JP2004535196A - ＩＦＮα−５遺伝子のポリヌクレオチド及びポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は新規SNPを含んで成るTFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及び本発明の１つ以上のSNPにより生じた１つ以上の突然変異を含んで成る、天然野生型IFNα−５に由来する新規ポリペプチド並びにそれらの医療上の使用に関連する。
Description
【技術分野】
【０００１】
関連出願：
本発明は、２００１年５月３日に提出された、仏国特許出願第０１０５９１９号の名称「Nouveaux polynucleotide et polypepptide del´IFN alpha５」の優先権を主張する。
【０００２】
技術背景
技術分野
本発明は、新規SNPを含んで成る、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPにより生じた突然変異を含んで成る、天然野生型IFNα−５タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの医療上の使用に関連する。
【０００３】
関連技術
インターフェロンα５遺伝子（本明細書中ではIFN−５に言及される）はHenocoらの刊行物「Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes」J.Mol.Biol.;１８５（２）;pp.２２７〜２６０;（１９８５）に記載されている。
【０００４】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、アクセス番号X０２９５６の下でGenBankデータベースにおいてアクセス可能である。
【０００５】
IFNαは、それらの細胞抗増殖性効果、並びにそれらが抗ウィルス反応及び抗寄生虫性反応に関わることが知られている。
【０００６】
INFαは、いくつか他のサイトカインの発現を造血幹細胞のレベルで阻害し、並びに所定の腫瘍の細胞増殖を阻害することも知られている。
【０００７】
IFNαは、腎ガンにおいてEGFに対するレセプターの発現を減らすこと、所定のミトコンドリア遺伝子の発現を阻害すること、繊維芽細胞、単球及びBリンパ球の増殖を、特にin vitroで阻害すること、並びにBリンパ球による抗体の合成を遮断することも知られている。
【０００８】
IFNαは、腫瘍特異的抗原の発現を腫瘍細胞表層上で誘導すること、及びISREの特異的転写因子に作用することによってISRE型（インターフェロン刺激応答エレメント）のプロモーター領域の調節下にある遺伝子を誘導することも知られている。
【０００９】
IFNαは、様々な障害及び／又はヒトの疾患、例えば、様々なガン、ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、頸部、頭部及び腎臓のガンなど、心疾患、代謝性疾患、例えば、免疫系に関係しないもので肥満など、感染症、例えばB型及C型の肝炎及びAIDS、肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病、統合性失調症及び鬱病など、組織又は器官移植の拒絶、傷の治癒、透析患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法による治療に関連した疾患にさえも関わっていることが知られている。
【００１０】
IFNαは、特に、所定の白血病、転移性腎ガン並びに免疫不全に続いて現われる、腫瘍、例えば、AIDSの場合のカポジ肉腫の治療をするために用いられている。IFNαは、他の種類の腫瘍に対して及び所定のウィルス感染症に対しても有効である。
【００１１】
IFNαはまた、FDA(Food and Drug administration)によって、陰部疣贅又は性病の治療をするための承認もなされている。
【００１２】
しかし、IFNα、詳細にはIFNα−５は、それが医薬組成物中で用いられた場合に多くの副作用も持つ。それは例えば、急性過敏症の反応(蕁麻疹、気管支収縮、アナフィラキシーショックなど)、心臓不整脈(cardiac arrythmia)、低血圧症、癲癇性発作、甲状腺機能の問題、インフルエンザ様の症候群(発熱、発汗、筋肉痛)などである。
【００１３】
更に、IFNαで治療された患者は、これらの分子を中和する抗体を生産し、それ故にそれらの効果が低下する。
【００１４】
本発明者は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる機能を有することが可能な新規ポリペプチド及びIFNα−５遺伝子に対する新規ポリヌクレオチドの類似体をこの度発見した。
【００１５】
これら新規のポリペプチド及びポリヌクレオチドは特に、先に説明された障害もしくは疾患を治療もしくは予防するのに用いられて良く、そしてそれらに関連する不利な点の全て又は一部が回避されうる。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明はその第１の対象として、１又は複数のSNP(一塩基多型)を含んで成るので参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列とは異なる新規ポリヌクレオチドを有する。
【００１７】
ヒト参照野生型INFα−５遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号１)は、１４７５ヌクレオチドからなり且つ５７０ヌクレオチドのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番(開始コドン)〜ヌクレオチド１００３番(停止コドン))を含んで成る。
【００１８】
出願人は、参照野生型INFα−６遺伝子のヌクレオチド配列において１１個のSNPを同定した。これら１１個のSNPは以下の：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aである。
【００１９】
本発明の背景において、予め規定された、SNPの位置決めに対応するナンバリングは、ヌクレオチド配列(配列番号１)のナンバリングに関連していると解される。
【００２０】
文字a、t、c、及びgは、それぞれ窒素含有塩基のアデニン、チミン、シトシン、及びグアニンに対応する。
【００２１】
最初の文字は野生型のヌクレオチドに対応し、他方、最後の文字は突然変異したヌクレオチドに対応する。
【００２２】
従って、例えば、SNP c４２tは、参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号１)上の位置４２において、ヌクレオチドシトシン(c)のヌクレオチドチミン(t)への突然変異に対応する。
【００２３】
これらのSNPは、出願人によって、「Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applicantions」という名称の、２０００年１２月６日に提出された出願人の仏国特許出願第００２２８９４号(本明細書中で参考文献として引用されている)に記載された決定方法を用いて同定された。
【００２４】
この特許出願に記載されたこのような方法により、１つ(又は複数の)の既存のSNP(s)を同定することが、複数の個体のランダムな集団に由来する１以上の個体において可能になる。
【００２５】
本発明の範囲内で、例えば、コーディング配列を含んで成るIFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列の断片が、ランダム態様で選択された個体の集団における様々な個体から単離された。
【００２６】
次いで、これらの断片の配列決定が、ヘテロ２本鎖プロファイル(即ち参照野生型INFα−５遺伝子配列のものとは異なるプロファイルである)を有するこれら所定の試料に対して、DHPLC(「変性高性能液体クロマトグラフィー」)による分析後に行われた。
【００２７】
その後、このようにして配列決定された断片は、参照野生型IFNα−５遺伝子の断片のヌクレオチド配列及び本発明により同定されたSNPと比較された。
【００２８】
従って、前記SNPは天然であり、そしてそれらの各々が世界集団の所定の個体中に存在している。
【００２９】
参照野生型INFα−５遺伝子は、１８９個のアミノ酸の、アミノ酸配列番号２に対応する、未熟なタンパク質をコードし、それは最初の２３個のアミノ酸を含むシグナルペプチドの解裂によって、１６６個のアミノ酸の成熟タンパク質に転換されるだろう。
【００３０】
本発明の各コーディングSNP、即ち、a５１６g、c６４１g、g７９８cは、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列のレベルでの変更を生ずる。
【００３１】
アミノ酸配列におけるこれらの変更は以下のとおりである。
【００３２】
SNP a５１６gは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置２８及び成熟タンパク質の位置５において、アミノ酸グルタミン（Q）のアルギニン（R）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はQ５RもしくはQ２８Rと呼ぶだろう。
【００３３】
SNP c６４１gは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置７０、及び成熟タンパク質の位置４７において、アミノ酸グルタミン（Q）のグルタミン酸（E）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はQ４７EもしくはQ７０Eと呼ぶだろう。
【００３４】
SNP g７９８cは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置１２２及び、成熟タンパク質の位置９９において、アミノ酸システイン（C）のセリン（S）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はC９９SもしくはC１２２Sのと呼ぶだろう。
【００３５】
SNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cは、本発明に従って、野生型参照IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比較された場合、ポリペプチドの空間的な配置の変更を起こす。
【００３６】
これらの変更は、当業界で周知の方法により、例えば、de novo(SEQFOLD／MSIなど)、相同性(MODELER／MSIなど)、力場の最小化(DISCOVER、DELPHI／MSIなど)及び／又は分子動力学(CFF／MSIなど)のモデリングツール使用する、コンピューター分子モデリングによって確認されて良い。
【００３７】
かかるモデルの例は、本明細書中、後の実施例の節に示されている。
【００３８】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異Q５Rにより、INFα−５タンパク質のN末端部分の構造における局所的な変化(それは、この部分の３次元構造を維持するCys１残基のジスルフィド架橋によってアテニュエーションされている)が生じるていることである。
【００３９】
しかし、Aヘリックスの前のINFαのN末端ドメインは非常に良く保存されていることに注目することが重要である。更に、Shaffermanら(Journal of Biological Chemistry (１９８７) ２６２:pp.６２２７〜６２３７において)及び(Journal of Immunology (２００) １６７:pp.１４８２〜１４８９において)によりタンパク質のこの部分が、IFNαの活性に関連していることを示している。
【００４０】
従って、Q５R突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次元構造を有し、その構造における穏和な変化を伴い且つグルタミン(極性)からアルギニン(正に荷電した)への電荷の増加により、その活性と機能において有意な変化を伴う。
【００４１】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異Q４７Eにより、「AB」ループのC末端部分(それは、IFNα−５のそのレセプターへの結合に関係することが知られている)のほどきを生じることである。これは、図１A及び１Bに示されている。
【００４２】
位置４７のグルタミン酸残基は、このループ形成において見掛け上重要な役割を果たす。それの理由は、それが全てのインターフェロン中で維持されているからである。
【００４３】
従って、コンピューター分子モデリングにより我々が予想可能になることは、位置４７のグルタミン酸の存在が、天然野生型IFNα−５タンパク質の構造と機能の有意な変化に関わるだろうということである。
【００４４】
従って、Q４７E突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次元構造を有し、特にIFNα−５がそのレセプターに対して結合するレベルにおいて、その構造と機能における有意な変化を伴う。
【００４５】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異C９９Sにより、天然野生型IFNα−５タンパク質において、N末端部分並びにヘリックスC及びD間の「CD」ループの３次元構造に参加するジスルフィド架橋の消失がもたらされることである。これは、図２A及び２Bに示されている。
【００４６】
突然変異C９９SはN末端ループ（Cys１−Thr６）可動部(mobile)を作る。これにより、ヘリックスCの末端のほどき及び「CD」ループの乱れがもたらされる。
【００４７】
このジスルフィド架橋は、全てのα及びβインターフェロン中で保持されていることも知られている。故に、突然変異C９９Sは、突然変異IFNα−５タンパク質のN末端部分及びCDループの両方の構造変化が理由で、そのレセプターに対する結合に影響を及ぼすに違いない。
【００４８】
従って、C９９S突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次構造を有し、特にIFNα−５がそのレセプターに対して結合するレベルにおいて、その構造と機能における有意な変化を伴う。
【００４９】
本発明に従い、他のSNP、即ち、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aは、アミノ酸配列（配列番号２）のレベルにおいて、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の変更に関連しない。SNP、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、及びg１００９aは非コーディングである。
【００５０】
本発明に従い、ポリヌクレオチドのジェノタイピングは、集団において、これらのポリヌクレオチドの対立形質頻度を測定するような態様において行われて良い。ジェノタイピングの例は、本明細書中、後の実施例の節に示されている。
【００５１】
本発明のポリペプチドの機能の測定は、それらの生物活性を測定するのと同じように行われて良い。
【００５２】
これについて、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、Tリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカインの放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、予め悪性Friend赤白血病細胞を接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi burkitt’s細胞系統に対する細胞増殖抗活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系統に対する細胞増殖抗活性を測定すること並びに野生型IFNα−５との比較、及び／又は代表的な市販製品として選択された野生型IFNα−２との比較をすることが可能である。
【００５３】
本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを出発して獲得及び／もしくは同定された治療分子の、特に所定のヒト障害及び／もしくは疾患を予防及び治療するための使用するための目的も有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
定義
「参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトIFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）であるとして解される。
【００５５】
この配列は、アクセス番号X０２９５６でGenBankにおいてアクセス可能である。更に、ヒトIFNα−５遺伝子はK.Henocoら「Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes」；J.Mol.Biol.；１８５（２）；pp.２２７〜２６０（１９８５）に記載されている。
【００５６】
「天然野生型IFNα−５タンパク質」又は「野生型IFNα−５タンパク質」とは、参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされた成熟タンパク質として解される。天然野生型未熟タンパク質IFNα−５は、配列番号２に示されているペプチドに対応する。
【００５７】
「ポリヌクレオチド」とは、変更された又は変更されていないDNAもしくはRNAでありうるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドとして解される。
【００５８】
用語「ポリヌクレオチド」には、例えば、１本鎖又は２本鎖DNA、１もしくは複数の１本鎖領域の混合物からなるDNA及び１もしくは複数の２本鎖領域からなるDNA、１本鎖又は２本鎖RNA並びに１もしくは複数の１本鎖領域の混合物からなるRNA及び１もしくは複数の２本鎖領域からなるRNAを含む。用語ポリヌクレオチドとは、１又は複数の３重鎖領域を含むRNA及び／又はDNAも含みうる。ポリヌクレオチドとは、安定性の理由又は他の理由のために、変更された骨格を有する態様で変更された１又は複数の塩基を含むDNA又はRNAと同じであると解されている。変更された塩基とは、例えば、イノシンのような異常な塩基と解される。
【００５９】
「ポリペプチド」とは、例えば、活性中心ペプチド（isosteric peptide）の場合などでは、通常のもしくは変更されたペプチド結合によって互いに連結した２以上のアミノ酸を含んで成るペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質と解される。
【００６０】
ポリペプチドは、遺伝子コードによって規定された２０個のアミノ酸以外から成りうる。ポリペプチドは同様に、天然のプロセス、例えば、翻訳後成熟プロセスによって変更されたアミノ酸又は当業者に周知の化学的方法によって変更されたアミノ酸からなるポリペプチドであって良い。かかる変更は刊行物中に詳細に記載されている。これらの変更はポリペプチドのどこにおいても、即ち、ペプチド骨格、アミノ酸鎖又はカルボキシもしくはアミノ末端においてさえも現われる。
【００６１】
ポリペプチドは、ユビキチン化の後に枝分かれされうる、あるいは枝分かれの有無に関わらず環状化されうる。このような種類の変更は、天然又は当業者に周知の人工翻訳後プロセスの結果でありうる。
【００６２】
例えば、ポリペプチド変更には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の固定化、ヘムの共有結合性の固定化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合性の固定化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合性の固定化、フォスファチジルイノシトールの共有結合性の固定化、共有結合性もしくは非共有結合性の架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、システイン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、例えば、PEG化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード添加、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解法、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化（seneloylation）、硫酸化、アミノ酸付加、例えば、アルギニル化もしくはユビキチン化などが含まれると解される。かかる変更は刊行物：PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、 T.E Creighton, New York,１９９３、POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, １９８３、Seifterら、“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol.（１９９０）１８２：pp.６２６〜６４６、及びRattanら“Protein Synthesis：Post-Translational Modifications and Aging”、Ann NY Acad Sci（１９９２）６６３：pp.４８〜６２中に十分に記載されている。
【００６３】
「単離されたポリヌクレオチド」もしくは「単離されたポリペプチド」とは、それぞれ例えば、予め規定されたように、ヒトの体から単離されたか又は技術的な方法によって生産された、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドとして解される。
【００６４】
「同一性」とは、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列の同一性の測定として解される。
【００６５】
同一性とは、当業者に周知の用語であり、そして刊行物中に十分に記載されている。
COMPUTATIONAL MOLECULER BIOLOGY, Lesk, A.M.,Ed.,Oxford University Press, New York,１９９８;BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W.,Acdemic Press,New York,１９９３;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTＩ,Griffin A.M.及びGriffin H.G.,Ed Humana Press, New Jersy １９９４;及びSEQUENCE ANALYSIS MOLECULER BIOLOGY, von Heinje,G.,Academic Press,１９８７を参照のこと。
【００６６】
２つの配列の間での同一性及び類似性を測定するのに通常用いられる方法も、同じように刊行物中に十分記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J.Bishop,Ed,Acdemic Press,San Diego, １９９４、及びCarillo H.及びLipton D, Siam J Applied Math（１９９８）４８：p.１０７３を参照のこと。
【００６７】
例えば、ヌクレオチド配列（配列番号１）と９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドは、前記配列に比較して、１００ヌクレオチドに渡り突然変異を最大で５点含むポリヌクレオチドである。
【００６８】
これらの点突然変異は、１（又は数個の）ヌクレオチドの置換、付加、及び／又は１(又は数個の)欠失でありうる。
【００６９】
同様に、例えばアミノ酸配列（配列番号２）と９５％以上の同一性を有するポリペプチドは、前記配列に比較して、１００ヌクレオチドに渡り突然変異を最大で５点含むポリペプチドである。
【００７０】
これらの点突然変異は、１（又は数個の）アミノ酸の置換、付加、及び／又は１(又は複数の)欠失でありうる。
【００７１】
それぞれヌクレオチド配列(配列番号１)又はアミノ酸配列(配列番号２)と完全に同一ではなく、本発明のSNPを１つ以上含むと解される本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列の変異体であると考えられる。
【００７２】
通常、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のSNPを１つ以上を含んで成るヌクレオチド配列(配列番号１)と同じもしくは事実上同じ生物活性を有する。
【００７３】
類似の態様において、通常、本発明のポリペプチドは、本発明のコーディングSNPを１つ以上を含んで成るアミノ酸配列(配列番号２)と同じもしくは事実上同じ生物活性を有する。
【００７４】
本発明により、変異体は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、あるいは直接合成によって獲得されて良い。
【００７５】
「SNP」とは、ヌクレオチド配列中の塩基の任意の天然変異と解される。ヌクレオチド配列上で、SNPは、コーディング、サイレント又は非コーディングであって良い。
【００７６】
コーディングSNPとは、ヌクレオチド配列のコーディング配列中に含まれた多型であり、それは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列におけるアミノ酸の変更に関わる。この場合、用語SNPを、ひいては、アミノ酸配列中の突然変異と同じように適用される。
【００７７】
サイレントSNPとは、ヌクレオチド配列のコーディング配列中に含まれた多型であり、それは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列におけるアミノ酸の変更に関わらない。
【００７８】
非コーディングSNPとは、ヌクレオチド配列の非コーディング配列中に含まれた多型である。この多型は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又はエンハンサー配列の部位中で顕著に発見される。
【００７９】
「機能的SNP」とは、先に規定されたように、機能を有するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列中に含まれているSNPであると解される。
【００８０】
「機能」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性であると解される。
【００８１】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能は、野生型の参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性の保存、増大、減少又は抑制からなりうる。
【００８２】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能は、同じように、参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性における本質的な変化にある。
【００８３】
前記生物活性は、特に本発明のポリペプチドとレセプターとの親和性又は親和性の不在に結びつきうる。
【００８４】
ポリヌクレオチド
本発明は、その第１の目的のために：
a) 配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０%以上の同一性、好適には９０%以上の同一性、更に好適には９５%以上の同一性、そして更には９９%以上の同一性を有するヌクレオチド配列(以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解されるヌクレオチド配列)；又は
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列；
を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを有する。
【００８５】
本発明の背景において、ナンバリングは、ヌクレオチド配列(配列番号１)中のSNPの位置に対応していると解される。
【００８６】
本発明は、同じように：
a) ヌクレオチド配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列 (これらの配列は、それぞれ以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解される)；又は
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列；
を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関連する。
【００８７】
好適には、本発明のポリヌクレオチドは、配列(配列番号１)又はそのコーディング配列(これらの各配列はそれぞれ、以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解される)からなる。
【００８８】
本発明によれば、先に規定されたポリヌクレオチドは：a５１６g、c６４１g、g７９８cからなる群から選択されたコーディングSNPを１つ含んで成る。
【００８９】
一層好適には、先に規定されたポリヌクレオチドは、SNP g７９８cを含んで成る。
【００９０】
例えば、先に規定されたポリヌクレオチドは、同じように以下の非コーディングSNPを１つ以上含んで良い。その非コーディングSNPは：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aである。
【００９１】
本発明は、その目的のために同じように：
a) 以下の非コーディングSNP： c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aを１つ以上含んで成ると解される、ヌクレオチド配列(配列番号１)；又は、
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
を含んで成る又はからなる単離されたポリヌクレオチドを有する。
【００９２】
本発明は：
a) 以下のSNP： c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a１５６g、c６４１g、g７９８c、g１００９aを１つ以上含んで成ると解されるヌクレオチド配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列；又は、
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列
の一部からなる、10ヌクレオチド以上からなる単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００９３】
好適には、先に規定された前記単離されたポリヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドからなる。
【００９４】
本発明は、その目的のために：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列(配列番号２);又は
b) アミノ酸の配列(配列番号２)の位置２４〜１８９に含まれたアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも有する。
【００９５】
本発明の背景において、SNP Q２８R、Q７０E及びC１２２Sの位置を決めることに対応するナンバリングは、アミノ酸配列(配列番号２)のナンバリングに関連すると解される。
【００９６】
本発明の好適な目的によれば、先に規定されたポリペプチドは、先に規定されたコーディングSNPを１つ含んで成る。
【００９７】
更に好適には、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸配列（配列番号２）の全部又は一部を含んで成るポリペプチドをコードし且つコーディングSNP C１２２S有する。
【００９８】
好適には、本発明のポリヌクレオチドはDNA又はRNA分子からなる。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成方法により得られうる。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列から出発し、ヌクレオチド配列（配列番号１）上の各SNPについての突然変異ヌクレオチドによって野生型ヌクレオチドを変更することにより、部位特異的突然変異誘発によって得られうる。
【０１０１】
例えば、SNP g７９８cを含んで成る本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号１）上の位置７９８で、ヌクレオチドグアニン（g）をヌクレオチドシトシン（c）によって変更することにより、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列から出発する部位特異的（site−directed）突然変異誘発によって得ることができうる。
【０１０２】
