CN118240929A - 一种检测tgfbi基因突变的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例涉及基因检测领域，具体涉及一种检测TGFBI基因突变的试剂盒。所述试剂盒包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂和第四反应体系试剂，第一反应体系试剂至第四反应体系试剂中包括：扩增引物和探针序列。本发明实施例中提供的检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个位点的试剂盒，利用ARMS‑PCR的高特异性结合Tagman荧光定量PCR技术的高灵敏性，并优化出多重PCR扩增体系，通过四管反应，即可同时检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个突变位点，操作简便、快速、准确性好，闭管操作，无PCR产物后续处理过程，大大降低了污染的发生。

Description

一种检测TGFBI基因突变的试剂盒
本申请是申请日为2020年7月28日、发明名称为“一种检测TGFBI基因突变的试剂盒”的中国专利申请No.202010738608.X的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测TGFBI基因突变的试剂盒。
背景技术
角膜营养不良是一系列与家族遗传有关的原发性、进行性、致盲性角膜病变的总称,属常染色体显性遗传性疾病，其开始在角膜中间具有模糊症状且逐渐蔓延，最终患者到老年时丧失视力，发病率约为1/1000。角膜营养不良包括颗粒状角膜营养不良、格子状角膜营养不良、里斯-布克乐斯(Reis-bucklers)角膜营养不良等。
TGFBI基因是首个被确定的角膜营养不良致病基因，超过50％的人角膜营养不良是由TGFBI基因的某些突变导致；TGFBI基因位于5q31染色体上，有17个外显子，编码由上皮细胞和间质细胞合成的含683个氨基酸残基的蛋白；TGFBI基因的突变与多种类型的角膜营养不良有关，其在不同位点上的突变可引起不同类型的角膜营养不良。由TGFBI基因R124C突变引起的颗粒状营养不良I型、由TGFBI基因R124H突变引起的颗粒状营养不良II型、由TGFBI基因R124L突变引起的Reis-Bücklers角膜营养不良、由TGFBI基因R555W突变引起的颗粒状营养不良I型、由TGFBI基因R555Q突变引起的Thiel-Behnke角膜营养不良均是我国人群中最为常见的角膜营养不良。
临床上用于近视治疗的方法准分子激光治疗性角膜切削术PTK(PhotoTherapeutic Keratectomy)，主要是针对角膜瓣切削的一种手术，如果患者存在这5种基因突变引起的角膜营养不良，术后会引起角膜混浊加剧、矫正视力明显下降甚至失明。因此，对于需要通过角膜屈光手术改善视力的患者而言，开展TGFBI基因检测，从基因水平判断角膜屈光手术的可行性，避免因诊断不准确而导致的失明等。
目前，ARMS(突变阻滞扩增系统)-PCR法为常用的检测基因突变的方法。ARMS-PCR法的技术原理为：Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，因此，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。ARMS技术针对引物3’端进行等位基因特异性的区分：只有3’端完全匹配才可以进行扩增。但是，对一个SNP位点的检出需要两个反应；且通量低，灵敏度低，对结果的查看需要经过琼脂糖凝胶电泳，容易出现污染产生假阳性。
荧光定量Tagman探针法的原理为：针对检测位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增；探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光基团从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET(荧光共振能量转移)，发出荧光。对于SNP分型检测，体系中会含有针对不同基因型的探针，两种探针5’端通过标记不同的荧光基团进行区分。当基因型为纯合子时，只会检测到单独一种荧光信号；而对于杂合子，两种荧光信号都将被检测到。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测TGFBI基因突变的试剂盒。本试剂盒利用ARMS-PCR的高特异性结合Tagman荧光定量PCR技术的高灵敏性，优化出多重PCR扩增体系，通过四管反应，可同时检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个突变位点，操作简便、快速、准确性好，闭管操作，无PCR产物后续处理过程，大大降低了污染的发生。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂和第四反应体系试剂，其中：
第一反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124WT位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555W位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第二反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124H位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555Q位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第三反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124L位点的下游ARMS引物，针对内参基因GAPDH的上游引物和下游引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对GAPDH基因的检测探针；
第四反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124C位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555WT位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第一反应体系试剂至第四反应体系试剂中，各个探针序列的5’和3’端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5’端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。
