aaaaataaga atccc 45
<210> 23
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针3P′(缺失型)
<400> 23
tcatcacacc taggagctaa tgcttcttga gcaggggtca tcacacctag gagctaatgc 60
ttcttgagca gggg 74
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物4F(共用)
<400> 24
gcaagccctc acgtagcgaa gtcttaacct ttctactagg cag 43
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物4R(野生型)
<400> 25
gcaagccctc acgtagcgaa gctcactctg tgctctaag 39
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物4R′(缺失型)
<400> 26
gcaagccctc acgtagcgaa cccctgaagt ctaaagcagt 40
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针4P(野生型)
<400> 27
ccacgacggt caacttattg gtcttctaaa aagccagcat ctactttgaa 50
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针4P′(缺失型)
<400> 28
agcgctctcc gggatgagca gccccaataa ctgc 34
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物5F(共用)
<400> 29
gcaagccctc acgtagcgaa ttcctttggg tatgtacctc a 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物5R(野生型)
<400> 30
gcaagccctc acgtagcgaa gaaagactgt ggcaattcct c 41
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物5R′(缺失型)
<400> 31
gcaagccctc acgtagcgaa cccaaaaggt catctaactc ac 42
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针5P(野生型)
<400> 32
gtccacactg tcctaaaaac agaaatacca tttgacccag ca 42
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针5P′(缺失型)
<400> 33
acactgtcca gcctggctac aacttccctt cctgcc 36
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物6F(野生型)
<400> 34
gcaagccctc acgtagcgaa tgagaatcct gactgtttca 40
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物6F′(缺失型)
<400> 35
gcaagccctc acgtagcgaa tctacaagac aggaatccta gt 42
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物6R(共用)
<400> 36
gcaagccctc acgtagcgaa tgggaagcga gttctctg 38
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针6P(野生型)
<400> 37
cccacctccg aatccgcccc ccttaccccc 30
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针6P′(缺失型)
<400> 38
gaccggtgca cccatgctat gaatagttta tcatcatatt ttctaccc 48
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物7F(共用)
<400> 39
gcaagccctc acgtagcgaa gccagacttg tctccaact 39
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物7R(野生型)
<400> 40
gcaagccctc acgtagcgaa cttgctggtc ttaattatac ctg 43
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物7R′(缺失型)
<400> 41
gcaagccctc acgtagcgaa caactttgac attttgagca 40
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针7P(野生型)
<400> 42
tctgactctc tactgagcat ttactatgtg ccaagtggtg 40
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针7P′(缺失型)
<400> 43
ctctctctgg taaacccaac ttttattaca tgatgcctct atgtga 46
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物8F(共用)
<400> 44
gcaagccctc acgtagcgaa gacctcttcc tatgaagcct 40
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物8R(野生型)
<400> 45
gcaagccctc acgtagcgaa tcttcccctc aacaagca 38
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物8R′(缺失型)
<400> 46
gcaagccctc acgtagcgaa tgaatgaaag tggataaaca cag 43
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针8P(野生型)
<400> 47
gcacagcctc gcctacaact accgccagta agtctg 36
<210> 48
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针8P′(缺失型)
<400> 48
cctggtgagc tttcactgtg ctctgccttc cctc 34
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物9F(野生型)
<400> 49
gcaagccctc acgtagcgaa gccacatcag ggatcgac 38
<210> 50
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物9R(野生型)
<400> 50
gcaagccctc acgtagcgaa ggtcagacct aaccattaag a 41
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物9F′(缺失型)
<400> 51
gcaagccctc acgtagcgaa ggtaacactt gttagagttt ggt 43
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物9R′(缺失型)
