KR100443503B1 - 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 돌연변이체, 이의 검출 방법 및 이 방법에 유용한 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 돌연변이체, 이의 검출 방법 및 이 방법에 유용한 프라이머에 관한 것으로, 본 발명에 따른 돌연변이체는 하기 유전자형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다:

(a) 상기 유전자의 인트론 2의 3'쪽 14 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 3 및 인트론 3의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 1의 염기서열에서 136 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

(b) 상기 유전자의 인트론 3의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 4 및 인트론 4의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 2의 염기서열에서 363 번째 내지 379 번째 뉴클레오티드 잔기가 결실된 유전자형;

(c) 상기 유전자의 인트론 6의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 7 및 인트론 7의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 3의 염기서열에서 15 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

(d) 상기 유전자의 인트론 10의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 11 및 인트론 11의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 4의 염기서열에서 134 번째와 135 번째 뉴클레오티드 잔기 사이에 뉴클레오티드 잔기 CTAG가 삽입된 유전자형; 및

(e) 상기 유전자의 엑손 13의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 14 및 인트론 14의 5'쪽 7 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 5의 염기서열에서 116 번째 뉴클레오티드 잔기 C가 A로 치환된 유전자형.

Description

가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 돌연변이체, 이의 검출 방법 및 이 방법에 유용한 프라이머{LDL RECEPTOR MUTANT INDUCING FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, METHOD FOR DETECTING SAME AND PRIMER BEING USEFUL IN SAID METHOD}

본 발명은 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 돌연변이체, 이의 검출 방법 및 이 방법에 유용한 프라이머에 관한 것이다.

가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia)은 저밀도 지단백질(LDL)이나 초저밀도 지단백질(VLDL) 잔량을 세포내로 수송하여 혈중 콜레스테롤 수준을 조절하는 LDL 수용체(LDLR)의 결함으로 발병하는 우성 유전병이다(Yamamoto et al.,Cell, 39: 27-38 (1984); 및 Brown et al.,Science, 232: 34-47 (1986)).

가족성 고콜레스테롤혈증에 대해 이형접합의 유전형질을 갖는 환자는 1/500 내지 1/400의 빈도로 나타나는데(Brown et al.,Science, 232: 34-47 (1986)), 이들은 정상인보다 2 내지 3 배 높은 혈중 콜레스테롤 수준을 가지며, 이로 인해 잉여 콜레스테롤이 말단 조직과 혈관 내벽에 축적되어 황색종(Achilles tendon xanthoma)이 발생하고 동맥경화와 심혈관 질환에 이를 확률이 높다.

가족성 고콜레스테롤혈증에 대해 동형접합의 유전형질을 갖는 환자는 1/1,000,000의 낮은 빈도로 나타나며, 이들 대부분은 유아기에 과다한 콜레스테롤에 기인한 심혈관 질환으로 사망한다(Russell et al.,J Biol Chem., 264: 21682-21688 (1989)).

LDLR 유전자는 19 번 염색체에 위치하며 약 45 kb 크기이고 18 개의 엑손(exon)으로 구성되며, 860 개 아미노산 잔기를 갖는 단백질을 코딩한다(Yamamoto et al.,Cell, 39: 27-38 (1984)).

LDLR 유전자의 돌연변이체는 가족성 고콜레스테롤혈증 환자들에서 발견되었는데, 현재까지 약 600 개 이상이 보고되었다. 이 중 Alu 반복서열(repeat)의 재조합에 의해 결실이나 삽입이 일어난 돌연변이는 20% 미만이고, 나머지는 점 돌연변이 또는 작은 결실이 일어난 것들이었다(Yamakawa et al.,Hum Genet, 82: 317-321 (1989); 및 Rudiger et al.,Eur J Biochem., 23: 107-111 (1991)).

종래에는 LDLR 유전자의 돌연변이체를 스크리닝하기 위해, 주형으로서 DNA 또는 RNA 시료와 함께 이 유전자의 각 엑손/인트론 연접 부위에 대한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였는데, 이 방법에는 스플라이스 연접부(splice junction)와 프로모터 영역에 위치하는 돌연변이를 탐지하지 못하는 단점이 있었다.