所述TGFBI基因为人TGFBI基因。所述ARMS引物指ARMS技术中设计的3’端碱基突变的用于区分等位基因的引物。一般情况下，ARMS引物除在3’端引入单个碱基的突变外，还会人为的增加3’端附近碱基的突变以达到更好地区分等位基因的效果。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，第一反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的针对R124位点的上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的针对R555位点的上游引物，如SEQ ID NO.3所示序列的针对R124WT位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.4所示序列的针对R555W位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.5所示序列的针对R124位点的探针，如SEQID NO.6所示序列的针对R555位点的探针；
第二反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的针对R124位点的上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的针对R555位点的上游引物，如SEQ ID NO.7所示序列的针对R124H位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.8所示序列的针对R555Q位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.5所示序列的针对R124位点的探针，如SEQ ID NO.6所示序列的针对R555位点的探针；
第三反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的针对R124位点的上游引物，如SEQ ID NO.9所示序列的针对R124L位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.10所示序列的针对内参基因GAPDH的上游引物，如SEQ ID NO.11所示序列的针对内参基因GAPDH的下游引物，如SEQ ID NO.5所示序列的针对R124位点的探针，如SEQ ID NO.12所示序列的针对GAPDH基因的探针；
第四反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的针对R124位点的上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的针对R555位点的上游引物，如SEQ ID NO.13所示序列的针对R124C位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.14所示序列的针对R555WT位点的下游ARMS引物，如SEQ ID NO.5所示序列的针对R124位点的探针，如SEQ ID NO.6所示序列的针对R555位点的探针。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，如SEQ ID NO.5所示序列的针对R124位点的探针的5’端的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO.6所示序列的针对R555位点的探针的5’端的荧光基团为CY5；如SEQ ID NO.12所示序列的针对GAPDH基因的探针的5’端的荧光基团为VIC。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，各个探针序列的3’端包括BHQ淬灭基团。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，试剂盒中还包括：用于荧光定量PCR的其他试剂。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，采用所述试剂盒检测的方法包括下述步骤：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于10ng/μl，DNA的OD260/OD280值在1.7-2.0之间；2)将DNA模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂、第四反应体系试剂中；3)进行荧光定量PCR扩增反应；4)判断是否发生突变。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述样本为EDTA抗凝外周血样本或口腔拭子。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所用样本为EDTA抗凝全血提取的基因组DNA。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应体系为4个总体积分别为20μl的如下体系：
2×荧光定量PCR试剂10μl，10μM的各引物各0.4μl，10μM的各探针各0.4μl，50×ROX reference DyeⅡ0.4μl，DNA样本1μl，ddH2O 6.2μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤3)中PCR扩增的反应条件如下：
37℃2min，95℃5min；95℃30sec，62℃35sec，40个循环；60℃34sec。
上述试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤4)判断是否发生突变的方法包括：
检测结果有效的前提，GAPDH基因荧光PCR的扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≦34；若GAPDH基因无扩增曲线或Ct值>34时，检测结果无效，需重新取样或提取基因组DNA进行检测；依据所检测位点的特异性ARMS引物扩增的Ct值与内参GAPDH基因扩增的Ct值之间的差值ΔCt来判断检测位点的型别；
(1)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H杂合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124H突变；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L杂合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124L突变；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C杂合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124C突变；
(2)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H纯合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L纯合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C纯合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
