CN114645081A

CN114645081A - 一种检测基因元件的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN114645081A
Application number: CN202011494340.6A
Authority: CN
Inventors: 黄秋英; 郭柳; 李庆阁; 张露
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2022-06-21

Abstract

本申请涉及含有基因元件的核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，通过同时、不对称扩增含有基因元件的核酸分子，本申请提供了一种检测基因元件的方法以及试剂盒。

Description

一种检测基因元件的方法和试剂盒

技术领域

背景技术

随着全球人口数量的急剧增加，如何利用有限的土地资源、水资源及其他资源来提高粮食产量，更好地解决粮食问题成为世界各国政府工作的重中之重。转基因生物是指利用基因工程在基因水平上对生物的某些性状进行遗传修饰和改良，用于农业生产或者农产品加工的植物、动物、微生物及其产品。转基因生物因其高产、抗病等一些优良性状成为世界各国解决粮食问题的一个很好的选择，自问世以后便在世界范围内逐渐推广。在带来巨大的社会效益、经济效益以及生态效益的同时，转基因生物的安全性也引起了世界上许多国家和组织的广泛关注。

为了维护人们的知情权和选择权，已有超过40个国家相继颁布了转基因产品的标识制度。不同国家设置的阈值各不相同，有些国家是强制性的，如澳大利亚、新西兰、巴西、智利、印度等，有些国家是自愿标识的，如阿根廷、加拿大、美国等。中国在2001年以后逐步完善了转基因相关法规和规章制度，确保技术安全和产业健康。中国对待转基因采取比较谨慎的态度，目前实行的是没有阈值的强制标识的管理制度，即只要产品中含有转基因成分，就需要在外包装上标明“转基因标识”。落实好转基因生物安全管理与标识制度，需要依靠科技的进步不断开发新的科学有效的检测方法。

转基因检测主要是针对启动子、筛选标记基因、终止子等转基因元件的检测。目前针对转基因生物的检测技术主要分为两类：一类为蛋白质水平上的检测技术，例如蛋白印迹法、酶联免疫吸附法、免疫试纸条法等。蛋白印迹法是依次经过电泳、抗原抗体反应、底物显色和放射自显影技术使目标蛋白的存在可视化，该技术对于检测不可溶蛋白质具有较好效果，但是耗时长，操作繁琐。酶联免疫吸附技术是利用抗原-抗体的沉淀反应结合显色反应，是目前所有基于外源蛋白的转基因检测手段中灵敏度最高且定量准确的方法。免疫试纸条技术也是应用抗原-抗体免疫反应，该技术对操作人员专业和检测设备要求低、检测快、所需样品量少，但是在定量和检测灵敏度上仍有待提高。外源蛋白质检测技术主要有四个不足：一是只适用于原料性产品以及初级加工产品，很难应用于深加工产品，因为外源蛋白质很可能因为各种加工条件降解、失活甚至消失，这就使得检测的稳定性、重复性面临挑战，同时也提高了假阴性率；二是无法做到真正的高通量检测，它要求转基因生物或产品中含有特定的基因，只能在少数授权的转基因产品中使用；三是部分转入的外源基因不表达蛋白，所以无法检测；四是操作较为繁琐，不适合批量检测。

另一类为基于DNA水平上的检测方法，常见的有Southern杂交法、PCR法、基因芯片法以及等温扩增法。相较于蛋白质，DNA具有很高的稳定性并且广泛存在，因此以DNA为靶标的转基因检测技术在实际应用中范围更广，从种子到终端产品一般不受材料加工程度的影响，同时以DNA为靶标的检测技术具有较高的灵敏度和特异性。聚合酶链式反应(PCR)通过设计引物有效扩增转基因生物中的特定外源基因片段，使之更容易被鉴定和识别，目前基于DNA的PCR检测方法是转基因生物检测过程中应用最广泛的技术，也是最准确的方法，在未来将继续发挥不可替代的作用。

