CN115109840A - 一种分析目标核酸中突变的存在及其类型的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种分析目标核酸中突变的存在及其类型的方法。此外，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于实施本发明的方法。

Description

一种分析目标核酸中突变的存在及其类型的方法

技术领域

本申请涉及分子生物学领域，特别是核酸检测和分析领域。特别地，本申请提供了一种分析目标核酸中突变的存在及其类型的方法。此外，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于实施本发明的方法。

背景技术

在当代生物学和医学领域，核酸扩增是一种必不可少的生物技术。目前，核酸扩增技术已经广泛运用于临床诊断、基础研究、流行病研究、转基因研究、考古研究等领域。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，该技术已经广泛运用于生物及医学相关领域。然而，运用PCR技术及PCR相关技术(如实时PCR、多重PCR)进行核酸扩增时，受到实验室条件的限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。除此之外，PCR结果的判定(即扩增产物的检测)比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区和快速诊断领域的应用。

为了克服PCR相关扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。与PCR相关技术比较，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度较快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，现场诊断和便捷检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)等。

交叉引物扩增(CPA)是一种设计简单，检测敏感的等温扩增技术，引物扩增体系主要包括交叉引物、剥离引物、检测引物，以及具有链置换功能的DNA聚合酶等。在该方法中，针对靶基因通常需要设计五条特异性引物，它们在链置换DNA聚合酶(例如Bst DNA聚合酶)的作用下进行等温扩增。等温扩增技术以反应快、对检测设备要求低等优势在众多检测技术中脱颖而出。与传统的聚合酶链反应相比，等温扩增技术可以在恒定温度下进行快速扩增，使用的仪器设备简单，扩增时间大大缩短，且结果易于判读。因此，交叉引物等温扩增技术目前在转基因作物检测、食品安全检验检疫、医学疾病安全检验检疫方面应用广泛。

然而，交叉引物扩增也存在着不足之处。一方面，传统CPA法的检测特异性较差，非特异性信号较强，可能会干扰结果判读。另一方面，传统的CPA法仅能检测核酸变异或突变的存在，而无法分辨变异的种类。例如，当某一基因片段存在多种变异或突变时，传统CPA法无法对此类不同的变异或突变进行区分。

因此，本领域仍然需要开发新的检测核酸变异的方法，以解决传统CPA法存在的问题。

发明内容

本申请的发明人基于深入的研究，开发了一种新的检测目标核酸分子的方法，本申请的方法具有简单、快速、高效等特点。

检测方法

因此，在一个方面，本发明提供了一种检测目标核酸中突变的存在及其类型的方法，其包括如下步骤：

(1)提供第一引物，第二引物，和第三引物；其中，

所述第一引物包含退火序列和交叉序列；其中，所述退火序列位于所述交叉序列的下游或3’端，并且二者直接连接或者通过核苷酸接头相连接；所述退火序列在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与目标核酸的第一链(a链)的第一区域杂交或退火，并且在允许核酸合成或扩增的条件下，能够起始延伸反应并生成含有待测核酸序列(Ta序列)的互补序列(Ts序列)的核酸链；所述Ta序列或Ts序列被怀疑含有突变；

所述第二引物和第三引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链的互补链(s链)杂交或退火；并且，所述第二引物能够与所述s链中位于Ts序列下游或3’端的第二区域退火或杂交；所述第三引物能够与所述s链中位于所述Ts序列下游或3’端的第三区域退火或杂交；并且，所述第二区域位于所述第三区域的下游或3’端；且，

所述交叉序列含有能够与所述第二区域退火或杂交的序列；

任选地，还提供第四引物和/或第五引物，其中，所述第四引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链中位于所述第一区域下游或3’端的第四区域退火或杂交；所述第五引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与所述s链中位于所述第二区域的下游或3’端的第五区域退火或杂交；

(2)在允许核酸合成或扩增的条件下，将所述第一、第二和第三引物，以及任选的第四和/或第五引物，与目标核酸和核酸聚合酶接触(例如孵育)，并生成核酸扩增产物；所述核酸扩增产物包括：(i)第一扩增链，其含有第一引物的序列，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列；和(ii)第二扩增链，其含有第二区域的互补序列，第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列；

(3)使用一种或多种检测探针对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析；其中，

所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

并且，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列和/或能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列；或者，所述检测探针含有能够与Ta序列杂交或退火的Ta捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域杂交或退火的第一区域捕获序列和/或能够与第三区域的互补序列杂交或退火的第三区域互补-捕获序列；

(4)根据熔解曲线分析的结果，确定目标核酸中突变的存在及其类型。

在本发明的方法中，所述目标核酸不受限于其序列组成或长度。例如，所述目标核酸可以是DNA，RNA，DNA/RNA复合物，或其混合物。此外，所述目标核酸可以以单链或双链形式存在，例如，所述目标核酸选自单链DNA，单链RNA，双链DNA，双链RNA，或DNA/RNA杂合双链。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(2)之前，可以对所述目标核酸进行预处理，例如，纯化，富集或逆转录。

例如，当所述目标核酸为RNA时，在某些实施方案中，在进行本发明的方法之前，进行逆转录反应，以获得与所述RNA互补的cDNA。关于逆转录反应的详细描述可参见例如，Joseph Sam-brook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。

所述目标核酸可获自任何来源，包括但不限于原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如Herpes病毒，HIV，流感病毒，EB病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)，类病毒或核酸分子文库。所述目标核酸还可以是任何形式的核酸序列，例如基因组序列，人工分离或片段化的序列，合成的序列等。

在本发明的方法中，所述Ts序列或Ta序列的长度不受限制。在某些优选的实施方案中，所述Ts序列或Ta序列的长度为1-100nt，例如1-3nt，3-5nt，5-8nt，8-10nt，10-13nt，13-15nt，15-18nt，18-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-55nt，55-60nt，60-65nt，65-70nt，70-75nt，75-80nt，80-85nt，85-90nt，90-95nt，95-100nt。