특히, 한국인의 인종적 지리적 고유성을 감안할 때, 한국인 가족성 고콜레스테롤혈증 환자들에서 고유한 LDLR 유전자 돌연변이들이 분포할 것으로 예상되며, 현재까지 2 종의 결실 변이체(인트론 6과 인트론 8 사이에서 3.83-kb 크기의 영역이 결실된 변이체와 인트론 8과 인트론 12 사이에서 5.17-kb 크기의 영역이 결실된 변이체)(Chae et al.,Hum Genet, 99: 155-163 (1997)), 3종의 작은 결실 변이체(△M510-I521, △T521-W515, T536del2nt)와 3종의 점 돌연변이체(C210Y, P584L, Q161X)(Chae et al.,Clin Genet, 55: 325-331 (1999); 및 Shin et al., ClinGenet, 57: 225-229 (2000))가 한국인 고콜레스테롤혈증에 관련된 LDLR 변이체로 보고되었다. 그러나 이 자료만으로는 한국인에서 발견되는 LDLR 유전자의 돌연변이들을 총체적으로 제공하기에 부족한 실정이므로, 추가의 돌연변이체를 스크리닝하기 위한 노력이 계속되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 LDLR 유전자의 돌연변이체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이체의 검출 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 유용한 PCR 프라이머를 제공하는 데 있다.

도 1은 가족성 고콜레스테롤혈증 환자의 DNA 시료로부터 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 엑손 3 및 그 인접 인트론 영역을 증폭한 후 단일가닥 형상 다형성(single strand conformation polymorphism) 및 헤테로두플렉스 동시 분석한 결과를 보여주는 사진이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자에 대해 하기 유전자형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는, 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자 돌연변이체를 제공한다:

(a) 상기 유전자의 인트론 2의 3'쪽 14 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 3 및 인트론 3의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 1의 염기서열에서 136 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

(b) 상기 유전자의 인트론 3의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 4 및 인트론 4의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 2의 염기서열에서 363 번째 내지 379 번째 뉴클레오티드 잔기가 결실된 유전자형;

(c) 상기 유전자의 인트론 6의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 7 및 인트론 7의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 3의 염기서열에서 15 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

(d) 상기 유전자의 인트론 10의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 11 및 인트론 11의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호:4의 염기서열에서 134 번째와 135 번째 뉴클레오티드 잔기 사이에 뉴클레오티드 잔기 CTAG가 삽입된 유전자형; 및

(e) 상기 유전자의 엑손 13의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 14 및 인트론 14의 5'쪽 7 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 5의 염기서열에서 116 번째 뉴클레오티드 잔기 C가 A로 치환된 유전자형.

상기 다른 목적에 따라, 본원 발명에서는 인간 DNA 또는 RNA 시료로부터 상기 (a) 내지 (e)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자 돌연변이체의 검출 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 10 및 11의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, 서열번호 14 및 15의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, 서열번호: 20 및 21의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, 서열번호: 28 및 29의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, 및 서열번호: 34 및 35의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 상기 방법에서 DNA 증폭에 유용한 프라이머 세트를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 돌연변이체는, 공지된 인간 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 유전자 서열(GenBank 등록번호 AF217403) 중 (a) 인트론 2의 3'쪽 14 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 3 및 인트론 3의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역(이하 '엑손 3 및 그 인접 인트론'이라 함)에 해당하는 서열번호: 1의 염기서열에서 136 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형(C83Y로 명명함); (b) 인트론 3의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 4 및 인트론 4의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역(이하 '엑손 4 및 그 인접 인트론'이라 함)에 해당하는 서열번호: 2의 염기서열에서 363 내지 379 번째 뉴클레오티드 잔기가 결실된 유전자형(D200del17nt로 명명함); (c) 인트론 6의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 7 및 인트론 7의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역(이하 '엑손 7 및 그 인접 인트론'이라 함)에 해당하는 서열번호: 3의 염기서열에서 15 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형(IVS6-1g→a로 명명함); 및 (d) 인트론 10의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 11 및 인트론 11의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역(이하 '엑손 11 및 그 인접 인트론'이라 함)에 해당하는 서열번호: 4의 염기서열에서 134 번째와 135 번째 뉴클레오티드 잔기 사이에 CTAG가 삽입된 유전자형(D548insCTAG로 명명함); 및 (e) 엑손 13의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 14 및 인트론 14의 5'쪽 7 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역(이하 '엑손 14 및 그 인접 인트론'이라 함)에 해당하는 서열번호: 5의 염기서열에서 116 번째 뉴클레오티드 잔기 C가 A로 치환된 유전자형(C675X로 명명함)을 하나 이상 가지며 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발한다.