このようにして行われうる部位特異的突然変異誘発の方法は、当業者に周知である。特に、TA Kunkelの１９８５年の刊行物「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」82：488に記載されている。
【０１０３】
単離されたポリヌクレオチドは、同じように、例えば、プレ、プロ、もしくはプレプロタンパク質アミノ酸配列又はマーカーアミノ酸配列、例えば、ヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、融合タンパク質もしくは他の精製産物を獲得するために、他のタンパク質もしくはタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列に関連しうる。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、ヌクレオチド配列、例えば、５´及び／又は３´非コーディング配列、例えば、転写されるもしくは転写されない配列、翻訳されるもしくは非翻訳されない配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列もしくはmRNAを安定化する配列さえも含む。
【０１０６】
前記ヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列とは、ストリンジェント条件下でこのヌクレオチド配列とハイブリダイズできるものとして規定されている。
【０１０７】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、必ずではないが一般には、ヌクレオチド配列が、８０％以上、好適には９０％以上、更に一層好適には９５％以上そして最も好適には９７％以上の同一性を有する場合にハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件として解されている。
【０１０８】
前記ストリンジェント条件は、当業者に周知の方法、例えば、５０％のホルムアミド、５×SSC（１５０mMのNaCl、１５mMのクエン酸三ナトリウム）、５０mMのリン酸ナトリウム（pH＝７.６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸及び２０μgの変性サケ精子DNAを含んで成る溶液中、４２℃でのポリヌクレオチドのインキュベーション、しかる後に０．１×SSCで６５℃でのフィルターの洗浄によって達成することができる。
【０１０９】
本発明の範囲内で、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件により、同一性が１００％に等しいヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが可能になる場合、当該ヌクレオチド配列は、a)で記載されたようなヌクレオチド配列に対して厳密に相補的であると考えられる。
【０１１０】
本発明の目的の範囲内で、あるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列は、本発明のアンチセンスSNPを１つ以上含んで成る。従って、例えば、もし前記ヌクレオチド配列がSNP g７９８cを含んで成るならば、それは、位置７９８相当にグアニン（g）ヌクレオチドを含んで成る相補的なヌクレオチド配列である。
【０１１１】
SNP を含んで成るポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅
本発明は、その目的のために：
ヌクレオチド配列(配列番号１)又は必要ならそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部を同定、ハイブリダイズ及び／もしくは増幅するために、
a) ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチド；及び／又は
b) SNPを１つ以上含んで成る本発明のポリヌクレオチド；
の全部もしくは一部の使用をも有する。これらヌクレオチド配列(配列番号１)又はそのコーディング配列は各自、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aを１つ以上含んで成ると解される。
【０１１２】
SNP の頻度のジェノタイピング及び測定
本発明は同じように、その目的のために：
ヌクレオチド配列(配列番号１)又は必要ならそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部をジェノタイピングするために、
a)ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチド；及び／又は
b)SNPを１つ以上含んで成る本発明のポリヌクレオチド；
の全部もしくは一部の使用をも有する。これらヌクレオチド配列(配列番号１)又はそのコーディング配列は各自、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aを１つ以上含んで成ると解される。
【０１１３】
本発明によれば、ジェノタイピングは個体又は個体の集団に対して行われて良い。
【０１１４】
本発明の目的の範囲内で、ジェノタイピングは、個体又は個体の集団の遺伝子型を特定するための方法として規定されている。遺伝子型は、１又は複数の特異的な座に存在する対立遺伝子からなる。
【０１１５】
「個体の集団」とは、ランダム又は非ランダム態様で選択された個体の集団として解されている。これらの個体はヒト、動物、微生物又は植物であって良い。
【０１１６】
通常、個体の集団は、１０以上の個体、好ましくは１００〜３００の個体を含んで成る。
【０１１７】
個体は、それらの民族性又はそれらの遺伝子型に従い、特に下記の障害及び／又は疾患に冒されているものが選択されて良い。その障害及び／又は疾患とは：ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、頸部、頭部、及び腎臓のガン、心疾患、代謝性疾患、例えば、免疫系と無関係な肥満症など、感染症、特にB型及C型の肝炎及びAIDS、肺炎、潰瘍性大腸炎などのウィルス性感染症、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病、統合性失調症及び鬱病など、組織又は器官移植の拒絶、傷の治癒、透析された患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法による治療に関連した疾患である。
【０１１８】
本発明の機能的SNPは、好適に個体の集団においてジェノタイピングされている。
【０１１９】
SNPをジェノタイピングするために行ことができうる複数の方法が存在する（特に、Knok Pharmacogenomics,２０００年、第１版、pp.９５〜１００“High−throughput genotyping assay approachs”を参照のこと）。これらの技術は、以下の４つの原理に基づいている。その原理とは：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによる、オリゴヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのライゲーション又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの解裂である。これらの各技術は、検出系、例えば、直接もしくは偏光蛍光の測定又は質量分析法と組み合わされて良い。
【０１２０】
ジェノタイピングは特に、偏光蛍光スキャナーと共同して、ホットdd NTP（異なる蛍光によって標識された２つの異なるdd NTP）及びコールドdd NTP（標識されていない２つの異なるdd NTP）によるミニシークエンシングにより行われうる。偏光蛍光の読み込みを伴うミニシークエンシングプロトコール（FP-TDI Technology or Fluoreseence Polarization Templated-direct Dye-Terminator Incorporation）は当業者に周知である。
【０１２１】
それは、各個体のDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅の後に得られた産物により行われて良い。このPCR産物は、調べられるSNPを含むポリヌクレオチドの遺伝子領域を網羅するように選択されている。次いで、PCRサーマルサイクラーの最後の段階の後に、プレートは偏光蛍光スキャナー上に置かれて、蛍光特異的励起フィルター及び放射フィルターを用いることによって標識された塩基の読み込みがなされる。標識された塩基の強度値は、グラフ上で報告される。
【０１２２】
PCR増幅のために、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、本発明のSNPの位置に従い、当業者によって容易に選択されて良い。
【０１２３】
例えば、PCR増幅プライマーのためのセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列はそれぞれ：
【化１】
でありうる。
【０１２４】
このヌクレオチド配列により、ヌクレオチド配列（配列番号１）における、ヌクレオチド３９０〜ヌクレオチド１０７０の６８１ヌクレオチドの長さの断片の増幅が可能になる。
【０１２５】
次いで、個体の集団において、SNPを含んで成る遺伝子によってコードされる各対立遺伝子の頻度（対立遺伝子頻度）の統計的解析が達成されている。それにより、様々な亜集団におけるそれらの影響力及びそれらの分布の重要性が特定可能になり、もし必要であれば、この個体の集団を形成する多様な民族集団も特定可能になる。
【０１２６】
調査された集団で確認された様々な対立遺伝子の分布頻度を見積もるために、ジェノタイピングデータが解析されている。対立遺伝子頻度の計算はSAS−suite（登録商標）（SAS）又はSPLUS（登録商標）（MathSoft）などのソフトウェアを用いて行われて良い。様々な民族集団の個体集団の全域に渡る本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェアARLEQUIN（登録商標）及びSAS−suite（登録商標）により行われてうる。
【０１２７】
遺伝子マーカーとしての本発明の SNP
遺伝子の機能的配列（プロモーター、スプライシング部位、コーディング領域など）を変更するSNPは、疾患の感受性又は耐性に直接関連しているようだが、全てのSNP（機能的又は非機能的な）により、これらの疾患の状態に関連する１又は複数の遺伝子を同定するための有用なマーカーが提供されて良く、従って、全てのSNPはこれらの疾患の症状に間接的に関連している（Cargillら（１９９９）.Nature Genetics ２２：pp.２３１〜２３８；Rileyら（２０００）pharmacogenomics１：pp.３９〜４７；Roberts L（２０００）Science ２８７：pp.１８９８〜１８９９を参照のこと）。
【０１２８】
従って、本発明は、INFα−５遺伝子のポリヌクレオチドにおいて以下のSNPを１つ以上含んで成るデータバンクにも関する。そのSNPは：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aである。
【０１２９】
前記SNPは、ヌクレオチド配列（配列番号１）上でのそれらの位置に従い番号が降られていることは十分理解されるだろう。
【０１３０】
このデータバンクは：
（ｉ）INFα−５遺伝子のポリヌクレオチドにおける、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つ以上、と
（ii）疾患又は疾患に対する耐性
の直接的な関連を統計学的に特定するために解析されて良い。
【０１３１】
本発明は、疾患又は疾患に対する耐性のための診断／予測キットを開発するために、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つ以上の使用にも関する。
【０１３２】
先に規定された本発明のSNPは、直接もしくは間接的に、疾患もしくは疾患に対する耐性に関連しうる。
【０１３３】
好適に、これらの疾患は、先に記載したように規定されたものであって良い。
【０１３４】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明はその目的のために、本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含んで成る組換えベクターをも有する。
【０１３５】
多くの発現系、例えば、限定ではないが、染色体、エピソーム、及び誘導ウィルス（derived virus）などが用いられて良い。さらに詳細には、用いられる組換えベクターは細菌のプラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス、例えば、バキュロウィルス、SV４０などのパピローマウィルス、ワクシニアウィルス、アデノーマウィルス、キツネポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、レトロウィルスなどに由来して良い。
【０１３６】
これら組換えベクターは同じように、コスミド又はファージミド誘導体であって良い。ヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に当業者に周知の方法によって挿入されてうる。それらの方法は、例えば、MOLECULAR CLONNING：A LABORATORY MANYUAL, Sambrookら、第４版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,２００１に記載されている。
【０１３７】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、並びに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写及び本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含んで成る。これらの配列は、用いられている宿主細胞に従って選択される。
【０１３８】
従って、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドが、小胞体のルーメンへ、細胞膜周辺腔へ、膜上に又は細胞外環境に向けられるように、例えば、適切な分泌シグナルが組換えベクター中に組み込まれて良い。
【０１３９】
本発明はその目的のために、本発明の組換えベクターを含んで成る宿主細胞も有する。
【０１４０】
宿主細胞中への組換えベクターの導入は、当業者に周知の例えば、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davisら、第２版、McGraw-Hill Professional Publishing、 １９９５年及びMOLECULAR CLONONG：A LABORATORY MANUALなどに記載されている、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、陽イオン脂質、エレクトロポレーション、トランスダクションによるトランスフェクション、マクロINジェクション、トランスフェクション又はインフェクションなどの方法によって行われて良い。
【０１４１】
宿主細胞は、例えば、ストレプトコクチ（streptococci）、スタフィロコクチ（staphylococci）、大腸菌（E.coli）又はバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）などの細菌細胞、酵母細胞及びアスペルジルス（Aspergillus）ストレプトミセス（Streptomyces）の細胞などの真菌の細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）S２及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf９などの昆虫の細胞、CHO、COS、HeLa、C１２７、BHK、HEK２９３細胞などの動物の細胞及び治療される人の細胞又は植物の細胞であってさえも良い。
【０１４２】
宿主細胞は、本明細書中で後に分かるように、例えば本発明のポリペプチドを発現するために又は医薬組成物中の活性産物として用いられて良い。
【０１４３】
ポリペプチド
本発明はその目的のために：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列(配列番号２)の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
の全部もしくは一部と８０％以上の同一性、好適には９０％以上の同一性、さらに好適には９５％以上の同一性、及び更に好適には９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、単離されたポリペプチドを有する。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは、同じように：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列；
の全部又は一部を含んで成ることができる。
【０１４５】
本発明のポリペプチドはさらに詳細には：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２)の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
から成る。
【０１４６】
好適には、本発明のポリペプチドは：Q２８R、Q７０E、C１２２Sからなる群から選択されたコーディングSNPを１つ含む。
【０１４７】
一層に好適には、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸２４〜１８９を含んで成り、そしてコーディングSNP C１２２Sも有する。
【０１４８】
本発明は、同じように、その目的のために、上記のポリペプチドを調製するための方法を有する。この方法では、先に規定した宿主細胞が培養培地中で培養されそして前記ポリペプチドが当該培養培地から単離されている。
【０１４９】
ポリペプチドは宿主細胞の培養培地から出発して、当業者に周知の方法、例えば塩、詳細には硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸、酸抽出物などのカオロピック剤による沈殿；イオン交換クロマトグラフィー；ホスホセルロースクロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；親和性クロマトグラフィー；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は除外（exclusion）クロマトグラフィーなどの方法によって精製されて良い。
【０１５０】
「培養培地」とは、本発明のポリペプチドが単離又は精製される培地として解される。この培地は、細胞外培地及び／又は細胞溶出物からなっていて良い。もし、前記ポリペプチドの構造が単離及び精製途中に変化したならば、当業者に周知の技術により、同じように、細胞溶出物を当該ポリペプチドに対して活性のある構造に戻すことが可能である。
【０１５１】
抗体
本発明はその目的のために、免疫特異的抗体を得るための方法をも有する。
【０１５２】
「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体並びにFab断片、例えばFab又は免疫グロブリン発現ライブラリー産物と解される。
【０１５３】
前記免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチドによる動物の免疫化によって得られうる。
【０１５４】
本発明は、先に規定した、本発明のポリペプチドに対する免疫特異的抗体にも関連する。
【０１５５】
本発明のポリペプチド、その断片の１つ、類似体、その変異体の１つ又はこのポリペプチドを発現する細胞が免疫特異的抗体を生産するのに用いられて良い。
【０１５６】
用語「免疫特異的」とは、本発明のポリペプチドに対して当業界で公知の他のペプチドよりも良い親和性を有する抗体を意味する。
【０１５７】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチド、その断片の１つ、類似物もしくはエピトープ断片又は、このポリペプチドを動物中(好ましくはヒトではない)で発現する細胞を当業者に周知の方法により投与することによって得られうる。
【０１５８】
モノクローナル抗体を調製するために、細胞系統から出発する抗体生産のための典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohlerら、Nature(１９７５)２５６：pp.４９５〜４９７)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kohlerら、Nature(１９７５)２５６：pp.４９５〜４９７)及びEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (第２７巻、UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series)における「The EBV−hybridoma technique and its application to human lung cancer」(R.A Reisfeld and S.Sell著)、pp.７７〜９６、 Alan R.Liss Inc. N.Y. １９８５,pp.７７〜９６)が用いられて良い。
【０１５９】
単鎖抗体を生産するための技術は、同じように、例えば、米国特許第４，９６４，７７８号に、同じように記載されている。
【０１６０】
トランスジェック動物、例えばマウスなどは、同じようにヒト化抗体を生産するために用いられて良い。
【０１６１】
本発明のポリペプチドと相互反応する因子
本発明は、同じように、その目的のために、本発明のポリペプチドを活性化もしくは阻害する因子を同定するための方法をも有する。その方法は：
a)コーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを調製し；
b)a)の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を調製し；
c)b)の宿主細胞と試験される因子とを接触させ；そして
d)試験される因子によって発生した活性化もしくは阻害効果を測定すること、
を含んで成る。
【０１６２】
本発明のポリペプチドは、これと相互に作用する化合物をスクリーニングするための方法に用いられても良い。
【０１６３】
これらの化合物は、本発明のポリペプチド固有の活性を、活性化する(アゴニスト)又は阻害する(アンタゴニスト)でありうる。これらの化合物は、同じように、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であって良い。Coliganら、Current Protocols in Immunology１(２)、第５章(１９９９)を参照のこと。
【０１６４】
一般に、かかる方法を行うには、本発明のポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を生産することが望ましい。かかる細胞は、例えば、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエなど昆虫の細胞又は大腸菌のような細菌であって良い。
【０１６５】
次いで、これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物は、試験される化合物の存在下に置かれる。
【０１６６】
次いで、試験される化合物の、本発明のポリペプチドとの結合能力が観察され、並びに機能的反応の阻害又は活性化も観察される。
【０１６７】
上記方法の段階d)は、これは直接又は間接的に標識されている試験される因子を用いることによって行われうる。その方法には、標識されたもしくは標識されていない因子及び標識された競合因子を用いることによる競合試験も含まれて良い。
【０１６８】
もし、試験される因子が、本発明のポリペプチドを発現する細胞に対して活性化シグナル又は阻害シグナルを発生するなら、検出されるシグナルに従い、適切に選択された検出手段を用いることによって、そのシグナルが、同じように測定されて良い。
【０１６９】
かかる活性化因子もしくは阻害因子は、ポリヌクレオチドであり、所定の場合、例えば、タンパク質もしくは抗体などの、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドでありうる。
【０１７０】
本発明は、同じように、その目的のために、本発明のポリペプチドによって活性化もしくは阻害される因子を同定するための方法も有する。その方法は：
a)コーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを調製し；
b)a)の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を調製し；
c)b)の宿主細胞を試験される因子の存在下に置き；そして
d)当該ポリペプチドによって、試験される因子に対して発生された活性化もしくは阻害効果の測定をすること、
を含んで成る。
【０１７１】
本発明のポリペプチドによって活性化もしくは阻害された因子は、それぞれこのペプチドの存在下における活性化もしくは阻害によって反応する因子である。
【０１７２】
本発明のポリペプチドによって直接もしくは間接的に活性化もしくは阻害される因子は、例えば、膜レセプターもしくは核内レセプター、キナーゼそして一層好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子などのポリペプチド又はポリヌクレオチドからなる。
【０１７３】
疾患の検出
本発明は、その目的のために、対象者における本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの生物学的な特性を分析するための方法をも有する。その方法は：
a) 対象者のゲノムにおける本発明のポリヌクレオチドの存在又は不在を特定すること；
b) 対象者における本発明のポリヌクレオチドの発現のレベルを測定すること；
c) 対象者における本発明のポリペプチドの存在又は不在を特定すること；
d) 対象者における本発明のポリペプチドの濃度を測定すること；
e) 対象者における本発明のポリペプチドの機能を特定すること、
を１つ以上含んで成る。
【０１７４】
これらの生物学的な特性は、対象者中もしくは対象者由来の試料において分析されて良い。
【０１７５】
これらの生物学的特性により、遺伝子診断を開始することを可能にし且つ対象者が病気に冒されるかもしくは冒される危険性があるのか、又は、逆に、本発明のポリヌクレオチド及び／又は本発明のポリペプチドの存在につながりがある疾患、軽い病気もしくは障害の進行に対して部分的に耐性が存在するかどうかを特定することが可能になりうる。
【０１７６】
これらの疾患は、障害並びに／又はヒト疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０１７７】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０１７８】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０１７９】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０１８０】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０１８１】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０１８２】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれて良い。
【０１８３】
この方法により、対象者における、本発明のSNPによってコードされる突然変異対立遺伝子の存在に関連する疾患の耐性又は遺伝子診断も可能になる。
【０１８４】
好適には、段階a)において、先に規定されたコーディングSNPを1つ以上含むポリヌクレオチドの存在又は不在が確認されるだろう。
【０１８５】
ポリヌクレオチドの検出は、試験される対象者由来の生物試料、例えば、細胞、血液、尿、唾液から出発して、又は試験される対象者の生検体もしくは検死解剖体から出発して行われて良い。ゲノムDNAは、例えば、直接又はPCR増幅の後に検出のために用いられて良い。RNAもしくはcDNAは、同じように、類似の態様において用いることができうる。
【０１８６】
次いで、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と対象者のゲノムにおいて検出されたヌクレオチド配列とを比較することが可能である。
【０１８７】
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション方法によって、変性剤を伴う又は伴わない電気泳動ゲル上でのDNA断片の移動度の差によって、又は融解温度の差を比較することによって行うことができる。Myersら、Science(１９８５)、２３０：p１２４２を参照のこと。かかるヌクレオチド配列の構造中の規定の位置でのかかる変更は、同じように、ヌクレアーゼ保護試験、例えばRN ase及びS１ヌクレアーゼにより、又は化学解裂剤によっても明らかにされて良い。Cottonら、Proc.Nat Acad.Sci.USA（１９８５）８５：pp４３９７〜４４０１を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド断片を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブは、同じように、スクリーニングを行うために用いられて良い。
【０１８８】
当業者に周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を特定するために、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝的多様性を同定するために用いられて良い(Science(１９８６)、第２４巻、pp.６１０〜６１３を参照のこと)。
【０１８９】
段階b)において、ポリヌクレオチドの発現のレベルは、このポリヌクレオチド(及びポリペプチドのためのコード領域)によってコードされるRNAのレベルを、当業者に周知の方法、例えば、PCR、RT−PCR、RN ase保護法、ノーザンブロット、及び他のハイブリダイゼーション法により定量化することによって測定されて良い。
【０１９０】
段階c)及びd)において、対象者又は対象者由来の試料における本発明のポリペプチドの存在もしくは不在並びに濃度(の特定)は、当業者に周知の方法、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合的結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験によって行われて良い。
【０１９１】
段階d)に引き続いて、本発明のポリペプチドの測定された濃度は、通常対象者において発見される天然野生型タンパク質の濃度と比較されうる。
【０１９２】
当業者は、感度、又はそれとは対照的な、疾患、軽い病気もしくは先に示した障害に対する耐性を示す閾値(上方もしくは下方の)を、従来技術の刊行物を用いることにより、もしくは先に記載したものなどの常用の試験もしくはアッセイにより容易に確認できうる。
【０１９３】
段階e)において、本発明のポリペプチドの機能の測定は当業者に周知の方法、例えば、先に記載したin vitro試験によって、又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞を使用することによって行われて良い。
【０１９４】
治療化合物及び疾患の治療
本発明は、その目的のために、活性因子として、本発明のポリペプチドを含む治療化合物も有する。
【０１９５】
本発明は、様々なヒトの疾患及び／もしくは障害を予防もしく治療をするのが目的の治療化合物を製造するための、本発明のポリペプチドの使用にも関連する。これらの疾患は、障害及び／又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０１９６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０１９７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０１９８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれうる。
【０１９９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０２００】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０２０１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２０２】
好適に、本発明のポリペプチドは、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための治療化合物を製造するために用いられて良い。その障害及び／又は疾患には、例えば、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫などの免疫疾患の後に現われる腫瘍及び陰部疣贅又は性病が挙げられる。