国际、国家、行业标准发布了一些转基因生物筛选检测的方法，但是在长期的检测实践中发现，其检测通量低，耗时长，个别引物会存在特异性和灵敏度差的问题。多重PCR扩增在对于少量核酸分子的平行扩增分析中表现出了简单、快速、多靶标扩增的优点，近年来受到广泛关注和深入研究，但应用于复杂体系中多个不同核酸分子的高通量分析则较难实现，主要是多重PCR方法中多对引物同时存在于一个体系中，很容易造成引物二聚体等非特异扩增，此外，由于不同引物扩增效率的差异会导致其中部分目的片段出现优先扩增。随着多重PCR重数(即引物对数)的增加以及扩增循环数的增加，这种缺陷带来的限制会表现得更加明显。所以，新的快速、精确和高通量的检测方法成为了转基因生物检测方法的一个重要研究方向。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“基因元件”意指与基因表达有关的任何核酸序列，其包括基因(例如，抗性基因、筛选标记基因)以及调控基因的启动子、增强子、操纵子、终止子等调控元件。基因的表达可在基因活化、转录起始、转录后加工、mRNA降解、蛋白质翻译、翻译后加工修饰及蛋白质降解等环节被调控(例如，诱导或阻遏)。

如本文中所使用的，术语“转基因植物”是指利用基因工程(DNA重组技术)技术，把从动物、植物或者微生物中分离到的目的基因或特定的DNA片段，加上合适的调控元件，通过各种方法转移到植物的基因组中，以得到该基因或DNA序列能稳定表达和遗传的植物。在本文中，术语“转基因元件”包括待整合的外源基因和调控基因的元件。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。

如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m就越高。因此，通过检测双链体的T_m，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m”具有相同的含义，并且可互换使用。

本发明通过采用多重不对称扩增系统和多色探针熔解曲线分析技术，实现对一个或多个基因元件的扩增和检测。在此基础上，本申请开发了一种能够简便、快速检测基因元件的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。

因此，在一个方面，本申请提供了一种检测基因元件的方法，其包括，

(a)提供含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种基因元件；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种基因元件，提供至少一个靶特异性引物对；其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述基因元件的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和

(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应扩增样品中的靶核酸，从而获得与样品对应的扩增产物；

(c)对步骤(b)获得的扩增产物进行熔解曲线分析；

(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，判断是否存在基因元件；任选地，通过是否存在基因元件判断所述样品的物种，或者，通过是否存在基因元件判断所述样品是否为转基因样品。

在本申请的方法中，正向引物和反向引物分别包含特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列和反向核苷酸序列，由此，在PCR反应过程中，靶特异性引物对(正向引物和反向引物)将退火至靶核酸，并启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)。进一步，由于正向引物和第一通用引物均包含第一通用序列，因此，与正向引物互补的核酸链A也能够与第一通用引物互补。类似地，与反向引物互补的核酸链B也能够与第二通用引物互补。

因此，随着PCR反应的进行，第一通用引物和第二通用引物将分别退火至初始扩增产物的核酸链A和核酸链B，并进一步启动PCR扩增。在该过程中，由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增初始扩增产物的核酸链A和核酸链B。与此同时，第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，虽然第二通用引物也可能退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链，其具有与正向引物互补的序列)，但是其与核酸链A在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与第一正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。

因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现了对含有一种或多种基因元件的靶核酸的不对称扩增。因此，在本申请方法的步骤(a)和(b)中，实现了不对称扩增样品中的一种或多种靶核酸。

另外，由于正向引物和反向引物均含有第一通用序列，因此，在PCR反应过程中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸在退火阶段容易自身退火，形成稳定的锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中，引物二聚体的非特异性扩增能够被有效抑制。

在某些实施方案中，所述样品获自植物和/或动物。

在某些实施方案中，所述样品获自的植物选自大豆，玉米，棉花，马铃薯，番茄，水稻，木瓜，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述基因元件选自启动子，增强子，操纵子，抗性基因，筛选标记基因，终止子，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述筛选标记基因为所述样品的外源基因(例如，转基因)。

在某些实施方案中，所述靶核酸包含选自下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi，18S rDNA，以及前述基因元件的任意组合(例如，前述基因元件中任意5个，10个，15个，20个，25个，30个，36个的组合)。

在某些实施方案中，所述样品中的靶核酸包含下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi和18SrDNA。

在某些实施方案中，在步骤(a)中，针对每一种基因元件，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述基因元件的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与样品对应的扩增产物进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，检测探针不受其长度的限制。在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。