특히, 이 돌연변이체들은 가족성 고콜레스테롤혈증 환자 그룹에서 나타나지만 정상인 그룹에서는 나타나지 않으므로 가족성 고콜레스테롤혈증의 지표로서 이 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이 돌연변이체는 인간 DNA 또는 RNA 시료로부터 상기 (a) 내지 (e) 중 하나이상의 유전자형을 결정함으로써 검출할 수 있다.

상세하게는, 먼저 인간으로부터 적절한 세포를 얻고 이로부터 통상적인 방법에 따라 DNA 또는 RNA 시료를 추출한다. 이때 세포원으로는 혈액 시료, 볼을 면봉으로 닦아내어 얻은 시료, 모낭 시료 또는 코로부터 흡인한 시료(nasal aspirate) 등을 사용할 수 있다. 세포로부터 추출된 RNA 시료가 본 발명에서 이용될 수 있음이 이미 잘 알려져 있으나, DNA 시료가 간편한 분리 등의 장점이 있어 바람직하며 DNA 시료의 추출 방법은 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, NY., 9.16-9.19)에 기재되어 있다.

필요에 따라, 추출된 DNA 또는 RNA 시료를 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 등의 통상적인 방법에 따라 증폭시킬 수 있다. 이 때 상기 (a) 내지 (e)의 유전자형 결정을 위한 PCR 반응에는 각각 서열번호: 10 및 11, 14 및 15, 20 및 21, 28 및 29, 및 34 및 35의 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 종래의 방법들에 사용된 프라이머들은 엑손에 인접한 비코딩 서열을 증폭하지 못해 코딩 영역과 스플라이싱 부위(splicing site) 및 프로모터의 돌연변이를 검출하지 못하는 단점을 가지고 있으나, 상기 프라이머 세트들은 엑손 뿐만 아니라 프로모터, 5'-비번역 영역, 인트론, 3'-비번역 영역을 증폭시킴으로써 이 영역에 위치하는 돌연변이체를 효과적으로 검출한다.

얻어진 DNA 또는 RNA 시료로부터 상기 (a) 내지 (e)의 유전자형을 공지된 방법에 따라 결정한다. 예를 들어 결실이 일어난 유전자형 (b)와 삽입이 일어난 유전자형 (d)는 해당 PCR 산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 조사함으로써 검출할 수 있으며, 돌연변이로 인해 제한효소 NIaIV의 절단 부위가 제거된 유전자형 (c)와 제한효소 DdeI의 절단 부위가 생성된 유전자형 (e)는 해당 PCR 산물을 각각 NIaIV 및 DdeI로 절단한 후 전기영동하여 밴드 패턴을 조사함으로써 검출할 수 있다.

이외의 방법으로 수동 또는 자동 형광 DNA 서열결정 방법(fluorescent DNA sequencing), 프라이머 연장 방법(Nikiforov, T.T. et al.,Nucl Acids Res 22, 4167-4175 (1994)), 올리고뉴클레오티드 연장 분석(OLA)(Nickerson, D.A. et al.,Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927 (1990)), 대립형질 특이적인 PCR 방법(Rust, S. et al.,Nucl Acids Res, 6, 3623-3629 (1993)), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage; Myers R.M. et al.,Science, 230, 1242-1246 (1985)), 단일가닥 형상 다형성(single strand conformation polymorphism: SSCP; Orita M. et al.,Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770 (1989)), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al.,Mol Cells, 5: 668-672 (1995)), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE; Cariello NF. et al.,Am J Hum Genet, 42, 726-734 (1988)), 및 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography: D-HPLC, Underhill PA. et al.,Genome Res, 7, 996-1005 (1997)) 등이 있다.

이러한 유전자형 결정 방법에서 유전자형 (a) 내지 (e)의 변이 뉴클레오티드 잔기 또는 이에 인접한 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드들 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오티드들이 유용하게 사용될 수 있는데, 특히 서열번호: 1 내지 5에서 유전자 (a) 내지 (e)의 변이가 일어난 뉴클레오티드 잔기를 포함하거나 이에 인접한 16 개 이상의 연속된 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 염기서열을 가지는 것들이 바람직하다.