【０２０３】
所定の、本発明のポリペプチドの獲得を可能にする化合物、並びにこのポリペプチドによってもしくはこのポリペプチドから獲得もしくは同定された化合物は、ヒトの体を治療学的に治療するために、即ち、治療化合物として用いられて良い。
【０２０４】
従って、本発明は、その目的のために、活性因子として先に規定したコーディングSNP１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／もしくは先に規定した抗体を含む医薬も有する。
【０２０５】
本発明は、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体の、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための医薬を製造するための使用にも関連する。これらの疾患は、障害並びに／又はヒト疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０２０６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２０７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２０８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０２０９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれて良い。
【０２１０】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０２１１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２１２】
好適に、本発明は、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体の、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための医薬を製造するための使用にも関連する。その障害及び／又は疾患には、例えば、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病及び、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫など免疫欠損症の後に現われる腫瘍、及び陰部疣贅又は性病が挙げられる。
【０２１３】
活性因子として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の投与量は、化合物の選択、治療上の適応、投与の態様、製剤の性質、対象者の性質及び医者の判断に依存する。
【０２１４】
本発明のポリペプチドは、活性因子として用いられた場合、一般に１〜１００μg／kg対象者の量で投与される。
【０２１５】
本発明は、その目的のために、医薬組成物も有する。それは、活性因子として、例えば、本発明のポリペプチド、先に規定したコーディングSNPを１つ以上を含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体などの上記化合物を１つ以上含み、並びに医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物も有する。
【０２１６】
これらの医薬組成物において、活性因子は生理的に有効な量において有利に存在している。
【０２１７】
これらの医薬組成物は、例えば、固体又は液体であって良く、且つ通常ヒトの医薬において用いられている医薬形態、例えば、単純もしくは被覆錠剤、ジェルキャップ、顆粒、カラメル、座薬及び好適には注射可能製剤及び注射可能にするための粉末、の形態において存在して良い。これらの医薬形態は、通常の方法により調製されて良い。
【０２１８】
活性因子は、通常医薬中で用いられている賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性又は非水性ビヒクル、動物もしくは植物起源の脂肪性物質、パラフェン誘導体、グリコール、様々な湿潤剤、分散剤もしくは乳化剤、防腐剤の中に組み込まれて良い。
【０２１９】
本発明の活性因子は、単独であるいは他の化合物、例えば、インターロイキンもしくはインターフェロンなど他のサイトカインなどの治療化合物と組み合わせて用いられて良い。
【０２２０】
様々な処方の医薬組成物が投与の態様により適用されている。
【０２２１】
医薬組成物は当業者に公知の様々な投与経路によって投与されて良い。
【０２２２】
本発明は、同じように、その目的ために、活性因子として、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドの全部又は一部、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体などの先に規定した化合物を１つ以上含み、並びに医薬的に許容できる適切な賦形剤を含む診断組成物を有する。
【０２２３】
この診断組成物は、例えば、診断組成物中で一般に用いられている、バッファー及び防腐剤など適切な賦形剤を含んでも良い。
【０２２４】
本発明は、同じように：
a) 治療的に有効な量の本発明のポリペプチド；及び／もしくは
b) 本発明のポリヌクレオチド；及び／もしくは、
c) 先に規定した、治療される対象者由来の宿主細胞、
を使用して、対象者において本発明のポリペプチドの発現又は活性を高める目的の治療化合物を調製する目的も有する。
【０２２５】
従って、本発明のポリペプチドの発現又は活性を高める必要がある対象者を治療するためには、いくつかの方法が可能である。
【０２２６】
治療的に有効な量の本発明のポリペプチドを、医薬的に許容できる賦形剤により対象者に対して投与することが可能である。
【０２２７】
本発明のポリヌクレオチドを対象者に投与することによって本発明のポリペプチドの内生生産を高めることも可能である。例えば、このポリヌクレオチドはレトロウィルス発現ベクター中に挿入できうる。かかるベクターは、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウィルスプラスミドベクターによって感染されている細胞から出発して、トランスダクションされた当該細胞が注目の遺伝子を含む感染性ウィルス粒子を生産する態様において、単離できうる。Strachan and Read ,Bios Scientific Publishers Ltd.(１９９６)、Human Molecular GeneticsにおけるGene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,第２０章、を参照のこと。
【０２２８】
本発明により、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含むポリヌクレオチドが好適に用いられるだろう。
【０２２９】
同じように、対象者に対して、彼に属する宿主細胞を投与することは可能であり、これらの宿主細胞は、先に規定した本発明のポリペプチドを発現するように、予め取り出されて改変されている。
【０２３０】
本発明は、同じように：
a) 治療上有効な量の先に規定した免疫特異的抗体；及び／又は
b) 本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド
の、対象者において本発明のポリペプチドの発現もしくは活性を下げる目的の治療化合物を調製するための使用にも関連する。
【０２３１】
従って、対象者に対して、治療上有効な量の阻害因子及び／又は先に規定した抗体を、可能性としては、医薬的に許容できる賦形剤との組み合わせにおいて投与することも可能である。
【０２３２】
同じように、対象者に対して、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする、本発明の相補的なポリヌクレオチドを投与することによって、本発明のポリペプチドの内生生産を減らすことが可能である。
【０２３３】
好適には、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む相補的ポリヌクレオチドが用いられて良い。
【０２３４】
本発明は、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つを含んで成るという条件のヌクレオチド配列(配列番号１)と、９５％以上の同一性(好適には９７％以上の同一性、更に好適には９９％の同一性、そして特に１００％の同一性)を有するヌクレオチド配列が患者ゲノム中に存在することに関連したIFNα−５突然変異体によって生じる障害もしくは疾患の予防もしくはその患者の治療をする医薬を調製するための、IFNα−５タンパク質の使用も考慮する。
【０２３５】
好適には、前記医薬は、ガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患からなる群から選択された疾患の１つを予防又は治療するために用いられている。
【０２３６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２３７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２３８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０２３９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患が挙げられる。
【０２４０】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も挙げられる。
【０２４１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２４２】
本発明の SNP C １２２ S を含んで成る IFN α−５ポリペプチドの擬態化合物
本発明は：
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
のポリペプチドの生物活性に実質上類似する生物活性を有する新規化合物にも関係する。ここでa）及びb)のアミノ酸配列は、SNP C１２２Sを含んで成るという条件を有する。
【０２４３】
前記生物活性は、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD４＋もしくはCD８＋Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスの抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性、TF−１細胞系統に対する細胞抗増殖活性を実施例の節に記載されたように測定することによって評価されて良い。
【０２４４】
実施例の節に記載されたように、野生型IFNα−２に比べて、C１２２S突然変異IFNα−５は：
−CD４＋又はCD８＋Tリンパ球によるIFN−γ放出を刺激するより高い能力、
−単球によるIL−１０及びTNF−α放出を刺激するより高い能力、
−VSVに感染した培養細胞におけるより低いin vitro抗ウィルス活性、
−予め悪性Friend赤白血病細胞を接種されたマウスにおけるより高い抗ウィルス活性、
−EMVCマウスモデルにおける類似のin vivo抗ウィルス活性、
を有する。
【０２４５】
実施例の節に記載されているように、C１２２S突然変異IFNα−５は、樹状細胞が成熟するのを刺激する高い能力を有し、このC１２２S突然変異IFNα−５による活性は、野生型IFNα−２及び野生型INFα−５に比べて高い。
【０２４６】
実施例の節に記載されたように、野生型IFNα−５に比べて、C１２２S突然変異IFNα−５は：
−MCF−７乳ガン細胞系統におけるシグナル伝達を活性化するより低い能力、
−Daudi Burkitt細胞系統に対するより低い抗増殖活性、
−VSVに感染した培養細胞におけるより低いin vitro抗ウィルス活性、
を有する。
【０２４７】
本発明の新規化合物は、例えば、先に規定したように、C１２２S突然変異IFNα−５の生物活性に実質上類似する生物活性を有しうる。
【０２４８】
前記化合物は、C１２２S突然変異IFNα−５よりも高い、Tリンパ球によるIFN−γ放出、単球によるIL−１０及びTNF−α放出、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスの抗腫瘍活性、及び／又は樹状細胞成熟などの生物活性を有しうる。
【０２４９】
前記化合物は、C１２２S突然変異IFNα−５よりも低い、例えばVSVに感染した培養細胞におけるin vitro抗ウィルス活性、及び／又は−Daudi Burkitt細胞系統に対するより低い抗増殖活性をも有しうる。
【０２５０】
前記化合物は生化学的な化合物、例えば、ポリペプチドもしくはペプチドなど、又は有機化学的な化合物、例えば、合成ペプチド擬態などでありうる。
【０２５１】
本発明は、C１２２S SNPを含む本発明のポリペプチドの、上に規定した化合物を同定するための使用にも関する。
【０２５２】
本発明は、本発明の化合物を同定する方法にも関連する。当該方法は、以下の段階：
a) 試験される化合物の生物活性、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD４＋もしくはCD８＋Tリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性を特定し；
b) i)試験される化合物の段階a)で特定した活性と、
ii)C１２２S SNPを含んで成るという条件であるアミノ酸配列（配列番号２）のポリペプチド又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれたアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列の活性、とを比較し；そして
c) ｂ)で行われた比較に基づき、試験された化合物が、C１２２S SNPを含んで成るという条件であるアミノ酸配列（配列番号２）のポリペプチド又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９のアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列に比較して、実質上類似する、又はより低いもしくはより高い活性を有するのかを特定する；
段階を含んで成る。
【０２５３】
好適に、試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、ハイスループットスクリーニングにより予め同定されて良い。あるいは、C１２２S SNPを含んで成るという条件である、アミノ酸配列（配列番号２）又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列と同じ３次構造を持つようにコンピューターによるドラッグデザインによって設計されうる。
【０２５４】
化合物を同定及び設計する方法は、当業者に周知である。
【０２５５】
これらの方法に言及する刊行物には、例えば：
−Silverman.R.B（１９９２）「Organic Chemistry of Drug Design and Action」、Academic Press 第１版（1992年１月１５日）；
−Anderson S及びChiplin .J（２００２）「Structural genomics; shaping the use of drug design」 Drug Discov. Today. ７（２）：pp.１０５〜１０７
−Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH.（２００２）「The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery」 Drug Discv .Today ７（２）:pp.１０９〜１１６；
−Burbidge R、Trotter M、Buxton B、Holden S.（２００２）「Drug design by machine lerning: support vector machines for pharmaceutical deta analysis」 Comput. Chem. ２６(１):pp.５〜１４；
−Kauvar L.M(１９９６).「Peptide mimetic drugs：a comment on progress and prospects」１４（６）：p７０９
などが挙げられうる。
【０２５６】
本発明の化合物は、ガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患からなる群から選択された疾患の１つの予防又は治療を目的とした医薬を調製するために用いられて良い。
【０２５７】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２５８】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２５９】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられうる。
【０２６０】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０２６１】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれて良い。
【０２６２】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２６３】
好適に、本発明の化合物は、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫などの免疫欠損症の後に現われる腫瘍及び陰部疣贅又は性病からなる群から選択された疾患の１つの予防又は治療を目的とした医薬を調製するために用いられて良い。
【実施例】
【０２６４】
実施例
実施例１
SNP c ６４１ g 又は g ７９８ c を含むヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のモデリング
第１の段階において、そしてPDBデータベースから入手可能（コード１ITF）なINFα−２の３次元構造から出発して、ソフトウェアModeler（MSI,San Diego,CA）を用いることによって、IFNα−５の３次元構造を構築した。
【０２６５】
次いで、成熟ポリペプチド断片を、突然変異Q４７E及びC９９Sを再生成する態様で変更した。
【０２６６】
次いで、この成熟断片に対してプログラムAMBER及びDISCOVER（MSI：Molecular Simulation Inc.）を用いることによって１０００段階の分子最小化を行った。
【０２６７】
次いで、２つの分子動力学計算ランを同じプログラム及び同じ力場で行った。
【０２６８】
各場合、５０，０００段階を３００°Kで計算し、３００平衡段階で終了した。
【０２６９】
モデリングの結果を図１A及び図１B、並びに図２A及び２Bに視覚化している。
【０２７０】
実施例２： SNP a ５１６ g 、 c ６４１ g 、又は g ７９８ c の各集団におけるジェノタイピング
SNPのジェノタイピングは、産物が偏光蛍光の読み込みによって検出されるミニシークエンシングの原理に基づいている。この技術は、蛍光ミニシークエンシングから成る（FP−TDI Technology又はFluorescence Polarization Template direct Dye−terminator incorporation）。
【０２７１】
ミニシークエンシングを、集団の各個体のゲノムDNAからPCRによって増幅した産物に対して行う。このPCR産物をジェノタイピングされるSNPを含む遺伝子領域を網羅する態様で選択した。用いられなかったPCRプライマー及び組み込まれなかったdNTPを除いた後で、前記ミニシークエンシングを行った。
【０２７２】
ミニシークエンシングは、SNP部位の上流側に丁度位置したオリゴヌクレオチドプライマーの、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いることによる伸長からなる。この伸長方法よりもたらされる産物を偏光蛍光を読み込むことによって直接解析する。
【０２７３】
これらの全ての段階、並びに読み込みを同じPCRプレートで行った。
【０２７４】
従って、ジェノタイピングには５つの段階：
１)PCRによる増幅、
２)酵素消化によるPCR産物の精製
３)オリゴヌクレオチドプライマーの伸長
４)読み込み
５)読み込んだものの翻訳
が必要である。
【０２７５】
ジェノタイピング段階１及び２を、a５１６g、c６４１g、g７９８cの各SNPに対して同じ条件で行った。段階３、４及び５は、これらの多型のそれぞれに対して特異的である。
【０２７６】
１)IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列のPCRによる増幅を、民族的に起源の異なる２６８個体に由来するのゲノムDNAから出発して行った。
【０２７７】
これらのDNAは、Coriell Institute in the United States によって提供された。
【０２７８】
２６８個体は以下のとおりである。
【表１】
【０２７９】
これらの個体それぞれに由来するゲノムDNAが試料を構成する。
【０２８０】
全てのSNPについて、PCR増幅を以下のプライマーから出発して行った。
【化２】
【０２８１】
これらのヌクレオチド配列により、ヌクレオチド配列（配列番号１）のヌクレオチド３９０〜ヌクレオチド１０７０の、６８１ヌクレオチドの長さの断片の増幅が可能になる。
【０２８２】
各SNPについて、PCR産物はミニシークエンシングのための鋳型として有効であろう。
【０２８３】
PCR反応の総反応体積は、試料につき５μｌである。
【０２８４】
反応体積は下の表に示した試薬からなる。
【表２】
【０２８５】
これらの試薬をABGene（参照TF−０３８４−K）によって提供された３８４ウェルのブラックPCRプレートに分注した。次いで、プレートを密封し、遠心し、３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tetrad of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。PCRサイクル、即ち、９４℃で１分、しかる後に３段階(９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分)からなる３６サイクルである。
【０２８６】
２)次いで、PCR増幅産物を２つの酵素：エビアルカリフォスファターゼ（SAP）及びエキソヌクレアーゼＩ（ExoＩ）を用いて精製する。これらの酵素により、第１に、PCR増幅中に組み込まれなかったdNTPの脱リン酸化が起こり、第２に、他方で単一標準DNA残さ、詳細には、PCR中に用いられなかったプライマーが取り除かれる。
【０２８７】
消化を、PCRプレートの各ウェルごとに、試料につき５μｌの反応混合物を添加することによって行う。この反応混合物は、以下の試薬からなる。
【表３】
【０２８８】
プレートを、充填した後に密封し、遠心し、そして３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tread of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。それは、SAP−EXO消化：３７℃で４５分、８０℃で１５分である。
【０２８９】
次いで、伸長又はミニシークエンシング段階を、調製した試料につき５μｌの反応混合物を添加することによって消化されたPCRの産物に対して行った。
【０２９０】
ミニシークエンシング３)及び読み込み４)及び読み込んだものの読み替え５)段階は、各SNP、a５１６g、c６４１g及びg７９８cに対して特異的である。
【０２９１】
これらの段階の全てを、これらそれぞれの多型のために用いた特異的な条件を正確に、本明細書中、以降に記載している。
【０２９２】
３)ミニシークエンシング
ジェノタイピングのために欠かせない２つのミニシークエンシングプライマーの配列を、本発明のSNP部位の上流に位置したヌクレオチドの配列に対応するように決定した。SNPを含むPCR産物は２本鎖DNA産物であり、故に、そのジェノタイピングをセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに対して行うことができうる。選定のプライマーは、Life Technologoes Inc.で製造されている。
【０２９３】
下の表には、各SNPについて、試験したミニシークエンシングプライマーの配列及びジェノタイピングのために維持した至適条件を示している。
【表４】
【０２９４】
SNPのミニシークエンシングを最初１６試料に対して確認し、そして２６８個体及び１０コントロールからなる一式の個体集団に対してジェノタイピングした。
【０２９５】
次いで、伸長又はミニシークエンシング段階を以下の表に示すように行う。
【表５】
【０２９６】
次いで、プレートを、充填した後に密封し、遠心し、３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tetrad of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。伸長PCRサイクル、即ち、９３℃で１分、しかる後に２段階(９３℃で１０秒、５５℃で３０秒)からなる３５サイクルである。
【０２９７】
サーモサイクラーでの最後の段階の後、プレートをLJL Biosystems IncのAnalyst（商標登録）HT型の偏光蛍光リーダーに直接置いた。２つの方法を用いることによるCriterion Host（商標登録）ソフトウェアを用いてプレートを読んだ。第1番目にTamra標識された塩基を、この蛍光（励起５５０〜１０nm、放射５８０〜１０nm）に対して特異的な放射及び励起フィルターを用いることによって読み込み可能にし、そして第２番目に、R１１０標識された塩基を、この蛍光（励起４９０〜１０nm、放射５２０〜１０nm）に対して特異的な励起及び放射フィルターを用いることによって読み込み可能にする。この２つの場合において、Dichroic double mirror（R１１０／Tamra）を使用し、そして他の読み込みパラメーターは：
Z高度：１．５mm
アテニュエーター：アウト
積分時間：１００，０００μ秒
ローデータ（Raw data）単位：カウント／秒
偏極スイッチ：ウェルによって
プレート定着時間：０ｍ秒
PMTセットアップ：Smart Read（＋）、感度２
ダイナミック偏極器：放射
空電偏極器：S
【０２９８】
このようにして得られたファイル結果（file result）は、Tamraフィルター及びR１１０フィルターについて計算されたmP（ミリ偏極化）の値を含んでいる。これらのmP値は、下記の式により、平行面（//）に対して得られた強度値及び垂直面（⊥）に対して得られた強度値から出発して計算される。
MP＝１０００（//−g⊥）／（//＋⊥）
【０２９９】
この計算では、値⊥は、因子ｇにより重み付けされている。それは、実験的に予め測定されていなければならない機械的パラメーターである。
【０３００】
４)及び５) 読み込んだものの読み替え及び遺伝子型の決定
mP値はMicrosoft Inc.のExcel ソフトウェア、及び／又はLJL Biosystems Inc.によって開発されたAllele Caller（登録商標）ソフトウェアを用いてグラフで報告されている。
【０３０１】
横軸上には、Tamra標識された塩基のmP値が示されており、縦軸にはR１１０標識された塩基のmP値が示されている。強mP値により、この蛍光で標識された塩基が組み込まれていることを示し、そして反対に弱mP値により、この塩基の組み込み不在が明らかになる。
【０３０２】
様々な遺伝子型を有するヌクレオチド配列の類似群が最大で３つ得られて良い。
【０３０３】
Allele Caller（登録商標）ソフトウェアの使用により、一度様々な群の同定が行われれば、表の形態で、各個体を規定する遺伝子型を直接抽出することが可能になる。
【０３０４】
例えば、SNP g798cについて、アンチセンスにおいて読まれた対立遺伝子cは、センスにおいて読まれた対立遺伝子gに対応し、そして未熟IFNα−５タンパク質配列の位置４９でシステイン（C）が存在することに関連し、それ故に、アンチセンスにおいて読まれた対立遺伝子gは、対応するタンパク質の配列のこの位置のセリン（S）に対応する、センスにおいて読まれた対立遺伝子ｃに対応するということを特定することは欠かせない。
【０３０５】
SNP a ５１６ g 、 c ６４１ g 、 g ７９８ c に関するミニシークエンシングの結果
ジェノタイピング方法の完了後、個々の個体集団の遺伝子型の特定を、本発明中で研究されたSNPに関して上記のグラフを用いて行った。
【０３０６】
SNP a５１６gに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体AAもしくはヘテロ接合体AGもしくはホモ接合体GGである。実際には、下に示したように、ホモ接合体遺伝子型GGはこの個体集団において検出されていない。
【０３０７】
SNP c６４１gに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体CCもしくはヘテロ接合体CGもしくはホモ接合体GGである。実際には、下に示したように、ホモ接合体遺伝子型GGは、この個体集団において検出されていない。
【０３０８】
SNP g７９８cに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体GG、もしくはヘテロ接合体GC遺伝子もしくはホモ接合体CCである。実際には、下に示したように、ヘテロ接合体CCは、この個体集団において検出されていない。
【０３０９】
個体集団において特定された遺伝子型の分布及び研究した３つのSNPに関する様々な対立遺伝子頻度の計算の結果を以下の表に記載している。
【表６】
【０３１０】
先の表では、
−Nは、個体数を示し、
−％は、特異的分集団における個体の百分率を示し
−対立遺伝子頻度は、特異的分集団における突然変異対立遺伝子の百分率を示し、
−９５％ICは、９５％信頼性での最小及び最大インターバル
である。
【０３１１】
系統集団、及びSNPによってこれらの結果を検証することで、以下のことを確認した。
−SNP a５１６gについて、４人のヘテロ接合体AG個体は、分集団の、アフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系白人に由来する
−SNP c６４１gについて、６人のヘテロ接合体CG個体は、分集団の、アフリカ系アメリカ人及び東南アジア人に由来する
−SNP g７９８cについて、４人のヘテロ接合体GC個体は、分集団の、カリブ人及びヨーロッパ系白人、メキシコ人及び南アメリカ人に由来する
【０３１２】
実施例３．天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α―５の酵母における発現
a) 天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α―５の真核発現ベクター pZip α− topo 中へのクローニング
天然野生型IFNα−５及びC１２２S突然変異IFNα−５の成熟部分をコードするためのヌクレオチド配列を、SNPについてヘテロ接合体である個体からのゲノムDNAを鋳型として用いることでPCRによって増幅した。
【０３１３】
かかる増幅を可能にするPCRプライマーは：
【化３】
である。
【０３１４】
PCR産物を、真核発現ベクターpZipZα−TOPO（TOPO（登録商標）−cloning；Invitrogen Corp.）中に、メタノールにより誘導可能なハイブリッドプロモーターAOX１の制御下で挿入した。
【０３１５】
このベクターにより、酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）中での真核生物タンパク質のヘテロ接合体発現が可能になる。
【０３１６】
組換えタンパク質をコードするためのベクター領域のヌクレオチド配列を調べた後、当該ベクターをPme１制限酵素によって直線状にした。そしてP.パストリス（pastoris）酵母系統（Invitrogen）をこれらの組換え発現ベクターで形質転換させた。
【０３１７】
b) P. パストリスにおけるヘテロ接合体発現及び天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α−５タンパク質の精製
天然野生型IFNα−５をコードするため又はC１２２S突然変異IFNα−５をコードするためのクローンを含む５０mLのBMGY培地（２％のペプトン、１％のイーストエクストラクト、１．３４％のYNB、１％のグリセロール、１００mMのリン酸カリウム、０．４mg／lのビオチンを含むpH６．０）により、２つの飽和事前培養物を、３０℃で２４〜４８時間に渡り２００回転／分（rpm）で動揺しながら行った。
【０３１８】
培地が飽和細胞密度（６００nmの波長で測定した光学密度１２に対応する）に到達した場合、それを、５OD／mLで、２５０mLのBMMY培地（２％のペプトン、１％のイーストエクストラクト、１．３４％のYNB、０．５％のメタノール、１００mMのリン酸カリウム、０．４mg／lのビオチンを含むpH６．０）に接種するために用いた。
【０３１９】
次いで、３０℃で２４時間に渡り、培養フラスコ中１８０rpmの動揺をしながら、最終濃度1％のメタノールによってタンパク質の発現を誘導した。