(3)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W杂合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555W突变；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q杂合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555Q突变；
(4)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W纯合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q纯合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测。
有益效果
本发明实施例中提供的检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个位点的试剂盒，利用ARMS-PCR的高特异性结合Tagman荧光定量PCR技术的高灵敏性，并优化出多重PCR扩增体系，通过四管反应，即可同时检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个突变位点，操作简便、快速、准确性好，闭管操作，无PCR产物后续处理过程，大大降低了污染的发生。
本发明针对5个检测位点分别优化出特异性的ARMS引物，所述引物只能与对应的模板结合发生扩增反应，对错配的模板不扩增或扩增效率极低。
本发明对多重反应体系荧光基团进行了筛选。探针的标记荧光集团根据光谱学性质，选择其间吸收光和发射光相互影响小、产品成熟的荧光素进行标记，分别为124probe：FAM-BHQ1；555probe：CY5-BHQ2；内标GAPDH probe：VIC-BHQ1。
为避免多重反应体系引物和探针之间的相互干扰，本发明对多重反应体系中引物和探针的组合进行了筛选：在反应体系1中同时检测R124WT、R555W，反应体系2中同时检测R124H、R555Q，反应体系3中同时检测R124L、GAPDH内参基因，反应体系4中同时检测R124C、R555WT；确保检测结果的准确性。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例2中样本1在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图。
图2是本发明实施例2中样本1的Sanger测序图。
图3是本发明实施例2中样本2在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图。
图4是本发明实施例2中样本2的Sanger测序图。
图5是本发明实施例2中样本3在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图。
图6是本发明实施例2中样本3的Sanger测序图。
图7是本发明实施例2中样本4在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图。
图8是本发明实施例2中样本4的Sanger测序图。
图9是本发明实施例2中样本5在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图。
图10是本发明实施例2中样本5的Sanger测序图。
图11是本发明实施例3中对R124H位点的设计的4条ARMS引物的筛选结果。
图12是本发明实施例3中样本2(R124H杂合型)在同时检测R124H和R555W位点的反应体系中的荧光定量扩增曲线图。
图13是本发明实施例3中样本4(R555W杂合型)在同时检测R124H和R555W位点的反应体系中的荧光定量扩增曲线图。
图14是本发明实施例3中样本5(R555Q杂合型)在同时检测R124wt和R555Q位点的反应体系中的荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
实施例1ARMS-荧光定量PCR体系的建立
1.血液样品DNA提取
按照DNA提取试剂盒的操作指导进行以下DNA提取的操作，以EDTA抗凝全血样品为例，使用血液DNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司；货号：CWY005S)进行DNA提取的操作。
2.DNA样本质检
提取后的DNA样本，需用NanoDrop One仪器进行质检，要求DNA样本浓度不低于10ng/ul，DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0之间。
3.一种检测TGFBI基因突变的试剂盒
所述试剂盒中包括根据TGFBI基因的R124位点和R555位点的野生型及5种突变R124H、R124L、R124C、R555W、R555Q序列设计的ARMS扩增引物及各自的特异性探针，详见表1。
表1
4.ARMS-荧光定量PCR的反应体系和反应程序
如下安排4个PCR反应体系，分别为反应体系1-4，其中：反应体系1中同时检测R124WT、R555W；反应体系2中同时检测R124H、R555Q；反应体系3中同时检测R124L、GAPDH内参基因；反应体系4中同时检测R124C、R555WT。各体系的具体组成如下所示：
反应体系1-4进行ARMS-荧光定量PCR的反应程序为：37℃2min，95℃5min；95℃30sec，62℃35sec，40个循环；60℃34sec。
其中，2x qPCR mix和50x ROX reference Dye II配套使用，均购自擎科生物，货号TSE301。
5.ARMS-荧光定量PCR的结果的判断
判断是否发生突变的方法包括：
检测结果有效的前提，GAPDH基因荧光PCR的扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≦34；若GAPDH基因无扩增曲线或Ct值>34时，检测结果无效，需重新取样或提取基因组DNA进行检测；依据所检测位点的特异性ARMS引物扩增的Ct值与内参GAPDH基因扩增的Ct值之间的差值ΔCt来判断检测位点的型别；
(1)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H杂合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124H突变；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L杂合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124L突变；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C杂合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124C突变；