<400> 52
gcaagccctc acgtagcgaa ctgttagtct ggaggtgga 39
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针9P(野生型)
<400> 53
ctctcacact tccctgctct ccaacatgac agct 34
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针9P′(缺失型)
<400> 54
ttccacatcg tgtgctatgt ccatttggaa caggtctt 38
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物10F(共用)
<400> 55
gcaagccctc acgtagcgaa cttccttcct tccttatctt gt 42
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物10R(野生型)
<400> 56
gcaagccctc acgtagcgaa gggttacagg aaacaagata ca 42
<210> 57
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物10R′(缺失型)
<400> 57
gcaagccctc acgtagcgaa gctggaggcc attatcctta g 41
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针10P(野生型)
<400> 58
ctcctgccac gaccatgggt actttgttgt accggg 36
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 媒介子探针10P′(缺失型)
<400> 59
atactgttct ctctttggtt ttctcttcca ttagtttgct aagg 44
Claims (39)
1.一种检测n种核苷酸片段缺失在样品中的核酸分子中的存在的方法,其中,n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数),并且,所述方法包括以下步骤:
(1)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述缺失型靶核酸序列是包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的下游,且所述野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所有缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列、所有野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;
并且,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列接触;
(2)在允许切割媒介子探针及核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触;
(3)提供m种检测探针,并且在允许核酸杂交的条件下,将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触,其中,
m为小于2n且大于0的整数,并且,
每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含,与一种或多种缺失型媒介子序列或其部分或一种或多种野生型媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述m种检测探针包含多种(例如至少2n种)捕获序列,其分别与步骤(1)中提供的每一种缺失型媒介子探针的缺失型媒介子序列或其部分以及每一种野生型媒介子探针的野生型媒介子序列或其部分互补;并且,
每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;并且,
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触;
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定每一种缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是否存在于所述样品中,并确定每一种核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中的核酸分子中。
2.权利要求1的方法,其中,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;
优选地,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失;优选地,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del,或其任何组合。
3.权利要求1或2的方法,其中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp;和/或,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
5.权利要求1-3任一项的方法,其中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
6.权利要求1-3任一项的方法,其中,在步骤(1)中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
7.权利要求1-6任一项的方法,其中,m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9或≥10的整数(例如,m为1、2、3、4、5、6、7或8);优选地,当m≥2时,所述m种检测探针各自标记有相同或不同的报告基团。
8.权利要求1-6任一项的方法,其中,步骤(1)提供了至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少8对、至少10对、至少15对、至少20对、至少25对、或至少30对媒介子探针对;并且,步骤(3)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种检测探针。
9.权利要求1-6任一项的方法,其中,所述m种检测探针包含相同的报告基团;并且,在步骤(5)中,对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析,并根据所获得的熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种核苷酸片段缺失的存在。
10.权利要求1-6任一项的方法,其中,所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同;并且,在步骤(5)中,在对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时,分别实时监测每一种报告基团的信号,由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线;随后,根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种核苷酸片段缺失的存在。
11.权利要求1-6任一项的方法,其中,m=1,并且n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数);
优选地,所述方法包括下述步骤:
(1)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,缺失型上游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于缺失型靶向序列的下游,且当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;其中,所述缺失型靶核酸序列是包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于野生型靶向序列的下游,且野生型靶向序列与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交;其中,所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
并且,所有缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列、所有野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;
并且,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列接触;
(2)在允许切割媒介子探针及核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触;
(3)在允许核酸杂交的条件下,将步骤(2)的产物与检测探针接触,所述检测探针从3'至5'方向包含,与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及每一种野生型媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触;
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析;并根据熔解曲线分析的结果,确定每一种缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是否存在于所述样品中,并确定每一种核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中。
12.权利要求1-11任一项的方法,其中,所述方法具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述样品包含或是DNA、或RNA、或核酸的混合物;
(2)所述缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是DNA或RNA;
(3)所述缺失型靶核酸序列和/或野生型靶核酸序列是单链的或双链的。
13.权利要求1-12任一项的方法,其中,所述缺失型媒介子探针和/或野生型媒介子探针具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸,经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成;
(2)所述缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针的长度各自独立地为15-1000nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt,900-1000nt;
(3)所述缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针中的靶向序列的长度各自独立地为10-500nt,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-150nt,150-200nt,200-250nt,250-300nt,300-350nt,350-400nt,400-450nt,450-500nt;
(4)所述缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针中的媒介子序列的长度各自独立地为5-140nt,例如5-10nt,10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt;和
(5)所述缺失型媒介子探针及野生型媒介子探针各自独立地具有3'-OH末端,或者其3'-末端是封闭的。
14.权利要求1-13任一项的方法,其中,所述缺失型上游寡核苷酸序列和/或野生型上游寡核苷酸序列具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述缺失型上游寡核苷酸序列及野生型上游寡核苷酸序列各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸,经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成;
(2)所述缺失型上游寡核苷酸序列及野生型上游寡核苷酸序列的长度各自独立地为15-150nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt,140-150nt;
(3)所述缺失型上游寡核苷酸序列在与缺失型靶核酸序列杂交后,各自独立地位于缺失型媒介子探针的上游远端,或位于缺失型媒介子探针的上游邻近,或与缺失型媒介子探针的靶向序列具有部分重叠的序列;和/或,所述野生型上游寡核苷酸序列在与野生型靶核酸序列杂交后,各自独立地位于野生型媒介子探针的上游远端,或位于野生型媒介子探针的上游邻近,或与野生型媒介子探针的靶向序列具有部分重叠的序列;和
(4)所述缺失型上游寡核苷酸序列各自独立地为特异于缺失型靶核酸序列的引物或者特异于缺失型靶核酸序列的探针;和/或,所述野生型上游寡核苷酸序列各自独立地为特异于野生型靶核酸序列的引物或者特异于野生型靶核酸序列的探针。
15.权利要求1-14任一项的方法,其中,所述缺失型下游寡核苷酸序列和/或野生型下游寡核苷酸序列具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述缺失型下游寡核苷酸序列及野生型下游寡核苷酸序列各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸,经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成;和
(2)所述缺失型下游寡核苷酸序列及野生型下游寡核苷酸序列的长度各自独立地为15-150nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-110nt,110-120nt,120-130nt,130-140nt,140-150nt。
16.权利要求1-15任一项的方法,其中,所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的DNA聚合酶;
优选地,所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌:Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermusflavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcuslitoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcushorikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifexaeolieus;特别优选地,所述DNA聚合酶为Taq聚合酶;
优选地,在步骤(2)中,所述具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶催化上游寡核苷酸序列的延伸,并诱导媒介子探针的切割。
17.权利要求1-16任一项的方法,其中,步骤(1)中提供的所有缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列;