【０３２０】
コーディング配列上流の、「α因子」のシグナルペプチド配列が存在することにより、タンパク質は、酵母によって培養培地中に分泌される。前記α因子は、天然に、プロセッシング中に解裂する。
【０３２１】
懸濁を遠心して、得られた上清から出発してタンパク質をHPLCによって精製した。
【０３２２】
開始前段階において、超遠心（Labscale カットオフ５０００Da、Millipore）、しかる後の透析により、１０倍濃度の酵母上清が５０mMのトリスCl、pH９．０、25mMのNaClのバッファー中で可能になる。
【０３２３】
最初のクロマトグラフィーによる段階で、青セファロースカラム（Amersham Pharmacia）上での親和性によりタンパク質回収が可能になる。その一方、SDS PAGE型の電気泳動、及びIFNα−５タンパク質に対して向けられた特異的抗体による免疫検出により、回収された画分中でのタンパク質の存在が確認される。この段階で、注目のタンパク質の純度は７５％超である。
【０３２４】
第２の精製段階で、ゲルろ過により、５０mMのトリス、pH９．０、２５mMのNaClに対して、IFNα−５タンパク質に対応する回集された画分のバッファー交換が可能になる。
【０３２５】
精製の最後の段階は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でタンパク質を分離することから成る。
【０３２６】
組換えタンパク質を含む画分を、トリス５０mM、pH９、NaCl２５mMバッファーで予め平衡化した陰イオン交換カラムに注入する。タンパク質の溶出を、勾配（トリス５０mM、pH９バッファー中、０．０２５〜１MのNaCl）の移動により行う。
【０３２７】
注目のタンパク質の純度をSDS／PAGEゲル上で計算し且つタンパク質濃度をデンシトメトリー（Quantity one、Biorad）及びBCAアッセイ（ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma）によって測定する。
【０３２８】
精製された、天然野生型IFNα−５及びC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質をこのプロトコール（いずれ、より多くの量のタンパク質を得るのにスケールアップされる）により得、それらを下記の機能試験のために用いる。
【０３２９】
実施例４．野生型及び C １２２ S 突然変異 IFN α−５の、乳ガン細胞系統 MCF −７中でのシグナル伝達を活性化する能力の評価
インターフェロンは、JAK（Janus Kinase）及びSTAT（Signal Transducer and Activators of Transcription）タンパク質を伴うシグナル経路を介して作用することが分かっている。インターフェロンがそのレセプターに対して結合することでJAKタンパク質のリン酸化が誘導され、そして順番にリン酸化によってSTATタンパク質が活性化される。活性化されたSTATタンパク質は核に移り、遺伝子のプロモーター上のインターフェロン応答エレメントに対して結合し、これにより各遺伝子の転写が刺激される。インターフェロンによって開始されるシグナル経路を調べるために、レポーター遺伝子技術を用いた。手順を以下に記載している。
【０３３０】
乳ガン細胞MCF−７（ECACC）を２４時間に渡り、１０％ウシ胎児血清を補足したRPMIの９６ウェルプレートにおいて、１・１０４細胞／ウェルの密度で播いた。次いで、細胞を６時間に渡り、製造説明書によりSuperfect（Qiagen）を用いて、インターフェロン刺激化応答エレメント（Clontech）の制御下に置かれたFirefly Luciferaseをコードするレポーター遺伝子構築体（pISRE−Luc）でトランスフェクトした。その後、培養培地を交換しそして細胞をCO２インキュベーター中３７℃でインキュベートし、その後、それらを様々な量の野生型又は突然変異INFα−５タンパク質で３７℃、６時間に渡り刺激を加えた。刺激化の後、培養培地を捨て１００μl／ウェルのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）／1mM MgCl２と換えた。ルシフェラーゼ活性を、１００μl／ウェルの基質Luclite−Plus（Packard）を添加後にMicroBetaカウンターで測定した。
【０３３１】
結果は、ルシフェラーゼ活性最大刺激の％として表されている。野生型IFNα−５又はC１２２S突然変異INFα−５のシグナル伝達経路を始動させる能力とは、それらの、それぞれルシフェラーゼ活性を（最大の刺激化を１００％活性とした場合）５０％刺激する個々の濃度に対応する、５０％(EC５０の)有効用量を測定することに基づいている。
【０３３２】
野生型IFNα−５について測定された平均EC５０値は、５．６７pMである。
【０３３３】
C１２２S突然変異IFNα−５について測定された平均EC５０値は、９３．２７pMである。
【０３３４】
従って、野生型タンパク質のEC５０値に対する、突然変異型タンパク質のEC５０値の対応する比率は（標準偏差７．６３で）１８．３２pMに至る。
【０３３５】
従って、この試験により、C１２２S突然変異IFNα−５の生物活性は、乳ガン細胞系統MCF−７中でインターフェロンシグナル経路を活性化するその能力に基づいて、野生型のものに比べて１０〜２５倍低いことが示された。
【０３３６】
実施例５． C122S 突然変異 INF α−５の免疫調節活性の評価
Ｉ型のIFN（IFNα及びINFβ）は免疫系の所定の機能を調節できる。それらは：樹状細胞（DC）の成熟を促すこと、即ち、MHCクラスＩ型（HLA−ABC）及びII型（HLA−DR）分子の発現を促すこと、Tリンパ球、CD８０、CD６０及びCD８３分子の共刺激に関わる分子の発現を増加させること並びにTリンパ球の刺激機能を促すことが示されている。
【０３３７】
a)C１２２S突然変異IFNα−５の樹状細胞の成熟に対する効果
C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節活性を最初に樹状細胞の成熟により調べ、そして代表的な市販のイントロンA産物として選択した野生型INFα−５又は野生型INFα−２のものと比較した。
【０３３８】
そのようにするために、樹状細胞を最初に、GM−CSF及びIL−４サイトカインの存在下で培養した成熟末梢血単球から生成した。CD１４＋細胞生成キットを用いて精製した後、これらの樹状細胞を、１００ng／mLのC１２２S突然変異INFα−５、野生型IFNα−２又は野生型INFα−５存在下に置き、そして、それらの遺伝子型をマーカーとしてMHCクラスＩ及びII分子並びにCD４０、CD８０、CD８６、CD８３及びCD１の発現を調べるための目的のFACS解析によって決定した。これら樹状細胞の成熟の状態を、刺激されていない樹状細胞との対照実験を供するために、IFNα処理をせずに獲得したのとも比較した。
【０３３９】
各マーカー及び４つの実験条件について測定した蛍光強度の中央値（任意の単位で示した）を下の表に示している。
【表７】
【０３４０】
この試験の結果により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、樹状細胞成熟を刺激する高い能力を有することが示された。詳細には、C１２２S突然変異INFα−５による樹状細胞の成熟の刺激は、野生型IFNα−５及び野生型IFNα−２のものよりも高い。
【０３４１】
b)C１２２S突然変異IFNα−５の、Tリンパ球によるサイトカイン放出に対する効果
C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節活性を、攻撃に対する免疫応答を模擬するために突然変異IFNα−５タンパク質存在及び強抗原（SEB）有無の存在下に置かれたTリンパ球によるサイトカイン放出を測定することによっても調べた。試験を、コントロールとして用いられ且つ代表的なイントロンA市販製品として選定される野生型IFNα−２の存在下でも行った。
【０３４２】
そのようにするために、末梢血単核細胞（PBMC）を健常な供与者から単離して１６時間に渡り、抗CD３及び抗CD２８抗体又はSEBを含む適切な培地中で刺激した。各培養では、４μg／mLのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型INFα−２を添加した。刺激後、Tリンパ球を抗CD３、抗CD４、抗CD６９抗体又は抗CD３、抗CD８及び抗CD６９抗体で細胞外標識し、そしてTh１型のサイトカイン（IFNγ）又はTh２型のサイトカイン（IL−１０）に対して向けられた特異的な抗体で細胞内標識をした。蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて分析した。
【０３４３】
得られた結果により、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２はIL−１０及びINFγの放出を刺激することはなく、そしてそれ故にSEBの不在下ではTリンパ球を活性化しないことが示された。その一方で、以下に示すように、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２タンパク質は、SEB活性化されたTリンパ球によるサイトカイン（IL−１０及びIFN−γ）放出を刺激する。この表は、SEBの存在下でリンパ球によるサイトカイン放出（CD４＋、CD６９＋細胞又はCD８＋、CD６９＋細胞のCD４＋Tリンパ球及びCD８＋Tリンパ球のそれぞれに対する％、並びに総細胞に対するCD６９細胞の％として表した）を示す。
【表８】
【０３４４】
これらの結果により、明らかに、C１２２S突然変異IFNα−５が、予めSEB抗原によって活性化されたCD４＋Tリンパ球及び、CD８＋Tリンパ球によるサイトカイン（IFNγ及びIL−１０）の放出を刺激することが示された。詳細には、CD４＋又はCD８＋Tリンパ球によるインターフェロンγの生産は、C１２２S突然変異INFα−５の存在下でのほうが野生型IFNα−２の存在下でよりも高い。
【０３４５】
c) C１２２S突然変異IFNα−５の、単球によるサイトカイン放出に対する効果
最後に、C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節効果を、細菌毒薬（LIP）の存在下又は不在下で単球によるサイトカイン放出を測定することによって調べた。この試験はコントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２の存在下でも行った。
【０３４６】
そのようにするために、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を健常な供与者から単離してそれらの遺伝子型を分析し、CD６４＋、CD４＋dim細胞の総対量を測定した（CD６４及びCD４dimは血液単球のためのマーカーである）。一晩培養した後、これらのPBMCを培地中単独（刺激された細胞はなく）で又はLPS（刺激された細胞）の存在下でインキュベートした。各培用では４μg／mLのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型INFα−２を添加した。培養後、細胞を抗CD６４及び抗CD４dimで細胞外標識し、そしてTh１型のサイトカイン（TNF−α）、IL−１２及びIL−１０に対して向けられた特異的抗体で細胞内標識をした。
【０３４７】
蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて分析した。
【０３４８】
得られた結果により、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２は、LPSの不在下ではサイトカイン（IL−１０、IL−１２及びTNF−α）の放出を刺激することはないことが示された。
【０３４９】
その一方で、LPSの存在下では、単球はサイトカイン（IL−１０、IL−１２及びTNF−α）放出し、この放出は更に、以下の表に示すように、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質又は野生型IFNα−２タンパク質の存在下で増加した。この表は、LPSの存在下での単球によるサイトカイン放出（総細胞に対するCD６４＋CD４dim細胞の％、及びCD４dimCD６４＋細胞の％として表した）を示す。
【表９】
【０３５０】
これらの結果により、LPSの存在下では、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質が単球によるサイトカイン（IFNγ及びIL−１０）の放出を刺激できることが示された。詳細には、単球によるIL−１０及びTNF−α放出の刺激は、C１２２S突然変異INFα−５の存在下でのほうが野生型IFNα−２の存在下でよりも高い。
【０３５１】
実施例６ .C １２２ S 突然変異 IFN α−５の in vitro 抗増殖活性の評価
a)ヒトリンパ腫のDaudi Burkitt細胞系統に対して
これらの試験をことなる２つのIFNα−５型、即ち、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−５により行った。予めRPMI１６４０培地（１０％ウシ胎児血清及び２mMのL−グルタミンを補足した）中で培養した細胞（ヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系統、本明細書中では以降「Daudi 細胞」と呼ぶ）を９６ウェルプレートに細胞密度４・１０４細胞／ウェルで播いた。
【０３５２】
各ウェルでは、Daudi 細胞を、０．００３pM〜６００nMの範囲で濃度を増加する天然野生型IFNα−５又は突然変異IFNα−５のどちらかと接触するよう置いた。
【０３５３】
３回繰り返した３つ以上の実験を両方のタンパク質及び各濃度について行った。
【０３５４】
次いで、Daudi 細胞を３７℃で６６時間に渡り５％CO２下でインキュベートし、その後、Uptiblue試薬（Uptima）を培養物に添加した。増殖の速度を、更なる４時間のインキュベーション後に、５９０nmで放射された蛍光（５６０nmで励起する）を測定することによって定量した。
【０３５５】
C１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−５の抗増殖活性は、細胞の増殖を５０％阻害するIFNα−５の濃度に対応するIC５０を測定することに基づいている。
【０３５６】
C１２２S突然変異IFNα−５に関して測定した平均IC５０値が９３．２７である一方で、野生型IFNα−５に関する測定した平均IC５０値は５．６７である。従って、天然野生型タンパク質のIC５０値に対する、突然変異型タンパク質のIC５０値に対応する平均比率は、１８．３２（標準偏差７．６３）に至る。
【０３５７】
この試験により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、Daudi細胞増殖を阻害するということが示された。更に、細胞抗増殖活性は、C１２２S突然変異IFNα−５の場合、野生型IFNα−５に比べて大いに減少している。
【０３５８】
b)TF−１赤白血病細胞系統に対して
C１２２S突然変異IFNα−５の効果をTF−１赤白血病細胞系統に対しても評価した。この試験は、コントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２の存在下でも行った。
【０３５９】
そのようにするために、C１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−２（０．００１〜１０００ng/mLの範囲で濃度が増加する）と接触するよう置いて細胞の増殖を測定した。
【０３６０】
この実験を３回繰り返し、そして代表的な実験の結果を図３に示している。
【０３６１】
これらのデータにより、C１２２S突然変異IFNα−５はTF−１に対して弱い抗増殖活性を有することが示される。特に、C１２２S突然変異IFNα−５の抗増殖活性効果は、野生型INFα−２より劣っており、C１２２S突然変異IFNα−５の血液毒性が野生型IFNα−２よりも優れていないことを示唆する。
【０３６２】
実施例７． C １２２ S 突然変異 IFN α−５の抗ウィルス活性の評価
IFNは抗ウィルス防御において重要な役割を果たす。IFN抗ウィルス活性は一部IFNが誘導した酵素系に起因する。それは、例えば：
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する酵素である２´５´オリゴアデニル化シンセターゼ。これらのオリゴマーは、一度活性化するとウィルスRNAを破壊するエンドリボヌクレアーゼであるRNaseLを活性化する。
−ウィルス転写産物の合成及び／又は突然変異を阻害するMxタンパク質（GTPase）。この活性は主にインフルエンザウィルスに対して発揮される。
−二本鎖化したRNAによって活性化されるPKRタンパク質（又はp６８キナーゼ）。活性化されたPKRはタンパク質合成を阻害する。
【０３６３】
IFNの抗ウィルス活性は他の機構によっても誘導される。それは例えば、レトロウィルスの場合、ウィルス粒子が細胞内へ侵入すること、複製、結合、粒子の射出及びウィルス粒子の感染性力を阻害することである。
【０３６４】
最後に、IFNは、免疫系の所定の機能を調節することによって、詳細には、（特に、MHCクラスＩ及びII型の分子を増加させること、IL−１２及びIFNγ生産を高めること、CTL活性の向上など）細胞が介在する反応によって、間接的に抗ウィルス活性を発揮する。
【０３６５】
C１２２S突然変異IFNα−５の抗ウィルス活性を培養細胞におけるin vitro及びマウスモデルにおけるin vivoの両方で評価した。両方の試験を、コントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２を用いて平行して行った。
【０３６６】
a)培養細胞におけるin vitro抗ウィルス活性
このアッセイにより、水泡性口内炎ウィルス（VSV）を用い培養細胞におけるC１２２S突然変異IFNα−５の抗ウィルス活性の評価、そして野生型IFNα−２又は野生型IFNα−５との比較が可能になる。
【０３６７】
そのようにするために、WISHヒト上皮細胞を、濃度を下げるC１２２S突然変異IFNα−５、野生型IFNα−５又は野生型IFNα−２の存在下で２４時間に渡り培養した。次いで、細胞を、水泡性口内炎ウィルス（VSV）によって２４〜４８時間に渡りインフェクションして細胞の溶解を測定した。
【０３６８】
試験された異なるIFNαの抗ウィルス効果を、細胞のVSVによって誘導される溶解を５０％阻害するIFNの濃度に対応するIC５０値を比較することによって測定した。
【０３６９】
類似の実験を３回行って、代表的な実験の１つにおいて測定されたIC５０値を下の表に示している。
【表１０】
【０３７０】
この実験の結果により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、培養細胞でin vitro抗ウィルス活性を有することが示された。更に、VSVでインフェクトされた培養細胞において、C１２２S突然変異IFNα−５は、野生型IFNα−５又は野生型IFNα−２よりも低い抗ウィルス活性を有する。
【０３７１】
b)マウスモデルでのin vivo抗ウィルス活性
このin vivo試験をEMCV（Encephalomyocarditis virus）マウスモデルで行っている。
【０３７２】
ヒトIFNは前記マウスにおいて用量依存性抗ウィルス活性を示す。一般にそれは、同量のマウスIFNによって示されるよりも１００〜１０００倍低い（Meisterら（１９８６）、J.Gen.Virol.６７;pp.１６３３〜１６４４）。
【０３７３】
マウスへの脳心筋炎ウィルス（EMCV）の腹腔内注射により、中枢神経系が巻き込まれ且つ脳障害（encephalitis）を特徴とする急速に進行する致死的疾患が生じる（Finter NB（１９７３）、Front Biol.２；pp.２９５〜３６０）。マウス及びヒトのインターフェロンαはどちらも、致死EMCV感染に対してマウスを保護することにおいて有効であることが示されている（Tovey及びMaury（１９９９）.J.IFN Cytokine Res. １９：pp.１４５〜１５５）。
【０３７４】
群中２０匹の、６週齢Swissマウスの腹腔内に１００×LD５０EMCVをインフェクトしそして１時間後に２μgのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−２調製物で処理し、その後３日に渡り１日に１回処理した。コントロールの群は賦形剤でのみ処理したもので行った。動物はその後日２１日に渡り延命された。
【０３７５】
結果を図４に示しており、そしてC１２２S突然変異IFNα−５で処理されたマウスの相対生存率は、無処理マウスの生存率よりもかなり高いことが示されており、これはC１２２S突然変異IFNα−５のマウスモデルにおけるin vivoでの抗ウィルス活性を示している。更に、C１２２S突然変異IFNα−５のマウスモデルにおけるin vivo抗ウィルス活性は、野生型IFNα−２で処理したマウスについて確認されたものと類似している。
【０３７６】
実施例８．悪性 Friend 赤白血病細胞を予め接種したマウスにおける C １２２ S 突然変異 IFN α−５の抗腫瘍活性の評価
IFNαは、IFN感受性親Friend白血病細胞に対するのと同じように、IFNαの直接抗増殖活性に対して耐性のFriend白血病細胞のクローン増殖に対してマウスを保護することにおいて有効であること（Belardelliら、Int.J.Cancer,３０,pp.８１３〜８２０,１９８２；Belardelliら、Int.J.Cancer,３０,pp.８２１〜８２５，１９８２）が示されており、これはIFNαの抗腫瘍活性における間接免疫介在機構の重要性を反映する。
【０３７７】
以下の実験により、C１２２S突然変異IFNα−５の、予めFriend赤白血病細胞を接種されたマウスにおける抗腫瘍活性の評価が可能になり、そして体表的な市販のイントロンA製品として選択した野生型IFNα−２の抗腫瘍活性との比較が可能になる。
【０３７８】
そのようにするために、群中１２匹の６週齢DBA／２マウスの腹腔内に１００，０００個のIFN耐性Friend赤白血病細胞（３Ｃ１８）（２０，０００LD５０）を接種し、そして１時間後、２μgの野生型IFNα−２もしくは２μgのC１２２S突然変異IFNα−５もしくは等体積の賦形剤のみで処理し、その後２１日に渡り１日に１回処理した。動物はその後毎日生き続け、そして賦形剤でのみ処理した群との比較において各処理群の一次効果測定値（primary efficacy measure）を４０日での生存率として、そして一次効果分析値（primary efficacy analysis）を各処理群の４０日での相対生存率として規定した。
【０３７９】
この実験の、図５に示した結果により、明らかに、IFNαで処理しなかったマウスに比較して、C１２２S突然変異IFNα−５でマウスを処理することで、非常に悪性のFriend赤白血病細胞（FLC）を接種した後に生存するマウスの数の増加がもたらされることが示される。詳細には、FLCを接種されたマウスの生存率の増加は、野生型IFNα−２で処理した後よりもC１２２S突然変異IFNα−５により処理した後の方が高い。
【０３８０】
これら全ての結果から、C１２２S突然変異IFNα−５は固有の生物学的特性を有することが示される。
【図面の簡単な説明】
【０３８１】
【図１】図１Aは、SNP Q４７Eを含んで成る本発明のコードされたタンパク質、及び天然野生型IFNα−５タンパク質のモデルを示す。図１Bは、図１Aで示された各タンパク質の、よりすぐれた部分のモデルの拡大を示している。図１A及び図１Bにおいて、黒のリボンは天然野生型IFNα−５タンパク質の構造を示し、そして白のリボンはQ４７E突然変異IFNα−５タンパク質の構造を示す。
【図２】図２Aは、本発明のSNP C９９Sを含んで成るコードされたタンパク質、及び天然野生型IFNα−５タンパク質のモデルを示す。図２Bは、図２Aで示された各タンパク質の、よりすぐれた部分のモデルの拡大を示している。図２A及び図２Bにおいて、黒のリボンは天然野生型IFNα−５タンパク質の構造を示し、そして白のリボンはC９９S突然変異IFNα−５タンパク質の構造を示す。
【図３】C１２２S突然変異IFNα−５のTF−１細胞系統に対する抗増殖効果を測定するための試験の結果を示す。この図において、横軸は、IFNαの濃度（ng／mL）に対応し、そして縦軸は、細胞増殖の阻害率（％）に対応する。C１２２S突然変異IFNα−５の抗増殖効果（黒菱形）を、野生型のもの(白四角)と比べている。
【図４】予めVSVウィルスに感染してC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質で処理されたマウスの生存率を、野生型IFNα−２、又は処理していないものとの比較で示す。この図において、横軸は生存時間（日）に対応し、そして縦軸はVSVに感染したマウスの相対生存率に対応する。黒四角はC１２２S突然変異IFNα−２で処理したVSV感染マウスに関するデータを示し、そして白抜き三角は何も処理をしなかったVSV感染マウスに関するデータを示している。
【図５】予め悪性Friend赤白血病細胞（FLC）を接種され、そしてC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質で処理されたマウスの生存率を、野生型IFNα−２で処理されたもの、又は処理していないものとの比較で示す。この図において、横軸は生存時間（日）に対応し、そして縦軸はFLCを接種したマウスの相対生存率に対応する。黒菱形はC１２２S突然変異IFNα−５で処理したFLC接種マウスに関するデータを示す。黒四角は野生型IFNα−２で処理したFLC接種マウスに関するデータを示し、そして白抜き三角は何も処理しなかったFLC接種マウスに関するデータを示している。
【０００１】
関連出願：
本発明は、２００１年５月３日に提出された、仏国特許出願第０１０５９１９号の名称「Nouveaux polynucleotide et polypepptide del´IFN alpha５」の優先権を主張する。
【０００２】
技術背景
技術分野
本発明は、新規SNPを含んで成る、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPにより生じた突然変異を含んで成る、天然野生型IFNα−５タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの医療上の使用に関連する。
【０００３】
関連技術
インターフェロンα５遺伝子（本明細書中ではIFN−５に言及される）はHenocoらの刊行物「Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes」J.Mol.Biol.;１８５（２）;pp.２２７〜２６０;（１９８５）に記載されている。
【０００４】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、アクセス番号X０２９５６の下でGenBankデータベースにおいてアクセス可能である。
【０００５】
IFNαは、それらの細胞抗増殖性効果、並びにそれらが抗ウィルス反応及び抗寄生虫性反応に関わることが知られている。
【０００６】
INFαは、いくつか他のサイトカインの発現を造血幹細胞のレベルで阻害し、並びに所定の腫瘍の細胞増殖を阻害することも知られている。
【０００７】
IFNαは、腎ガンにおいてEGFに対するレセプターの発現を減らすこと、所定のミトコンドリア遺伝子の発現を阻害すること、繊維芽細胞、単球及びBリンパ球の増殖を、特にin vitroで阻害すること、並びにBリンパ球による抗体の合成を遮断することも知られている。
【０００８】
IFNαは、腫瘍特異的抗原の発現を腫瘍細胞表層上で誘導すること、及びISREの特異的転写因子に作用することによってISRE型（インターフェロン刺激応答エレメント）のプロモーター領域の調節下にある遺伝子を誘導することも知られている。
【０００９】
IFNαは、様々な障害及び／又はヒトの疾患、例えば、様々なガン、ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、頸部、頭部及び腎臓のガンなど、心疾患、代謝性疾患、例えば、免疫系に関係しないもので肥満など、感染症、例えばB型及C型の肝炎及びAIDS、肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病、統合性失調症及び鬱病など、組織又は器官移植の拒絶、傷の治癒、透析患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法による治療に関連した疾患にさえも関わっていることが知られている。
【００１０】
IFNαは、特に、所定の白血病、転移性腎ガン並びに免疫不全に続いて現われる、腫瘍、例えば、AIDSの場合のカポジ肉腫の治療をするために用いられている。IFNαは、他の種類の腫瘍に対して及び所定のウィルス感染症に対しても有効である。
【００１１】
IFNαはまた、FDA(Food and Drug administration)によって、陰部疣贅又は性病の治療をするための承認もなされている。
【００１２】
しかし、IFNα、詳細にはIFNα−５は、それが医薬組成物中で用いられた場合に多くの副作用も持つ。それは例えば、急性過敏症の反応(蕁麻疹、気管支収縮、アナフィラキシーショックなど)、心臓不整脈(cardiac arrythmia)、低血圧症、癲癇性発作、甲状腺機能の問題、インフルエンザ様の症候群(発熱、発汗、筋肉痛)などである。
【００１３】
更に、IFNαで治療された患者は、これらの分子を中和する抗体を生産し、それ故にそれらの効果が低下する。
【００１４】
本発明者は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる機能を有することが可能な新規ポリペプチド及びIFNα−５遺伝子に対する新規ポリヌクレオチドの類似体をこの度発見した。
【００１５】
これら新規のポリペプチド及びポリヌクレオチドは特に、先に説明された障害もしくは疾患を治療もしくは予防するのに用いられて良く、そしてそれらに関連する不利な点の全て又は一部が回避されうる。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明はその第１の対象として、１又は複数のSNP(一塩基多型)を含んで成るので参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列とは異なる新規ポリヌクレオチドを有する。
【００１７】
ヒト参照野生型INFα−５遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号１)は、１４７５ヌクレオチドからなり且つ５７０ヌクレオチドのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番(開始コドン)〜ヌクレオチド１００３番(停止コドン))を含んで成る。
【００１８】
出願人は、参照野生型INFα−６遺伝子のヌクレオチド配列において１１個のSNPを同定した。これら１１個のSNPは以下の：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aである。
【００１９】
本発明の背景において、予め規定された、SNPの位置決めに対応するナンバリングは、ヌクレオチド配列(配列番号１)のナンバリングに関連していると解される。
【００２０】
文字a、t、c、及びgは、それぞれ窒素含有塩基のアデニン、チミン、シトシン、及びグアニンに対応する。
【００２１】
最初の文字は野生型のヌクレオチドに対応し、他方、最後の文字は突然変異したヌクレオチドに対応する。
【００２２】
従って、例えば、SNP c４２tは、参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号１)上の位置４２において、ヌクレオチドシトシン(c)のヌクレオチドチミン(t)への突然変異に対応する。
【００２３】
これらのSNPは、出願人によって、「Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applicantions」という名称の、２０００年１２月６日に提出された出願人の仏国特許出願第００２２８９４号(本明細書中で参考文献として引用されている)に記載された決定方法を用いて同定された。
【００２４】
この特許出願に記載されたこのような方法により、１つ(又は複数の)の既存のSNP(s)を同定することが、複数の個体のランダムな集団に由来する１以上の個体において可能になる。
【００２５】
本発明の範囲内で、例えば、コーディング配列を含んで成るIFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列の断片が、ランダム態様で選択された個体の集団における様々な個体から単離された。
【００２６】
次いで、これらの断片の配列決定が、ヘテロ２本鎖プロファイル(即ち参照野生型INFα−５遺伝子配列のものとは異なるプロファイルである)を有するこれら所定の試料に対して、DHPLC(「変性高性能液体クロマトグラフィー」)による分析後に行われた。
【００２７】
その後、このようにして配列決定された断片は、参照野生型IFNα−５遺伝子の断片のヌクレオチド配列及び本発明により同定されたSNPと比較された。
【００２８】
従って、前記SNPは天然であり、そしてそれらの各々が世界集団の所定の個体中に存在している。
【００２９】