此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。

然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。

因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。

在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL FluorRed590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。

在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。

在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:1，4，7，10和，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61，64，67，70，73，76，79，82，85，88，91，94，97，100，103和106。

在某些实施方案中，所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸。

在某些实施方案中，所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-30个或更多基因元件。

在某些实施方案中，所述样品是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述样品的浓度大于1拷贝/反应(例如，5×10¹拷贝/反应，5×10²拷贝/反应，5×10³拷贝/反应，5×10⁴拷贝/反应，5×10⁵拷贝/反应)。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-30个或更多个靶特异性引物对。

在某些实施方案中，待扩增的靶核酸是单链的或双链的。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的。

在某些实施方案中，所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分。

在本申请的实施方案中，所述第一通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。在某些实施方案中，所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在某些实施方案中，所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在本申请的实施方案中，所述第二通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。在某些实施方案中，所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在某些实施方案中，所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。

在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些实施方案中，所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补。

在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:109所示。

在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:110所示。

在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:2和3；5和6；8和9；11和12；14和15；17和18；20和21；23和24；26和27；29和30；32和33；35和36；38和39；41和42；44和45；47和48；50和51；53和54；56和57；59和60；62和63；65和66；68和69；71和72；74和75；77和78；80和81；83和84；86和87；89和90；92和93；95和96；98和99；101和102；104和105；107和108。

在某些实施方案中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：

(I)提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种基因元件；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种基因元件，提供一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如前述所定义；

(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性。

在某些实施方案中，在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交。

在某些实施方案中，在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸。

在某些实施方案中，在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。

在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)。

在某些实施方案中，重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次。在某些实施方案中，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。

在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括能够不对称扩增含有基因元件的靶核酸的引物组。

在某些实施方案中，所述引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种基因元件，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述基因元件的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述基因元件的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述基因元件的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述靶核酸包含下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi和18S rDNA。

易于理解，本申请试剂盒中的第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。

在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶如前述所定义。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测基因元件。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于检测转基因元件。

在又一方面，本申请提供了一种如前所描述的引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增含有基因元件的靶核酸。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所描述的检测探针。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)相比于转基因常规PCR检测技术而言，本发明的技术方案能够实现在单个PCR反应管中检测转基因产品的多个外源基因和内源基因，操作简便，检测高效，成本低，具广阔的应用前景。

(2)相比于常规的转基因多重PCR检测方法而言，本发明的技术方案能够有效抑制引物二聚体的非特异性扩增，显著提高了扩增的特异性和检测的灵敏度。

因此，本发明开发了一种新的能够同时、不对称扩增多个转基因靶核酸的方法，其能够同时实现有效的多重PCR扩增和不对称PCR扩增，满足转基因产品检测工作中对多个靶核酸同时进行扩增和检测的要求。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1示意性地描述了本发明方法检测转基因生物内源基因和外源基因的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。

图1A示意性地描述了该实施方案中所涉及的引物组和自淬灭荧光检测探针，其中，引物组包括：第一通用引物和第二通用引物，以及，包含正向引物和反向引物的靶特异性引物对；其中，

第一通用引物包含第一通用序列(Tag1)；

第二通用引物包含第二通用序列(Tag2)，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸(例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸)；

正向引物包含第一通用序列和特异于含有外源基因或内源基因的靶核酸的正向核苷酸序列，且正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；

反向引物包含第二通用序列和特异于含有外源基因或内源基因的靶核酸的反向核苷酸序列，且反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，

正向引物和反向引物能够特异性扩增相应的含有外源基因或内源基因的靶核酸；并且，

第二通用序列不能与正向引物的互补序列完全互补。

图1B示意性地描述了使用图1A的引物组进行扩增时，引物二聚体的非特异性扩增被抑制的原理，其中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸自身在退火阶段将形成锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。

图1C示意性地描述了使用图1A的引物组和检测探针对内源基因和外源转基因元件同时检测的原理。在该实施方案中，针对每个含有内源基因或外源基因的靶核酸分别设计一对正向引物和反向引物以及一条自淬灭荧光检测探针，具体检测流程如下：

首先，由浓度低的靶特异性引物对启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物/第一通用引物和反向引物/第二通用引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)；随后，由浓度高的第一通用引物和第二通用引物对所述初始扩增产物进行后续的PCR扩增。