在本发明的方法中，所述Ts序列或Ta序列被怀疑含有的突变类型不受限制。在某些优选的实施方案中，所述突变选自添加，缺失，置换，或其任何组合。

第一引物

在本发明的方法中，所述第一引物含有退火序列和交叉序列。

所述退火序列不受其组成和长度的限制，只要其能与所述目标核酸的第一链(a链)的第一区域特异性杂交。例如，所述退火序列的长度为5-50nt，例如5-8nt，8-10nt，10-13nt，13-15nt，15-18nt，18-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列能够与所述a链中位于Ta序列下游或3’端的第一区域退火或杂交。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列含有与第一区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列位于所述第一引物的3’端。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述退火序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在本发明的方法中，所述交叉序列不受其组成和长度的限制，只要其能与所述第二区域特异性杂交。例如，所述交叉序列的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-14nt，14-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

所述交叉序列含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述交叉序列含有所述第二引物的序列。

在某些优选的实施方案中，所述交叉序列与所述第二引物的序列相同。

在某些优选的实施方案中，所述交叉序列包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述交叉序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述交叉序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

核苷酸接头

在本发明的方法中，在某些实施方案中，所述第一引物的退火序列和交叉序列通过核苷酸接头连接。

在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头的长度为5-20nt，例如5-10nt，10-15nt，15-20nt。

在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

第二引物

在本发明的方法中，所述第二引物不受其组成和长度的限制，只要其能与所述第二区域特异性杂交。例如，所述第二引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-14nt，14-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些优选的实施方案中，所述第二引物含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述第二引物包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述第二引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述第二引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

第三引物

在本发明的方法中，所述第三引物不受其组成和长度的限制，只要其能与所述第三区域特异性杂交。例如，所述第三引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些优选的实施方案中，所述第三引物含有与第三区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述第三引物包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述第三引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述第三引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

第四引物

在本发明的方法中，所述第四引物不受其组成和长度的限制，只要其能与所述第四区域特异性杂交。例如，所述第四引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-23nt，23-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些优选的实施方案中，所述第四引物含有与第四区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述第四引物包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述第四引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述第四引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

第五引物

在本发明的方法中，所述第五引物不受其组成和长度的限制，只要其能与所述第五区域特异性杂交。例如，所述第五引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-22nt，22-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些优选的实施方案中，所述第五引物含有与第五区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

在某些优选的实施方案中，所述第五引物包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述第五引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述第五引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

关于步骤(2)，(3)和(4)

易于理解的是，本发明的方法并不限于所使用的检测探针的数目。在步骤(3)中，可以使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针所包含的报告基团彼此不同。

易于理解，所述检测探针可以在生成核酸扩增产物之前(例如，在进行核酸合成或扩增之前)，被添加至步骤(2)的反应体系中；或者，所述检测探针在生成核酸扩增产物之后(例如在步骤(2)结束之后)，与步骤(2)中生成的核酸扩增产物接触。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，在对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种检测探针的报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的一条或多条熔解曲线；随后，在步骤(4)中，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定突变的存在及其类型。

如上文所论述的，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，可对步骤(2)的产物进行逐渐的升温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(2)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(2)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。

在某些实施方案中，可对步骤(2)的产物进行逐渐的降温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(2)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(2)的产物从75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)逐渐降温至45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。降温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，降温的速率可以为：每步骤降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。

随后，可对获得的曲线进行求导，从而获得步骤(2)的产物的熔解曲线。根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，可确定对应于该熔解峰(熔点)的突变类型的存在。

不拘于理论限制，熔解曲线分析的分辨率或精度可达到0.1℃或更高。换言之，熔解曲线分析能够区分熔点相差仅0.1℃或更低的两个熔解峰。因此，在本发明方法的某些实施方案中，任意的两个双链体(例如，不同探针与同一扩增产物形成的不同双链体；或者，相同探针与不同扩增产物形成的不同双链体)之间的熔点差异可以为至少0.1℃，从而所述任意的两个双链体可通过熔解曲线分析来区分和辨别。然而，出于便于区分和辨别的目的，两个双链体的更大的熔点差异在某些情况下是优选的。因此，在本发明方法的某些实施方案中，两个双链体之间的熔点差异可以为任何期望的值，只要所述熔点差异能够通过熔解曲线分析来区分和辨别即可。

根据本发明的方法，步骤(2)中允许核酸合成或扩增的条件可以由本领域技术人员常规地确定。

在某些优选的实施方案中，在允许进行核酸等温扩增的条件下进行步骤(2)。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)中，在55℃～65℃(例如55℃～58℃，58℃～60℃，60℃～63℃，63℃～65℃)的温度下，将所述第一、第二和第三引物，以及任选的第四和/或第五引物，与目标核酸和核酸聚合酶接触(例如孵育)，并生成核酸扩增产物。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)中，所述第一、第二和第三引物，以及任选的第四和/或第五引物，与目标核酸和核酸聚合酶接触(例如孵育)的持续时间为至少10min，至少20min，至少30min，至少40min，至少50min，或至少60min。

在某些优选的实施方案中，所述目标核酸的浓度为至少0.01×10³copies/μL(例如至少0.01×10³copies/μL，至少0.05×10³copies/μL，至少0.1×10³copies/μL，至少0.5×10³copies/μL，至少1.0×10³copies/μL，至少2.0×10³copies/μL)。

在某些优选的实施方案中，所述第一扩增链从5’端开始含有第一引物的序列，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列。

在某些优选的实施方案中，所述第二扩增链从5’端开始含有第二区域的互补序列，第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列。

探针

在本发明的方法中，所述检测探针不受其长度的限制。例如，所述检测探针的长度为10-500nt，例如10-15nt，15-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列和/或能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列。

例如，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列；或者，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列，并且，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端；或者，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列，并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端；或者，所述检测探针含有Ts捕获序列，第一区域互补-捕获序列，和第三区域捕获序列；并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端。

当使用多种检测探针对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析时，在某些优选的实施方案中，不同的检测探针与第一扩增链和/或第二扩增链的不同区域杂交或退火。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，所述检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如检测探针)的3'-末端。例如，可通过对检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH进行修饰，以封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