参照野生型INFα−５遺伝子は、１８９個のアミノ酸の、アミノ酸配列番号２に対応する、未熟なタンパク質をコードし、それは最初の２３個のアミノ酸を含むシグナルペプチドの解裂によって、１６６個のアミノ酸の成熟タンパク質に転換されるだろう。
【００３０】
本発明の各コーディングSNP、即ち、a５１６g、c６４１g、g７９８cは、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列のレベルでの変更を生ずる。
【００３１】
アミノ酸配列におけるこれらの変更は以下のとおりである。
【００３２】
SNP a５１６gは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置２８及び成熟タンパク質の位置５において、アミノ酸グルタミン（Q）のアルギニン（R）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はQ５RもしくはQ２８Rと呼ぶだろう。
【００３３】
SNP c６４１gは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置７０、及び成熟タンパク質の位置４７において、アミノ酸グルタミン（Q）のグルタミン酸（E）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はQ４７EもしくはQ７０Eと呼ぶだろう。
【００３４】
SNP g７９８cは、アミノ酸配列番号２に対応する、IFNα−５遺伝子の未熟タンパク質中の位置１２２及び、成熟タンパク質の位置９９において、アミノ酸システイン（C）のセリン（S）への突然変異を起こす。本発明の記載において、当業者は、このSNPによってコードされた突然変異を、成熟タンパク質もしくは未熟タンパク質のいずれを参照するかにより、当業者はC９９SもしくはC１２２Sのと呼ぶだろう。
【００３５】
SNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cは、本発明に従って、野生型参照IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比較された場合、ポリペプチドの空間的な配置の変更を起こす。
【００３６】
これらの変更は、当業界で周知の方法により、例えば、de novo(SEQFOLD／MSIなど)、相同性(MODELER／MSIなど)、力場の最小化(DISCOVER、DELPHI／MSIなど)及び／又は分子動力学(CFF／MSIなど)のモデリングツール使用する、コンピューター分子モデリングによって確認されて良い。
【００３７】
かかるモデルの例は、本明細書中、後の実施例の節に示されている。
【００３８】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異Q５Rにより、INFα−５タンパク質のN末端部分の構造における局所的な変化(それは、この部分の３次元構造を維持するCys１残基のジスルフィド架橋によってアテニュエーションされている)が生じるていることである。
【００３９】
しかし、Aヘリックスの前のINFαのN末端ドメインは非常に良く保存されていることに注目することが重要である。更に、Shaffermanら(Journal of Biological Chemistry (１９８７) ２６２:pp.６２２７〜６２３７において)及び(Journal of Immunology (２００) １６７:pp.１４８２〜１４８９において)によりタンパク質のこの部分が、IFNαの活性に関連していることを示している。
【００４０】
従って、Q５R突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次元構造を有し、その構造における穏和な変化を伴い且つグルタミン(極性)からアルギニン(正に荷電した)への電荷の増加により、その活性と機能において有意な変化を伴う。
【００４１】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異Q４７Eにより、「AB」ループのC末端部分(それは、IFNα−５のそのレセプターへの結合に関係することが知られている)のほどきを生じることである。これは、図１A及び１Bに示されている。
【００４２】
位置４７のグルタミン酸残基は、このループ形成において見掛け上重要な役割を果たす。それの理由は、それが全てのインターフェロン中で維持されているからである。
【００４３】
従って、コンピューター分子モデリングにより我々が予想可能になることは、位置４７のグルタミン酸の存在が、天然野生型IFNα−５タンパク質の構造と機能の有意な変化に関わるだろうということである。
【００４４】
従って、Q４７E突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次元構造を有し、特にIFNα−５がそのレセプターに対して結合するレベルにおいて、その構造と機能における有意な変化を伴う。
【００４５】
コンピューター分子モデリングにより示されることは、成熟した突然変異タンパク質上での突然変異C９９Sにより、天然野生型IFNα−５タンパク質において、N末端部分並びにヘリックスC及びD間の「CD」ループの３次元構造に参加するジスルフィド架橋の消失がもたらされることである。これは、図２A及び２Bに示されている。
【００４６】
突然変異C９９SはN末端ループ（Cys１−Thr６）可動部(mobile)を作る。これにより、ヘリックスCの末端のほどき及び「CD」ループの乱れがもたらされる。
【００４７】
このジスルフィド架橋は、全てのα及びβインターフェロン中で保持されていることも知られている。故に、突然変異C９９Sは、突然変異IFNα−５タンパク質のN末端部分及びCDループの両方の構造変化が理由で、そのレセプターに対する結合に影響を及ぼすに違いない。
【００４８】
従って、C９９S突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−５タンパク質とは異なる３次構造を有し、特にIFNα−５がそのレセプターに対して結合するレベルにおいて、その構造と機能における有意な変化を伴う。
【００４９】
本発明に従い、他のSNP、即ち、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aは、アミノ酸配列（配列番号２）のレベルにおいて、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の変更に関連しない。SNP、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、及びg１００９aは非コーディングである。
【００５０】
本発明に従い、ポリヌクレオチドのジェノタイピングは、集団において、これらのポリヌクレオチドの対立形質頻度を測定するような態様において行われて良い。ジェノタイピングの例は、本明細書中、後の実施例の節に示されている。
【００５１】
本発明のポリペプチドの機能の測定は、それらの生物活性を測定するのと同じように行われて良い。
【００５２】
これについて、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、Tリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカインの放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、予め悪性Friend赤白血病細胞を接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi burkitt’s細胞系統に対する細胞増殖抗活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系統に対する細胞増殖抗活性を測定すること並びに野生型IFNα−５との比較、及び／又は代表的な市販製品として選択された野生型IFNα−２との比較をすることが可能である。
【００５３】
本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを出発して獲得及び／もしくは同定された治療分子の、特に所定のヒト障害及び／もしくは疾患を予防及び治療するための使用するための目的も有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
定義
「参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトIFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）であるとして解される。
【００５５】
この配列は、アクセス番号X０２９５６でGenBankにおいてアクセス可能である。更に、ヒトIFNα−５遺伝子はK.Henocoら「Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes」；J.Mol.Biol.；１８５（２）；pp.２２７〜２６０（１９８５）に記載されている。
【００５６】
「天然野生型IFNα−５タンパク質」又は「野生型IFNα−５タンパク質」とは、参照野生型IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされた成熟タンパク質として解される。天然野生型未熟タンパク質IFNα−５は、配列番号２に示されているペプチドに対応する。
【００５７】
「ポリヌクレオチド」とは、変更された又は変更されていないDNAもしくはRNAでありうるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドとして解される。
【００５８】
用語「ポリヌクレオチド」には、例えば、１本鎖又は２本鎖DNA、１もしくは複数の１本鎖領域の混合物からなるDNA及び１もしくは複数の２本鎖領域からなるDNA、１本鎖又は２本鎖RNA並びに１もしくは複数の１本鎖領域の混合物からなるRNA及び１もしくは複数の２本鎖領域からなるRNAを含む。用語ポリヌクレオチドとは、１又は複数の３重鎖領域を含むRNA及び／又はDNAも含みうる。ポリヌクレオチドとは、安定性の理由又は他の理由のために、変更された骨格を有する態様で変更された１又は複数の塩基を含むDNA又はRNAと同じであると解されている。変更された塩基とは、例えば、イノシンのような異常な塩基と解される。
【００５９】
「ポリペプチド」とは、例えば、活性中心ペプチド（isosteric peptide）の場合などでは、通常のもしくは変更されたペプチド結合によって互いに連結した２以上のアミノ酸を含んで成るペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質と解される。
【００６０】
ポリペプチドは、遺伝子コードによって規定された２０個のアミノ酸以外から成りうる。ポリペプチドは同様に、天然のプロセス、例えば、翻訳後成熟プロセスによって変更されたアミノ酸又は当業者に周知の化学的方法によって変更されたアミノ酸からなるポリペプチドであって良い。かかる変更は刊行物中に詳細に記載されている。これらの変更はポリペプチドのどこにおいても、即ち、ペプチド骨格、アミノ酸鎖又はカルボキシもしくはアミノ末端においてさえも現われる。
【００６１】
ポリペプチドは、ユビキチン化の後に枝分かれされうる、あるいは枝分かれの有無に関わらず環状化されうる。このような種類の変更は、天然又は当業者に周知の人工翻訳後プロセスの結果でありうる。
【００６２】
例えば、ポリペプチド変更には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の固定化、ヘムの共有結合性の固定化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合性の固定化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合性の固定化、フォスファチジルイノシトールの共有結合性の固定化、共有結合性もしくは非共有結合性の架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、システイン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、例えば、PEG化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード添加、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解法、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化（seneloylation）、硫酸化、アミノ酸付加、例えば、アルギニル化もしくはユビキチン化などが含まれると解される。かかる変更は刊行物：PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、 T.E Creighton, New York,１９９３、POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, １９８３、Seifterら、“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol.（１９９０）１８２：pp.６２６〜６４６、及びRattanら“Protein Synthesis：Post-Translational Modifications and Aging”、Ann NY Acad Sci（１９９２）６６３：pp.４８〜６２中に十分に記載されている。
【００６３】
「単離されたポリヌクレオチド」もしくは「単離されたポリペプチド」とは、それぞれ例えば、予め規定されたように、ヒトの体から単離されたか又は技術的な方法によって生産された、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドとして解される。
【００６４】
「同一性」とは、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列の同一性の測定として解される。
【００６５】
同一性とは、当業者に周知の用語であり、そして刊行物中に十分に記載されている。
COMPUTATIONAL MOLECULER BIOLOGY, Lesk, A.M.,Ed.,Oxford University Press, New York,１９９８;BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W.,Acdemic Press,New York,１９９３;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTＩ,Griffin A.M.及びGriffin H.G.,Ed Humana Press, New Jersy １９９４;及びSEQUENCE ANALYSIS MOLECULER BIOLOGY, von Heinje,G.,Academic Press,１９８７を参照のこと。
【００６６】
２つの配列の間での同一性及び類似性を測定するのに通常用いられる方法も、同じように刊行物中に十分記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J.Bishop,Ed,Acdemic Press,San Diego, １９９４、及びCarillo H.及びLipton D, Siam J Applied Math（１９９８）４８：p.１０７３を参照のこと。
【００６７】
例えば、ヌクレオチド配列（配列番号１）と９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドは、前記配列に比較して、１００ヌクレオチドに渡り突然変異を最大で５点含むポリヌクレオチドである。
【００６８】
これらの点突然変異は、１（又は数個の）ヌクレオチドの置換、付加、及び／又は１(又は数個の)欠失でありうる。
【００６９】
同様に、例えばアミノ酸配列（配列番号２）と９５％以上の同一性を有するポリペプチドは、前記配列に比較して、１００ヌクレオチドに渡り突然変異を最大で５点含むポリペプチドである。
【００７０】
これらの点突然変異は、１（又は数個の）アミノ酸の置換、付加、及び／又は１(又は複数の)欠失でありうる。
【００７１】
それぞれヌクレオチド配列(配列番号１)又はアミノ酸配列(配列番号２)と完全に同一ではなく、本発明のSNPを１つ以上含むと解される本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列の変異体であると考えられる。
【００７２】
通常、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のSNPを１つ以上を含んで成るヌクレオチド配列(配列番号１)と同じもしくは事実上同じ生物活性を有する。
【００７３】
類似の態様において、通常、本発明のポリペプチドは、本発明のコーディングSNPを１つ以上を含んで成るアミノ酸配列(配列番号２)と同じもしくは事実上同じ生物活性を有する。
【００７４】
本発明により、変異体は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、あるいは直接合成によって獲得されて良い。
【００７５】
「SNP」とは、ヌクレオチド配列中の塩基の任意の天然変異と解される。ヌクレオチド配列上で、SNPは、コーディング、サイレント又は非コーディングであって良い。
【００７６】
コーディングSNPとは、ヌクレオチド配列のコーディング配列中に含まれた多型であり、それは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列におけるアミノ酸の変更に関わる。この場合、用語SNPを、ひいては、アミノ酸配列中の突然変異と同じように適用される。
【００７７】
サイレントSNPとは、ヌクレオチド配列のコーディング配列中に含まれた多型であり、それは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列におけるアミノ酸の変更に関わらない。
【００７８】
非コーディングSNPとは、ヌクレオチド配列の非コーディング配列中に含まれた多型である。この多型は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又はエンハンサー配列の部位中で顕著に発見される。
【００７９】
「機能的SNP」とは、先に規定されたように、機能を有するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列中に含まれているSNPであると解される。
【００８０】
「機能」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性であると解される。
【００８１】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能は、野生型の参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性の保存、増大、減少又は抑制からなりうる。
【００８２】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能は、同じように、参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はこの後者のヌクレオチド配列の生物活性における本質的な変化にある。
【００８３】
前記生物活性は、特に本発明のポリペプチドとレセプターとの親和性又は親和性の不在に結びつきうる。
【００８４】
ポリヌクレオチド
本発明は、その第１の目的のために：
a) 配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０%以上の同一性、好適には９０%以上の同一性、更に好適には９５%以上の同一性、そして更には９９%以上の同一性を有するヌクレオチド配列(以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解されるヌクレオチド配列)；又は
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列；
を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを有する。
【００８５】
本発明の背景において、ナンバリングは、ヌクレオチド配列(配列番号１)中のSNPの位置に対応していると解される。
【００８６】
本発明は、同じように：
a) ヌクレオチド配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列 (これらの配列は、それぞれ以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解される)；又は
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列；
を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関連する。
【００８７】
好適には、本発明のポリヌクレオチドは、配列(配列番号１)又はそのコーディング配列(これらの各配列はそれぞれ、以下のコーディングSNP：a５１６g、c６４１g、g７９８cを１つ以上含んで成ると解される)からなる。
【００８８】
本発明によれば、先に規定されたポリヌクレオチドは：a５１６g、c６４１g、g７９８cからなる群から選択されたコーディングSNPを１つ含んで成る。
【００８９】
一層好適には、先に規定されたポリヌクレオチドは、SNP g７９８cを含んで成る。
【００９０】
例えば、先に規定されたポリヌクレオチドは、同じように以下の非コーディングSNPを１つ以上含んで良い。その非コーディングSNPは：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aである。
【００９１】
本発明は、その目的のために同じように：
a) 以下の非コーディングSNP： c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c及びg１００９aを１つ以上含んで成ると解される、ヌクレオチド配列(配列番号１)；又は、
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
を含んで成る又はからなる単離されたポリヌクレオチドを有する。
【００９２】
本発明は：
a) 以下のSNP： c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a１５６g、c６４１g、g７９８c、g１００９aを１つ以上含んで成ると解されるヌクレオチド配列(配列番号１)もしくはそのコーディング配列；又は、
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列
の一部からなる、10ヌクレオチド以上からなる単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００９３】
好適には、先に規定された前記単離されたポリヌクレオチドは、１０〜４０個のヌクレオチドからなる。
【００９４】
本発明は、その目的のために：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列(配列番号２);又は
b) アミノ酸の配列(配列番号２)の位置２４〜１８９に含まれたアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも有する。
【００９５】
本発明の背景において、SNP Q２８R、Q７０E及びC１２２Sの位置を決めることに対応するナンバリングは、アミノ酸配列(配列番号２)のナンバリングに関連すると解される。
【００９６】
本発明の好適な目的によれば、先に規定されたポリペプチドは、先に規定されたコーディングSNPを１つ含んで成る。
【００９７】
更に好適には、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸配列（配列番号２）の全部又は一部を含んで成るポリペプチドをコードし且つコーディングSNP C１２２S有する。
【００９８】
好適には、本発明のポリヌクレオチドはDNA又はRNA分子からなる。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成方法により得られうる。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列から出発し、ヌクレオチド配列（配列番号１）上の各SNPについての突然変異ヌクレオチドによって野生型ヌクレオチドを変更することにより、部位特異的突然変異誘発によって得られうる。
【０１０１】
例えば、SNP g７９８cを含んで成る本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号１）上の位置７９８で、ヌクレオチドグアニン（g）をヌクレオチドシトシン（c）によって変更することにより、IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列から出発する部位特異的（site−directed）突然変異誘発によって得ることができうる。
【０１０２】
このようにして行われうる部位特異的突然変異誘発の方法は、当業者に周知である。特に、TA Kunkelの１９８５年の刊行物「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」82：488に記載されている。
【０１０３】
単離されたポリヌクレオチドは、同じように、例えば、プレ、プロ、もしくはプレプロタンパク質アミノ酸配列又はマーカーアミノ酸配列、例えば、ヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、融合タンパク質もしくは他の精製産物を獲得するために、他のタンパク質もしくはタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列に関連しうる。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチドは、同じように、ヌクレオチド配列、例えば、５´及び／又は３´非コーディング配列、例えば、転写されるもしくは転写されない配列、翻訳されるもしくは非翻訳されない配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列もしくはmRNAを安定化する配列さえも含む。
【０１０６】
前記ヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列とは、ストリンジェント条件下でこのヌクレオチド配列とハイブリダイズできるものとして規定されている。
【０１０７】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、必ずではないが一般には、ヌクレオチド配列が、８０％以上、好適には９０％以上、更に一層好適には９５％以上そして最も好適には９７％以上の同一性を有する場合にハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件として解されている。
【０１０８】
前記ストリンジェント条件は、当業者に周知の方法、例えば、５０％のホルムアミド、５×SSC（１５０mMのNaCl、１５mMのクエン酸三ナトリウム）、５０mMのリン酸ナトリウム（pH＝７.６）、５×デンハルト液、１０％のデキストラン硫酸及び２０μgの変性サケ精子DNAを含んで成る溶液中、４２℃でのポリヌクレオチドのインキュベーション、しかる後に０．１×SSCで６５℃でのフィルターの洗浄によって達成することができる。
【０１０９】
本発明の範囲内で、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件により、同一性が１００％に等しいヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが可能になる場合、当該ヌクレオチド配列は、a)で記載されたようなヌクレオチド配列に対して厳密に相補的であると考えられる。
【０１１０】
本発明の目的の範囲内で、あるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列は、本発明のアンチセンスSNPを１つ以上含んで成る。従って、例えば、もし前記ヌクレオチド配列がSNP g７９８cを含んで成るならば、それは、位置７９８相当にグアニン（g）ヌクレオチドを含んで成る相補的なヌクレオチド配列である。
【０１１１】
SNP を含んで成るポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅
本発明は、その目的のために：
ヌクレオチド配列(配列番号１)又は必要ならそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部を同定、ハイブリダイズ及び／もしくは増幅するために、
a) ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチド；及び／又は
b) SNPを１つ以上含んで成る本発明のポリヌクレオチド；
の全部もしくは一部の使用をも有する。これらヌクレオチド配列(配列番号１)又はそのコーディング配列は各自、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aを１つ以上含んで成ると解される。
【０１１２】
SNP の頻度のジェノタイピング及び測定
本発明は同じように、その目的のために：
ヌクレオチド配列(配列番号１)又は必要ならそのコーディング配列(ヌクレオチド４３４番〜ヌクレオチド１００３番)と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部をジェノタイピングするために、
a)ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０％〜１００％の同一性(好適には９０％以上の同一性、更に一層好適には９５％の同一性そして特に１００％の同一性)を有するポリヌクレオチド；及び／又は
b)SNPを１つ以上含んで成る本発明のポリヌクレオチド；
の全部もしくは一部の使用をも有する。これらヌクレオチド配列(配列番号１)又はそのコーディング配列は各自、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aを１つ以上含んで成ると解される。
【０１１３】
本発明によれば、ジェノタイピングは個体又は個体の集団に対して行われて良い。
【０１１４】
本発明の目的の範囲内で、ジェノタイピングは、個体又は個体の集団の遺伝子型を特定するための方法として規定されている。遺伝子型は、１又は複数の特異的な座に存在する対立遺伝子からなる。
【０１１５】
「個体の集団」とは、ランダム又は非ランダム態様で選択された個体の集団として解されている。これらの個体はヒト、動物、微生物又は植物であって良い。
【０１１６】
通常、個体の集団は、１０以上の個体、好ましくは１００〜３００の個体を含んで成る。
【０１１７】
個体は、それらの民族性又はそれらの遺伝子型に従い、特に下記の障害及び／又は疾患に冒されているものが選択されて良い。その障害及び／又は疾患とは：ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、頸部、頭部、及び腎臓のガン、心疾患、代謝性疾患、例えば、免疫系と無関係な肥満症など、感染症、特にB型及C型の肝炎及びAIDS、肺炎、潰瘍性大腸炎などのウィルス性感染症、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病、統合性失調症及び鬱病など、組織又は器官移植の拒絶、傷の治癒、透析された患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法による治療に関連した疾患である。
【０１１８】
本発明の機能的SNPは、好適に個体の集団においてジェノタイピングされている。
【０１１９】
SNPをジェノタイピングするために行ことができうる複数の方法が存在する（特に、Knok Pharmacogenomics,２０００年、第１版、pp.９５〜１００“High−throughput genotyping assay approachs”を参照のこと）。これらの技術は、以下の４つの原理に基づいている。その原理とは：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによる、オリゴヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのライゲーション又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの解裂である。これらの各技術は、検出系、例えば、直接もしくは偏光蛍光の測定又は質量分析法と組み合わされて良い。
【０１２０】
ジェノタイピングは特に、偏光蛍光スキャナーと共同して、ホットdd NTP（異なる蛍光によって標識された２つの異なるdd NTP）及びコールドdd NTP（標識されていない２つの異なるdd NTP）によるミニシークエンシングにより行われうる。偏光蛍光の読み込みを伴うミニシークエンシングプロトコール（FP-TDI Technology or Fluoreseence Polarization Templated-direct Dye-Terminator Incorporation）は当業者に周知である。
【０１２１】