由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增核酸链A和核酸链B。

第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，其与核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。

因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量目标单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现不对称扩增。此外，为进一步增强扩增的不对称性，还可以调整第一通用引物和第二通用引物的比例，使得第一通用引物的浓度低于第二通用引物，以更好地富集目标单链产物。在同一反应体系内同时使用多对正向引物和反向引物对，就可以同时不对称扩增多个含有内源基因和外源基因的目的靶核酸，产生大量的含有内源基因和外源转基因元件的靶核酸单链。

PCR扩增完之后，预先加入的多条自淬灭荧光检测探针与对应的含有内源基因和外源转基因元件的靶核酸单链分别结合，形成检测探针与靶核酸单链的双链杂交体，因所形成双链杂交体稳定性的不同，经熔解曲线分析后，即能获得不同的熔解峰，再根据熔解峰的有无即可判定各靶核酸单链中是否存在内源基因和外源转基因元件。

图2显示了实施例1中使用本发明系统对大豆内源lectin基因扩增后进行熔解曲线分析的结果。黑色和灰色实线分别代表使用非转基因大豆基因组DNA和阴性对照为模板的检测结果。

图3显示了实施例2中使用本发明检测体系对36种外源基因和内源基因扩增后进行熔解曲线分析的结果。

图4显示了实施例2中使用本发明检测体系对不同浓度质粒DNA样品进行扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线、灰色虚线、黑色虚线、灰色实线、灰色点线分别代表质粒DNA样品浓度为5×10⁴拷贝/反应、5×10³拷贝/反应、5×10²拷贝/反应、5×10¹拷贝/反应及无模板对照的样本PCR扩增后进行熔解曲线分析的结果。

图5显示了实施例3中使用本发明体系对转基因大豆基因组DNA样本扩增后进行熔解曲线分析的结果。其中，黑色实线和灰色实线分别代表使用转基因大豆基因组DNA和阴性对照为模板的检测结果。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。

本申请实施例中所使用的检测探针、上游寡核苷酸(正向引物)、下游寡核苷酸(反向引物)和通用引物的详细信息，以及它们的工作浓度(除特定实施例再给出工作浓度外)已概述于表1中。

表1：实施例中所涉及的引物和探针的序列及使用浓度

实施例1.单个转基因元件的检测

本实施例中，使用表1中Lectin元件的检测探针和上下游引物，对大豆内源基因Lectin进行检测。具体配制方式如下：25μL反应体系中含有1×Taq PCR buffer(TaKaRa，北京)，3mM MgCl₂，0.24mM dNTPs，1U Taq HS(TaKaRa，北京)，0.2μM检测探针，0.04μM上下游引物，0.2μM通用引物Tag1，1.6μM通用引物Tag2，5μL非转基因大豆基因组DNA(浓度约为1ng/μL)或5μL水(阴性对照)。

PCR扩增程序为：50℃UNG酶作用5min；95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃-56℃(每个循环下降1℃)退火15s，76℃延伸20s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火15s，76℃延伸20s，50个循环；随后进行熔解曲线分析，程序为：95℃变性1min，37℃保温3min，从40℃-85℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.4℃/s，检测HEX通道的荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。检测结果如图2所示。

图2的结果显示，非转基因大豆基因组样本在HEX通道73.9℃有熔解峰(黑色实线)，而未加入模板的空白对照(NTC)无任何熔解峰(灰色实线)。该结果表明，依据本发明原理所设计的检测体系可用于检测单个转基因元件。

实施例2.36种转基因元件的同时检测

通过使用表1中提供的试剂(36种检测探针、36种上游引物、36种下游引物和2种通用引物)，本发明的方法在两个反应中即可对36种转基因元件tOCS、pRice-Eactin、pNOS、bar、NPTII、cry3A、CTP2-CP4-EPSPS、waxy、Lectin、pSsuAra、tE9、pCaMV35S、pTA29、CryIA(c)、CHY、UGPase、SadI、PMI、tCaMV35S、PAT、tg7、CP4-EPSPS、SAH7、Alfalfa-Acc、tNOS、CryIA(b)、LAT52、GAG56、GLuA3、SPS、HMG、GOX、zSSIIb、pFMV35S、pUbi、18S rDNA进行同时检测。所使用的荧光检测通道、各元件的GenBank登录号以及所检测的熔解峰的熔点概述于表2中。