如上文所描述的，检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。

在本发明的方法中，所述报告基团和淬灭基团可以是本领域已知的任何合适的基团或分子，其具体实例包括但不限于Cy2^TM(506),YO-PRO^TM-l(509),YOYO^TM-l(509),Calcein(517),FITC(518),FluorX^TM(519),Alexa^TM(520),Rhodamine 110(520),Oregon Green^TM500(522),Oregon Green^TM488(524),RiboGreen^TM(525),Rhodamine Green^TM(527),Rhodamine123(529),Magnesium Green^TM(531),Calcium Green^TM(533),TO-PRO^TM-l(533),TOTOl(533),JOE(548),BODIPY530/550(550),Dil(565),BODIPY TMR(568),BODIPY558/568(568),BODIPY564/570(570),Cy3^TM(570),Alexa^TM546(570),TRITC(572),MagnesiumOrange^TM(575),Phycoerythrin R&B(575),Rhodamine Phalloidin(575),CalciumOrange^TM(576),PyroninY(580),Rhodamine B(580),TAMRA(582),Rhodamine Red^TM(590),Cy3.5^TM(596),ROX(608),Calcium Crimson^TM(615),Alexa^TM594(615),Texas Red(615),Nile Red(628),YO-PRO^TM-3(631),YOYO^TM-3(631),R-phycocyanin(642),C-Phycocyanin(648),TO-PRO^TM-3(660),T0T03(660),DiD DilC(5)(665),Cy5^TM(670),Thiadicarbocyanine(671),Cy5.5(694),HEX(556),TET(536),Biosearch Blue(447),CALFluor Gold 540(544),CAL Fluor Orange 560(559),CAL Fluor Red 590(591),CALFluor Red 610(610),CAL Fluor Red 635(637),FAM(520),Fluorescein(520),Fluorescein-C3(520),Pulsar 650(566),Quasar 570(667),Quasar 670(705)，和Quasar705(610)。括号中的数字表示最大发射波长，单位为nm。

此外，报告基团和淬灭基团的各种合适配对是本领域已知的，参见例如Pesce etal.,editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971)；White etal.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,Color AND Constitution of OiganicMolecules(Academic Press,New York,1976)；Bishop,editor,Indicators(PeigamonPress,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)；Haugland,R.P.,Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals,6th Edition(Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996)；美国专利3,996,345和4,351,760。

在某些优选的实施方案中，所述报告基团为荧光基团。在此类实施方案中，报告基团发出的信号即为荧光，并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如，能够吸收所述荧光的另一荧光分子，或者能够淬灭所述荧光的淬灭剂)。在某些优选的实施方案中，所述荧光基团包括但不限于各种荧光分子，例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。在某些优选的实施方案中，所述淬灭基团包括但不限于各种淬灭剂，例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。

由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。

然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。

因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。

在本发明的方法中，还可以对检测探针进行修饰，例如使其具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性。例如，可在检测探针的主链中引入抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在本发明的方法中，检测探针可以是线性的，或者可具有发夹结构。在某些优选的实施方案中，所述检测探针是线性的。在某些优选的实施方案中，所述检测探针具有发夹结构。发夹结构可以是天然的，也可以是人工引入的。此外，可使用本领域中的常规方法来构建具有发夹结构的检测探针。例如，可通过在检测探针的2个末端(5'端和3'端)添加互补的2段寡核苷酸序列，从而使得检测探针可形成发夹结构。在此类实施方案中，互补的2段寡核苷酸序列构成发夹结构的臂(茎)。发夹结构的臂可具有任何期望的长度，例如臂的长度可以是2-15nt，例如3-7nt，4-9nt，5-10nt，6-12nt。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针与所述核酸扩增产物形成的双链体的熔解温度高于第一、第二或第三引物与所述核酸扩增产物形成的双链体的熔解温度。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)所使用的核酸聚合酶具有链置换活性和/或高保真性。

在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶还具有逆转录活性。

在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶不具有5’至3’外切酶活性或具有显著降低的5’至3’外切酶活性。

在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶选自Bst聚合酶，Bsm聚合酶，Phi29聚合酶，exo-Klenow聚合酶，BsobⅠ聚合酶和exo-Bca聚合酶或其组合。

试剂盒

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如上文定义的第一引物，第二引物，第三引物，以及，一种或多种检测探针。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含如上文定义的第四引物，和/或第五引物。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含核酸聚合酶。在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶如上文所定义。

易于理解的是，此类试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对第一引物，第二引物，第三引物，第四引物，第五引物和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于试剂盒中的第一引物，第二引物，第三引物，第四引物，第五引物和检测探针。并且，此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含：用于进行核酸杂交的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、或其任何组合。此类试剂可由本领域技术人员常规地确定，并且包括但不限于，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白(Single Strand DNA-Binding Protein，SSB)、或其任何组合。

本领域技术人员基于本申请所详细描述的原理，可对本发明技术方案的各种技术特征进行修饰、替换或组合，而不背离本发明的精神和范围。所有此类技术方案以及其变形都涵盖在本申请的权利要求书或其等同物的范围内。

术语说明

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。除非在本文别处具体限定或不同地描述，否则以下与本发明有关的术语和描述应按照下面给出的定义来理解。

当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。

如本文中所使用的，术语“目标核酸”是指待检测的核酸。所述目标核酸可以是DNA，RNA，DNA/RNA复合物，或其混合物，并且可以任何形式存在。例如，所述目标核酸可以以单链、双链或杂合双链形式存在。在某些优选的实施方案中，所述目标核酸选自单链DNA，单链RNA，双链DNA，双链RNA，或DNA/RNA杂合双链。