(2)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H纯合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L纯合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C纯合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
(3)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W杂合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555W突变；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q杂合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555Q突变；
(4)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W纯合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q纯合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测。
实施例2ARMS-荧光定量PCR体系的验证
1、应用实施例1中的反应体系1-4和反应过程对不同样本(样本编号为1-5)进行检测，按照实施例1中的判断标准进行判断，并与Sanger测序的测序结果进行对比，以确认本发明实施例1中提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒进行ARMS-荧光定量PCR检测TGFBI基因突变的准确性，结果如表2所示。由表2可知，使用本发明提供的试剂盒对EDTA抗凝全血基因组DNA进行TGFBI基因突变检测，检测结果与金标准Sanger测序(一代测序)法的结果一致。
表2
2、上述ARMS-荧光定量PCR的扩增图谱
(1)样本1在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图见图1，图1中的a为样本1在反应体系1中的荧光定量扩增曲线图，b为样本1在反应体系2中的荧光定量扩增曲线图，c为样本1在反应体系3中的荧光定量扩增曲线图，d为样本1在反应体系4中的荧光定量扩增曲线图。由图1可知，反应体系1中只有R124位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本1存在R124wt位点；反应体系2中无扩增曲线或扩增曲线荧光值很低，说明该样本无R124H和R555Q突变位点；在反应体系3中仅GAPDH基因有扩增曲线，说明该样本正常；在反应体系4中R555位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本1存在R555wt位点。综上，样本1的R124和R555位点无突变。其中，无模板对照组均无扩增曲线出现。
图2为样本1的R124和R555位点Sanger测序图，图2中的a为R124位点测序结果，b为R555位点测序结果，由图2可知，样本1的R124和R555位点均为野生型。
上述结果证明，本发明提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒的检测结果与Sanger测序法的结果一致。
(2)样本2在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图见图3，图3中的a为样本2在反应体系1中的荧光定量扩增曲线图，b为样本2在反应体系2中的荧光定量扩增曲线图，c为样本2在反应体系3中的荧光定量扩增曲线图，d为样本2在反应体系4中的荧光定量扩增曲线图。由图3可知，反应体系1中只有R124位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本1存在R124wt位点；反应体系2中R124H型的ARMS引物有扩增曲线，说明该样本存在R124H突变位点；在反应体系3中仅GAPDH基因有扩增曲线，说明该样本正常；在反应体系4中仅R555位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本2存在R555wt位点。综上，样本2为R124H杂合型。其中，无模板对照组均无扩增曲线出现。
图4为样本2的R124位点Sanger测序图，由图4可知，样本2为R124H杂合型。
上述结果证明，本发明提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒的检测结果与Sanger测序法的结果一致。
(3)样本3在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图见图5，图5中的a为样本3在反应体系1中的荧光定量扩增曲线图，b为样本3在反应体系2中的荧光定量扩增曲线图，c为样本3在反应体系3中的荧光定量扩增曲线图，d为样本3在反应体系4中的荧光定量扩增曲线图。由图5可知，反应体系1中只有R124位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本3存在R124wt位点；反应体系2中无扩增曲线或扩增曲线荧光值很低，说明该样本无R124H和R555Q突变位点；在反应体系3中仅GAPDH基因有扩增曲线，说明该样本正常；在反应体系4中R555位点的野生型ARMS引物和R124C型的ARMS引物都有扩增曲线，说明该样本存在R124C突变位点和R555wt位点。综上，样本3为R124C杂合型。其中，无模板对照组均无扩增曲线出现。
图6为样本3的R124位点Sanger测序图，由图6可知，样本3为R124C杂合型。
上述结果证明，本发明提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒的检测结果与Sanger测序法的结果一致。
(4)样本4在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图见图7，图7中的a为样本4在反应体系1中的荧光定量扩增曲线图，b为样本4在反应体系2中的荧光定量扩增曲线图，c为样本4在反应体系3中的荧光定量扩增曲线图，d为样本4在反应体系4中的荧光定量扩增曲线图。由图7可知，反应体系1中R124位点的野生型ARMS引物和R555W型的ARMS引物都有扩增曲线，说明样本4存在R124wt位点和R555W突变位点；反应体系2中无扩增曲线或扩增曲线荧光值很低，说明该样本无R124H和R555Q突变位点；在反应体系3中仅GAPDH基因有扩增曲线，说明该样本正常；在反应体系4中仅R555位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明该样本存在R555wt位点。综上，样本4为R555W杂合型。其中，无模板对照组均无扩增曲线出现。
图8为样本4的R555位点Sanger测序图，由图8可知，样本4为R555W杂合型。