表2.检测方案

简言之，本实施例中使用25μL的PCR反应体系来进行PCR扩增和熔解曲线分析，所述PCR反应体系包括：1×Taq PCR buffer，6mM MgCl₂，0.32mM dNTPs，2U Taq HS(TaKaRa，北京)，表1中描述的探针和引物(以指定的工作浓度使用)，5μL DNA模板(包含36种转基因元件的混合质粒)或水(阴性对照)。PCR扩增程序和熔解曲线分析程序同实施例1，检测FAM、HEX、ROX、CY5和Quasar 705这5个通道的荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。检测结果如图3和图4所示。

图3的结果显示，两个反应共产生了36个熔解峰，对应于36个转基因元件，各转基因元件均能得到正确识别。并且，各通道临近熔解峰间熔点差异在4℃以上，不会出现熔点交叠。这一结果表明，对于含有不同转基因元件的样本，所设计的检测体系可以获得正确的检测结果。对于任一待测样本，所设计的检测体系均可根据检测结果中熔解峰的有无即可判定待测样本是否含有相应转基因元件。

图4为10倍梯度稀释的不同浓度梯度的DNA模板(混合质粒)的检测结果，其中，黑色实线、灰色虚线、黑色虚线、灰色实线分别代表质粒DNA浓度为5×10⁴拷贝/反应、5×10³拷贝/反应、5×10²拷贝/反应和5×10¹拷贝/反应的熔解曲线分析结果，灰色点线代表无模板对照的样本PCR扩增后进行熔解曲线分析的结果。结果显示，本发明系统对低至5×10¹拷贝/反应的混合质粒的各转基因元件均能正确检出，具有较高的检测灵敏度，可以满足转基因产品的检测需求。

实施例3.转基因大豆多个元件的同时检测

利用实施例2中的检测方案、检测体系和检测程序，我们对厦门海关提供的转基因大豆进行液氮研磨，采用经典酚氯仿提取法提取大豆基因组DNA后，进行检测，检测结果如图5所示。

图5的结果显示，两个反应共产生了7个熔解峰。反应1的HEX通道检出CTP2-CP4-EPSPS(59.4℃)和lectin(73.9℃)对应的熔解峰，ROX通道检出pSsuAra(51.4℃)和tE9(59.8℃)对应的熔解峰，CY5通道检出cry1A(c)(50.0℃)对应的熔解峰，反应2的CY5通道检出pFMV35S(67.6℃)对应的熔解峰，Quasar 705通道检出18S rDNA(67.0℃)对应的熔解峰，其检测结果与中华人民共和国国家标准GB/T 19495.4-2018中提供的检测方法的检测结果相符。

上述实验结果表明，本发明系统能够同时实现对转基因生物多个基因元件的检测和鉴定。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种检测基因元件的方法和试剂盒

<130> IDC200411

<160> 110

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 检测探针

<400> 1

tgaggcatct tcaacgatgg cct 23

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 2

gcaagccctc acgtagcgac gctcctacaa atgccatcat t 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 3

gcaagccctc acgtagcgat caatccactt gctttgaaga c 41

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 检测探针

<400> 4

agcttgtcaa catcgagcag ctg 23

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcaagccctc acgtagcgag aagacttaaa gttagtgggc atc 43

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 6

gcaagccctc acgtagcgac gacagctctt ttccacgtt 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 7

ctgacgtatg tgcttagctc 20

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 8

gcaagccctc acgtagcgat gctagctgat agtgacctta g 41

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 9

gcaagccctc acgtagcgac gaactgacag aaccgcaac 39

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 10

gctggaataa tgcc 14

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 11

gcaagccctc acgtagcgag ttgagaccct tatcggcttg 40

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 12

gcaagccctc acgtagcgac actcatagat aacgataaga ttcatg 46

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 13

ccagccaccc accttatgca agtctgct 28

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 14

gcaagccctc acgtagcgag ctgtgctaga gaagatgtt 39

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 15

gcaagccctc acgtagcgac tcgaagtatg cacatttagc aa 42

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 16

gccgtcgacg agtctaacgg acaccaac 28

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 17

gcaagccctc acgtagcgag agtagataat gccagcctgt 40

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 18

gcaagccctc acgtagcgac gtgccgtctg cttcgctt 38

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 19

gagagtcggg atagtcgc 18

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 20

gcaagccctc acgtagcgaa ctcgaggtca ttcatatgct tg 42

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcaagccctc acgtagcgac aactgatgtt ttcacttttg acc 43