所述目标核酸的来源不受限制，其可来源于生物体(例如原核生物，真核生物，病毒，类病毒)或非生物体(例如核酸分子文库)。在某些情况下，可根据需要经预处理步骤(例如纯化，扩增，富集，酶解，变性等)获得所述目标核酸。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，“允许核酸退火或杂交的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，并且可通过常规的方法来确定。例如，具有互补序列的两条核酸分子可在合适的杂交条件下发生杂交。此类杂交条件可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的pH值、成分和离子强度等，并且可根据互补的两条核酸分子的长度和GC含量来确定。例如，当互补的两条核酸分子的长度相对较短和/或GC含量相对较低时，可采用低严紧的杂交条件。当互补的两条核酸分子的长度相对较长和/或GC含量相对较高时，可采用高严紧的杂交条件。此类杂交条件是本领域技术人员熟知的，并且可参见例如Joseph Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001)；和M.L.M.Anderson,Nucleic Acid Hybridization,Springer-VerlagNew York Inc.N.Y.(1999)。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。相应地，表述“允许核酸杂交的条件”和“允许核酸退火的条件”也具有相同的含义，并且可互换使用。

如本文中所使用的，表述“允许核酸合成或扩增的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，允许核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)以一条核酸链为模板合成另一条核酸链，并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的，并且可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的pH值、成分、浓度和离子强度等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如Joseph Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。在本申请中，“合成”和“扩增”具有相同的含义，并且可互换使用。在本发明的方法中，“允许核酸合成或扩增的条件”优选地为核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的工作条件。各种酶的工作条件可由本领域技术人员通过常规方法确定，并且通常可涉及下列因素：温度，缓冲液的pH值，成分，浓度，离子强度等。备选地，可使用酶的制造商所推荐的条件。

如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与后者相比，前者位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。

如本文中所使用的，术语“荧光探针”是指携带荧光基团、且能够产生荧光信号的一段寡核苷酸。在本申请中，荧光探针被用作检测探针。

如本文所使用的，具有“链置换活性”的核酸聚合酶是指，在延伸新核酸链的过程中，如果遇到下游与模板链互补的核酸链，可以继续延伸反应并将所述与模板链互补的核酸链剥离(而非降解)的核酸聚合酶。

如本文所使用的，具有“高保真性”的核酸聚合酶是指，在扩增核酸的过程中，引入错误核苷酸的概率(即，错误率)低于野生型Taq酶(例如其序列如UniProt Acession:P19821.1所示的Taq酶)的核酸聚合酶。

如本文所使用的，具有“显著降低的5'至3'核酸外切酶活性”的核酸聚合酶是指具有约或低于10％的，或优选约或低于5％或1％，的野生型Taq酶(例如其序列如UniProtAcession:P19821.1所示的Taq酶)的5'至3'核酸外切酶活性的核酸聚合酶。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m值)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m值就越高。因此，通过检测双链体的T_m值，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m值”具有相同的含义，并且可互换使用。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明的方法采用等温扩增方式(交叉引物扩增法)对目标核酸分子进行扩增，这大大缩短了扩增步骤所需的时间，使得能够快速(例如，在1个小时内)完成对目标核酸分子的扩增和检测。

(2)本发明的方法在扩增结束后采用熔解曲线分析对等温扩增产物进行分析和检测，这不仅大大提高了分析和检测的灵敏度和特异性，而且使得能够对目标核酸分子中突变的存在和类型进行高效、准确的分析。

此外，本申请的发明人还已意外发现，在对等温扩增产物进行熔解曲线分析时，针对第一引物的扩增产物(即，第一扩增链)而设计的检测探针具有显著优于针对第二引物的扩增产物(即，第二扩增链)而设计的检测探针的检测能力。

因此，本发明提供了一种简单、快速、高效的检测目标核酸分子的方法，解决了传统交叉引物扩增法存在的问题。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了利用本发明的方法检测目标核酸中的突变的示例性方案。简言之，所述示例性方案包含以下步骤。

首先，提供第一引物，第二引物，和第三引物；其中，

所述第一引物包含退火序列和交叉序列；其中，所述退火序列位于所述交叉序列的下游或3’端，并且二者直接连接或者通过核苷酸接头相连接；所述退火序列在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与目标核酸的第一链(以下简称a链)的第一区域杂交或退火，并且在允许核酸合成或扩增的条件下，能够起始延伸反应并生成含有待测核酸序列(以下简称Ta序列)的互补序列(以下简称Ts序列)的核酸链；

所述第二引物和第三引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链的互补链(以下简称s链)杂交或退火；并且，所述第二引物能够与所述s链中位于所述Ts序列下游或3’端的第二区域退火或杂交；所述第三引物能够与所述s链中位于所述Ts序列下游或3’端的第三区域退火或杂交；并且，所述第二区域位于所述第三区域的下游或3’端；且，

所述交叉序列含有能够与所述第二区域退火或杂交的序列。

在某些优选的实施方案中，所述退火序列能够与a链中位于Ta序列下游或3’端的第一区域退火或杂交。在某些优选的实施方案中，所述退火序列含有与第一区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。在某些优选的实施方案中，所述退火序列位于所述第一引物的3’端。

在某些优选的实施方案中，所述第二引物含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。在某些优选的实施方案中，所述第三引物含有与第三区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。在某些优选的实施方案中，所述交叉序列含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。在某些优选的实施方案中，所述交叉序列含有所述第二引物的序列。在某些优选的实施方案中，所述交叉序列与所述第二引物的序列相同。

在某些优选的实施方案中，任选地，还提供第四引物和第五引物，其中，所述第四引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链中位于所述第一区域下游或3’端的第四区域退火或杂交；所述第五引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与所述s链中位于所述第二区域的下游或3’端的第五区域退火或杂交。

在某些优选的实施方案中，所述第四引物含有与第四区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。在某些优选的实施方案中，第五引物含有与第五区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列。

其次，在允许核酸合成或扩增的条件下，将所述第一、第二和第三引物(以及，任选的第四和第五引物)与目标核酸分子和核酸聚合酶接触(例如孵育)，并生成核酸扩增产物。图1A示意性地展示了使用上述五种引物对目标核酸分子进行扩增的过程。

在核酸扩增过程中，核酸聚合酶能够以目标核酸分子的a链为模板延伸第一引物(如图1A中的(1)所示)，并生成第一扩增链，其从5’端开始，含有第一引物的序列(包括交叉序列和退火序列)，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列(如图1A中的(2)所示)。