それは、各個体のDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅の後に得られた産物により行われて良い。このPCR産物は、調べられるSNPを含むポリヌクレオチドの遺伝子領域を網羅するように選択されている。次いで、PCRサーマルサイクラーの最後の段階の後に、プレートは偏光蛍光スキャナー上に置かれて、蛍光特異的励起フィルター及び放射フィルターを用いることによって標識された塩基の読み込みがなされる。標識された塩基の強度値は、グラフ上で報告される。
【０１２２】
PCR増幅のために、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、本発明のSNPの位置に従い、当業者によって容易に選択されて良い。
【０１２３】
例えば、PCR増幅プライマーのためのセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列はそれぞれ：
【化１】
【０１２４】
このヌクレオチド配列により、ヌクレオチド配列（配列番号１）における、ヌクレオチド３９０〜ヌクレオチド１０７０の６８１ヌクレオチドの長さの断片の増幅が可能になる。
【０１２５】
次いで、個体の集団において、SNPを含んで成る遺伝子によってコードされる各対立遺伝子の頻度（対立遺伝子頻度）の統計的解析が達成されている。それにより、様々な亜集団におけるそれらの影響力及びそれらの分布の重要性が特定可能になり、もし必要であれば、この個体の集団を形成する多様な民族集団も特定可能になる。
【０１２６】
調査された集団で確認された様々な対立遺伝子の分布頻度を見積もるために、ジェノタイピングデータが解析されている。対立遺伝子頻度の計算はSAS−suite（登録商標）（SAS）又はSPLUS（登録商標）（MathSoft）などのソフトウェアを用いて行われて良い。様々な民族集団の個体集団の全域に渡る本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェアARLEQUIN（登録商標）及びSAS−suite（登録商標）により行われてうる。
【０１２７】
遺伝子マーカーとしての本発明の SNP
遺伝子の機能的配列（プロモーター、スプライシング部位、コーディング領域など）を変更するSNPは、疾患の感受性又は耐性に直接関連しているようだが、全てのSNP（機能的又は非機能的な）により、これらの疾患の状態に関連する１又は複数の遺伝子を同定するための有用なマーカーが提供されて良く、従って、全てのSNPはこれらの疾患の症状に間接的に関連している（Cargillら（１９９９）.Nature Genetics ２２：pp.２３１〜２３８；Rileyら（２０００）pharmacogenomics１：pp.３９〜４７；Roberts L（２０００）Science ２８７：pp.１８９８〜１８９９を参照のこと）。
【０１２８】
従って、本発明は、INFα−５遺伝子のポリヌクレオチドにおいて以下のSNPを１つ以上含んで成るデータバンクにも関する。そのSNPは：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aである。
【０１２９】
前記SNPは、ヌクレオチド配列（配列番号１）上でのそれらの位置に従い番号が降られていることは十分理解されるだろう。
【０１３０】
このデータバンクは：
（ｉ）INFα−５遺伝子のポリヌクレオチドにおける、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つ以上、と
（ii）疾患又は疾患に対する耐性
の直接的な関連を統計学的に特定するために解析されて良い。
【０１３１】
本発明は、疾患又は疾患に対する耐性のための診断／予測キットを開発するために、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つ以上の使用にも関する。
【０１３２】
先に規定された本発明のSNPは、直接もしくは間接的に、疾患もしくは疾患に対する耐性に関連しうる。
【０１３３】
好適に、これらの疾患は、先に記載したように規定されたものであって良い。
【０１３４】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明はその目的のために、本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含んで成る組換えベクターをも有する。
【０１３５】
多くの発現系、例えば、限定ではないが、染色体、エピソーム、及び誘導ウィルス（derived virus）などが用いられて良い。さらに詳細には、用いられる組換えベクターは細菌のプラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス、例えば、バキュロウィルス、SV４０などのパピローマウィルス、ワクシニアウィルス、アデノーマウィルス、キツネポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、レトロウィルスなどに由来して良い。
【０１３６】
これら組換えベクターは同じように、コスミド又はファージミド誘導体であって良い。ヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に当業者に周知の方法によって挿入されてうる。それらの方法は、例えば、MOLECULAR CLONNING：A LABORATORY MANYUAL, Sambrookら、第４版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,２００１に記載されている。
【０１３７】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、並びに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写及び本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含んで成る。これらの配列は、用いられている宿主細胞に従って選択される。
【０１３８】
従って、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドが、小胞体のルーメンへ、細胞膜周辺腔へ、膜上に又は細胞外環境に向けられるように、例えば、適切な分泌シグナルが組換えベクター中に組み込まれて良い。
【０１３９】
本発明はその目的のために、本発明の組換えベクターを含んで成る宿主細胞も有する。
【０１４０】
宿主細胞中への組換えベクターの導入は、当業者に周知の例えば、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davisら、第２版、McGraw-Hill Professional Publishing、 １９９５年及びMOLECULAR CLONONG：A LABORATORY MANUALなどに記載されている、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、陽イオン脂質、エレクトロポレーション、トランスダクションによるトランスフェクション、マクロINジェクション、トランスフェクション又はインフェクションなどの方法によって行われて良い。
【０１４１】
宿主細胞は、例えば、ストレプトコクチ（streptococci）、スタフィロコクチ（staphylococci）、大腸菌（E.coli）又はバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）などの細菌細胞、酵母細胞及びアスペルジルス（Aspergillus）ストレプトミセス（Streptomyces）の細胞などの真菌の細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）S２及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf９などの昆虫の細胞、CHO、COS、HeLa、C１２７、BHK、HEK２９３細胞などの動物の細胞及び治療される人の細胞又は植物の細胞であってさえも良い。
【０１４２】
宿主細胞は、本明細書中で後に分かるように、例えば本発明のポリペプチドを発現するために又は医薬組成物中の活性産物として用いられて良い。
【０１４３】
ポリペプチド
本発明はその目的のために：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列(配列番号２)の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
の全部もしくは一部と８０％以上の同一性、好適には９０％以上の同一性、さらに好適には９５％以上の同一性、及び更に好適には９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、単離されたポリペプチドを有する。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは、同じように：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列；
の全部又は一部を含んで成ることができる。
【０１４５】
本発明のポリペプチドはさらに詳細には：
以下のコーディングSNP：Q２８R、Q７０E、C１２２Sを１つ以上含んで成ると解される、
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２)の位置２４〜位置１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列；
から成る。
【０１４６】
好適には、本発明のポリペプチドは：Q２８R、Q７０E、C１２２Sからなる群から選択されたコーディングSNPを１つ含む。
【０１４７】
一層に好適には、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸２４〜１８９を含んで成り、そしてコーディングSNP C１２２Sも有する。
【０１４８】
本発明は、同じように、その目的のために、上記のポリペプチドを調製するための方法を有する。この方法では、先に規定した宿主細胞が培養培地中で培養されそして前記ポリペプチドが当該培養培地から単離されている。
【０１４９】
ポリペプチドは宿主細胞の培養培地から出発して、当業者に周知の方法、例えば塩、詳細には硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸、酸抽出物などのカオロピック剤による沈殿；イオン交換クロマトグラフィー；ホスホセルロースクロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；親和性クロマトグラフィー；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は除外（exclusion）クロマトグラフィーなどの方法によって精製されて良い。
【０１５０】
「培養培地」とは、本発明のポリペプチドが単離又は精製される培地として解される。この培地は、細胞外培地及び／又は細胞溶出物からなっていて良い。もし、前記ポリペプチドの構造が単離及び精製途中に変化したならば、当業者に周知の技術により、同じように、細胞溶出物を当該ポリペプチドに対して活性のある構造に戻すことが可能である。
【０１５１】
抗体
本発明はその目的のために、免疫特異的抗体を得るための方法をも有する。
【０１５２】
「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体並びにFab断片、例えばFab又は免疫グロブリン発現ライブラリー産物と解される。
【０１５３】
前記免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチドによる動物の免疫化によって得られうる。
【０１５４】
本発明は、先に規定した、本発明のポリペプチドに対する免疫特異的抗体にも関連する。
【０１５５】
本発明のポリペプチド、その断片の１つ、類似体、その変異体の１つ又はこのポリペプチドを発現する細胞が免疫特異的抗体を生産するのに用いられて良い。
【０１５６】
用語「免疫特異的」とは、本発明のポリペプチドに対して当業界で公知の他のペプチドよりも良い親和性を有する抗体を意味する。
【０１５７】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチド、その断片の１つ、類似物もしくはエピトープ断片又は、このポリペプチドを動物中(好ましくはヒトではない)で発現する細胞を当業者に周知の方法により投与することによって得られうる。
【０１５８】
モノクローナル抗体を調製するために、細胞系統から出発する抗体生産のための典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohlerら、Nature(１９７５)２５６：pp.４９５〜４９７)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kohlerら、Nature(１９７５)２５６：pp.４９５〜４９７)及びEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (第２７巻、UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series)における「The EBV−hybridoma technique and its application to human lung cancer」(R.A Reisfeld and S.Sell著)、pp.７７〜９６、 Alan R.Liss Inc. N.Y. １９８５,pp.７７〜９６)が用いられて良い。
【０１５９】
単鎖抗体を生産するための技術は、同じように、例えば、米国特許第４，９６４，７７８号に、同じように記載されている。
【０１６０】
トランスジェック動物、例えばマウスなどは、同じようにヒト化抗体を生産するために用いられて良い。
【０１６１】
本発明のポリペプチドと相互反応する因子
本発明は、同じように、その目的のために、本発明のポリペプチドを活性化もしくは阻害する因子を同定するための方法をも有する。その方法は：
a)コーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを調製し；
b)a)の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を調製し；
c)b)の宿主細胞と試験される因子とを接触させ；そして
d)試験される因子によって発生した活性化もしくは阻害効果を測定すること、
を含んで成る。
【０１６２】
本発明のポリペプチドは、これと相互に作用する化合物をスクリーニングするための方法に用いられても良い。
【０１６３】
これらの化合物は、本発明のポリペプチド固有の活性を、活性化する(アゴニスト)又は阻害する(アンタゴニスト)でありうる。これらの化合物は、同じように、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であって良い。Coliganら、Current Protocols in Immunology１(２)、第５章(１９９９)を参照のこと。
【０１６４】
一般に、かかる方法を行うには、本発明のポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を生産することが望ましい。かかる細胞は、例えば、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエなど昆虫の細胞又は大腸菌のような細菌であって良い。
【０１６５】
次いで、これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物は、試験される化合物の存在下に置かれる。
【０１６６】
次いで、試験される化合物の、本発明のポリペプチドとの結合能力が観察され、並びに機能的反応の阻害又は活性化も観察される。
【０１６７】
上記方法の段階d)は、これは直接又は間接的に標識されている試験される因子を用いることによって行われうる。その方法には、標識されたもしくは標識されていない因子及び標識された競合因子を用いることによる競合試験も含まれて良い。
【０１６８】
もし、試験される因子が、本発明のポリペプチドを発現する細胞に対して活性化シグナル又は阻害シグナルを発生するなら、検出されるシグナルに従い、適切に選択された検出手段を用いることによって、そのシグナルが、同じように測定されて良い。
【０１６９】
かかる活性化因子もしくは阻害因子は、ポリヌクレオチドであり、所定の場合、例えば、タンパク質もしくは抗体などの、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドでありうる。
【０１７０】
本発明は、同じように、その目的のために、本発明のポリペプチドによって活性化もしくは阻害される因子を同定するための方法も有する。その方法は：
a)コーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを調製し；
b)a)の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を調製し；
c)b)の宿主細胞を試験される因子の存在下に置き；そして
d)当該ポリペプチドによって、試験される因子に対して発生された活性化もしくは阻害効果の測定をすること、
を含んで成る。
【０１７１】
本発明のポリペプチドによって活性化もしくは阻害された因子は、それぞれこのペプチドの存在下における活性化もしくは阻害によって反応する因子である。
【０１７２】
本発明のポリペプチドによって直接もしくは間接的に活性化もしくは阻害される因子は、例えば、膜レセプターもしくは核内レセプター、キナーゼそして一層好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子などのポリペプチド又はポリヌクレオチドからなる。
【０１７３】
疾患の検出
本発明は、その目的のために、対象者における本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの生物学的な特性を分析するための方法をも有する。その方法は：
a) 対象者のゲノムにおける本発明のポリヌクレオチドの存在又は不在を特定すること；
b) 対象者における本発明のポリヌクレオチドの発現のレベルを測定すること；
c) 対象者における本発明のポリペプチドの存在又は不在を特定すること；
d) 対象者における本発明のポリペプチドの濃度を測定すること；
e) 対象者における本発明のポリペプチドの機能を特定すること、
を１つ以上含んで成る。
【０１７４】
これらの生物学的な特性は、対象者中もしくは対象者由来の試料において分析されて良い。
【０１７５】
これらの生物学的特性により、遺伝子診断を開始することを可能にし且つ対象者が病気に冒されるかもしくは冒される危険性があるのか、又は、逆に、本発明のポリヌクレオチド及び／又は本発明のポリペプチドの存在につながりがある疾患、軽い病気もしくは障害の進行に対して部分的に耐性が存在するかどうかを特定することが可能になりうる。
【０１７６】
これらの疾患は、障害並びに／又はヒト疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０１７７】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０１７８】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０１７９】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０１８０】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０１８１】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０１８２】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれて良い。
【０１８３】
この方法により、対象者における、本発明のSNPによってコードされる突然変異対立遺伝子の存在に関連する疾患の耐性又は遺伝子診断も可能になる。
【０１８４】
好適には、段階a)において、先に規定されたコーディングSNPを1つ以上含むポリヌクレオチドの存在又は不在が確認されるだろう。
【０１８５】
ポリヌクレオチドの検出は、試験される対象者由来の生物試料、例えば、細胞、血液、尿、唾液から出発して、又は試験される対象者の生検体もしくは検死解剖体から出発して行われて良い。ゲノムDNAは、例えば、直接又はPCR増幅の後に検出のために用いられて良い。RNAもしくはcDNAは、同じように、類似の態様において用いることができうる。
【０１８６】
次いで、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と対象者のゲノムにおいて検出されたヌクレオチド配列とを比較することが可能である。
【０１８７】
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション方法によって、変性剤を伴う又は伴わない電気泳動ゲル上でのDNA断片の移動度の差によって、又は融解温度の差を比較することによって行うことができる。Myersら、Science(１９８５)、２３０：p１２４２を参照のこと。かかるヌクレオチド配列の構造中の規定の位置でのかかる変更は、同じように、ヌクレアーゼ保護試験、例えばRN ase及びS１ヌクレアーゼにより、又は化学解裂剤によっても明らかにされて良い。Cottonら、Proc.Nat Acad.Sci.USA（１９８５）８５：pp４３９７〜４４０１を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド断片を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブは、同じように、スクリーニングを行うために用いられて良い。
【０１８８】
当業者に周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を特定するために、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝的多様性を同定するために用いられて良い(Science(１９８６)、第２４巻、pp.６１０〜６１３を参照のこと)。
【０１８９】
段階b)において、ポリヌクレオチドの発現のレベルは、このポリヌクレオチド(及びポリペプチドのためのコード領域)によってコードされるRNAのレベルを、当業者に周知の方法、例えば、PCR、RT−PCR、RN ase保護法、ノーザンブロット、及び他のハイブリダイゼーション法により定量化することによって測定されて良い。
【０１９０】
段階c)及びd)において、対象者又は対象者由来の試料における本発明のポリペプチドの存在もしくは不在並びに濃度(の特定)は、当業者に周知の方法、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合的結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験によって行われて良い。
【０１９１】
段階d)に引き続いて、本発明のポリペプチドの測定された濃度は、通常対象者において発見される天然野生型タンパク質の濃度と比較されうる。
【０１９２】
当業者は、感度、又はそれとは対照的な、疾患、軽い病気もしくは先に示した障害に対する耐性を示す閾値(上方もしくは下方の)を、従来技術の刊行物を用いることにより、もしくは先に記載したものなどの常用の試験もしくはアッセイにより容易に確認できうる。
【０１９３】
段階e)において、本発明のポリペプチドの機能の測定は当業者に周知の方法、例えば、先に記載したin vitro試験によって、又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞を使用することによって行われて良い。
【０１９４】
治療化合物及び疾患の治療
本発明は、その目的のために、活性因子として、本発明のポリペプチドを含む治療化合物も有する。
【０１９５】
本発明は、様々なヒトの疾患及び／もしくは障害を予防もしく治療をするのが目的の治療化合物を製造するための、本発明のポリペプチドの使用にも関連する。これらの疾患は、障害及び／又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０１９６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０１９７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０１９８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれうる。
【０１９９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０２００】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０２０１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２０２】
好適に、本発明のポリペプチドは、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための治療化合物を製造するために用いられて良い。その障害及び／又は疾患には、例えば、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫などの免疫疾患の後に現われる腫瘍及び陰部疣贅又は性病が挙げられる。
【０２０３】
所定の、本発明のポリペプチドの獲得を可能にする化合物、並びにこのポリペプチドによってもしくはこのポリペプチドから獲得もしくは同定された化合物は、ヒトの体を治療学的に治療するために、即ち、治療化合物として用いられて良い。
【０２０４】
従って、本発明は、その目的のために、活性因子として先に規定したコーディングSNP１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／もしくは先に規定した抗体を含む医薬も有する。
【０２０５】
本発明は、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体の、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための医薬を製造するための使用にも関連する。これらの疾患は、障害並びに／又はヒト疾患、例えばガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患でありうる。
【０２０６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２０７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２０８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０２０９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれて良い。
【０２１０】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれうる。
【０２１１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２１２】
好適に、本発明は、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体の、様々なヒト障害及び／又は疾患を予防もしくは治療をする目的のための医薬を製造するための使用にも関連する。その障害及び／又は疾患には、例えば、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病及び、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫など免疫欠損症の後に現われる腫瘍、及び陰部疣贅又は性病が挙げられる。
【０２１３】
活性因子として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の投与量は、化合物の選択、治療上の適応、投与の態様、製剤の性質、対象者の性質及び医者の判断に依存する。
【０２１４】
本発明のポリペプチドは、活性因子として用いられた場合、一般に１〜１００μg／kg対象者の量で投与される。
【０２１５】
本発明は、その目的のために、医薬組成物も有する。それは、活性因子として、例えば、本発明のポリペプチド、先に規定したコーディングSNPを１つ以上を含む本発明のポリヌクレオチド、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体などの上記化合物を１つ以上含み、並びに医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物も有する。
【０２１６】
これらの医薬組成物において、活性因子は生理的に有効な量において有利に存在している。
【０２１７】
これらの医薬組成物は、例えば、固体又は液体であって良く、且つ通常ヒトの医薬において用いられている医薬形態、例えば、単純もしくは被覆錠剤、ジェルキャップ、顆粒、カラメル、座薬及び好適には注射可能製剤及び注射可能にするための粉末、の形態において存在して良い。これらの医薬形態は、通常の方法により調製されて良い。
【０２１８】
活性因子は、通常医薬中で用いられている賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性又は非水性ビヒクル、動物もしくは植物起源の脂肪性物質、パラフェン誘導体、グリコール、様々な湿潤剤、分散剤もしくは乳化剤、防腐剤の中に組み込まれて良い。
【０２１９】
本発明の活性因子は、単独であるいは他の化合物、例えば、インターロイキンもしくはインターフェロンなど他のサイトカインなどの治療化合物と組み合わせて用いられて良い。
【０２２０】
様々な処方の医薬組成物が投与の態様により適用されている。
【０２２１】
医薬組成物は当業者に公知の様々な投与経路によって投与されて良い。
【０２２２】
本発明は、同じように、その目的ために、活性因子として、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドの全部又は一部、先に規定した組換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び／又は先に規定した抗体などの先に規定した化合物を１つ以上含み、並びに医薬的に許容できる適切な賦形剤を含む診断組成物を有する。
【０２２３】
この診断組成物は、例えば、診断組成物中で一般に用いられている、バッファー及び防腐剤など適切な賦形剤を含んでも良い。
【０２２４】
本発明は、同じように：
a) 治療的に有効な量の本発明のポリペプチド；及び／もしくは
b) 本発明のポリヌクレオチド；及び／もしくは、
c) 先に規定した、治療される対象者由来の宿主細胞、
を使用して、対象者において本発明のポリペプチドの発現又は活性を高める目的の治療化合物を調製する目的も有する。
【０２２５】
従って、本発明のポリペプチドの発現又は活性を高める必要がある対象者を治療するためには、いくつかの方法が可能である。
【０２２６】
治療的に有効な量の本発明のポリペプチドを、医薬的に許容できる賦形剤により対象者に対して投与することが可能である。
【０２２７】
本発明のポリヌクレオチドを対象者に投与することによって本発明のポリペプチドの内生生産を高めることも可能である。例えば、このポリヌクレオチドはレトロウィルス発現ベクター中に挿入できうる。かかるベクターは、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウィルスプラスミドベクターによって感染されている細胞から出発して、トランスダクションされた当該細胞が注目の遺伝子を含む感染性ウィルス粒子を生産する態様において、単離できうる。Strachan and Read ,Bios Scientific Publishers Ltd.(１９９６)、Human Molecular GeneticsにおけるGene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,第２０章、を参照のこと。
【０２２８】
本発明により、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含むポリヌクレオチドが好適に用いられるだろう。
【０２２９】
同じように、対象者に対して、彼に属する宿主細胞を投与することは可能であり、これらの宿主細胞は、先に規定した本発明のポリペプチドを発現するように、予め取り出されて改変されている。
【０２３０】
本発明は、同じように：
a) 治療上有効な量の先に規定した免疫特異的抗体；及び／又は
b) 本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド
の、対象者において本発明のポリペプチドの発現もしくは活性を下げる目的の治療化合物を調製するための使用にも関連する。
【０２３１】
従って、対象者に対して、治療上有効な量の阻害因子及び／又は先に規定した抗体を、可能性としては、医薬的に許容できる賦形剤との組み合わせにおいて投与することも可能である。
【０２３２】