이 올리고뉴클레오티드는 또한 상기 돌연변이체의 검출용 키트에 사용될 수 있는데, 예를 들어 상기 올리고뉴클레오티드가 집적된 칩 형태의 키트로 제조될 수 있으며, 형광물질 등으로 표지된 DNA 또는 RNA 시료를 이 칩에 접촉시킨 후 형광을 측정함으로써 돌연변이체를 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이체의 검출 방법 및 키트는 가족성 고콜레스테롤혈증의 진단에 유용하다.

본 발명에서 언급된 모든 서열은 컴퓨터 기독성 매체(computer-readable medium)에 제공할 수 있을 만큼 편리한 충분한 길이를 가진다. 대표적인 컴퓨터 기독성 매체로는 플로피 디스크, 하드 디스크, 임의 액세스 기억장치(RAM), 읽기 전용 기억장치(ROM) 및 콤팩트 디스크(CD)-ROM과 같이 당업계에 공지된 것들이 있다.

가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는 LDLR 유전자 돌연변이는 인종간에 그 종류 및 빈도에 많은 차이를 보이는데, 한국인에서 발견된 본 발명의 돌연변이체들은 한국인의 고콜레스테롤혈증 및 심혈관질환을 DNA 수준에서 분자유전학적으로 진단할 수 있게 하며, 더 나아가 산전 및 조기 진단을 통해 이러한 유전 질환의 예방 및 조기 치료를 가능하게 하고, 원인의 정확한 규명을 통해 정확한 치료가 가능하게 하며, 유전자 치료법을 활용하여 이러한 질환의 근본적인 치료를 가능하게 해준다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 인간 게놈 DNA의 추출

헤파린이 들어있는 시험관에 인간 혈액 시료를 채취한 다음, 3,000x g에서 15 분 동안 원심분리하여 혈액 세포들을 침전시켰다. 이 세포 침전물에 0.5% 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 100 ㎍/㎖ 단위의 단백질분해효소(proteinase) K를 가하고 3 시간 동안 처리하여 핵을 용해시키고 단백질을 분해시켰다. 여기에 20 ㎍/㎖ RNase를 가하여 RNA를 분해시킨 후 동일 부피의 페놀과 클로로포름의 혼합용매(혼합비 1:1)를 가하여 충분히 섞은 후 3,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 용매를 제거하는 과정을 3 회 반복한 다음 동일 부피의 클로로포름을 가하고 원심분리하여 단백질을 제거하였다. 수층에 2 배 부피의 에탄올을 가하고 침전시켜 게놈 DNA 침전물을 얻었다. 얻어진 게놈 DNA는 분광계를 사용하여 260 ㎚의 파장에서 측정하여 정량하였다.

참조예 2: LDLR 유전자의 엑손별 증폭

LDLR 유전자의 18 개 엑손 및 이의 인접 영역을 증폭하기 위해, 공지된 LDLR 유전자 서열(Genbank 등록번호 AF217403 및 런던 대학(University college London)이 제공한 LDLR 유전자 지도(www.ucl.ac.kr/fh/genegook.html))에 기초하여 각 엑손으로부터 상류와 하류로 20 내지 50 bp 떨어진 위치에 해당하는 서열번호: 6 내지 43의 프라이머들을 합성하였다(서열번호: 9, 12, 17 내지 29의 프라이머는Genbank 등록번호 AF217403에 기초하였으며, 나머지 프라이머들은 상기 LDLR 유전자 지도에 기초하였다). 이때, 엑손 4의 증폭을 위한 프라이머는, 2 회의 PCR 반응을 통해 일부 서열이 중복된 두 개의 PCR 산물을 얻도록 2 세트(서열번호; 12 및 13, 14 및 15)로 고안되었고, 엑손 1의 증폭을 위한 프라이머는 이 유전자의 전사에 중요한 프로모터의 스테롤 조절 인자(sterol regulatory element, SRE; Scholt et al.,Am J Hum Genet,61:S, A412 (1997))를 포함하여 증폭하도록 전사 개시 뉴클레오티드로터 -151 bp 위치에 해당하는 5'-프라이머(서열번호: 6)로 고안되었다. 나머지 엑손의 증폭을 위한 프라이머들은 해당 엑손에 인접한 인트론 영역 또는 3'-비번역 서열 영역을 포함하여 증폭할 수 있도록 고안되었다.