不受理论限制，核酸聚合酶还能够以目标核酸分子的a链为模板延伸第四引物；因此，当所使用的核酸聚合酶具有链置换活性时，第四引物的添加和使用，将有利于第一扩增链从目标核酸分子的a链剥离，形成单链核酸分子。

在生成第一扩增链后，核酸聚合酶能够以第一扩增链为模板，延伸第二和第三引物(如图1A中的(2)所示)，并生成第二和第三扩增链，其中，第二扩增链从5’端开始，含有第二区域的互补序列，第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列(包括退火序列的互补序列和交叉序列的互补序列)(如图1A中的(3)所示)；第三扩增链从5’端开始，含有第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列(包括退火序列的互补序列和交叉序列的互补序列)(如图1A中的(4)所示)。

不受理论限制，核酸聚合酶还能够以第一扩增链为模板延伸第五引物；因此，当所使用的核酸聚合酶具有链置换活性时，第五引物的添加和使用，将有利于第二和第三扩增链从第一扩增链剥离，形成单链核酸分子。

在生成第二扩增链后，核酸聚合酶能够以第二扩增链为模板，延伸第一和第二引物，并生成含有第一扩增链和第二扩增链的双链核酸分子(如图1A中的(5)所示)。由于第一扩增链包含交叉序列，退火序列，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列，而所述交叉序列又能够与所述第二区域退火或杂交(例如互补)，因此，第一扩增链可自发形成茎环结构(如图1A中的(8)所示)。类似地，第二扩增链也可自发形成茎环结构(如图1A中的(7)所示)。

随后，双链核酸分子中的第二扩增链又可以用作模板用于延伸第一和第二引物(如图1A中的(7)所示)，生成新的第一扩增链；并且，第一扩增链又可以用作模板用于延伸第二和第三引物(如图1A中的(8)所示)，生成新的第二和第三扩增链。由此，通过多轮核酸扩增，各自能形成茎环结构的含有Ts序列的第一扩增链和含有Ta序列的第二扩增链被大量合成和富集。

此外，需要说明的是，在生成第三扩增链后，核酸聚合酶也能够以第三扩增链为模板延伸第二引物，并生成含有另一种双链核酸分子(如图1A中的(6)所示)。该双链核酸分子为扩增反应的副产物，所含有的两条核酸链均无法形成茎环结构。

可以使用各种核酸聚合酶来实施本发明的方法。在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。在某些优选的实施方案中，所述DNA聚合酶具有链置换活性，和/或，不具有5’至3’外切酶活性。

本发明的方法可用于检测各种目标核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述目标核酸分子可以是双链核酸(例如，双链DNA)。在某些优选的实施方案中，所述目标核酸分子可以是单链核酸(例如单链DNA，单链RNA)。

在生成各自能形成茎环结构的第一扩增链和第二扩增链后，可通过熔解曲线分析对第一扩增链中含有的Ts序列和/或第二扩增链中含有的Ta序列进行分析或鉴定。图1B示意性地展示了使用检测探针对第一扩增链中含有的Ts序列进行熔解曲线分析的示例性方案。

在该检测方案中，提供一种检测探针，其含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列和/或能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些优选的实施方案中，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列。在某些优选的实施方案中，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列，并且，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端。在某些优选的实施方案中，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列，并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端。在某些优选的实施方案中，所述检测探针含有Ts捕获序列，第一区域互补-捕获序列，和第三区域捕获序列；并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端。

可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列(例如第一扩增链的环区域)形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列(例如第一扩增链的环区域)的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m值)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m值就越高。因此，通过检测双链体的T_m值，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m值”具有相同的含义，并且可互换使用。

例如，可设计检测探针，使其含有与野生型基因的Ts序列完全互补的序列。由此，当待检测的目标核酸分子中不含有突变(目标核酸分子含有野生型基因的序列)时，检测探针将能够与第一扩增链完全互补，二者所形成的双链体将具有最高的T_m值；而当待检测的目标核酸分子中含有一个或多个突变时，检测探针将无法与第一扩增链完全互补(即，二者是部分互补的)，二者所形成的双链体将具有降低的T_m值。目标核酸分子/第一扩增链中含有的突变越多，所形成的双链体的T_m值就越低。因此，通过测定T_m值的熔解曲线分析，可以确定第一扩增链是否含有突变，以及确定突变的类型。反之，也可设计检测探针，使其含有与突变型基因的Ts序列完全互补的序列。

图2显示了实施例1中利用5种引物和检测探针1和2对含有野生型A基因(黑色实线)或对照基因(灰色实线)的待测核酸样品进行等温扩增的扩增曲线。

图3显示了在使用5种引物对含有野生型或突变型A基因的待测核酸样品进行等温扩增后，使用2种检测探针对等温扩增产物进行熔解曲线分析的结果。

图4显示了在使用5种引物对含有野生型B基因的待测核酸样品进行等温扩增后，使用检测探针3或4分别对等温扩增产物进行熔解曲线分析的结果。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

表1

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。

实施例1：目的核酸的扩增和检测

在本实施例中，以野生型的A基因为例，验证本发明方法用于扩增和检测目的核酸的能力。野生型的A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且，A基因存在多种突变体，包括例如下述突变体：269C>T(SEQ ID NO:2)；281A>C(SEQ ID NO:6)；281A>G(SEQ ID NO:7)；280G>C(SEQ ID NO:4)；280G>A(SEQ ID NO:3)和280G>T(SEQ ID NO:5)等。

根据A基因的野生型和突变体的核苷酸序列，以其中的高频突变区域为检测的目标区域(Ts序列)，设计如下5条引物：第一引物(SEQ ID NO:8)、第二引物(SEQ ID NO:9)、第三引物(SEQ ID NO:10)、第四引物(SEQ ID NO:11)、第五引物(SEQ ID NO:12)，以便对待检样品中的核酸分子进行扩增，生成含有Ts序列的第一扩增链(其为第一引物的扩增产物)和含有Ts序列的互补序列(Ta序列)的第二扩增链(其为第二引物的扩增产物)。进一步，设计检测探针1(SEQ ID NO:13)和检测探针2(SEQ ID NO:14)，以便对第一扩增链进行扩增曲线分析和熔解曲线分析。