同じように、対象者に対して、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする、本発明の相補的なポリヌクレオチドを投与することによって、本発明のポリペプチドの内生生産を減らすことが可能である。
【０２３３】
好適には、先に規定したコーディングSNPを１つ以上含む相補的ポリヌクレオチドが用いられて良い。
【０２３４】
本発明は、以下のSNP：c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c及び１００９aの１つを含んで成るという条件のヌクレオチド配列(配列番号１)と、９５％以上の同一性(好適には９７％以上の同一性、更に好適には９９％の同一性、そして特に１００％の同一性)を有するヌクレオチド配列が患者ゲノム中に存在することに関連したIFNα−５突然変異体によって生じる障害もしくは疾患の予防もしくはその患者の治療をする医薬を調製するための、IFNα−５タンパク質の使用も考慮する。
【０２３５】
好適には、前記医薬は、ガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患からなる群から選択された疾患の１つを予防又は治療するために用いられている。
【０２３６】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２３７】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２３８】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０２３９】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患が挙げられる。
【０２４０】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も挙げられる。
【０２４１】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２４２】
本発明の SNP C １２２ S を含んで成る IFN α−５ポリペプチドの擬態化合物
本発明は：
a) アミノ酸配列（配列番号２）；又は
b) アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
のポリペプチドの生物活性に実質上類似する生物活性を有する新規化合物にも関係する。ここでa）及びb)のアミノ酸配列は、SNP C１２２Sを含んで成るという条件を有する。
【０２４３】
前記生物活性は、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD４＋もしくはCD８＋Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスの抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性、TF−１細胞系統に対する細胞抗増殖活性を実施例の節に記載されたように測定することによって評価されて良い。
【０２４４】
実施例の節に記載されたように、野生型IFNα−２に比べて、C１２２S突然変異IFNα−５は：
−CD４＋又はCD８＋Tリンパ球によるIFN−γ放出を刺激するより高い能力、
−単球によるIL−１０及びTNF−α放出を刺激するより高い能力、
−VSVに感染した培養細胞におけるより低いin vitro抗ウィルス活性、
−予め悪性Friend赤白血病細胞を接種されたマウスにおけるより高い抗ウィルス活性、
−EMVCマウスモデルにおける類似のin vivo抗ウィルス活性、
を有する。
【０２４５】
実施例の節に記載されているように、C１２２S突然変異IFNα−５は、樹状細胞が成熟するのを刺激する高い能力を有し、このC１２２S突然変異IFNα−５による活性は、野生型IFNα−２及び野生型INFα−５に比べて高い。
【０２４６】
実施例の節に記載されたように、野生型IFNα−５に比べて、C１２２S突然変異IFNα−５は：
−MCF−７乳ガン細胞系統におけるシグナル伝達を活性化するより低い能力、
−Daudi Burkitt細胞系統に対するより低い抗増殖活性、
−VSVに感染した培養細胞におけるより低いin vitro抗ウィルス活性、
を有する。
【０２４７】
本発明の新規化合物は、例えば、先に規定したように、C１２２S突然変異IFNα−５の生物活性に実質上類似する生物活性を有しうる。
【０２４８】
前記化合物は、C１２２S突然変異IFNα−５よりも高い、Tリンパ球によるIFN−γ放出、単球によるIL−１０及びTNF−α放出、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスの抗腫瘍活性、及び／又は樹状細胞成熟などの生物活性を有しうる。
【０２４９】
前記化合物は、C１２２S突然変異IFNα−５よりも低い、例えばVSVに感染した培養細胞におけるin vitro抗ウィルス活性、及び／又は−Daudi Burkitt細胞系統に対するより低い抗増殖活性をも有しうる。
【０２５０】
前記化合物は生化学的な化合物、例えば、ポリペプチドもしくはペプチドなど、又は有機化学的な化合物、例えば、合成ペプチド擬態などでありうる。
【０２５１】
本発明は、C１２２S SNPを含む本発明のポリペプチドの、上に規定した化合物を同定するための使用にも関する。
【０２５２】
本発明は、本発明の化合物を同定する方法にも関連する。当該方法は、以下の段階：
a) 試験される化合物の生物活性、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD４＋もしくはCD８＋Tリンパ球によるサイトカインの放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、悪性Friend赤白血病細胞を予め接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性を特定し；
b) i)試験される化合物の段階a)で特定した活性と、
ii)C１２２S SNPを含んで成るという条件であるアミノ酸配列（配列番号２）のポリペプチド又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれたアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列の活性、とを比較し；そして
c) ｂ)で行われた比較に基づき、試験された化合物が、C１２２S SNPを含んで成るという条件であるアミノ酸配列（配列番号２）のポリペプチド又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９のアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列に比較して、実質上類似する、又はより低いもしくはより高い活性を有するのかを特定する；
段階を含んで成る。
【０２５３】
好適に、試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、ハイスループットスクリーニングにより予め同定されて良い。あるいは、C１２２S SNPを含んで成るという条件である、アミノ酸配列（配列番号２）又は当該アミノ酸配列（配列番号２）の位置２４〜１８９に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列と同じ３次構造を持つようにコンピューターによるドラッグデザインによって設計されうる。
【０２５４】
化合物を同定及び設計する方法は、当業者に周知である。
【０２５５】
これらの方法に言及する刊行物には、例えば：
−Silverman.R.B（１９９２）「Organic Chemistry of Drug Design and Action」、Academic Press 第１版（1992年１月１５日）；
−Anderson S及びChiplin .J（２００２）「Structural genomics; shaping the use of drug design」 Drug Discov. Today. ７（２）：pp.１０５〜１０７
−Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH.（２００２）「The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery」 Drug Discv .Today ７（２）:pp.１０９〜１１６；
−Burbidge R、Trotter M、Buxton B、Holden S.（２００２）「Drug design by machine lerning: support vector machines for pharmaceutical deta analysis」 Comput. Chem. ２６(１):pp.５〜１４；
−Kauvar L.M(１９９６).「Peptide mimetic drugs：a comment on progress and prospects」１４（６）：p７０９
などが挙げられうる。
【０２５６】
本発明の化合物は、ガン及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連した疾患及び／もしくは自己免疫疾患及び障害、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患、及び化学的治療に関連した疾患からなる群から選択された疾患の１つの予防又は治療を目的とした医薬を調製するために用いられて良い。
【０２５７】
前記ガン及び腫瘍には、転移性腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部、腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る、免疫欠損症に続いて現われる腫瘍が挙げられる。
【０２５８】
前記感染症には、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅のような性病を含んで成るウィルス感染症が挙げられる。
【０２５９】
前記免疫及び自己免疫に関連した疾患には、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられうる。
【０２６０】
前記代謝性疾患には、肥満症のような免疫とは無関係の疾患も含まれうる。
【０２６１】
中枢神経系の前記疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病も含まれて良い。
【０２６２】
前記疾患及び障害には傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び骨粗鬆症が含まれうる。
【０２６３】
好適に、本発明の化合物は、所定のウィルス感染症、例えば、B型及びC型肝炎、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びに、AIDSの場合のカポジー肉腫などの免疫欠損症の後に現われる腫瘍及び陰部疣贅又は性病からなる群から選択された疾患の１つの予防又は治療を目的とした医薬を調製するために用いられて良い。
【実施例】
【０２６４】
実施例
実施例１
SNP c ６４１ g 又は g ７９８ c を含むヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のモデリング
第１の段階において、そしてPDBデータベースから入手可能（コード１ITF）なINFα−２の３次元構造から出発して、ソフトウェアModeler（MSI,San Diego,CA）を用いることによって、IFNα−５の３次元構造を構築した。
【０２６５】
次いで、成熟ポリペプチド断片を、突然変異Q４７E及びC９９Sを再生成する態様で変更した。
【０２６６】
次いで、この成熟断片に対してプログラムAMBER及びDISCOVER（MSI：Molecular Simulation Inc.）を用いることによって１０００段階の分子最小化を行った。
【０２６７】
次いで、２つの分子動力学計算ランを同じプログラム及び同じ力場で行った。
【０２６８】
各場合、５０，０００段階を３００°Kで計算し、３００平衡段階で終了した。
【０２６９】
モデリングの結果を図１A及び図１B、並びに図２A及び２Bに視覚化している。
【０２７０】
実施例２： SNP a ５１６ g 、 c ６４１ g 、又は g ７９８ c の各集団におけるジェノタイピング
SNPのジェノタイピングは、産物が偏光蛍光の読み込みによって検出されるミニシークエンシングの原理に基づいている。この技術は、蛍光ミニシークエンシングから成る（FP−TDI Technology又はFluorescence Polarization Template direct Dye−terminator incorporation）。
【０２７１】
ミニシークエンシングを、集団の各個体のゲノムDNAからPCRによって増幅した産物に対して行う。このPCR産物をジェノタイピングされるSNPを含む遺伝子領域を網羅する態様で選択した。用いられなかったPCRプライマー及び組み込まれなかったdNTPを除いた後で、前記ミニシークエンシングを行った。
【０２７２】
ミニシークエンシングは、SNP部位の上流側に丁度位置したオリゴヌクレオチドプライマーの、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いることによる伸長からなる。この伸長方法よりもたらされる産物を偏光蛍光を読み込むことによって直接解析する。
【０２７３】
これらの全ての段階、並びに読み込みを同じPCRプレートで行った。
【０２７４】
従って、ジェノタイピングには５つの段階：
１)PCRによる増幅、
２)酵素消化によるPCR産物の精製
３)オリゴヌクレオチドプライマーの伸長
４)読み込み
５)読み込んだものの翻訳
が必要である。
【０２７５】
ジェノタイピング段階１及び２を、a５１６g、c６４１g、g７９８cの各SNPに対して同じ条件で行った。段階３、４及び５は、これらの多型のそれぞれに対して特異的である。
【０２７６】
１)IFNα−５遺伝子のヌクレオチド配列のPCRによる増幅を、民族的に起源の異なる２６８個体に由来するのゲノムDNAから出発して行った。
【０２７７】
これらのDNAは、Coriell Institute in the United States によって提供された。
【０２７８】
２６８個体は以下のとおりである。
【表１】
これらの個体それぞれに由来するゲノムDNAが試料を構成する。
【０２８０】
全てのSNPについて、PCR増幅を以下のプライマーから出発して行った。
【化２】
これらのヌクレオチド配列により、ヌクレオチド配列（配列番号１）のヌクレオチド３９０〜ヌクレオチド１０７０の、６８１ヌクレオチドの長さの断片の増幅が可能になる。
【０２８２】
各SNPについて、PCR産物はミニシークエンシングのための鋳型として有効であろう。
【０２８３】
PCR反応の総反応体積は、試料につき５μｌである。
【０２８４】
反応体積は下の表に示した試薬からなる。
【表２】
これらの試薬をABGene（参照TF−０３８４−K）によって提供された３８４ウェルのブラックPCRプレートに分注した。次いで、プレートを密封し、遠心し、３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tetrad of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。PCRサイクル、即ち、９４℃で１分、しかる後に３段階(９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分)からなる３６サイクルである。
【０２８６】
２)次いで、PCR増幅産物を２つの酵素：エビアルカリフォスファターゼ（SAP）及びエキソヌクレアーゼＩ（ExoＩ）を用いて精製する。これらの酵素により、第１に、PCR増幅中に組み込まれなかったdNTPの脱リン酸化が起こり、第２に、他方で単一標準DNA残さ、詳細には、PCR中に用いられなかったプライマーが取り除かれる。
【０２８７】
消化を、PCRプレートの各ウェルごとに、試料につき５μｌの反応混合物を添加することによって行う。この反応混合物は、以下の試薬からなる。
【表３】
プレートを、充填した後に密封し、遠心し、そして３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tread of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。それは、SAP−EXO消化：３７℃で４５分、８０℃で１５分である。
【０２８９】
次いで、伸長又はミニシークエンシング段階を、調製した試料につき５μｌの反応混合物を添加することによって消化されたPCRの産物に対して行った。
【０２９０】
ミニシークエンシング３)及び読み込み４)及び読み込んだものの読み替え５)段階は、各SNP、a５１６g、c６４１g及びg７９８cに対して特異的である。
【０２９１】
これらの段階の全てを、これらそれぞれの多型のために用いた特異的な条件を正確に、本明細書中、以降に記載している。
【０２９２】
３)ミニシークエンシング
ジェノタイピングのために欠かせない２つのミニシークエンシングプライマーの配列を、本発明のSNP部位の上流に位置したヌクレオチドの配列に対応するように決定した。SNPを含むPCR産物は２本鎖DNA産物であり、故に、そのジェノタイピングをセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらかに対して行うことができうる。選定のプライマーは、Life Technologoes Inc.で製造されている。
【０２９３】
下の表には、各SNPについて、試験したミニシークエンシングプライマーの配列及びジェノタイピングのために維持した至適条件を示している。
【表４】
SNPのミニシークエンシングを最初１６試料に対して確認し、そして２６８個体及び１０コントロールからなる一式の個体集団に対してジェノタイピングした。
【０２９５】
次いで、伸長又はミニシークエンシング段階を以下の表に示すように行う。
【表５】
次いで、プレートを、充填した後に密封し、遠心し、３８４ウェルプレートのためのサーモサイクラー（Tetrad of MJ Reserch）に置いて、以下のインキュベーション行った。伸長PCRサイクル、即ち、９３℃で１分、しかる後に２段階(９３℃で１０秒、５５℃で３０秒)からなる３５サイクルである。
【０２９７】
サーモサイクラーでの最後の段階の後、プレートをLJL Biosystems IncのAnalyst（商標登録）HT型の偏光蛍光リーダーに直接置いた。２つの方法を用いることによるCriterion Host（商標登録）ソフトウェアを用いてプレートを読んだ。第1番目にTamra標識された塩基を、この蛍光（励起５５０〜１０nm、放射５８０〜１０nm）に対して特異的な放射及び励起フィルターを用いることによって読み込み可能にし、そして第２番目に、R１１０標識された塩基を、この蛍光（励起４９０〜１０nm、放射５２０〜１０nm）に対して特異的な励起及び放射フィルターを用いることによって読み込み可能にする。この２つの場合において、Dichroic double mirror（R１１０／Tamra）を使用し、そして他の読み込みパラメーターは：
Z高度：１．５mm
アテニュエーター：アウト
積分時間：１００，０００μ秒
ローデータ（Raw data）単位：カウント／秒
偏極スイッチ：ウェルによって
プレート定着時間：０ｍ秒
PMTセットアップ：Smart Read（＋）、感度２
ダイナミック偏極器：放射
空電偏極器：S
【０２９８】
このようにして得られたファイル結果（file result）は、Tamraフィルター及びR１１０フィルターについて計算されたmP（ミリ偏極化）の値を含んでいる。これらのmP値は、下記の式により、平行面（//）に対して得られた強度値及び垂直面（⊥）に対して得られた強度値から出発して計算される。
MP＝１０００（//−g⊥）／（//＋⊥）
【０２９９】
この計算では、値⊥は、因子ｇにより重み付けされている。それは、実験的に予め測定されていなければならない機械的パラメーターである。
【０３００】
４)及び５) 読み込んだものの読み替え及び遺伝子型の決定
mP値はMicrosoft Inc.のExcel ソフトウェア、及び／又はLJL Biosystems Inc.によって開発されたAllele Caller（登録商標）ソフトウェアを用いてグラフで報告されている。
【０３０１】
横軸上には、Tamra標識された塩基のmP値が示されており、縦軸にはR１１０標識された塩基のmP値が示されている。強mP値により、この蛍光で標識された塩基が組み込まれていることを示し、そして反対に弱mP値により、この塩基の組み込み不在が明らかになる。
【０３０２】
様々な遺伝子型を有するヌクレオチド配列の類似群が最大で３つ得られて良い。
【０３０３】
Allele Caller（登録商標）ソフトウェアの使用により、一度様々な群の同定が行われれば、表の形態で、各個体を規定する遺伝子型を直接抽出することが可能になる。
【０３０４】
例えば、SNP g798cについて、アンチセンスにおいて読まれた対立遺伝子cは、センスにおいて読まれた対立遺伝子gに対応し、そして未熟IFNα−５タンパク質配列の位置４９でシステイン（C）が存在することに関連し、それ故に、アンチセンスにおいて読まれた対立遺伝子gは、対応するタンパク質の配列のこの位置のセリン（S）に対応する、センスにおいて読まれた対立遺伝子ｃに対応するということを特定することは欠かせない。
【０３０５】
SNP a ５１６ g 、 c ６４１ g 、 g ７９８ c に関するミニシークエンシングの結果
ジェノタイピング方法の完了後、個々の個体集団の遺伝子型の特定を、本発明中で研究されたSNPに関して上記のグラフを用いて行った。
【０３０６】
SNP a５１６gに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体AAもしくはヘテロ接合体AGもしくはホモ接合体GGである。実際には、下に示したように、ホモ接合体遺伝子型GGはこの個体集団において検出されていない。
【０３０７】
SNP c６４１gに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体CCもしくはヘテロ接合体CGもしくはホモ接合体GGである。実際には、下に示したように、ホモ接合体遺伝子型GGは、この個体集団において検出されていない。
【０３０８】
SNP g７９８cに関して、その遺伝子型は試験される個体において理論上、ホモ接合体GG、もしくはヘテロ接合体GC遺伝子もしくはホモ接合体CCである。実際には、下に示したように、ヘテロ接合体CCは、この個体集団において検出されていない。
【０３０９】
個体集団において特定された遺伝子型の分布及び研究した３つのSNPに関する様々な対立遺伝子頻度の計算の結果を以下の表に記載している。
【表６】
先の表では、
−Nは、個体数を示し、
−％は、特異的分集団における個体の百分率を示し
−対立遺伝子頻度は、特異的分集団における突然変異対立遺伝子の百分率を示し、
−９５％ICは、９５％信頼性での最小及び最大インターバル
である。
【０３１１】
系統集団、及びSNPによってこれらの結果を検証することで、以下のことを確認した。
−SNP a５１６gについて、４人のヘテロ接合体AG個体は、分集団の、アフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系白人に由来する
−SNP c６４１gについて、６人のヘテロ接合体CG個体は、分集団の、アフリカ系アメリカ人及び東南アジア人に由来する
−SNP g７９８cについて、４人のヘテロ接合体GC個体は、分集団の、カリブ人及びヨーロッパ系白人、メキシコ人及び南アメリカ人に由来する
【０３１２】
実施例３．天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α―５の酵母における発現
a) 天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α―５の真核発現ベクター pZip α− topo 中へのクローニング
天然野生型IFNα−５及びC１２２S突然変異IFNα−５の成熟部分をコードするためのヌクレオチド配列を、SNPについてヘテロ接合体である個体からのゲノムDNAを鋳型として用いることでPCRによって増幅した。
【０３１３】
かかる増幅を可能にするPCRプライマーは：
【化３】
【０３１４】
PCR産物を、真核発現ベクターpZipZα−TOPO（TOPO（登録商標）−cloning；Invitrogen Corp.）中に、メタノールにより誘導可能なハイブリッドプロモーターAOX１の制御下で挿入した。
【０３１５】
このベクターにより、酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）中での真核生物タンパク質のヘテロ接合体発現が可能になる。
【０３１６】
組換えタンパク質をコードするためのベクター領域のヌクレオチド配列を調べた後、当該ベクターをPme１制限酵素によって直線状にした。そしてP.パストリス（pastoris）酵母系統（Invitrogen）をこれらの組換え発現ベクターで形質転換させた。
【０３１７】
b) P. パストリスにおけるヘテロ接合体発現及び天然野生型 IFN α−５及び C １２２ S 突然変異 IFN α−５タンパク質の精製
天然野生型IFNα−５をコードするため又はC１２２S突然変異IFNα−５をコードするためのクローンを含む５０mLのBMGY培地（２％のペプトン、１％のイーストエクストラクト、１．３４％のYNB、１％のグリセロール、１００mMのリン酸カリウム、０．４mg／lのビオチンを含むpH６．０）により、２つの飽和事前培養物を、３０℃で２４〜４８時間に渡り２００回転／分（rpm）で動揺しながら行った。
【０３１８】
培地が飽和細胞密度（６００nmの波長で測定した光学密度１２に対応する）に到達した場合、それを、５OD／mLで、２５０mLのBMMY培地（２％のペプトン、１％のイーストエクストラクト、１．３４％のYNB、０．５％のメタノール、１００mMのリン酸カリウム、０．４mg／lのビオチンを含むpH６．０）に接種するために用いた。
【０３１９】
次いで、３０℃で２４時間に渡り、培養フラスコ中１８０rpmの動揺をしながら、最終濃度1％のメタノールによってタンパク質の発現を誘導した。
【０３２０】
コーディング配列上流の、「α因子」のシグナルペプチド配列が存在することにより、タンパク質は、酵母によって培養培地中に分泌される。前記α因子は、天然に、プロセッシング中に解裂する。
【０３２１】
懸濁を遠心して、得られた上清から出発してタンパク質をHPLCによって精製した。
【０３２２】
開始前段階において、超遠心（Labscale カットオフ５０００Da、Millipore）、しかる後の透析により、１０倍濃度の酵母上清が５０mMのトリスCl、pH９．０、25mMのNaClのバッファー中で可能になる。
【０３２３】
最初のクロマトグラフィーによる段階で、青セファロースカラム（Amersham Pharmacia）上での親和性によりタンパク質回収が可能になる。その一方、SDS PAGE型の電気泳動、及びIFNα−５タンパク質に対して向けられた特異的抗体による免疫検出により、回収された画分中でのタンパク質の存在が確認される。この段階で、注目のタンパク質の純度は７５％超である。
【０３２４】
第２の精製段階で、ゲルろ過により、５０mMのトリス、pH９．０、２５mMのNaClに対して、IFNα−５タンパク質に対応する回集された画分のバッファー交換が可能になる。
【０３２５】
精製の最後の段階は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でタンパク質を分離することから成る。
【０３２６】
組換えタンパク質を含む画分を、トリス５０mM、pH９、NaCl２５mMバッファーで予め平衡化した陰イオン交換カラムに注入する。タンパク質の溶出を、勾配（トリス５０mM、pH９バッファー中、０．０２５〜１MのNaCl）の移動により行う。
【０３２７】
注目のタンパク質の純度をSDS／PAGEゲル上で計算し且つタンパク質濃度をデンシトメトリー（Quantity one、Biorad）及びBCAアッセイ（ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma）によって測定する。
【０３２８】
精製された、天然野生型IFNα−５及びC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質をこのプロトコール（いずれ、より多くの量のタンパク質を得るのにスケールアップされる）により得、それらを下記の機能試験のために用いる。
【０３２９】
実施例４．野生型及び C １２２ S 突然変異 IFN α−５の、乳ガン細胞系統 MCF −７中でのシグナル伝達を活性化する能力の評価
インターフェロンは、JAK（Janus Kinase）及びSTAT（Signal Transducer and Activators of Transcription）タンパク質を伴うシグナル経路を介して作用することが分かっている。インターフェロンがそのレセプターに対して結合することでJAKタンパク質のリン酸化が誘導され、そして順番にリン酸化によってSTATタンパク質が活性化される。活性化されたSTATタンパク質は核に移り、遺伝子のプロモーター上のインターフェロン応答エレメントに対して結合し、これにより各遺伝子の転写が刺激される。インターフェロンによって開始されるシグナル経路を調べるために、レポーター遺伝子技術を用いた。手順を以下に記載している。
【０３３０】
乳ガン細胞MCF−７（ECACC）を２４時間に渡り、１０％ウシ胎児血清を補足したRPMIの９６ウェルプレートにおいて、１・１０４細胞／ウェルの密度で播いた。次いで、細胞を６時間に渡り、製造説明書によりSuperfect（Qiagen）を用いて、インターフェロン刺激化応答エレメント（Clontech）の制御下に置かれたFirefly Luciferaseをコードするレポーター遺伝子構築体（pISRE−Luc）でトランスフェクトした。その後、培養培地を交換しそして細胞をCO２インキュベーター中３７℃でインキュベートし、その後、それらを様々な量の野生型又は突然変異INFα−５タンパク質で３７℃、６時間に渡り刺激を加えた。刺激化の後、培養培地を捨て１００μl／ウェルのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）／1mM MgCl２と換えた。ルシフェラーゼ活性を、１００μl／ウェルの基質Luclite−Plus（Packard）を添加後にMicroBetaカウンターで測定した。
【０３３１】
結果は、ルシフェラーゼ活性最大刺激の％として表されている。野生型IFNα−５又はC１２２S突然変異INFα−５のシグナル伝達経路を始動させる能力とは、それらの、それぞれルシフェラーゼ活性を（最大の刺激化を１００％活性とした場合）５０％刺激する個々の濃度に対応する、５０％(EC５０の)有効用量を測定することに基づいている。
【０３３２】
野生型IFNα−５について測定された平均EC５０値は、５．６７pMである。
【０３３３】
C１２２S突然変異IFNα−５について測定された平均EC５０値は、９３．２７pMである。
【０３３４】
従って、野生型タンパク質のEC５０値に対する、突然変異型タンパク質のEC５０値の対応する比率は（標準偏差７．６３で）１８．３２pMに至る。
【０３３５】
従って、この試験により、C１２２S突然変異IFNα−５の生物活性は、乳ガン細胞系統MCF−７中でインターフェロンシグナル経路を活性化するその能力に基づいて、野生型のものに比べて１０〜２５倍低いことが示された。
【０３３６】
実施例５． C122S 突然変異 INF α−５の免疫調節活性の評価
Ｉ型のIFN（IFNα及びINFβ）は免疫系の所定の機能を調節できる。それらは：樹状細胞（DC）の成熟を促すこと、即ち、MHCクラスＩ型（HLA−ABC）及びII型（HLA−DR）分子の発現を促すこと、Tリンパ球、CD８０、CD６０及びCD８３分子の共刺激に関わる分子の発現を増加させること並びにTリンパ球の刺激機能を促すことが示されている。
【０３３７】
a)C１２２S突然変異IFNα−５の樹状細胞の成熟に対する効果
C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節活性を最初に樹状細胞の成熟により調べ、そして代表的な市販のイントロンA産物として選択した野生型INFα−５又は野生型INFα−２のものと比較した。
【０３３８】
そのようにするために、樹状細胞を最初に、GM−CSF及びIL−４サイトカインの存在下で培養した成熟末梢血単球から生成した。CD１４＋細胞生成キットを用いて精製した後、これらの樹状細胞を、１００ng／mLのC１２２S突然変異INFα−５、野生型IFNα−２又は野生型INFα−５存在下に置き、そして、それらの遺伝子型をマーカーとしてMHCクラスＩ及びII分子並びにCD４０、CD８０、CD８６、CD８３及びCD１の発現を調べるための目的のFACS解析によって決定した。これら樹状細胞の成熟の状態を、刺激されていない樹状細胞との対照実験を供するために、IFNα処理をせずに獲得したのとも比較した。
【０３３９】
各マーカー及び４つの実験条件について測定した蛍光強度の中央値（任意の単位で示した）を下の表に示している。
【表７】
この試験の結果により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、樹状細胞成熟を刺激する高い能力を有することが示された。詳細には、C１２２S突然変異INFα−５による樹状細胞の成熟の刺激は、野生型IFNα−５及び野生型IFNα−２のものよりも高い。