优选地,在步骤(1)中,除了所述媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列之外,还提供一种通用引物,所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列;然后,在允许核酸杂交的条件下,将所述样品与所提供的媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列和通用引物接触;
优选地,所述通用引物具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述通用引物包含或者由天然存在的核苷酸,经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成;和
(2)所述通用引物的长度为8-50nt,例如8-15nt,15-20nt,20-30nt,30-40nt,或40-50nt。
18.权利要求1-17任一项的方法,其中,所述检测探针包含多种捕获序列;并且,所述多种捕获序列以相邻的方式、以间隔有连接序列的方式,或者以重叠的方式排列。
19.权利要求1-18任一项的方法,其中,所述检测探针具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸,经修饰的核苷酸,非天然的核苷酸,或其任何组合组成;
(2)所述检测探针的长度各自独立地为15-1000nt,例如15-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt,900-1000nt;
(3)所述检测探针中的每一种捕获序列的长度各自独立地为10-500nt,例如10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-150nt,150-200nt,200-250nt,250-300nt,300-350nt,350-400nt,400-450nt,450-500nt;
(4)所述检测探针中的模板序列的长度各自独立地为1-900nt,例如1-5nt,5-10nt,10-20nt,20-30nt,30-40nt,40-50nt,50-60nt,60-70nt,70-80nt,80-90nt,90-100nt,100-200nt,200-300nt,300-400nt,400-500nt,500-600nt,600-700nt,700-800nt,800-900nt;
(5)所述检测探针各自独立地具有3'-OH末端,或者其3'-末端是封闭的;
(6)所述检测探针各自独立地为自淬灭探针;例如,所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团,或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团;优选地,所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离;
(7)所述检测探针中的报告基团各自独立地为荧光基团(例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CALGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar705);并且,淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA);
(8)所述检测探针各自独立地具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性,例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性;例如,所述检测探针的主链各自独立地包含抵抗核酸酶活性的修饰,例如硫代磷酸酯键,烷基磷酸三酯键,芳基磷酸三酯键,烷基膦酸酯键,芳基膦酸酯键,氢化磷酸酯键,烷基氨基磷酸酯键,芳基氨基磷酸酯键,2'-O-氨基丙基修饰,2'-O-烷基修饰,2'-O-烯丙基修饰,2'-O-丁基修饰,和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰;
(9)所述检测探针各自独立地是线性的,或者具有发夹结构。
20.权利要求1-19任一项的方法,其中,在步骤(4)中,在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下,所述核酸聚合酶以检测探针为模板,对杂交至检测探针的缺失型媒介子片段和/或野生型媒介子片段进行延伸,并由此形成双链体;
优选地,步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。
21.权利要求1-20任一项的方法,其中,步骤(1)-(4)通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行:
(a)提供m种检测探针,并且针对待检测的每一种核苷酸片段缺失,提供一对媒介子探针对、一种缺失型上游寡核苷酸序列、一种缺失型下游寡核苷酸序列、一种野生型上游寡核苷酸序列、一种野生型下游寡核苷酸序列;其中,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;并且,任选地,提供一种通用引物;
(b)将待检测的样品与所提供的检测探针、媒介子探针对、缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列、野生型下游寡核苷酸序列、以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如,DNA聚合酶,特别是热稳定的DNA聚合酶)混合;并且任选地,添加通用引物;
(c)在允许核酸变性的条件下,温育前一步骤的产物;
(d)在允许核酸退火或杂交的条件下,温育前一步骤的产物;
(e)在允许核酸延伸的条件下,温育前一步骤的产物;和
(f)任选地,重复步骤(c)-(e)一次或多次。
22.权利要求1-21任一项的方法,其中,在步骤(5)中,对步骤(4)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号,从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线;
优选地,对所获得的曲线进行求导,从而获得步骤(4)的产物的熔解曲线;
优选地,根据熔解曲线中的熔解峰(熔点),确定对应于所述熔解峰(熔点)的缺失型媒介子片段或野生型媒介子片段的存在;随后,通过缺失型媒介子片段与缺失型靶核酸序列的对应关系、以及野生型媒介子片段与野生型靶核酸序列的对应关系,确定与缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列的存在;
优选地,所述方法还包括下述步骤:(6)根据熔解曲线分析的结果(特别是熔解曲线中的熔解峰的峰高),确定与各个熔解峰对应的缺失型靶核酸序列或野生型靶核酸序列的水平。
23.一种探针组(probe set),其包含一种检测探针,以及至少一对媒介子探针对,所述媒介子探针对包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;所述缺失型靶核酸序列是包含核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;和
所述检测探针从3'至5'方向包含,与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;
优选地,所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列彼此均不同;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失。
24.权利要求23的探针组,其中,所述探针组还包含针对每一种缺失型靶核酸序列的缺失型上游寡核苷酸序列和缺失型下游寡核苷酸序列、以及针对每一种野生型靶核酸序列的野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游;
优选地,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp;