根据检测探针、目的基因和引物的核苷酸序列，可以计算由检测探针和各种第一扩增链形成的双链体的预期T_m值，如表2所示。

表2：由检测探针和第一扩增链形成的双链体的预期T_m值

按照表3配制25μL的反应体系。

表3：用于扩增和检测A基因的反应体系

组分	终浓度
		10×Bst buffer	1×
MgSO4(购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10013018)	2.0mM
		dNTPs(购自赛默飞，货号：AM822G)	0.3mM
BST DNA聚合酶(购自菲鹏，货号：MD030)	8.0U
		检测探针1(SEQ ID NO:13)	0.14μM
检测探针2(SEQ ID NO:14)	0.14μM
		第一引物(SEQ ID NO:8)	0.5μM
第二引物(SEQ ID NO:9)	0.3μM
		第三引物(SEQ ID NO:10)	0.3μM
第四引物(SEQ ID NO:11)	0.15μM
		第五引物(SEQ ID NO:12)	0.15μM
甜菜碱(购自西格玛奥德里奇，货号：14300-100G)	1.0μM
		待测核酸样品(含有野生型A基因或对照基因)	2×10<sup>3</sup>copies/μL
水	添加至25μL

按照下述扩增反应程序进行扩增：63℃扩增50min(以1min为一个循环，采集FAM与ROX通道的荧光信号)；95℃孵育1min(使BST DNA聚合酶失活)。本实施例采用的仪器为SLAN96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。

检测结果如图2所示。图2显示了利用5种引物和检测探针1与检测探针2对含有野生型A基因(黑色实线)或对照基因(灰色实线)的待测核酸样品进行等温扩增的扩增曲线。结果显示，当待测核酸样品中含有A基因时，能够检测到扩增曲线；反之，当待测核酸样品中不含A基因时，无法检测到扩增曲线。这些结果表明，根据本发明方法设计的引物和探针能够快速(在1h内)、有效且特异性地对目标核酸分子进行等温扩增。

实施例2：野生型基因和突变型基因的检测

在本实施例中，使用实施例1中设计的5条引物(第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物)对含有野生型A基因(WT)或突变型A基因(269C>T，281A>C，281A>G，280G>C，280G>A和280G>T)的待测核酸分子进行等温扩增，并使用检测探针1和2对扩增产物进行熔解曲线分析，以验证本发明方法用于检测和分析目标核酸分子中的突变的能力。

简言之，按照表4配制25μL的反应体系：

表4：用于扩增和检测野生型或突变型A基因的反应体系

按照下述扩增反应程序进行扩增：63℃扩增50min(以1min为一个循环，采集FAM和ROX通道的荧光信号)；95℃孵育1min(使BST DNA聚合酶失活)。随后，从40℃-85℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.4℃/s，并采集FAM、ROX通道荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。

检测结果如图3所示。图3显示了在使用5种引物对含有野生型或突变型A基因的待测核酸样品进行等温扩增后，使用2种检测探针对等温扩增产物进行熔解曲线分析的结果。结果显示，这2种检测探针与由野生型A基因(WT)或突变型A基因(269C>T，281A>C，281A>G，280G>C，280G>A和280G>T)生成的第一扩增链形成了具有不同T_m值的双链体。由此，通过对等温扩增产物进行熔解曲线分析，确定检测探针与第一扩增链形成的双链体的T_m值，可以分析和确定待测目标核酸分子是否含有突变，以及确定突变的类型。这些结果表明，根据本发明方法设计的引物和探针能够用于检测和分析目标核酸分子中的突变的存在和类型。

实施例3：检测探针的设计

通过本发明方法获得的等温扩增产物中含有两种能够自发形成茎环结构的核酸单链，即，因第一引物的延伸而产生的第一扩增链，和因第二引物的延伸而产生的第二扩增链。相应地，在熔解曲线分析中，可以针对第一扩增链设计检测探针(s链检测探针)，也可以针对第二扩增链设计检测探针(a链检测探针)。在本实施例中，以野生型B基因为例，评估了两种检测探针的检测能力。

在本实施例中，设计检测探针3、4(SEQ ID NO:21、22)，分别对获自野生型B基因的扩增链进行熔解曲线分析。

简言之，本实施例使用针对野生型B基因(SEQ ID NO:15)设计的5条引物(第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物)对含有野生型B基因的核酸样品进行等温扩增；扩增结束后，分别使用检测探针3或检测探针4对扩增产物进行熔解曲线分析。

按照表5配制25μL的反应体系：

表5：用于扩增和检测B基因的反应体系

按照下述扩增反应程序进行扩增：63℃扩增50min(以1min为一个循环，采集ROX通道的荧光信号)；95℃孵育1min(使BST DNA聚合酶失活)。随后，从40℃-85℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.4℃/s，并采集ROX通道荧光信号。本实施例采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。

检测结果如图4所示。图4显示了在使用5种引物对含有野生型B基因的待测核酸样品进行等温扩增后，使用检测探针3或4分别对等温扩增产物进行熔解曲线分析的结果。结果显示，检测探针3和4分别与因野生型B基因的等温扩增而生成的第一扩增链和第二扩增链形成了具有预期T_m值的双链体。这表明，针对第一扩增链或第二扩增链而设计的检测探针均可以用于本发明的方法中。

此外，图4的结果还显示，结合并检测第一扩增链的检测探针(s链检测探针，检测探针3)能够形成更具特异性的熔解峰，具有优于结合并检测第二扩增链的检测探针(a链检测探针，检测探针4)的检测效果。因此，不受理论限制，在本发明的方法中，使用结合并检测第一扩增链的检测探针是优选的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种分析目标核酸中突变的存在及其类型的方法

<130> IDC200477

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型A基因的核苷酸序列

<400> 1

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

atgggcaact accacccgca cggcgacgcg tcgatctacg acagcctggt gcgcatggcc 300

cagccctggt cgctgcgcta cccgctggtg gacggccagg gcaacttcgg ctcgccaggc 360

aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgct 425

<210> 2

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 269C>T突变体的核苷酸序列

<400> 2

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

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gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