각 엑손을 증폭하기 위해, 하기 표 1에 나타낸 프라이머와 최적의 어닐링 온도 조건에 따라 PCR 반응을 수행하였다. 이 때, 다른 PCR 반응 조건으로는 94 ℃에서 60 분 동안 가열한 후, 94 ℃에서 40 초 동안 변성시키고 최적 어닐링 온도에서 60 초 동안 어닐링시킨 다음 72 ℃에서 120 초 동안 연장시키는 과정을 35 회 수행한 다음, 72 ℃에서 180 초 동안 반응시켰다. 얻어진 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 크기를 확인하였다.

엑손	프라이머	어닐링 온도(℃)	PCR 산물 크기(bp)
1	서열번호: 6 및 7	57	350
2	서열번호: 8 및 9	51	229
3	서열번호: 10 및 11	51	214
4A	서열번호: 12 및 13	53	328
4B	서열번호: 14 및 15	53	229
5	서열번호: 16 및 17	53	225
6	서열번호: 18 및 19	56	218
7	서열번호: 20 및 21	60	217
8	서열번호: 22 및 23	60	229
9	서열번호: 24 및 25	58	263
10	서열번호: 26 및 27	43	316
11	서열번호: 28 및 29	60	205
12	서열번호: 30 및 31	53	236
13	서열번호: 32 및 33	55	211
14	서열번호: 34 및 35	53	245
15	서열번호: 36 및 37	57	231
16	서열번호: 38 및 39	55	176
17	서열번호: 40 및 41	51	252
18	서열번호: 42 및 43	54	193

실시예 1: LDLR 유전자의 돌연변이체의 스크리닝

LDLR 유전자의 돌연변이체를 스크리닝하기 위해, 가족성 고콜레스테롤혈증 환자로부터 얻은 LDLR 유전자 각 엑손에 대해 SSCP 및 헤테로두플렉스 분석을 다음과 같이 수행하였다.

(단계 1) 가족성 고콜레스테롤혈증 환자의 게놈 DNA 추출

먼저 가족성 고콜레스테롤혈증 환자는 20 세 이상인 경우에는 총 콜레스테롤 농도가 약 300 ㎎/㎗이고, 20 세 미만인 경우에는 총 콜레스테롤 농도가 약 230 ㎎/㎗이며, 황색종을 보이고, 가족 중 심혈관 질환을 갖는 사람이 있는 경우를 기준으로 하여 선정한 후, 이러한 환자 29 명으로부터 참조예 1의 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 비교를 위해, 가족성 고콜레스테롤혈증을 보이지 않는 정상인 16명으로부터 참조예 1의 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다.

(단계 2) LDLR 유전자의 엑손별 증폭

단계 1에서 얻은 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 참조예 2의 방법으로 PCR를 수행하여 18 개 엑손 및 그 인접 인트론 영역을 증폭하였다.

(단계 3) SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석

단계 2에서 얻은 PCR 산물 각각에 대해, 문헌(Lee et al., Mol Cells, 5: 668-672 (1995))에 기재된 방법에 따라 방사능 동위원소를 사용하지 않는 SSCP 및 헤테로두플렉스 동시분석을 다음과 같이 수행하였다. PCR 산물에 동일 부피의 95 % 포름아미드 및 10 mM NaOH를 포함하는 로딩 완충액를 가한 후 95 ℃에서 3 분 동안 처리하여 DNA를 변성시켰다. 변성된 DNA를 글리세롤을 10 %로 포함하거나 포함하지 않는 0.5 X MDE 겔(AT biochem., 미국, 20 ㎝ x 40 ㎝ 크기)에서 전기영동하였다. 전기영동시 상온을 유지하기 위해 겔 후면 유리판에 알루미늄 판을 장착한 후 그 전면에 선풍기를 작동시켰다. 전기영동이 종료된 후 DNA를 염색하였다. 돌연변이의 존재 여부는 환자의 각 엑손의 PCR 산물로부터 얻어진 SSCP 및 헤테로두플렉스 부위의 DNA 밴드 양상을 정상인의 경우와 비교하여 판정하였다.