上述结果证明，本发明提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒的检测结果与Sanger测序法的结果一致。
(5)样本5在反应体系1-4中的荧光定量扩增曲线图见图9，图9中的a为样本5在反应体系1中的荧光定量扩增曲线图，b为样本5在反应体系2中的荧光定量扩增曲线图，c为样本5在反应体系3中的荧光定量扩增曲线图，d为样本5在反应体系4中的荧光定量扩增曲线图。由图9可知，反应体系1中R124位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明样本5存在R124wt位点；反应体系2中R555Q位点的ARMS引物有扩增曲线，说明该样本存在R555Q突变位点；在反应体系3中仅GAPDH基因有扩增曲线，说明该样本正常；在反应体系4中仅R555位点的野生型ARMS引物有扩增曲线，说明该样本存在R555wt位点。综上，样本5为R555Q杂合型。其中，无模板对照组均无扩增曲线出现。
图10为样本5的R555位点Sanger测序图，由图10可知，样本5为R555Q杂合型。
上述结果证明，本发明提供的检测TGFBI基因突变的试剂盒的检测结果与Sanger测序法的结果一致。
实施例3ARMS-荧光定量PCR体系建立过程中的筛选
(1)针对各位点的特异性下游ARMS引物的筛选
分别针对TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L位点设计特异性的ARMS引物，ARMS引物设计为下游引物，引物的3’末端碱基落在检测位点处且与对应的检测位点匹配，为了保证ARMS引物的特异性，在3’末端附近额外引入一个错配碱基。针对每个检测位点设计3-5条特异性的ARMS引物。检测位点特异性的ARMS引物分别与对应的通用上游引物结合，扩增所有位点特异型的质粒模板，选取只扩增对应位点质粒模板的引物。比如：使用设计的R124H的下游ARMS引物，同时扩增R124WT、R124H、R124C、R124L型的质粒，选取只有R124H型质粒模板有特异扩增条带，其余类型质粒无非特异扩增条带的下游ARMS引物，作为为R124H的特异性下游ARMS引物。
针对R124H位点共设计了4条ARMS引物，分别为R-1(具体序列为GGCCT CAGCTTCTCC ACGT，SEQ ID NO.15)，R-2(SEQ ID NO.7)，R-3(具体序列为GGCCT CAGCT TCTCCCTGT，SEQ ID NO.16)，R-4(具体序列为GGCCT CAGCT TCTCC GAGT，SEQ ID NO.17)。4条ARMS引物与通用的上游引物124-F结合，以R124WT、R124H、R124C、R124L型的质粒为模板进行PCR扩增，每一基因型的质粒做3个重复，PCR扩增结果如图11所示。由图11(琼脂糖凝胶电泳图)可以看出，R-1引物除了能扩增R124H型的质粒模板外，还对R124WT型质粒模板有较弱的扩增条带；R-2引物只对R124H型质粒模板有扩增条带，对其余三种基因型的质粒模板无非特异扩增条带；R-3引物除了对R124H型的质粒有扩增条带外，对R124WT型的质粒也有扩增条带；R-4引物对R124H型质粒无扩增条带，能扩增R124WT和R124C型的质粒模板；在4组引物的扩增体系中，无模板对照(NTC)均无扩增条带出现，说明扩增体系无污染，实验结果可靠。综上，我们筛选出R-2为针对R124H的下游ARMS引物。
其余位点ARMS引物的筛选过程同R124H型ARMS引物的筛选过程。
(2)同一个反应体系中组合过多引物，引物间会相互影响，从而影响检测准确性，如：引物和引物，引物和探针之间相互影响，易形成引物二聚体；或引起错配，发生非特异性扩增。每一组中多条引物如何设计以及不同组之间引物如何组合，这些都需要通过实验验证。
对于本发明的检测TGFBI基因R124和R555位点突变的多重试剂盒，反应体系采用其他组合时，扩增效率极低。如，当在同一个反应体系中同时检测R124H和R555W位点时，分别对样本2(R124H杂合型)和样本4(R555W杂合型)进行检测，扩增曲线分别如图12和13所示。由图12和图13可以看出，在同时包含R124H和R555W的ARMS引物的反应体系中，样本2(R124H杂合型)和样本4(R555W杂合型)的扩增曲线的荧光值很低，推测可能是因为引物之间或引物和探针间存在相互干扰。
同样，当在同一个反应体系中同时检测R124wt和R555Q位点时，对样本5(R555Q杂合型)进行检测，扩增曲线如图14所示。由图14可知，在同时包含R124wt和R555Q的ARMS引物的反应体系中，样本5(R555Q杂合型)的R555Q的扩增曲线很直，非S型且荧光值很低，推测为R124wt的ARMS引物会抑制R555Q的ARMS引物的扩增。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂和第四反应体系试剂，其中：
第一反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124WT位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555W位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第二反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124H位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555Q位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第三反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124L位点的下游ARMS引物，针对内参基因GAPDH的上游引物和下游引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对GAPDH基因的检测探针；
第四反应体系试剂中包括：针对TGFBI基因R124位点的上游引物，针对TGFBI基因R124C位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R555位点的上游引物，针对TGFBI基因R555WT位点的下游ARMS引物，针对TGFBI基因R124位点的探针，针对TGFBI基因R555位点的探针；
第一反应体系试剂至第四反应体系试剂中，各个探针序列的5’和3’端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5’端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：第一反应体系试剂中包括：如SEQ IDNO.1所示序列的引物，如SEQ ID NO.2所示序列的引物，如SEQ ID NO.3所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.4所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.5所示序列的探针，如SEQ ID NO.6所示序列的探针；