优选地,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
25.权利要求24的探针组,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
26.权利要求24的探针组,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
27.权利要求24的探针组,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
28.权利要求23-27任一项的探针组,其中,所述探针组具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述探针组包含至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少12对、至少15对、或至少20对媒介子探针对;优选地,所述媒介子探针对靶向1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种核苷酸片段缺失;
(2)所有媒介子探针对各自特异性于不同的核苷酸片段缺失;
(3)所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失;优选地,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del,或其任何组合;
(4)所述的缺失型上游寡核苷酸序列、缺失型下游寡核苷酸序列、野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列的5'端均含有一段相同的寡核苷酸序列;优选地,所述探针组进一步包含通用引物,其具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列;优选地,所述通用引物如权利要求17中所定义。
29.权利要求23-28任一项的探针组,其中,所述探针组具有选自下列的一个或多个特征:
(a)所述缺失型媒介子探针和/或野生型媒介子探针如权利要求13中所定义;
(b)所述检测探针如权利要求18-19任一项中所定义;
(c)所述缺失型上游寡核苷酸序列和/或野生型上游寡核苷酸序列如权利要求14中所定义;
(d)所述缺失型下游寡核苷酸序列和/或野生型下游寡核苷酸序列如权利要求15中所定义。
30.权利要求23的探针组,其中,所述探针组包含选自下列的一对或多对媒介子探针对:
(1)如SEQ ID NO:12所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:13所示的缺失型媒介子探针;
(2)如SEQ ID NO:17所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:18所示的缺失型媒介子探针;
(3)如SEQ ID NO:22所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:23所示的缺失型媒介子探针;
(4)如SEQ ID NO:27所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:28所示的缺失型媒介子探针;
(5)如SEQ ID NO:32所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:33所示的缺失型媒介子探针;
(6)如SEQ ID NO:37所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:38所示的缺失型媒介子探针;
(7)如SEQ ID NO:42所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:43所示的缺失型媒介子探针;
(8)如SEQ ID NO:47所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:48所示的缺失型媒介子探针;
(9)如SEQ ID NO:53所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:54所示的缺失型媒介子探针;和
(10)如SEQ ID NO:58所示的野生型媒介子探针、如SEQ ID NO:59所示的缺失型媒介子探针。
31.一种试剂盒,其包含一种或多种如权利要求23-30任一项所定义的探针组;
任选地,所述试剂盒还包含:具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶;
任选地,所述试剂盒还包含:用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合;
优选地,所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。
32.一种试剂盒,其包含:m种检测探针和n对媒介子探针,其中,n为≥1的整数(例如,n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数),m为小于2n且大于0的整数,并且,每一对媒介子探针对各自独立地包含一种缺失型媒介子探针和一种野生型媒介子探针;其中,
所述缺失型媒介子探针从5'至3'方向包含缺失型媒介子序列和缺失型靶向序列,其中,所述缺失型媒介子序列包含不与缺失型靶核酸序列和野生型靶核酸序列互补的序列,并且,所述缺失型靶向序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;所述缺失型靶核酸序列是包含核苷酸片段缺失的核酸分子;
所述野生型媒介子探针从5'至3'方向包含野生型媒介子序列和野生型靶向序列,其中,所述野生型媒介子序列包含不与野生型靶核酸序列和缺失型靶核酸序列互补的序列,并且,所述野生型靶向序列包含能够与野生型靶核酸序列中怀疑发生缺失的核苷酸片段的全部或部分杂交、退火或互补的序列;所述野生型靶核酸序列是不包含该核苷酸片段缺失的核酸分子;
所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型媒介子序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型媒介子序列彼此均不同;和
每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含,与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补的捕获序列,以及模板序列(templating sequence);并且,所述m种检测探针包含多种(例如至少2n种)捕获序列,其分别与每一种缺失型媒介子序列或其部分以及野生型媒介子序列或其部分互补;并且,
每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团,其中,所述报告基团能够发出信号,并且,所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号;并且,每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号;
优选地,所有媒介子探针对中的缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列以及野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列彼此均不同;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失。
33.权利要求32的试剂盒,其中,所述试剂盒还包含针对每一种缺失型靶核酸序列的缺失型上游寡核苷酸序列和缺失型下游寡核苷酸序列、以及针对每一种野生型靶核酸序列的野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列;其中,