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atgct 425

<210> 3

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 280G>A突变体的核苷酸序列

<400> 3

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gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

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cagccctggt cgctgcgcta cccgctggtg gacggccagg gcaacttcgg ctcgccaggc 360

aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgct 425

<210> 4

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 280G>C突变体的核苷酸序列

<400> 4

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

atgggcaact accacccgca cggcgacgcg tcgatctacc acagcctggt gcgcatggcc 300

cagccctggt cgctgcgcta cccgctggtg gacggccagg gcaacttcgg ctcgccaggc 360

aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgct 425

<210> 5

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 280G>T突变体的核苷酸序列

<400> 5

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

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atgggcaact accacccgca cggcgacgcg tcgatctact acagcctggt gcgcatggcc 300

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atgct 425

<210> 6

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 281A>C突变体的核苷酸序列

<400> 6

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gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

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aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgct 425

<210> 7

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 281A>G突变体的核苷酸序列

<400> 7

atgacagaca cgacgttgcc gcctgacgac tcgctcgacc ggatcgaacc ggttgacatc 60

gagcaggaga tgcagcgcag ctacatcgac tatgcgatga gcgtgatcgt cggccgcgcg 120

ctgccggagg tgcgcgacgg gctcaagccc gtgcatcgcc gggtgctcta tgcaatgttc 180

gattccggct tccgcccgga ccgcagccac gccaagtcgg cccggtcggt tgccgagacc 240

atgggcaact accacccgca cggcgacgcg tcgatctacg gcagcctggt gcgcatggcc 300

cagccctggt cgctgcgcta cccgctggtg gacggccagg gcaacttcgg ctcgccaggc 360

aatgacccac cggcggcgat gaggtacacc gaagcccggc tgaccccgtt ggcgatggag 420

atgct 425

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游交叉引物1s的核苷酸序列

<400> 8

gggtagcgca gcgaccaggg caactaccac ccgcac 36

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游检测引物2a的核苷酸序列

<400> 9

gggtagcgca gcgacca 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游检测引物3a的核苷酸序列

<400> 10

gctgggccat gcgcacc 17

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游剥离引物4s的核苷酸序列

<400> 11

acgccaagtc ggcccggt 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游剥离引物5a的核苷酸序列

<400> 12

gaagttgccc tggccgtcc 19

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 检测探针1的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n表示次黄嘌呤脱氧核苷酸残基

<400> 13

gntgtcgcag attcaccacg tcgccgcgcg gc 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 检测探针2的核苷酸序列

<400> 14

gcgcatcaac ctagccctag atcgacacgt cg 32

<210> 15

<211> 176

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型B基因的核苷酸序列

<400> 15

tcgtcagctc ccactcgtag ccgtacagga tctcgaggaa actgttgtcc catttcgtcg 60

gggtgttcgt ccatacgacc tcgatgccgc tggtgatcgc gtccttaccg gttccggtgc 120

catacgagct cttccagccc aagcccatct gctccagcgg agcagcctcg ggttcg 176

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B基因上游交叉引物1s的核苷酸序列

<400> 16

ttgggctgga agagctcgta tgtcggggtg ttcgtccata cg 42

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B基因下游检测引物2a的核苷酸序列

<400> 17

ttgggctgga agagctcgta t 21

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B基因下游检测引物3a的核苷酸序列

<400> 18

gaaccggtaa ggacgcgat 19

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B基因上游剥离引物4s的核苷酸序列

<400> 19

tcgtcagctc ccactcgtag ccgta 25

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B基因下游剥离引物5a的核苷酸序列

<400> 20

tgctccgctg gagcagatg 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 检测探针3的核苷酸序列

<400> 21

cgatcaccag cggcatcgag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 检测探针4的核苷酸序列

<400> 22

ctcgatgccg ctggtgatcg 20

Claims (10)

1.一种检测目标核酸中突变的存在及其类型的方法，其包括如下步骤：

(1)提供第一引物，第二引物，和第三引物；其中，

所述第一引物包含退火序列和交叉序列；其中，所述退火序列位于所述交叉序列的下游或3’端，并且二者直接连接或者通过核苷酸接头相连接；所述退火序列在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与目标核酸的第一链(a链)的第一区域杂交或退火，并且在允许核酸合成或扩增的条件下，能够起始延伸反应并生成含有待测核酸序列(Ta序列)的互补序列(Ts序列)的核酸链；所述Ta序列或Ts序列被怀疑含有突变；

所述第二引物和第三引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链的互补链(s链)杂交或退火；并且，所述第二引物能够与所述s链中位于Ts序列下游或3’端的第二区域退火或杂交；所述第三引物能够与所述s链中位于所述Ts序列下游或3’端的第三区域退火或杂交；并且，所述第二区域位于所述第三区域的下游或3’端；且，

所述交叉序列含有能够与所述第二区域退火或杂交的序列；

任选地，还提供第四引物和/或第五引物，其中，所述第四引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与a链中位于所述第一区域下游或3’端的第四区域退火或杂交；所述第五引物在允许核酸退火或杂交的条件下，能够与所述s链中位于所述第二区域的下游或3’端的第五区域退火或杂交；

(2)在允许核酸合成或扩增的条件下，将所述第一、第二和第三引物，以及任选的第四和/或第五引物，与目标核酸和核酸聚合酶接触(例如孵育)，并生成核酸扩增产物；所述核酸扩增产物包括：(i)第一扩增链，其含有第一引物的序列，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列；和(ii)第二扩增链，其含有第二区域的互补序列，第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列；

(3)使用一种或多种检测探针对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析；其中，

所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

并且，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列和/或能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列；或者，所述检测探针含有能够与Ta序列杂交或退火的Ta捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域杂交或退火的第一区域捕获序列和/或能够与第三区域的互补序列杂交或退火的第三区域互补-捕获序列；

(4)根据熔解曲线分析的结果，确定目标核酸中突变的存在及其类型。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述目标核酸是DNA，RNA，DNA/RNA复合物，或其混合物；