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 22

gcggcgaatg ggctgaccgc t 21

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 23

gcaagccctc acgtagcgag atctcgtcgt gacccat 37

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 24

gcaagccctc acgtagcgac ggcgataccg taaagca 37

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 25

agccactctc cattcagg 18

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 26

gcaagccctc acgtagcgat actgcctttc ctgttcaaag ta 42

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 27

gcaagccctc acgtagcgac tttggcaaaa ccgatttcag 40

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 28

aaatacatac taagggtttc 20

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 29

gcaagccctc acgtagcgag gggatctgga ttttagtact g 41

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 30

gcaagccctc acgtagcgac ttcgctcatg tgttgagca 39

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 31

aactcttctc catccatttc c 21

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 32

gcaagccctc acgtagcgag tcattagagg ccacgatttg 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcaagccctc acgtagcgac atggcattgg gaaaactgtt 40

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 34

atcagctggt acattgccgt agatg 25

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 35

gcaagccctc acgtagcgat gatgcaagtt taaattcaga aatatttca 49

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 36

gcaagccctc acgtagcgat caagtcaggt attatagtcc aagca 45

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 37

gggtttttat gattagagtc ccg 23

<210> 38

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 38

gcaagccctc acgtagcgag catgtaatgc atgacgttat ttatgag 47

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 39

gcaagccctc acgtagcgac ttatcctagt ttgcgcgct 39

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 40

agactgatta cataaatct 19

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 41

gcaagccctc acgtagcgag gcagaaccgg tcaaaccta 39

<210> 42

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 42

gcaagccctc acgtagcgac gctcggtgtg tcgtagatac t 41

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 43

cccggcgaca agtcgatctc ccaccgg 27

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 44

gcaagccctc acgtagcgag caaatcctct ggcctttc 38

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 45

gcaagccctc acgtagcgac gagaccgccg aacatga 37

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 46

ggtcatgtct tctgtttcc 19

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 47

gcaagccctc acgtagcgag gatgacgtta attggctctg 40

<210> 48

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcaagccctc acgtagcgac tgcaccgtga agcatgca 38