그 결과 환자 8명의 DNA 시료로부터 각각 엑손 3, 4, 7, 11 및 14 영역에 돌연변이가 존재함을 확인하였다. 도 1은 엑손 3의 PCR 산물을 SSCP 및 헤테로두플렉스 동시분석한 결과를 보여주는 사진이며, 여기에서 제1열은 정상인의 DNA 시료이고 제2열은 가족성 고콜레스테롤혈증 환자의 DNA 시료이다.

(단계 4) 염기서열 분석

단계 3에서 돌연변이가 있는 것으로 확인된 PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 이때 염기서열 결정 방법으로는, 각 PCR 산물을 벡터 pGEM-T(Promega, 미국)에 클로닝한 후 6 개 이상의 클론들로부터 DNA를 분리하여 생거 등의 방법(Sanger. F. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 74, 5463 (1977))에 따라 염기서열을 결정하거나, PCR 산물을 직접 사용하여 염기서열 결정 키트(ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, PE Biosystems, 미국)로 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 엑손 3 및 그 인접 인트론 영역에 해당하는 서열번호: 1의 염기서열에서 136 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 돌연변이체(C83Y로 명명함); 엑손 4 및 그 인접 인트론 영역에 해당하는 서열번호: 2의 염기서열에서 363 내지 379 번째 뉴클레오티드 잔기가 결실된 돌연변이체(D200del17nt로 명명함); 엑손 7 및 그 인접 인트론 영역에 해당하는 서열번호: 3의 염기서열에서 15 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 돌연변이체(IVS6-1g→a로 명명함); 및 엑손 11 그 인접 인트론 영역에 해당하는 서열번호: 4의 염기서열에서 134 번째와 135 번째 뉴클레오티드 잔기 사이에 CTAG가 삽입된 돌연변이체(D548insCTAG로 명명함); 및 엑손 14 및 그 인접 인트론 영역에 해당하는 서열번호: 5의 염기서열에서 116 번째 뉴클레오티드 잔기 C가 A로 치환된 돌연변이체(C675X로 명명함)를 확인하였다.

이 외에도 이미 다른 인종에서도 보고(www.ucl.ac.uk/fh)된 바 있는, 엑손 4의 R94H(CGC→CAC), 엑손 4의 E119K(GAG→AAG), 엑손 4의 D200N(GAC→AAC), 엑손 4의 E207K(GAG→AAG), 엑손 4의 E207X(GAG→TAG), 엑손 12의 R574Q(CGG→CAG), 엑손13의 IVS12-1g→a(tagGA→taaGA) 및 엑손 14의 P664L(CCG→CTG) 돌연변이체들도 확인되었고, 엑손 7의 IVS7+10g→c(ccgc→cccc), 엑손 10의 R540R(AGG→AGA), 엑손 11의 P518P(CCC→CCT), 엑손 12의 L554L(CTC→CTT), 엑손 12의 N570N(AAT→AAC), 엑손 13의 V632(GTC→GTT) 및 엑손 18의 3'UTR+52g→a(ccgg→ccag) 다형성도 확인되었다.

실시예 2: LDLR 돌연변이의 확인

실시예 1의 단계 4에서 얻은 돌연변이체와 가족성 고콜레스테롤혈증의 연관성을 다음과 같이 조사하였다.

먼저 가족성 고콜레스테롤혈증 환자 8 명 및 그 가족으로부터 참조예 1의 방법으로 게놈 DNA를 추출한 후, 이를 주형으로 사용하고 서열번호: 10 및 11, 14 및 15, 20 및 21, 28 및 29, 또는 34 및 35의 프라이머 세트를 사용하여 실시예 1의 단계 2에서와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 엑손 3, 4, 7, 11 및 14를 증폭하였다.