优选地，所述目标核酸以单链或双链形式存在；例如，所述目标核酸选自单链DNA，单链RNA，双链DNA，双链RNA，或DNA/RNA杂合双链；

优选地，所述目标核酸获自选自下列的来源：原核生物，真核生物，病毒，类病毒或核酸分子文库；

优选地，在进行步骤(2)之前，对所述目标核酸进行预处理，例如，纯化，富集或逆转录。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述Ts序列或Ta序列的长度为1-100nt，例如1-3nt，3-5nt，5-8nt，8-10nt，10-13nt，13-15nt，15-18nt，18-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-55nt，55-60nt，60-65nt，65-70nt，70-75nt，75-80nt，80-85nt，85-90nt，90-95nt，95-100nt；

优选地，所述突变选自添加，缺失，置换，或其任何组合。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：

(a)所述第一引物中的退火序列能够与所述a链中位于Ta序列下游或3’端的第一区域退火或杂交；

(b)所述退火序列含有与第一区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(c)所述退火序列位于所述第一引物的3’端；

(d)所述退火序列的长度为5-50nt，例如5-8nt，8-10nt，10-13nt，13-15nt，15-18nt，18-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt；

(e)所述退火序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(f)所述第一引物中的交叉序列含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(g)所述交叉序列含有所述第二引物的序列；

(h)所述交叉序列与所述第二引物的序列相同；

(i)所述交叉序列的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-14nt，14-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(j)所述交叉序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(k)所述第二引物含有与所述第二区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(l)所述第二引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-14nt，14-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(m)所述第二引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(n)所述第三引物含有与第三区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(o)所述第三引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(p)所述第三引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(q)所述第四引物含有与第四区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(r)所述第四引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-23nt，23-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(s)所述第四引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(t)所述第五引物含有与第五区域或其片段的核苷酸序列互补(例如完全互补)的序列；

(u)所述第五引物的长度为5-100nt，例如5-10nt，10-13nt，13-17nt，17-20nt，20-22nt，22-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(v)所述第五引物包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(w)所述核苷酸接头包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(x)所述核苷酸接头的长度为5-20nt，例如5-10nt，10-15nt，15-20nt。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析；

优选地，所述检测探针所包含的报告基团彼此不同；

优选地，所述检测探针在生成核酸扩增产物之前(例如，在进行核酸合成或扩增之前)，被添加至步骤(2)的反应体系中；或者，所述检测探针在生成核酸扩增产物之后(例如在步骤(2)结束之后)，与步骤(2)中生成的核酸扩增产物接触；

优选地，在步骤(3)中，在对所述第一扩增链和/或第二扩增链进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种检测探针的报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的一条或多条熔解曲线；随后，在步骤(4)中，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定突变的存在及其类型。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，在允许进行核酸等温扩增的条件下进行步骤(2)；

优选地，步骤(2)中，在55℃～65℃(例如55℃～58℃，58℃～60℃，60℃～63℃，63℃～65℃)的温度下，将所述第一、第二和第三引物，以及任选的第四和/或第五引物，与目标核酸和核酸聚合酶接触(例如孵育)，并生成核酸扩增产物；

优选地，所述接触(例如孵育)的持续时间为至少10min，至少20min，至少30min，至少40min，至少50min，或至少60min；

优选地，所述目标核酸的浓度为至少0.1×10³copies/μL(例如至少0.1×10³copies/μL，至少0.5×10³copies/μL，至少1.0×10³copies/μL，至少2.0×10³copies/μL)；

优选地，所述第一扩增链从5’端开始含有第一引物的序列，Ts序列，第三区域的序列和第二区域的序列；

优选地，所述第二扩增链从5’端开始含有第二区域的互补序列，第三区域的互补序列，Ta序列，和第一引物的互补序列。

7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述检测探针具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及任选地，含有能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列和/或能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列；

例如，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列；或者，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第一区域的互补序列杂交或退火的第一区域互补-捕获序列，并且，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端；或者，所述检测探针含有能够与Ts序列杂交或退火的Ts捕获序列，以及能够与第三区域杂交或退火的第三区域捕获序列，并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端；或者，所述检测探针含有Ts捕获序列，第一区域互补-捕获序列，和第三区域捕获序列；并且，第三区域捕获序列位于所述Ts捕获序列的上游或5’端，第一区域互补-捕获序列位于所述Ts捕获序列的下游或3’端；

优选地，不同的检测探针与第一扩增链和/或第二扩增链的不同区域杂交或退火；

(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(3)所述检测探针的长度为10-500nt，例如10-15nt，15-20nt，20-25nt，25-30nt，30-35nt，35-40nt，40-45nt，45-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt；

(4)所述检测探针具有3'-OH末端，或者其3'-末端是封闭的；

(5)所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；

优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；

(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；

(9)所述检测探针与所述核酸扩增产物形成的双链体的熔解温度高于第一、第二或第三引物与所述核酸扩增产物形成的双链体的熔解温度。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述核酸聚合酶具有链置换活性和/或高保真性；

优选地，所述核酸聚合酶还具有逆转录活性；

优选地，所述核酸聚合酶不具有5’至3’外切酶活性或具有显著降低的5’至3’外切酶活性；

优选地，所述核酸聚合酶选自Bst聚合酶，Bsm聚合酶，Phi29聚合酶，exo-Klenow聚合酶，Bsob Ⅰ聚合酶和exo-Bca聚合酶或其组合。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中，在步骤(3)中，对所述核酸扩增产物和所述检测探针进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；随后，对所获得的曲线进行求导，从而获得步骤(2)的产物的熔解曲线。

10.一种试剂盒，其包含第一引物，第二引物，第三引物，以及，一种或多种检测探针；其中，所述第一引物，第二引物，第三引物如权利要求1或权利要求4中所定义；且，所述检测探针如权利要求1，5或7中所定义；

优选地，所述试剂盒还包含第四引物，和/或第五引物，所述第四引物，第五引物如权利要求1或权利要求4中所定义；

优选地，所述试剂盒还包含核酸聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如权利要求8中所定义；

优选地，所述试剂盒还包含：用于进行核酸杂交的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、或其任何组合。

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