<210> 49

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 49

cctaactgga aacg 14

<210> 50

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 50

gcaagccctc acgtagcgag gcttcgcgtg gcgggtacgg t 41

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 51

gcaagccctc acgtagcgac gaactcgcag gcgcgagggc t 41

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 52

taccgagccg caggaaccg 19

<210> 53

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 53

gcaagccctc acgtagcgaa caagcacggt caacttcc 38

<210> 54

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 54

gcaagccctc acgtagcgac aggtcgtccg tccactc 37

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 55

cgcggtttgt gatatcg 17

<210> 56

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 56

gcaagccctc acgtagcgaa gtcgacatgt ctccggagag 40

<210> 57

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 57

gcaagccctc acgtagcgac gcaaccaacc aagggtatc 39

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 58

cgagctgacc ctgaccgtgc t 21

<210> 59

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 59

gcaagccctc acgtagcgaa cgcgactgga tcaggtaca 39

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 60

gcaagccctc acgtagcgac tggggaacag gctcacgat 39

<210> 61

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 61

ccgaactatg actcg 15

<210> 62

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 62

gcaagccctc acgtagcgaa ctcacagttt tggacattgt gt 42

<210> 63

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 63

gcaagccctc acgtagcgac atttctctgg taagttggga cact 44

<210> 64

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 64

acttgtttct ccttaag 17

<210> 65

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 65

gcaagccctc acgtagcgaa cctatgctca agctgcc 37

<210> 66

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 66

gcaagccctc acgtagcgac tcttctccat agatttgagc gt 42

<210> 67

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 67

ccaaggaagg cagcaggcg 19

<210> 68

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 68

gcaagccctc acgtagcgag agagggagcc tgagaaac 38

<210> 69

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 69

gcaagccctc acgtagcgac gtgtcaggat tgggtaat 38

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 70

cgctgcaatg caaaacgg 18

<210> 71

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 71

gcaagccctc acgtagcgat gacatctgct ccgaagcaa 39

<210> 72

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 72

gcaagccctc acgtagcgac ggatgatcag ctttgggtc 39

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 73

agcgttgcca gcttcgccgc tt 22

<210> 74

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 74

gcaagccctc acgtagcgag ccccatccac atttgggac 39

<210> 75

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 75

gcaagccctc acgtagcgac gcccatctgc aagccttttt 40

<210> 76

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 76

caaagagagt gtgt 14

<210> 77

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 77

gcaagccctc acgtagcgaa gaccacgaga acgatatttg 40

<210> 78

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 78

gcaagccctc acgtagcgac caacattgtc actacactca attc 44

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 79

tgtaaccacc ggatgacgca cgg 23

<210> 80

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 80

gcaagccctc acgtagcgat gcgcctgaac ggatatct 38

<210> 81

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 81

gcaagccctc acgtagcgac ggttgatctt ttcgggatg 39

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 82

gtaatggtgg tagggggtac gc 22

<210> 83

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 83

gcaagccctc acgtagcgag gacatgtgaa gagacggag 39

<210> 84

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 84

gcaagccctc acgtagcgac cttcttgggc ctacctctac c 41

<210> 85

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 85

atgggaacaa ccatg 15

<210> 86

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 86

gcaagccctc acgtagcgag taggttttga tgttacattg agt 43

<210> 87

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 87

gcaagccctc acgtagcgac tgcatctttg aaccgccta 39

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 88

acgaagttta aagtatgtgc c 21

<210> 89

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 89

gcaagccctc acgtagcgag gacctccata ttactgaaag ga 42

<210> 90

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 90

gcaagccctc acgtagcgac gagtaattgc tccatcctgt tca 43

<210> 91

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 91

accgcaacaa tcattc 16

<210> 92

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 92

gcaagccctc acgtagcgat caattttctc agccccaaca 40

<210> 93

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 93

gcaagccctc acgtagcgac tcttgcatgg gttcacctgt t 41

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 94

cggccgaaat aggttgccgc 20

<210> 95

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 95

gcaagccctc acgtagcgag caggaacaga ggtgttca 38

<210> 96

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 96

gcaagccctc acgtagcgac ggtgttcctc cattgcgaa 39

<210> 97

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 97

acagtgaatg ctcctgtg 18

<210> 98

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 98

gcaagccctc acgtagcgag atcagtgaac ttcgcaaagt 40

<210> 99

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 99

gcaagccctc acgtagcgac tcaacgacgt gaacactaca 40

<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 100

tcatccattc ccactcttga g 21

<210> 101

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 101

gcaagccctc acgtagcgaa ccatgcggat cctccca 37

<210> 102

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 102

gcaagccctc acgtagcgac atcgtagcca ttgtaacact agc 43

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 103

acccactcca tgccgcctca caag 24

<210> 104

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 104

gcaagccctc acgtagcgaa ccaaaggagg tgcctgttca 40

<210> 105

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 105

gcaagccctc acgtagcgac ttgaggtgag tcagaatgtt gt 42

<210> 106

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 106

agttgcggca ccgagtggct ccg 23

<210> 107

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 107

gcaagccctc acgtagcgaa cgtcctccta aggcgaaag 39

<210> 108

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 108

gcaagccctc acgtagcgac ttcttcggcg gtcgtccac 39

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tag1

<400> 109

gcaagccctc acgtagcga 19

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Tag2

<400> 110

gcaagccctc acgtagcgac 20

Claims

1.一种检测基因元件的方法，其包括，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

(c)对步骤(b)获得的扩增产物进行熔解曲线分析；

2.权利要求1的方法，所述样品获自植物和/或动物；

优选地，所述样品获自的植物选自大豆，玉米，棉花，马铃薯，番茄，水稻，木瓜，或其任何组合；

优选地，所述基因元件选自启动子，增强子，操纵子，抗性基因，筛选标记基因，终止子，或其任何组合；

优选地，所述筛选标记基因为所述样品的外源基因(例如，转基因)；

优选地，所述靶核酸包含选自下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi，18S rDNA，以及前述基因元件的任意组合(例如，前述基因元件中任意5个，10个，15个，20个，25个，30个，36个的组合)；