변이로 인해 제한효소 NIaIV의 절단 부위가 제거된 돌연변이 IVS6-1g→a와 제한효소 DdeI의 절단 부위가 생성된 돌연변이 C675X의 분석을 위해, 엑손 7의 PCR 산물을 제한효소 NIaIV로 처리하고 엑손 14의 PCR 산물을 제한효소 Dde I으로 처리한 후 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 밴드 패턴을 조사하였다. 또한 결실이 일어난 돌연변이 D200del17nt 및 삽입이 일어난 D548insCTAG의 분석을 위해, 엑손 4와 11의 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 밴드 패턴을 조사하였다. 변이로 인한 제한효소 절단 부위 또는 길이의 변화가 없는 돌연변이 C83Y의 분석을 위해, 엑손 3의 PCR 산물을 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 SSCP 및 헤테로두플렉스 동시분석을 수행하여 밴드 패턴을 조사하였다. 비교를 위해, 고콜레스테롤혈증 환자이나 그 가족 중에 이 질환을 갖는 사람이 없는 경우의 그 환자와 가족, 및 정상인의 게놈 DNA를 사용하여 동일하게 분석하였다.

그 결과, 가족성 고콜레스테롤혈증을 갖는 환자 및 그의 가족 모두에서 돌연변이가 나타났지만, 가족중에 고콜레스테롤혈증을 갖는 사람이 없는 고콜레스테롤 혈증 환자와 그 가족 및 정상인들에서는 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 돌연변이체들은 가족성 고콜레스테롤혈증의 원인이 되는 병리학적 돌연변이임을 알 수 있다.

본 발명의 돌연변이체는 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하므로, 가족성 고콜레스테롤혈증의 진단 및 유전자 치료법에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> DNA Link, Inc. <120> LDL RECEPTOR MUTANT INDUCING FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, METHO D FOR DETECTING SAME AND PRIMER BEING USEFUL IN SAID METHOD <130> 2000-538 <160> 43 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 144 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(14) <223> 3' portion of intron 2 of human LDLR gene <220> <221> exon <222> (15)..(138) <223> exon 3 of human LDLR gene <220> <221> intron <222> (139)..(144) <223> 5' portion of intron 4 of human LDLR gene <400> 1 ctgtctcttc tgtagtgtct gtcacctgca aatccgggga cttcagctgt gggggccgtg 60 tcaaccgctg cattcctcag ttctggaggt gcgatggcca agtggactgc gacaacggct 120 cagacgagca aggctgtcgt aagt 144 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(15) <223> 3' portion of intron 3 of human LDLR gene <220> <221> exon <222> (16)..(396) <223> exon 4 of human LDLR gene <220> <221> intron <222> (397)..(402) <223> 5' portion of intron 4 of human LDLR gene <400> 2 catccatccc tgcagccccc aagacgtgct cccaggacga gtttcgctgc cacgatggga 60 agtgcatctc tcggcagttc gtctgtgact cagaccggga ctgcttggac ggctcagacg 120 aggcctcctg cccggtgctc acctgtggtc ccgccagctt ccagtgcaac agctccacct 180 gcatccccca gctgtgggcc tgcgacaacg accccgactg cgaagatggc tcggatgagt 240 ggccgcagcg ctgtaggggt ctttacgtgt tccaagggga cagtagcccc tgctcggcct 300 tcgagttcca ctgcctaagt ggcgagtgca tccactccag ctggcgctgt gatggtggcc 360 ccgactgcaa ggacaaatct gacgaggaaa actgcggtat gg 402 <210> 3 <211> 141 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(15) <223> 3' portion of intron 6 of human LDLR gene <220> <221> exon <222> (16)..(135) <223> exon 7 of human LDLR gene <220> <221> intron <222> (136)..(141) <223> 5' portion of intron 7 of human LDLR gene <400> 3 cctggccctg cgcagggacc aacgaatgct tggacaacaa cggcggctgt tcccacgtct 60 gcaatgacct taagatcggc tacgagtgcc tgtgccccga cggcttccag ctggtggccc 120 agcgaagatg cgaaggtgaa t 141 <210> 4 <211> 140 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(15) <223> 3' portion of intron 10 of human LDLR gene <220> <221> exon <222> (16)..(134) <223> exon 11 of human LDLR gene <220> <221> intron <222> (135)..(140) <223> 5' portion of intron 11 of human LDLR gene <400> 4 ctgtcctccc accagcttca tgtactggac tgactgggga actcccgcca agatcaagaa 60 agggggcctg aatggtgtgg acatctactc gctggtgact gaaaacattc agtggcccaa 120 tggcatcacc ctaggtatgt 140 <210> 5 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(15) <223> 3' portion of intron 13 of human LDLR gene <220> <221> exon <222> (16)..(167) <223> exon 14 of human LDLR gene <220> <221> intron <222> (168)..(174) <223> 5' portion of intron 14 of human LDLR gene <400> 5 cttcttctgc cccaggagtg aactggtgtg agaggaccac cctgagcaat ggcggctgcc 60 agtatctgtg cctccctgcc ccgcagatca acccccactc gcccaagttt acctgcgcct 120 gcccggacgg catgctgctg gccagggaca tgaggagctg cctcacaggt gtgg 174 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 1 and the adjacent intron <400> 6 ggaatcagag cttcacgggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 1 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 7 tccctctcaa cctattctgg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 2 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 8 gtcagtttct gattctggcg t 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 2 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 9 ccctcgtctc tattacaaaa ta 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 3 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 10 tcagtgggtc tttcctttga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 3 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 11 ggactcagat aggctcaata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 4A and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 12 gctggtgttg ggagacttca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 4A and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 13 gctactgtcc ccttggaaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 4B and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 14 gactgcgaag atggctcgga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 4B and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 15 cagggacagg tgataggacg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 5 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 16 ctctggttga ctcttcttga g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 5 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 17 cagcaaggca cagagaatgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 6 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 18 aactgaggct cagacacacc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 6 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 19 gctccccaca aactctgcaa 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 7 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 20 gatgggtagg ggcccgaga 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 7 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 21 tcaggaagcg cagaggggg 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 8 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 22 taggccattg gggaagagcc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 8 and the adjacent introns o f human LDLR gene <400> 23 tgcctgcaag gggtgaggc 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 9 and the adjacent introns of hu man LDLR gene <400> 24 atcgacgggt cccctctga 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antsense primer for amplifying exon 9 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 25 atctcacctg cgggccaag 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 10 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 26 ttggcccgca ggtgagatg 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 10 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 27 tgcagccctc agcgtcgtg 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 11 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 28 gcctcacagc tattctctgt c 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 11 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 29 tctgtcctcc agcctgtgcc 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 12 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 30 ctgggactgg catcagcac 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 12 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 31 tctatccggc cacctaagtg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 13 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 32 gtcatcttcc ttgctgcctg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 13 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 33 caaggaggtt tcaaggttgg 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 14 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 34 tatagctgat gatctcgttc c 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 14 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 35 cagttggagg acacaggacg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 15 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 36 acgtggcact cagaagacgt 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 15 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 37 gtgtggtggc gggcccagtc ttt 23 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 16 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 38 tggtggcctt cctttagacc 20 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 16 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 39 agcgggaggc tgtgacctg 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 17 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 40 agctgggtct ctggtctcg 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 17 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 41 cgccatggct ctggctttc 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying exon 18 and the adjacent introns of h uman LDLR gene <400> 42 gcctgtttcc tgagtgctgg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying exon 18 and the adjacent introns of human LDLR gene <400> 43 gctctggcag gcaatgcttt 20