第二反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的引物，如SEQ ID NO.2所示序列的引物，如SEQ ID NO.7所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.8所示序列的ARMS引物，如SEQID NO.5所示序列的探针，如SEQ ID NO.6所示序列的探针；
第三反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的引物，如SEQ ID NO.9所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.10所示序列的引物，如SEQ ID NO.11所示序列的引物，如SEQ IDNO.5所示序列的探针，如SEQ ID NO.12所示序列的探针；
第四反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的引物，如SEQ ID NO.2所示序列的引物，如SEQ ID NO.13所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.14所示序列的ARMS引物，如SEQ ID NO.5所示序列的探针，如SEQ ID NO.6所示序列的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：如SEQ ID NO.5所示序列的探针的5’端的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO.6所示序列的探针的5’端的荧光基团为CY5；如SEQ IDNO.12所示序列的探针的5’端的荧光基团为VIC。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：各个探针序列的3’端包括BHQ淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括：用于荧光定量PCR的其他试剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：采用所述试剂盒检测的方法包括下述步骤：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于10ng/μl，DNA的OD260/OD280值在1.7-2.0之间；2)将DNA模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂、第四反应体系试剂中；3)进行荧光定量PCR扩增反应；4)判断是否发生突变。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述样本为EDTA抗凝外周血样本或口腔拭子。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应体系为4个总体积分别为20μl的如下体系：
2×荧光定量PCR试剂10μl，10μM的各引物各0.4μl，10μM的各探针各0.4μl，50×ROXreference DyeⅡ0.4μl，DNA样本1μl，ddH2O 6.2μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤3)中PCR扩增的反应条件如下：
37℃2min，95℃5min；95℃30sec，62℃35sec，40个循环；60℃34sec。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤4)判断是否发生突变的方法包括：
检测结果有效的前提，GAPDH基因荧光PCR的扩增曲线呈典型的S型，且Ct值≦34；若GAPDH基因无扩增曲线或Ct值>34时，检测结果无效，需重新取样或提取基因组DNA进行检测；依据所检测位点的特异性ARMS引物扩增的Ct值与内参GAPDH基因扩增的Ct值之间的差值ΔCt来判断检测位点的型别；
(1)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H杂合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124H突变；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L杂合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124L突变；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C杂合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R124C突变；
(2)当针对R124WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R124位点的型别：
当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124H纯合突变；当针对R124H的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124L纯合突变；当针对R124L的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R124C纯合突变；当针对R124C的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
(3)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt<5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W杂合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555W突变；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q杂合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测样本无R555Q突变；
(4)当针对R555WT的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5时，按照以下方法判断R555位点的型别：
当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555W纯合突变；当针对R555W的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测；
当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt<5，则检测样本为R555Q纯合突变；当针对R555Q的下游ARMS引物检测的ΔCt≥5，则检测失败，重新检测。
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