【０３４１】
b)C１２２S突然変異IFNα−５の、Tリンパ球によるサイトカイン放出に対する効果
C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節活性を、攻撃に対する免疫応答を模擬するために突然変異IFNα−５タンパク質存在及び強抗原（SEB）有無の存在下に置かれたTリンパ球によるサイトカイン放出を測定することによっても調べた。試験を、コントロールとして用いられ且つ代表的なイントロンA市販製品として選定される野生型IFNα−２の存在下でも行った。
【０３４２】
そのようにするために、末梢血単核細胞（PBMC）を健常な供与者から単離して１６時間に渡り、抗CD３及び抗CD２８抗体又はSEBを含む適切な培地中で刺激した。各培養では、４μg／mLのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型INFα−２を添加した。刺激後、Tリンパ球を抗CD３、抗CD４、抗CD６９抗体又は抗CD３、抗CD８及び抗CD６９抗体で細胞外標識し、そしてTh１型のサイトカイン（IFNγ）又はTh２型のサイトカイン（IL−１０）に対して向けられた特異的な抗体で細胞内標識をした。蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて分析した。
【０３４３】
得られた結果により、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２はIL−１０及びINFγの放出を刺激することはなく、そしてそれ故にSEBの不在下ではTリンパ球を活性化しないことが示された。その一方で、以下に示すように、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２タンパク質は、SEB活性化されたTリンパ球によるサイトカイン（IL−１０及びIFN−γ）放出を刺激する。この表は、SEBの存在下でリンパ球によるサイトカイン放出（CD４＋、CD６９＋細胞又はCD８＋、CD６９＋細胞のCD４＋Tリンパ球及びCD８＋Tリンパ球のそれぞれに対する％、並びに総細胞に対するCD６９細胞の％として表した）を示す。
【表８】
これらの結果により、明らかに、C１２２S突然変異IFNα−５が、予めSEB抗原によって活性化されたCD４＋Tリンパ球及び、CD８＋Tリンパ球によるサイトカイン（IFNγ及びIL−１０）の放出を刺激することが示された。詳細には、CD４＋又はCD８＋Tリンパ球によるインターフェロンγの生産は、C１２２S突然変異INFα−５の存在下でのほうが野生型IFNα−２の存在下でよりも高い。
【０３４５】
c) C１２２S突然変異IFNα−５の、単球によるサイトカイン放出に対する効果
最後に、C１２２S突然変異IFNα−５の免疫調節効果を、細菌毒薬（LIP）の存在下又は不在下で単球によるサイトカイン放出を測定することによって調べた。この試験はコントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２の存在下でも行った。
【０３４６】
そのようにするために、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を健常な供与者から単離してそれらの遺伝子型を分析し、CD６４＋、CD４＋dim細胞の総対量を測定した（CD６４及びCD４dimは血液単球のためのマーカーである）。一晩培養した後、これらのPBMCを培地中単独（刺激された細胞はなく）で又はLPS（刺激された細胞）の存在下でインキュベートした。各培用では４μg／mLのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型INFα−２を添加した。培養後、細胞を抗CD６４及び抗CD４dimで細胞外標識し、そしてTh１型のサイトカイン（TNF−α）、IL−１２及びIL−１０に対して向けられた特異的抗体で細胞内標識をした。
【０３４７】
蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて分析した。
【０３４８】
得られた結果により、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−２は、LPSの不在下ではサイトカイン（IL−１０、IL−１２及びTNF−α）の放出を刺激することはないことが示された。
【０３４９】
その一方で、LPSの存在下では、単球はサイトカイン（IL−１０、IL−１２及びTNF−α）放出し、この放出は更に、以下の表に示すように、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質又は野生型IFNα−２タンパク質の存在下で増加した。この表は、LPSの存在下での単球によるサイトカイン放出（総細胞に対するCD６４＋CD４dim細胞の％、及びCD４dimCD６４＋細胞の％として表した）を示す。
【表９】
これらの結果により、LPSの存在下では、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質が単球によるサイトカイン（IFNγ及びIL−１０）の放出を刺激できることが示された。詳細には、単球によるIL−１０及びTNF−α放出の刺激は、C１２２S突然変異INFα−５の存在下でのほうが野生型IFNα−２の存在下でよりも高い。
【０３５１】
実施例６ .C １２２ S 突然変異 IFN α−５の in vitro 抗増殖活性の評価
a)ヒトリンパ腫のDaudi Burkitt細胞系統に対して
これらの試験をことなる２つのIFNα−５型、即ち、C１２２S突然変異IFNα−５及び野生型IFNα−５により行った。予めRPMI１６４０培地（１０％ウシ胎児血清及び２mMのL−グルタミンを補足した）中で培養した細胞（ヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系統、本明細書中では以降「Daudi 細胞」と呼ぶ）を９６ウェルプレートに細胞密度４・１０４細胞／ウェルで播いた。
【０３５２】
各ウェルでは、Daudi 細胞を、０．００３pM〜６００nMの範囲で濃度を増加する天然野生型IFNα−５又は突然変異IFNα−５のどちらかと接触するよう置いた。
【０３５３】
３回繰り返した３つ以上の実験を両方のタンパク質及び各濃度について行った。
【０３５４】
次いで、Daudi 細胞を３７℃で６６時間に渡り５％CO２下でインキュベートし、その後、Uptiblue試薬（Uptima）を培養物に添加した。増殖の速度を、更なる４時間のインキュベーション後に、５９０nmで放射された蛍光（５６０nmで励起する）を測定することによって定量した。
【０３５５】
C１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−５の抗増殖活性は、細胞の増殖を５０％阻害するIFNα−５の濃度に対応するIC５０を測定することに基づいている。
【０３５６】
C１２２S突然変異IFNα−５に関して測定した平均IC５０値が９３．２７である一方で、野生型IFNα−５に関する測定した平均IC５０値は５．６７である。従って、天然野生型タンパク質のIC５０値に対する、突然変異型タンパク質のIC５０値に対応する平均比率は、１８．３２（標準偏差７．６３）に至る。
【０３５７】
この試験により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、Daudi細胞増殖を阻害するということが示された。更に、細胞抗増殖活性は、C１２２S突然変異IFNα−５の場合、野生型IFNα−５に比べて大いに減少している。
【０３５８】
b)TF−１赤白血病細胞系統に対して
C１２２S突然変異IFNα−５の効果をTF−１赤白血病細胞系統に対しても評価した。この試験は、コントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２の存在下でも行った。
【０３５９】
そのようにするために、C１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−２（０．００１〜１０００ng/mLの範囲で濃度が増加する）と接触するよう置いて細胞の増殖を測定した。
【０３６０】
この実験を３回繰り返し、そして代表的な実験の結果を図３に示している。
【０３６１】
これらのデータにより、C１２２S突然変異IFNα−５はTF−１に対して弱い抗増殖活性を有することが示される。特に、C１２２S突然変異IFNα−５の抗増殖活性効果は、野生型INFα−２より劣っており、C１２２S突然変異IFNα−５の血液毒性が野生型IFNα−２よりも優れていないことを示唆する。
【０３６２】
実施例７． C １２２ S 突然変異 IFN α−５の抗ウィルス活性の評価
IFNは抗ウィルス防御において重要な役割を果たす。IFN抗ウィルス活性は一部IFNが誘導した酵素系に起因する。それは、例えば：
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する酵素である２´５´オリゴアデニル化シンセターゼ。これらのオリゴマーは、一度活性化するとウィルスRNAを破壊するエンドリボヌクレアーゼであるRNaseLを活性化する。
−ウィルス転写産物の合成及び／又は突然変異を阻害するMxタンパク質（GTPase）。この活性は主にインフルエンザウィルスに対して発揮される。
−二本鎖化したRNAによって活性化されるPKRタンパク質（又はp６８キナーゼ）。活性化されたPKRはタンパク質合成を阻害する。
【０３６３】
IFNの抗ウィルス活性は他の機構によっても誘導される。それは例えば、レトロウィルスの場合、ウィルス粒子が細胞内へ侵入すること、複製、結合、粒子の射出及びウィルス粒子の感染性力を阻害することである。
【０３６４】
最後に、IFNは、免疫系の所定の機能を調節することによって、詳細には、（特に、MHCクラスＩ及びII型の分子を増加させること、IL−１２及びIFNγ生産を高めること、CTL活性の向上など）細胞が介在する反応によって、間接的に抗ウィルス活性を発揮する。
【０３６５】
C１２２S突然変異IFNα−５の抗ウィルス活性を培養細胞におけるin vitro及びマウスモデルにおけるin vivoの両方で評価した。両方の試験を、コントロールとして用い且つ代表的なイントロンA市販製品として選択された野生型INFα−２を用いて平行して行った。
【０３６６】
a)培養細胞におけるin vitro抗ウィルス活性
このアッセイにより、水泡性口内炎ウィルス（VSV）を用い培養細胞におけるC１２２S突然変異IFNα−５の抗ウィルス活性の評価、そして野生型IFNα−２又は野生型IFNα−５との比較が可能になる。
【０３６７】
そのようにするために、WISHヒト上皮細胞を、濃度を下げるC１２２S突然変異IFNα−５、野生型IFNα−５又は野生型IFNα−２の存在下で２４時間に渡り培養した。次いで、細胞を、水泡性口内炎ウィルス（VSV）によって２４〜４８時間に渡りインフェクションして細胞の溶解を測定した。
【０３６８】
試験された異なるIFNαの抗ウィルス効果を、細胞のVSVによって誘導される溶解を５０％阻害するIFNの濃度に対応するIC５０値を比較することによって測定した。
【０３６９】
類似の実験を３回行って、代表的な実験の１つにおいて測定されたIC５０値を下の表に示している。
【表１０】
この実験の結果により、C１２２S突然変異IFNα−５タンパク質は、培養細胞でin vitro抗ウィルス活性を有することが示された。更に、VSVでインフェクトされた培養細胞において、C１２２S突然変異IFNα−５は、野生型IFNα−５又は野生型IFNα−２よりも低い抗ウィルス活性を有する。
【０３７１】
b)マウスモデルでのin vivo抗ウィルス活性
このin vivo試験をEMCV（Encephalomyocarditis virus）マウスモデルで行っている。
【０３７２】
ヒトIFNは前記マウスにおいて用量依存性抗ウィルス活性を示す。一般にそれは、同量のマウスIFNによって示されるよりも１００〜１０００倍低い（Meisterら（１９８６）、J.Gen.Virol.６７;pp.１６３３〜１６４４）。
【０３７３】
マウスへの脳心筋炎ウィルス（EMCV）の腹腔内注射により、中枢神経系が巻き込まれ且つ脳障害（encephalitis）を特徴とする急速に進行する致死的疾患が生じる（Finter NB（１９７３）、Front Biol.２；pp.２９５〜３６０）。マウス及びヒトのインターフェロンαはどちらも、致死EMCV感染に対してマウスを保護することにおいて有効であることが示されている（Tovey及びMaury（１９９９）.J.IFN Cytokine Res. １９：pp.１４５〜１５５）。
【０３７４】
群中２０匹の、６週齢Swissマウスの腹腔内に１００×LD５０EMCVをインフェクトしそして１時間後に２μgのC１２２S突然変異IFNα−５又は野生型IFNα−２調製物で処理し、その後３日に渡り１日に１回処理した。コントロールの群は賦形剤でのみ処理したもので行った。動物はその後日２１日に渡り延命された。
【０３７５】
結果を図４に示しており、そしてC１２２S突然変異IFNα−５で処理されたマウスの相対生存率は、無処理マウスの生存率よりもかなり高いことが示されており、これはC１２２S突然変異IFNα−５のマウスモデルにおけるin vivoでの抗ウィルス活性を示している。更に、C１２２S突然変異IFNα−５のマウスモデルにおけるin vivo抗ウィルス活性は、野生型IFNα−２で処理したマウスについて確認されたものと類似している。
【０３７６】
実施例８．悪性 Friend 赤白血病細胞を予め接種したマウスにおける C １２２ S 突然変異 IFN α−５の抗腫瘍活性の評価
IFNαは、IFN感受性親Friend白血病細胞に対するのと同じように、IFNαの直接抗増殖活性に対して耐性のFriend白血病細胞のクローン増殖に対してマウスを保護することにおいて有効であること（Belardelliら、Int.J.Cancer,３０,pp.８１３〜８２０,１９８２；Belardelliら、Int.J.Cancer,３０,pp.８２１〜８２５，１９８２）が示されており、これはIFNαの抗腫瘍活性における間接免疫介在機構の重要性を反映する。
【０３７７】
以下の実験により、C１２２S突然変異IFNα−５の、予めFriend赤白血病細胞を接種されたマウスにおける抗腫瘍活性の評価が可能になり、そして体表的な市販のイントロンA製品として選択した野生型IFNα−２の抗腫瘍活性との比較が可能になる。
【０３７８】
そのようにするために、群中１２匹の６週齢DBA／２マウスの腹腔内に１００，０００個のIFN耐性Friend赤白血病細胞（３Ｃ１８）（２０，０００LD５０）を接種し、そして１時間後、２μgの野生型IFNα−２もしくは２μgのC１２２S突然変異IFNα−５もしくは等体積の賦形剤のみで処理し、その後２１日に渡り１日に１回処理した。動物はその後毎日生き続け、そして賦形剤でのみ処理した群との比較において各処理群の一次効果測定値（primary efficacy measure）を４０日での生存率として、そして一次効果分析値（primary efficacy analysis）を各処理群の４０日での相対生存率として規定した。
【０３７９】
この実験の、図５に示した結果により、明らかに、IFNαで処理しなかったマウスに比較して、C１２２S突然変異IFNα−５でマウスを処理することで、非常に悪性のFriend赤白血病細胞（FLC）を接種した後に生存するマウスの数の増加がもたらされることが示される。詳細には、FLCを接種されたマウスの生存率の増加は、野生型IFNα−２で処理した後よりもC１２２S突然変異IFNα−５により処理した後の方が高い。
【０３８０】
これら全ての結果から、C１２２S突然変異IFNα−５は固有の生物学的特性を有することが示される。
【図面の簡単な説明】
【０３８１】
【図１】図１Aは、SNP Q４７Eを含んで成る本発明のコードされたタンパク質、及び天然野生型IFNα−５タンパク質のモデルを示す。図１Bは、図１Aで示された各タンパク質の、よりすぐれた部分のモデルの拡大を示している。図１A及び図１Bにおいて、黒のリボンは天然野生型IFNα−５タンパク質の構造を示し、そして白のリボンはQ４７E突然変異IFNα−５タンパク質の構造を示す。
【図２】図２Aは、本発明のSNP C９９Sを含んで成るコードされたタンパク質、及び天然野生型IFNα−５タンパク質のモデルを示す。図２Bは、図２Aで示された各タンパク質の、よりすぐれた部分のモデルの拡大を示している。図２A及び図２Bにおいて、黒のリボンは天然野生型IFNα−５タンパク質の構造を示し、そして白のリボンはC９９S突然変異IFNα−５タンパク質の構造を示す。
【図３】C１２２S突然変異IFNα−５のTF−１細胞系統に対する抗増殖効果を測定するための試験の結果を示す。この図において、横軸は、IFNαの濃度（ng／mL）に対応し、そして縦軸は、細胞増殖の阻害率（％）に対応する。C１２２S突然変異IFNα−５の抗増殖効果（黒菱形）を、野生型のもの(白四角)と比べている。
【図４】予めVSVウィルスに感染してC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質で処理されたマウスの生存率を、野生型IFNα−２、又は処理していないものとの比較で示す。この図において、横軸は生存時間（日）に対応し、そして縦軸はVSVに感染したマウスの相対生存率に対応する。黒四角はC１２２S突然変異IFNα−２で処理したVSV感染マウスに関するデータを示し、そして白抜き三角は何も処理をしなかったVSV感染マウスに関するデータを示している。
【図５】予め悪性Friend赤白血病細胞（FLC）を接種され、そしてC１２２S突然変異IFNα−５タンパク質で処理されたマウスの生存率を、野生型IFNα−２で処理されたもの、又は処理していないものとの比較で示す。この図において、横軸は生存時間（日）に対応し、そして縦軸はFLCを接種したマウスの相対生存率に対応する。黒菱形はC１２２S突然変異IFNα−５で処理したFLC接種マウスに関するデータを示す。黒四角は野生型IFNα−２で処理したFLC接種マウスに関するデータを示し、そして白抜き三角は何も処理しなかったFLC接種マウスに関するデータを示している。
Claims (42)
- 単離されたポリヌクレオチドであって：
a) ヌクレオチド配列(配列番号１)、ここでかかるヌクレオチド配列は、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択されたSNPを１つ以上含んで成るという条件であり；又は
b) a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、
の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。 - a５１６g、c６４１g、g７９８cからなる群から選択されたコーディングSNPを１つ以上含むという条件の配列番号１の４３４〜１００３番目のヌクレオチドを含んで成る、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが１０以上のヌクレオチドからなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- アミノ酸配列（配列番号２）の全部又は一部を含んで成り、そしてQ２８R、Q７０E及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- アミノ酸配列（配列番号２）の全部又は一部を含んで成り、そしてコーディングSNP C１２２Sを有するポリペプチドをコードする、離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部を同定もしくは増幅する方法であって、適切なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドと請求項１に記載のポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせることを含んで成る方法。
- ヌクレオチド配列（配列番号１）と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部もしくは一部をジェノタイピングする方法であって、対象者もしくは対象者集団のゲノムDNA中の注目の領域を増幅し、そしてヌクレオチド配列（配列番号１）中での４２、４３、８２、１２３、１５２、１７４、２９２、５１６、６４１、７９８及び１００９から成る群から選択された１つ以上の位置で対立遺伝子を特定する段階を含んで成る方法。
- 前記ジェノタイピングが、ミニシークエンシングにより行われている請求項７に記載の方法。
- 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター。
- 請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞。
- 請求項１０に記載の宿主細胞を培養培地中で培養し、そして当該培養培地から前記ポリペプチドを分離することを含んで成る、ポリペプチドを分離する方法。
- 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
- アミノ酸配列（配列番号２）の全部又は一部を含んで成り、そしてQ２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上有する、単離されたポリペプチド。
- アミノ酸配列（配列番号２）の２４〜１８９番目のアミノ酸を含んで成り、そしてQ２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
- アミノ酸配列（配列番号２）の２４〜１８９番目のアミノ酸を含んで成り、そしてコーディングSNP C１２２S有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
- 免疫特異的抗体を獲得する方法であって、請求項１２に記載のポリペプチドで動物を免疫し、そして前記抗体を前記動物から回収することを含んで成る方法。
- 請求項１６に記載の方法によりもたらされる免疫特異的抗体。
- アミノ酸配列（配列番号２）の全部もしくは一部を含んで成り、そしてQ２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上有する単離されたポリペプチドの活性を活性化もしくは阻害する因子を、試験される１もしくは複数の化合物の中から同定する方法であって、当該方法は：
a) 請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し；
b) 前記宿主細胞と前記試験される化合物とを接触させ；
c) 前記ポリペプチドの活性にもたらす活性化もしくは阻害効果を測定することによって前記活性化もしくは阻害因子を同定する、
ことを含んで成る方法。 - アミノ酸配列（配列番号２）の全部もしくは一部を含んで成り、そしてQ２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上有する単離されたポリペプチドによって活性が増強もしくは阻害される因子を、試験される１もしくは複数の化合物の中から同定する方法であって、前記方法は：
a) 請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し；
b) 前記宿主細胞と前記試験される化合物とを接触させ；
c) 前記因子の活性にもたらす増強もしくは阻害効果を測定することによって前記増強もしくは阻害された因子を同定する、
ことを含んで成る方法。 - 対象者の生物学的性質を分析する方法であって、以下の段階：
a) 対象者のゲノムにおける請求項１に記載のポリヌクレオチドの存在又は不在を特定すること；
b) 対象者における請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現のレベルを測定すること；
c) 対象者における請求項１２に記載のポリペプチドの存在又は不在を特定すること；
d) 対象者における請求項１２に記載のポリペプチドの濃度を測定すること；
e) 対象者における請求項１２に記載のポリペプチドの機能を特定すること、
を１つ以上行うことを含んで成る方法。 - c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択されたSNPを１つ以上含んで成るという条件のヌクレオチド配列(配列番号１) の全部もしくは一部、又は前記ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；
前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞；
Q２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上含んで成るという条件のアミノ酸配列(配列番号２)の全部又は一部を含んで成る単離されたポリペプチド；
前記ポリペプチドに対して特異的な抗体；
からなる群から選択された１もしくは複数の化合物を含んで成る治療剤。 - 個体における、ガン及び腫瘍、感染症、免疫及び自己免疫疾患に関連した疾患、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患からなる群から選択された疾患、並びに化学的治療に関連した障害を予防又は治療するための方法であって、前記個体に対して治療上有効な量の請求項２１に記載の治療剤に、医薬的に許容できる賦形剤を加えて投与することを含んで成る方法。
- 前記ガン及び腫瘍が、転移性腎ガン、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る免疫欠損症に続いて現われる腫瘍を含んで成る請求項２２に記載の方法。
- 前記代謝性疾患が免疫とは無関係の疾患、例えば、肥満症を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
- 前記感染症がウィルス感染症、例えば、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅などの性病を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
- 前記中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
- 前記免疫及び自己免疫に関連した疾患が、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
- 個体における、傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び／又は骨粗鬆症から成る群から選択された疾患を予防又は治療する方法であって、前記個体に対して治療上有効な量の請求項２１に記載の治療剤に、医薬的に許容できる賦形剤を加えて投与することを含んで成る方法。
- 請求項１２に記載のポリペプチドの対象者における活性を高める又は下げる方法であって、治療上有効な量の１又は複数の：
c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択されたSNPを１つ以上含んで成るという条件のヌクレオチド配列（配列番号１) の全部もしくは一部、又は前記ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；
前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞、ここで前記宿主細胞は治療される対象者から獲得されて良く；
Q２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上含んで成るという条件のアミノ酸配列(配列番号２)の全部又は一部を含んで成る単離されたポリペプチド；
前記ポリペプチドに対して特異的な抗体；及び
医薬的に許容できる賦形剤、
を投与することを含んで成る方法。 - 個体において、当該個体のゲノム中に請求項１に記載のポリヌクレオチドが存在することに関連した障害もしくは疾患を予防もしくは治療するための方法であって、治療上有効な量の１又は複数の：
c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択されたSNPを１つ以上含んで成るという条件のヌクレオチド配列（配列番号１) の全部もしくは一部、又は前記ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；
前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞；
Q２８R、Q７０E、及びC１２２Sから成る群から選択されたコーディングSNPを１つ以上含んで成るという条件のアミノ酸配列（配列番号２)の全部又は一部を含んで成る単離されたポリペプチド；
前記ポリペプチドに対して特異的な抗体；及び
医薬的に許容できる賦形剤、
を投与することを含んで成る方法。 - IFNα−５遺伝子におけるc４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択された１つ以上のSNPと疾患又は疾患に対する耐性との直接的な関連性を統計学的に特定する方法であって：
a) 個体の群をジェノタイピングをし；
b) 前記疾患又は疾患に対する耐性の分布を前記個体の群中で特定し；
c) 遺伝子型データと前記疾患又は疾患に対する耐性の分布とを比較し；そして
d) 前記統計的な直接の関連性についての比較を分析する、
ことを含んで成る方法。 - 疾患もしくは疾患に対する耐性を診断する又は予後診断を促す方法であって、IFNα−５遺伝子において、c４２t、g４３a、c８２t、a１２３t、g１５２c、t１７４c、g２９２c、a５１６g、c６４１g、g７９８c、及びg１００９aからなる群から選択される１つ以上のSNPを検出することを含んで成る方法。
- 試験される１又は複数の化合物の中から、C１２２S突然変異IFNα−５遺伝子産物の活性に実質上類似する生物活性を有する化合物を同定する方法であって、当該方法は：
a) 前記化合物の生物活性、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD４＋もしくはCD８＋Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroもしくはin vivo抗ウィルス活性、悪性Friend赤白血病を予め接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt細胞系統に対する細胞抗増殖活性、TF−１細胞系統に対する細胞抗増殖活性を測定し；
b) 前記化合物の段階a)で測定した活性と、C１２２S突然変異IFNα−５遺伝子産物の活性とを比較し；
c) 段階b)で行われた比較に基づき、前記化合物が、C１２２S突然変異IFNα−５遺伝子産物の活性と比較して、実質上類似している、又はより低いもしくはより高い活性を有するかどうかを特定する、
段階を含んで成る方法。 - 前記試験される化合物が、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、ハイスループットスクリーニングから同定される、又は配列番号２のポリペプチド、もしくはC１２２S SNPを含んで成るという条件を有するアミノ酸配列(配列番号２)の位置２４〜１８９に含まれたアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列と同じ３次構造を有するようにコンピューターによる薬物設計によって設計される、請求項３３に記載の方法。
- 請求項３３に記載の方法によって同定された化合物。
- 個体における、ガン及び腫瘍、感染症、免疫及び自己免疫に関連した疾患、心疾患、代謝性疾患、中枢神経系の疾患からなる群から選択された疾患、並びに化学的治療に関連した障害を予防又は治療する方法であって、前記個体に対して治療上有効な量の請求項３５に記載の化合物に、医薬的に許容できる賦形剤を加えて投与することを含んで成る方法。
- 前記ガン及び腫瘍が、転移性腎ガン、黒色腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍及びAIDSの場合のカポジー肉腫を含んで成る免疫欠損症に続いて現われる腫瘍を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
- 前記感染症が、ウィルス感染症、例えば、慢性B型及びC型肝炎及びHIV／AIDS、感染性肺炎、並びに陰部疣贅などの性病を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
- 前記免疫及び自己免疫に関連した疾患が、組織又は器官移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
- 前記中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合性失調症及び鬱病を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
- 前記代謝性疾患が、免疫とは無関係の疾患、例えば、肥満症を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
- 個体における、傷の治癒、透析された患者の貧血症、及び／又は骨粗鬆症から成る群から選択された疾患を予防又は治療する方法であって、前記個体に対して治療上有効な量の請求項３５に記載の化合物に、医薬的に許容できる賦形剤を加えて投与することを含んで成る方法。
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