优选地，所述样品中的靶核酸包含下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi和18S rDNA。

3.权利要求1或2的方法，在步骤(a)中，针对每一种基因元件，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述基因元件的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与样品对应的扩增产物进行熔解曲线分析；

优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；

(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；

(3)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(4)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；

(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL FluorGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；

(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；

(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；

(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；

(11)所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:1，4，7，10和，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61，64，67，70，73，76，79，82，85，88，91，94，97，100，103和106。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸；

(2)所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-30个或更多基因元件；

(3)所述样品是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合；

(4)所述靶核酸是DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA分子(例如mRNA)或者其任何组合；

(5)所述样品的浓度大于1拷贝/反应(例如，5×10¹拷贝/反应，5×10²拷贝/反应，5×10³拷贝/反应，5×10⁴拷贝/反应，5×10⁵拷贝/反应)；

(6)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-30个或更多个靶特异性引物对；

(7)待扩增的靶核酸是单链的或双链的；

(8)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍；

(9)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物；

(10)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；

(11)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和

(12)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermusantranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermusrubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotogamaritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(2)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；

(3)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；

(4)所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(5)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(6)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；

(7)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(8)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和

(9)所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；

(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；

(5)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(6)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(7)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(8)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(9)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(10)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；

(11)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；

(12)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(13)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；

(14)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和

(15)所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补；

优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:109所示；

优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:110所示；

优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:2和3；5和6；8和9；11和12；14和15；17和18；20和21；23和24；26和27；29和30；32和33；35和36；38和39；41和42；44和45；47和48；50和51；53和54；56和57；59和60；62和63；65和66；68和69；71和72；74和75；77和78；80和81；83和84；86和87；89和90；92和93；95和96；98和99；101和102；104和105；107和108。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：

(I)提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种基因元件；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种基因元件，提供一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如权利要求1所定义；

(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；

(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；

(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和

(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次；

优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；

(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；

(3)在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；

(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；

(5)在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(4)的产物，从而允许核酸延伸；

(6)在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min；

(7)在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)；和

(8)重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。

8.一种试剂盒，所述试剂盒包括能够不对称扩增含有基因元件的靶核酸的引物组；

优选地，所述引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种基因元件，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述基因元件的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；

优选地，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述基因元件的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述基因元件的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合；

优选地，所述基因元件选自启动子，增强子，操纵子，筛选标记基因，终止子，或其任何组合；

优选地，所述靶核酸包含下列的基因元件：tOCS，pRice-Eactin，pNOS，bar，NPTII，cry3A，CTP2-CP4-EPSPS，waxy，Lectin，pSsuAra，tE9，pCaMV35S，pTA29，CryIA(c)，CHY，UGPase，SadI，PMI，tCaMV35S，PAT，tg7，CP4-EPSPS，SAH7，Alfalfa-Acc，tNOS，CryIA(b)，LAT52，GAG56，GLuA3，SPS，HMG，GOX，zSSIIb，pFMV35S，pUbi和18S rDNA；

优选地，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:1，4，7，10和，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61，64，67，70，73，76，79，82，85，88，91，94，97，100，103和106；

优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:109所示；

优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:110所示；

优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个引物对的组合)：SEQ ID NO:2和3；5和6；8和9；11和12；14和15；17和18；20和21；23和24；26和27；29和30；32和33；35和36；38和39；41和42；44和45；47和48；50和51；53和54；56和57；59和60；62和63；65和66；68和69；71和72；74和75；77和78；80和81；83和84；86和87；89和90；92和93；95和96；98和99；101和102；104和105；107和108；

优选地，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如权利要求4所定义；

优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；

优选地，所述试剂盒用于检测基因元件；

优选地，所述试剂盒用于检测转基因元件。

9.权利要求8所定义的引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增含有基因元件的靶核酸；

优选地，所述试剂盒还包含权利要求3所定义的检测探针；

优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-7任一项所描述的方法。