Claims (5)

1. 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자에 대해 하기 유전자형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고 가족성 고콜레스테롤혈증을 유발하는, 인간 저밀도 지단백질 수용체 유전자의 돌연변이체:

   (a) 상기 유전자의 인트론 2의 3'쪽 14 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 3 및 인트론 3의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 1의 염기서열에서 136 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

   (b) 상기 유전자의 인트론 3의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 4 및 인트론 4의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 2의 염기서열에서 363 번째 내지 379 번째 뉴클레오티드 잔기가 결실된 유전자형;

   (c) 상기 유전자의 인트론 6의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 7 및 인트론 7의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 3의 염기서열에서 15 번째 뉴클레오티드 잔기 G가 A로 치환된 유전자형;

   (d) 상기 유전자의 인트론 10의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 11 및 인트론 11의 5'쪽 6 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 4의 염기서열에서 134 번째와 135 번째 뉴클레오티드 잔기 사이에 뉴클레오티드 잔기 CTAG가 삽입된 유전자형; 및

   (e) 상기 유전자의 엑손 13의 3'쪽 15 개 뉴클레오티드 잔기, 엑손 14 및 인트론 14의 5'쪽 7 개 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 영역에 해당하는 서열번호: 5의 염기서열에서 116 번째 뉴클레오티드 잔기 C가 A로 치환된 유전자형.
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