所述缺失型上游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列,所述缺失型下游寡核苷酸序列包含与缺失型靶核酸序列互补的序列;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型上游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的上游,所述缺失型下游寡核苷酸序列位于所述缺失型媒介子探针所包含的缺失型靶向序列的下游;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列不位于所述野生型上游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列之间;
所述野生型上游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列,所述野生型下游寡核苷酸序列包含与野生型靶核酸序列互补的序列;并且,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的上游,所述野生型下游寡核苷酸序列位于所述野生型媒介子探针所包含的野生型靶向序列的下游;
优选地,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列不超过500bp,例如,为200-500bp;
优选地,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述缺失型下游寡核苷酸序列距离所述野生型上游寡核苷酸序列和/或缺失型上游寡核苷酸序列至少500bp,例如,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,至少1000bp或更远。
34.权利要求33的试剂盒,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的上游;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列可以相同或不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的下游。
35.权利要求33的试剂盒,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中,且所述野生型下游寡核苷酸序列位于怀疑发生缺失的核苷酸片段的下游;所述缺失型上游寡核苷酸序列与所述野生型上游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型下游寡核苷酸序列与野生型下游寡核苷酸序列可以相同或不同并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列位于断点的上游。
36.权利要求33的试剂盒,其中,当与野生型靶核酸序列杂交时,所述野生型上游寡核苷酸序列和野生型下游寡核苷酸序列均位于怀疑发生缺失的核苷酸片段中;所述缺失型下游寡核苷酸序列与所述野生型下游寡核苷酸序列不同,并且,所述缺失型上游寡核苷酸序列与野生型上游寡核苷酸序列不同;并且,当与缺失型靶核酸序列杂交时,所述缺失型靶向序列所包含的与缺失型靶核酸序列互补的序列可以位于断点的上游或下游。
37.权利要求32-36任一项的试剂盒,其中,所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种检测探针;
(2)所述试剂盒包含至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少8对、至少10对、至少15对、至少20对、至少25对、或至少30对媒介子探针对;
(3)所述缺失型媒介子探针和/或野生型媒介子探针如权利要求13中所定义;
(4)所述检测探针如权利要求18-19任一项中所定义;
(5)所述缺失型上游寡核苷酸序列和/或野生型上游寡核苷酸序列如权利要求14中所定义;
(6)所述缺失型下游寡核苷酸序列和/或野生型下游寡核苷酸序列如权利要求15中所定义;
(7)所述试剂盒还包含通用引物;优选地,所述通用引物如权利要求17中所定义;
(8)所述试剂盒还包含:具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶。
38.权利要求32-37任一项的试剂盒,其中,所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征:
(1)所有媒介子探针对各自特异性于不同的核苷酸片段缺失;
(2)所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团;
(3)所述试剂盒还包含:用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、用于进行逆转录的试剂、或其任何组合;和
(4)所述具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶是DNA聚合酶;优选地,所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌:Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermusflavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcuslitoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcushorikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifexaeolieus;特别优选地,所述DNA聚合酶为Taq聚合酶;
(5)所述试剂盒包含:分别如SEQ ID NO:2-8所示的7种检测探针,以及,分别如SEQ IDNO:12、17、22、27、32、37、42、47、53、58所示的10种野生型媒介子探针和分别如SEQ ID NO:13、18、23、28、33、38、43、48、54、59所示的10种缺失型媒介子探针;优选地,所述试剂盒还包含:分别如SEQ ID NO:9、14、19、24、29、34、39、44、49、55所示的10种野生型上游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:11、16、22、25、30、36、40、45、50、56所示的10种野生型下游寡核苷酸序列,分别如SEQ ID NO:10、15、19、24、29、34、39、44、51、55所示的10种缺失型上游寡核苷酸序列,以及分别如SEQ ID NO:11、16、21、26、31、36、41、46、52、57所示的10种缺失型下游寡核苷酸序列;任选地,所述试剂盒还包含:如SEQ ID NO:1所示的通用引物。
39.权利要求23-30任一项的探针组用于制备试剂盒的用途,所述试剂盒用于检测核苷酸片段缺失在样品中的核酸分子中的存在或水平,或者用于诊断受试者是否具有所述核苷酸片段缺失和/或患有由所述核苷酸片段缺失所导致的疾病;
优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失;优选地,所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失;优选地,所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失;优选地,所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del,或其任何组合;
优选地,所述由所述核苷酸片段缺失所导致的疾病是苯丙氨酸羟化酶缺乏症;
优选地,所述样品包含DNA,或RNA,或核酸的混合物;
优选地,所述核酸分子是DNA或RNA;和/或,所述核酸分子是单链的或双链的;
优选地,所述样品为获自受试者的样品,例如,血液,唾液,组织,或毛发;优选地,所述受试者为哺乳动物,例如灵长类动物,例如人。
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